ES2773682T3 - Método para el diagnóstico y tratamiento del cáncer usando anticuerpos que se unen al inactivador de C1, proteína C reactiva y/o componente C4 del complemento - Google Patents

Método para el diagnóstico y tratamiento del cáncer usando anticuerpos que se unen al inactivador de C1, proteína C reactiva y/o componente C4 del complemento Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a la proteína C reactiva humana (anti-CRP) para uso en el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas, inhibiendo el crecimiento del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas y/o inhibiendo la proliferación del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas en un individuo.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para el diagnóstico y tratamiento del cáncer usando anticuerpos que se unen al inactivador de C1, proteína C reactiva y/o componente C4 del complemento
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una composición farmacéutica que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a la proteína C reactiva humana (anti-CRP) para uso en el tratamiento del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas, inhibiendo el crecimiento del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas y/o inhibiendo la proliferación del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas en un individuo.
Antecedentes de la invención
A pesar del rápido incremento del número de tratamientos inmunes disponibles de varios tipos de cáncer, todavía existe una necesidad no solo de desarrollar métodos para el diagnóstico del cáncer aplicando técnicas simples y muy conocidas - también existe una necesidad de desarrollar composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de estos tipos de cáncer. Actualmente, no existe un tratamiento para, p. ej., glioblastomas. Por lo tanto, sería ventajoso desarrollar un método para diagnosticar este tipo de cáncer e incluso más ventajoso desarrollar una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de, p. ej., este tipo específico de cáncer. EP 2 368 564 A1 describe el uso médico de anticuerpos anti-CRP como activo farmacéutico en enfermedades inflamatorias.
Resumen
Así, un objeto se refiere a, p. ej., un nuevo método para diagnosticar cáncer en un individuo aplicando anticuerpos que se unen al inactivador de C1 humano (anti-C1 IA), anticuerpos que se unen a la proteína C reactiva humana (anti-CRP) y/o anticuerpos que se unen al componente C4 del complemento (anti-C4).
Así, un aspecto se refiere a un método para detectar y/o cribar y/o monitorizar el cáncer en un individuo, comprendiendo dicho método determinar:
a) un primer parámetro representado por el nivel de inactivador de C1 esterasa humano (C1 IA) en al menos una muestra del individuo y
b) un segundo parámetro representado por el nivel de proteína C reactiva humana (CRP) en al menos una muestra del individuo
en donde la presencia del primer parámetro por encima de un primer nivel de referencia y la presencia del segundo parámetro por encima de un segundo nivel de referencia es una indicación de que es probable que el individuo tenga cáncer.
Otro aspecto más es proporcionar un método para monitorizar el cáncer en un individuo, comprendiendo dicho método las etapas de
a) tomar muestras sucesivamente de un individuo con cáncer durante un periodo de tiempo,
b) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA) y determinar el nivel de C1 IA humano en dicha muestra,
c) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y determinar el nivel de CRP humana en dicha muestra,
d) comparar el C1 IA determinado de cada una de las muestras en b)
e) comparar la CRP determinada de cada una de las muestras en c) y determinar de esta manera:
a. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es mayor que el nivel de C1 IA humano y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de progreso del cáncer, o
b. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es esencialmente igual al nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de cáncer en estado estacionario, o
c. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es menor que el nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de recuperación del cáncer.
Otro aspecto más es proporcionar a kit que comprende (i) uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) y (ii) instrucciones para el uso de dicho kit.
Un aspecto adicional se refiere a una composición que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4)
Otro aspecto más se refiere a una composición farmacéutica que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) y un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto adicional más se refiere a un método o kit de diagnóstico basado en las mismas variantes de anti-C1 IA, anti-CRP y anti-componente C4 como se usan en la terapia del cáncer, permitiendo de esta manera la identificación de individuos que son receptivos para la terapia del cáncer. Este aspecto puede definirse alternativamente como un método para el tratamiento del cáncer, en donde las mismas variantes de anti-C1 IA, anti-CRP y anti-componente C4 que se usan en un método o kit de diagnóstico como se describe en la presente memoria se usan para el tratamiento de individuos identificados en un método de detección y/o cribado y/o monitorización de la invención.
Descripción breve de las figuras
La Figura 1 muestra inmunoelectroforesis en cohete de Laurell, gel de agarosa que contiene anti-C1 IA de conejo al
2 % (BehringWerke, Alemania). El inmunógeno C1 IA se aplica en los pocillos de la izquierda en dilución seriada, un control con dosis baja del inmunógeno C1 IA en los 6 pocillos del medio, el C1 IA de C1 IA combinado estándar de donantes se aplica en dilución seriada en los pocillos de la derecha.
La Figura 2 muestra la medición de C1 IA y del componente C4 del complemento en muestras de suero usando anticuerpos anti-C1 IA y anti-C4 de conejo usando inmunoelectroforesis en cohete de Laurell. El primer grupo consiste en mediciones de suero de sujetos sanos (C1 IA varía de 15 a 40 % en mg, y C4 varía de 15 a 50 % en mg en sujetos sanos). El segundo grupo de muestras de suero fue de pacientes con enfermedades no malignas, que muestra esencialmente los mismos niveles de C1 IA y C4 que los sujetos sanos. El tercer grupo consiste en muestras de suero de pacientes con diferentes tipos de cánceres malignos (carcinomas), que muestra niveles globales mayores de C1 IA y C4, con algo de superposición entre el grupo de pacientes no maligno.
La Figura 3 muestra la medición en el citofotómetro Leitz MPV2 de C1 IA, la columna 1 muestra cultivos de células de carcinoma de varias biopsias de carcinoma en explantes, los resultados se proporcionan en número de células en porcentaje para cada cultivo de células de carcinoma ensayado (37) cultivos de células de carcinoma de explantes de biopsias de pacientes con varios tipos de carcinomas, usando anti-C1 IA de conejo isotiocianato de fluoresceína (FITC). La columna 2 muestra 24 células de carcinoma subcultivadas durante varios días, y reensayadas para determinar la presencia de C1 IA usando anti-C1 IA FITC. La columna 3 muestra 12 cultivos (controles) preincubados con anti-C1 IA de conejo no marcado, lavados y después incubados con anti-C1 IA de conejo FITC. En la columna 4, diez (10) cultivos de células de explantes no malignos se incubaron con anti-C1 IA de conejo FITC y no mostraron unión del anti-C1 IA marcado con FITC.
La Figura 4a muestra una visión global de las áreas del sistema del complejo del complemento inmune innato de "bloqueo" por el inhibidor de C1 que afectan la activación de C1rs, que se bloquea para actuar con el componente C4 (tres áreas rodeadas por un círculo en la esquina superior izquierda), C4 rodeado por un círculo indica sin activación de C4 a C4b y sin activación de C2 a C9. El bloqueo de CRP inhibe C5 (rodeado por un círculo). "X" indica la parte bloqueada de C5 del sistema del complemento. El siguiente círculo cruzado indica ausencia de perforación debida a la inhibición del efecto de lisis de C5b - C9.
La Figura 4b una visión global de las áreas del sistema del complejo del complemento inmune innato desbloqueadas por anti-C1 IA humano recombinante y anti-CPR humano recombinante infundidos/inyectados en el paciente con carcinoma. A) El anti-C1-IA recombinante activa C1rs, y desbloquea C4 que se divide ahora en C4b permitiendo la activación del componente C2 del complemento hasta C9. B) El anti-CRP humano recombinante activa/desbloquea el componente C5 del complemento (rodeado por un círculo) indicando el desbloqueo del componente C5 del complemento que se convierte en C5b y permite la activación de los componentes C6-C9 del sistema del complemento. La siguiente flecha indica el efecto de lisis del C9 "acumulado" que perfora la célula de carcinoma dando lugar a la lisis celular y a la muerte celular causada por la perforación de C9.
La Figura 5 muestra una inmunodifusión radial doble modificada (RID Doble) usando el método de Mancini. La inmunodifusión doble de Mancini es una técnica de difusión en la que el gel de agar contiene anti-C1 IA de cerdo y anti-CRP de cerdo (detectado recientemente) que consiste en inmunógeno purificado de células de carcinoma humano. Los 3 pocillos superiores contienen 25 ul de suero de donante estándar que muestra una reacción con C1 IA y los pocillos inferiores contienen suero de 3 pacientes con cáncer con distinta concentración de CRP y C1 IA. La difusión se deja toda la noche en nevera y se examina al día siguiente. Puede observarse que los anillos radiales grandes inferiores cruzan el anillo superior de C1 IA del donante estándar. Se identificó posteriormente en otros ensayos que estos eran CPR usando anti-CRP originado a partir del inmunógeno de carcinoma, recogidos directamente conjuntamente con el C1 IA y purificados usando métodos diseñados para purificar C1 IA.
La Figura 6a muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma RG-2 de rata observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 6b muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma RG-2 de rata observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 7a muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma NS-1 (CNS-1) de rata observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 7b muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma NS-1 (CNS-1) de rata observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 8 muestra la fluorescencia verde derivada de la GFP incorporada en las células con la fluorescencia verde especialmente visible en el núcleo y en el citoplasma de las células de glioma. El anti-CRP marcado con TRITS rojo aparece recubriendo la periferia de las células de glioma RG-2 proporcionando evidencia de una CRP localizada en la membrana plasmática reaccionando con anti-humano de conejo (que se sabe que reacciona de manera cruzada con anti-CRP de rata).
La Figura 9 muestra un recubrimiento de C1-IA de células de glioma RG-2 de rata. Se usa la tinción Dapi para mostrar los núcleos, y la tinción con Dapi junto con anti-C1 IA (más anticuerpo en sándwich (TRITS) proporciona evidencia de que los núcleos de estas células de glioma de rata no se tiñen con anti C1-IA y que C1 IA está meramente presente en el recubrimiento de la célula.
La Figura 10a muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma RG-2 de rata observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 10b muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma RG-2 de rata observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 11a muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma NS-1 (CNS-1) de rata que expresan CRP, observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 11b muestra la fluorescencia de TRITS de células de glioma NS-1 (CNS-1) de rata que muestran expresión de CRP, observadas en microscopio de fluorescencia.
La Figura 12 muestra el examen en microscopio de campo oscuro de células de glioma RG-2 de rata con GFP incorporada proporcionando evidencia de las células RG-2 vivas en el cultivo.
La Figura 13 muestra la fluorescencia verde derivada de la GFP incorporada en las células con la fluorescencia verde especialmente visible en el núcleo y en el citoplasma de las células de glioma. El anticuerpo marcado con TRITS rojo aparece recubriendo la membrana plasmática de las células de glioma RG-2 proporcionando evidencia de una proteína de recubrimiento localizada en la membrana plasmática, proteína C reactiva (CRP) que reacciona con anti humano de conejo (que se sabe que reacciona de manera cruzada con anti proteína C reactiva de rata) y usando el método de sándwich, un anticuerpo secundario marcado con TRITS muestra la localización de la CRP en las células.
La Figura 14 muestra el recubrimiento del inactivador de C1 de las células de glioma RG-2 de rata. Fotografía superior izquierda, se usa tinción verde de GFP fusionada para mostrar los núcleos y localizar la unión del inactivador de C1 a las células de glioma RG-2 de rata, fotografía superior izquierda células de glioma RG-2 de rata que muestran C1 IA como se indica por el anticuerpo anti C1 IA, más anticuerpo secundario en sándwich marcado con TRITS. La fotografía inferior derecha revela la tinción del gen GFP en las células RG-2.
La Figura 15 muestra cuatro fotografías que muestran las células de glioma NS-1 de rata identificadas como células vivas con el gen GFP en la fotografía superior derecha, y tinción de los núcleos con Dapi azul en la fotografía inferior derecha. Las células de glioma se hicieron impermeables para la inmunotinción con anti C1 IA TRITS en la fotografía superior izquierda. En la fotografía inferior izquierda la inmunotinción con anticuerpo primario anti C1 IA y tinción con anticuerpo secundario marcado con TRITS (técnica de sándwich se fusionó con tinción con Dapi azul indicando el núcleo de las células en contraste con el recubrimiento externo que muestra expresión de C1 IA.
La Figura 16a muestra el recubrimiento del inactivador de C1 expresado en células de glioma AMN humano (glioblastoma) mostrado por la incubación de las células con anti inactivador de C1 y usando anticuerpo secundario marcado con FITC (método de sándwich), realizado usando la impermeabilización de las células como se muestra en la fotografía superior e inferior izquierda a diferentes aumentos. La tinción con Dapi azul se realizó en las mismas células y se muestra en la sección superior e inferior media. Las fotografías superior e inferior en el lado derecho muestran versiones fusionadas de la expresión de C1 IA y la tinción de los núcleos con Dapi, proporcionando evidencia de que la membrana plasmática de las células está recubierta con C1 IA.
La Figura 16b muestra el recubrimiento del inactivador de C1 expresado en células de glioma GA humano (glioblastoma) mostrado por la incubación de las células con anti inactivador de C1 y usando anticuerpo secundario marcado con FITC (método de sándwich), realizado usando la impermeabilización de las células como se muestra en la fotografía superior e inferior izquierda a diferentes aumentos. La tinción con Dapi azul se realizó en las mismas células y se muestra en la sección superior e inferior media. Las fotografías superior e inferior en el lado derecho muestran versiones fusionadas de la expresión de C1 IA y la tinción de los núcleos con Dapi, proporcionando evidencia de que la membrana plasmática de las células está recubierta con C1 IA.
La Figura 16c muestra el recubrimiento del inactivador de C1 expresado en células de glioma DZ humano (glioblastoma) mostrado por la incubación de las células con anti inactivador de C1 y usando anticuerpo secundario marcado con FITC (método de sándwich), realizado usando la impermeabilización de las células como se muestra en la fotografía superior e inferior izquierda a diferentes aumentos. La tinción con Dapi azul se realizó en las mismas células y se muestra en la sección superior e inferior media. Las fotografías superior e inferior en el lado derecho muestran versiones fusionadas de la expresión de C1 IA y la tinción de los núcleos con Dapi, proporcionando evidencia de que la membrana plasmática de las células está recubierta con C1 IA.
La Figura 17 muestra una débil expresión de C1 IA en el núcleo de los fibroblastos de la piel humana, a diferencia de las células cancerosas (p. ej., glioma de rata y glioma/glioblastoma humano), donde el C1 IA proporcionó una señal fuerte en el citoplasma y en las membranas plasmáticas de las células cancerosas.
La Figura 18 muestra en las tres imágenes marcadas A y una fotografía marcada B, CRP en fibroblasto (fibroblastos de la piel benignos), incubación con anti CRP y con anticuerpo secundario marcado con FITC sin tratamiento para la impermeabilización. No se observa una expresión significativa de CRP. Las fotografías marcadas CRP en células GA (fotografía inferior media; células de glioma/glioblastoma GA humano) y CRP en células AMN (inferior derecha; células de glioma/glioblastoma AMN humano) muestran la expresión de CRP. En estas dos últimas fotografías, hay una unión significativa de la CRP.
La Figura 19 y 20 muestran la matriz Gene Chip de affymetrix.
La Figura 21 muestra la lectura génica C1r NCBI X03084 ARNm humano para ARNm de C1r del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de inhibidor de C1 (C1 IA): > 1 log sobre la línea límite= Actividad del gen C1 IA presente en los cuatro (4) cultivos de células mesenquimales diferentes Morado claro= Lectura del nivel de Control X, sin activación génica. Línea límite roja: <90 lectura= sin actividad génica del colágeno X.
La Figura 22 muestra la lectura génica de C1q NCBI X03084 ARNm humano para para la cadena B de C1q del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de la cadena B de C1q <90 = sin actividad génica de C1q Morado claro= Lectura del nivel de Control X, <90 = sin activación génica. Línea límite roja: <90 lectura= sin actividad génica C1q-B o colágeno tipo X.
La Figura 23 muestra la lectura génica de C1r NCBI M14048, ARNm humano para ARNm de C1r del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de C1r: significativamente > 1 log sobre la línea límite= Actividad génica. Morado claro= Lectura del nivel de Control X, sin activación génica. Línea límite: lectura <90 = sin actividad génica del colágeno X.
La Figura 24 muestra la lectura génica de C4b NCBI U24578. ARNm humano para C4b del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de la cadena C4b <90= sin actividad génica de C4b Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90 = sin activación génica. Línea límite: lectura <90 = sin actividad génica de C4b o colágeno de tipo X.
La Figura 25 muestra la lectura génica de C5 NCBI M57729. C5b es una parte escindida del ARNm humano para C5 del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes, KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de la cadena C5 <90= sin actividad génica de C5 Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de C5 o colágeno de tipo X.
La Figura 26 muestra la lectura génica del componente C6 del complemento NCBI X72177. C6 del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de la cadena C6 <90= sin actividad génica de C6 Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de C6 o colágeno de tipo X.
La Figura 27 muestra la lectura génica del componente C7 del complemento NCBI J03507. C7 del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de la cadena C7 <90= sin actividad génica de C7 Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de C7 o colágeno de tipo X.
La Figura 28 muestra la lectura génica del componente C8 (beta) del complemento NCBI M16973. C8 del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de la cadena C8 <90= sin actividad génica de C8 (beta) Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de C8 o colágeno de tipo X.
La Figura 29 muestra la lectura génica del componente C8 (alfa) del complemento NCBI M16974. C8 del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de cadena de C8 <90 = sin actividad génica de C8 (alfa) Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de C8 (alfa) o colágeno de tipo X'
La Figura 30 muestra la lectura génica del componente C9 del complemento NCBI K02766. C9 del sistema del complemento de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB. Morado oscuro= Lectura del nivel de cadena de C9 <90= sin actividad génica de C9 Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de C9 o colágeno de tipo X.
La Figura 31 muestra la lectura génica de C reactiva PI X56692. La proteína C reactiva (CRP) en células mesenquimales benignas (condroblastos) de cada uno de los cuatro (4) pacientes: KM, HL, MT, e IB de los que se recogió el cartílago y las células se cultivaron usando el método de explantes, no muestran activación génica de CRP Morado oscuro= Lectura del nivel de CRP <90= sin actividad génica de CRP (alfa) Morado claro= Lectura del nivel de Control de complemento X, <90= sin activación génica. Línea límite: lectura <90= sin actividad génica de la proteína C reactiva o colágeno de tipo X.
La Figura 32 muestra el ARNm del inhibidor de C1 NCBI 144838 en glioblastoma de AMN y DZ de pacientes. Los valores en glioblastoma exceden Log 1 sobre el tejido cerebral normal tanto en AMN como DZ.
La Figura 33 muestra el ARNm del precursor de C1r NCBI T69603 en glioblastoma de AMN y DZ de pacientes. Los valores en glioblastoma exceden Log 1 sobre el tejido cerebral normal tanto en AMN como DZ.
La Figura 34 muestra el ARNm del componente C4a del complemento NBCI AA664406 en glioblastoma de AMN y DZ de pacientes. Los valores en glioblastoma exceden Log 1 sobre el tejido cerebral normal tanto en AMN como DZ.
La Figura 35 muestra el ARNm del componente C2 del complemento NCBI T71878 NBCI AA664406 en glioblastoma de AMN y DZ de pacientes. Los valores en glioblastoma exceden Log 1 sobre el tejido cerebral normal tanto en AMN como DZ.
La Figura 36 muestra el ARNm del componente C5 del complemento NCBI AA780059 NBCI en glioblastoma de AMN y de DZ. Los valores en glioblastoma Log negativo por debajo del tejido cerebral normal tanto en AMN como DZ.
La Figura 37 muestra una visión global del sistema del complemento y cómo C1 IA y/o CRP inhiben el sistema del complemento.
La presente invención se describirá ahora con más detalle en lo que sigue.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Antes de discutir la presente invención con más detalle, se definirán en primer lugar los siguientes términos y convenciones:
Anticuerpo: en el presente contexto, un anticuerpo es una proteína que se une específicamente a un antígeno correspondiente. Los anticuerpos pueden surgir particularmente del sistema inmune, p. ej., de mamíferos, y pueden estar dirigidos hacia antígenos relacionados con cuerpos extraños. Un anticuerpo es una inmunoglobulina intacta que tiene dos cadenas ligeras y dos pesadas. Así, un único anticuerpo aislado o fragmento puede originarse de la lista no limitante de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico, o un anticuerpo humanizado. El término anticuerpo se usa para hacer referencia tanto a una mezcla molecular homogénea como a una mezcla tal como un producto sérico compuesto por una pluralidad de diferentes entidades moleculares.
En el presente contexto, inactivador de C1 (C1 IA) es un inhibidor de proteasa que pertenece a la superfamilia de la serpina. Su función principal es la inhibición del sistema del complemento para prevenir la activación espontánea. El inhibidor de C1 es una proteína de fase aguda que circula en la sangre. En el presente contexto, los términos inactivador de C1, inhibidor de C1, C1-inh o inhibidor de la C1 esterasa se usan en la presente memoria indistintamente. Inactivador de C1 puede abreviarse: C1 IA o C1-IA. La proteína es una proteína humana - así, el término "humano" puede insertarse después de C1 IA. C1 IA es una neuraminoglicoproteína alfa 1 de aminoácidos con un peso molecular de 110-130 kDa. El peso molecular es variable debido a diferencias potenciales en la glicosilación de la proteína. La proteína C1 IA es un inhibidor de C1 (C1-inh, inhibidor de la C1 esterasa) que es un inhibidor de proteasa que pertenece a la superfamilia de la serpina. Su función principal es la inhibición del sistema del complemento para prevenir la activación espontánea y es una proteína de fase aguda que circula en la sangre a niveles de aproximadamente 0,25 g/L. Los niveles se elevan ~2-veces durante la inflamación. El inhibidor de C1 se une irreversiblemente a e inactiva C1r y C1s proteasas en el complejo C1 de la ruta clásica del complemento. Los alias para la proteína son SERPING1, C1IN, C1INH, C1NH, HAE1, HAE2, miembro G de la familia de la serpina 1. En los seres humanos, la proteína C1 IA está codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Número de acceso de Genebank: X54486 e ID del Gen: 710 en NCBI.
En el presente contexto, la proteína C reactiva (CRP) es una proteína pentamérica anular (con forma de anillo), encontrada en el plasma sanguíneo, cuyos niveles se elevan en respuesta a la inflamación. Es una proteína de fase aguda de origen hepático que se incrementa después de la secreción de interleuquina-6 por los macrófagos y células T. Su papel fisiológico es unirse a la lisofosfatidilcolina expresada en la superficie de células muertas o moribundas (y algunos tipos de bacterias) con el fin de activar el sistema del complemento a través del complejo C1Q. CRP es sintetizada por el hígado en respuesta a factores liberados por los macrófagos y células adiposas (adipocitos). La proteína C reactiva puede abreviarse como CRP. La proteína es una proteína humana - así, el término "humana" puede insertarse después de CRP. La proteína CRP pertenece a la familia de la pentaxina. Está implicada en varias funciones relacionadas con la defensa del huésped basadas en su capacidad de reconocer patógenos extraños y células dañadas del huésped y de iniciar su eliminación interaccionando con sistemas efectores humorales y celulares en la sangre. Por consiguiente, el nivel de esta proteína en plasma se incrementa en gran medida durante la respuesta de fase aguda al daño tisular, infección, u otros estímulos inflamatorios. En La Figura 37 puede observarse que la proteína C reactiva aumenta el complejo C1qrs, y a través de su unión al factor H, CRP inmoviliza el factor componente C3b del complemento. En los seres humanos, la proteína CRP está codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2. Acceso Genbank; X56692 e ID del Gen: ID del Gen: 1401 en NCBI).
El componente C4 del complemento (C4) en los seres humanos, es una proteína implicada en el intrincado sistema del complemento, que se origina a partir del sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA). Realiza varias funciones críticas en inmunidad, tolerancia, y autoinmunidad con los demás numerosos componentes. Además, es un factor crucial en la conexión de las rutas de reconocimiento del sistema global instigado por los complejos anticuerpoantígeno (Ab-Ag) con las otras proteínas efectoras de la respuesta inmune innata. El componente C4 del complemento puede abreviarse: C4. La proteína es una proteína humana - así, el término "humana" puede insertarse después de C4. C4 también es conocida como CH; C4F; CO4; C4B1; C4B2; C4B3; C4B5; C4BD; C4B12; C4B_2; CPAMD3. Factor 4 del complemento, parte de la ruta de activación clásica. La proteína se expresa como un precursor de cadena única que se escinde proteolíticamente en un trímero de cadenas alfa, beta, y gamma antes de la secreción. El trímero proporciona una superficie para la interacción entre el complejo antígeno-anticuerpo y otros componentes del complemento. La cadena alfa puede escindirse para liberar la anafilatoxina C4, un mediador de la inflamación local. La deficiencia de esta proteína está asociada con el lupus eritematoso sistémico. Este gen está localizado en la región del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase III en el cromosoma 6. Existen varios haplotipos de esta agrupación génica, de manera que los individuos pueden tener 1, 2, o 3 copias de este gen. Además, este gen existe como una forma larga y una forma corta debido a la presencia o ausencia de un retrovirus HERV-K endógeno de
6,4 kb en el intrón 9.
En los seres humanos, la proteína C4 está codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3. ID del Gen: 721 en NCBI y acceso Genebank U24578.
El término "anticuerpo que se une al inactivador de C1 (C1 IA) humano" (anti-C1 IA), tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier anticuerpo que se une a un epítopo en la parte extracelular de C1 IA.
El término "anticuerpo que se une a la proteína C reactiva (CRP) humana" (anti-CRP), tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier anticuerpo que se une a un epítopo en la parte extracelular de CRP.
El término "anticuerpo que se une al componente C4 del complemento (anti-C4)", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier anticuerpo que se une a un epítopo en la parte extracelular de C4.
El término "epítopo" significa un determinante proteico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupaciones de moléculas en la superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares o una combinación de los mismos y tienen habitualmente características específicas de estructura tridimensional, así como características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros, pero no a los últimos se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender residuos de aminoácidos que están implicados directamente en la unión, y otros residuos de aminoácidos que no están implicados directamente en la unión, tal como residuos de aminoácidos que están bloqueados o cubiertos de manera efectiva por el péptido específico de unión a antígeno (en otras palabras, el residuo de aminoácido está en la huella del péptido específico de unión a antígeno).
El sistema del complemento es una parte del sistema inmune que aumenta (complementa) la capacidad de los anticuerpos y células fagocíticas de eliminar microbios y células dañadas de un organismo, promueve la inflamación, y ataca la membrana plasmática del patógeno. Es parte del sistema inmune innato que no es adaptable y no cambia durante el curso de la vida del individuo. Puede ser reclutado y puesto en acción por el sistema inmune adaptativo.
En el presente contexto, el término "anti-C1 IA" debe entenderse como una molécula de anticuerpo que se une al inactivador de C1 (C1 IA) humano.
En el presente contexto, el término "anti-CRP" debe entenderse como una molécula de anticuerpo que se une a la proteína C reactiva humana.
En el presente contexto el término "anti-C4" debe entenderse como una molécula de anticuerpo que se une al componente C4 del complemento (C4) humano.
Los términos "anticuerpo monoclonal", "Ab monoclonal", "composición de anticuerpo monoclonal", "mAb", o semejantes, tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad y afinidad de unión para un epítopo particular. De acuerdo con esto, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden producirse por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico o transcromosómico, tal como un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera, fusionado con una célula inmortalizada.
Diagnóstico/cri bado/monitorización
Un aspecto proporciona un método para método para detectar y/o cribar y/o monitorizar el cáncer en un individuo adecuado para facilitar el diagnóstico temprano de un cáncer.
Es otro aspecto proporcionar un método para monitorizar la recurrencia de un cáncer, estado de un cáncer o el efecto del tratamiento del cáncer en un individuo.
En un ejemplo, la descripción se refiere a un método para detectar y/o cribar y/o monitorizar el cáncer en un individuo, comprendiendo dicho método determinar:
a) un primer parámetro representado por el nivel de inactivador de la C1 esterasa (C1 IA) en al menos una muestra del individuo y
b) un segundo parámetro representado por el nivel de proteína C reactiva (CRP) en al menos una muestra del individuo
en donde la presencia del primer parámetro por encima de un primer nivel de referencia y la presencia del segundo parámetro por encima de un segundo nivel de referencia es una indicación de que es probable que el individuo tenga cáncer.
