MX2013010127A - Procedimiento, matriz y uso para determinar la presencia de cancer pancreatico. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo, que comprende o consiste en las etapas de: (a) proporcionar una muestra a ensayar del individuo y (b) determinar una firma biomarcadora de la muestra de ensayo midiendo la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la Tabla III, en el que la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la Tabla III es indicativa del cáncer pancreático que padece el individuo. La invención también comprende matrices y kits de partes para su uso en el procedimiento de la invención.

Description

PROCEDIMIENTO, MATRIZ Y USO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE CANCER PANCREATICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procedimientos para el diagnóstico de cáncer pancreático y a biomarcadores y matrices para su uso en los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A pesar de los grandes esfuerzos realizados, el cáncer pancreático (PaC), aún conlleva un mal pronóstico [1]. Aunque el PaC solo es el 10° cáncer más común, es la 4a causa que conduce a muerte por cáncer en los Estados Unidos [2-4]. De hecho, la supervivencia de 5 años es <5 %, la menor de todos los tumores malignos [2-3]. Sin embargo, datos recientes han demostrado que los resultados pueden mejorarse drásticamente por detección temprana cuando el cáncer está aun predominantemente en la fase I, como se ilustra mediante una supervivencia de 5 años del 30-60 % (tumor de un tamaño < 20 mm) e incluso >75 % (tumor de tamaño <10 mm), después de resección de PaC temprana [2-4].

El PaC se caracteriza por una rápida progresión tumoral, metastasización temprana e insensibilidad a las terapias más convencionales [1 , 5]. El mal pronóstico se debe principalmente a la ausencia de diagnósticos tempranos eficaces combinado con el que los síntomas clínicos específicos de la enfermedad se producen tarde en el transcurso de la enfermedad. En el momento del diagnóstico, a menudo el tumor ha alcanzado un tamaño de 30-40 mm y la mayoría de los pacientes (52 %) ya tienen metástasis, el 26 % cáncer localmente avanzado, y solamente el 7 % tienen tumores confinados al páncreas [2, 4]. En este momento, aproximadamente el 15 % de los pacientes aún puede operarse, pero su supervivencia media solo es de 20 meses.

Para el diagnóstico del PaC se usan diversas metodologías no invasivas, incluyendo ultrasonidos (endoscópico), tomografía computerizada y/o colangiopancreatografía retrógrada endoscópica [1-2, 6]. Aunque potentes, estos procedimientos no son específicos para el PaC y no están diseñados para la detección temprana cuando el tumor es aún pequeño y posiblemente curable. La situación también se complica por el hecho de que el PaC es difícil de diferenciar de afecciones benignas, tales como pancreatitis crónica, usando las herramientas de diagnóstico actualmente disponibles [2]. Por tanto, el uso de biomarcadores para la detección específica y temprana del PaC podría ser de beneficio clínico incalculable.

A pesar de los grandes esfuerzos realizados, las identificaciones genéticas moleculares asociadas con PaC, en particular, de suero bruto, no fraccionado y plasma, continúan sin descifrarse [2, 7-9]. Entre el número de biomarcadores principalmente sencillos que se han descrito hasta ahora, incluyendo, por ejemplo, CRP, CA 242, GDF-15, haptoglobina, M2-piruvato quinasa, amiloide A sérico, IGFBP-1 , ninguno ha demostrado ser clínicamente superior al CA 19-9 [2, 8-10]. No obstante, el uso del CA 19-9 está significativamente complicado por el hecho de que se ha descubierto que i) está elevado en afecciones no malignas (por ejemplo, pancreatitis y colangitis aguda) y otros cánceres gastrointestinales (por ejemplo, cáncer gástrico y cáncer colorrectal) ii) carece de sensibilidad para el PaC precoz y iii) está ausente aproximadamente en el 10 % de la población [2, 8-10]. Cuando se realiza un cribado por el PaC, el CA 19-9 solo obtiene una sensibilidad (que varía del 69 % al 98 %) y una especificidad (del 46 % al 98 %) media [2, 9-11].

Contra este inconveniente, los inventores desarrollaron una estrategia proteómica para pronosticar diagnósticos de cáncer en el documento WO 2008/1 17067 mediante la cual se identificaron los primeros grupos de biomarcadores séricos para la detección de cáncer pancreático y para predecir la supervivencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Motivados por un reciente estudio, en el que se indicaba que la proteómica de afinidad [12-13] podría usarse para determinar identificaciones candidatas de biomarcadores séricos para el PaC [14], también se ha descifrado el proteoma sérico del PaC.

En este estudio, por primera vez se han prevalidado identificaciones de biomarcadores séricos formando complejos múltiples para el diagnóstico de PaC, lo que demuestra que la información de diagnóstico podría extraerse a partir de muestras sanguíneas sin procesar, que presentan alta especificidad y sensibilidad. Esto proporciona un mejor diagnóstico, y por tanto mejor pronóstico, del PaC, aportando un valor clínico significativamente añadido, así como el esclarecimiento adicional sobre la biología compleja, subyacente, de la enfermedad.

Por consiguiente, un primer aspecto de la invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo que comprende o consiste en las etapas de: a) proporcionar una muestra a ensayar del individuo; b) determinar una firma biomarcadora de la muestra de ensayo midiendo, en la muestra de ensayo, la expresión de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la Tabla III; en el que la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la Tabla III es indicativa del individuo que tiene cáncer pancreático.

Por "muestra a ensayar", "muestra de ensayo" o "muestra de control", se incluyen muestras tisulares, de proteoma y/o expresoma líquidas de un individuo en el que realizar el ensayo o de un individuo control, según sea apropiado.

Por "expresión" se entiende el nivel o la cantidad de un producto génico tal como ARNm o proteína.

Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos de detección y/o medición de la concentración de proteínas y/o ácidos nucleicos, véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001 , Cold Spring Hárbor Laboratory Press.

Por "biomarcador" se entiende una molécula biológica de origen natural, o componente o fragmento de la misma, cuya medición puede proporcionar información útil en el pronóstico de cáncer pancreático. Por ejemplo, el biomarcador puede ser una proteína o un resto carbohidrato de origen natural, o un componente antigénico o fragmento de los mismos.

En una realización, el procedimiento comprende o consiste en las etapas (a) y (b) y en las etapas adicionales de: c) proporcionar una muestra de control de un individuo que no padece cáncer pancreático (es decir, un control negativo); d) determinar una identificación biomarcadora de la muestra de control midiendo la expresión en la muestra de control de uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b); en el que la presencia de cáncer pancreático se identifica en el caso en el que la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b) sea diferente de la expresión en la muestra de control de uno o más biomarcadores medidos en la etapa (d) En otra realización el procedimiento comprende o consiste en las etapas (a), (b), (c) y (d) y en las etapas adicionales de: e) proporcionar una muestra de control de un individuo que padece cáncer pancreático (es decir, un control positivo); f) determinar una identificación biomarcadora de la muestra de control midiendo la expresión en la muestra de control de uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b); en el que la presencia de cáncer pancreático se identifica en el caso en el que la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b) corresponde a la expresión en la muestra control de uno o más biomarcadores medidos en la etapa (f).

Por "corresponde a la expresión en la muestra de control" se incluye que la expresión de uno o más biomarcadores en la muestra a ensayar es la misma que o similar a la expresión de uno o más biomarcadores de la muestra de control positivo. Preferentemente la expresión de uno o más biomarcadores en la muestra a ensayar es idéntica a la expresión de uno o más biomarcadores de la muestra de control positivo.

La expresión diferencial (regulación positiva o regulación negativa) de biomarcadores, o su ausencia, puede determinarse mediante cualquier medio adecuado conocido por un experto en la técnica. La expresión diferencial se determina frente a un valor p de al menos menor de 0,05 (p = < 0,05), por ejemplo al menos <0,04, <0,03, <0,02, <0,01 , <0,009, <0,005, <0,001 , <0,0001 , <0,00001 o al menos <0, 000001. Preferentemente, la expresión diferencial se determina usando una máquina de soporte vectorial (SVM, Support Vector Machine). Preferentemente, la SVM es una SVM como se describe más adelante. Más preferentemente, la SVM es la SVM descrita más adelante en la Tabla V(A).

Los expertos en la técnica apreciarán que la expresión diferencial puede relacionarse con un solo biomarcador o con múltiples biomarcadores considerados en combinación (es decir, como una identificación biomarcadora). Por tanto, un valor p puede asociarse con un solo biomarcador o con un grupo de biomarcadores. De hecho, cuando las proteínas que tienen un valor p de expresión diferencial mayor de 0,05 se consideran individualmente, pueden sin embargo ser útiles como biomarcadores de acuerdo con la invención cuando sus niveles de expresión se consideran en combinación con uno o más biomarcadores distintos.

En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de uno o más de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A), por ejemplo, al menos 2 de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A).

Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, la expresión de determinadas proteínas en una muestra de ensayo de sangre, suero o plasma puede ser indicativa de cáncer pancreático en un individuo. Por ejemplo, la expresión relativa de determinadas proteínas séricas en una sola muestra de ensayo puede ser indicativa de la presencia de cáncer pancreático en un individuo.

Preferentemente, el individuo es un ser humano. Sin embargo, el individuo en el que realizar el ensayo puede ser cualquier mamífero, tal como un mamífero doméstico (preferentemente de significado agrícola o comercial, incluyendo un caballo, cerdo, vaca, oveja, perro y gato).

Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de interleucina-7 (IL-7) y/o integrina alfa-10, por ejemplo medir la expresión de interleucina-7, medir la expresión de integrina alfa-10 o medir la expresión de interleucina-7 e integrina alfa-10. Más preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de cada uno de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A).

En una realización la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(B). Por tanto, la etapa (b) comprende o consiste preferentemente en medir la expresión de todos los biomarcadores indicados en la Tabla IV(B).

En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32 o 33 de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(C). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de todos los biomarcadores indicados en la Tabla IV(C).

Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de la muestra de ensayo de todos los biomarcadores definidos en la Tabla IV.

En una realización, el procedimiento es para diferenciar entre cáncer pancreático (PaC) y otra patología.

Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A). Preferentemente, la etapa (b) también comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B). También se prefiere que la etapa (b) comprenda o consista en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4 o 5 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D), por ejemplo al menos, 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5 o 6 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), Tabla V(B), Tabla V(C), Tabla V(D) y/o Tabla V(F).

Por "diferenciación entre cáncer pancreático (PaC) y otra patología" se incluye la diferenciación entre PaC y cualquier otra afección, incluyendo un estado de salud.

En una realización, la otra patología o patologías es pancreatitis crónica (ChP), pancreatitis inflamatoria aguda (AIP) y/o normal, por ejemplo, la otra patología o patologías puede ser solamente pancreatitis crónica; solamente pancreatitis inflamatoria aguda; pancreatitis crónica y pancreatitis inflamatoria aguda; pancreatitis crónica y normal; pancreatitis inflamatoria aguda y normal, o pancreatitis crónica, pancreatitis inflamatoria aguda y normal.

Cuando se hace referencia a una patología "normal" se incluyen individuos que no padecen pancreatitis crónica (ChP) o pancreatitis inflamatoria aguda (AIP). Preferentemente los individuos no padecen ninguna enfermedad o trastorno pancreático. Más preferentemente, los individuos son individuos sanos, es decir, no padecen ninguna enfermedad o trastorno.

En otra realización, el procedimiento es para diferenciar entre cáncer pancreático y pancreatitis crónica (ChP). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A). La etapa (b) puede comprender o consistir en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4 o 5 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C). La etapa (b) puede comprender o consistir en medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A) y/o Tabla V(C).

En una realización adicional/alternativa, el procedimiento es para diferenciar entre cáncer pancreático y pancreatitis inflamatoria aguda (AlP) y la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B). La etapa (b) puede comprender o consistir en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4 o 5 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(E). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5 o 6 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(H), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(H). Por tanto, la etapa (b) comprende o consiste preferentemente en medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), Tabla V(B), Tabla V(C), Tabla V(E), Tabla V(F) y/o Tabla IV(H).

En una realización, el procedimiento es para diferencia entre cáncer pancreático y normal (N). Para una definición de patología "normal", véase la definición indicada anteriormente. Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B). Preferentemente, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D). En el que, preferentemente la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(E). También se prefiere que la etapa (b) comprenda o consista en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(G), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(G). Por tanto, la etapa (b) puede comprender o consistir en medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), Tabla V(B), Tabla V(D), Tabla V(E) y/o Tabla IV(G).

En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-3. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Integrina a-10. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Mucina-1. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de C1s. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de MCP-3. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Angiomotina. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de BTK. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de C1q. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión del ligando CD40. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de GM-CSF. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IgM. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-11. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-16. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-1-ra. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-1a. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-1 ß. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-2. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-7. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-9. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de INF-?. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Integrina a-11. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de JAK3. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Leptina. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Lewis y. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de MCP-4. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Procatepsina W. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Properdina. En una realización aún adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de PSA. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de RANTES. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Sialyl Lewis x. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión del péptido TM. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de TNF-a. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de C4. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de ß-galactosidasa.

En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-12. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de TGF-ß?. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de VEGF. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-8. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de C3. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IFN-?. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-10. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL- 3. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-18. En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-6. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Lewis x. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de Eotaxina. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión del inhibidor de C1 esterasa. En otra realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de MCP- . En otra realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de TNF-ß. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de GLP-1. En una realización, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-5. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de IL-4. En una realización aún adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión del Factor B. En otra realización, la etapa (b) compjende o consiste en medir la expresión de C5. En una realización adicional, la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de CD40.

En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-3. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Integrina a-10. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Mucina-1. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de C1 s. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de MCP-3. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Angiomotina. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de BTK. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de C1 q. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión del ligando CD40. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de GM-CSF. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IgM. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-1 1 . En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-16. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-1 -ra. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-1 a. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-? ß. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-2. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-7. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-9. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de INF-?. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Integrina ot-1 1 . En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de JAK3. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Leptina. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Lewis y. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de MCP-4. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Procatepsina W. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Properdina. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de PSA. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de RANTES. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Sialyl Lewis x. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión del péptido TM. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de TNF-a. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de C4. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de ß-galactosidasa.

En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-12. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de TGF-ß . En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de VEGF. En una realización más adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-8. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de C3. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IFN-?. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-10. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-13. En una realización aún adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-18. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-6. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Lewis x. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de Eotaxina. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión del inhibidor de C1 estearasa. En otra realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de MCP-1. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de TNF-ß. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de GLP-1. En una realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-5. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de IL-4. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión del Factor B. En otra realización, la etapa (b) no comprende medir la expresión de C5. En una realización adicional, la etapa (b) no comprende medir la expresión de CD40.

La expresión "péptido T " se refiere a un péptido derivado de una proteína 10TM por la que tiene especificidad la siguiente construcción de anticuerpo scFv de la SEC ID N°: 1 (en la que las secuencias CDR se indican en negrita, en cursiva): MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSVGFHlA'VRQAPGKGLEvWSL/SM DGGSTYY ¾DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA\A C \RG7WFDPWGQG TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQR ISCSGSSSW/G/VAM VA/WYQQLPGTAPKLLIY/?WWQ ?PSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC AAWDDSLSWVF GGGTKLTVLG [SEC ID N°: 1] Por tanto, para unirse a la proteína 10TM, puede usarse este anticuerpo scFv o cualquier otro anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, que compita con este scFv. Por ejemplo, el anticuerpo, o su fragmento de unión, puede comprender las mismas CDR que las presentes en la SEC ID N°: 1.

Los expertos en la técnica apreciarán que dicho anticuerpo pude producirse con una etiqueta de afinidad {por ejemplo, en el extremo C) con fines de purificación. Por ejemplo, puede usarse una etiqueta de afinidad de la siguiente SEC ID N°: 2: DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAAHHHHHH [SEC ID N°: 2] En una realización, se identifica la presencia de cáncer pancreático en el caso en el que la expresión en la muestra de ensayo de IL-3, Integrina a-10, Mucina-1 , C1s, GLP-1 R, MCP-3, Angiomotina, BTK, ligando CD40, GM-CSF, IgM, IL-11 , IL-16, IL-1-ra, IL-1a, IL-? ß, IL-2, IL-7, IL-9, INF-?, Integrina a-1 1 , JAK3, Leptina, Lewis y, MCP-4, Procatepsina W, PSA, RANTES, Sialyl Lewis x, péptido TM, TNF-a, C4, ß-galactosidasa, IL-12, TGF-ß? , VEGF, IL-8, C3, IFN-?, IL-10, IL-13, IL-18, IL-6, Lewis x, Eotaxina, inhibidor de C1 estearasa, MCP-1 , TNF-ß, GLP-1 , IL-5, IL-4, Factor B, C5 y/o CD40 se regule positivamente en comparación con el control (o controles) negativo y/o se corresponda con la expresión del control (o controles) positivo.

En otra realización, la presencia de cáncer pancreático se define en el caso en el que la expresión en la muestra de ensayo de C1q y/o Properdina se regule negativamente en comparación con el control (o controles) negativo y/o se corresponda con la expresión del control (o controles) positivo. Generalmente, el diagnóstico se realiza con un ABC ROC de al menos 0,55, por ejemplo con al menos un ABC ROC de al menos 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 o con un ABC ROC de 1 ,00. Preferentemente, el diagnóstico se realiza con un ABC ROC de al menos 0,85, y más preferentemente con una ABC ROC de 1.

Normalmente, el diagnóstico se realiza usando una máquina de soporte vectorial (SVM), como las disponibles en http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html (por ejemplo e1071 1.5-24). Sin embargo, también puede usarse cualquier otro medio adecuado.

Las máquinas de soporte vectorial (SVM) son una serie de procedimientos de aprendizaje supervisado relacionados usados para la clasificación y regresión. Dada una serie de ejemplos de entrenamiento, marcado cada uno de ellos como perteneciente a una de dos categorías, un algoritmo de entrenamiento de SVM crea un modelo que predice si un nuevo ejemplo se encuentra dentro de una u otra categoría. De manera intuitiva, un modelo SVM es una representación de los ejemplos como puntos en el espacio, cartografiados de tal manera que los ejemplos de las distintas categorías quedan divididos por un intervalo vacío que es tan amplio como sea posible. Después, en el mapa se trazan nuevos ejemplos en el mismo espacio y se predice que pertenecen a una categoría basándose en el lado del intervalo en el que se encuentran.

Más formalmente, una máquina de soporte vectorial construye un hiperplano o conjunto de hiperplanos en un espacio dimensional grande o infinito, que puede usarse para clasificación, regresión u otros cometidos. De manera intuitiva, mediante el hiperplano se consigue una buena separación ya que tiene la mayor distancia a los puntos de datos de entrenamiento más cercanos de cualquier clase (denominado margen funcional) dado que, en general, cuanto mayor es el margen, menor es el error de generalización del clasificador. Para más información sobre las SVM, véase, por ejemplo, Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-167.

En una realización de la invención, la SVM se 'entrena' antes de analizar los procedimientos de la invención usando perfiles biomarcadores de individuos con patologías conocidas (por ejemplo, individuos que se sabe que padecen cáncer pancreático, individuos que se sabe que padecen pancreatitis inflamatoria aguda, individuos que se sabe que padecen pancreatitis crónica o individuos que se sabe que están sanos). Analizando dichos ejemplos de entrenamiento, la SVM puede aprender qué perfiles biomarcadores están asociados con el cáncer pancreático. Después, una vez completado el proceso de entrenamiento, la SVM puede indicar si la muestra con biomarcador ensayada procede o no de un individuo con cáncer pancreático.

Sin embargo, este procedimiento de entrenamiento puede evitarse reprogramando la SVM con los parámetros de entrenamiento necesarios. Por ejemplo, pueden realizarse diagnósticos de acuerdo con los parámetros SVM conocidos usando el algoritmo SVM detallado en la Tabla V, basado en la medición de cualquiera o de todos los biomarcadores indicados en la Tabla III o Tabla IV.

Los expertos en la técnica apreciarán que los parámetros SVM adecuados pueden determinarse para cualquier combinación de los biomarcadores indicados en la Tabla III o Tabla IV entrenando una máquina SVM con la selección de datos apropiados (es decir mediciones de biomarcador de individuos con estado de cáncer pancreático conocido).

Preferentemente, el procedimiento de la invención tiene una precisión de al menos el 60 %, por ejemplo una precisión del 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

Preferentemente, el procedimiento de la invención tiene una sensibilidad de al menos el 60 %, por ejemplo, una sensibilidad del 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

Preferentemente, el procedimiento de la invención tiene una especificidad de al menos el 60 %, por ejemplo, una especificidad del 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

Por "precisión" se entiende la proporción de resultados correctos de un procedimiento, por "sensibilidad" se entiende la proporción de todas las muestras positivas a PaC que están correctamente clasificadas como positivas y por especificidad se entiende la proporción de todas las muestras negativas PaC que se clasifican correctamente como negativas.

En una realización, el individuo no afectado por cáncer pancreático no está afectado por cáncer pancreático (PaC), pancreatitis crónica (ChP) o pancreatitis inflamatoria aguda (AIP). Más preferentemente, el individuo sano no está afectado por ninguna enfermedad o patología pancreática. Incluso más preferentemente, el individuo no afectado con cáncer pancreático no está afectado por ninguna enfermedad o patología. Más preferentemente, el individuo no afectado con cáncer pancreático es un individuo sano. Individuo sano es aquel considerado por un experto en la técnica como físicamente sano y exento de patología.

Sin embargo, en otra realización el individuo no afectado por cáncer pancreático está afectado por pancreatitis crónica. En otra realización adicional el individuo no afectado por cáncer pancreático está afectado por pancreatitis inflamatoria aguda.

Como se ha mencionado anteriormente el procedimiento presente es para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo. En una realización el cáncer pancreático se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma hepatoideo, carcinoma coloidal, carcinoma no diferenciado y carcinomas indiferenciados con células gigantes como osteoclastos. Preferentemente, el cáncer pancreático es un adenocarcinoma pancreático. Más preferentemente, el cáncer pancreático es adenocarcinoma ductal pancreático también conocido como cáncer pancreático exocrino.

En una realización adicional, la etapa (b), (d) y/o la etapa (f) se realizan usando un primer agente de unión capaz de unirse a uno o más biomarcadores. Los expertos en la técnica apreciarán que el primer agente de unión puede comprender o consistir en una sola especie con especificidad para una de los biomarcadores de proteína una pluralidad de diferentes especies, cada uno con especificidad para un biomarcador de proteína diferente.

Los agentes de unión adecuados (denominados también moléculas de unión) pueden seleccionarse de una biblioteca, basándose en su capacidad de unirse a un motivo determinado, como se analizará más adelante.

Al menos un tipo de los agentes de unión y más particularmente todos los tipos puede comprender o consistir en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una variante de los mismos.

Los procedimientos para la producción y uso de anticuerpos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo véase Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Harlow & Lañe, Cold Spring Harbor Press, ISBN-13: 978-0879693145, Using Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Harlow & Lañe, Cold Spring Harbor Press, ISBN-13: 978-0879695446 and Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, 2006, Howard & Kaser, CRC Press, ISBN-13: 978-0849335280 (cuya descripción se incorpora en el presente documento por referencia).

Por tanto, un fragmento puede contener uno o más de los dominios pesados variables (VH) o ligeros variables (VL). Por ejemplo, la expresión fragmento de anticuerpo incluye moléculas de tipo Fab (Better y col (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra y col (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv monocatenarias (ScFv) en las que los dominios afines VH y VL están unidos mediante un oligopéptido flexible (Bird y col (1988) Science 242, 423; Huston y col (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879) y los anticuerpos de dominio sencillo (dAbs) comprenden dominios V aislados (Ward y col (1989) Nature 341 , 544).

La expresión "variante de anticuerpo" incluye cualquier anticuerpo sintético, anticuerpos recombinantes o híbridos de anticuerpos, tales como pero sin limitación una molécula de anticuerpo monocatenaria producidas por expresión en fago de una región constante y/o variable de cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno en un formato de inmunoensayo que se conoce por los expertos en la técnica.

Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que conservan sus sitios de unión específicos se encuentra en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Bibliotecas moleculares tales como bibliotecas de anticuerpos (Clackson y col, 1991 , Nature 352, 624-628; Marks y col, 1991 , J Mol Biol 222(3): 581-97), bibliotecas peptídicas (Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), bibliotecas de ADNc expresadas (Santi y col (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), bibliotecas de otros armazones en lugar del armazón de anticuerpos tal como afibodies (Gunneriusson y col, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40) o bibliotecas basadas en aptámeros (Kenan y col, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31) pueden usarse como una fuente a partir de las cuales las moléculas de unión que son específicas para un motivo determinado se seleccionan para su uso en los procedimientos de la invención.

Las bibliotecas moleculares pueden expresarse in vivo en células procariotas (Clackson y col, 1991 , op. cit; Marks y col, 1991 , op. cit.) o eucariotas (Kieke y col, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96(10):5651-6) o pueden expresarse in vitro sin implicación de células (Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Nati Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto y col, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).

En los casos en los que se usan bibliotecas basadas en proteínas, a menudo los genes que codifican las bibliotecas de posibles moléculas de unión están envueltos en virus y la posible molécula de unión está presente en la superficie del virus (Clackson y col, 1991 , op. cit.; Marks y col, 1991 , op. cit; Smith, 1985, op. cit.).

El sistema más comúnmente usado hoy en día es la expresión de fragmentos de anticuerpos en la superficie de bacteriófagos filamentosos, donde los fragmentos de anticuerpo se expresan como una fusión en la proteína de envoltura menor del bacteriófago (Clackson y col, 1991 , op. cit; Marks y col, 1991 , op. cit). Sin embargo, también se han usado otros sistemas de expresión que usan otros virus (EP 39578), bacterias (Gunneriusson y col, 1999, op. cit; Daugherty y col, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty y col, 1999, Protein Eng 12(7):613-21) y levaduras (Shusta y col, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56).

Además, los sistemas de expresión se han desarrollado usando la unión del producto polipeptídico a su ARNm codificante en el denominado sistema de expresión en ribosomas (Hanes & Pluckthun, 1997, op. cit; He & Taussig, 1997, op. cit; Nemoto y col, 1997, op. cit), o como alternativa la asociación del producto polipeptídico con el ADN codificante (véase la Patente de Estados Unidos N° 5.856.090 y el documento WO 98/37186).

Cuando se seleccionan posibles moléculas de unión a partir de bibliotecas, uno o algunos péptidos de selección que tienen motivos definidos se emplean normalmente. Los restos de aminoácidos que proporcionan estructura, disminuyen flexibilidad en el péptido o tienen cadenas laterales cargadas polares o hidrófobas permiten la interacción con la molécula de unión pueden usarse en el diseño de motivos para péptidos selectores.

Por ejemplo: (i) La prolina puede estabilizar una estructura peptídica ya que su cadena lateral está unida tanto al carbono alfa como al nitrógeno; (ii) La fenilamina, la tirosina y el triptófano tienen cadenas laterales aromáticas y son muy hidrófobas mientras que la leucina y la isoleucina tienen cadenas laterales alifáticas y también son hidrófobas; (iii) La lisina, arginina e histidina tienen cadenas laterales básicas y estarán positivamente cargadas a pH neutro, mientras que el aspartato y el glutamato tienen cadenas laterales ácidas y estarán cargados negativamente a pH neutro; (iv) La asparagina y la glutamina son neutras a pH neutro pero contienen un grupo amida que puede participar en enlaces hidrógeno; (v) La serina, treonina y tirosina tienen cadenas laterales que contienen grupos hidroxilo que pueden participar en enlaces de hidrógeno.

Normalmente, la selección de agentes de unión puede implicar el uso de tecnologías de micromatriz y sistemas para analizar la unión a spots que corresponden a tipos de moléculas de unión.

En una realización, el primer agente (o agentes) de unión es/son inmovilizados en una superficie (por ejemplo en una placa multipocillo o micromatriz).

Los dominios ligeros variables (V|_) y pesado variable (VH) del anticuerpo están implicados en el reconocimiento antigénico, un hecho que fue reconocido en primer lugar en experimentos de digestión con proteasa temprana. Otra confirmación se encontró por la "humanización" de anticuerpos de roedores. Los dominios variables de origen roedor pueden fusionarse a dominios constantes de origen humano de tal manera que el anticuerpo resultante conserve la especificidad antigénica del anticuerpo emparentado con el roedor (Morrison y col. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 , 6851-6855).

Que la especificidad antigénica está conferida por dominios variables y es independiente de los dominios constantes se conoce de experimentos que implican la expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpo, todos conteniendo uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas de tipo Fab (Better y col (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra y col (1988) Science 240, 1038); moléculas monocatenarias Fv (ScFv), en el que los dominios afines VH y VL están unidos mediante un oligopéptido flexible (Bird y col (1988) Science 242, 423; Huston y col (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos de dominio sencillo (dAbs) que comprenden dominios V aislados (Ward y col (1989) Nature 341 , 544). Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que conservan sus sitios de unión específicos se encuentran Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Por "moléculas ScFv" se refiere a moléculas en las que los dominios afines VH y VL están unidos mediante un oligopéptido flexible.

Las ventajas de usar fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos, son varias. El menor tamaño de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas, tales como una mejor penetración de tejidos sólidos. Las funciones efectoras de anticuerpos completos tales como unión al complemento se eliminan. Los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Los anticuerpos completos, y fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalente" se refiere a que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab')2 tienen dosis sitios de combinación a antígeno. A diferencia, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, que solo tienen un sitio de unión de combinación al antígeno.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales adecuados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, por ejemplo las desveladas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) and in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982), ambas incorporadas en el presente documento por referencia.

En una realización, el primer agente de unión inmovilizado sobre una superficie (por ejemplo una placa multipocillo o micromatriz).

Los dominios variable pesado (VH) y variable ligero (VL) del anticuerpo están implicados en el reconocimiento antigénico, un hecho que primero está reconocido por experimentos de digestión en proteasa temprana. Confirmación adicional se encontró por humanización de anticuerpos de roedores. Los dominios variables de origen de roedor pueden fusionarse a dominios constantes de origen humano de tal manera que el anticuerpo resultante conserve la especificidad antigénica del anticuerpo emparentado roedor (Morrison y col ( 1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 , 6851-6855).

Que la especificidad antigénica está conferida por dominios variables es independiente de los dominios constantes se sabe a partir de experimentos que implican la expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpo, conteniendo todos uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas de tipo Fab (Better y col (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra y col (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv monocatenarias (ScFv) en la que los dominios afines VH y V|_ están unidos mediante un oligopéptido flexible (Bird y col (1988) Science 242, 423; Huston y col (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos de un solo dominio (dAbs) que comprende dominios V aislados (Ward y col (1989) Nature 341 , 544). Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que conservan sus sitios de especificidad de unión se encuentran en Winter & Milstein (1991 ) Nature 349, 293-299.

Por "moléculas ScFv" se refiere a moléculas en las que los dominios afines VH y VL están unidos mediante un oligopéptido flexible.

Las ventajas de usar fragmentos de anticuerpo en lugar de anticuerpos completos son diversas. El menor tamaño de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas tal como una mejor penetración de tejidos sólidos. Las funciones efectoras de los anticuerpos completos tal como unión del complemento se eliminan. Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse y secretarse a partir de £ coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Los anticuerpos completos y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalente" significa que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab')2 tienen dos sitios de combinación a antígeno. Por otro lado, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, que solo tienen un sitio de combinación al antígeno.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales adecuados pueden prepararse por técnicas conocidas, por ejemplo las descritas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) and in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982), ambas de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia.

Por tanto, el primer agente de unión puede comprender o consistir en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Preferentemente el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede seleccionarse del grupo que consiste en: scFv, Fab y un dominio de unión de una molécula de inmunoglobulina.

Preferentemente, el primer agente de unión está inmovilizado sobre una superficie.

El uno o más marcadores en una muestra de ensayo puede marcarse con un resto de detección.