La monitorización del cáncer también significa recurrencia del cáncer.
El método también puede comprender determinar:
c) un tercer parámetro representado por el nivel del componente C4 del complemento (C4) humano en al menos una muestra del individuo,
y en donde la presencia del primer parámetro por encima de un primer nivel de referencia, la presencia del segundo parámetro por encima de un segundo nivel de referencia y la presencia del tercer parámetro por encima de un tercer nivel de referencia es una indicación de que es probable que el individuo tenga cáncer.
En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un método para detectar y/o cribar y/o monitorizar el cáncer en un individuo, comprendiendo dicho método determinar:
a) un primer parámetro representado por la concentración del inactivador de la C1 esterasa (C1 IA) en al menos una excreta del individuo y
b) un segundo parámetro representado por la concentración del componente C4 del complemento (C4) humano en al menos una excreta del individuo
en donde la presencia del primer parámetro en o por encima de un primer valor de discriminación predeterminado y la presencia del segundo parámetro por encima de un segundo valor de discriminación predeterminado es una indicación de que el individuo tiene una alta probabilidad de tener cáncer.
Los términos excreta y muestra se usan en la presente memoria indistintamente.
El nivel de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano puede ser la concentración de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano.
Los inventores han encontrado sorprendentemente que niveles altos del inactivador de la C1 esterasa (C1 IA) en combinación con niveles altos de proteína C reactiva en excreta humana pueden ser indicativos de cáncer.
Es posible, por lo tanto, proporcionar un método fácil y económico para la detección temprana y la monitorización de un cáncer en un individuo o poblaciones grandes usando el método de la presente invención.
Con el fin de no obtener ningún resultado falso positivo, es importante determinar un nivel de referencia, que divida a los individuos ensayados en un grupo que tiene bien una alta o baja probabilidad de tener cáncer.
El primer nivel de referencia se establece midiendo la concentración del inactivador de la C1 esterasa (C1 IA) tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido y determinando de esta manera el valor de discriminación. El valor de discriminación identifica la población con cáncer bien con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada o ambas, y se basa en un análisis de la relación entre los valores de concentración y los datos clínicos conocidos de la población control sana y la población de pacientes con cáncer.
El segundo nivel de referencia se establece midiendo la concentración de la proteína C reactiva (CRP) humana tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido y determinando de esta manera el valor de discriminación. El valor de discriminación identifica la población con cáncer bien con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada o ambas, y se basa en un análisis de la relación entre los valores de concentración y los datos clínicos conocidos de la población control sana y la población de pacientes con cáncer.
El tercer nivel de referencia se establece midiendo la concentración del componente C4 del complemento (C4) humano tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido y determinando de esta manera el valor de discriminación. El valor de discriminación identifica la población con cáncer bien con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada o ambas, y se basa en un análisis de la relación entre los valores de concentración y los datos clínicos conocidos de la población control sana y la población de pacientes con cáncer.
El valor de discriminación determinado de esta manera es válido para el mismo ajuste experimental en ensayos individuales futuros.
En un ejemplo más, el primer nivel de referencia se determina determinando la concentración de C1 IA humano en al menos una muestra tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido, determinando de esta manera el primer nivel de referencia que identifica la población con cáncer con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada. Asimismo, el segundo nivel de referencia puede determinarse determinando la concentración total de CRP humana en al menos una muestra tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido, determinando de esta manera el primer nivel de referencia que identifica la población con cáncer con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada. También, el tercer nivel de referencia se determina determinando la concentración total de C4 humano en al menos una muestra tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido, determinando de esta manera el primer nivel de referencia que identifica la población con cáncer con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada.
En un ejemplo, el primer parámetro puede ser la concentración de C1 IA humano, el segundo parámetro puede ser la concentración de CRP humana y el tercer parámetro puede ser la concentración de C4 humano.
En un ejemplo adicional, la concentración de C1 IA humano y/o la concentración de CRP humana y/o la concentración de C4 humano pueden obtenerse en cualquier momento antes de la operación y/o tratamiento médico y/o irradiación.
En otro ejemplo, la concentración de C1 IA humano y/o la concentración de CRP humana y/o la concentración de C4 humano nativo pueden obtenerse en cualquier momento después de una operación y/o tratamiento médico y/o irradiación, tal como 2 semanas, 1 mes, 1,5 mes, 2 meses, 3 mes, 4 meses, 5 mes, 6 meses, 7 mes, 8 meses después de la operación y/o tratamiento médico y/o irradiación.
Los niveles de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano pueden medirse por métodos analíticos convencionales, tales como métodos inmunológicos conocidos en la técnica.
Las mediciones de los marcadores biológicos tales como C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano pueden combinarse con mediciones de otras moléculas a nivel génico, de ARN, o proteína según las enseñanzas de la presente memoria.
Como se ha indicado anteriormente, la determinación de las concentraciones de los marcadores biológicos tales como C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano puede hacerse al nivel de proteína o ácido nucleico. Los ligandos de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 son particularmente útiles para detectar y/o cuantificar estas moléculas.
Los anticuerpos que se unen a C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano son particularmente útiles. Las técnicas para los ensayos contemplados en la presente memoria son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos en sándwich, multiplexación xMAP, Luminex, ELISA y ELISpot. La referencia a anticuerpos incluye partes de anticuerpos, anticuerpos "mamalianizados" (p. ej., humanizados), anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes o sintéticos y anticuerpos híbridos y de cadena única.
Así, puede ser preferible que la concentración de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano se mida mediante un inmunoensayo. El inmunoensayo puede ser ELISA y el resultado del ELISA puede obtenerse usando ensayo de CRP de alta sensibilidad (HSCRP).
En un ejemplo, el ELISA aplica uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano, uno o más anticuerpos que se unen a CPR humana y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano.
Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales pueden obtenerse por inmunización con C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano o fragmentos antigénicos de los mismos y cualquiera de los dos tipos puede utilizarse para los inmunoensayos. Los métodos de obtención de estos tipos de sueros son muy conocidos en la técnica.
Los sueros policlonales pueden ser menos preferidos, pero se preparan relativamente fácilmente por inyección en un animal de laboratorio adecuado de una cantidad efectiva de, p. ej., C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano o parte antigénica de los mismos, recogida de suero o plasma del animal y aislamiento de suero específico por cualquiera de las técnicas inmunoadsorbentes conocidas. Aunque los anticuerpos producidos por este método son utilizables en prácticamente cualquier tipo de inmunoensayo, son generalmente menos favorecidos debido a la heterogeneidad potencial del producto.
El uso de anticuerpos monoclonales en un inmunoensayo puede preferirse particularmente debido a la capacidad de producirlos en grandes cantidades y a la homogeneidad del producto. La preparación de líneas celulares de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales derivados de la fusión de una línea celular inmortal y linfocitos sensibilizados frente a la preparación inmunogénica puede hacerse por técnicas que son muy conocidas para los expertos en la técnica.
La detección también puede obtenerse bien por la medición directa del C1 IA humano, CRP humana o C4 humano usando un anticuerpo específico en un inmunoensayo de polarización fluorescente competitivo (CFIPA) o por detección de la homodimerización de interferón-gamma por polarización de fluorescencia inducida por dimerización (DIFP).
En una realización, el C1 IA humano puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En una realización, la CRP humana puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
En una realización, el C4 humano puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
Los anticuerpos (es decir, el uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano, el uno o más anticuerpos que se unen a CPR humana y/o el uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano) pueden seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico, o un anticuerpo humanizado y anticuerpo oligoclonal.
En una realización preferida, el anticuerpo puede producirse por métodos recombinantes o por un método de hibridoma; dichos métodos serán conocidos para el experto en la técnica.
En un ejemplo, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma maligno, carcinomas escamosos (cáncer esofágico, cáncer de laringe, carcinomas bronquiales, carcinomas rectales, carcinoma del páncreas), adenocarcinomas, tales como carcinomas de colon de varios tipos y subtipos, carcinomas de páncreas, carcinoma de páncreas ductal, carcinoma de páncreas acinar, todas las estructuras epiteliales glandulares en las que los adenocarcinomas malignos, tales como carcinomas de mama, carcinomas bronquiales, que varía de carcinomas alveolares pulmonares, carcinomas de mama, p. ej., ductal, lobular, etc., carcinomas hepatocelulares y carcinomas de riñón, carcinomas de vejiga, tumor de cerebro maligno, incluyendo glioblastomas y oligodendroglioma y determinados grados de astrocitomas (grado III).
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para monitorizar el cáncer en un individuo, comprendiendo dicho método las etapas de
a) tomar muestras sucesivamente de un individuo con cáncer durante un periodo de tiempo,
b) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA) y determinar el nivel de C1 IA humano en dicha muestra,
c) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y determinar el nivel de CRP humana en dicha muestra,
d) comparar el C1 IA determinado cada una de las muestras en b)
e) comparar la CRP determinada de cada una de las muestras en c) y determinar de esta manera:
a. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es mayor que el nivel de C1 IA humano y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de progreso del cáncer, o
b. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es esencialmente igual al nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de estado estacionario del cáncer, o
c. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es menor que el nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de recuperación del cáncer.
En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un método para monitorizar el cáncer en un individuo, comprendiendo dicho método las etapas de
a) tomar muestras sucesivamente de un individuo con cáncer durante un periodo de tiempo,
b) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA) y determinar el nivel de C1 IA humano en dicha muestra,
c) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y determinar el nivel de CRP humana en dicha muestra,
d) incubar una muestra obtenida en la etapa a) con uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) y determinar el nivel de C4 humano en dicha muestra,
e) comparar el C1 IA determinado de cada una de las muestras en b)
f) comparar la CRP determinada de cada una de las muestras en c)
g) comparar el C4 determinado de cada una de las muestras en d)
y determinar de esta manera:
a. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es mayor que el nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente y si los niveles de C4 son menores que el nivel de C4 en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de progreso del cáncer, o
b. si el nivel de C1 IA y el nivel de CRP es esencialmente igual al nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente y si los niveles de C4 son esencialmente iguales al nivel de C4 en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de estado estacionario del cáncer, o
c. si los niveles de C1 IA y CRP son menores que el nivel de C1 IA y el nivel de CRP en la mezcla inmediatamente precedente y si los niveles de C4 son mayores que el nivel de c 4 en la mezcla inmediatamente precedente, lo que es indicativo de recuperación del cáncer.
Especificidad y sensibilidad
La sensibilidad de cualquier ensayo de diagnóstico dado define la proporción de individuos con una respuesta positiva que se identifican o se diagnostican correctamente por el ensayo, p. ej., la sensibilidad es el 100 %, si todos los individuos con una afección dada tienen un ensayo positivo. La especificidad de un ensayo de cribado dado refleja la proporción de individuos sin la afección que se identifican o se diagnostican correctamente por el ensayo, p. ej., una especificidad del 100 % es, si todos los individuos sin la afección tienen un resultado negativo en el ensayo.
La sensibilidad se define como la proporción de individuos con una afección dada (p. ej., cáncer), que se identifican correctamente por los métodos descritos de la invención (p. ej., tienen un resultado positivo en el ensayo).
La especificidad se define en la presente memoria como la proporción de individuos sin la afección (p. ej., cáncer), que se identifican correctamente por los métodos descritos de la invención (p. ej., tienen un resultado negativo en el ensayo).
Niveles de referencia
Como entenderán generalmente los expertos en la técnica, los métodos para cribar/monitorizar/determinar el cáncer son procesos de toma de decisión por comparación. Para cualquier proceso de toma de decisión, son necesarios valores de referencia basados en sujetos que tienen la enfermedad y/o sujetos que no tienen la enfermedad, infección, o afección de interés.
Los niveles de referencia para cada una de las proteínas (C1 IA, CRP y/o C4) pueden estar basados en varios criterios incluyendo el número de sujetos que continuarían para un ensayo de diagnóstico invasivo adicional, el riesgo promedio de tener y/o desarrollar, p. ej., cáncer, de todos los sujetos que continúan para un ensayo de diagnóstico adicional, una decisión de que cualquier sujeto cuyo riesgo específico como paciente es mayor que un determinado nivel de riesgo debería continuar para un ensayo de diagnóstico invasivo adicional o u otros criterios conocidos para los expertos en la técnica.
Los niveles de referencia pueden ajustarse sobre la base de varios criterios, tales como, pero no restringidos a, el determinado grupo de individuos ensayado. P. ej., los niveles de referencia podrían ajustarse en valores menores en individuos con cáncer conocido, los niveles de referencia pueden ser mayores en grupos de individuos de otra manera sanos con riesgo bajo de desarrollar cáncer.
Se describe un método para determinar si es probable que un sujeto tenga cáncer, que comprende:
(a) obtener una muestra del sujeto, y
(b) determinar cuantitativamente la concentración de C1 IA humano y la concentración de CRP humana presente en la muestra, indicando la presencia del polipéptido de C1 IA humano presente en la muestra a una concentración mayor que el nivel de referencia seleccionado y la presencia de la CRP humana presente en la muestra a una concentración mayor que el nivel de referencia seleccionado, que es probable que el sujeto tenga cáncer.
El primer, segundo y tercer niveles de referencia que se han determinado midiendo el parámetro o parámetros tanto en una población control sana como en una población con cáncer conocido determinando de esta manera los niveles de referencia que identifican a la población con cáncer bien con una especificidad predeterminada o una sensibilidad predeterminada sobre la base de un análisis de la relación entre los valores de los parámetros y los datos clínicos conocidos de la población control sana y la población de pacientes con cáncer, tal como es evidente a partir de la discusión detallada en los ejemplos en la presente memoria. Los niveles de referencia determinados de esta manera son válidos para el mismo ajuste experimental en ensayos individuales futuros.
En los ajustes experimentales específicos descritos en la presente memoria, se encontró que el umbral del nivel de C1 IA humano útil como un primer nivel de referencia era 35 mg/100 ml de muestra.
Las concentraciones séricas normales de C1 IA humano están en el rango de 15-35 mg/ml de muestra, mientras las concentraciones séricas normales de CRP son 00 mg/100 ml de muestra.
En un ejemplo, el primer nivel de referencia puede ser 35 mg de C1 IA humano/100 ml de muestra. En otro ejemplo, el segundo nivel de referencia puede ser 00 mg de CRP humana/100 ml de muestra. En un ejemplo adicional, el tercer nivel de referencia es 45 mg de C4 humano/100 ml de muestra.
Claramente, y como conocerá el experto en la técnica, el primer, segundo y tercer niveles de referencia deben determinarse individualmente para poblaciones específicas.
Así, sobre la base de lo anterior, si un paciente tiene una concentración de C1 IA humano por encima del primer nivel de referencia y una concentración de CRP por encima del segundo nivel de referencia es probable que el paciente tenga cáncer.
Puede realizarse el análisis multivariante DISCRIMINANT y otras evaluaciones del riesgo en el paquete estadístico de programas informáticos disponible comercialmente Statistical Analysis System (fabricado y vendido por SAS Institute Inc.) o por otros métodos de análisis estadístico multivariante u otros paquetes de software estadístico o software de cribado conocidos para los expertos en la técnica.
El método puede usarse igualmente bien para monitorizar la respuesta al tratamiento y el progreso del cáncer ya que la elevación de las concentraciones de C1 IA humano en combinación con la elevación de los valores de CRP humana C4 pueden sugerir que el paciente podría tener un desarrollo negativo del cáncer. En dichos casos, el valor de discriminación se ajusta específicamente para cada individuo.
El método puede usarse tanto para un individuo como para una población completa, pero más apropiadamente para una población que ya se ha identificado que tiene un riesgo incrementado de desarrollar cáncer, p. ej., individuos con una disposición genética, individuos que han estado expuestos a sustancias carcinogénicas, o individuos con enfermedades no malignas que predisponen al cáncer.
Cuando se ha identificado que un individuo tiene concentraciones altas de C1 IA humano en combinación con concentraciones altas de CRP en su excreta, el individuo debe referirse para un examen adicional.
Características operativas del receptor
La exactitud de un ensayo de diagnóstico se describe mejor por sus características operativas del receptor (ROC) (véase, especialmente, Zweig et al. 1993. El gráfico R o C es una representación de todas las parejas de sensibilidad/especificidad que resultan de la variación continua del umbral de decisión sobre el rango completo de datos observados.
El rendimiento clínico de un ensayo de laboratorio depende de su exactitud diagnóstica, o de la capacidad de clasificar correctamente a los sujetos en subgrupos clínicamente relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad del ensayo de distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los sujetos investigados. Dichas condiciones son, por ejemplo, sano y enfermo, infección latente o reciente frente a ausencia de infección, o enfermedad benigna frente a maligna.
En cada caso, la representación ROC representa la superposición entre las dos distribuciones representando la sensibilidad frete a 1 - especificidad para el rango completo de umbrales de decisión. En el eje de las y está la sensibilidad, o la función positiva verdadera [definida como (número de resultados positivos verdaderos en el ensayo) (número de positivos verdaderos número de resultados negativos falsos en el ensayo]. Esto también se ha referido como positividad en presencia de una enfermedad o afección. Se calcula solamente a partir del subgrupo afectado. En el eje de las x está la fracción positiva falsa, o 1 - especificidad [definida como (número de resultados positivos falsos) / (número de negativos verdaderos número de resultados positivos falsos)]. Esto es un índice de especificidad y se calcula enteramente a partir del subgrupo no afectado.
Como las fracciones positiva verdadera y falsa se calculan enteramente separadamente, usando los resultados del ensayo a partir de dos subgrupos diferentes, la representación ROC es independente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto en la representación ROC representa una pareja de sensibilidad/- especificidad correspondiente a un umbral de decisión particular. Un ensayo con una discriminación perfecta (sin superposición en las dos distribuciones de resultados) tiene una representación ROC que pasa a través de la esquina superior izquierda, donde la fracción positiva verdadera es 1,0, o 100 % (sensibilidad perfecta), y la fracción positiva falsa es 0 (especificidad perfecta). La representación teórica para un ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45° desde la esquina inferior izquierda hasta la esquina superior derecha. La mayor parte de las representaciones se encuentran entre estos dos extremos. (Si la representación ROC se encuentra completamente debajo de la diagonal de 45°, esto se remedia fácilmente revirtiendo el criterio para "positividad" de "mayor de" a "menor de" o viceversa.) Cualitativamente, cuanto más cerca esté la representación de la esquina superior izquierda, mayor será la exactitud global del ensayo.
Un objetivo conveniente para cuantificar la exactitud diagnóstica de un ensayo de laboratorio es expresar su rendimiento por un único número. La medición global más común es el área bajo la representación ROC. Por convención, esta área es siempre > 0,5 (si no lo es, se puede revertir la regla de decisión para hacer que lo sea). Los valores varían entre 1,0 (separación perfecta de los valores del ensayo de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia distribucional aparente entre los dos grupos de valores del ensayo). El área no depende solo de una parte particular de la representación, tal como el punto más cercano a la diagonal o la sensibilidad al 90 % de especificidad, sino de la representación completa. Esto es una expresión descriptiva cuantitativa de lo cerca que está la representación ROC a la perfecta (área= 1,0).
Así, es un objeto proporcionar un método para diagnosticar cáncer en un individuo, comprendiendo el método:
a) determinar la concentración de C1 IA humano y la concentración de CRP humana in una muestra de dicho individuo,
b) construir una representación de percentiles del C1 IA humano y la concentración de CPR humana concentraciones obtenidas a partir de una población sana
c) construir una curva ROC (características operativas del receptor) basada en las concentraciones de C1 IA humano y CRP humana determinadas en la población sana y en las concentraciones de C1 IA humano y humana determinadas en una población con cáncer conocido
d) seleccionar una especificidad deseada
e) determinar, a partir de la curva ROC, la sensibilidad correspondiente a la especificidad deseada
f) determinar, a partir de la representación de percentiles, las concentraciones de C1 IA humano y CRP humana correspondientes a la sensibilidad determinada; y
g) predecir que el individuo tiene cáncer, si la concentración de human C1 IA humano en la muestra es igual a o mayor que dicha concentración de C1 IA humano correspondiente a la especificidad determinada y si la concentración de CRP humana en la muestra es mayor que dicha concentración de CRP humana correspondiente a la especificidad determinada, y
h) predecir que es improbable o no que el individuo tenga cáncer si la concentración de C1 IA humano en la muestra es menor que dicha concentración de C1 IA humano correspondiente a la especificidad determinada y si la concentración de CRP humana en la muestra es igual a o está por encima de dicha concentración de CRP humana correspondiente a la especificidad determinada.
La especificidad del método puede ser del 70 % al 100 %, más preferiblemente del 80 % al 100 %, más preferiblemente del 90 % al 100 %. Así, en un ejemplo, la especificidad es del 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %,
88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
La sensibilidad del método puede ser del 70 % al 100 %, más preferiblemente del 80 % al 100 %, más preferiblemente del 90 % al 100 %. Así, en un ejemplo, la sensibilidad es del 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
La concentración de C1 IA humano y CRP humana puede compararse con un conjunto de datos de referencia o valor de referencia, tal como los niveles de referencia para determinar si el sujeto tiene un riesgo o probabilidad incrementado de, p. ej., cáncer.
Alternativamente, los niveles de referencia pueden determinarse como la media, mediana o media geométrica del grupo de control negativo ((p. ej., población sana, individuo sano, población con cáncer conocido o individuo con cáncer conocido) /- una o más desviaciones estándar o un valor derivado de la desviación estándar) Pronóstico
En un ejemplo, el C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano puede usarse para predecir el pronóstico de sujetos diagnosticados con cáncer. Cuando se usa en el pronóstico de pacientes, el método puede ayudar a predecir el curso y resultado probable del cáncer, asistiendo así al experto en la técnica en la selección del método de tratamiento apropiado y predecir el efecto de un determinado tratamiento para la afección.
Muestra
Puede contemplarse que al menos una muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, saliva, fluido espinal, fluido espinal cerebroespinal, fluido pleural, fluido ascítico, orina, muestras de tejido, células de tejido y combinaciones de los mismos.
En un ejemplo preferido, la muestra deriva de la sangre.
Generalmente, la sangre se mantiene en presencia de un anticoagulante (preferiblemente, heparina, alternativamente p. ej., citrato o EDTA). El anticoagulante está presente en el tubo de recogida de la sangre cuando se añade la sangre. El uso de tubos de recogida de la sangre es preferiblemente, pero no necesariamente, compatible con sistemas de laboratorio automatizados estándar y estos son susceptibles de análisis en muestreo a gran escala y acceso aleatorio. Los tubos de recogida de la sangre también minimizan los costes de manejo y reducen la exposición del laboratorio a sangre completa y plasma y, por lo tanto, reducen el riesgo de que el personal del laboratorio contraiga un agente patógeno, tal como, pero no limitado a, el virus de la inmunodeficiencia humana.
Las partes alícuotas de la sangre completa pueden tener volúmenes que varían de 10^1-4.000 pl, tal como, pero no limitado a, 50pl, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, 600 pl, 700 pl, 800 pl, 900pl, 1.000 pl, 1.100 pl, 1.200 pl, 1.300 pl, 1.400 pl, 1.500 pl, 1.600 pl, 1.700 pl, 1.800 pl, 1.900pl, 2.000pl, 2.100 pl, 2.200 pl, 2.300 pl, 2.400 pl, 2.500 pl, 2.600 pl, 2.700 pl, 2.800 pl, 2.900pl o 3.000pl.
Anticuerpos
En un aspecto, la presente descripción se refiere a uno o más anticuerpos que se unen a C1-IA humano. En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana. En un aspecto, la presente descripción se refiere a uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano.
El uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CPR humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) pueden aplicarse claramente en todos los aspectos de la presente invención - es decir, pueden aplicarse en el método para el diagnóstico/cribado y/o monitorización del cáncer en un individuo, en el kit y la composición y composiciones farmacéuticas de la presente descripción.
En un ejemplo, el C1 IA humano puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En un ejemplo, la CRP humana puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
En un ejemplo, el C4 humano puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
En un ejemplo, C1 IA es C1 IA humano.
En un ejemplo, CRP es CRP humana.
En un ejemplo, C4 es C4 humano.
Los anticuerpos (es decir, el uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano, el uno o más anticuerpos que se unen a CPR humana y/o el uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano) pueden seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico, o un anticuerpo humanizado y un anticuerpo oligoclonal.
En un ejemplo preferido, el anticuerpo puede producirse por métodos recombinantes o por un método de hibridoma; dichos métodos serán conocidos para el experto en la técnica.
En un ejemplo preferido, el uno o más anti-C1 IA pueden ser IgG anti-C1 IA y/o IgM anti-C1 IA. La una o más IgG anti-C1 IA pueden seleccionarse del grupo que consiste en IgG1 anti-C1 IA, IgG2 anti-C1 IA, IgG3 anti-C1 IA, IgG4 anti-C1 IA y mezclas de los mismos.
En un ejemplo preferido, el uno o más anti-CRP pueden ser IgG anti-CRP o IgM anti-CRP. La una o más IgG anti-CRP pueden seleccionarse del grupo que consiste en IgG1 anti-CRP, IgG2 anti-CRP, IgG3 anti-CRP, IgG4 anti-CRP y mezclas de los mismos.
En un ejemplo preferido, el uno o más anti-C4 pueden ser IgG anti-C4 y/o IgM anti-C4. La una o más IgG anti-C4 pueden seleccionarse del grupo que consiste en IgG1 anti-C4, IgG2 anti-C4, IgG3 anti-C4, IgG4 anti-C4 y mezclas de los mismos.
Los anticuerpos para uso en la presente invención pueden producirse por varios métodos.
Un método para producir dichos anticuerpos comprende transfectar una célula huésped de mamífero con uno o más vectores que comprenden secuencias relevantes del anticuerpo que se va a producir, cultivar la célula huésped y recuperar y purificar la molécula de anticuerpo.
Otro método para producir dichos anticuerpos comprende la construcción de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados.
Los anticuerpos recombinantes humanos pueden producirse usando IgG humana producida en células de riñón embrionarias humanas o cualquier célula derivada de placenta o derivada de amnios de seres humanos. Los determinantes antigénicos pueden obtenerse, en el caso del inhibidor de C1, de linfocitos B de un paciente con edema de Quincke que tiene el tipo de Quincke (tipo 1), donde el paciente ha desarrollado anti inhibidor de C1 como la razón para los pacientes con deficiencia de inhibidor de C1. Los determinantes antigénicos se aíslan de los linfocitos B del paciente que están produciendo determinantes antigénicos frente al inhibidor de C1 (que pueden obtenerse de un hospital universitario que tiene pacientes con edema de Quincke, p. ej., la Universidad de Lund, Suecia o la Washington University Medical School en St. Louis Missouri). Otros tipos de determinantes antigénicos frente a CRP pueden identificarse en colaboración con la Washington University Medical School, St. Louis, Missouri.
En una realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena única.
En un aspecto adicional, el anticuerpo puede ser un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos una primera región de unión de un anticuerpo según cualquier aspecto o realización descrito en la presente memoria, y una segunda región de unión que se une a una diana o epítopo diferente que la primera región de unión. El término "anticuerpo multiespecífico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a anticuerpos en donde las regiones de unión dos a al menos dos, tal como al menos tres, diferentes antígenos o al menos dos, tal como al menos tres, epítopos diferentes en el mismo antígeno.
En una realización, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región de unión de un anticuerpo según cualquier aspecto o realizaciones descritos en la presente memoria, y una segunda región de unión que se une a una diana o epítopo diferente que la primera región de unión. El término "biespecífico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de unión, tales como anticuerpos, en donde las regiones de unión de la molécula de unión se unen a dos antígenos diferentes o a dos epítopos diferentes en el mismo antígeno. El término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que tiene especificidades para al menos dos epítopos diferentes, típicamente no superpuestos. Dichos epítopos pueden estar en la misma diana o en dianas diferentes. Si los epítopos están en dianas diferentes, dichas dianas pueden estar en la misma célula o en células, tipos celulares o estructuras diferentes, tal como tejido extracelular. El término "diana diferente", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a otra proteína, molécula o semejante distinta de C1 IA, CRP y/o C4 o a un fragmento de C1 IA, CRP y/o C4.