Por un "resto de detección" se incluye el significado de que el resto es uno que puede detectarse y determinarse la cantidad relativa y/o localización del resto (por ejemplo, la localización en una micromatriz).

Los restos detectables adecuados se conocen en la técnica.

Por tanto, el resto detectable puede ser un resto fluorescente y/o luminiscente y/o quimioluminiscente que, cuando se expone a condiciones específicas, puede detectarse. Por ejemplo, puede ser necesario exponer un resto fluorescente a radiación (es decir luz) a una longitud de onda específica e intensidad para producir la exposición del resto fluorescente, permitiendo por lo tanto que emita fluorescencia detectable a una longitud de onda específica que puede detectarse.

Como alternativa, el resto detectable puede ser una enzima que puede convertir un sustrato (preferentemente no detectable) en un producto detectable que puede visualizarse y/o detectarse. Ejemplos de enzimas adecuadas se analizan con más detalle más adelante en relación a, por ejemplo, ensayos ELISA.

Como alternativa, el resto detectable puede ser un átomo radioactivo que es útil en la formación de imágenes. Los átomos radiactivos adecuados incluyen 99mTc y 123l para estudios escintigráficos. Otros restos fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, etiquetas de espín para formación de imágenes por resonancia magnética (IMR) tales como 23l de nuevo, 131l, 1 1ln, 19F, 13C, 15N, 17O, gadolinio, manganeso o hierro. Claramente, el agente a detectar (tal como, por ejemplo, uno o más biomarcadores en la muestra de ensayo y/o muestra de control descrita en el presente documento y/o una molécula de anticuerpo para su uso en la detección de una proteína seleccionada) puede tener suficientes isótopos atómicos apropiados para el resto detectable a detectar fácilmente.

Las radioetiquetas u otras etiquetas pueden incorporarse a los agentes de la invención (es decir las proteínas presentes en las muestras de los procedimientos de la invención y/o los agentes de unión de la invención) de maneras conocidas. Por ejemplo, si el resto de unión es un polipéptido, este puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas tales como 99mTc, 123l, 186Rh, 188Rh y 111 ln pueden por ejemplo unirse mediante restos de cisteína en el resto de unión. El ltrio-90 puede unirse mediante un resto de lisina. El procedimiento IODOGEN (Fraker y col (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) puede usarse para incorporar 123l. La referencia (" onoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe otros procedimientos con detalle. Procedimientos para conjugar otros restos detectables (tales como restos enzimáticos, fluorescentes, luminiscentes, quimioluminiscentes o reactivos) a proteínas son bien conocidos en la técnica.

Preferentemente, uno o más biomarcadores en la muestra (o muestras) control se marcan con un resto detectable. El resto detectable puede seleccionarse del grupo que consiste en: un resto fluorescente; un resto luminiscente, un resto quimioluminiscente, un resto radiactivo; un resto enzimático. Sin embargo, se prefiere que el resto detectable sea biotina.

En una realización adicional, la etapa (b), (d) y/o la etapa (f) se realizan usando un ensayo que comprende un segundo agente de unión capaz de unirse a uno o más biomarcadores, comprendiendo el segundo agente de unión un resto detectable. Preferentemente, el segundo agente de unión comprende o consiste en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo recombinante o fragmento de unión a antígeno del mismo. Más preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en: scFv, Fab y un dominio de unión de una molécula de inmunoglobulina. En una realización, el resto detectable se selecciona del grupo que consiste en: un resto fluorescente; un resto luminiscente; un resto quimioluminiscente; un resto radiactivo y un resto enzimático. Preferentemente, el resto detectable es un resto fluorescente (por ejemplo un colorante Fluor Alexa por ejemplo Alexa647).

En una realización, el procedimiento del primer aspecto de la invención comprende o consiste en un ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción ).

Los ensayos preferidos para detectar proteína en suero o plasmáticas incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayos inmunoradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos en sándwich usando anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Ensayos en sándwich ilustrativos se describen por David y col en las Patentes de Estados Unidos N° 4.376.1 10 y 4.486.530, incorporadas por el presente en este documento por referencia. La tinción de anticuerpo de células sobre portaobjetos puede usarse en procedimientos bien conocidos en ensayos de diagnóstico de laboratorio de citología así también conocidos por los expertos en la técnica.

Normalmente, el ensayo es un ensayo ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción) que normalmente implica el uso de enzimas que proporcionan un producto de reacción coloreado, normalmente en ensayos de fase sólida. Los ensayos tales como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa se han empleado ampliamente. Una forma de amplificar la reacción fosfatasa es usar NADP como sustrato para generar NAD que actúa ahora como una coenzima para un segundo sistema enzimático. La pirofosfatasa de Escherichia coli proporciona un buen conjugado porque la enzima no está presente en tejidos, es estable y proporciona un buen color de reacción. Los sistemas quimioluminiscentes basados en enzimas tales como luciferasa también pueden usarse.

Los procedimientos ELISA se conocen bien en la técnica como, por ejemplo véase The ELISA Guidebook (Methods in Molecular Biology), 2000, Crowther, Humana Press, ISBN-13: 978-0896037281 (cuyas descripciones se incorporan en el presente documento por referencia).

La conjugación con la vitamina biotina se usa frecuentemente ya que puede detectarse fácilmente mediante su reacción con avidina o estreptavidina unida a enzimas a la cual esta se une con una gran especificidad y afinidad.

Sin embargo, la etapa (b), (d) y/o la etapa (f) se realizan alternativamente usando una matriz. Las micromatrices por sí mismas son bien conocidas en la técnica. Normalmente están formadas por una estructura lineal o bidimensional que tiene regiones separadas (es decir individuales) ("spots"), cada una teniendo un área finita formada sobre la superficie de un soporte sólido. Una matriz también puede ser una estructura en forma de perla en la que cada perla puede identificarse mediante un código molecular o un código de color e identificarse en un flujo continuo. El análisis también puede realizarse secuencialmente cuando la muestra se pasa sobre una serie de spot cada una absorbiendo la clase de moléculas a partir de la solución. El soporte sólido es normalmente vidrio o un polímero, siendo lo más comúnmente usado polímeros de celulosa, poliacrilamida de nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos, chips de silicio, microplacas, membranas de polivinilideno difluoruro (PVDF), membrana de nitrocelulosa, membrana de nylon, otras membranas porosas, membranas no porosas (por ejemplo, plástico, polímero, perspex, silicona, entre otras) una pluralidad de pines poliméricos o una pluralidad de pocilios de microtitulación o cualquier otra superficie adecuada para inmunizar proteínas, polinucleótidos y otras moléculas adecuadas y/o realizar un inmunoensayo. Los procesos de unión son bien conocidos en la técnica y generalmente consisten en entrecruzar la unión covalentemente o adsorber físicamente una molécula de proteína, polinucleótido o similar al soporte sólido. Usando técnicas bien conocidas tales como impresión por contacto o sin contacto, enmascaramiento o fotolitografía, la localización de cada mancha puede definirse. Para una revisión véase Jenkins, R. E., Pennington, S. R. (2001 , Proteomics, 2,13-29) y Lal y col (2002, Drug Discov Today 15; 7(18 Suppl):S143-9).

Normalmente la matriz es una micromatriz. Por "micromatriz" se incluye el significado de una matriz de regiones que tienen una densidad de regiones individuales de al menos aproximadamente 100/cm2, y preferentemente al menos aproximadamente 1000/cm2. Las regiones de una micromatriz tienen dimensiones típicas, por ejemplo diámetros, en el intervalo de entre aproximadamente 10-250 µ?? y están separadas de otras regiones de la matriz en aproximadamente la misma distancia. La matriz también puede ser una micromatriz o una nanomatriz.

Una vez identificadas las moléculas de unión adecuadas (indicadas anteriormente) y aisladas, el experto en la técnica puede preparar una matriz usando procedimientos bien conocidos en la técnica de biología molecular.

Por tanto, la matriz puede ser una matriz basada en perlas o una matriz basada en superficie. Preferentemente, la matriz se selecciona del grupo que consiste en: macromatriz, micromatriz o nanomatriz.

En una realización, el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención comprende: (i) marcar biomarcadores presentes en la muestra con biotina; (ii) poner en contacto las proteínas marcadas con biotina con una matriz que comprenda una pluralidad de scFv inmovilizados en localizaciones individuales sobre su superficie, teniendo el scFv especificidad para una o más de las proteínas en la Tabla III; (iii) poner en contacto el scFv inmovilizado con un conjugado de estreptavidina que comprende un colorante fluorescente; y (¡v) detectar la presencia del colorante en localizaciones individuales en la superficie de la matriz en el que la expresión del colorante sobre la superficie de la matriz es indicativa de la expresión de un biomarcador de la Tabla III en la muestra.

En una realización alternativa, la etapa (b), (d) y/o (f) comprende medir la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más biomarcadores. Preferentemente la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc o una molécula de ARNm. Más preferentemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARNm.

Por tanto, la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (b), (d) y/o (f) puede realizarse usando un procedimiento seleccionado del grupo que comprende una hibridación de Southern, hibridación de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), nanomatriz, micromatriz, macromatriz, autorradiografía e hibridación in situ. Preferentemente, la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (b) se determina usando una micromatriz de ADN.

En una realización, la medición de la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (b), (d) y/o (f) se realiza usando uno o más restos de unión, cada uno individualmente capaz de unirse selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica uno de los biomarcadores identificados en la Tabla III.

En una realización adicional, cada uno del uno o más restos de unión comprende o consiste en una molécula de ácido nucleico. Por tanto, cada uno del uno o más restos de unión pueden comprender o consistir en ADN, ARN, PNA, LNA, GNA, TNA o PMO. Sin embargo, se prefiere que cada uno del uno o más restos de unión comprenda o consista en ADN.

Preferentemente, el uno o más restos de unión tienen una longitud de 5 a 100 nucleótidos. Más preferentemente, la una o más moléculas de ácido nucleico tienen una longitud de 15 a 35 nucleótidos. Más preferentemente aún, el resto de unión comprende un resto detectable.

En una realización adicional, el resto detectable puede seleccionarse del grupo que consiste en: un resto fluorescente; un resto luminiscente; un resto quimioluminiscente; un resto radioactivo (por ejemplo, un átomo radioactivo); y un resto enzimático. Preferentemente, el resto detectable comprende o consiste en un átomo radiactivo. El átomo radiactivo puede seleccionarse del grupo que comprende tecnecio-99m, yodo-123, yodo-125, yodo-131 , indio-1 1 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, fósforo-32, azufre-35, deuterio, tritio, renio-186, renio-188 e itrio-90.

Sin embargo, el resto detectable del resto de unión puede ser un resto fluorescente (por ejemplo un colorante Fluor Alex, por ejemplo Alexa647).

En una realización, la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, fluido tisular no fraccionado, tejido pancreático, jugo pancreático, bilis y orina. Preferentemente, la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) se selecciona del grupo que consiste en muestra plasma y suero no fraccionado. Más preferentemente, la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) es plasma. En otra realización preferida, la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) es suero.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona una matriz para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo que comprende uno o más agentes de unión como se define en el primer aspecto de la presente invención.

Las matrices adecuadas para su uso en los procedimientos de la invención se han analizado anteriormente.

Preferentemente el uno o más agentes de unión pueden unirse a todas las proteínas definidas en la Tabla III.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona el uso de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definidos en que el primer aspecto de la invención como un marcador diagnóstico para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo. Preferentemente, todas las proteínas definidas en la Tabla III se usan como marcadores de diagnóstico para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona un kit para determinar la presencia de cáncer pancreático que comprende: A) uno o más primeros agentes de unión de acuerdo con el primer aspecto de la invención o una matriz de acuerdo con el segundo aspecto de la invención; y B) instrucciones para realizar el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Como ejemplos no limitantes preferidos que representan determinados aspectos de la invención se describirán ahora con referencia a las siguientes tablas y figuras: Clasifiación de PaC frente a N La figura 1 (A) muestra una imagen escaneada de una micromatriz de anticuerpo hibridado con un suero PaC. En total, 160 sondas, incluyendo marcadores de posición y controles se imprimieron en ocho submatrices 20x8 por portaobjetos.

La figura 1 (B) muestra analitos en suero diferencialmente expresados (p<0,05) para PaC frente a N.

La figura 1 (C) muestra la curva ROC para PaC frente a N basándose en todos los anticuerpos, es decir usando datos no filtrados.

La figura 1 (D) muestra la clasificación de PaC frente a N, usando valores de predicción SVM basados en todos los anticuerpos, (manchas rojas PaC, manchas azules N). Los niveles de expresión relativos de los 20 analitos no redundantes principales diferencialmente expresados (p<0,02) se muestran en un mapa codificado por colores. Rojo - regulado positivamente, verde - regulado negativamente, negro -niveles iguales.

La figura 1 (E) muestra la validación de especificidad de anticuerpos scFv ilustrada para un analito expresado altamente diferencialmente (p=0,005), IL-6, usando una matriz de proteína humana 278.

La figura 1 (F) muestra la validación de especificidad de anticuerpos scFv ilustrada para un analito expresado modestamente diferenciado (p=0,04), IL-10 usando una matriz de proteína humana 278.

Prevalidación de firma biomarcadora para PaC frente a clasificación N La figura 2 (A) muestra la condensación de la firma biomarcadora para PaC frente a la clasificación N en la primera cohorte de pacientes usando un procedimiento LOO combinado con una estrategia de retroeliminación. Los valores ABC ROC observados se representaron gráficamente frente al número restante de anticuerpos.

La figura 2 (B) muestra los 18 analitos de la firma biomarcadora no redundantes condensados obtenidos a partir de la primera cohorte de pacientes.

La figura 2 (C) La primera cohorte de pacientes, se usó como conjunto de entrenamiento y el clasificador de rendimiento se ensayó después sobre un nuevo grupo de pacientes independiente, la segunda cohorte de pacientes La figura 2 (D) muestra la prevalidación de firma biomarcadora para PaC frente a la clasificación N ilustrada por la curva ROC obtenida a partir de clasificador del conjunto de ensayo.

Firmas biomarcadoras de suero candidatas que diferencian PaC y pancreatitis La figura 3 (A) muestra los analitos en suero diferencialmente expresados (p<0,05) para PaC frente a ChP, AIP o ChP+AIP+N, respectivamente.

La figura 3 (B) muestra las curvas ROC para PaC frente a ChP, AIP, o ChP+AIP+ clasificación N basándose en todos los anticuerpos, es decir usando datos no filtrados.

La figurfa 3 (c) muestra la validación de los datos de micromatriz de anticuerpos de analitos seleccionados usando una micromatriz de anticuerpos en sandwich de citocinas decaplexadas (MSD). Solo se muestran los datos para el único analito, IL-8, para el cual la mayoría de las señales observadas están por encima del límite inferior y el límite de detención inferior del ensayo MSD.

Prevalidación de una firma biomarcadora de suero candidata para diagnóstico de PaC.

La figura 4 (A) muestra la primera cohorte de pacientes, compuesta por PaC, N, ChP y AIP, se dividió en un conjunto de entrenamiento (dos tercios) y un conjunto de ensayo (un tercio).

La figura 4 (B) muestra la firma biomarcadora condensada en suero para los 25 analitos no redundantes obtenida a partir del conjunto de entrenamiento usando una estrategia de eliminación inversa.

La figura 4 (C) muestra la prevalidación de la firma biomarcadora de 25 analitos condensados para diagnóstico de PaC como se ilustra mediante la curva ROC obtenida para el clasificador de la etapa de ensayo.

La figura 4 (D) muestra la realización, expresada como valores ABC para ROC, de la firma biomarcadora condensada obtenida a partir de la estrategia de retroeliminación (línea en negrita) en comparación con las firmas de 25 analitos obtenida por cualquiera de i) 1000 firmas de 25 marcadores al azar (círculo en blanco), ii) valores p más bajos (línea discontinua) o iii) veces de cambio mayor (línea de puntos).

La figura 4 (E) muestra la comparación para el valor ABC de ROC obtenido para la firma biomarcadora de 25 analitos condensados en el conjunto de ensayo, cuando la anotación de la muestra fue correcta (línea continua) o permutada 1000 veces (círculos en blanco).

La figura 5 muestra la representación esquemática de la estrategia de micromatriz de anticuerpos.

La figura 6 muestra valores de ABC de ROC para diferenciación entre (A) cáncer pancréatico y (B) pancreatitis normal crónica, y/o pancreatitis inflamatoria aguda.

Los valores de ABC de ROC son mostrados para firmas de marcador que tienen todos los marcadores de la Tabla IV(A) (es decir núcleo) y Tabla IV(B) (es decir preferidos) y números de incremento de marcadores de la tabla IV(C) (es decir opcionales). El mejor valor de ABC de ROC (0.90) es obtenido para una firma de analito 29 (es decir marcadores núcleo + marcadores preferidos+ 15 marcadores opcionales). Sin embargo, todas las combinaciones de marcadores tuvieron capacidad predictiva sustancial.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Materiales v procedimientos Muestras de suero Se recogieron muestras de suero en el momento del diagnóstico, es decir antes de comenzar cualquier terapia, a partir de dos cohortes de pacientes independientes y se conservaron a -80 °C. En la primera cohorte, las muestras de suero de 103 pacientes, diagnosticados con cáncer pancreático (PaC) (n=34), pancreatitis crónica (ChP) (n=16), pancreatitis autoinmune (AIP) (n=23) o individuos sanos (N) (n=30) (sin síntomas clínicos) se exploraron. La demografía de pacientes se ha descrito en la Tabla 1. La cohorte se dividió al azar y se usó como conjunto de formación y conjunto de ensayo. La segunda cohorte, que comprendía 41 pacientes con diagnóstico de PaC (n=25), o N (n=20) (para la demografía de pacientes, véase [14]) se usó como conjunto de ensayo independiente solamente, usando datos de micromatriz de anticuerpo recientemente recogidos [14]. El tamaño de las cohortes de muestra vino limitada por la disponibilidad de las muestras de suero bien caracterizadas recogidas en el momento del diagnóstico.

Análisis de micromatriz de anticuerpos El análisis de micromatriz de anticuerpo recombinante se realizó usando protocolos optimizados internos previamente [12-15] (véase más adelante). Brevemente, 121 anticuerpos Fv monocatenarios recombinantes (scFv), que se dirigen a 57 analitos principalmente inmunoreguladores, se usaron como sondas. La especificidad, afinidad (intervalo nM) o sobre la funcionalidad en chip de la presentación de fagos derivada de los scFv [16] se garantizó usando i) protocolos de selección rigurosos [16], ii) múltiples clones (<4) por analito diana y III) una micromatriz de biblioteca scFv adaptada por diseño molecular (REF). Las micromatrices de anticuerpo planar (tamaño de matriz 160x8, <0,5 cm2) se prepararon dispensando los anticuerpos y controles uno por uno (330 pL/gota) usando un dispensador sin contacto. Las muestras de suero biotiniladas se exploraron por separado y los analitos específicamente unidos se visualizaron añadiendo estreptavidina marcada de manera fluorescente usando un escáner de fluorescencia confocal. Cada punto de dato de la matriz individual representa el valor medio de cuatro duplicados. La normalización entre placas se realizó usando una estrategia de normalización semiglobal. De acuerdo con estudios previos [12, 15, 17], el coeficiente de correlación para la reproductibilidad entre spots y la reproducibilidad entre matrices fue de 0,99 y 0,94, respectivamente. Las especificidades de anticuerpos seleccionados y datos de micromatriz se validaron (Tabla II) usando una matriz de 234 proteínas humanas y una micromatriz de anticuerpos en sándwich de citocinas decuplexadas, respectivamente. Además, diversas especificidades de anticuerpo se habían validad previamente usando ELISA, matrices de proteína, experimentos de bloqueo, adición y/o espectrometría de masa (Tabla II).

Análisis de datos de micromatriz El análisis de datos se realizó en R (véase más adelante). En resumen, se empleó una maquinaria vectorial soporte (SVM) para clasificar las muestras como pertenecientes a uno de los dos grupos definidos (por ejemplo cáncer frente a individuos sanos), usando un kernel lineal con el coste de limitaciones establecido a 1. No se realizaron intentos para modificarlo para impedir el riesgo de sobreajuste. El SVM se entrenó y se ensayó usando un procedimiento de validación cruzado con omisión (leave-one-out, LOO). En dos de las comparaciones, esta parte de entrenamiento incluyó la creación de un subpanel de anticuerpos por anticuerpos de selección que, en el conjunto de entrenamiento, presentó el mayor poder discriminatorio. Esta selección de anticuerpos se realizó usando una estrategia de eliminación inversa directa o validada en cruz. Usando esta estrategia, se identificaron firmas biomarcadoras candidatas condensadas y posteriormente se evaluaron en conjuntos de ensayos independientes.

Los valores de sensibilidad y especificidad se calcularon a partir de los valores de decisión SVM usando un nivel de umbral de cero. Una curva característica operadora receptora (ROC) se construyó usando valores de decisión SVM. El área bajo la curva (ABC) se calculó y se usó como una medición de realización de la predicción. Además, el valor p de Wilcoxon y el cambio en veces se calcularon para cada anticuerpo. Las firmas biomarcadoras candidatas se describieron según las recomendaciones para estudios de pronósticos para marcadores tumorales [18]. Muestras de suero Después de la obtener el consentimiento informado, las muestras de suero se recogieron de dos cohortes de pacientes independientes en el momento del diagnóstico, es decir antes de iniciar la terapia, y se conservaron a -80 °C. Se verificó el PC mediante histología. La cohorte de pacientes 1 estaba compuesta por muestras de suero de 103 pacientes (Hospital Universitario de Mannheim, Alemania), con diagnóstico de adenocarcinoma ductal pancreático (PaC) (n=34), pancreatitis crónica (hCP) (n=16), pancreatitis autoinmune (AIP) (n=23), o individuos sanos (controles; N) (n=30) (síntomas no clínicos). Los valores demográficos de los pacientes se describen en la Tabla 1. Esta cohorte también se dividió al azar y se usó como conjunto de entrenamientos (dos tercios de las muestras) y conjunto de muestras (un tercio). La cohorte de paciente 2 estaba compuesta de 45 pacientes, diagnosticados con PaC (n=25), o N (n=20) (Stockholm South General Hospital and Lund University Hospital, Suecia) (para demografía de pacientes véase [39]) y se adoptó usando datos de micromatriz de anticuerpos como se ha descrito anteriormente [39]. Se llevó a cabo un análisis de potencia(véase más adelante) para confirmar que el tamaño de las cohortes de la muestra era suficiente para proporcionar una potencia estadística >80 %. Los experimentos principales se realizaron la cohorte de pacientes , mientras que la cohorte 2 se usó como conjunto de datos independíente para la validación de un experimento (véase Figura 5).

Marcador de muestras de suero Las muestras de suero se marcaron usando protocolos de mareaje previamente optimizados para proteomas de suero [39-43]. Brevemente, muestras de suero bruto se descongelaron en hielo y se centrifugaron alícuotas de 30 µ? (16 000 x g durante 20 minutos a 4 °C). Cinco µ? de sobrenadante se diluyeron 45 veces en PBS, dando como resultado una concentración de proteína de aproximadamente 2 mg/ml. Las muestras se marcaron con EZ-link® Sulfo-NHS-LC-Biotin (Píerce, Rockford, IL, Estados Unidos) a una concentración final de 0,6 mM durante 2 h en hielo con agitación vorticial cuidadosa cada 20 minutos. Se eliminó la biotina libre por diálisis frente PBS durante 72 horas a 4 °C usando unidades de diálisis cut-off MW de 3,5 kDa (Thermo Scientific, Rockford, IL, Estados Unidos). Las muestras se dividieron en alícuotas y se conservaron a -20 °C.

Producción y purificación de scFv En total, 121 fragmentos de anticuerpo Fv monocatenario recombinante humano (scFv) dirigidos principalmente contra 57 biomoléculas inmunoreguladoras se seleccionaron a partir de una biblioteca n-CoDeR [43] y proporcionada amablemente por Biolnvent International AB, Lund, Suecia o proporcionada por el Profesor Mats Ohlin (Universidad de Lund, Suecia) (5 clones contra mucina-1). La especificidad, afinidad (intervalo nM) y funcionalidad en matriz de expresión en fago derivada de scFv se garantizó usando i) protocolos de selección rigurosos [43], ii) clones múltiples (<4) por molécula diana y iii) una microplaca de bibliotecas de scFv adaptadas por diseño molecular [44, 45]. Los fragmentos de anticuerpos producidos en 100 mi de cultivos de E. coli se purificaron de los sobrenadantes de expresión o periplasmo celular usando cromatografía de afinidad sobre agarosa Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). Las moléculas unidas se eluyeron con imidazol 250 mM, se dializaron ampliamente contra PBS y se conservaron a 4 °C hasta usarse para la fabricación de la micromatriz. La concentración de anticuerpo se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm (promedio 500 µg/ml, intervalo 50 - 1840 µg/ml).

Fabricación y procesamiento de micromatrices con anticuerpos Para la producción de micromatrices de anticuerpos planares se usó un conjunto previamente optimizado y validado [39-43, 46]. Brevemente, los scFv se dispusieron sobre portaobjetos de micromatrices Maxisorb poliméricas balck (NUNC, Roskilde, Dinamarca) usando un impresor sin contacto (BioChip Arrayer, PerkinElmer Life & Analytical Sciences, Wellesley, MA, Estados Unidos) depositando gotas de aproximadamente 330 pl usando piezotecnología. Dos gotas se mancharon en cada posición, permitiendo que la primera gota se secase antes de dispensar la segunda gota. En promedio, se depositaron 5 fmol de anticuerpo (intervalo 1 ,5-25) por posición. Para garantizar estadísticas adecuadas y para garantizar cualquiera de los defectos locales, cada sonda se imprimió por octuplicado. En total, se imprimieron en cada portaobjetos 160 sondas, incluyendo marcadores de posición y los scFv de control , orientados en ocho submatrices 20 x 8. Para ayudar a alinear la rejilla durante la cuantificación, una hilera de Estreptavidína conjugada con Alexa647 (Invitrogen, Carlsband, CA, Estados Unidos) (10 µg/ml) se manchó en posiciones seleccionadas. Las matrices se bloquearon en 5 % (p/v) de leche en polvo desnatada (Semper AB, Sundbyberg, Suecia) en PBS durante una noche.

Los portaobjetos de micromatrices se procesaron en una estación de trabajo Proteína Array (PerkinElmer Life & Analytical Sciences) de acuerdo con un protocolo previamente descrito [42]. Brevemente, las matrices se lavaron con Tween-20 al 0,5 % (v/v) en PBS (PBS-T) durante 4 minutos a 60 µ?/min y después se incubaron con 75 µ? de muestra de suero biotinilada (diluida 1 :2 dando como resultado una dilución en suero total de 1 :90) en leche en polvo desnatada al 1 % (p/v) y Tween-20 al 1 % (v/v) en PBS (PBS-MT), durante 1 hora con agitación cada 15 segundos. Después, las matrices se lavaron de nuevo con PBS-T y se incubaron con estreptavidína conjugada con Alexa-647 1 µg/ml en PBS-MT, durante 1 h. Finalmente, las matrices se lavaron con PBS-T, se secaron al vapor de gas nitrógeno y se exploraron con un explorador de micromatríz confocal (PerkinElmer Life & Analytical Sciences) a una resolución de 10 µ??, usando cuatro entornos de escáner diferentes de aumento PMT y una potencia de láser. La intensidad de cada mancha se cuantificó en el programa informático ScanArray Express v.4.0 (PerkinElmer Life & Analytical Sciences) usando el procedimiento de círculo fijo. El fondo local se restó. Para compensar cualquier posible defecto local, los dos duplicados más altos y los dos más bajos se excluyeron automáticamente y se usó el valor medio de los cuatro duplicadosrestantes . Para los anticuerpos que presentaban señales saturadas, se graduaron valores de entornos de escáner inferiores que se usaron en su lugar. Se realizó la normalización entre placas usando una estrategia de normalización semiglobal previamente descrita [39, 40, 42]. Primero, el CV de cada sonda sobre todas las muestras se calculó y se clasificó. Segundo, se identificó el 15 % de las sondas que presentó los valores CV más bajos para todas las muestras , que se usó para calcular un factor de normalización entre placas para cada matriz. El factor de normalización N, se calculó por la fórmula N, = S, / µ, en la que S, es la suma de las intensidades de señal para los anticuerpos usados, promediados para todas las muestras y µ es el promedio de la muestra de S,. Las intensidades se recalcularon a valores log2 antes de análisis estadístico.

Validación de especificidad de anticuerpos Las especificidades de dos scFv seleccionados (ant¡-IL-6 (2) y anti-IL-10 (1)) se ensayaron usando las series RayBio® 278 Human Proteína Array G (Norcross, GA, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los scFv se marcaron con EZ-link® Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) durante 2 h en hielo a un exceso molar de 3,5 veces de biotina. La biotina no unida se retiró por diálisis 72 h contra PBS. En total, se añadieron 5 µg de anticuerpos a cada matriz. La unión se detectó usando Estreptavidina conjugada con Alexa647 1 µg ml (Invitrogen). Se añadió PBS a una matriz como un control negativo para comprobar la unión no específica de la Estreptavidina. Las matrices se exploraron y se restaron las señales procedentes de la matriz del control negativo. Además, diversas especificidades de anticuerpos se habían validado previamente usando muestras de suero estandarizadas bien caracterizadas y procedimientos independientes tales como espectrometría de masas, ELISA, MSD y CBA así como usando experimentos de adición de bloqueo (Tabla II).

Validación de datos de matriz Se desarrolló un ensayo Th1/Th2 decuplexado humano MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, Estados Unidos) en un intento para validar los resultados de micromatriz de anticuerpos. Cada pocilio de la placa de MSD 96 se había prefuncionalizado con anticuerpos contra IFN-?, IL-? ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 y TNF-a en manchas de electrodo distintas espacialmente. Un total de 34 muestras de suero (no diluidas) se analizaron, incluyendo 11 PaC, 11 sanas, 9 ChP y 3 muestras AIP (el menor número de muestras AIP se debía a volúmenes de muestra limitado en este subgrupo). El ensayo se desarrolló de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante y la lectura basada en electroquimioluminiscencia se realizó en un instrumento MSD SECTOR®.

Análisis de datos de micromatriz Todos los datos estadísticos y de análisis se realizaron en R (http://www.r-project.org). Brevemente, se empleó una máquina de soporte vectorial (SVM) para clasificar las muestras, pertenecientes a uno de los dos grupos definidos (por ejemplo cáncer o sanos), usando un kernel lineal con el coste de limitaciones establecido a 1. No se realizaron intentos de refinado para impedir el riesgo de sobreajuste. LA SVM se entrenó y ensayó usando un procedimiento de validación cruzada leave-one-out (LOO) [42]. En dos de las comparaciones, esta parte de entrenamiento incluyó la creación de un subpanel de anticuerpos seleccionando anticuerpos que, en el conjunto de entrenamiento, presentaron el mayor poder discriminatorio. Esta selección de anticuerpos se realizó usando bien una estrategia de retroeliminación validada indirecta o cruzada. Usando esta estrategia, se identificaron firmas de biomarcador candidato condensadas y posteriormente se evaluaron en conjuntos de ensayos independientes.

Se calcularon los valores de sensibilidad y especificidad a partir de los valores de decisión SVM usando un nivel de umbral de cero. Se construyó una curva característica operativa receptora (ROC) usando los valores de decisión SVM. El área bajo la curva (ABC) se calculó y se usó como una medición de realización de la predicción. Además, el valor p Wilcoxon y el cambio en veces se calcularon para cada anticuerpo. Las firmas biomarcadoras candidatas se describieron siguiendo las recomendaciones para estudios de pronóstico con marcador tumoral [47].