Los anticuerpos (es decir, el anti-C1 IA, anti-CRP y/o anti-C4) pueden conjugarse con resto terapéutico o de diagnóstico, tal como un agente citotóxico, un fármaco quimioterapéutico, una citoquina, un inmunosupresor, antibiótico, o a radioisótopo. Dichos conjugados se refieren en la presente memoria como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se refieren como "inmunotoxinas". Los anticuerpos conjugados con un agente citotóxico, fármaco o semejantes también se conocen como conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). En una realización, el resto terapéutico es un agente citotóxico. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial (p. ej., mata) para las células. Los agentes citotóxicos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, tubulisinas, duoestatinas, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, maitansina o un análogo o derivado de la misma, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina; caliqueamicina o análogos o derivados de la misma; antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, tal como carboplatino; así como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC-1065 (también conocido como raquelmicina), o análogos o derivados de CC-1065), dolastatina, auristatina, pirrolo[2,1 -c][1,4] benzodiazepinas (PDB), indolinbenzodiazepina (IGN) o análogos de los mismos, antibióticos (tales como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos (p. ej., agentes dirigidos a tubulina), tal como la toxina de la difteria y moléculas relacionadas (tales como la cadena A de la difteria y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas); toxina ricina (tal como ricina A o una toxina de la cadena A de la ricina desglicosilada), toxina del cólera, una toxina semejante a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina
LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertussis, toxina del tétano, inhibidor de la proteasa de soja de Bowman-Birk, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfasarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y toxinas de enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas incluyen péptidos antimicrobianos/líticos, tales como CLIP, Magainina 2, melitina, Cecropina, y P18; ribonucleasa (ARNasa), ADNasa I, enterotoxina A Staphylococcal, proteína antiviral de fitolaca, toxina de la difteria, y endotoxina de Pseudomonas. Los agentes terapéuticos que pueden administrarse en combinación con anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 o conjugados anticuerpo-fármaco de la presente invención como se describe en otro lugar en la presente memoria, tal como, p. ej., citoquinas o quimioquinas anticancerosas, también son candidatos para restos terapéuticos útiles para la conjugación con un anticuerpo descrito en la presente invención. El término "agente citotóxico", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier agente que es perjudicial para las células.
En otra realización alternativa, el anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 puede comprender ácido nucleico o molécula asociada a ácido nucleico conjugada. En dicha realización, el ácido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotóxica, un ácido nucleico antisentido, una molécula de ARN inhibidora (p. ej., una molécula de ARNsi) o un ácido nucleico inmunoestimulador (p. ej., una molécula de ADN que contiene un resto CpG inmunoestimulador). En otra realización alternativa, el anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 puede conjugarse con un aptámero o una ribozima o un péptido funcional análogo o derivado de los mismos. En otra realización alternativa, se proporcionan conjugados de anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 fármaco que comprenden uno o más aminoácidos radiomarcados. Un anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 radiomarcado puede usarse tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos (la conjugación con moléculas radiomarcadas es otra posible característica). Los ejemplos no limitantes de marcadores para polipéptidos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, y 125I, 131I y 186Re. En una realización, el anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 pueden conjugarse con un radioisótopo o con un quelato que contiene un radioisótopo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 pueden conjugarse con un conector quelante, p. ej., DOTA, DTPA o tiuxetano, que permite que el anticuerpo forme un complejo con un radioisótopo. El anticuerpo también o alternativamente puede comprender o estar conjugado con uno o más aminoácidos radiomarcados u otras moléculas radiomarcadas. Un anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 radiomarcado puede usarse tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos. Los ejemplos no limitantes de radioisótopos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 111ln, 131I, 186Re, 213Bs, 225Ac y 227T
Kits
Es un aspecto de la presente descripción proporcionar un kit o dispositivo para realizar el método, que tiene un diseño simple y económico, siendo rápido y fácil de usar y no requiere la asistencia de especialistas o el uso de equipamiento especializado.
En otro aspecto más, la descripción se refiere a un kit que comprende (i) uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a c Rp humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) e (ii) instrucciones para el uso de dicho kit.
En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un kit para realizar el método descrito anteriormente, comprendiendo dicho kit (i) uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) e (ii) instrucciones para el uso de dicho kit.
En un ejemplo preferido, el uno o más anti-C1 IA puede ser anticuerpo IgG anti-C1 IA y/o anticuerpo IgM anti-C1 IA. El uno o más anticuerpo IgG anti-C1 IA puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpo IgG1 anti-C1 IA, anticuerpo IgG2 anti-C1 IA, anticuerpo IgG3 anti-C1 IA, anticuerpo IgG4 anti-C1 IA y mezclas de los mismos.
En un ejemplo preferido, el uno o más anti-CRP puede ser anticuerpo IgG anti-CRP o anticuerpo IgM anti-CRP. El uno o más anticuerpo IgG anti-CRP puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpo IgG1 anti-CRP, anticuerpo IgG2 anti-CRP, anticuerpo IgG3 anti-CRP, anticuerpo IgG4 anti-CRP y mezclas de los mismos.
En un ejemplo preferido, el uno o más anti-C4 puede ser anticuerpo IgG anti-C4 y/o anticuerpo IgM anti-C4. El uno o más anticuerpo IgG anti-C4 puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpo IgG1 anti-C4, anticuerpo IgG2 anti-C4, anticuerpo IgG3 anti-C4, anticuerpo IgG4 anti-C4 y mezclas de los mismos.
Puede contemplarse que la concentración de cada una de las proteínas (es decir, C1 IA, CPR y/o C4) se determina separadamente.
El kit puede seleccionarse del grupo que consiste en ELISA, inmunoturbidimetría, nefelometría, inmunodifusión, kit de aglutinación, transferencia Western y SDS page. Los principios de la inmunodifusión se describen en Mancini et al.
1964.
El uno o más anti-C1 IA, anti-CPR y/o anti-C4 pueden inmovilizarse en un soporte sólido seleccionado del grupo que consiste en membranas, plástico, vidrio, metal, porcelana y combinaciones de los mismos. El kit de aglutinación puede ser el Eldon Card™.
En términos de inmunodifusión, el kit puede comprender al menos dos capas de gel, en donde una primera capa de gel comprende uno o más anti-C1 IA y en donde una segunda capa de gel comprende uno o más anti-CPR. En otra realización, el kit puede comprender al menos tres capas de gel, en donde una primera capa de gel comprende uno o más anti-C1 IA, en donde una segunda capa de gel comprende uno o más anti-CPR y en donde la tercera capa de gel comprende uno o más anti-C4. Claramente, el orden del gel puede revertirse.
En otro ejemplo, el uno o más anti-C1 IA, anti-CPR y/o anti-C4 pueden conjugarse con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un marcador fluorescente o un derivado de fluoresceína o seleccionarse del grupo que consiste en cromógenos, catalizadores tales como enzimas, un anticuerpo secundario, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, marcadores radioactivos, metales, partículas magnéticas, partículas de colorante, partículas de látex de polímero orgánico, liposomas u otras vesículas que contienen sustancias productoras de una señal y semejantes.
La señal detectable se puede observar por cualquier clase de medio visual o instrumental conocido para el experto en la técnica, sin embargo, dichos medios pueden seleccionarse del grupo que consiste en magne(magno)tómetro, espectrofotómetro, lector de ELISA y/o cámara CCD.
También se describe un kit para la medición de la concentración de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano en al menos una muestra. Dicho kit puede consistir en una tira reactiva para determinar la concentración de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano en al menos una muestra, sin embargo, otras opciones pueden ser, pero no están limitadas a, ensayo de actividad (tal como zimografía), ensayos inmunológicos o un kit de reacción con color.
La presente descripción contempla además un kit para realizar el método de la presente invención. El kit está convenientemente en forma compartimental con uno o más compartimentos adaptados para recibir una muestra de un sujeto, tal como sangre completa, suero, células purificadas, biopsias u otro material de muestra aplicable. Ese compartimento u otro compartimento también puede estar adaptado para contener heparina cuando la muestra es sangre completa.
Generalmente, el kit está en una forma que está envasada para la venta con un conjunto de instrucciones. Las instrucciones estarán generalmente en la forma de un método - es decir, para diagnosticar cáncer en un sujeto.
En un ejemplo, el kit comprende anticuerpos que se unen a C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano un inmunoensayo o fragmentos de unión específicos de dichos anticuerpos para uso como un reactivo de diagnóstico.
El kit contemplado puede estar en una forma de múltiples componentes, en donde un primer componente comprende una multiplicidad de tubos de recogida de sangre, un segundo componente que comprende un medio de detección basado en anticuerpo para C1 IA humano, tercer componente que comprende un medio de detección basado en anticuerpo para CRP humana, cuarto componente que comprende un conjunto de instrucciones y, opcionalmente, un quinto componente que comprende un medio de detección basado en anticuerpo para C4 humano.
El ensayo también puede automatizarse o semiautomatizarse y los aspectos automatizados pueden controlarse por software informático.
El ensayo puede automatizarse o semiautomatizarse para el cribado de alto rendimiento o para el cribado de varios efectores inmunes de un sujeto. La automatización se controla convenientemente por software informático. La presente descripción contempla un producto de programa informático, por lo tanto, para evaluar la presencia o ausencia o el nivel de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano, dicho producto comprende:
(1) código que recibe, como valores de entrada, la identidad de una molécula informadora asociada con un anticuerpo marcado o ARNm
(2) código que compara dichos valores de entrada con valores de referencia para determinar el nivel de moléculas informadoras y/o la identidad de la molécula a la que se une la molécula informadora; y
(3) un medio legible por ordenador que almacena los códigos.
Otro aspecto más se extiende a un ordenador para evaluar la presencia o ausencia o nivel de C1 IA humano, CRP humana y/o C4 humano, dicho ordenador comprende:
(1) un medio de almacenamiento de datos legible por una máquina que compone un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles por una máquina, en donde dichos datos legibles por una máquina I comprenden valores de entrada que identifican una molécula informadora asociada con un anticuerpo marcado o ARNm;
(2) una memoria de trabajo para almacenar instrucciones para el procesamiento de dichos datos legibles por una máquina
(3) una unidad de procesamiento central acoplada a dicha memoria de trabajo y a dicho medio de almacenamiento de datos legibles por una máquina, para el procesamiento de dichos datos legibles por una máquina para comparar dichos valores para proporcionar una evaluación sobre la identidad o nivel de moléculas informadoras o de moléculas a las que se unen; y
(4) un hardware de salida acoplado a dicha unidad de procesamiento central, para recibir los resultados de la comparación.
Composición y composición farmacéutica y uso de las mismas
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a una composición que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4).
En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano (anti-C1 IA), uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana (anti-CRP) y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano (anti-C4) y un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, el uno o más anticuerpos anti-C1 IA puede ser un anticuerpo IgG anti-C1 IA y/o un anticuerpo IgM anti-C1 IA. El uno o más anticuerpos IgG anti-C1 IA pueden seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo IgG1 anti-C1 IA, un anticuerpo IgG2 anti-C1 IA, un anticuerpo IgG3 anti-C1 IA, y un anticuerpo IgG4 anti-C1 IA. En una realización preferida, el anticuerpo anti-C1 IA es un anticuerpo IgG1 y/o IgG3 anti-C1 IA, ya que estos tipos de anticuerpos activan el sistema del complemento. También puede contemplarse que la composición y composición farmacéutica comprenden una mezcla de diferentes anticuerpos que se unen a C1 IA ya que dicha mezcla puede estar dirigida a partes ligeramente diferentes de la proteína C1 IA y de esta manera se proporciona un efecto mejorado. En una realización adicional, el uno o más anticuerpos anti-CRP puede ser un anticuerpo IgG anti-CRP y/o un anticuerpo IgM anti-CRP. El uno o más anticuerpos IgG anti-CRP pueden seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo IgG1 anti-CRP, un anticuerpo IgG2 anti-CRP, un anticuerpo IgG3 anti-CRP, un anticuerpo IgG4 anti-CRP y mezclas de los mismos. En una realización preferida, el anticuerpo anti-CRP es un anticuerpo IgG1 o IgG3 o, p. ej., un anticuerpo IgM anti-CRP, ya que estos tipos de anticuerpos activan el sistema del complemento. También puede contemplarse que la composición y composición farmacéutica comprenden una mezcla de diferentes anticuerpos que se unen a CRP ya que dicha mezcla puede estar dirigida a partes ligeramente diferentes de la proteína CRP y de esta manera se proporciona un efecto mejorado.
En una realización, el C1 IA humano puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En una realización, la CRP humana puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
En una realización, el C4 humano puede comprender o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
Los anticuerpos (es decir, el uno o más anticuerpos que se unen a C1 IA humano, el uno o más anticuerpos que se unen a CPR humana y/o el uno o más anticuerpos que se unen a C4 humano) pueden seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico, o un anticuerpo humanizado y un anticuerpo oligoclonal.
En una realización preferida, el anticuerpo puede producirse por métodos recombinantes o por un método de hibridoma; dichos métodos serán conocidos para el experto en la técnica.
Las composiciones se optimizan para parámetros tales como tolerancia fisiológica y vida útil.
Un ejemplo se refiere a una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente, que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales.
En otro ejemplo, dicho uno o más agentes terapéuticos adicionales se seleccionan de agentes que inducen la apoptosis. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una disolución de tampón, que, en un grado sustancial, mantiene la integridad química del uno o más anticuerpos y siendo fisiológicamente aceptable para infusión en pacientes.
Así, un aspecto de la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un radioinmunoconjugado, y un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los vehículos farmacéuticos aceptables incluyen, pero no están limitados a, tampones no tóxicos, rellenos, disoluciones isotónicas, etc. Más específicamente, el vehículo farmacéutico puede ser, pero no está limitado a, disolución salina normal (0,9 %), disolución salina a la mitad de la normal, lactato de Ringer, dextrosa al 5 %, dextrosa al 3,3 %/disolución salina al 0,3 %. El vehículo fisiológicamente aceptable puede contener un estabilizador radiolítico, p. ej., ácido ascórbico, albúmina de suero humano, que protege la integridad del radiofármaco durante el almacenamiento y transporte.
En otro aspecto, la descripción se refiere a la composición farmacéutica descrita anteriormente para uso como un medicamento.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a la composición farmacéutica descrita anteriormente para uso en el tratamiento del cáncer, inhibición del crecimiento del cáncer y/o inhibición de la proliferación del cáncer en un individuo.
La composición puede administrarse intratumoralmente aplicando, p. ej., un catéter Ommaya, intracerebralmente, intraespinalmente, intratecalmente y/o intravenosamente.
La composición puede administrarse, por ejemplo, al individuo cada día, una vez cada dos días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses.
Las dosificaciones y regímenes de dosificación eficientes para un anticuerpo anti-C1 IA, un anticuerpo anti-CRP y/o un anticuerpo anti-C4 o ADC dependen de la enfermedad o afección que se va a tratar y pueden determinarlos los expertos en la técnica.
Un médico con una experiencia ordinaria en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. En relación con esto, cuando se hace referencia a una composición farmacéutica, debe entenderse que también comprende una composición como tal, o viceversa. Por ejemplo, el médico podría empezar con dosis del anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 empleadas en la composición farmacéutica a niveles menores de los requeridos con el fin de conseguir el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se consigue el efecto deseado. En general, una dosis adecuada de una composición farmacéutica de la presente invención será la cantidad del compuesto que es la dosis efectiva más baja para producir un efecto terapéutico según un régimen de dosificación particular. Dicha dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente.
Por ejemplo, una "cantidad efectiva" para un uso terapéutico puede medirse por su capacidad de estabilizar la progresión de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir el cáncer puede evaluarse, por ejemplo, en un sistema de modelo animal que sea predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto de inhibir el crecimiento celular o de inducir citotoxicidad por ensayos in vitro conocidos para el experto en la técnica. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar de otra manera los síntomas en un sujeto. Un experto en la técnica será capaz de determinar dichas cantidades sobre la base de factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición o ruta particular de administración seleccionada.
Un rango ejemplar, no limitante, para una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-C1 IA o un anticuerpo anti-CRP según esta invención es una dosificación estimada de entre 10-20 ml con un contenido de anticuerpo de 100-200 mg para una persona de 70 kg.
La administración puede ser, p. ej., intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea, y, por ejemplo, puede administrarse cerca del sitio de la diana.
Los regímenes de dosificación en los métodos de tratamiento y usos anteriores se ajustan ara proporcionar la respuesta deseada óptima (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica.
En un ejemplo, la ventana de eficacia-seguridad se optimiza disminuyendo la toxicidad específica, tal como, por ejemplo, disminuyendo la relación fármaco-anticuerpo (DAR) y/o mezclando anticuerpo anti-C1 IA ADC, anticuerpo anti-CRP ADC y/o anticuerpo anti-C4 ADC con anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 no marcados.
En un ejemplo, la eficacia del tratamiento se monitoriza durante la terapia, p. ej., a puntos de tiempo predefinidos. En una realización, la eficacia puede monitorizarse midiendo el nivel de C1 IA, CRP y/o C4 en una muestra que contiene células tumorales, por visualización del área de la enfermedad, o por otros métodos diagnósticos descritos además en la presente memoria, p. ej., realizando uno o más escaneos p ET-CT, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-C1 IA, un anticuerpo anti-CRP y/o un anticuerpo anti-C4 marcado, fragmento o mini-anticuerpo derivado del anticuerpo anti-C1 IA, anticuerpo anti-CRP y/o anticuerpo anti-C4 de la presente invención.
Si se desea, una dosis diaria efectiva de una composición farmacéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas separadamente a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias. En otra realización, el anticuerpo anti-C1 IA, el anticuerpo anti-CRP y/o el anticuerpo anti-C4 se administran por infusión continua lenta durante un periodo largo, tal como más de 24 horas, con el fin de minimizar cualquier efecto secundario no deseado.
Aunque es posible administrar un compuesto de la presente invención solo, es preferible administrar el compuesto como una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente.
Una dosis efectiva de un anticuerpo anti-C1 IA, un anticuerpo anti-CRP y/o un anticuerpo anti-C4, anticuerpo biespecífico o ADC de la invención también puede administrarse usando un periodo de dosificación semanal, bisemanal o trisemanal. El periodo de dosificación puede estar restringido, p. ej., a 8 semanas, 12 semanas o hasta que se haya establecido la progresión clínica.
Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo anti-C1 IA, el anticuerpo anti-CRP y/o el anticuerpo anti-C4, anticuerpos biespecíficos o ADC pueden administrarse por infusión en una dosificación estimada semanalmente de entre
10-20 ml con un contenido de anticuerpo de 100-200 mg para una persona de 70 kg. Dicha administración puede repetirse, p. ej., 1 a 8 veces, tal como 3 a 5 veces. La administración puede realizarse por infusión continua durante un periodo de 1 a 24 horas, tal como de 1 a 12 horas.
En otra realización, el anticuerpo anti-C1 IA, el anticuerpo anti-CRP y/o el anticuerpo anti-C4, anticuerpos biespecíficos o ADC pueden administrarse por infusión cada tres semanas en una dosificación estimada de entre 10-20 ml con un contenido de anticuerpo de 100-200 mg para una persona de 70 kg. Dicha administración puede repetirse, p. ej., 1 a 8 veces, tal como 3 a 5 veces. La administración puede realizarse por infusión continua durante un periodo de 1 a 24 horas, tal como de 1 a 12 horas.
En una realización, un anticuerpo anti-C1 IA ADC, un anticuerpo anti-CRP ADC y/o un anticuerpo anti-C4 ADC o anticuerpos biespecíficos pueden administrarse como una única dosis correspondiente a una dosis estimada de aproximadamente 10 - 20 ml con un contenido de 200 - 400 mg de inmunoglobulina para un peso promedio de 70 kg, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas durante hasta doce veces, hasta ocho veces, o hasta la progresión clínica. La administración puede realizarse por infusión continua durante un periodo de 1 a 24 horas, tal como de 1 a 12 horas. Dichos regímenes pueden repetirse una o más veces, según sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses.
La dosificación puede determinarse o ajustarse midiendo la cantidad de compuesto de la presente invención en la sangre después de la administración, por ejemplo, tomando una muestra biológica y usando anticuerpos antiidiotípicos dirigidos a la región de unión del antígeno del anticuerpo anti-C1 IA, del anticuerpo anti-CRP y/o del anticuerpo anti-C4 de la presente invención.
En una realización, el anticuerpo anti-C1 IA, el anticuerpo anti-CRP y/o el anticuerpo anti-C4 pueden administrarse como terapia de mantenimiento, tal como, p. ej., una vez a la semana durante un periodo de seis meses o más.
Como ejemplos no limitantes, el tratamiento según la presente invención puede proporcionarse como una dosificación diaria de un compuesto de la presente invención en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, tal como 0,2, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o, alternativamente, al menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, usando dosis únicas o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4, o 2 horas, o cualquier combinación de los mismos.
Las composiciones parenterales pueden formularse en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la presente invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se quiere conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparación de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
La administración (tal como, pero no limitado a, inyección o infusión) de anti-C1 IA a un individuo que padece cáncer es probable que dé lugar a la neutralización del efecto inhibidor de C1 IA en el complejo C1qrs, activando de esta manera este complejo a C1r y C1s que, de nuevo, activarán C4 a C4b. C4b activará C2 a C2b e iniciará la ruta clásica siempre que este anticuerpo sea capaz de activar el sistema del complemento. Por lo tanto, puede ser preferible que el anti-C1 IA sea IgG1 y/o IgG3, ya que estos tipos de anticuerpos activan el sistema del complemento (véase también la Figura 37).
La administración (tal como, pero no limitado a, inyección o infusión) de anti-CRP a un individuo que padece cáncer es probable que dé lugar a la neutralización de la inhibición del factor H y entonces se liberará C3b. C3b puede activar entonces mediante C5b mediante la c5 convertasa dando lugar a la activación de C6, C7, C8 y C9, en donde C9 constituirá múltiples componentes del C9. Esto ocurrirá en la superficie de la célula (véase también la Figura 37).
La administración (tal como, pero no limitado a, inyección o infusión) de anti-CRP a un individuo que padece cáncer es probable que dé lugar a una aceleración de la reacción en casada del complemento (véase también la Figura 37).
El uno o más anti-C1 IA, uno o más anti-CPR y/o uno o más anti-C4 pueden conjugarse con un fármaco quimioterapéutico, isótopo y/o anticuerpos monoclonales. El fármaco quimioterapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en fármacos de quimioterapia, agentes alquilantes y fármacos de platino. Los agentes alquilantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en mostazas de nitrógeno, tales como mecloretamina (mostaza de nitrógeno), clorambucilo, ciclofosfamida (Cytoxan®), ifosfamida, y melfalán, nitrosoureas tales como estreptozocina, carmustina (BCNU), y lomustina, sulfonatos de alquilo tales como busulfán, triazinas tales como dacarbazina (DTIC) y temozolomida (Temodar®), etileniminas tales como tiotepa y altretamina (hexametilmelamina). El fármaco de platino puede seleccionarse del grupo que consiste en cisplatino, carboplatino y oxalaplatino.
En un ejemplo, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma maligno, carcinomas escamosos (cáncer esofágico, cáncer de laringe, carcinomas bronquiales, carcinomas rectales, carcinoma del páncreas); adenocarcinomas, tales como carcinomas de colon de varios tipos y subtipos, carcinomas de páncreas, carcinoma de páncreas ductal, carcinoma de páncreas acinar, todas las estructuras epiteliales glandulares en las que los adenocarcinomas malignos, tales como carcinomas de mama, carcinomas bronquiales, que varía de carcinomas alveolares pulmonares, carcinomas de mama, p. ej., ductal, lobular, etc., carcinomas hepatocelulares, carcinomas de riñón, carcinomas de vejiga, tumores de cerebro malignos (p. ej., glioblastomas o astrocitomas), astrocitoma, glioblastomas de grado III-IV, gliomas, glioblastoma multiforme, oligodendrogliomas, ependimoma, y meduloblastoma. En una realización preferida, el cáncer es un tumor de cerebro maligno.
Una realización adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica de la presente invención para tratar tipos de cáncer que expresan C1-IA humano, CRP humana y/o C4 humano. En una realización preferida, los tipos de cáncer expresan human C1-IA humano y CRP humana en su superficie.
Un aspecto se refiere a la composición farmacéutica de la presente invención para uso en la depleción de células que expresan C1-IA humano, CRP humana y/o C4 humano en su superficie.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o proliferación de una célula tumoral que expresa C1-IA, CPR y/o C4, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición o la composición farmacéutica descrita anteriormente a un individuo que lo necesita.
Otro aspecto se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende anti-C1 IA, anti-CPR y/o anti-C4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Un aspecto adicional se refiere a un método para tratar a un paciente que padece un cáncer que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende anti-C1 IA, anti-CPR y/o anti-C4. Un aspecto más se refiere al uso de anti-C1 IA, anti-CPR y/o anti-C4 en el tratamiento del cáncer.
Un aspecto adicional se refiere a una composición de diagnóstico que comprende uno o más anti-C1 IA, uno o más anti-CPR y/o uno o más anti-C4.
El uso terapéutico de una disolución farmacéutica puede ser para el tratamiento frente a células malignas que expresan C1-IA humano, CRP humana y/o C4 humano, incluyendo, pero no limitado a, los tipos de cáncer seleccionados del grupo que consiste en osteosarcoma, sarcomas de tejido blando, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia y cáncer de cerebro.
La terapia podría basarse en inmunoterapia, conjugado anticuerpo fármaco, inmunotoxina o radioinmunoterapia incluyendo, pero no están limitados a, radiación de partículas beta o radiación de partículas alfa o una combinación de estas.
La terapia podría administrarse bien como una monoterapia o en combinación con otras terapias, preferentemente tratamientos estándar. Dichas otras terapias pueden ser pretratamiento, cirugía, quimioterapia (incluyendo doxorrubicina, vinblastina y gemcitabina), inmunoterapia, terapia fotodinámica, inhibidor de proteasoma (incluyendo bortezomib), inhibidores de la histona desacetilasa (incluyendo vorinostat y ácido hidroxámico suberoilanilida), vitamina D3 y análogos de la vitamina D3, inhibidores de puntos de control del ciclo celular (incluyendo UCN-01 y 2-(4-(4-Clorofenoxi)fenil)-1H-bencimidazol-5-carboxamida), radiosensibilizadores de células hipóxicas (incluyendo metronidazol y misonidazol), inductores de la apoptosis (incluyendo witaferina A) radiosensibilizadores, radioinmunoterapia o una combinación de dos o más de estos.
Por administrado se quiere decir infusión intravenosa o inyección intravenosa. Más específicamente, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrase directamente en una vena por una cánula periférica conectada a una cámara de goteo que previene el embolismo por aire y permite una estimación de la tasa de flujo en el paciente.
En una realización, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse de una forma repetida.
En otra realización de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención podría administrarse de una forma repetida, pero con diferentes modalidades, p. ej., la radioinmunoterapia beta podría estar seguida de radioinmunoterapia alfa o viceversa o conjugado de fármaco citotóxico seguido de inmunoconjugado etc.
Una realización de la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la presente invención administrada en combinación con o además de otra terapia. En una realización de la presente invención las otras terapias se seleccionan de pretratamiento, quimioterapia, terapia con anticuerpos monoclonales, cirugía, radioterapia, y/o terapia fotodinámica. En otra realización de la presente invención, las otras terapias son trasplante de médula ósea o trasplante de células madre y/o terapia.
En un aspecto particular, el anticuerpo anti-C1 IA, el anticuerpo anti-CRP y/o el anticuerpo anti-C4 o ADC puede administrarse profilácticamente con el fin de reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar el inicio de un evento en la progresión del cáncer o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión y/o un tumor primario ha sido retirado quirúrgicamente. En el último caso, el anticuerpo anti-C1 IA, el anticuerpo anti-CRP y/o el anticuerpo anti-C4 podrían administrarse, por ejemplo, en asociación con (es decir, antes, durante, o después) la cirugía. La administración profiláctica también puede ser útil en pacientes en donde es difícil localizar un tumor que se cree que está presente debido a otros factores biológicos.
En una realización de la presente invención están los usos y métodos de tratamiento de la presente invención realizados in vitro o ex vivo.
Una realización adicional de la presente invención se refiere a la administración intracavitaria de uno o más anticuerpos que se unen a C1-IA humano, uno o más anticuerpos que se unen a CRP humana y/o uno o más anticuerpos que se unen a C4 humana, conjugados o composiciones de la presente invención.
Los ejemplos de dichas administraciones son administraciones intraperitoneal, intrapleural, e intracraneal.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa, que comprende; poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la presente invención, inhibiendo de esta manera el crecimiento de la célula cancerosa.
En un ejemplo de la presente descripción están los métodos llevados a cabo in vitro.
La administración de los anticuerpos y composiciones farmacéuticas de la presente invención puede hacerse a través de muchas rutas de administración diferentes incluyendo tópica, oral, a través del tracto gastrointestinal, intradérmica, subcutánea, nasal, intravenosa, intramuscular, enteral o parenteral.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, así como cualquier otro adyuvante o excipiente conocido según técnicas convencionales. Una composición farmacéutica usada en la presente invención también puede incluir diluyentes, rellenos, sales, tampones, detergentes (p. ej., un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween-80), estabilizadores (p. ej., azúcares o aminoácidos sin proteínas), conservantes, fijadores tisulares, solubilizantes, y/u otros materiales adecuados para su inclusión en una composición farmacéutica. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención pueden ser variados, de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particular, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o la amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general y técnicas médicas previas, historial del paciente que se está tratando, y factores semejantes muy conocidos en las técnicas médicas. La composición farmacéutica puede administrarse por cualquier ruta y modo adecuado. Las rutas de administración adecuadas para un compuesto usado en la presente invención in vivo e in vitro son muy conocidas en la técnica y pueden seleccionarlas los expertos en la técnica. En una realización, la composición farmacéutica usada en la presente invención se administra parenteralmente Los términos "administración parenteral" y "administrado parenteralmente", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal. En una realización, la composición farmacéutica usada en la presente invención se administra por inyección o infusión intravenosa o subcutánea. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes adecuados, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de isotonicidad, antioxidantes y agentes que retrasan la absorción, y semejantes que son fisiológicamente compatibles con un compuesto de la presente invención. Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tales como glicerol, propilen glicol, polietilen glicol, y semejantes), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, y aceite de sésamo, disoluciones coloidales de carboximetil celulosa, goma de tragacanto y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo, y/o varios tampones. Otros vehículos son muy conocidos en las técnicas farmacéuticas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de tensioactivos. Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención también pueden comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y semejantes; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y semejantes; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y semejantes. Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención también pueden comprender agentes de isotonicidad, tales como azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro de sodio en las composiciones. Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la ruta de administración elegida, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes, conservantes o tampones, que pueden aumentar la vida útil o efectividad de la composición farmacéutica. Los compuestos usados en la presente invención pueden prepararse con vehículos que protegerán al compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados. Dichos vehículos pueden incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliorto-ésteres, y ácido poliláctico solo o con una cera, u otros materiales muy conocidos en la técnica. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. En una realización, los compuestos usados en la presente invención pueden formularse para asegurar una distribución apropiada in vivo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración parenteral incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención. En las composiciones también pueden incorporarse otros compuestos activos o terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas para inyección deben ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse as a disolución, micro-emulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión acuoso o no acuoso que contiene, por ejemplo, agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilen glicol, polietilen glicol, y semejantes), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como glicerol, manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes, p. ej., como se ha enumerado anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos, p. ej., de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los ejemplos de métodos de preparación son secado en vacío y secado por congelación (liofilización) que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución del mismo previamente esterilizada por filtración. Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los ejemplos de métodos de preparación son secado en vacío y secado por congelación (liofilización) que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución del mismo previamente esterilizada por filtración. La composición farmacéutica usada en la presente invención puede contener uno o más anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o ADC de la presente invención, una combinación de un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o ADC según la invención con otro compuesto terapéutico, o una combinación de compuestos usados en la presente invención.
Debe indicarse que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención.
Ítems
C1 IA, y otros inmunógenos bloqueantes relacionados con las células cancerosas para el diagnóstico del cáncer, monitorización y tratamiento del cáncer
Resumen
Una combinación de inactivador de C1 (C1 IA) y efecto añadido en el cáncer, por una nueva combinación de proteína C reactiva, denominada CRP, habiéndose identificado recientemente que estas dos proteínas, inactivador de C1 y proteína C reactiva (CRP) conjuntamente como una nueva combinación obtenida pueden usarse tanto como un sistema de ensayo diagnóstico basado en la demostración de la presencia de CRP, anticuerpos y antisueros con especificidad frente a anticuerpos C1 IA y CRP, y una terapia para el cáncer humano de determinados tipos de cáncer tales como carcinomas y tumores de cerebro malignos usando antisueros o anticuerpos humanos y preferiblemente antisueros humanos monoclonales o recombinantes que combinan C1 IA y CRP en el tratamiento del cáncer, así como mezclados conjuntamente como anti C1 IA y CRP humano con especificidad frente a estas proteínas. CRP puede identificarse como una proteína con diferentes localizaciones en una inmunoelectroforesis Grabar, de manera que CRP puede localizarse en o alrededor de la proteína alfa o en la región de la proteína gamma dependiendo de los disolventes y otras posibilidades de cambiar la localización en una inmunoelectroforesis Grabar, y no se considera, por lo tanto, una nueva CRP debido a una localización diferente en este método de ensayo, pero lo más probablemente cambia en el punto isoeléctrico de la proteína.
Según esta invención, es sorprendente que CRP pueda recogerse junto con C1 IA de cultivos de carcinoma y de fluido pleural y ascítico, debido a las metástasis de pacientes con cáncer de mama y con carcinomas de ovario. Pero, debido al hecho de que se ha descrito que los carcinomas contienen frecuentemente áreas con células de carcinoma muertas o moribundas que aparecen como necrosis tumoral en tumores sólidos tales como, por ejemplo, carcinomas, puede entenderse ahora por qué CRP también aparece en cultivos de carcinoma y puede derivar de células de carcinoma muertas o moribundas que junto con las células de carcinoma que también muestran la presencia de C1 IA al mismo tiempo frecuentemente al mismo tiempo estas células de carcinoma recogidas también contendrán células muertas o moribundas dando lugar a CRP al mismo tiempo. El uso concomitante de anti C1 IA humano, anti CRP humana y anti C4 humano para monitorizar las enfermedades cancerosas es, por lo tanto, una estrategia razonable para detectar, monitorizar, y tratar carcinoma en seres humanos con anticuerpo y más bien anticuerpos anti humano monoclonales y/o recombinantes humanos.
Descripción breve de los aspectos descritos
La presente descripción se refiere a una combinación de un kit para el diagnóstico y un kit para el tratamiento del cáncer humano tal como carcinomas, y tumores de cerebro, así como determinados otros cánceres sólidos malignos, donde puede encontrarse que C1 IA y CRP, a procesos para su aislamiento y caracterización, a métodos de ensayo de diagnóstico y materiales basados en el principio de demostrar la presencia de CRP, a anticuerpos y antisueros con especificidad frente a C1 IA y CRP, a la preparación de dichos anticuerpos y composiciones que contienen los mismos, a anticuerpos inmovilizados en matrices, y a la terapia del cáncer humano usando, por ejemplo, antisueros o anticuerpos monoclonales y/o recombinantes con especificidad frente a C1 IA y CRP.
Los aspectos importantes se basan en el principio de utilizar anticuerpos dirigidos específicamente frente a proteínas de bloqueo y enmascaramiento, en particular C1 IA y CRP, asociadas con enfermedades cancerosas humanas y presentes en las membranas de las células cancerosas. Según la invención, este principio se utiliza para el tratamiento del cáncer in vivo y para el tratamiento extracorporal del suero del paciente con cáncer.
C1 IA y CRP es una proteína asociada con el cáncer humano que puede aislarse de fluidos corporales de pacientes con cáncer, incluyendo suero, y de células cancerosas malignas humanas, también de cultivos celulares. Se han realizado ciclos repetidos de cultivo y recogida de cultivos celulares y C1 IA y CRP se han aislado del medio de cultivo, indicando que las células cancerosas en sí mismas son capaces de producir C1 IA y CRP.
Se ha encontrado que C1 IA y CRP poseen propiedades biológicas similares a las propiedades del inactivador del componente C1 del complemento humano (también denominado "inhibidor de C1 esterasa"), que es una alpha2 neuramino glicoproteína encontrada en los fluidos corporales de varias especies, incluyendo el hombre (Pensky et al., J.Biol.Chem., 236, 1674, 1961, Ratnoff et al., J. Exp. Med. 129. 315, Pensky et al., Science 163, 698, 1969, Nagaki et al., Int. Arch. Allergy 46, 935, 1974), pero que es una proteína no idéntica químicamente al inactivador del componente C1 del complemento humano.
En lo que sigue, el inactivador del componente C1 del complemento humano (inhibidor de C1 esterasa) se denominará "C1 IA", mientras el término "inactivador de C1", usado en varios contextos, designará al grupo que consiste en C1 IA y CRP.
Se ha encontrado que C1 IA y CRP poseen propiedades biológicas similares a las propiedades C1 IA, incluyendo el efecto inhibidor en la activación inicial por el componente C1 del complemento humano de C4 y C2 (es decir, inhibición del efecto hidrolizante de la C1 esterasa), la inactivación de plasmina, y la ausencia de efecto sobre el tiempo de coagulación del plasma (es decir, esta ausencia es común a C1 IA y que no puede excluirse, también puede ser común a CRP). Según el principio sobre el que se basa la presente invención, se cree que estos efectos inhibidores de C1 IA y CRP juegan un papel importante en la defensa de las células cancerosas frente a la destrucción por el sistema inmune humano.
En la bibliografía, se ha descrito que una proteína semejante a C1 IA está presente en las membranas de las células cancerosas humanas (p. ej., Osther et al. 1973 y 1974).
Según la presente invención, dicho C1 IA presente en el cáncer humano y, como se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que es un nuevo C1 IA denominado C1 IA y CRP. Los nuevos desarrollos importantes están basados en estos descubrimientos.
Una caracterización tentativa de CRP, que distingue C1 IA y CRP de C1 IA y otras proteínas conocidas, se proporciona en la sección siguiente denominada "Caracterización de C1 IA y CRP". Mediante enfoque isoeléctrico en LKB Multiphor, se encontraron dos bandas separadas por enfoque en una anfolina de C1 IA purificado y C1 IA y CRP, siendo la anfolina una placa PAG® para electroenfoque en gel de poliacrilamida de capa fina, variando el gradiente de pH de 4,0-8,6, 2 horas con enfriamiento a 0 grados C. a 500 V, 50 mamps. Después de la electroforesis, el gel de poliacrilamida de cortó y posteriormente se operó en un ángulo de 90 grados, frente a gel de agarosa al 2 % en tampón diemal, fuerza iónica 0,02, pH 8,6 a 18 grados C durante 12 horas, conteniendo dicho gel de agarosa antiC1 IA humano de conejo. Mediante esto, se obtuvieron dos líneas de precipitación que no se cruzaban, mientras operaciones idénticas, pero con antisuero oligoespecífico tanto frente a C1 IA como C1 IA y CRP, puede prepararse como anticuerpos monoclonales o anticuerpos recombinantes dando lugar a dos líneas de precipitación que se cruzan. Un conejo inmunizado con C1 IA no es capaz de distinguir entre C1 IA y CRP, mientras los otros animales mencionados son capaces de identificar las dos proteínas que aparecen cuando se usan los métodos de C1 IA para la purificación de C1 IA usando métodos cromatográficos conocidos, donde C1 IA y CRP pueden aislarse de fluido pleural o ascítico de pacientes que padecen cáncer metastásico, por ejemplo, de tipo carcinomas, tales como tipos de cáncer de mama y tipos de cáncer de ovario. El hecho de que el antisuero de conejo no sea capaz de distinguir entre C1 IA y CRP y C1 IA juega un papel importante en el presente contexto y se enfatiza, por lo tanto. En la lectura de la presente memoria descriptiva, es importante recordar que una respuesta, en ensayos inmunológicos, basada en la reacción con anti C1 IA humano de conejo (que es un reactivo disponible comercialmente) será una respuesta al "inactivador de C1" o, en otras palabras, una respuesta a la suma de C1 IA y CRP y C1 IA.
C1 IA, y probablemente también CRP, se ha aislado de medios del cultivo de varios tipos de células cancerosas humanas, incluyendo carcinomas independientemente del origen, porque el anticuerpo producido en animales del medio de cultivo recogido produce anticuerpos, especialmente frente a C1 IA y CRP.
La proteína C reactiva (CRP) es una proteína pentamérica anular (con forma de anillo), encontrada en el plasma sanguíneo, cuyos niveles se elevan en respuesta a la inflamación. Es una proteína de fase aguda de origen hepático que se incrementa después de la secreción de interleuquina-6 por los macrófagos y células T. Su papel fisiológico es unirse a la lisofosfatidilcolina expresada en la superficie de células muertas o moribundas (y algunos tipos de bacterias) con el fin de activar el sistema del complemento a través del complejo C1Q. Esta unión a lisofosfatidilcolina que se expresa realmente en células muertas o moribundas, también puede estar presente en determinadas células cancerosas o determinado porcentaje de células cancerosas de tipo carcinoma o de tumores de cerebro malignos. CRP está compuesta por 5 subunidades idénticas con un peso molecular de 21.500. Es detectable en la superficie de aproximadamente el 4 % de los linfocitos de sangre periférica normal. El reactante CRP de fase aguda se produce en el hígado; la CRP detectable en los linfocitos se produce por estas células (Kuta y Baum, 1986).
Kilpatrick y Volanakis (1991) revisaron la genética molecular, estructura, y función de CRP. Localización citogenética: 1q23.2 Coordenadas genómicas: (GRCh38): 1: 159,712,288-159,714,608 (de NCBI).
Sobre la base de los experimentos in vitro e in vivo, se ha propuesto que la función de CRP se refiere a su capacidad de reconocer específicamente patógenos extraños y células dañadas del huésped e iniciar su eliminación mediante la interacción con sistemas efectores humorales y celulares en la sangre. Así, la molécula de CRP tiene una función tanto de reconocimiento como efectora (Kilpatrick y Volanakis, 1991).
Robey et al. (1984) demostraron que CRP se une con alta afinidad a la cromatina. Se ha propuesto que una de sus funciones fisiológicas principales es actuar como un secuestrador para la cromatina liberada por las células muertas durante el proceso inflamatorio agudo.
La interleuquina-6 (IL6; 147620) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFA; 191160) son citoquinas inflamatorias y los inductores principales de la secreción de la proteína C reactiva en el hígado. CRP es un marcador de la inflamación de grado bajo y puede tener un papel en la patogénesis de las lesiones ateroscleróticas en los seres humanos (Blake y Ridker, 2002). Los efectos de TNF-alfa están mediados por 2 receptores: tipo 1 (TNFR1; 191190) y tipo 2 (t Nf R2; 191191). El Nurses' Health Study (NHS) y el Health Professionals Follow-up Study (HPFS) son investigaciones de cohortes prospectivas que implican un gran número de enfermeras registradas en los EE. UU. y profesionales sanitarios masculinos de los EE. UU., respectivamente. Pai et al. (2004) examinaron los niveles plasmáticos de TNFR1 soluble, TNFR2 soluble, interleuquina-6, y proteína C reactiva como marcadores del riesgo para enfermedad coronaria entre las mujeres y hombres participantes, respectivamente, en estos 2 estudios.
Entre los participantes que proporcionaron una muestra de sangre y que no tenían enfermedad cardiovascular en la línea base, 239 mujeres y 265 hombres tuvieron un infarto de miocardio no fatal o enfermedad cardiaca coronaria fatal (véase, 607339) durante 8 años y 6 años de seguimiento, respectivamente. Pai et al. (2004) encontraron niveles elevados de marcadores inflamatorios, particularmente proteína C reactiva, lo que indica un riesgo incrementado de enfermedad cardiaca coronaria. Aunque los niveles de lípidos plasmáticos estaban más fuertemente asociados con un riesgo incrementado que los marcadores inflamatorios, el nivel de proteína C reactiva fue un contribuyente significativo para la predicción de enfermedad cardiaca coronaria.
Para el aislamiento y purificación de C1 IA y CRP, pueden usarse varios métodos. Es común a todos los métodos útiles el hecho de que comprenden técnicas de separación con el fin de aislar y purificar un material de pseudoglobulina que tiene las propiedades descritas en la sección denominada "Caracterización de C1 IA y CRP" del medio en el que se encuentra. Los métodos adecuados comprenden técnicas de adsorción y filtración en gel que son muy conocidas para el experto en la técnica. Como se ha mostrado que C1 IA y CRP pueden prepararse a partir de medios del cultivo de células cancerosas humanas, y también que C1 IA no puede aislarse de medios de cultivo de dichas células cancerosas humanas, un método no ambiguo para la concentración, aislamiento y purificación de C1 IA y CRP es usar métodos de adsorción y filtración en gel con un ensayo inmunológico concomitante usando anti C1 IA humano de conejo, para obtener, a partir del medio de cultivo de los tipos de células cancerosas mencionados anteriormente, la proteína que reacciona inmunológicamente con el anti C1 IA humano de conejo. En dicho procedimiento, debe tenerse cuidado para evitar valores de pH por debajo de 5,5 y por encima de 10,5 y temperaturas de calentamiento superiores a 56 grados C, ya que se ha mostrado, véase la sección denominada "Caracterización de C1 IA y CRP", que dichas condiciones dan lugar a alteraciones de las propiedades biológicas de C1 IA y CRP. Cuando se diseña un método adecuado para concentrar o purificar C1 IA y CRP, el experto en la técnica también usará otras de las características que caracterizan indicadas en la sección "Caracterización de C1 IA y CRP", incluyendo el peso molecular estimado de C1 IA y CRP, que es 110.000-130.000. La evidencia de la presencia de C1 IA y CRP en cualquier material se puede obtener usando ensayos inmunológicos frente a anticuerpos o antisueros que dan una reacción con C1 IA y CRP que es fácilmente distinguible de la reacción con cualquier otra proteína, incluyendo C1 IA. La preparación de dichos anticuerpos o antisueros se describe en la presente memoria descriptiva. Los métodos adecuados para concentrar, aislar y purificar C1 IA y CRP emplean cromatografía de adsorción en columna y filtración en gel.
Se indica que se ha encontrado que C1 IA y CRP no reacciona con anticuerpos con especificidad frente a otros antígenos conocidos, especialmente no con anticuerpos frente a antígenos oncofetales conocidos y, en particular, no con anticuerpos frente a la fetoproteína alfa2 o proteína CEA.
Un método preferido para la preparación de C1 IA y CRP a partir de un medio que contiene C1 IA y CRP se describe en la sección "Preparación de C1 IA y CRP" e implica cromatografía de adsorción en columna y filtración en gel posterior. Una columna preferida para la cromatografía de adsorción en columna es una columna de resina de intercambio aniónico tal como Dowex 2x8, malla 200-400, y un material de gel preferido para la filtración en gel es un gel de dextrano tal como Sephadex® G75 Superfine. Las operaciones de unidad convencionales se incluyen en estos procedimientos, p. ej., diálisis y liofilización en los estadios apropiados.
El medio a partir del que C1 IA y CRP pueden concentrarse, aislarse y purificarse puede ser un medio de cultivo del cultivo de un tipo de células cancerosas humanas que producen C1 IA y CRP, o un fluido corporal tal como suero o exsudado pleural/ascítico de un paciente que padece un tipo de cáncer que produce C1 IA y CRP. Como se ha explicado anteriormente, el medio de cultivo de las células cancerosas no contendrá C1 IA, pero se encontrará C1 IA junto con C1 IA y CRP en el fluido corporal de pacientes humanos con cáncer. Para la mayor parte de las utilidades prácticas de C1 IA y CRP, la presencia de C1 IA en cualquier medio de partida usado no presenta un problema serio, ya que los aislados que contienen C1 IA además de C1 IA y CRP son valiosos en sí mismos, tal como se explicará más adelante.
Cuando las células cancerosas se cultivan para la producción de C1 IA y CRP, el medio de cultivo adecuado es medio esencial mínimo de Eagle y medio RPMI con aminoácidos sintéticos (véase la Publicación 73/74 de Flow Laboratories, Irvine Ayrshire, K.A. 128 NB, Escocia), pero también puede usarse cualquier otro medio que soporte el crecimiento de las células cancerosas. Se ha encontrado que los mejores rendimientos de C1 IA y c Rp se obtienen cuando el medio de cultivo contiene glutamina añadida en una cantidad que supera aproximadamente 285 mg por litro, preferiblemente que supera 290 mg por litro. Actualmente, se ha encontrado que la cantidad óptima de glutamina añadida es aproximadamente 294 mg por litro, y la adición de cantidades mayores no parece proporcionar ninguna ventaja añadida. Los procedimientos habituales para cultivar células cancerosas emplean una fase de crecimiento en medio esencial mínimo de Eagle enriquecido con glutamina añadida y una fase de producción en medio RPMI con glutamina añadida. Cada fase puede comprender unos pocos días, p. ej., 3-7 días; actualmente, 3 días es el periodo preferido.
Como se ha mencionado anteriormente, se cree que C1 IA y CRP juega un papel importante en la defensa de las células cancerosas frente a la destrucción por el sistema inmune humano. C1 IA y CRP, una de ellas siendo una sialoproteína (neuraminoglicoproteína), posee una baja antigenicidad, y se cree que C1 IA y CRP, junto con otras proteínas encontradas en el medio de cultivo de las células cancerosas y en fluidos corporales de pacientes con cáncer, especialmente orosomucoide, alfa2 glicoproteína HS, y alfa2 glicoproteína Zn (también (obsoleto) designada alfa2 glicoproteína Zn), "enmascaran" a las células cancerosas frente a la identificación como "no propias" por el sistema inmune humano. Además, como se ha mencionado anteriormente, C1 IA y CRP es capaz de inhibir la activación de C4 por C1, y se cree que esta es una de las razones principales de que las células cancerosas no sean atacadas de manera efectiva por el sistema inmune, lo que podría deberse al hecho de que un tumor maligno sólido puede consistir fácilmente en células cancerosas muertas o moribundas, a un efecto de recambio celular del que no sabemos mucho, pero que podría explicar que CRP pueda estar presente al mismo tiempo que C1 IA. Realmente, este fenómeno según experiencias en informes patológicos dice que está presente la necrosis tumoral, esto significa que las células de cáncer de mama muertas pueden observarse en la muestra de tejido. La necrosis tumoral está frecuentemente limitada a un área pequeña en la muestra. Su presencia sugiere un cáncer de mama más agresivo.
Para investigar la relación entre necrosis e hipoxia, por ejemplo, en cáncer de mama o carcinoma de mama, Tomes et al (Tomes L, Emberley E, Niu Y, Troup S, Pastorek J, Strange K, Harris A, Watson PH. Necrosis and hypoxia in invasive breast carcinoma. Breast Cancer Res Treat. 2003 sep;81(1): 61-9) examinaron la expresión de los marcadores asociados a hipoxia HIF1, CA IX y GLUT1 por inmunohistoquímica en 97 carcinomas ductales invasivos. Esta serie seleccionada comprendía 48 tumores con necrosis extensa y 49 tumores control sin necrosis. Más del
90 % de los tumores necróticos y el 30 % de no necróticos expresaban al menos un marcado de hipoxia. El grupo también observó la expresión de marcadores asociados a hipoxia en el estroma tumoral. El examen de fibroblastos de mama humanos primarios in vitro confirmó que el ARNm de y la proteína CA IX pueden inducirse por hipoxia. Los análisis de supervivencia de 53 casos encontraron que el subconjunto de tumores con hipoxia estromal presenta un mejor pronóstico (p=0,027). Los resultados de Tomes et al indican que la necrosis está acompañada frecuentemente de hipoxia pero que la hipoxia sin necrosis también puede ser una aparición frecuente. El uso de varios marcadores de hipoxia puede identificar un continuo de hipoxia en tumores, que pueden subclasificarse por diferentes patrones de coexpresión. Tomes concluye que la hipoxia estromal y epitelial puede tener diferentes fondos biológicos y que la hipoxia estromal puede afectar a la supervivencia.
En dichos casos, y en muchas otras descripciones de carcinomas, se sabe que la necrosis puede estar presente frecuentemente y, por lo tanto, es bastante plausible que en los carcinomas aislados, o fluido ascítico o pleural de pacientes con metástasis de cáncer podrían tener obviamente tejido necrótico que contiene células moribundas o muertas, de manera que las células, además de la presencia de C1 IA recubriendo una determinada parte de las células de carcinoma, también pueden contener la presencia de CRP originada de las células moribundas o muertas.
Expresado de otra manera, la capacidad de las células cancerosas de producir C1 IA como una proteína de membrana puede ser una de las razones principales de por qué estas células cancerosas poseen la capacidad de bloquear tanto la rama como la rama eferente de la respuesta inmune. Al mismo tiempo, CRP podría estar presente en algunas de las células cancerosas muertas o moribundas, que tienen lugar lo más probablemente en los cánceres sólidos.
La rama aferente está bloqueada aparentemente principalmente debido al efecto de enmascaramiento de C1 IA y CRP (efecto symbody), y la rama eferente parece estar bloqueada tanto a nivel de la defensa inmune humoral como al nivel de la respuesta inmune celular, siendo el primero un bloqueo del sistema del complemento en el estadio mencionado adicionalmente anteriormente, y siendo el último atribuible a la carga eléctrica fuertemente negativa de la membrana de las células cancerosas debido a C1 IA y CRP cargado negativamente y otros compuestos sialo cargados fuertemente negativamente que repelerán a los linfocitos cargados negativamente.
Una representación esquemática del sistema del complemento humano y de la acción de bloqueo e inhibidora del inactivador de C1 a partir de ahí se muestra en la FIG. 1. Cuando una reacción del complemento se ha iniciado por el fragmento Fc de una inmunoglobulina, el C1 activado activará, en el curso normal de una reacción o cascada del complemento, los componentes C4 y C2 del complemento, después de lo cual la reacción del complemento continuará hasta el punto final y la lisis del material "no propio" o antígeno con el que había reaccionado la inmunoglobulina, pero el inactivador de C1 puede inhibir la activación por C1 de C4, en cuyo caso C4 no se unirá al antígeno, y las reacciones adicionales del complemento no continuarán.
Los fluidos corporales de seres humanos sanos contienen C1 IA como un controlador necesario del sistema del complemento. Está bien establecido que el efecto controlador de C1 IA en el organismo sano (manifestándose dicho efecto de control en sí mismo mediante la inhibición de C1r y C1s, dando lugar a la ausencia de la activación por C1 de C4) está relacionado con la concentración de C1 IA, y que normalmente, el efecto inactivador de C1 IA en la molécula de C1 está limitado a la inactivación de cualquier exceso de activación de C1, que de otra manera podría dar lugar a una cascada del complemento en la fase de suero, dando lugar a edema de Quincke. Los valores normales de C1 IA en la fase de suero son hasta 15- 35 % en mg.
Se ha encontrado ahora que los pacientes que padecen enfermedades cancerosas verificadas muestran frecuentemente niveles séricos anormalmente elevados del inactivador de C1, incremento que probablemente es atribuible al C1 IA y CRP presente en el suero del paciente, así como la elevación del componente c 4 del complemento en el suero de estos pacientes.
En la estimación de en qué grado los pacientes que padecen cáncer verificado tienen niveles elevados del inactivador de C1 (C1 IA), cien pacientes que padecen cáncer de distinto origen, es decir, carcinomas, reticulosarcomas, y en casos aparentemente raros en algunos tipos de linfomas, se evaluaron para determinar la concentración sérica del inactivador de C1, usando la técnica de cohete de Laurell con anti C1 IA humano de conejo. Los experimentos control incluyeron el examen equivalente del suero de sujetos sanos y de pacientes que padecen enfermedades no malignas verificadas. Los resultados se muestran en la FIG. 2. Parece que los valores medios de C1 IA de sujetos sanos son mucho menores que los de pacientes que padecen cáncer. También, los pacientes que padecen enfermedades no malignas mostraron niveles del inactivador de C1 con valores medios menores que los pacientes con cáncer y aproximadamente en el rango normal como se encuentra en los sujetos sanos.