Identificación de firmas biomarcadoras Se usó un procedimiento de retroeliminación para identificar una firma biomarcadora para distinguir PaC de individuos sanos. En esta estrategia, una muestra de cada vez quedó excluida del conjunto de datos. Las muestras restantes se usaron para el entrenamiento de la SVM excluyendo un anticuerpo cada vez y realizando la clasificación con los anticuerpos restantes. Tras excluir todos los anticuerpos, , el anticuerpo menos informativo se definió como el que se había excluido cuando se obtuvo el error Kullback-Leibler más pequeño (KL) para la clasificación y se eliminó del conjunto de datos. El procedimiento LOO se repitió hasta que solo quedó un anticuerpo dejó y se registró el orden en el que los anticuerpos se habían eliminado. El procedimiento se repitió excluyendo una nueva muestra y la repetición continuó hasta que todas las muestras se habían excluido. Se generó un listado del orden en el que los anticuerpos se eliminaban para cada momento en que se excluía una muestra. Al final, todas las muestras habían quedado excluidas una vez y se había creado una lista consenso en la que cada anticuerpo recibía una puntuación basándose cuánto tiempo había soportado el proceso de eliminación, promediado para todas las repeticiones realizadas. A lo largo del proceso, cada muestra excluida se usó para ensayar los modelos SVM construidos para cada nueva longitud de subpaneles de anticuerpos, regresando a un valor de decisión correspondiente a la realización. Consecuentemente, se recogieron los valores de decisión para todas las muestras para cualquier longitud de subpanel determinada . Las áreas ROC correspondientes se representaron gráficamente frente a diversos anticuerpos como un medio para evaluar la intensidad del conjunto de datos y la estrategia de eliminación. Una firma condensada de 18 analitos se seleccionó a partir de la lista consenso y un conjunto de datos independientes de análisis de micromatriz de anticuerpos de 25 PaC y 20 N en muestras de suero [39] se usó como conjunto de muestra para prevalidar la firma candidata. Los analitos de la firma se usaron en un procedimiento de validación cruzada LOO SVM para el conjunto de ensayo y la capacidad de la firma para diferenciar PaC de N se ilustra en una curva ROC.

Se generó una segunda firma biomarcadora candidata para la clasificación de PaC entre N, ChP e IAP. En primer lugar, los datos se dividieron al azar en un conjunto de ensayo (dos tercios de las muestras) y un conjunto de ensayo (un tercio). Se usó una estrategia de retroeliminación modificada (incluso más rigurosa). En lugar de excluir una muestra en cada momento, la SVM se entrenó solamente una vez usando todas las muestras en el conjunto de ensayo. Como consecuencia, se generó una lista de eliminación a partir de la cual se seleccionó y se usó un panel condensado de 25 analitos para construir la SVM para el conjunto de entrenamiento. El modelo se aplicó sobre el conjunto de ensayo independiente y se generó una curva ROC. Adicionalmente, se realizó un análisis de potencia estadística para calcular el número de pacientes requeridos en el conjunto de ensayo usando la función "power.t.test" en R (valores de decisión teóricamente distribuidos de forma normal como sugiere el ensayo de Shapiro-Wilk). Los valores de decisión observados a partir del análisis SVM en el conjunto de entrenamiento presentaron una desviación típica de 2,87 y un valor delta entre los grupos de 3,47 (diferencia entre valores medios). El nivel alfa (nivel de significación) se estableció a 0,05. Además, la validez de este procedimiento de validación inverso se ensayó comparando la realización de la firma seleccionada en 1000 firmas generadas al azar de la misma longitud y firmas generadas seleccionando los anticuerpos del valor p más bajo y el cambio en veces más alto, respectivamente. Finalmente, la fuerza del clasificador y el conjunto de datos se sometió a ensayo comparando los resultados de la firma en el conjunto de datos de ensayo con respecto a datos al azar, generando permutaciones de 1000 de las anotaciones en la muestra en el conjunto de datos de ensayo.

Resultados Clasificación de PaC frente a controles sanos Para identificar la firma biomarcadora en suero con PaC, se realizó un perfil de expresión de proteína sérica diferencial de PaC (n=34) frente N (n=30), usando la primera cohorte de pacientes. Una imagen representativa de una micromatriz de anticuerpo se muestra en la Figura 1A, que ¡lustra que las intensidades de señal dinámicas, morfología de mancha adecuada y unión de fondo específico no bajo se obtuvieron. Los resultados muestran que se encontró que 33 analitos de proteína no redundantes, incluyendo por ejemplo tanto citocinas tanto Th1 como Th2, se expresaron diferencialmente (p<0,05) de los cuales, salvo las proteínas C1q del complemento y la Properdina, se regulaban positivamente en PaC (Figura 1 B).

Para investigar si se podía diferenciar entre PaC y N , se desarrolló una validación cruzada SVM LOO basada en todos los anticuerpos, es decir usando datos no filtrados. Los datos mostraron que las cohortes de pacientes podrían clasificarse con un valor ABC de ROC de 0,94 (Fig. 1 C). En la Figura 1 D, se representan gráficamente las muestras disminuyendo los valores de decisión SVM y el modelo de expresión relativo de los 20 analitos diferencialmente expresados (p<0,02) se muestran en un mapa de colores. Usando un umbral de 0 (valor por defecto), el análisis mostró que se podría clasificar PaC frente a N con una sensibilidad y especificidad del 82 % y 87 %, respectivamente.

A continuación, se usó una matriz de 278 proteínas humanas para la validación de especificidades de loa anticuerpos seleccionados (Figs. 1 E y 1 F). Para esta finalidad, se seleccionaron anticuerpos scFv contra un analito expresado altamente diferenciado, IL-6 (p=0,005) y un analito modesto diferencialmente expresado IL-10 (p=0,04). En ambos casos, el análisis de la matriz de proteínas mostró que los fragmentos de anticuerpo scFv se unían específicamente a su proteína diana.

Prevalidación de la firma biomarcadora condensada para clasificación PaC frente a N Para ensayar la fuerza de la clasificación derivada de la primera cohorte de pacientes (n=64), se condensó primero el número total de analitos de los 18 biomarcadores no redundantes que contribuyen a la mayoría de la clasificación, combinando en este procedimiento LOO con una estrategia de eliminación inversa repetitiva. En este proceso, el error de divergencia Kullback-Leibler se minimizó y se usó como guía para la retirada gradual de los anticuerpos uno o uno. Después de cada ronda, los valores de decisión SVM se recogieron y la curva ROC correspondiente y el valor ABC se calcularon. En la Figura 2A, el valor ABC se representa gráficamente frente al número de anticuerpos restantes, lo que indica una clasificación alta y estable incluso cuando solo se incluyeron algunos pocos anticuerpos. La firma biomoarcadora en suero candidata condensada de 18 analitos, compuesta de diversos analitos, por ejemplo, citocinas, proteínas del complemento y enzimas se muestran en la Figura 2B. Después, se aplicó este clasificado de 18 analitos sobre un nuevo grupo de ensayo independiente, la segunda cohorte de pacientes (n=45) (Fig. 2C). Los resultados muestran que el clasificador permite una estratificación de pacientes en PaC frente a N con un valor ABC ROC de 0,95 (Fig. 2D), correspondiente a una sensibilidad del 88 % y una especificidad del 85 %. Por tanto, los datos indican la primera firma biomarcadora en suero prevalidada para diagnóstico PaC.

Firmas de biomarcador que diferencian PaC frente a pancreatitis Para ensayar si el cáncer podría diferenciarse de dolencias benignas del páncreas, se comparó el perfil de expresión de proteínas en suero de PaC (n=34) con el de ChP (n=16) o AIP (n=23) usando la primera cohorte de pacientes. En el caso de PaC frente a ChP, se identificaron 15 analitos en suero expresados diferencialmente no redundantes (p<0,05) todos los cuales, salvo dos (IL-4 e IL- 2), se regularon positivamente en PaC (Fig. 3A). Basándose en datos no filtrados, los resultados muestran que PaC y ChP podrían diferenciarse con un valor ABC ROC de 0,86 (Fig. 3B), correspondiente a una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 69 %. Se encontró que un total de 49 analitos en suero no redundantes se expresaban diferencialmente en PaC frente a AIP, todos excepto C1q y Properdina, regulándose positivamente en PaC (Fig. 3A). De nuevo, basándose en datos no filtrados, los resultados muestran que PaC frente a AIP podría clasificarse con un valor ROC de 0,99 (Fig. 3B), basándose en una sensibilidad y especificidad del 97 % y 91 % respectivamente.

Para reflejar mejor la realidad clínica, se investigó después si las diferencias podrían diferenciarse entre PaC y el grupo de pacientes combinado heterogéneo de ChP+AIP+N, usando la primera cohorte de pacientes (n=103). Los resultados demuestran que 47 proteínas séricas no redundantes se expresaban diferencialmente (p<0,05) (Fig. 3A). Se encontró que una mayoría de analitos (45 de 47) estaban regulados positivamente en PaC, incluyendo una amplia serie de proteínas. Basándose en datos no filtrados, los resultados mostraron que PaC podría diferenciarse de este grupo de pacientes heterogéneo con un valor ABC ROC de 0,85 (Fig. 3B).

En un intento para validar los datos de la matriz se aplicó una micromatriz de anticuerpos en sándwich de citocinas decuplexado (MSD) (Fig. 3C). Sin embargo, solamente 1 de 10 analitos en suero diana, IL-8, estaba por encima del límite inferior de detención del ensayo MSD en la mayoría de las muestras. Además, la regulación positiva observada de IL-12 en PaC comparada con la observada en N, ChP, IAP y cohorte combinada se confirmó estadísticamente (p<0,05) mediante ensayo MSD en todos los casos, excepto para PaC frente a IAP (p=0,29).

Firma biomarcada refinada para diagnóstico de PaC Para ensayar la fuerza de la clasificación de toda la primera cohorte de pacientes, incluyendo PaC, N, ChP e IAP (n=103), se dividió la cohorte en un conjunto de entrenamiento (dos tercios) y un conjunto de ensayo (un tercio) (Fig. 4A). A continuación, una firma biomarcadora en suero condensada compuesta de 25 analitos no redundantes que contribuía a la mayoría de la clasificación en el conjunto de entrenamiento se descifró usando una estrategia de retroeliminación directa repetitiva. La firma biomarcadora condensada de 25 analitos, compuesta de, por ejemplo, citocinas y proteínas del complemento, se muestra en la Figura 4B. A continuación, se aplicó este clasificador de 25 analitos sobre el conjunto de ensayo independiente (Fig. 4C). Los datos mostraron que PaC podría determinarse con precisión con un valor ABC ROC de 0,88 (Fig. 4C), reflejando una sensibilidad y especificidad del 73 % y 75 %, respectivamente.

Para exponer adicionalmente el clasificador, se evalúa estadísticamente esta capacidad de discriminación. En primer lugar, 1000 firmas al azar de la misma longitud (25 anticuerpos) se generaron en el conjunto de entrenamiento y se aplicaron al conjunto de ensayo. Los resultados mostraron que los valores ABC para las firmas al azar eran menores que los de la firma biomarcadora clasificadora (ABC=0,88) en el 95 % de los casos (Fig. 4D). Además, los valores ABC para las correspondientes 25 firmas de analito seleccionadas basándose en los valores p más bajos (ABC=0,77) o los de veces de cambio más elevados (ABC=0,78) eran significativamente inferiores en comparación con la firma clasificadora. Por tanto, los datos indican adicionalmente la capacidad de discriminación del clasificador, y la aplicabilidad de la estrategia de eliminación inversa para definir una firma de alto rendimiento condensada. En segundo lugar, la anotación de la muestra del conjunto de ensayo se permutó 1000 veces para comparar la clasificación específica con la clasificación aleatoria del mismo número de muestras. Los resultados muestran que se obtuvo un valor ABC ligeramente más elevado (0,88 frente 0,19-0,86, valor medio de 0,5) cuando se usó la anotación de muestra correcta que cuando se aplicó la notación aleatoria, demostrando adicionalmente la fuerza de la clasificación.

Discusión En este estudio se ha aplicado la proteómica de afinidad para aprovechar la potencia diagnóstica del sistema inmunitario tomando PaC como diana. La estrategia se basó en el conocimiento de que el sistema inmunitario es exquisitamente sensible a alteraciones en el estado de salud de cada individual, resultante de enfermedades, registrando estos cambios a través de fluctuaciones en niveles de, en particular, analitos inmunorreguladores. Para esta finalidad, se diseñaron micromatrices de anticuerpos para dirigirse predominantemente a estos tipos de analitos reguladores clave en suero. Los datos muestran que las firmas biomarcadoras candidatas asociadas con PaC presentan un alto poder de diagnóstico que puede desconvolucionarse. De una manera similar, esta estrategia proteómica de afinidad ha permitido identificar de diversas firmas biomarcadoras serológicas que distinguen otras indicaciones cancerosas y controles sanos [14-15, 17, 19], demostrando adicionalmente la capacidad de la plataforma.

Se ha demostrado por primera vez que la información almacenada en suero permitía discriminar son solamente entre no cohortes de pacientes de PaC bien definidas frente a controles y PaC frente a pancreatitis sino también entre PaC frente a una cohorte combinada de controles y pacientes con pancreatitis con alto grado de confianza. Este último hallazgo era en particular crítico, ya que las firmas biomarcadoras candidatas deben comportarse correctamente también en entornos clínicos en los que se exploran grupos de pacientes heterogéneos.

El impacto clínico de un clasificador PaC de alto rendimiento debe ser alto ya que aún no se ha validado un discriminador serológico [2, 7-9, 20-21]. Mientras se espera la llegada del clasificador perfecto, el CA-19-9 continua siendo el marcador molecular más útil para diagnóstico PaC [2, 8-10]. Notablemente, nuestros datos muestran una sensibilidad media significativamente superior (88 %) y especificidad (85 %) para diagnóstico de PaC que cuando se ha observado coherentemente para CA-19-9 [2, 9-1 1], reflejando un valor añadido clínicamente significativo . Adicionalmente, se ha modelado recientemente el impacto de nuevas posibilidades de diagnóstico sobre el coste de supervivencia y calidad de vida de pacientes en riesgo, y se ha demostrado que la proteómica de afinidad tiene grandes prospectos para llegar a ser una herramienta rentable en la exploración de PaC (Bolin y col, ms in prep.).

El clasificador tendrá mejores resultados si en el diagnóstico precoz, puede realizarse, cuando el tumor es aún pequeño y operable [2, 9].

En la búsqueda de biomarcadores del cáncer, se ha destacado frecuentemente que la inflamación es un factor posible de confusión [23] dado que el desarrollo del cáncer y la inflamación se han relacionado. En trabajos iniciales basados en proteómica de afinidad, los resultados también demuestran frecuentemente que las firmas de enfermedad general (inflamatoria) se delinearon en lugar de las específicas de cáncer [24-26]. De manera notable, se ha observado aquí que PaC y pancreatitis podrían discriminarse con una alta confidencia. Además, las firmas observadas mostraron diferencias significativas, es decir solo con solapamientos pequeños, con las observadas para otras diversas afecciones inflamatorias referencias [19, 27] (Carlsson y col., ms in prep.) y otros cánceres [14-15, 17, 19], lo que refuerza adicionalmente la noción de que se descifraron firmas específicas de PaC.