Se cree que las concentraciones elevadas del inactivador de C1 en el suero de pacientes que padecen cáncer se debe principalmente a la presencia de C1 IA liberado de clones de células cancerosas. Por la técnica de Ouchterlony, se verificó que los pacientes con cáncer que se encontró que tenían valores elevados del inactivador de C1 revelaron las líneas de precipitación tanto para C1 IA como CRP, y que los pacientes que padecen enfermedades no malignas y los sujetos sanos no mostraron ninguna presencia significativa o niveles muy bajos de CRP (ambos medidos frente a anti C1 IA/C1 IA y CRP humano oligoespecífico de cerdo). Un ejemplo típico de una investigación en suero Ouchterlony de este tipo se muestra en la FIG. 3.
Como se ha descrito previamente, el C4 del complemento también está elevado en pacientes con cáncer, debido lo más probablemente al bloqueo de la activación de C4 que no puede activarse por C1qrs debido a la ausencia de disociación de este complejo debido al efecto de bloqueo o inhibidor de la presencia de C1 IA (elevado en pacientes con cáncer debido a la presencia de células cancerosas).
Las estimaciones del nivel del componente C4 del complemento, realizadas en los mismos grupos de pacientes, mostraron casi los mismos valores medios para sujetos sanos y pacientes que padecen enfermedades no malignas, mientras los pacientes que padecen cáncer mostraron niveles de C4 significativamente elevados, véase la FIG. 2.
Se ha encontrado que los valores del "inactivador de C1" (C1 IA) que superan las concentraciones de aproximadamente 50 % en mg (50 mg/100 ml) (como se estima por electroforesis en cohete usando anti C1 IA humano de conejo) coincidirán frecuentemente con la elevación de C4 indicando que el sistema del complemento está bloqueado en el estadio de C4, es decir, en el estadio donde la activación por C1 de C4 debería producirse con el consumo consecuente de C4 (el C4 activado se une a las membranas de las células que se van a lisar por el sistema del complemento). En la investigación del cáncer con crecimiento progresivo, se ha encontrado que el "inactivador de C1" y C4 se elevan continuamente hasta la muerte del paciente. También se ha encontrado que los valores subterminales y terminales de C4 alcanzan valores de hasta 160 % en mg, y valores del inactivador de C1 de hasta aproximadamente 120 % en mg. En el suero de algunos pacientes con cáncer verificado con clones de células cancerosas pequeños primarios, los valores de aproximadamente 40-50 % en mg del inactivador de C1 (C1 IA) se han confirmado sin ningún signo de niveles de C4 anormalmente elevados; sin embargo, cuando estos pacientes han sido sometidos a cirugía, los niveles del inactivador de C1 disminuyen después de un periodo de aproximadamente 3 semanas y permanecerán en el rango normal, concomitantemente con C4 permaneciendo en el rango normal (indicativo de una operación radical exitosa), o se encuentra una elevación del inactivador de C1 acompañada de C4 elevado. La explicación del último fenómeno puede ser que una operación radical supuesta puede haber incitado una concentración elevada del inactivador de C1, así como CRP alta en la fase de suero debido a la liberación de CRP de las células cancerosas dañadas y de las células cancerosas arrojadas en la corriente sanguínea, y que este incremento en la concentración del inactivador de C1 cause el bloqueo del sistema del complemento. En estos casos, C4 también se elevará. Cuando se produce una elevación de CRP, y posiblemente al mismo tiempo también una elevación de C1 IA, en una muestra de suero, pero C4 no está significativamente elevado, el paciente tiene entonces otra razón para este patrón, concretamente un trastorno o enfermedad inflamatorio tal como hepatitis viral, hepatitis B aguda o crónica, enfermedad relacionada con el corazón u otra enfermedad inflamatoria, por ejemplo, causada por la muerte o necrosis celular debida a otra enfermedad distinta del cáncer.
En el fondo de la explicación anterior, se entenderá que un incremento radical en las posibilidades de tratar de manera efectiva el cáncer se conseguiría si la inhibición de la respuesta inmune que tiene lugar en el caso del cáncer pudiera neutralizarse, esto es, si el bloqueo de la defensa inmune pudiera obviarse, y si las células cancerosas pudieran "desenmascararse", de manera que fueran reconocidas más fácilmente por la vigilancia inmune del sistema inmune humano. La presente descripción proporciona dicho desbloqueo y desenmascaramiento.
Cuando, por ejemplo, un fluido pleural o fluido ascítico de un paciente con cáncer con metástasis se somete a purificación usando los métodos descritos para la purificación de C1 IA, un aspecto importante es que esta forma de purificación para C1 IA contendrá a la vez CRP en las mismas fracciones que C1 IA. Por lo tanto, cuando se usa C1 Ia purificado de pacientes con cáncer usando los métodos descritos en esta memoria descriptiva el inmunógeno resultante que se ha usado para la vacunación de los animales tales como cerdos, un aspecto importante se refiere a antisueros o anticuerpos con especificidad tanto frente a C1 IA como a CRP.
Dichos antisueros pueden producirse inmunizando selectivamente animales inmunizables, p. ej., cerdos con vacunas que contienen C1 IA y CRP como un componente antigénico, y recuperando el suero de los animales inmunizados. Sobre la base del descubrimiento de que orosomucoide, la alfa2 glicoproteína HS, y la alfa2 glicoproteína Zn son proteínas que pueden aislarse de medios de cultivo de células cancerosas, especialmente en los estadios tempranos del cultivo (antes de tripsinizar y subcultivar), que estas tres proteínas son de forma notoria proteínas que muestran una antigenicidad muy baja, y que el orosomucoide está presente en altas concentraciones en el exudado de pleura de pacientes con cáncer, se cree que estas tres proteínas adicionales toman parte en el "enmascaramiento" de las células cancerosas, razón por la cual se prefiere incluir también a estas tres proteínas en las vacunas que se van a administrar a los animales huésped para la preparación de los antisueros para propósitos de terapia del cáncer, con el fin de que los antisueros contengan también anticuerpos frente a estas proteínas animales. Además, como no puede evitarse que C1 IA sea, en varios casos, el inactivador predominante de C1 en la fase de fluido, mientras C1 IA y CRP es el inactivador de C1 presente en las células cancerosas, puede presumirse que el antisuero más efectivo es uno que sea capaz de atacar tanto a C1 IA como a CRP.
En lo que sigue, se explicará el efecto de los antisueros o anticuerpos con más detalle. Para brevedad y una mejor valoración, el término "INA" (antisuero inmune neutralizante-desbloqueante) usado en el tratamiento previo de pacientes con cáncer con anticuerpos anti humanos porcinos (que se han inmunizado con C1 IA y CRP) se usó para tratar a pacientes tratados con el anticuerpo denominado INA, es ahora por inyección o infusión del anticuerpo denominado INA era capaz de causar el encogimiento de los carcinomas (metástasis de carcinoma avanzado) concomitantemente con una disminución en C1 IA y C4 como se encuentra en algunos de los pacientes tratados con el anticuerpo porcino frente a C1 IA, con el que los pacientes también ha sido tratados por inyección o infusión de anti C1 IA y anti CRP. Cuando se aplica el anticuerpo anti C1 IA monoclonal o puede ser recombinante, el efecto del tratamiento puede incluso ser eficiente cuando la composición es anticuerpo anti C1 IA y anti CRP bien proporcionado como una mezcla de estas dos proteínas o inyección como anti C1 IA e inyección como CRP separadamente, lo que significa un kit de ensayo de tratamiento que contiene bien una mezcla que consiste en una composición de anticuerpo recombinante anti C1 IA y CRP, o dos kits en donde un kit consiste en anti C1 IA recombinante administrado separadamente y otro kit que consiste en anti CRP administrado separadamente.
Los anticuerpos antiC1 IA y CRP humano reaccionan con C1 IA y CRP en la membrana de la célula cancerosa, por una reacción antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, la interacción entre INA y las células cancerosas puede mostrarse marcando INA (p. ej., con FITC (isotiocianato de fluoresceína)) e incubando las células cancerosas humanas con el INA marcado. Las células cancerosas mostrarán un marcaje positivo. Las células del mismo cultivo preincubadas con neuraminidasa no muestran ningún marcaje después de la incubación con antisuero de INA marcado, lo que indica que los determinantes antigénicos de C1 IA y c Rp se descomponen por la neuraminidasa. Cuando INA bloquea los determinantes de C1 IA y CRP en las membranas de las células cancerosas, las células cancerosas se vuelven accesibles al ataque por el sistema de defensa inmune humoral humano, lo que se demuestra, p. ej., de la siguiente manera: se incuban células cancerosas humanas con INA y se incuban posteriormente con suero del mismo paciente o de otros pacientes con el mismo tipo de cáncer. Después de la incubación durante, p. ej., 6 horas, las células cancerosas se despegan del matraz de cultivo, y después, p. ej., de 18 horas, todas las células cancerosas están muertas. Las células mesoteliales y fibroblastos tratados de la misma manera continúan creciendo en los matraces de cultivo, inalteradas por las incubaciones, y en cultivos control sin incubación con INA, la incubación con suero no afectó a las células cancerosas. Esto demuestra que anti C1 IA puede actuar neutralizando o eliminando el factor inhibidor o bloqueante relacionado con C1 IA en las células cancerosas matando así a una determinada cantidad de células cancerosas y anti CRP se unirá a CRP que recubre las células cancerosas moribundas o células cancerosas muertas, eliminando así otro grupo de las células cancerosas que también parece ser parte de la masa de carcinoma sólido, así C1qrs se activará cuando el anticuerpo frente a C1 IA se una a un determinado grupo de células cancerosas y C1qrs se activará cuando el anticuerpo frente a CRP se una a otro grupo de células cancerosas activando así la reacción del complemento frente a ambos grupos de células cancerosas encontrados en el carcinoma. Así, INA que se produjo en cerdos como se ha descrito anteriormente podría ser capaz de neutralizar este efecto bloqueante activando C1qrs en las células cancerosas recubiertas con C1 IA y el encogimiento restante del carcinoma podría deberse a la activación de C1qrs causada por la unión de un anti CRP a la otra parte de las células cancerosas. Cuando C1 IA y CRP se neutraliza por INA in vitro, su efecto inhibidor en la activación por C1 de C4 se neutraliza, lo que significa que cesa el bloqueo de la acción del sistema inmune, C4 se une a las membranas de las células cancerosas, y tiene lugar la acción adicional del sistema del complemento dando lugar a una lisis de las células cancerosas; después de la activación de C4, la reacción del complemento no puede pararse por ninguna influencia de C1 IA y CRP, véase la FIG. 1.
Descripción breve añadida
Nuevos métodos biológicos para el diagnóstico y monitorización del cáncer con bloqueo inmune y tratamiento del cáncer con desbloqueo inmune
Durante varios años, los investigadores de Dana-Genetic se han centrado en las respuestas inmunes de desbloqueo en pacientes con cáncer que tienen lugar en el sistema inmune innato, que incluye el complemento.
Las funciones generales conocidas del sistema inmune innato de vertebrados incluyen:
• Reclutamiento de células inmunes a sitios de infección, a través de la producción de factores químicos, incluyendo mediadores químicos especializados, denominados citoquinas.
• Activación de la cascada del complemento para identificar bacterias, activa células, y promueve la eliminación de complejos de anticuerpo o células muertas.
• Identificación y eliminación de sustancias extrañas presentes en órganos, tejidos, la sangre y linfa, por células sanguíneas blancas especializadas.
• Activación del sistema inmune adaptativo a través de un proceso conocido como presentación de antígeno
• Actuar como una barrera física y química para agentes infecciosos.
Encontramos que el sistema inmune innato parece estar realmente bloqueado por las células cancerosas, y entre estas especialmente las células de carcinoma en los seres humanos. Después, identificamos las razones para el bloqueo y hemos encontrado vías para desbloquear las células cancerosas. Esto se sugirió incluso en un estudio piloto temprano que implicaba el tratamiento de unos pocos pacientes que padecían carcinoma metastásico avanzado (pacientes con cáncer en estadio final).
Esta estrategia de tratamiento de desbloqueo inmune registrada en carcinomas permite una nueva metodología para eliminar o neutralizar el recubrimiento de otra forma protector de las células de carcinoma con el inhibidor de C1 también llamado inactivador de C1 (C1 IA), que actúa como una proteína de bloqueo inhibiendo la activación del componente C1qrs del complemento que normalmente está activado, así permite que el sistema inmune innato mate a los microorganismos y cause la lisis o rechazo de las células extrañas (p. ej., el rechazo observado después de un trasplante alogénico), y la proteína C reactiva (CRP) que en determinadas condiciones interfiere con el componente C5 del complemento bloqueando C5b. La presencia del inactivador de C1 en las células de carcinoma dio lugar a la medición en suero del inactivador de C1 y C4, que se encontró que era un posible predictor del cáncer. Tomado conjuntamente con CRP, se desarrolló un sistema de diagnóstico y monitorización del tratamiento del cáncer patentado.
El bloqueo por C1 IA de C1qrs del complemento previene la activación por C1rs de la conversión de C4 a C4b, previniendo la cascada del complemento adicional y, por lo tanto, previene la lisis o muerte celular. De esta manera, el carcinoma sobrevivirá sin ser reconocido y bloqueado frente al sistema de vigilancia inmune. Los carcinomas son el tipo de cáncer dominante en los seres humanos (~80 % de todos los canceres).
Además, se encontró que también estaba presente una proteína de bloqueo adicional. Mediante la recogida del inactivador de C1 de cultivos de células de carcinoma humanas, sabemos ahora que el factor de bloqueo adicional parece ser la proteína C reactiva.
El bloqueo de carcinomas y tumores de cerebro malignos descrito anteriormente se utilizará para crear un kit de ensayo de diagnóstico y monitorización futuro, así como una estrategia de tratamiento.
Además de estos descubrimientos en carcinomas y determinados sarcomas, también identificamos el inactivador de C1 bloqueante en cánceres de cerebro malignos tales como astrocitomas y glioblastomas (Osther K et al, Demonstration of a complement inactivator on cultured cells from human malignant brain tumors, Acta Neurol. Scandinav. (1974), 50: 681-689).
El intento inicial de usar anticuerpos desbloqueantes en el estudio piloto clínico consistió en el tratamiento de pacientes con carcinoma con anticuerpos inmunoglobulina G de cerdo purificados frente al inactivador de C1 y anti proteína C reactiva, que se inyectaron I.V. en seis (6) pacientes con carcinomas avanzados y metástasis acercándose al estadio final de su enfermedad. Como se ha descrito anteriormente, este estudio piloto se basó en los descubrimientos del recubrimiento del inactivador de C1 en células de carcinoma humano cultivadas como un "Factor de Boqueo del Complemento". Sin embargo, el tratamiento usando proteínas IgG de cerdo tuvo que interrumpirse después de unos pocos intentos de tratamiento. De otra forma, los pacientes tratados con IgG de cerdo produjeron rápidamente anticuerpos frente a las proteínas de cerdo como se indica por un incremento significativo de IgM en suero después de la infusión de IgG de cerdo.
Nuestra presente memoria descriptiva es usar en primer lugar anticuerpos monoclonales en nuestro ensayo de diagnóstico y monitorización, que en laboratorios clínicos puede basarse en ELISA, inmunoturbidimetría, nefelometría; y los kits tales como inmunodifusión rápida, y una aglutinación visual pueden usarse en el consultorio médico.
Sobre la base del efecto de bloqueo descrito anteriormente, nuestra segunda intención es desarrollar tecnología recombinante para producir anticuerpos desbloqueantes humanos para el tratamiento del cáncer.
La titulación del inmunógeno C1 IA se estimó en ese momento mediante ensayo del inmunógeno en inmunoelectroforesis en cohete de Laurell (Walker JM. Rocket Immunoelectrophoresis. Methods Mol. Biol. 1984; 1: 317-23), y se cuantificó comparando un suero control de C1 IA preparado usando un control en lotes que consistió en inactivador de C1 sérico de un número representativo de donantes sanos. El ensayo se realizó en inmunoelectroforesis en cohete de Laurell (véase La figura 1).
Anticuerpos monoclonales de Dana Genetic que se van a usar en el kit de ensayo de diagnóstico y monitorización del cáncer
Antecedentes para el desarrollo del kit de ensayo de bloqueo para el diagnóstico/monitorización inmune de Dana Genetic.
Los anticuerpos usados fueron suero anti inactivador de C1 humano de conejo y anti C4 de conejo de Behring Institute, Marburg, Alemania. El ensayo del inactivador de C1 y C4 se hizo usando suero de carcinomas humanos de diferentes tipos de cáncer que variaron de cáncer de pulmón, cáncer de mama, otros cánceres ginecológicos, cáncer de próstata, cánceres de riñón, cáncer de vejiga, melanomas y otros tipos de carcinoma. Estas muestras de suero se compararon con el suero de pacientes con enfermedades no malignas y de donantes sanos. Las muestras de suero fueron de los departamentos de oncología, ginecología, y departamento de cirugía de hospitales basados en Copenhague, así como de bancos de sangre municipales de Copenhague, véase la figura 2.
Nuestro ensayo de diagnóstico inicial que comparó niveles de inactivador de C1 en suero (inhibidor de C1 en suero) y componente C4 del complemento en suero se basó en el uso de anticuerpo policlonal de conejo anti humano anti inhibidor de C1 y anticuerpo policlonal de conejo anti humano frente a C4, y el método inmune para la medición fue inmunoelectroforesis en cohete de Laurell (Walker JM. Rocket immunoelectrophoresis. Methods Mol. Biol. 1984; 1: 317-23), véanse los resultados en la Figura 2.
Medición del recubrimiento del inactivador de C1 en cultivos y subcultivos de células de carcinoma
Estos resultados se basan en nuestros descubrimientos de laboratorio durante el cultivo de células de carcinoma de biopsias de carcinoma de pacientes con diferentes tipos de carcinomas y metástasis, así como de fluido corporal adyacente a áreas de metástasis en pacientes con carcinoma como se ha enumerado anteriormente.
Las biopsias de carcinoma se explantaron en matraces de cultivo celular y en micro portas para la incubación de las células con anti inactivador de C1 humano (C1IA) de conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), también denominado anti inhibidor de C1 humano de conejo - FITC. Las muestras de células cultivadas en microportas con anti C1 IA-FITC adherente se midieron en un citofotómetro Leitz MPV2 montado en un microscopio de contraste de fase equipado para la medición de inmunofluorescencia en células únicas en microportas de cultivos de células de carcinoma cultivados y subcultivados.
Como se muestra en la figura 3, un número de 37 cultivos de células de carcinoma de 37 pacientes con cáncer se midió usando este método. El número de células que muestra una concentración relativa del inactivador de C1 (inhibidor de C1) se expresa en porcentaje para cada cultivo celular como se mide por excitación de FITC proporcionando una señal específica significativa (la señal control identificada cuando se establece un límite de corte y se deduce de la excitación específica).
Los subcultivos de 24 explantes (que habían mostrado un recubrimiento específico de inactivador de C1 por una señal alta significativa en el citofotómetro) se ensayaron de nuevo más de 3 días después de haberse tripsinizado, lavado y explantado en medio de cultivo en tubos Leighton (dos (2) microportas del mismo paciente, donde un microporta se midió y no mostró señal de excitación 1-2 horas después de la incubación con anti inactivador de C1 de conejo-FITC, y el otro microporta emparejado con las mismas células se ensayaron después de haber sido incubado durante más de 3 días, mostró de nuevo la presencia de inactivador de C1 en las superficies celulares como se indica por las mediciones, que pueden observarse en la segunda columna. El inactivador de C1 también está presente en determinadas células en individuos sanos, tales como monocitos. Sin embargo, estas células no son adherentes y se eliminarían durante los lavados con tampón, mientras las células cancerosas serán adherentes a los microportas. También se sabe que las células Kupffer en cualquier tejido hepático producen C1 IA.
Estos resultados coinciden y se corresponden bien con los descubrimientos del nivel del inhibidor de C1 (inactivador de C1) y C4 en las muestras de suero de células de carcinoma, en comparación con el suero de donantes sanos y de pacientes con tumores no malignos. Indicando así que la producción del inactivador de C1 de las células de carcinoma se corresponde bien con los descubrimientos de un nivel mayor de inactivador de C1 (C 1 IA) en suero, y postulamos que está causado por la presencia de células de carcinoma en los pacientes. Las mediciones de C4 del complemento reflejan el bloqueo de C4 que se ilustra en la figura 3, que, lo más probablemente, se produce en exceso en el hígado debido a un sistema del complemento desequilibrado.
Los números relativos de células que muestran una señal positiva del inactivador de C1 se expresaron como un porcentaje de células que fueron positivas en el ensayo en el primer ensayo, indicando que el recubrimiento del inactivador de C1 se restableció 3 días después de la tripsinización (que se demostró que eliminaba el recubrimiento del inactivador de C1), indicándonos de nuevo que estas células de carcinoma eran capaces de volver a producir el inactivador de C1 en su membrana celular durante los 3 días de incubación. Se hicieron estudios de presaturación en 12 cultivos de células de carcinoma que estaban entre los que dieron positivo en los ensayos para el inactivador de C1 anteriormente.
Las muestras emparejadas en los mircroportas se preincubaron con anti inactivador de C1 humano de conejo no marcado, después se lavaron y se incubaron con anti inactivador de C1 marcado con FITC. Estas muestras de células no mostraron ninguna señal de excitación específica indicando la unión específica del anti inactivador de C1 de conejo a la membrana celular. Un número de 12 biopsias de adenomas y fibromas no malignos se ensayaron para determinar el recubrimiento del inactivador de C1 y no mostraron un recubrimiento específico del inactivador de C1 en su membrana celular (véase la figura 3).
Kit TRIADE de diagnóstico/monitorización de bloqueo inmune de Dana Genetic
Este "Kit TRIADE" contiene anticuerpos monoclonales para determinaciones cuantitativas separadas en sangre humana de
1. Inactivador de C1
2. Proteína C reactiva (CRP)
3. Componente C4 del complemento
En teoría, los pacientes con cáncer, y en particular los pacientes con carcinoma, se espera que muestren, lo más probablemente, el siguiente patrón en el kit TRIADE:
C1 IA, CRP, C4 del complemento= posible carcinoma u otro tipo de cáncer
Como el primer producto relacionado con el cáncer, Dana Genetic introducirá el Kit de Ensayo de Bloqueo (kit TRIADE) pretendido para
1. Diagnosticar cáncer temprano (p. ej., carcinomas)
2. Monitorizar el comienzo y seguimiento de cualquier tratamiento del cáncer que varía de cirugía, quimioterapia, tratamiento con irradiación, efecto inmuno-oncológico de anticuerpos monoclonales y varios otros aspectos del tratamiento tales como inhibidores (inhibidores de tirosina quinasa, etc.) p. ej., Sunitinib (TKI).
3. Monitorizar el tratamiento de desbloqueo inmune del cáncer.
Desarrollo por Dana Genetic de anticuerpos recombinantes humanos como la terapia de desbloqueo inmune para pacientes con carcinoma, determinados sarcomas, leucemia y tumores de cerebro malignos
El desarrollo de anticuerpos recombinantes humanos frente al inactivador de C1 y la proteína C reactiva se hará en cultivos de células humanas transfectadas que se puedan fabricar en un sitio industrial. Los anticuerpos se ensayarán en estudios de laboratorio in vitro que implican células de carcinoma cultivadas y células de tumor de cerebro maligno tales como astrocitomas y glioblastomas.
Dana Genetic desarrollará una IgG anti inactivador de C1 recombinante humana, e IgG anti proteína C reactiva (anti CRP) recombinante humana y ensayará este producto desbloqueante para determinar su seguridad, toxicología y farmacología usando servicios CRO competentes, diseñados para ofrecer una validación CRO, donde el ensayo incluirá:
1. Caracterizar cualesquiera efectos adversos
2. Identificar toxicidad de órganos diana potencial
3. Determinar los niveles de dosis
4. Definir los mecanismos de acción
5. Evaluar el riesgo para seres humanos, animales y el medioambiente
Sobre la base de los estudios piloto previos que implicaron a unos pocos pacientes con cáncer, se realizará la validación del anti inhibidor de C1 recombinante humano y el anti proteína C reactiva recombinante usando estudios separados de actividad y estabilidad. Usando el estudio piloto previo que trató a pacientes con cáncer con IgG anti C1IA/CRP de cerdo como un modelo, Dana Genetic iniciará los estudios de tratamiento siguientes con "IgG anti-C1 IA/CRP recombinante humana" reemplazando la IgG anti C1 IA/CRP humano de cerdo:
• Estudios de seguridad en pacientes con carcinoma metastásico avanzado en Clínicas de Investigación Clínica aprobadas (CRO)
• Fase I - II, estudios de seguridad y eficacia clínica expandidos continuados incluyendo escalada y frecuencia de la dosis (CRO)
• Ensayos clínicos de Fase III en varios departamentos de oncología y neurocirugía en pacientes con carcinomas metastásicos avanzados (p. ej., carcinoma de mama, carcinoma gastrointestinal, carcinomas de páncreas, carcinoma de riñón, con metástasis (RCC), etc. en tres centros o más.
El desarrollo y fabricación de los "anticuerpos recombinantes humanos" como anticuerpos desbloqueantes frente al recubrimiento protector de las células de carcinoma con el inactivador de C1 y, como se ha encontrado recientemente, frente a la proteína C reactiva recogidos de cultivos de células de carcinoma humano se usarán como el "tratamiento inmune desbloqueante". Este nuevo método se basa en las dianas que hemos identificado en el tipo de cánceres enumerados anteriormente, independientemente de dónde y en qué órgano están localizados los carcinomas.
Este modelo de tratamiento se usará como "tratamiento inmune desbloqueante" frente a cánceres tales como carcinomas humanos de diferentes tipos de cáncer que varían de cáncer de pulmón, cáncer de mama, otros cánceres ginecológicos, carcinomas de próstata, cánceres de riñón, cáncer de vejiga, melanomas y otros tipos de carcinoma.
Como se ilustra en la figura 4a, WT rC1q retuvo esencialmente la capacidad de C1q sérico de desencadenar la activación de C1s-C1r-C1r-C1s, rindiendo un 95 % de activación después de incubación durante 1 h. WT rC1q y sus variantes se mezclaron cada una con la proenzima tetramérica C1s-C1r-C1r-C1s y los complejos resultantes se ensayaron para determinar su capacidad de autoactivarse después de incubación a 37 °C en ausencia del inhibidor de C1.
C1q Como se esperaba, la adición del inhibidor de C1 suprimió el proceso de activación en todos los casos, rindiendo valores de activación del 0,5-5 % después de incubación durante 1 h.
Hay tres áreas de bloqueo del sistema inmune en la célula de carcinoma. El complejo C1qrs normalmente activado por una reacción antígeno - anticuerpo en una superficie de una célula extraña, está bloqueado en la membrana celular de la célula de carcinoma debido al bloqueo por el inactivador de C1 del complejo C1qrs a C1rs en la superficie celular. Esta inhibición causa el bloqueo de la conversión de C4 en C4b en el sistema inmune innato inhibiendo que tenga lugar la cascada del complemento en la célula de carcinoma como se muestra en la figura 4a.
En relación con la reacción inhibidora por la proteína C reactiva (CRP) en el carcinoma, se anticipa que esta reacción se asemeja a la reacción observada por CRP durante el daño miocárdico que ocurre en los vasos sanguíneos coronarios inhibiendo que la convertasa C5 active C5 a C5b. La inhibición de C5b previene que la cascada del complemento tenga lugar de C5b a C9 previniendo la lisis o muerte de la célula (véase la figura 4a).
Esta inhibición causa que otras señales iniciadas por CRP a través de interacciones con receptores de Fc de neutrófilos tengan un efecto antiinflamatorio global. Así, la función biológica principal de CRP en relación con las células de carcinoma parece ser la misma razón que en el sistema cardiovascular, donde constituye funciones adicionales, tales como participación en la aterogénesis y patogénesis del daño miocárdico después de un infarto de miocardio (Volanakis j E, Mol Immunol. 2001 ago;38(2-3): 189-97).