Las inmunofirmas de suero podrían considerarse como fotografías de la actividad del sistema inmunitario en un paciente en el momento del ensayo. Estas huellas reflejarán una combinación de efectos directos e indirectos (sistémicos) en respuesta al cáncer. Al centrarse en los perfiles de expresión de citocinas, los informes previos han demostrado que las líneas celulares de cáncer pancreático que se expresan en un conjunto de citocinas también se expresan en exceso en este estudio, incluyendo, por ejemplo IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18 y TGF-ß? [28]. También se ha encontrado que algunas de estas y otras citocinas (por ejemplo VEGF e IL-7) se expresan en exceso en el tejido tumoral de PaC y/o en suero/plasma [29-33] reforzando adicionalmente las observaciones. Aunque las citocinas desempeñan una función principal en el sistema inmunitario, la interpretación de estos modelos de expresión intrínsecos en un contexto biológico se requiere dado que muchos de estos analitos presentan funciones pleiotrópicas y PaC se caracteriza por modelos de expresión de citocinas peculiares [29]. Aunque la expresión de, por ejemplo, IFN-? podía señalizar un intento de respuesta inmunitaria antitumoral [29], el entorno inmunológico de PaC a menudo se ha encontrado que es en un sitio inmunosupresor, como se ilustra mediante la expresión simultánea de citocinas antiinflamatorias (por ejemplo TGF-ß e IL-10) y citocinas proinflamatorias posiblemente inactivas (por ejemplo IL-12 e IL-18) [29]. Una inmunosupresión celular es una característica biológica llamativa de PaC observada en muchos pacientes [34]. Aunque se han descrito respuestas sesgadas Th2 con el equilibrio Th1 Th2 indicado en el presente documento también se ha observado [29, 31 , 35]. El modelo de expresión de citocinas también se ha observado que refleja otros parámetros, tales como la supervivencia. La búsqueda de algunos de los marcadores que no son citocinas, diversas proteínas del complemento, tal como C3, que se ha sugerido que actúa en la supervivencia inmunitaria contra tumores [36-37] y el antígeno de hidrato de carbono en Lewis x también se ha encontrado previamente que está asociado con PaC [38].

Considerado en su conjunto, se ha resuelto una necesidad clínica y se ha demostrado que la inmunofirma era una estrategia potente para descifrar las primeras firmas biomarcadoras serológicas prevalidadas para el diagnóstico PaC. Esto se consiguió a través de una plataforma de alto rendimiento, muestras muy controladas y una bioinformática rigurosa y estrategias de validación. La posibilidad de la firma predictora se validará adicionalmente en estudios de seguimiento en los que se perfilarán cohortes de muestra independientes. En esta finalidad, estos hallazgos proporcionarán nuevas oportunidades para diagnósticos PaC mejorados y por lo tanto potenciarán el pronóstico y tratamiento clínico de PaC.

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TABLA I - Demografía de pacientes para la primera cohorte de pacientes ClaseN0 de pacientes Género Edad ( /F/desconocido)Media (DT)lntervalo PaC 34 18/12/4 65,0 (10,4) 42-93 N 30 15/15/0 33,2 (8,6) 24-53 ChP 16 12/4/0 48,8 (14,2) 32-73 AIP 23 11/11/1 42,4 (18,3) 14-74 Todo 103 56/42/5 48,2 (18,1 ) 14-93 TABLA II - Resumen de biomarcadores en suero analizados por micromatrices de anticuerpos * Especificidad de anticuerpo previamente validada por ELISA, matriz de proteínas, experimentos de bloqueo/adición y/o espectroscopia de masas.

TABLA III - Biomarcadores de diagnóstico para cáncer pancreático TABLA IV - Biomarcadores de diagnóstico de cáncer pancreático (A) Biomarcadores núcleo Nombre del biomarcador lnterleucina-7 (IL-7) Integrina a-10 (B) Biomarcadores preferidos Nombre del biomarcador ß-galactosidasa Tirosina quinasa de Bruton (BTK) Proteína del complemento C1q (C1q) Proteína del complemento C1s (C1s) . cadena de receptor de células ß (IgM) nterleucina-9 (IL-9) " ntegrina a-1 1 Janus quinasa 3 proteína tirosina quinasa (JAK3) Procatepsina W Properdina Péptido TM Factor a de necrosis tumoral (TNF-a) (C) Biomarcadores adicionales opcionales Nombre del biomarcador lnterleucina-6 (IL-6) lnterieucina-8 (IL-8) lnterferón-? (IFN-?) Leptina Lewis X /CD 5 Lewis y Proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) Mucina-1 Antígeno específico de próstata (PSA) Rantes Sialyl Lewis x Factor de crecimiento transformante 1 (TGF-b1 ) Factor de necrosis tumoral ß (TNF-ß) Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ligando CD40 lnterleucina-16 (IL-16) lnterleucina-1 ra (1L-1 ra) Proteína 3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3) Proteína 4 quimiotáctica de monocitos (MCP-4) TABLA V - Subconjuntos de biomarcadores de diagnóstico de cáncer pancreático TABLA VI - Programa SVM entrenado Los siguientes parámetros se obtuvieron usando la SVM e1071 1.5-24, disponible de http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html.

(A) - Definición de una identificación biomarcadora condensada para PaC frente a todos (N+Chp +AIP) usando una estrategia de eliminación inversa nombre del archivo <- "PaC_vs_all_entrenamiento _set.txt" grupol <- "otro" grupo2 <- "PaC" # Incluye fuente ("NaiveBayesian") biblioteca (el071) # datos Hámta archivo de datos sin procesar <- read. delim (nombre del archivo) # Las in grupper grupos <- archivo de datos sin procesar [,2] # Hámta provnamn i datafilen nombres de muestra <- as . carácter ( archivo de datos sin procesar [ , 1 ] ) # Skapa dataset ur ráfilen datos <- t (archivo de datos sin procesar [, -c (1, 2) ] ) # Log # datos <- log (datos) /log (2) # antal prover N muestras <- ncol (datos) # Skapa antikroppsnamnlista ur NYA datafilen Nombres de Proteina <- read . delim (nombre del archivo, header=FALSE) Nombres de Proteina <- as . carácter (as .matrix (Nombres de Proteina) [1, ] ) Nombres de Proteina <- Nombres de Proteina [-( 1 : 2 ) ] # Kolla antal Ab i nya datasetet antal <- longitud (Nombres de Proteina) # Ge rátt prov- och Ab-namn rownames (datos) <- Nombres de Proteina colnames (data) <- nombres de muestra # subconjuntos Skapa subconjuntol <- is . element (grupos , strsplit (grupol, ", ") [ [1] ] ) subconjunto2 <- is . element (grupos , strsplit (grupo2, ",") [ [1] ] ) # lista del factor Skapa svmfac <- factor (rep (' rest ', ncol (datos ) ) , niveles=c (grupol , grupo2 , ' rest ' ) ) svmfac [subconjuntol] <- grupol svmfac [subconjunto2] <- grupo2 svmfac <- svmfac [subconjuntol I subconjunto2] # Skapa vektor for K-L felen dar det minsta for varje signaturlangd sparas smallestErrorPerLength <- rep (NA, antal ) # Berakna medelvarde for varje Ab over alia prov som ar med promedio <- apply (datos, 1, mean) # Skapa vektor for Ab-ordningen efter K-L felen som erhállits nar # respektive antikropp var satt till medelvarde. abOrder <- rep (NA, antal ) # Skapa ett dataset att eliminera i elimData <- datos [, subconjuntol | subconjunto2] # Lista att fórvara SVM-modellerna i modelos <- numérico (n muestras) # Skapa variabel for att hálla reda pá hur mánga Ab som tagits bort borttagna <- 0 ############################################################### ##### BEGIN BACKELIM ######################################### ############################################################### ##### print (Sys . time ( ) ) # Kór tills bara tvá analyter áterstár for(j in l: (antal-l)) { # Comprobar si los grupos se proporcionan en orden correcto control < - as .numérico (svmfac) si (suma (control [subconjuntol] ) > suma (control [subconjunto2] ) ) { print ( "ERROR: Cambio de orden del grupol y grupo2!!!") rotura } # For varje signaturlángd, dar alia ár med frán bórjan, trana en modell for # varje N-l kombiantion av prover med den data som finns i elimData for (i in 1 : nmuestras) { # Modellerna sparas i en array av listor kallad models modelsti] <- list ( svm (t (elimData [, -i] ) , svmfac [-i], kernel="linear") ) } # u ár alia modeller som behovs for LOO tránade och ska testas pá elimData.

# I elimData sátts forst en analyt till medelvárde, sen testas var och en av # modellerna med det prov som var borttaget nár den tránades.

# Nár alia modellerna ár testade en gáng beráknas KL-fel som sparas i errors.

# Nu sátts násta analyt till medelvárde och testprocessen górs om, tills alia # analyter varit medelvárdeseliminerade en gáng. Resultatet blir en KL-fel # lista lika láng som antalet analyter som ár kvar i datasetet .

# Skapa en lista med K-L fel en viss signaturlángd (antal + 1 - j láng) # dar areorna for varje korning dar en Ab i taget har satts till medelvárde errores <- test odels (models, elimData, promedio) # Lágg namnet pá Ab med samst inverkan pá felet i abOrder abOrder[j] <- getWorstAb (errors, row . names (elimData) ) # Lágger till várdet pá det rainsta felet smallestErrorPerLength [j ] <- getSmallestError (errors ) # Tar bort samsta Ab ur medelvárdeslistan promedio <- getNewPromedio (errores, promedio) # Tar bort samsta Ab ur elimData elimData <- getNewElimData (errores, elimData) # Noterar att en Ab tagits bort borttagna <- borttagna + 1 # Ange hur manga analyter sora eliminerats, samt vad klockan r . print (paste ( , "analytes eliminated @", Sys . time ( ) ) , sep="") } # Lágg till namnet pá sista analyetn, som aldrig bien eliminerad abOrder [length (abOrder) ] <- setdiff (Nombres de Proteina, abOrder ) # Spara resultatet till fil filename <- paste ( "Backward elimination result (", rnorm(l) +1, ") . txt", sep="" ) write . table (cbind ( smallestErrorPerLength, abOrder ) , file=filename, sep="\t", quote = F, row. names = F) ############################################################### #### FUNCTIONS ########################################### ############################################################### ##### # getWorstAb: Rapporterar namnet pá antikroppen som kommer tas bort # (den dar ROC-arean var som stórst) getWorstAb <- función (errores , abNames) { retroceso (abNames [orden (errores, disminución = F) [l]]) } # testModels: testar alia modeller som finns i 'models' med alia # analyser satta till medelvárde en gáng testModels <- función (modelos, elimData, promedio) { nmuestras <- ncol (elimData) d <- as . numérico ( svmfac) -1 y <- numérico (nmuestras ) E <- numérico (nmuestras) analitos <- nro (elimData) errores <- numérico (nrow (elimData) ) for(k in l:analitos) { # Satt analyt k till medelvárde i elimData # Men spara fórst analytens orginalvarde backup <- elimData [kf] elimData [k,] <- promedios [k] # Gor LOO loop for datasetet med de redan fardiga modellena for (i in 1: nmuestras) { pred <- predict (modelos [ [i] ] , t (elimData [, i] ) , decisión. alues=TRUE) #spara decisión valúes y [i] <- as . numérico (attributes (pred) $decision . valúes ) } # Berakna "sannolikheterna" y = 1-(1/(1 + exp(-y) ) ) # Berakna KL-fel nár aktuell analyt ár eliminerad for (i in 1: nmuestras) { E[i] <- -(d[i]*log(y[i] )+(l-d[i] ) *log(l-y[i] ) ) } # Spara felet errores [k] <- sum(E) # Lagg tillbaka analyten elimData [ k, ] <- backup } retorno ( errores ) } # getNewElimData : Váljer vilken antikropp som ska tas bort ur tranigsdatan och tar bort den getNewElimData <- función (errores, eliminar datos) { # Positionen for det minsta felet tasBort <- orden (errores, disminución = F) [1] retroceso (eliminar datos [-tasBort, ] ) } # getSmallestError : Rapporterar minsta K-L felet getSmallestError <- función (errores ) { retroceso (min (errores) ) } # getNewPromedio : skapar en ny lista med medelvárden efter att en analyt # eliminerats. getNewPromedio <- función (errores, promedios) { # Positionen for det minsta felet tasBort <- orden (errores, disminución = F) [1] retroceso (promedios [-tasBort] ) } # getRemovedAb : tar fram ID pá analyt som eliminerats getRemovedAb <- función (errores, abNames) { retroceso (abNames [orden (errores, disminución = T) [l]]) } TABLA VI - continuación (B) - Definición de una identificación biomarcadora condensada para PaC frente a N usando una estrategia de eliminación inversa modificada # Archivo de datos och grupper nombre del archivo <- "conjunto de datos PaC_frente a_N_.txt" grupol <- "N" grupo2 <- "PaC" # Las in datafil archivo de datos sin procesar ORG <- read . delim (nombre del archivo) # Las in grupper gruposORG <- archivo de datos sin procesar ORG[,2] # Las in data datos ORG <- log (t (archivo de datos si procesar ORG [, -c (1, 2) ] ) ) # Las in Ab-namn Nombres de proteina <- read. delim (nombre del archivo, header=FALSE) Nombres de proteina <- as . carácter (as .matrix (Nombres de Proteína) [1, ] ) Nombres de Proteína <- Nombres de Proteína [-( 1 : 2 ) ] # Kalla Ab rátt namn rownames (datos ORG) <- Nombres de Proteína # Kalla prover ratt namn nombres de muestra ORG <- as . carácter (archivo de datos sin procesarORG [, 1] ) colnames (datos ORG) <- nombres de muestra ORG # Kontrollera antalet prover N° de muestras <- dim (archivo de datos sin procesar ORG) [1] # Kontrollera antalet Ab NoAntibodies <- dim(archivo de datos sin procesar ORG) [2] - 2 # Skapa subsets utifrán grupepr subsetORGl <- is . element (groupsORG , strsplit (grupol, ",") [ [1] ] ) subsetORG2 <- is . element (gruposORG , strsplit (grupo2, ",") [ [1] ] ) # Skapa faktorer utifrán subsets svmfacORG <- factor ( rep (' rest ', ncol (dataORG )), niveles=c (grupol , grupo2 , 1 rest 1 ) ) svmfacORG [subsetORGl] <- grupol svmfacORG[subsetORG2] <- grupo2 # Skapa vektor och array fár ROC-areor respektive Signaturer # frán varje korning utan A provet BestROCsForEachRun <- rep (NA, NoSamples*NoAntibodies ) dim (BestROCsForEachRun) <- c (NoSamples, NoAntibodies) AbRemovalOrderForEachRun <- rep (NA, NoSamples*NoAntibodies) dim (AbRemovalOrderForEachRun) <- c (NoSamples, NoAntibodies) # For varje prov i datasetet: for (A in 1: NoSamples) # para (A in NoSamples :1) { # Hamta data frán orginal-ráfilen for alla prover utom A archivo de datos sin procesar<-archivo de datos sin procesar ORG[-A, ] # Hamta provnamn i NYA datafilen nombres de muestra <- as . carácter (archive de datos sin procesar [ , 1 ] ) # Hamta grupper i NYA datafilen grupos <- archive de datos sin procesar [, 2] # Skapa dataset ur NYA dátasete runData <- t (archivo de datos sin procesar [,-c(l,2)]) # Skapa antikroppsnamnlista ur NYA datafilen Nombres de Proteina <- read . delim (nombre del archivo, header=FALSE) Nombres de Proteina <- as . carácter (as . matri (Nombres de Proteina) [1, ] ) Nombres de Proteina <- Nombres de Proteina [-( 1 : 2 ) ] , # Kolla antal Ab i nya datasetet antal <- longitud (Nombres de Proteina) # Ge ratt prov- och Ab-namn rownames (runData) <- Nombres de Proteina colnames (runData) <- nombres de muestra # Skapa nya subsets subsetl <- is . element (grupos , strsplit (grupol, ", ") [ [1] ] ) subset2 <- is . element (grupos , strsplit (grupo2, ",") [ [1] ] ) # Skapa ny factorlista svmfac <- factor (rep ( 1 rest ncol (runData )), niveles=c (grupo1 , grupo2 , ' rest ' ) ) svmfac [subsetl] <- grupol svmfac [subset2 ] <- grupo2 # Skapa vektor for ROC-areor dar den basta for varje signaturlángd sparas bestRocPerLength <- rep (NA, antal ) # Berákna medelvárde for varje Ab over alia prov som ár med promedio <- apply (runData, 1, mean) # Skapa vektor fór Ab-ordningen efter ROC-areorna som erhállits nar # respektive antikropp var satt till medelvarde. abOrder<-rep (NA, antal ) # Skapa tránings och testset att kora Datos de entrenamiento <- runData Datos de ensayo <- runData # Skapa variabel for att hálla reda pá hur manga Ab som tagits bort borttagna <- 0 # Kór lika manga gánger som antalet Ab - 1 for(j in l:(antal-l)) { # Skapa en lista med ROC-areor en viss signaturlángd (antal + 1 - j láng) # dar areorna for varje korning dar en Ab i taget har satts till medelvarde Lista ROC <- svmForAbList (antal-borttagna, Datos de entrenamiento, svmfac, promedios) # Lágg Ab med samst inverkan pá ROC-area abOrder[j] <- getRemovedAb (Lista ROC, row. ñames (Datos de entrenamiento) ) # Skapa ny traningsdata dar sámsta Ab tas bort Datos de entrenamiento <- getNewDatos de entrenamiento (Lista ROC, Datos de entrenamiento) # Tar bort samsta Ab ur medelvárdeslistan promedios <- getNewPromedio (Lista ROC, promedios) # Noterar att en Ab tagits bort borttagna <- borttagna+1 # Lágger till várdet pá den basta ROC-arean bestRocPerLength [ j ] <-getBestROC (Lista ROC) } # Lagg till den basta arean fór aktuell langd i en lista BestROCsForEachRun [A, ] <- bestRocPerLength # Lagg till vilken Ab som togs bort fór aktuell lángd i en lista AbRemovalOrderForEachRun [A, ] <- abOrder # Skriv vilken kórning som genomfórts till prompten print (paste ( , "in", A, "of" , NoSamples , "at" , Sys . time ( ) ) ) } # Incluye fuente ( "NaiveBayesian" ) biblioteca (el071) # Skapar en listamed ROC-areor fór en vanda med ett antal antikroppar # dar alia antikroppar satts till medelvárde en gáng svmForAbList <- función (abNumber, Datos de entrenamiento, svmfac, promedios) { Datos de ensayo <- Datos de entrenamiento Lista ROC <- rep (NA, abNumber) para(k in 1: abNumber) # Byter en variabel i tráningsdata till medelvarden, { # kór svmloo, byter tillbaka till orginalvárdena .

Datos de ensayo [k,] <- promedios [k] #Lista ROC[k] <- svmLOOvaluesBE ( Datos de entrenamiento, Datos de ensayo, svmfac) Lista ROC[k] <- svmLOOvaloresProb ( Datos de entrenamiento, Datos de ensayo, svmfac) Datos de ensayo [k,] <- Datos de entrenamiento [k, ] } retroceso (Lista ROC) } # Rapporterar namnet pá antikroppen som kommer tas bort # (den dar ROC-arean var som storst) getRemovedAb <- función (Lista ROC, abNames) { retroceso (Nombres ab [orden (Lista ROC, disminución = T) [1] ] ) } # Rapporterar stórsta ROC-arean getBestROC <- función (Lista ROC) { retroceso (max (Lista ROC)) } # Valjer vilken antikropp som ska tas bort ur tránigsdatan och tar bort den getNewDatos de entrenamiento <- función (Lista ROC, Datos de entrenamiento) { # Positionen for den stórsta ROC-arean tasBort <- order (Lista ROC, decreasing=T) [1] retroceso (Datos de entrenamiento [ -tasBort ,] ) } # Valjer vilken antikropp som ska tas bort ur promedio getNewPromedio <- función (Lista ROC, promedio) { # Positionen fór den stórsta ROC-arean tasBort <- order (Lista ROC, decreasing=T) [1] retroceso (promedio [-tasBort] ) } svmLOOvaluesBE <- función ( Datos de entrenamiento, Datos de ensayo, svmfac) { nmuestras <- ncol (Datos de entrenamiento) res <- numérico (nmuestras) sign <- numérico (nmuestras) para (i in 1 : nmuestras) { svmtrain <- svm(t (Datos de entrenamiento [, -i ] ) , svmfac [-i] , kernel="linear" ) pred <- predict ( svmtrain , t (Datos de ensayo [, i]) , decisión . values=TRUE) res [i] <- as. numérico (attributes (pred) $decision. valúes) fcn <- colnames (attributes (pred) $decision. valúes) [1] if (fcn==paste (levéis (svmfac) [1] , "/", niveles (svmfac) [2] ,sep=w") ) {sign[i]<-l} if (fcn==paste (levéis (svmfac) [2],"/", niveles (svmfac) [1] , sep=w") ) {sign [i] <—1} } res <- sign * res Datos ROC <- myROC (res, svmfac) retroceso (Datos R0C[1]) } # Tranar svm med viss signatur pá viss data och testar pá ett prov testlsample <- function (dataORG, svmfacORG, A, signatureAbs ) { svmtrain <- svm (t (dataORG [ signatureAbs , -A] ) , svmfacORG [-A] , kernel="linear") pred <- predict ( svmtrain , t (dataORG [ signatureAbs , A] ) , decisión. values=TRUE) res <- as . numérico (attributes (pred) $decision . valúes ) retroceso (res) } svmLOOvaloresProb <- función ( Datos de entrenamiento, Datos de ensayo, svmfac) { nmuestras <- ncol (Datos de entrenamiento) tres <- numérico (nmuestras ) #sign <- numérico (nmuestras ) d <- as . numérico (svmfac) -1 y <- numérico (nmuestras ) E <- numérico (nmuestras ) para (i in 1: nmuestras) { svmtrain <- svm(t (Datos de entrenamiento [, -i ] ) , svmfac [-i] , kernel="linear" ) pred <- predict (svmtrain , t (Datos de ensayo[,i]), decisión . alues=TRUE) y [i] <- as . numérico (attributes (pred) $decision . valúes ) } y = 1-(1/(1 + exp(-y) ) ) for (i in 1: nmuestras) { E[i] <- -(d[i]*log(y[i])+(l-d[i])*log(l-y[i])) } retroceso (1/suma (E) ) } TABLA VI - continuación (C) -Ensayo de identificación definida en la Tabla 5(A) biblioteca (MASS) biblioteca (gplots) biblioteca (el071) fuente ("C: /Program/R/R-2.8.1 /library/NaiveBayesian" ) nombre del archivo<-"PaC_all_data . txt" archivo de datos sin procesar <- read. delim (nombre del archivo) nombre de muestra <- as . character (archive de datos sin procesar [ , 1 ] ) grupos <- archivo de datos sin procesar [,2] datos <- t (archivo de datos sin procesar [, -c ( 1 , 2 )] ) Nombres de Proteina <- read . delim (nombre del archivo, header=FALSE) Nombres de Proteina <- as . carácter (as .matrix (Nombres de Proteina) [1, ] ) Nombres de Proteina <- Nombres de Proteína [-( 1 : 2 ) ] rownames (datos ) <- Nombres de Proteína colnames (datos) <- nombres de muestra grupol <- "otro" grupo2 <- "PaC" nEntrenamiento Samples <- 68 nTestSamples <- 35 entrenamiento <- datos [, 1 : nEntrenamiento Samples ] ensayo <- datos [, (nEntrenamiento Samples+1) : (nEntrenamiento Samples+nTestSamples) ] aprioriBoolean <- is . element (rownames (data) , apri) facTr <-factor (rep ("rest", ncol (entrenamiento) ) , niveles=c (grupol, grupo2, "rest")) subconjuntolTr <- is . element (grupos [1 : nEntrenamiento Samples] , grupol) subconjunto2Tr <- is . element (grupos [ 1 : nEntrenamiento Samples] , grupo2) facTr [subconjuntolTr] <- grupol facTr [subconjunto2Tr] <- grupo2 facTe <- factor (rep ("rest", ncol (test )), levels=c (grupol, grupo2, "rest") ) subsetlTe <- is . element (grupos [ (nEntrenamiento Samples+1) : (nEntrenamiento Samples+nTestSamples) ] , strsplit (grupol, ", ") [ [1] ] ) subset2Te <- is . element (grupos [ (nEntrenamiento Samples+1) : (nEntrenamiento Samples+nTestSamples) ] , strsplit (grupo2, ", ") [ [1] ] ) facTe [subconjuntolTe] <- grupol facTe [subconjunto2Te] <- grupo2 svmtrain <- svm (t (entrenamiento [aprioriBoolean,]) , facTr, kernel="linear" ) pred <- predict ( svmtrain, t (test [aprioriBoolean, ] ) , decisión . alúes = TRUE, probability = T) res <- as . numérico (attributes (pred) $decision . valúes , probability = T) facnames <- colnames (attributes (pred) $decision. valúes) [1] Datos ROC <- myROC (res, facTe) Datos ROC[l] SenSpe <- SensitivitySpecificity (res, facTe) Sensibilidad <- as . numérico ( SenSpe [, 1 ] ) Specificity <- as . numérico ( SenSpe [, 2 ] ) omSpecificity <- 1-Specificity plot (omSpecificity, Sensibilidad, ylab="Sensibilidad", xlab="l-Specificity", type="l") mtext (side=l, line = -1.1, paste ("ROC AUC = signif ( Datos R0C[1], digits=2))) TABLA VI - continuación (D) - Modelo SVM final para PaC frente a todos (N+ChP+AIP) $call svm.default(x = t(entrenamiento [aprioriBoolean, ]), y = facTr, kernel = "linear") $tipo [1] 0 $kernel [1] 0 $coste [1] 1 $grado [1] 3 $gamma [1] 0.04 $coef0 [1] 0 $nu [1] 0.5 $épsilon [1] 0.1 $sparse [1] FALSO $scaled [1] VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO VERDADERO $x.scale $x.scale$'scaled:center* Inh. d .est. C3..1. C5..1. CD40..2. Eotaxina..3. GM.CSF..1. lgM..B. IL.11..2. IL.12..1. IL16..1. 24090.45 569451.81 102936.57 22951.29 26674.95 24125.44 20855.98 14129.86 44608.14 20611.42 IL.1a..1. IL1.ra..3. IL.2..3. IL.3..1. IL.4..3. IL.7..2. Integrina.a.10 MCP.1..3. MCP.3..2. MUC.1..P3.15. 219572.74 19584.88 40985.94 49070.16 24741.71 20879.60 13058.64 1 1227.79 14915.23 50846.38 Properdina TGF.M ..1. TNF.a..1. TNF.b..1. VEGF..3. 28296.18 22788.14 13682.89 25428.40 41955.64 Sx.scaleS'scalediscale" Inh. Cl .est. C3..1. C5..1. CD40..2. Eotax¡na..3. GM.CSF..1. lgM..B. IL.11..2. IL.12..1. IL.16..1. 20404.868 122237.943 28461.795 12025.068 13215.275 16954.639 14666.366 10156.372 57988.003 13187.529 IL.1a..1. IL.1.ra..3. IL.2..3. IL.3..1. IL.4..3. IL.7..2. Integrina.a.10 MCP.1..3. MCP.3..2. MUC.1..P3.15. 1531 12.225 1 1314.71 1 76593.575 21019.692 10105.650 19923.025 8856.321 5452.479 6368.842 28650.095 Properdina TGF.M ..1. TNF.a..1. TNF.b..1. VEGF..3. 56720.049 11069.444 8292.061 12180.614 20857.971 $y.scale ANULADO $nclasses [1] 2 $niveles [1] "otro" "PaC" "rest" $tot.nSV [1] 27 $nSV [1] 17 10 $etiquetas [1] 2 $SV lnh. C1.est. C3..1. C5..1. CD40..2. Eotaxina..3. GM.CSF..1. IglVLB. IL.1 1..2. IL12..1. IL.16..1. IL.1a..1.

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Pa009 -0.873764678 -0.411 1 12998 -1.03076857 -0.78714053 -0.5233176752 -1.0569348707 2.27173362 -1.25407017 -1.0252649 0.1360317 -0.2661644 Pa038 -0.206056847 0.009708982 -0.60314751 0.44373161 -0.3919296075 0.8585696202 -0.07305799 -0.03616494 0.8055718 1.6515214 -0.1293500 Pa006 -0.961571 105 -0.289056355 -0.34582654 -1.06718063 -0.6638369686 -0.7098872057 -1.23264385 -1.31169599 -0.6500758 -1.3448447 -0.9306547 Pa013 0.234806863 2.175447589 0.01266928 0.54717541 -0.1957777100 -0.4801514210 -0.99759860 -0.91896270 0.6498548 -1.1706810 0.4960250 Pa024 -0.305358326 -0.221631817 0.36267874 -0.18586281 -0.2572215174 -0.0456176001 0.08051256 0.56408243 -0.5609039 -1.1089805 -0.2477406 Pa056 0.217707838 -0.154053300 -0.72632423 -0.17209153 -0.0467640708 -0.5423370601 -0.53963593 -0.61602551 0.9101779 -1.0850042 -0.7841200 Pa125 0.275035954 -0.224926621 -0.11926723 1.08023147 -0.0206201972 -0.0008422566 1.28473810 0.48915923 0.61 11125 -0.3934791 0.1846749 Pa001 -0.091741993 -0.213105078 -0.47534929 -0.76802149 -0.0327458023 -0.4608177008 -0.98212847 -0.23474026 -0.7966689 -0.2220837 -0.4402696 Pa010 -0.464155570 -0.068647798 0.64754337 -0.22005784 -0.0766204082 0.5695475081 -0.13335331 0.53436185 0.3457089 -0.1 103537 -0.2059105 Pa021 0.809674963 0.0821 11 154 0.57592395 0.85625877 0.5975398206 0.3056060393 -0.07617649 1.04456867 2.3882107 0.2397382 0.4214540 Pa029 -0.59851 1728 -0.226930137 -0.44135325 -0.88287360 -0.4211643576 -0.5463940807 -0.73863658 -0.13480309 -1.0338848 1.3801873 -0.9098994 Pa048 -0.540799012 -0.132230617 -0.48802315 -0.4042141 1 -0.3511893489 -0.2933086328 -0.69288196 -0.32862131 -0.51 17 69 -0.5428015 -0.6331645 Pa058 -0.216266096 -0.263744491 -0.021 1 1594 0.02466775 0.7903127709 -0.4266999225 0.04047197 0.59968815 -0.6309139 0.2644843 0.4347455 Pa092 0.188422574 -0.178937815 0.55239494 -0.03520631 0.0359698815 -0.1928812726 -0.60201879 -0.03639941 0.2006243 -0.6324198 -0.2174438 Pa106 0.134678555 -0.023059591 0.13626501 0.32218390 -0.0635055923 -0.08061 19478 0.09892621 0.72394826 -0.4466987 0.3305753 0.8539264 Pa128 0.007572306 -0.139367554 0.21470674 -0.12000217 -0.1506709444 0.2875368605 -0.35548071 0.63819849 -0.4067314 1.0337810 0.1537436 Pa142 -0.266469132 -0.281152595 0.82774995 -0.25295292 -0.3165063500 -0.3388735672 1.71680502 0.49242804 -0.2902914 1.5769876 -0.3204796 Pa015 -0.414827646 -0.335150876 -0.59577082 -0.84721879 -0.6165233284 -0.5728379380 -1.06685693 -1.32707320 -0.8710250 -1.3049299 -0.7987132 Pa025 -0.614322842 -0.351470829 -0.93514922 -1.21928380 -0.5784378396 -0.7578714150 -1.07065042 -0.36768309 -1.0996868 -1.1292653 -0.8399010 Pa027 -0.289995023 -0.234718460 -0.34640819 -0.11023567 0.0001702044 0.0004392925 -0.35285696 -0.23601985 0.5504571 -0.8609139 0.5920421 Pa045 -0.071721708 -0.122541540 1.74977696 0.33065121 -0.3344757232 -0.0134402551 0.14558436 -0.40419305 0.5895674 -0.9058004 -0.2084024 Pa047 0.579454777 -0.023082065 1.00137061 -0.02504929 0.3732057511 0.4029526915 0.28311658 0.20414137 -0.3904702 1.3038092 -0.3220880 Pa100 -0.409728805 -0.323942678 0.13563267 -0.32632146 0.2183483192 -0.5858327012 -0.32588781 0.36754365 -0.8761754 1.0424584 -0.3768059 Pa121 -0.177281870 -0.189628137 0.0454901 1 -0.22387032 0.0960551709 -0.1245495609 -0.01 148733 0.08500916 -0.2435519 -0.4560824 -0.2646761 Pa129 0.211284366 -0.255781747 0.20501384 -0.08248423 0.7175913867 0.0496293721 0.39857908 0.87914844 0.9371010 -0.3958375 0.6287985 Pa137 -0.641370977 -0.393683315 -1.25425888 1.23623466 -0.7024639259 -0.6739023588 -0.83664778 -0.50259826 -1.1584413 -1.1886815 -1.1372398 Pa147 0.091538371 -0.178739738 0.06208210 0.04644500 -0.0264655443 0.1878050701 0.50826277 -0.60143916 1.5374629 1.31 12835 0.0817073 TNF.a..1. TNF.b..1. VEGF..3.