Bloqueo inmune de Dana Genetic - Kit TRIADE
El kit TRIADE de Dana Genetic puede ser una estrategia valiosa como un posible método rentable para la detección temprana de varios tipos de cáncer (p. ej., carcinomas), antes de la manifestación significativa de una enfermedad cancerosa en el paciente.
Por lo tanto, Dana Genetic pretende introducir este kit patentado de Dana Genetic para usarse como una herramienta futura de diagnóstico/monitorización que puede ser ofrecida a los médicos, y especialistas como un posible predictor de los estadios tempranos del cáncer y especialmente carcinomas, que constituyen aproximadamente el 80 % de todos los tipos de cáncer en los seres humanos.
Antecedentes para la selección de proteínas bloqueantes en el kit de diagnóstico/monitorización de Dana Genetic El kit de ensayo se desarrollará como un ensayo de laboratorio, tal como ELISA, inmunoturbidimetría, nefelometría, etc.; y como un kit de "ensayo de consultorio médico", inmunodifusión rápida, y aglutinación visual.
El kit de diagnóstico/monitorización de Dana Genetic se considera principalmente como una estrategia para un "ensayo de diagnóstico de bloqueo inmune", sobre la base de tres componente bloqueantes inmunes identificados en el sistema inmune innato (véase la figura 4a). Los componentes son:
• Inactivador de C1
• Proteína C reactiva
• Componente C4 del complemento
Los niveles anormales anticipados demostrados más adelante son una estimación preliminar, basada en nuestros descubrimientos previos en pacientes con cáncer, como se demuestra en la figura 1.
(Valores normales: C1 IA: 15 - 40 % en mg, CRP: 0 - 10 % en mg, C4: 12 - 60 % en mg)
• Carcinomas y otras formas de cáncer, determinados sarcomas, y determinadas leucemias blásticas;
o C1 IA incrementado, CRP incrementada C4 incrementado.
• Trastornos linfoproliferativos de células B, enfermedad maligna de células B (linfoma de células B, linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, leucemia linfática crónica, otras gammopatías monoclonales; angioedema adquirido (debido frecuentemente a las enfermedades anteriores)
o C1 IA disminuido (< 15 % en mg!), CRP incrementada (> 10 % en mg), C4 disminuido (< 12 % en mg) (Gompels MM, J Clin Pathol 2002;55: 145-147)).
• Trastornos autoinmunes, SLE, artritis reumatoide, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, etc,
o C1 IA disminuido (< 15 % en mg!), CRP incrementada > 10 % en mg), C4 disminuido (< 12 % en mg) (Gompels MM. J Clin Pathol 2002;55: 145-147).
• Edema angioneurótico hereditario, tipo I o tipo II
o C1 IA disminuido (< 15 % en mg!), CRP normal (0-10 % en mg), C4 disminuido (< 12 % en mg) (Gompels MM. J Clin Pathol 2002;55: 145-147).
Inactivador de C1
El inactivador de C1 (también denominado inhibidor de C1) es el único inhibidor fisiológico conocido de la ruta clásica del complemento en sangre y tejidos. Sin embargo, el inhibidor de C1 también es un regulador importante del sistema contacto-cinina por el bloqueo de FXII activado (FXIIa) y calicreína plasmática,
Nivel del inactivador de C1 en suero: rango normal entre 15-40 % en mg.
El inactivador de C1 se usa rutinariamente para el tratamiento de pacientes con angioedema hereditario HANE o HAE. La cantidad de inactivador de C1 infundida para afecciones de HANE (HAE) es eficiente para tratar estos ataques con dosis de alrededor de 20 Unidades/kg de peso corporal, y ha sido evaluado para ataques repetidos sin cambio significativo en el rango de dosis usando Berinert (un inhibidor de C1 plasmático).
Los inhibidores o inactivadores de C1 monoclonales también se usan para el tratamiento de esta afección.
Cuando el angioedema secundario aparece en relación con trastornos linfoproliferativos o enfermedades linfogénicas malignas como se ha descrito anteriormente, los pacientes deficientes en C1 IA también deben recibir un tratamiento adecuado e inmediato con inactivador de C1.
Proteína C reactiva
En los seres humanos siempre están presentes cantidades pequeñas de proteína C reactiva (CRP), pero están elevadas significativamente en pacientes que padecen una variedad de enfermedades incluyendo determinados tipos de cáncer y, como hemos encontrado recientemente, están especialmente elevadas en el suero en pacientes con carcinoma o metástasis de carcinoma.
Se ha encontrado recientemente que CRP es parte de las "proteínas de bloqueo inmune" que implica el sistema del complemento y se ha encontrado que es una de las dos proteínas que aislamos inicialmente de células de carcinoma humano detectada usando un método de ensayo adicional, una variante del ensayo de inmunodifusión radial de Mancini (ensayo RID denominado un "ensayo de inmunodifusión doble de Mancini" (véase la figura 5).
La presencia de esta otra proteína "bloqueante", que ahora se sabe que es CRP, se ensayó midiendo el tamaño del anillo de precipitación desarrollado usando la tecnología de Mancini como se muestra en la figura 5.
Esta presencia de CRP en tejido de carcinoma se ha convertido recientemente en un nuevo foco para los investigadores respecto a determinados cánceres, tales como carcinomas y se ha encontrado que está incrementada respecto a cómo de progresivo puede ser un cáncer maligno.
Se han identificado factores predictivos de supervivencia en pacientes del mundo occidental con carcinoma de células renales de células claras metastásico (mCCRCC) como se pone de manifiesto en estudios donde los pacientes se trataron con Sunitib, un inhibidor de tirosina quinasa usado para el tratamiento del riñón. Se indicó por una disminución de CRP en los pacientes que mostraban remisión de su cáncer de riñón. Estos resultados sugieren una posible relación en afecciones tumorales una respuesta al tratamiento con sunitib encontrada en el "mundo occidental".
Sin embargo, esta predicción con CRP no podría usarse como una herramienta de pronóstico cuando se estudia la supervivencia en pacientes japoneses con mCCRCC tratados con sunitinib de primera línea para la evaluación del tratamiento en Japón (Kawai Y, Osawa T, Kobayashi K, Inoue R, Yamamoto Y, Matsumoto H, Nagao K, Hara T, Sakano S, Nagamori S, Matsuyama H. Factors Prognostic for Survival in Japanese Patients Treated with Sunitinib as First-line Therapy for Metastatic Clear Cell Renal Cell Cancer. Asian Pac J Cancer Prev. 2015; 16(14): 5687-90).
Originalmente, CRP se definió como una sustancia, observada en el plasma de pacientes con inflamaciones agudas, como, por ejemplo, en infecciones que reaccionan con el polisacárido C del neumococo como descubrió Tillett et al en 1930 (Tillett Ws y Francis T. J Exp Med. 1930 sep 30;52(4): 561-71). Es una de esas proteínas plasmáticas que se denominaron originalmente "reactante de fase aguda" debido a la elevación pronunciada de la concentración después del daño tisular o inflamación; en el caso de CRP, la elevación puede ser de 1.000 veces o más. CRP está compuesta por 5 subunidades idénticas con un peso molecular de 21.500. CRP es producida por el hígado y es detectable en linfocitos. Se sabe bien que CRP es un marcador sistémico en respuesta a citoquinas, y también se ha identificado que está incrementada en enfermedades virales tales como hepatitis B crónica (Shima M1, Nakao K, Kato Y, Nakata K, Ishii N, Nagataki S. Comparative study of C-reactive protein in chronic hepatitis B and chronic hepatitis C. Tohoku J Exp Med. 1996 mar; 178(3): 287-97) e infecciones por VIH (Noursadeghi M1, Miller RF. Clinical value of C-reactive protein measurements in HIV-positive patients. Int J St D AId S. 2005 jun; 16(6) :438-41).
C4
El componente C4 del complemento es una proteína implicada en el sistema del complemento. Cuando el complejo C1qrs se une a una reacción anticuerpo - antígeno y convierte el complejo C1qrs en C1rs, el C1rs convertido activa entonces C4, que se escinde entonces en C4b que, conjuntamente con el componente C2a del complemento a través de la C3 convertasa, activa C3, y la cascada del complemento se activará toda la ruta hasta C9. Véase la figura 4b, donde se elimina el efecto de desbloqueo.
El componente C4b estará en este proceso unido a la membrana celular durante el proceso de la cascada del complemento, así como el componente C5 se convierte en C5b. Estos componentes se unirán entonces en secuencia a la membrana celular a través de C9, que entonces penetrará la membrana celular y causará la lisis de la célula (muerte celular). Si C4 no es activado por C1qrs, que puede ser inhibido por el inactivador de C1, evitará que C1rs active C4. Esto dará lugar a un incremento de C4 que no puede ser activado en C4b, y C4 será el componente de bloqueo identificado indirectamente por un incremento en C4 circulante, lo que significa C4 incrementado en sangre.
Por lo tanto, respecto al inactivador de C1 bloqueante inmune innato, C4 se bloqueará indirectamente (véase la figura 4a.
En los trastornos autoinmunes, el factor C4 del complemento mostrará frecuentemente un nivel disminuido de C4 sérico por debajo de los valores normales. En el lupus eritematoso sistémico (SLE) puede encontrarse una deficiencia completa de c 4 del complemento y sugiere un factor de riesgo genético fuerte para SLE. C4 está codificado por dos genes diferentes, C4a y C4b, que muestran una variación considerable en el número de copias de los genes (GCN). Este estudio investiga la asociación de "GCN" de C4 total, C4a y C4b con SLE (Pereira KM, et al. Low C4, c 4a and C4B gene copy numbers are stronger risk factors for juvenile-onset than for adult-onset systemic lupus erythematosus. Rheumatology (Oxford). 2016 ene 22).
Bloqueo inmune de Dana Genetic - Uso en monitorización
En los estudios tempranos en los 6 pacientes tratados con anticuerpo IgG anti C1 IA/CRP de cerdo, monitorizamos el efecto del tratamiento "desbloqueante" con IgG de cerdo midiendo en suero el inactivador de C1 (C1 IA) y el componente C4 del complemento.
Entre los efectos que se han observado después de la administración del INA porcino a pacientes humanos con cáncer están:
(1) Disminución en la concentración en suero del "inactivador de C1" (C1 IA), según se mide con anti C1 IA humano de conejo.
(2) Disminución en la concentración en suero de C4.
Además, se han observado varias manifestaciones de remisiones, tales como disminución en la masa tumoral. Sin embargo, C1 IA y C4 son indicadores del curso de la enfermedad importantes y que se pueden determinar fácilmente antes, durante, y después de la administración de INA, y, adicionalmente, de cualquier tipo de terapia del cáncer, tal como se explica anteriormente. Sin embargo, una indicación de un incremento significativo de IgM después de unos pocos días después de la administración del INA porcino fue causada lo más probablemente por la inmunización del paciente frente a proteínas porcinas infundidas, haciendo imposible infundir el tratamiento con INA más de una (1) o como máximo dos (2) veces, y el tratamiento adicional con el INA porcino fue, por supuesto, imposible debido a la presencia de anticuerpos inmunes anti porcino.
Como una manifestación adicional de remisión, se observa que la baja cantidad (bajo porcentaje) de linfocitos T encontrados frecuentemente en pacientes que padecen cáncer, especialmente después de tratamiento citostático o irradiación, se elevará hasta valores normales en unas pocas semanas desde el inicio del tratamiento con INA.
La preparación de anticuerpos específicos frente a C1 IA y CRP, también abre la posibilidad de establecer un diagnóstico no ambiguo del cáncer. Este diagnóstico se basa en la seguridad de la presencia o ausencia de C1 IA y CRP en los fluidos corporales humanos, para propósitos prácticos especialmente en el suero humano, así como el ensayo del nivel de C4. La presencia o ausencia de C1 IA y CRP en una muestra se confirma sometiendo la muestra a reacción inmunológica con antiC1 IA y CRP humano en condiciones tales que el resultado de la reacción inmunológica es fácilmente distinguible de cualquier respuesta a C1 IA en la muestra. Esto significa que el antisuero INA y otros materiales que contienen anticuerpos o modificaciones o derivados de los mismos inmunológicamente activos son materiales de diagnóstico extremadamente valiosos. Las discusiones adicionales del aspecto de diagnóstico de la presente invención se proporcionan más adelante.
Anti C1 IA recombinante y anti CRP recombinante
Cuando se han producido anticuerpos monoclonales o recombinantes frente a C1 IA y/o CRP humano, dependiendo de la titulación del anti C1 IA humano y la titulación del anti CRP humano, puede consistir en una composición purificada de monoclonales, monoclonales mixtos frente a C1 IA y monoclonales mixtos frente a CRP según la invención para la terapia del cáncer humano, preferiblemente siendo una disolución de IgG que, entre otras cosas, activará el sistema del complemento cuando encuentre su diana en las células cancerosas, una cantidad de 100 -1.000 mg de IgG disuelta en aproximadamente 2 ml de disolución salina isotónica (o equivalente, p. ej., glucosa isotónica). Dicha composición podría suministrarse de forma práctica como, p. ej., un kit de anti C1 IA y anti CRP mixto en, por ejemplo, un vial de 2 ml bien liofilizado o en disolución como un inyectable bien para uso en infusión intravenosa diluida en las cantidades normales de disolución salina isotónica o equivalente. En el caso de un tumor de cerebro maligno, p. ej., astrocitoma grado II, III o glioblastoma correspondiente a grado IV, el anticuerpo puede proporcionarse intraespinalmente o intratecalmente o incluso a través de un catéter Ommaya aplicado en el tumor del cerebro. Otra composición preferida es una inmunoglobulina IgG humana liofilizada para reconstitución. Los rangos de administración preferidos son aproximadamente 2-15 mg de inmunoglobulina por kg del peso corporal del paciente por día con intervalos diarios a semanales, y posteriormente aproximadamente 2 -10 mg/kg corporal con intervalos diarios o intervalos semanales - o incluso intervalos mensuales dependiendo de la titulación monitorizada del nivel en suero del inactivador de C1 que no debería ser menor de 15 % en mg. Un nivel menor de 15 % en mg o cantidad mínima de C1 IA en el suero puede ajustarse por infusión i.v. de C1 IA para contrarrestar cualquier posibilidad de edema angioneurótico. C1 IA (y C4) puede monitorizarse frecuentemente - por ejemplo, diariamente después de la o las inyecciones de anti C1 IA y CRP recombinante.
Durante el tratamiento con antisuero o anticuerpos frente a C1 IA y CRP, el paciente se monitoriza cuidadosamente como se describe en la sección "Terapia del cáncer con suero inmune según la invención", y los parámetros medidos especialmente importantes son los niveles en suero de C1 IA y CRP y C4. Mediante el tratamiento exitoso, C1 IA y CRP se deplecionarían pero el nivel en suero de C1 IA no debería ser preferiblemente menor de 15 % en mg. El nivel de C4 en suero puede disminuirse a menos de los valores de rango inferior normal, debido al consumo del C4 en la reacción del complemento que ocurre en el paciente.
Durante el periodo en el que se administra el tratamiento con anti C1 IA anti CRP, no se prefiere el tratamiento simultáneo con citostáticos según la presente invención debido al efecto inmunosupresor de los citostáticos. Por otra parte, si se usa el tratamiento con citostáticos, el paciente debería tratarse preferiblemente con INA durante, p. ej., la última quincena del tratamiento con citostáticos y continuamente durante un periodo de 1 o 2 meses después de cesar el tratamiento con citostáticos, con el fin de normalizar el sistema inmune agotado incluyendo el restablecimiento de los valores normales de linfocitos T y linfocitos B.
Los citostáticos acoplados con antiCI IA y CRP humano como vehículos selectivos pueden demostrarse, sin embargo, útiles ya que pueden administrarse en cantidades muchos menores que los citostáticos convencionales.
Con el fin de monitorizar y ajustar el nivel de inmunoglobulinas del paciente, especialmente IgG debe evaluarse continuamente, ya que la concentración de IgG refleja tanto el contenido de IgG humana como de cerdo en el suero. El propósito de dicha monitorización y ajuste es asegurar que se administra una cantidad suficiente de antisuero INA para controlar y neutralizar el bloqueo de la defensa inmune y las proteínas de enmascaramiento, en particular C1 IA y CRP, tanto en la fase humoral como en las membranas de las células cancerosas. La cantidad necesaria de antisuero anti C1 IA y anti CRP puede depender, por lo tanto, tanto de la masa total del tumor según se mide con métodos convencionales, rayos x, escaneo CT, escaneo MR, ultrasonidos, etc. como de la actividad (capacidad de producir C1 IA y CRP) de las células cancerosas.
La experiencia de terapia temprana obtenida hasta ahora, donde solo principalmente anticuerpo anti C1 IA y anti CRP porcino en la forma de INA, realizada en los años setenta, indica que si se tiene acceso al anti C1 IA y anti CRP humano o monoclonal humanizado o recombinante se puede ser capaz de prevenir que el tumor progrese adicionalmente, o después de más de una, y pueden ser varias, dosis administradas proporcionadas durante algunas semanas a meses pueden inducir responses menores, responses parciales o incluso responses importantes del tumor. Sin embargo, si no se obtiene respuesta en un determinado periodo de tiempo, semanas a meses, puede ser necesario encontrar otros módulos de tratamiento para el paciente, tales como otros anticuerpos monoclonales conocidos y muy ensayados que los anticuerpos identificados en esta invención o puede ser necesario el tratamiento con rutina de quimioterapia.
Se ha obtenido la evidencia del hecho de que anti C1 IA y CRP en suero INA es capaz de combinarse con las células cancerosas in vivo:
Las observaciones usando anti C1 IA (y/o anti CRP) acoplado a trazadores tales como 99tecnecio proporcionado intravenosamente también pueden indicar que los anticuerpos marcados con isótopos inyectados en un paciente pueden rastrear las metástasis.
Para la preparación de un antisuero o producto de inmunoglobulina para uso diagnóstico in vivo, después del marcaje con isótopo, p. ej., con, preferiblemente, tecnecio, que tiene una vida media muy corta (4 horas), la vacuna usada es preferiblemente una que no contiene C1 IA.
Las realizaciones preferidas de un kit de diagnóstico se proporcionan más adelante en la sección "kits de diagnóstico". Los kits de diagnóstico según la invención contienen un material antiC1 IA y CRP humano, cuya reacción con C1 IA y CRP humano en métodos de ensayo inmunológicos es fácilmente distinguible de la reacción con C1 IA humano.
Fiabilidad.
Sería preferible que se ensaye la presencia tanto de C1 IA en suero como de CRP en suero, así como el nivel en suero de C4 se usan como kit de monitorización denominado kit TRIADE para el ensayo inicial de la presencia de cáncer (carcinoma) o C1 IA monitorizado 1 a 2 veces a la semana durante el tratamiento i.v. con anti C1 IA humano recombinante humano, y un seguimiento mensual de CRP y C4 en suero del paciente.
El C1 IA en suero, CRP en suero y C4 en suero pueden detectarse por el ensayo en un estadio tan temprano de un cáncer en el que no es posible confirmar o verificar el cáncer por ningún otro método conocido. Esto puede dar cuanta de los resultados del ensayo que se considerarían, a primera vista, "falsos positivos". La experiencia ha mostrado que incluso entre muestras de suero de aproximadamente 200 donantes de sangre, el 2 % de las muestras. Si C1 IA en suero, CRP en suero están elevados, pero C4 en suero está en el rango normal, se debería disminuir el porcentaje de falsos positivos del 2 % a menos del 1 %.
Más específicamente, la experiencia de las investigaciones en suero realizadas hasta ahora usando el kit de diagnóstico de inmunodifusión son las siguientes:
Se ha encontrado que los siguientes tipos de cáncer son de forma bastante consistente positivos para C1-IAC: carcinomas tales como como carcinoma mammae (carcinoma de mama), carcinoma corporis uteri (carcinoma uterino), cáncer pulmonis (carcinoma broncogénico), cáncer pancreatis (cáncer pancreático), cáncer ventriculi (cáncer de estómago), hepatoma (cáncer hepático primario), cáncer coli (cáncer colorrectal), cáncer renal (cáncer de riñón), incluyendo carcinoma pélvico (carcinoma pelvis renis), y carcinoma vesicae urinariae (carcinoma de la vejiga urinaria), sarcomas (se han investigado unos pocos osteosarcomas y se encontrado que son negativos). Los teratomas testiculares son fuertemente positivos para C1 IA y CRP-. Melanomas: se encontró que no todos los melanomas eran positivos para C1 IA y CRP.
Se encontró que unos pocos casos investigados de Hodgkins eran positivos para C1 IA y CRP.
Neoplasma en niños: se encontró que el nefroblastoma era positivo para C1 IA y CRP.
Se encontró que el neuroblastoma era positivo para C1 IA y CRP. Los tumores en el sistema nervioso central, por ejemplo, astrocitoma y glioblastoma deberían ensayarse porque se ha encontrado que los cultivos celulares de tumores de cerebro malignos son positivos para C1 IA (Osther K, H0jgaard K, Dybkj^r E, Demonstration of a complement inactivator on cultured cells from human malignant brain tumours, Acta Neurol. Scandinav. (1974, 50: 681­ 689). Enfermedades malignas en la sangre y sistema linfático: se encuentra que la leucemia mieloblástica aguda (AML) y la leucemia mieloide crónica (CML) son positivas para C1 IA y CRP, excepto durante la fase de remisión. También se encuentra que la mielomatosis es positiva para C1 IA y CRP. Se encuentra que la leucemia linfoblástica aguda (ALL) y la leucemia linfoblástica crónica son positivas para C1 IA y CRP en el 5-20 % de los casos totales verificados; se indica que la mayor parte de los casos de a Ll investigados hasta ahora eran casos en remisión, mientras que se encontró que unos pocos casos de estadios activos de ALL investigados eran significativamente positivos para C1 IA y CRP. Se encontró que un caso de leucemia de linfosarcoma aguda era negativo para C1 IA y CRP. Los linfomas no mostraron un incremento significativo de C1 IA.
Debe indicarse que una característica valiosa del ensayo de diagnóstico es que permite una monitorización con sentido del paciente durante cualquier intento de terapia. La experiencia ha mostrado que el tratamiento con citostáticos de varias enfermedades no disminuirá la titulación de C1 IA y CRP en el paciente, si los tumores no están mostrando regresión de la carga tumoral por el tratamiento.
En otras palabras, si el ensayo muestra que no hay una disminución en C1 IA y CRP en suero durante un intento de terapia, esto es una indicación de que la terapia no es efectiva. También puede decirse, sobre la base de la explicación anterior, que debe presumirse que los tipos y estadios de cáncer que son positivos para C1-IAC son aquellos que son susceptibles de una terapia exitosa con antisuero anti-C1 IA y CRP.
C1 IA en suero elevado, CRP elevada, pero C4 disminuido y trastornos autoinmunes inflamatorios y hepatitis!
Es interesante indicar que una enfermedad "autoinmune" tal como LED (lupus eritematoso diseminado), y hepatitis, tal como hepatitis B, muestra una reacción positiva para C1 IA y CRP, pero tiene un nivel de C4 de complemento en suero normal bajo a significativamente disminuido. El C4 bajo se encuentra realmente en la artritis reumatoide, artritis psoriásica, varios trastornos autoinmunes, hepatitis B, enfermedades de colágeno vascular. En investigaciones del suero de aproximadamente 200 pacientes de un departamento neurológico, con una diversidad de enfermedades que van de trombosis cerebral, infartos cerebrales, a enfermedades tales como esclerosis múltiple proporcionaron aproximadamente un 2 % de positivos, justo como el resultado encontrado en el grupo de donantes de sangre. El grupo de donantes de sangre consiste en 200 donantes de sangre, y como se ha mencionado anteriormente se encontró más del 2 % de muestras de suero positivas para C1 IA y CRP y 10 muestras de suero dudosamente positivas. Los sueros de algunos de estos donantes de sangre positivos para C1 IA y CRP se han vuelto a examinar después de algunas semanas, y en el reexamen, se encontró que algunos de los sueros previamente positivos de los donantes de sangre eran negativos para C1 IA y CRP. Se encontró que los sueros de aproximadamente 50 pacientes con diferentes tipos de enfermedades alérgicas que van de asma y eccema a erupción por urticaria (excepto del tipo de Quincke) eran negativos para C1 IA y CRP.
De 760'
Recubrimiento de C1 IA, y CRP de las células cancerosas
Antecedentes técnicos
Como se ha descrito previamente en la solicitud de patente provisional de EE. UU. 62/388.720 con fecha de prioridad 5 de febrero, 2016 (05.02.2016) y además, en la solicitud de patente provisional 62/495.203 con fecha de prioridad 7 de septiembre, 2016 (07.09.16) combinados con los datos más recientes revela una fotografía significativa del concepto de lo que pasa cuando un tratamiento desbloqueante del sistema inmune innato tiene lugar mediante la neutralización del efecto inhibidor del inhibidor de C1 (C1IA) o cualquier otro factor que pueda interferir o neutralizar el efecto inhibidor de esta proteína, por ejemplo, con aprotinina u otro u otros factores como, por ejemplo, compuestos que tendrían un efecto neuraminidasa en C1 IA por tratamiento del cáncer con anti C1 IA tal como anti inhibidor de C1 humano (anti C1IA) presente en las células cancerosas, tales como células de carcinoma, y tumores de cerebro malignos tales como células de glioma maligno en mamíferos como, por ejemplo, ratas o glioma maligno humano -también denominado glioblastoma o glioblastoma multiforme, permitiendo la activación del sistema inmune innato mediante la inducción de la cascada del complemento.
La presente descripción también describe, como parte de otra proteína enmascaradora "bloqueante", o que interfiere con el complemento y, en algunos casos, se colocaliza con el complemento, denominada proteína C reactiva (CRP) hacia la que el tratamiento de desbloqueo engloba la adición importante de la neutralización de CRP en la célula cancerosa, que, según nuestros descubrimientos, como, por ejemplo, se muestra en los ejemplos que tanto gliomas de rata, tal como glioma NS-1 de rata y glioma/glioblastoma humano. Estas células cancerosas muestran un recubrimiento significativo con CRP según se pone de manifiesto en los ejemplos presentados en la presente memoria en esta solicitud de patente provisional. El tratamiento de las células cancerosas recubiertas con CRP se hace, entre otras cosas, usando anticuerpos antihumanos frente a CRP o cualquier péptido o nanopéptido o compuestos químicos que puedan eliminar la CRP en la célula cancerosa el uso de una proteína adicional (una proteína pentamérica) denominada proteína C reactiva o CRP identificada y documentada al mostrarse un recubrimiento significativo usando métodos en sándwich con anticuerpo anti CRP también mostró recubrimiento de las mismas células cancerosas malignas que se encontró que estaban recubiertas con C1 IA tales como, p. ej., células de glioma de rata y células de glioblastoma humano.
El tratamiento consiste en quitar el recubrimiento de determinadas células cancerosas, tales como, por ejemplo, las que se han identificado por inmunotinción de proteínas tales como, por ejemplo, gliomas de rata malignos NS1 y PG2, así como inmunotinción de estas proteínas en células cancerosas tales como glioma/glioblastoma maligno humano o glioblastomas como se documenta en los ejemplos de esta invención, que indica claramente que estas proteínas pueden encontrarse recubriendo tanto las células de glioma de rata como los glioblastomas humanos, y que se ha descrito previamente que están presentes en determinadas células de carcinoma.
Descripción breve
La presente descripción se refiere a una combinación de un kit para diagnóstico y un kit para el tratamiento del cáncer humano tal como carcinomas, y tumores de cerebro, así como determinados otros cánceres sólidos malignos donde pueden encontrarse C1 IA y CRP, a procesos para su aislamiento y caracterización, a métodos de ensayo diagnóstico y a materiales basados en el principio de demostrar la presencia de CRP, a anticuerpos y antisueros con especificidad frente a C1 IA y CRP, a la preparación de dichos anticuerpos y composiciones que contienen los mismos, a anticuerpos inmovilizados en matrices, y a la terapia del cáncer humano usando, por ejemplo, antisueros o anticuerpos monoclonales y/o recombinantes con especificidad frente a C1 IA y CRP.
Los aspectos importantes de la presente invención se basan en el principio de utilizar anticuerpos dirigidos específicamente frente a proteínas de bloqueo y enmascaramiento, en particular C1 IA y CRP, asociadas con enfermedades cancerosas humanas y presentes en las membranas de las células cancerosas. Según la invención, este principio se utiliza para el tratamiento del cáncer in vivo y para el tratamiento extracorporal del suero del paciente con cáncer.
C1 IA y CRP es una proteína asociada al cáncer humano que puede aislarse de los fluidos corporales de pacientes con cáncer, incluyendo suero, y de células cancerosas malignas humanas, también de cultivos celulares. Se han realizado ciclos repetidos de cultivo y recogida de cultivos celulares y C1 IA y CRP se han aislado del medio de cultivo, indicando que las células cancerosas en sí mismas son capaces de producir C1 IA y CRP.
Se ha encontrado que C1 IA y CRP posee propiedades biológicas similares a las propiedades del inactivador del componente C1 del complemento humano (también denominado "inhibidor de C1 esterasa"), que es una alpha2 neuramino glicoproteína encontrada en los fluidos corporales de varias especies, incluyendo el hombre (Pensky et al., J.Biol.Chem., 236, 1674, 1961, Ratnoff et al., J. Exp. Med. 129. 315, Pensky et al., Science 163, 698, 1969, Nagaki et al., Int. Arch. Allergy 46, 935, 1974), pero que es una proteína no idéntica químicamente al inactivador del componente C1 del complemento humano.
En lo que sigue, el inactivador del componente C1 del complemento humano (inhibidor de C1 esterasa) se denominará "C1 IA", mientras el término "inactivador de C1", usado en varios contextos, designará al grupo que consiste en C1 IA y CRP.
Se ha encontrado que C1 IA y CRP posee propiedades biológicas similares a las propiedades C1 IA, incluyendo el efecto inhibidor en la activación inicial por el componente C1 del complemento humano de C4 y C2 (es decir, inhibición del efecto hidrolizante de la C1 esterasa), la inactivación de plasmina, y la ausencia de efecto sobre el tiempo de coagulación del plasma (es decir, esta ausencia es común a C1 IA y que no puede excluirse, también puede ser común a CRP). Según el principio sobre el que se basa la presente invención, se cree que estos efectos inhibidores de C1 IA y CRP juegan un papel importante en la defensa de las células cancerosas frente a la destrucción por el sistema inmune humano.
En la bibliografía, se ha descrito que una proteína semejante a C1 IA está presente en las membranas de las células cancerosas humanas (p. ej., Osther, K., Hojgaard, K., y Dybkjaer E., Acta neurol. Scand, 197450, 681, Osther, K., the Lancet, mar. 2, 1974, p. 359, Osther, K., Linnemann, R., Acta path, microbiol. scand. 1973, 81, p. 365).
Según la presente descripción, dicho C1 IA presente en el cáncer humano y, como se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que es un nuevo C1 IA denominado C1 IA y CRP. Los nuevos desarrollos importantes están basados en estos descubrimientos.
Tratamiento anti C1 IA y anti CRP de determinados tipos de cáncer
Para el tratamiento de las células cancerosas en mamíferos (incluyendo seres humanos), la preparación por ingeniería de biomacromoléculas para investigación y para uso terapéutico es una de las partes integrales de la presente innovación. La producción de anticuerpos humanos o humanizados usando la tecnología de exposición en fagos y un amplio rango de servicios de ingeniería génica, maduración por afinidad y humanización de anticuerpos puede ser proporcionada por Creative Biolabs, (Creative Biolabs., EE. UU., 45-1 Ramsey Road, Shirley, NY 11967; Europa, Ringstrasse 4, 64401 Gross-Bieberau, Alemania). Esta empresa está muy reconocida en la fabricación de scFv/Fab y anticuerpos IgG de tamaño completo. Además, la misma empresa también proporciona servicios de OEM para la fabricación de anticuerpos a escala a granel, incluyendo producción bacteriana de scFv, diacuerpo, scFv en tándem, minianticuerpo y Fab, y expresión en células de mamíferos de minicuerpo, IgG quimérica e IgG, que también están disponibles en la industria de producción de anticuerpos, que incluye la producción de anticuerpos monoclonales de ratón y rata usando la tecnología del hibridoma.
La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: preparación de C1 IA y CRP.
Obtención de células cancerosas humanas para cultivo.
Las células cancerosas humanas pueden obtenerse de fluido pleural o ascítico de pacientes que padecen cáncer con metástasis en pleura y/o ascitis. El fluido pleural/ascítico debería manejarse en condiciones estériles, y los fluidos pleural/ascíticos infecciosos deberían excluirse. La separación de las células del fluido puede obtenerse por centrifugaciones a 1.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. El precipitado contiene las células. El sobrenadante se decanta y se almacena a -20 °C para el aislamiento posterior de proteínas valiosas inmunogénicamente de ellos como se describe en secciones posteriores.
Otra fuente son tumores humanos sólidos retirados de pacientes con cáncer por operación, por ejemplo, tumores de cerebro malignos de pacientes que padecen tumores de cerebro malignos primarios. Las células cancerosas pueden obtenerse de dichos tumores por tripsinización. Por ejemplo, las muestras de cerebro se lavan varias veces en medio mínimo esencial de Eagle (MEM) después de lo cual el tejido se corta en cubos de 1-2 mm y se resuspende en el medio después de lavados y centrifugaciones adicionales, p. ej., durante 10 minutos a 900 rpm, puede añadirse disolución de tripsina, después de lo cual se lleva a cabo una incubación durante, p. ej., 30 minutos a 25 °C, y la suspensión celular puede filtrarse a través de una gasa estéril mezclada con un mínimo de MEM de Eagle con suero bovino al 15 % añadido, y centrifugarse como se ha mencionado anteriormente. El precipitado contiene las células, y el sobrenadante se decanta.
Cada uno de los precipitados anteriores puede usarse individualmente en el siguiente procedimiento, o los precipitados pueden combinarse. Además, las células cancerosas humanas obtenidas de otras fuentes pueden tratarse análogamente y usarse p e r se o combinarse con células cancerosas obtenidas como se ha descrito anteriormente.
Cultivo de las células cancerosas.
Las células cancerosas obtenidas como se ha descrito anteriormente se explantan en matraces Roux de 1.000 ml que contienen MEM de Eagle enriquecido con glutamina añadida (aproximadamente 294 mg por litro) y que contienen suero fetal de ternera inactivado al 15 % y se incuban en incubador sin adición de CO2. Para los cultivos de ensayo paralelos, se explantan aproximadamente 0,5 ml de la suspensión celular directamente en portas en un tubo Leighton con el fin de examinar la presencia de C1 IA y CRP en la membrana celular por citofotometría de inmunofluorescencia (Osther et al., Acta. path. microbiol. scand.B 81, 365, 1973).
Cuando los cultivos de ensayo muestran la presencia de C1 IA y CRP, el cultivo principal se usa como el cultivo de producción: el medio se retira, la estructura celular se lava con tampón PBS, pH 7,3, y se introduce medio de aminoácidos sintéticos RPMI de Flow, Escocia, enriquecido con glutamina (aproximadamente 294 mg/litro) pero sin ninguna otra mezcla, y la incubación se realiza durante 3 días a 37 grados C, después de lo cual el medio se recoge en condiciones estériles y se centrifuga a 1.000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual el sobrenadante se almacena en botellas cerradas a -20 °C hasta que se lleva a cabo el aislamiento de C1 IA y CRP. El cultivo de las células cancerosas se cultiva adicionalmente en el medio MEM de Eagle modificado mencionado anteriormente, y después de 3 días de incubación, el medio se cambia de nuevo por medio RPMI enriquecido con glutamina, que se recoge de nuevo después de 3 días de incubación y se trata y congela como se ha descrito anteriormente para el aislamiento posterior. De esta manera, el cultivo alternado en medio MEM de Eagle modificado y medio RPMI enriquecido con glutamina y la recogida del último se lleva a cabo siempre que el cultivo de las células cancerosas sea productivo. En el caso de un crecimiento especialmente bueno (mucho más de aproximadamente 2 veces 105 células por matraz Roux), se realiza el explante a matraces de cultivo Roux adicionales, y los nuevos cultivos celulares resultantes también se usan para la producción de la misma manera a la que se ha descrito anteriormente. A lo largo del procedimiento, la productividad de C1 IA y CRP de las células en cultivo se monitoriza mediante los cultivos de ensayo en los tubos Leighton, y al medio de cultivo, se añaden penicilina y estreptomicina en concentraciones apropiadas antes del uso.
Aislamiento de C1 IA y CRP.
El medio RPMI enriquecido con glutamina recogido de los cultivos de células cancerosas como se ha descrito anteriormente se separa por adición de sal para precipitar las proteínas contaminantes, adecuadamente hasta un 40 % de saturación con (NH4)2SO4 saturado a 0 °C con agitación. El medio así tratado se centrifuga a 4.000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. También pueden usarse otros procedimientos de centrifugación, pero se ha encontrado que el indicado proporciona resultados excelentes. El precipitado se desecha, y el sobrenadante se dializa durante aproximadamente 48 horas a 4 °C frente a numerosos cambios de agua destilada y posteriormente se centrifuga a 3.500 rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. También son adecuados otros procedimientos de centrifugación, p. ej., usando una centrífuga enfriada. Se obtiene una purificación especialmente buena en una ultracentrífuga preparativa enfriada.
Purificación por métodos de cromatografía
En el procesamiento adicional de C1 IA y CRP del sobrenadante claro, la cromatografía de absorción en columna es la primera etapa. Una resina de intercambio aniónica preferida para este propósito es Dowex 2 x 8, mesh 200-400, pero también pueden usarse otros materiales de intercambio iónico. La resina de intercambio iónico se pretrata hirviendo en un baño de agua durante 2 horas, cambio de 5 x 2 horas con HCI 0,1 M y posteriormente equilibrado por numerosos cambios con agitación con tampón Tris 0,06 M, pH 7,3 hasta que el pH se estabiliza en aproximadamente 7,3. También se han usado otros tampones Tris y tampones fosfato de diferente pH y fuerza iónica, pero se ha encontrado que el tampón mencionado anteriormente es óptimo.
El sobrenadante claro mencionado anteriormente se aplica en la columna de resina de intercambio aniónico Dowex 2 x 8 (K 50/100 con adaptadores con un flujo del tampón Tris mencionado anteriormente, pH 7,3, siendo la tasa de flujo 100 ml por hora a temperatura ambiente. El mejor rendimiento de C1 IA y CRP se obtiene usando 160 ml de medio RPMI por 1.500 ml de material de columna. El efluente de la columna pasa a través de una micro cubeta de flujo continuo de un espectrofotómetro que registra gráficamente la densidad óptica a 580 nm del efluente (se usó un espectrofotómetro Isco) y se recoge en fracciones de 10 ml en un colector de fracciones. En este y en los siguientes fraccionamientos, las proteínas eluidas detectadas como picos de densidad óptica en el espectrofotómetro se comprueban para C1 IA y CRP por inmunoelectroforesis en cohete usando anti C1 IA humano de conejo, anti C1 IA humano de cerdo y anti CRP humana (absorbido) C1 IA y CRP (preparados como se describe adicionalmente más adelante) en el gel y para proteínas contaminantes por inmunoelectroforesis cruzada de Freeman usando suero de proteínas completas antihumano en el gel e inmunoelectroforesis Grabar usando los dos tipos de antisueros mencionados anteriormente. La traza contaminante de otras proteínas se comprueba adecuadamente tal como para detectar la presencia de orosomucoide, transferrina, alfa2 glicoproteína HS, inhibidor de inter-alfa-tripsina, prealbúmina, y albúmina.
La parte principal de C1 IA y CRP se absorbe en el intercambiador iónico. Mediante el paso repetido a través del intercambiador iónico en tampón Tris, el resto puede absorberse.
La mayor parte de las proteínas contaminantes aparece en un primer pico de elución importante en la elución con tampón Tris. Un gráfico espectrofotométrico típico de esta elución se muestra en la figura 5. Después de un número adecuado de fracciones después de la aparición del pico, se añade a la columna una concentración ascendente lineal de NaCl hasta un punto final de NaCl 0,09 M. El número "adecuado" de fracciones mencionado anteriormente es un número de fracciones que asegurará la separación apropiada del primer pico y la proteína eluida posteriormente. También pueden usarse otros modelos de concentración de sal adicional, incluyendo el incremento por etapas, pero sin ventaja adicional.
C1 IA y CRP se libera del intercambiador iónico en el punto final de aproximadamente NaCl 0,09 M (como se muestra por un pico menor en el gráfico espectrofotométrico, véase la figura 5), y las fracciones que contienen C1 IA y CRP se combinan y dializan durante aproximadamente 24 horas a 4 °C frente a agua destilada. Posteriormente, el producto dializado se liofiliza (se encontró que la liofilización con cubierta usando vacío y calentamiento externo suave a 40 °C es un procedimiento adecuado).
El liofilizado se resuspende en tampón Tris 0,06 M, pH 8,6, y se aplica en una columna de dextrano de filtración en gel Sephadex® G75 Superfine tal como una columna Pharmacia K 15/50, usando el tampón Tris, pH 8,6, como tampón efluente. La tasa de flujo es adecuadamente aproximadamente 10 ml por hora. El efluente se monitorizó con el espectrofotómetro y se examinó por técnicas de inmunoelectroforesis como se ha descrito anteriormente. Un registro espectrofotométrico típico de la densidad óptica del efluente se muestra en la Figura 6, en la que el primer pico representa C1 IA y CRP. Las fracciones ricas en C1 IA y CRP se recogen, se dializan exhaustivamente frente a agua destilada (48 horas) y se liofilizan como se ha descrito anteriormente. En lo que sigue, este producto se designa "C1 IA y CRP (Sephadex®G75 Superf.)" o "C1 IA y CRP semipurificado". Según la estimación inmunoelectroforética, este producto es puro y no está agregado.
En un procedimiento de purificación alternativo, el liofilizado mencionado anteriormente de las fracciones que contienen C1 IA y CRP dializadas del intercambiador iónico Dowex 2 x 8 se resuspende en tampón Tris 0,06 M, pH 8,6, y se aplica en una columna de intercambiador aniónico de celulosa Whatman DE-52 (p. ej., K 25/60) con adaptadores. El intercambiador aniónico se eluye con un gradiente ascendente lineal de cloruro de sodio de NaCl 0 a 0,15 M. Los pasos repetidos a través del intercambiador iónico Whatman se llevaron a cabo hasta que se obtuvo una purificación óptima, según se confirma por los métodos anteriores. El C1 IA y CRP purificado de esta manera se agrega en algún grado, según se confirma por inmunoelectroforesis, véase la Figura 7.
Para uso como un agente inmunogénico en una vacuna que sea adecuada para la primera vacunación de animales huésped adecuados, las fracciones ricas en C1 IA y CRP del intercambiador iónico Whatman se combinaron con las fracciones de la columna Sephadex® G75 Superfine, y las fracciones combinadas se dializaron y posteriormente se liofilizaron como se ha descrito anteriormente. En lo que sigue, este producto combinado se designa "proteína C1 IA y CRP subagregada C1 IA y CRP Sephadex® G75 Superf.". Este producto está listo para resuspenderlo para una mezcla posible con otras proteínas como se describe más adelante y/o mezcla con C1 IA solo para proporcionar un antisuero específico con una función óptima.
Ejemplo 2: caracterización de C1 IA y CRP.
Antisueros
Anti C1 IA humano de conejo (contenido de anticuerpo 0,7 mg/ml), anti C4 humano de conejo (contenido de anticuerpo 1,0 mg/ml), anti C3 humano de conejo (contenido de anticuerpo 1,2 mg/ml), anti activador de C3 humano de conejo (contenido de anticuerpo 0,5 mg/ml), anti alfa2 glicoproteína HS humana de conejo (contenido de anticuerpo
0,35 mg/ml), anti inhibidor de inter-alfa-tripsina humano de conejo (contenido de anticuerpo 1,0 mg/ml), anti orosomucoide humano de conejo (contenido de anticuerpo 0,9 mg/ml), anti transferrina humana de conejo (contenido de anticuerpo 2,5 mg/ml), anti albúmina humana de conejo (contenido de anticuerpo 1,1 mg/ml), anti prealbúmina humana de conejo (contenido de anticuerpo 0,25 mg/ml), anti fetoproteína alfa1 humana de conejo (0,2 mg/ml), anti plasminógeno humano de conejo (contenido de anticuerpo 0,25 mg/ml) fueron de Behringwerke. Anti IgG humana de conejo (contenido de anticuerpo 0,4 mg/ml), anti IgM humana de conejo (contenido de anticuerpo 0,4 mg/ml), y anti suero completo humano de conejo fueron de Dakopatts.
Procedimientos experimentales
Inmunoelectroforesis
La electroforesis cuantitativa en agarosa al 1 % que contiene anticuerpo (1,5 mm de grosor) se operó con 2,5 V/cm durante 18-20 horas a 20 °C (Laurell C. B., Quantitative Estimation of Proteins by Electrophoresis in Agarose Gel Containing Antibodies. Ann. Biochem. 15:45-52, 1966). La inmunoelectroforesis cualitativa se operó según el método de Grabar y Scheidegger. La electroforesis cruzada antígeno-anticuerpo se operó según Freeman (Clarke, H. C. y Freeman, T. A Quantitative Immunoelectrophoresis Method (Laurell Electrophoresis) p. 503-509 en Protides of the Biological Fluids. Vol. 14 Elsevier, Amsterdam, 1966., Laurell, C. B. Antigen-antibody Crossed Electrophoresis. Ann. Biochem. 10: 358-361, 1965). Separación inicial por electroforesis en agarosa con 10 V/cm durante 1,5 horas a
20 °C. Después de girar el campo eléctrico 90°C la electroforesis se operó en gel de agarosa que contenía anticuerpo con 2,5 V/cm durante 18 a 20 horas a 20 °C.
Inmunodifusión
Se operó en agarosa al 1 % según la técnica de difusión en gel de Ouchterlony (Ouchterlony, O. Progr. Allergy, 6: 30, 1962). La difusión se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 3 días.
Inmunoelectroforesis cruzada en tándem
Se operó según Kroll (Kroll, J. Tandem-crossed Immunoelectrophoresis, en A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Eds. Axelsen, NH, Kroll, J., Weeke, B.) Universitetsforlaget, Oslo, 1973, p. 57-59). El principio es una electroforesis inicial de dos muestras de antígeno en la misma operación de separación en gel de agarosa con 10 V/cm durante 1,5 horas. Después de girar el campo eléctrico 90 grados, la electroforesis se opera en gel que contiene anticuerpo con 2,5 V/cm durante 18-20 horas a 20 °C.
Propiedades inmunológicas de C1 IA y CRP
Inmunoelectroforesis de Grabar-Scheidegger.
En la inmunoelectroforesis de Grabar-Scheidegger frente a anti C1 IA humano de conejo, se produce un precipitado en forma de ala de gaviota a partir de C1 IA, mientras que C1 IA y CRP no muestran precipitación en forma de ala de gaviota, (véase la figura 9 de US 4.132.769). (El " ala de gaviota" lo describe Hirschfeld (1960)). El precipitado de C1 IA y CRP se extiende en la zona beta en una inmunoelectroforesis de Grabar cuando la inmunoelectroforesis se opera en la presencia de lactato de calcio, véase la Figura 10 de US 4.132.769.
Inmunoelectroforesis en cohete de Laurell.
En la inmunoelectroforesis en cohete de Laurell frente a anti C1 IA humano de conejo, se encuentra una ligera diferencia entre C1 IA y C1 IA y CRP en la configuración de lo cohetes, que son de alguna forma más romos para C1 IA y CRP que para C1 IA, aproximadamente como se observa en la Figura 7.
Inmunoelectroforesis cruzada en tándem según Kroll.
Usando anti C1 IA humano de conejo, se encontró una identidad completa entre C1 IA y C1 IA y CRP en la inmunoelectroforesis cruzada en tándem; véase la Figura 14 de US 4.132.769.
Inmunoelectroforesis cruzada de Freeman.
Usando anti suero de proteínas totales humano de conejo, el C1 IA purificado y C1 IA y CRP purificado proporcionan precipitados idénticos en la inmunoelectroforesis cruzada de Freeman (véanse las Figuras 11, 12 y 14 de US 4.132.769) .
En la inmunoelectroforesis de Grabar-Scheidegger frente a anti C1 IA humano de conejo (véase la Figura 10 de US 4.132.769) se mostró que C1 IA y CRP tratado con neuraminidasa como se ha descrito anteriormente no proporciona ningún precipitado.
Inmunodifusión de Ouchterlony frente a antisuero oligoespecífico.
En la inmunodifusión de Ouchterlony frente a antisuero producido en cerdos de "Landrace Danés", animales huésped que se han vacunado con vacunas que contienen C1 IA y CRP, p. ej., la vacuna tipo 1 o 2 descrita en la sección "Vacunación de animales huésped ", o frente a antisuero de cualquier otro animal que sea capaz de distinguir entre C1 IA y CRP de C1 IA y que se ha vacunado con vacunas que contienen C1 IA y CRP y C1 IA en cantidades inmunogénicas efectivas, C1 IA y CRP proporciona un precipitado distinguible de la precipitación de C1 IA. Por ejemplo, el suero de pacientes con cáncer proporcionará dos precipitados distinguibles entre sí, mientras el suero de donantes sanos (o pacientes con enfermedades no malignas) solo proporcionará un precipitado, siendo este el precipitado de C1 IA. Uno de los precipitados del suero de los pacientes con cáncer se corresponderá con el precipitado de C1 IA del suero de los pacientes con cáncer. Una inmunodifusión de este tipo se muestra en la Figura 3. En los dos agujeros centrales, se aplicó antisuero oligoespecífico, y en los agujeros circunferenciales, se aplicó suero de donantes sanos ("DONANTE) y varios pacientes. El suero de cada muestra se aplicó en cada uno de los dos agujeros opuestos. En el presente caso, el antisuero usado fue el obtenido de un cerdo vacunado con una vacuna de tipo 1 (véase la sección "Vacunación de animales huésped").
A partir de la Figura 3, se observará que se formó un fuerte precipitado interior que fue idéntico para donante y para todos los pacientes. Este es el precipitado de C1 IA. Sin embargo, el suero del paciente 3 (cáncer verificado) proporcionó un precipitado adicional fácilmente distinguible del precipitado de C1 IA. Este es el precipitado de C1 IA y CRP. También, todas las muestras de suero proporcionaron un precipitado exterior débil común, siendo este el precipitado de orosomucoide.
Es evidente que el precipitado formado por C1 IA y CRP es fácilmente distinguible del precipitado de C1 IA. Aunque la inmunodifusión mostrada en la FIG. 3 fueron realmente experimentos hechos para propósitos de diagnóstico, se han demostrado, por supuesto, patrones de precipitación análogos con mezclas de C1 IA y C1 IA y CRP puro, y se entenderá que la técnica Ouchterlony es solo un ejemplo de los métodos de identificación o ensayo inmunológicos (Laurell, Mancini, etc. etc.) que proporcionan una distinción entre C1 IA y C1 IA y CRP cuando se usa un antisuero oligoespecífico.
Otras propiedades de C1 IA y CRP.
Estimación del peso molecular de C1 IA y CRP por la técnica de filtración en gel.
Una columna Sephadex® G200 de filtración en gel (Pharmacia K 25/50) se equilibró con tampón Tris, pH 8,6. Una disolución de C1 IA y CRP Sephadex® G75 Superf., albúmina humana purificada (cromatografiada y evaluada para pureza por inmunoelectroforesis), hemoglobina (preparada por hemolisis de eritrocitos y purificada, evaluada para pureza), e IgG purificada (peso molecular 130.000-150.000) se aplicó en la columna, y el efluente se monitorizó espectrofotométricamente, siendo confirmada la identidad de los picos por Inmunoelectroforesis. El primer pico consistió en IgG, y antes de que hubiera descendido totalmente, empezó a aparecer el segundo pico (C1 IA y c Rp ). Cuando el pico de C1 IA y CRP había pasado, se observaron varias fracciones sustancialmente vacías, después de lo cual apareció el siguiente pico que era la albúmina. Casi inmediatamente después del pico de albúmina, apareció el pico de hemoglobina.
Sobre la base del gráfico espectrofotométrico, es evidente que el peso molecular de C1 IA y CRP debe ser mayor que el peso molecular de la albúmina que es 60.000, y justo por debajo el peso molecular de la IgG. Como el peso molecular de IgG no puede indicarse más exactamente que 130.000-150.000, una incertidumbre similar se aplica a la estimación del peso molecular de C1 IA y CRP que basado en la posición del pico de C1 IA y CRP, es 110.000-130.000.
Ejemplo 3: Demostración de la asociación con el cáncer de C1 IA y CRP.
Los exsudados pleurales o ascíticos de pacientes que padecen carcinomas muy avanzados se usaron como fuentes para el cultivo de células de carcinoma. Los fluidos contaminados se excluyeron. Los cultivos celulares crecidos en matraces Roux y en matraces Falcon de plástico se distribuyeron para el crecimiento clonal o crecimiento más difuso. La morfología de los clones mostró polimorfismo celular y nuclear, un nucleolo grande o varios, más células tenían varios núcleos. Se observaron muchas mitosis. De estas mitosis, varias fueron atípicas. La unión de las células a plástico y vidrio fue suficiente.
27 de los 37 cultivos de carcinoma humano se subcultivaron de 1 a 4 veces. Una media de 1,8 subcultivos de 27 cultivos. Las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con esto y se usaron para la producción de C1 IA y CRP durante un periodo que varió de 2 a 5 meses. 10 cultivos de células de carcinoma no se subcultivaron, y por consiguiente se usaron para la producción de C1 IA y CRP durante aproximadamente 2 meses.
El C1 IA y CRP sin células se recogió aproximadamente una vez a la semana, liberado alternativamente en el medio MEM que contenía suero de ternera fetal inactivado al 15 % y en medio de aminoácidos RPMI. Por consiguiente, fue posible recoger 4 veces al mes del mismo cultivo celular. En total, se realizaron 235 aislamientos de C1 IA y CRP. De estos aislamientos, 37 se realizaron directamente de los fluidos pleurales y ascíticos sin células.
Se realizaron 101 aislamientos de medio MEM que contenía suero de ternera fetal inactivado al 15 % y 97 aislamientos se realizaron de medio RPMI. En cada cultivo de células de carcinoma, C1 IA y CRP se aisló con una variación de 2 a 14 veces. Una media de 5,4 aislamientos por cultivo celular. Durante el periodo de crecimiento en medio RPMI, el crecimiento celular se disminuyó, mientras que durante el periodo en medio MEM que contenía suero de ternera fetal inactivado, las células recuperaron su ciclo de crecimiento normal in vitro. En varios cultivos celulares, fue necesario dejar que el cultivo celular se desarrollara más suficientemente antes de cambiar a medio RPMI de nuevo. La cantidad de células en un cultivo se mantuvo de forma óptima a aproximadamente 2 x 105 células por matraz Roux. Los cultivos celulares se evaluaron constantemente para determinar el desarrollo de los tipos celulares individuales. Los tipos celulares de pleura y ascitis consistieron en células de carcinoma, fibroblastos y células mesoteliales. En los matraces con crecimiento clonal de las células de carcinoma no fue difícil establecer la cantidad aproximada de estas células. Pero, en los cultivos celulares creciendo bastante difusamente, fue más difícil establecer la cantidad aproximada de células de carcinoma. La cantidad de células productoras de C1 IA y CRP estaba relacionada con la cantidad de células recubiertas con C1 IA y CRP, como se encuentra por citofotometría, de líneas de cultivo celular iguales.
Se usó un total de 37 pacientes como donantes. La edad de los pacientes varió de 33 a 80 años. El grupo de pacientes consistió en 34 mujeres y 3 hombres. Los 37 pacientes estaban yendo al hospital para la retirada de fluidos pleurales y ascíticos. Todos los pacientes tenían carcinomas muy avanzados de origen variado. Todos los pacientes habían sido tratados previamente durante su enfermedad con radiación de 1 a 3 series. Todos los pacientes habían sido tratados con citostáticos y cortisona o prednisona. 25 de los pacientes se trataron durante el periodo de donación con cortisona o prednisona.