Pa009 0.40813630 -0.29072629 0.21376386 Pa038 -0.18826712 0.01047747 -0.29116552 Pa006 -0.66615076 -1.03733849 -0.95344856 Pa013 0.13709356 -0.43789203 -0.39786986 Pa024 0.35985522 -0.69484995 -0.3981 1383 Pa056 -0.32725609 -0.65537476 -0.81052618 Pa125 0.13099818 0.09666528 0.25745881 Pa001 -0.54730109 -0.26784028 -0.01851188 Pa010 -0.07002966 0.14109466 0.47584857 Pa021 0.35647693 0.84739885 1.41457100 Pa029 -0.70424687 0.01067955 -0.12682955 Pa048 -0.88347271 -0.37892814 0.03951 195 Pa058 1.71697123 0.18848291 0.01324853 Pa092 -0.43475610 0.92880031 -0.27996250 Pa106 1.01 132754 1.45346413 0.67985051 Pa128 -0.59595956 0.29156722 0.09509325 Pa142 0.12253269 0.41393499 -0.31 173738 Pa015 -0.93543929 -0.62606091 -0.82759284 Pa025 -0.16053458 -0.51839963 -0.21614866 Pa027 0.20233072 0.41248908 -0.18909465 Pa045 -0.17202350 -0.50984474 0.77281999 Pa047 -0.29192335 0.22268877 0.33534050 Pa100 0.48915718 -0.30606315 -0.21250898 Pa121 -0.45976438 0.09615171 0.28373940 Pa129 0.29426203 0.62249829 0.08120801 Pa137 -0.91532270 -0.81985007 -1.12040867 Pa147 0.11963137 0.13800477 0.29478773 $index [1] 1 3 15 16 17 21 24 26 28 30 31 32 34 37 38 42 44 47 48 50 53 54 61 64 66 67 68 $rho [1] -0.6668827 $compprob [1] FALSO $probA ANULADO $probB ANULADO $s¡gma ANULADO $coefs [.1] [1.J 0.30343126 [2,] 0.09542226 [3,] 1.00000000 [4,] 0.20660644 [5,] 0.05461905 [6,] 0.82341233 [7,] 0.50601183 [8,] 1.00000000 [9,] 0.24168457 [10, ] 0.33709008 [11 , | 0.15704187 [12, 0.50405791 [13, 0.24715788 [14,] 0.85521666 [15,] 0.20152940 [16,] 1.00000000 [17,] 0.50180868 [18,] -1.00000000 [19,; -1.00000000 [20,; -1.00000000 [21 ,] -0.49831606 [22,] -1.00000000 [23,; -1.00000000 [24,] -1.00000000 [25,] -1.00000000 [26,] -0.10618995 [27,] -0.43058420 $na.acción ANULADO $fitted Pa009 Pa012 Pa038 Pa042 Pa055 Pa063 Pa066 Pa069 Pa081 Pa097 Pa105 Pa108 Pa1 14 Pa135 Pa006 Pa013 Pa024 Pa033 Pa039 Pa052 Pa056 Pa089 Pa096 Pa125 Pa138 otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro Pa001 Pa007 Pa010 Pa014 Pa021 Pa029 Pa048 Pa053 Pa058 Pa088 Pa091 Pa092 Pa106 Pa1 10 Pa1 19 Pa126 Pa128 Pa133 Pa142 Pa145 Pa005 Pa015 Pa025 Pa026 Pa027 otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro otro PaC otro PaC PaC PaC Pa034 Pa040 Pa045 Pa047 Pa070 Pa071 Pa079 Pa080 Pa085 Pa094 Pa100 Pa102 Pa1 13 Pa121 Pa123 Pa129 Pa137 Pa147 PaC PaC PaC PaC PaC PaC PaC PaC PaC PaC other PaC PaC PaC PaC otro PaC PaC Niveles: otro PaC rest Tabla VII

Claims (94)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra a ensayar del individuo; b) determinar una firma biomarcadora en la muestra de ensayo midiendo la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la Tabla III; en el que la expresión en la muestra de ensayo de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo definidos en la Tabla III es indicativa del individuo que padece cáncer pancreático; y en el que la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión de uno o más de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A) y/o Tabla IV(B).

2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado adicionalmente porque comprende las etapas de: c) proporcionar una muestra de control de un individuo que no padece cáncer pancreático; d) determinar una firma biomarcadora de la muestra control midiendo la expresión en la muestra de control del uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b); en el que la presencia de cáncer pancreático se identifica en el caso de que la expresión en la muestra de ensayo del uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b) sea diferente de la expresión en la muestra de control del uno o más biomarcadores medidos en la etapa (d).

3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado adicionalmente porque comprende las etapas de: e) proporcionar una muestra de control de un individuo que padece cáncer pancreático; f) determinar una firma biomarcadora de la muestra de control midiendo la expresión en la muestra de control del uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b); en el que la presencia de cáncer pancreático se identifica en el caso de que la expresión en la muestra de ensayo del uno o más biomarcadores medidos en la etapa (b) se corresponda con la expresión en la muestra control del uno o más biomarcadores medidos en la etapa (f).

4. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , 2 o 3, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión de uno o más de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A), por ejemplo, al menos 2 de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A).

5. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b) comprende la etapa de medir la expresión de interleucina-7 (IL-7) y/o integrina alfa-10, por ejemplo medir la expresión de interleucina-7, medir la expresión de integrina alfa-10 o medir la expresión de interleucina-7 e integrina alfa-10.

6. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión de cada uno de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(A).

7. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión de 1 o más de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(B).

8. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión de todos los biomarcadores indicados en la Tabla IV(B).

9. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en medir la expresión de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32 o 33 de los biomarcadores indicados en la Tabla IV(C).

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado prorque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión de todos los biomarcadores indicados en la Tabla IV(C).

1 1. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores definidos en la Tabla IV.

12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el procedimiento es para diferenciar entre cáncer pancreático (PaC) y cualquier otra patología o patologías.

13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A).

14. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B).

15. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, 13 o 14, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4 o 5 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C).

16. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D).

17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5 o 6 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F).

18. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), Tabla V(B), Tabla V(C), Tabla V(D) y/o Tabla V(F).

19. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, caracterizado porque la otra patología o patologías es/son pancreatitis crónica (ChP), pancreatitis inflamatoria aguda (AIP) y/o normal, por ejemplo, la otra patología o patologías puede/n ser solo pancreatitis crónica, solo pancreatitis inflamatoria aguda; pancreatitis crónica y pancreatitis inflamatoria aguda; pancreatitis crónica y normal; pancreatitis inflamatoria aguda y normal; o, pancreatitis crónica, pancreatitis inflamatoria aguda y normal.

20. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado porque el procedimiento es para diferenciar entre cáncer pancreático y pancreatitis crónica (ChP).

21. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A).

22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20 o 21 , caracterizado porque la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4, o 5 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C).

23. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, 21 o 22, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A) y/o Tabla V(C).

24. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado porque el procedimiento es para diferenciar entre cáncer pancreático y pancreatitis inflamatoria aguda (AIP).

25. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterzado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A).

26. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B).

27. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, 25 o 26, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C), por ejemplo al menos 2, 3, 4 o 5 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(C).

28. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(E).

29. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(F), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5 o 6 de los biomarcadores en la Tabla V(F).

30. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(H), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores en la Tabla V(H).

31. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), Tabla V(B), Tabla V(C), Tabla V(E), Tabla V(F) y/o Tabla IV(H).

32. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado porque el procedimiento es para diferenciar entre individuos con cáncer pancreático e individuos normales (N).

33. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(A).

34. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32 o 33, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B), por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(B).

35. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, 33 o 34, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(D).

36. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(E).

37. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 66, caracterizado porque la etapa (b) comprende el paso de medir la expresión en la muestra de ensayo de 1 o más biomarcadores de los biomarcadores indicados en la Tabla V(G), por ejemplo al menos 2 o 3 de los biomarcadores indicados en la Tabla V(G).

38. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37, caracterizado porque la etapa (b) comprende o consiste en medir la expresión en la muestra de ensayo de todos los biomarcadores indicados en la Tabla V(A), Tabla V(B), Tabla V(D), Tabla V(E) y/o Tabla IV(G).

39. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 38, caracterizado porque el individuo que no padece cáncer pancreático no padece cáncer pancreático (PaC), pancreatitis crónica (ChP) o pancreatitis inflamatoria aguda (AIP).

40. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el individuo que no padece cáncer pancreático no padece ninguna enfermedad o afección pancreática.

41. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39 o 40, caracterizado porque el individuo que no padece cáncer pancreático no padece ninguna enfermedad o afección.

42. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39, 40 o 41 , caracterizado porque el individuo que no padece cáncer pancreático es un individuo sano.

43. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 38, caracterizado porque el individuo que no padece cáncer pancreático padece pancreatitis crónica.

44. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 38, caracterizado porque el individuo que no padece cáncer pancreático padece pancreatitis inflamatoria aguda.

45. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cáncer pancreático se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma hepatoideo, carcinoma coloidal, carcinoma no diferenciado y carcinomas no indiferenciados con células gigantes de tipo osteoclasto.

46. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el cáncer pancreático es un adenocarcinoma.

47. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b), (d) y/o la etapa (f) se realizan usando un primer agente de unión capaz de unirse a uno o más biomarcadores.

48. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el primer agente de unión comprende o consiste en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

49. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

50. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 48 o 49, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en: scFv; Fab; un dominio de unión de una molécula de inmunoglobulina.

51. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, caracterizado porque el primer agente de unión está inmovilizado sobre una superficie.

52. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque uno o más biomarcadores en la muestra de ensayo se marcan con un resto detectable.

53. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 25, caracterizado porque uno o más biomarcadores en la muestra (o muestras) de control se marca/n con un resto detectable.

54. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 52 o 53, caracterizado porque el resto detectable se selecciona del grupo que consiste en: un resto fluorescente; un resto luminiscente; un resto quimioluminiscente; un resto radioactivo, un resto enzimático.

55. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 52 o 53, caracterizado porque el resto detectable es biotina.

56. El procedimiento de conformidad con ualquiera de las reivindicaciones 47 a 55, caracterizado porque la etapa (b), (d) y/o la etapa (f) se realizan usando un ensayo que comprende un segundo agente de unión capaz de unirse a uno o más biomarcadores, comprendiendo el segundo agente de unión un resto detectable.

57. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56, caracterizado porque el segundo agente de unión comprende o consiste en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

58. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al mismo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

59. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57 o 58, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en: scFv; Fab; un dominio de unión de una molécula de inmunoglobulina.

60. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56 a 59, caracterizado porque el resto detectable se selecciona del grupo que consiste en: un resto fluorescente; un resto luminiscente; un resto quimioluminiscente; un resto radioactivo; un resto enzimático.

61. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el resto detectable es un resto fluorescente (por ejemplo un colorante Alexa Fluor, por ejemplo Alexa647).

62. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el procedimiento comprende un ELISA (enzimoinmunoanálisis de absorción).

63. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa (b), (d) y/o la etapa (f) se realizan usando una matriz.

64. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 63, caracterizadop porque la matriz es una matriz a base de perlas.

65. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la matriz es una matriz a base de una superficie.

66. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, caracterizado porque la matriz se selecciona del grupo que consiste en: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.

67. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el procedimiento comprende: (v) marcar biomarcadores presentes en la muestra con biotina; (vi) poner en contacto las proteínas marcadas con biotina con una matriz que comprenda una pluralidad de scFv inmovilizados en lugares diferentes sobre su superficie, teniendo el scFv especificidad para una o más de las proteínas indicadas en la Tabla III; (vii) poner en contacto el scFv inmovilizado con un conjugado de estreptavidina que comprenda un colorante fluorescente; y (viii) detectar la presencia del colorante en lugares distintos sobre la superficie de la matriz en el que la expresión del colorante en la superficie de la matriz es indicativa de la expresión de un biomarcador de la Tabla III en la muestra.

68. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones en el que, la etapa (b), (d) y/o (f) comprende medir la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifique uno o más biomarcadores.

69. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc o una molécula de ARNm.

70. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARNm.

71. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 68, 69 o 70, caracterizado porque la medición de la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (b), (d) y/o (f) se realiza usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en hibridación Southern, hibridación Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), nanomatriz, micromatriz, macromatriz, autorradiografía e hibridación in situ.

72. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 71 , caracterizado porque la medición de la expresión del uno o más biomarcadores en la etapa (b) se determina usando una micromatriz de ADN.

73. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 72, caracterizado porque la medición de la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (b), (d) y/o (f) se realiza usando uno o más restos de unión, cada uno individualmente capaz de unirse selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica uno de los biomarcadores identificados en la Tabla III.

74. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque cada uno del uno o más restos de unión comprende o consiste en una molécula de ácido nucleico.

75. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque, cada uno del uno o más restos de unión comprende o consiste en ADN, ARN, PNA, LNA, GNA, TNA o PMO.

76. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 74 o 75, caracterizado porque cada uno del uno o más restos de unión comprende o consiste en ADN.

77. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74 a 76, caracterizado porque el uno o más restos de unión tienen una longitud de 5 a 100 nucleótidos.

78. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74 a 76, caracterizadas por que la una o más moléculas de ácido nucleico tiene una longitud de 15 a 35 nucleótidos.

79. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74 a 78, caracterizado porque el resto de unión comprende un resto detectable.

80. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 79, caracterizao porque el resto detectable se selecciona del grupo que consiste en: un resto fluorescente; un resto luminiscente; un resto quimioluminiscente; un resto radioactivo (por ejemplo, un átomo radioactivo); o un resto enzimático.

81. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el resto detectable comprende o consiste en un átomo radioactivo.

82. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 81 , caracterizado porque el átomo radioactivo se selecciona del grupo que consiste en tecnecio-99m, yodo-123, yodo-125, yodo-131 , indio-1 1 1 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, fósforo-32, azufre-35, deuterio, tritio, renio-186, renio-188 e itrio-90.

83. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el resto detectable del resto de unión es un resto fluorescente.

84. El procedimiento de conformidad con alguna de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) se selecciona del grupo que consiste en sangre no fraccionada, plasma, suero, líquido tisular, tejido pancreático, jugo pancreático, bilis y orina.

85. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) se selecciona del grupo que consiste en sangre no fraccionada, plasma y suero.

86. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 84 u 85, caracterizado porque la muestra proporcionada en la etapa (b), (d) y/o (f) es plasma.

87. Una matriz para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo, que comprende uno más agentes de unión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 61.

88. La matriz de conformidadcon la reivindicación 87, caracterizada porque el uno o más agentes de unión es capaz de unirse a todas las proteínas definidas en la Tabla III.

89. El uso de uno más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la Tabla III como un marcado de diagnóstico para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo.

90. El uso de acuerdo con la reivindicación 89 en el que todas las proteínas definidas en la Tabla III se usan como un marcador de diagnóstico para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo.

91. Un kit para determinar la presencia de cáncer pancreático, caracterizado porque comprende: C) uno o más de un primer agente de unión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 55 o una matriz de acuerdo con las reivindicaciones 63 a 66 o reivindicación 87 u 88; D) instrucciones para realizar el procedimiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67 o 68 a 86.

92. El kit de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque comprende un segundo agente de unión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 56 a 61.

93. Un procedimiento o un uso para determinar la presencia de cáncer pancrático en un individuo, sustancialmente como se describe en el presente documento.

94. Una matriz o un kit para determinar la presencia de cáncer pancreático en un individuo, sustancialmente como se describe en el presente documento.