De las líneas celulares de carcinoma primario, un promedio del 51,3 % de las células mostró inmunofluorescencia específica con anti C1 IA-FITC según se mide por citofotometría. Las distribuciones promedio de las mediciones de inmunofluorescencia de cultivos de células de carcinoma se demuestra en la Figura 3. Los valores con puntuación menor de 40 w.u. se definen como señales no específicas.
Un promedio del 58,4 % de las células de las líneas celulares subcultivadas mostró una inmunofluorescencia específica. Cuando se comparan las células de carcinoma cultivadas primarias con las líneas celulares subcultivadas correspondientes, la cantidad de células que presenta recubrimiento con C1 IA y CRP varía significativamente.
En algunas de las líneas celulares subcultivadas, la cantidad de células recubiertas con C1 IA y CRP es mayor, cuando se compara con su cultivo de origen.
La inmunofluorescencia específica control como se realiza con presaturación del cultivo celular con anti C1 IA no marcado, seguido de incubación con anti C1 IA-FITC y anti C1 IA-FITC neutralizado (con C1 IA purificado), no mostró valores que superaran la línea límite y así, no se encontró una sola célula que mostrara inmunofluorescencia específica. Los cultivos celulares control (células no malignas) medidos por citofotometría no mostraron ningún recubrimiento con inactivador de C1. Los valores medidos de las células puntuadas estuvieron todos por debajo de
40 w.u. Los valores de los cultivos celulares control se distribuyen más o menos como los valores para el control de la especificidad de inmunofluorescencia. Los cultivos celulares control mostraron una fiabilidad para al menos el 63 % y los cultivos de células malignas una fiabilidad para al menos el 90 %. La diferencia significativa es menor de 0,002 (ensayo exacto de Fischer).
Los medios MEM control que contenían suero de ternera fetal inactivado al 15 % y medio RPMI control (no usado para el cultivo celular) se sometieron a inmunoelectroforesis antes y después de una elución en Dowex. Los medios investigados no revelaron ninguna línea de precipitación frente a antisuero anti C1 IA humano de conejo. Las únicas líneas de precipitación detectadas se encontraron frente a anti albúmina humana de conejo. Estos experimentos control proporcionaron de acuerdo con esto evidencia del hecho de que los medios usados para el cultivo celular no contenían ninguna proteína que reaccionara con anti C1 IA antes de usarse para el cultivo celular.
Los medios MEM y medios RPMI recogidos de líneas celulares no malignas, sometidos a Inmunoelectroforesis no revelaron ninguna línea de precipitación frente a antisuero anti C1 IA humano de conejo. Usando la inmunodifusión de Ouchterlony, no se detectaron líneas de precipitación frente a antisuero anti C1 IA humano de conejo.
De acuerdo con esto, no se liberó C1 IA detectable de los cultivos de células no malignas control en los medios, cuando se usaron para la detección métodos inmunoelectroforéticos y de inmunodifusión.
Ejemplo 4: Purificación de C1 IA y CRP/C1 IA de fluido pleural/ascítico de pacientes con cáncer.
El fluido pleural/ascítico de pacientes que padecen cáncer con metástasis en la pleura y/o ascitis se centrifuga como se ha descrito en la sección anterior "Preparación de C1 IA y CRP", y el precipitado se explanta en cultivos de células cancerosas como se ha descrito anteriormente. El sobrenadante, posiblemente después de almacenamiento a -20 °C (véase anteriormente), se deja que se coagule espontáneamente durante 2 horas a temperatura ambiente, y posteriormente se deja permanecer toda la noche en nevera para la coagulación espontánea completa. El sobrenadante se centrifuga de nuevo para eliminar la fibrina y se congela a -20 °C hasta que tiene lugar la purificación adicional.
Se mezclan 2 ml del fluido pleural/ascítico así tratado con 2,5 g de intercambiador aniónico DEAE Sephadex ® A50 que se había precalentado hasta 100 grados C durante 30 minutos y posteriormente se enfrió hasta temperatura ambiente. La mezcla se agita a 8 °C durante una hora. Posteriormente, la mezcla se pone en una columna y se lava 5 veces con 40 ml de NaCl 0,15 M con succión desde la parte inferior de la columna. El material de la proteína C1 IA y CRP/C1 IA se absorbe en el intercambiador iónico. El material de intercambiador iónico en la columna se lava con 200 ml de NaCl, 2 M, y citrato de trisodio, 0,01 M, pH 7,0.
El último eluato que contenía C1 IA y CRP/C1 IA se mezcló con (NH4)2SO4 saturado (pH ajustado a 7,0 con NaOH) hasta el 50 % de saturación a 8 °C en el curso de una hora. Posteriormente, se realzó una centrifugación (10 minutos a 3.000 rpm a temperatura ambiente), y al sobrenadante se añadió (NH4)2SO4 (como anteriormente, pH 7,0) hasta el 65 % de saturación a 8 grados C en el curso de una hora. De nuevo, se realizó una centrifugación (10 minutos a
3.000 rpm a temperatura ambiente), y el precipitado que contenía C1 IA y CRP/C1 IA se dializó toda la noche frente a agua destilada a 4-6 °C y posteriormente se volvió a disolver en NaCl 0,15 M.
La disolución se liofilizó, bien por liofilización con cubierta o por liofilización en vacío con calentamiento externo como se ha descrito en la sección denominada "Preparación de C1 IA y CRP".
Estabilización incrementada de los anticuerpos monoclonales y de los anticuerpos recombinantes frente a proteínas descritas en la presente memoria y en proteínas recombinantes preparadas para otros propósitos.
Para el propósito de estabilizar anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes frente al inactivador de C1, proteína C reactiva (CRP), y C4, se puede añadir una determinada cantidad de tipos no reductores de componentes de azúcar tales como disacáridos no reductores, que podrían ser cualquier disacárido no reductor tal como, p. ej., trehalosa, o disacáridos que consisten en combinaciones azúcar-alcohol tales como, p. ej., isomalta. Además, pueden usarse moléculas mayores tales como Dextrano, porque también es una combinación de azúcares no reductores.
Anticuerpos monoclonales tales como anti C1 IA, anti CRP, y anti C4 monoclonales como IgM
Una alternativa al uso de anticuerpos monoclonales del tipo IgG (p. ej., IgG1, IgG3), es en esta invención el uso de anticuerpos monoclonales anti IgM frente a C1 IA, frente a CRP y frente a C4. También pueden ser mixtos tales como, por ejemplo, mezclando IgM anti C1 IA e IgM anti CRP, y posiblemente IgM anti C4.
Cualquiera de estas combinaciones de IgM podría usarse en métodos de ensayo de aglutinación, por ejemplo, como marcados o etiquetados con, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) u otro método de marcaje. Cuando se usa el sistema que se usa para el tipado de la sangre tal como ELDON CARD (Eldon Biologicals A/S, Sandtoften 10, DK-2820 Gentofte, Dinamarca), es posible en esta invención recubrir la tarjeta "Eldon" entre otras cosas con anticuerpos policlonales o monoclonales IgM anti C1 IA, y/o IgM anti CRP, y/o IgM anti C4. Estos anticuerpos monoclonales de tipo IgM debido a su múltiple unión a antígenos, serán capaces de bridging más de un antígeno together, y de esta manera lo más probablemente ser identificables en la tarjeta Eldon (y, si es necesario, usando la fuente de luz de excitación de FITC), para observar la aglutinación en la sangre completa o en suero, y de esta manera encontrar una línea límite de aglutinación visible donde puede evaluarse una línea límite preestablecida (por validación) entre la aglutinación significativa y la aglutinación no significativa, puede ser incluso con el uso del microscopio o semejantes para observar aglutinaciones pequeñas, como, por ejemplo, usando luz de excitación de FITC. Puede anticiparse que las muestras de sangre de pacientes, que sospecha que tienen un cáncer maligno, o incluso puede ser más fácil de identificar, por ejemplo, respecto a determinadas leucemias, donde las células ya pueden estar recubiertas con C1 IA, etc. de manera que la aglutinación sería fácilmente visible.
Inmunógeno usado para la producción de anticuerpos.
Tipo 1:
Se proporciona proteína C1 IA y CRP subagregada C1 IA y CRP Sephadex ® G75 Superf. como una vacunación inicial en una cantidad total de 20 mg, disuelto en 1 ml de NaCl 0,15 M, preparado en una emulsión de agua en aceite con un volumen igual de adyuvante completo de Freund.
Como dosis de refuerzo, se mezclan 20 mg de proteína C1 IA y CRP subagregada C1 IA y CRP Sephadex® G75 Superfine con 20 mg de C1 IA y CRP/C1 IA DEAE Sephadex® A50 20 mg de C1 IA y CRP/C1 IA, HS alfa2, Zn alfa2, orosom. La mezcla se resuspende en 1 ml de NaCl 0,15 M y se prepara en una emulsión de agua en aceite con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Este refuerzo es adecuado como primera y segunda dosis de refuerzo para cerdos.
Tipo 2:
Se proporciona proteína C1 IA y CRP (retirado por Kurt Osther, 3.2.2017 C1 IA y CRP Sephadex® G75 Superf. como una vacunación inicial a animales de producción de ratones usados para uso en la preparación para fusión con células plasmáticas para la producción de antisuero monoclonal para diagnóstico y para anti C1 IA recombinante y anti proteína C reactiva recombinante (anti CRP rec.) para propósitos terapéuticos.
Tratamiento futuro con anti C1 IA y CRP
Solo se usarán anticuerpos monoclonales humanizados frente a C1 IA, frente a CRP y monoclonales frente al componente C4 del complemento.
Para el tratamiento de pacientes con cáncer con anti C1 IA y anti CRP: solo se usarán anticuerpos monoclonales humanos mixtos o humanizados y preferiblemente anti C1 IA humano y/o CRP humano recombinante.
Ejemplo 5: terapia del cáncer con suero inmune.
En lo que sigue, se revisan tres intentos preliminares de utilizar sueros desbloqueantes en el tratamiento a corto plazo de cáncer humano. Además del tratamiento reportado más adelante, también han sido tratados otros pacientes con cáncer y se ha confirmado la remisión, es decir, una disminución en la masa tumoral. Sin embargo, los tratamientos reportados aquí fueron los primeros en los que fue posible una memoria descriptiva más completa del efecto del tratamiento.
Sueros inmunes desbloqueantes usados para los pacientes tratados con cerdos.
Se produjeron sueros desbloqueantes INA (antisuero neutralizante inmune) en cerdos como se ha descrito anteriormente. El suero de cerdo contenía anticuerpo con una titulación de 2 mg/ml frente a C1 IA y CRP en suero total, estimado como se ha descrito en la sección "Vacunación de animales huésped ". La concentración media de IgG en el suero total de cerdo fue 1.200 mg/100 ml, según se estima usando anti IgG humana. La titulación del anticuerpo frente a C1 IA y CRP en suero de cerdo fue aproximadamente 3 mg/ml. Los sueros se fraccionaron en una columna estéril Sephadex® G200 usando tampón fosfato de sodio a pH fisiológico, y las fracciones que contenían inmunoglobulina se aislaron, se dializaron, y se liofilizaron. Al inicio del tratamiento, la proteína liofilizada se resuspendió en disolución salina isotónica. Se estimó que el suero desbloqueante de cerdo purificado anti C1IA/CRP contenía 100-1.000 mg de IgG/ml (por Inmunoelectroforesis en cohete usando anti IgG humana).
Investigaciones rutinarias del paciente durante la inmunoterapia con INA.
Monitorización del paciente con ECG, frecuencia del pulso, control de temperatura externo e interno.
Las concentraciones en suero de inmunoglobulinas, componente C4 del complemento, e inactivador de C1 (C1 IA C1 IA y CRP) se estimaron consecutivamente antes, durante y después del tratamiento. Los ensayos serológicos se realizaron por inmunoelectroforesis en cohete según Laurell, C. B., Analyt. Biochem., 15, 45 (1966), usando los siguientes sueros de ensayo: anti C1 IA humano de conejo (contenido de anticuerpo 0,7 mg/ml), y anti C4 humano de conejo (contenido de anticuerpo 1,0 mg/ml), ambos de Behringwerke. Anti IgG humana de conejo (contenido de anticuerpo 0,4 mg/ml) y anti IgM humana de conejo (contenido de anticuerpo 0,4 mg/ml) de Dakopatts, Copenhague. El recubrimiento y secreción de inmunoglobulinas de los linfocitos del paciente se investigaron consecutivamente según el siguiente método.
Los linfocitos se separan de una muestra de sangre del paciente que contiene citrato por centrifugación en gradiente de Isopague-Ficoll seguido de lavados en disolución madre de Hanck con centrifugación después de cada lavado. El combinado de linfocitos resultante se divide en dos partes. Una parte se examina para determinar la presencia de recubrimiento de inmunoglobulinas como se describe en Osther, K. y Dybkjaer, E., Scand. J. Haemat., 13, 24 (1974). La otra parte se tripsiniza usando tampón Trypure-PBS durante 2 minutos a 37 grados C. El efecto de la tripsina se para por lavados repetidos en MEM de Eagle que contiene suero de ternera fetal inactivado al 15 %. Posteriormente, los linfocitos se evalúan para determinar la presencia de inmunoglobulina. Cuando se encuentra que son negativos, los linfocitos se incuban en disolución madre de Hanck a 4 grados C toda la noche. Posteriormente, los linfocitos se separan y se incuban entonces en anti inmunoglobulinas humanas marcado con FITC. FITC (Isotiocianato de fluoresceína) fue de BBL, Cockeysville, Md., EE. UU. Los antisueros se conjugaron con FITC según Fothergill, J. E. (Properties of conjugated serum proteins. En Nairn, R. C, (ed.), Fluorescent Protein Tracing, p. 5, 3a ed. E. y S. Livingstone Ltd., Edimburgo y Londres (1969)). Inmediatamente posteriormente, se mide la inmunofluorescencia de los linfocitos por citofotometría como se describe en Osther, K. y Dybkjaer, E. (Scand. J. Haemat., 13, 24 (1974)).
Véase también Sandahl Christiansen, J, et al y Osther K. Acta Pathol. Microbial. Scand. Secc. C 84: 313-318, 1978, y las figuras relacionadas con pacientes en US 4.132.769.
Procedimiento de tratamiento.
Se ajustó en ensayo intracutáneo con suero desbloqueante de cerdo anti C1 IA/CRP diluido 1:10 y la reacción se notificó, si se producía. El paciente se pretrató con antihistamina con el fin de evitar una liberación de histamina iatrogénica en el paciente.
El suero desbloqueante de cerdo anti C1 IA/CRP, diluido en disolución salina, se administró intravenosamente. Se administraron el recuento de gotas y dosis total según la afección del paciente.
Resultados
Una introducción básica del uso de la monitorización del nivel en suero del nivel de C1 IA y C4 se ejemplifica en un niño de 2,5 años de edad (masculino) con reticulosarcoma metastásico tratado con quimioterapia, cirugía, y "dosis única de IgG desbloqueante de cerdo anti C1 IA/CRP.
El paciente No. 6 (véase el historial del paciente en los otros pacientes más adelante)
Un ejemplo temprano de la monitorización de C1 IA y C4 durante el tratamiento desbloqueante se hizo en un niño de 2,5 años de edad con reticulosarcoma metastásico progresivo con infiltración de testículos y médula ósea.
Cuatro meses antes del tratamiento de desbloqueo de "una dosis" con IgG de cerdo, el paciente recibió 3,0 mg de Vincristina semanalmente con remisión parcial temprana.
El tratamiento con Vincristina tuvo que pararse debido al desarrollo de ataxia y edema cerebral. Esta interrupción de la quimioterapia fue seguida del crecimiento recurrente de progresión rápida del reticulosarcoma a sus testículos y su médula ósea.
Durante las siguientes 4 semanas un tumor naranja de gran tamaño en su testículo derecho requirió cirugía. El cirujano no eliminó el otro testículo que contenía una masa tumoral palpable. Debido a la afección del paciente que tenía reticulosarcoma en la zona de resección, tumor pequeño papable tumor en el otro testículo y metástasis ósea, se decidió administrar 500 mg de IgG anti C1 IA/CRP de cerdo proporcionada I.V. como un intento de desbloqueo. Se proporcionó al paciente solo una infusión I.V. con ~500 mg de IgG anti C1 IA/CRP de cerdo purificada sin ninguna reacción adversa. La concentración en suero de C1 IA disminuyó de 85 % en mg a 50 % en mg después de un pico inmediato en el nivel de C1IA en suero de 90 % en mg. Se encontró que el nivel de C4 disminuyó de 60 % en mg a aproximadamente 20 % en mg (el rango estándar normal encontrado en los donantes de sangre fue 15-50 % en mg). Interpretamos esta disminución en las dos proteínas bloqueadas como una indicación de una respuesta.
Fue imposible un tratamiento adicional con IgG de cerdo debido a un incremento significativo en el nivel de IgM en el suero del paciente causado por anticuerpos frentes a proteínas de cerdo.
Se decidió entonces proporcionar al paciente dosis semanales reducidas de Vincristina (1,75 mg) durante 4 semanas y durante este periodo, el paciente volvió a desarrollar síntomas neurotóxicos, ataxia y paresia. Después de la segunda y tercera inyección semanal de Vincristina, el nivel de C4 empezó a incrementar de forma constante hasta cerca de 100 % en mg después de aproximadamente 2,5-3 meses después de la cirugía, indicando un bloqueo continuo interpretado como la inhibición de la reacción inmune debida a la quimioterapia.
Debido a estos síntomas, la Vincristina se paró. Dos a tres meses después de parar la quimioterapia, los síntomas neurológicos desaparecieron.
Después de la cirugía y el tratamiento desbloqueante del paciente en una única vez, el nivel en suero del inactivador de C1 permaneció a 50 % en mg después de aproximadamente 3 meses.
Los descubrimientos en la médula ósea mostraron durante los siguientes 2-3 meses ausencia de recurrencia de la infiltración sarcomatosa.
Tres meses después de parar el tratamiento, el paciente había sido evaluado varias veces. No había recurrencia de linfomas, el testículo izquierdo tenía un tamaño normal sin signo de tumor. La médula ósea se ha evaluado varias veces sin ningún signo de células tumorales. Ni el escaneo reveló signos de recidiva.
Resumen de 5 pacientes más tratados con IgG de cerdo anti inactivador de C1/CRP humano
La fluorescencia de IgG e IgM de linfocitos se mide en relación a estos pacientes como se describe en US 4.132.769. Paciente No. 1
Una paciente femenina con una edad de 55 años con carcinoma de mama metastásico avanzado con metástasis en coraza en la zona de resección del carcinoma cercano al estadio final de su enfermedad, con metástasis en pulmones, hígado y hueso se trató con 2 gramos de IgG de cerdo anti inactivador de C1/CRP humano infundida I.V. después de un ensayo cutáneo negativo para proteínas de cerdo. Después de la infusión I.V. de una cantidad de 2 gramos de IgG porcina (anti C1 IA y anti CRP), el paciente empezó a experimentar dolores en el área completa alrededor de la zona de resección cerca de la coraza constituyendo 10-12 tumores que promediaban 2-3 cm después de 1 a 1 y 1/2 hora de la infusión de la IgG de cerdo. Al mismo tiempo, el área completa de esta metástasis tumoral relativamente grande se volvió azul de repente sin reacción o enrojecimiento de la piel circundante que pareció ser más pálida, mientras los tumores se volvieron cada vez más azulados - rojo oscuro. Sin haber visto esto nunca antes, y con el fondo de las metástasis hepáticas de la paciente, se decidió parar la reacción por inyección de corticosteroides que poco después posteriormente paró la reacción inmune. Los dolores se pararon, pero los tumores permanecieron azules y parecieron después de pocas horas mostrar evidencia de rechazo. A la mañana siguiente, los tumores en coraza se secaron lentamente y realmente se despellejaron dejando zonas de demarcación claras. Alrededor de dos días después, todos los tumores se habían secado y la parte inferior de las lesiones se cicatrizó con una cicatriz fibrosa de color normal. Se tuvo la impresión de que el suministro de sangre en cada tumor se había parado en el momento del cambio de color. Este rechazo tumoral se interpretó como una reacción inmediata que apareció como resultado de una cascada del complemento. Esta paciente no se ensayó para determinar el inactivador de C1 o C4 en suero.
Paciente No. 2
Una paciente femenina de 53 años de edad que padece metástasis diseminadas de un carcinoma de mama con metástasis osteolíticas verificadas en sus vértebras, metástasis de carcinoma en la médula ósea y metástasis en coraza en la zona de resección. Después de la cirugía, la paciente había sido tratada previamente con irradiación frente a nódulos linfáticos bilaterales supra, infra y axilares, e irradiación paliativa frete a la columna lumbar.
Debido a la rápida progresión del carcinoma metastásico, la paciente, después de un ensayo cutáneo negativo, se trató inicialmente con IgG de cerdo anti inactivador de C1/CRP a una dosis total de 1 gramo I.V. El único efecto secundario inmediatamente después fue una elevación en la temperatura corporal, que desapareció después de unas pocas horas. Una semana después de la infusión de IgG de cerdo, la paciente recibió dos ciclos (con un intervalo de una semana) de un tratamiento citostático que consistió en Vincristina (dosis total 1,15 mg), 5-fluorouracilo (dosis total 600 mg), metotrexato (dosis total 45 mg), ciclofosfamida (dosis total 150 mg) y prednisona (dosis total 550 mg). Veintisiete (27) días después de la infusión inicial de IgG de cerdo y después de un ensayo cutáneo negativo, se administraron un segundo y un tercer tratamiento I.V. con un intervalo de 7 días (dosis total de los dos ciclos 2 gramos de IgG de cerdo).
La paciente experimentó fiebre después del tercer ciclo con IgG de cerdo a 40o.4 C, que después disminuyó tras la administración de aspirina después de algunas horas hasta el rango normal. Un mes después de la última infusión de IgG de cerdo, se proporcionó a la paciente un total de 5,0 mg de Vincristina durante un periodo de dos meses, 5-fluorouracilo (1.355 mg), y metotrexato (100 mg) y una dosis administrada peroralmente de 70 mg de ciclofosfamida se proporciona diariamente.
Respecto a la condición del carcinoma de la paciente, el ácido úrico de la paciente se incrementó hasta niveles extremadamente altos, y 15 días después (8 días después del primer ciclo con citostático), las metástasis cutáneas en coraza se aplanaron, y se volvieron cicatrices córneas. Después de un periodo de 3,5 meses, las metástasis osteolíticas en sus vértebras fueron reemplazadas por alteración osteoesclerótica. Una muestra de médula ósea mostró ahora una médula normoblástica, otra médula ósea tomada después de 3,5 meses mostró pequeñas islas de células tumorales rodeadas de linfocitos y tejido conectivo, y médula normoblástica.
Después de la primera infusión con anti inactivador de C1/CRP humano de cerdo, una disminución de C1 IA y C4 en suero de 60 - 40 % en mg que se observó en el momento del primer tratamiento con citostático (una semana después de la infusión de IgG de cerdo). Después del tratamiento con citostático, C4 se incrementó y el inactivador de C1 estaba inalterado alrededor de 65 % en mg. Durante el segundo y tercer tratamientos con IgG de cerdo, el nivel de C1 IA, después de un nivel de pico inmediato de 85 % en mg durante la segunda y tercera infusión de IgG de cerdo, empezó a disminuir hasta aproximadamente a 40 - 45 % en mg y un C4 disminuido hasta 5 % en mg entre la segunda y tercera infusión de IgG de cerdo. La concentración de inactivador de C1 disminuyó entonces lentamente y después de 3,5 meses después del primer tratamiento con IgG de cerdo estaba a 30 % en mg. Después del siguiente ciclo de quimioterapia, el C4 mostró un incremento constante hasta alrededor de 70 % en mg. La paciente no tuvo ningún incremento significativo en IgM en suero durante la quimioterapia y tratamiento con IgG de cerdo combinados.
Paciente No. 3
Un hombre de 41 años de edad con melanocarcinoma con metástasis diseminadas muy avanzadas subcutánea y en múltiples órganos. El paciente había sido tratado previamente con DTIC (dosis total 660 mg), CCNU (dosis total
20 mg) e Hydrea (dosis total 5.000 mg), sin ningún efecto en el cáncer, pero el tratamiento se paró debido a la aparición de cardiotoxicidad, toxicidad hematopoyética y toxicidad hepática. Se infundieron ciclos semanales de 1 gramo de anti inactivador de C1/CRP humano de cerdo. Los ciclos semanales se proporcionaron con un intervalo de una semana (dosis total 2 gramos). La temperatura se incrementó hasta 41o.6 C. Durante la segunda infusión de IgG de cerdo, el paciente empezó a desarrollar metástasis cerebrales y no se intentó un tratamiento adicional con IgG de cerdo.
Clínicamente, las metástasis crecieron más rápidamente durante el periodo de tratamiento con citostático. Una posible parada del crecimiento de las metástasis se observó durante 2 semanas después del tratamiento con IgG de cerdo. Como se describe más adelante, el paciente desarrolló una metástasis cerebral, que previno el tratamiento adicional. El paciente murió 6 semanas después del último tratamiento con IgG de cerdo sin ningún signo de remisión de su cáncer.
Durante la primera y segunda infusión semanal de IgG anti C1 IA/CRP humano de cerdo, se observó un pico inmediato significativo de incremento de inactivador de C1 en suero de alrededor de 60 % en mg a 90 % en mg, seguido de una disminución unos pocos días después hasta 50 % en mg. En el momento de la detección de las metástasis tumorales cerebrales, el C1 IA en suero había disminuido - finalizando a 45 % en mg antes de la muerte del paciente después de 4 semanas. C4 fluctuó con una disminución inmediata durante el tratamiento con IgG de cerdo seguido de un incremento ligero en C4 hasta alrededor de 50 % en mg en el estadio final. Ya después de la primera infusión de igG de cerdo, el nivel de IgM en el suero del paciente mostró un ligero incremento, debido probablemente a las infusiones de IgG de cerdo. El tratamiento intenso de quimioterapia ocultó cualquier efecto detectable de la IgG de cerdo.
Paciente No. 4
Un paciente masculino de 51 años de edad con cáncer de riñón con metástasis pulmonares. Al comienzo del tratamiento con anti inactivador de C1/CRP humano de cerdo, el paciente tenía tumores con crecimiento progresivo. Un ensayo cutáneo con IgG de cerdo fue negativo. El tratamiento I.V. con anti C1 IA/CRP humano de cerdo consistió en la infusión de 1 gramo de IgG de cerdo en 200 ml de disolución salina por día para los primeros 5 días, y posteriormente se hizo entonces el tratamiento I.V. con 0,5 gramos de IgG de cerdo diariamente durante 4 semanas dando lugar a la parada del crecimiento de las metástasis pulmonares. Durante el siguiente periodo de 4 meses después del tratamiento, se observó una regresión menor de la carga tumoral, aunque las metástasis pulmonares son difíciles de medir. El paciente no se inmunizó frente a la proteína IgG de cerdo, incluso después de una pausa intermitente de una quincena (vacaciones). 11/2 meses después del último tratamiento con anti C1 IA/CRP humano de cerdo, no se observó crecimiento tumoral. No tuvimos acceso a la inmunoelectroforesis de Laurell en el departamento y en su lugar realizamos el ensayo de inmunodifusión doble de Mancini. El suero del paciente mostró un anillo de CRP con un tamaño significativo al inicio del tratamiento con IgG de cerdo, mientras la repetición del mismo ensayo en una muestra de suero 1,5 meses después de la terminación del tratamiento con anti C1IA/CRP humano de cerdo mostró un anillo de CRP positivo en línea límite, cuando se compara con el ensayo inicial. El paciente se transfirió entonces a tratamiento con quimioterapia.
Paciente No. 5
Un hombre de 19 años de edad con teratoma testicular metastásico, que había sido tratado con Adriamicina durante varias semanas, pero este tratamiento tuvo que interrumpirse debido a efectos secundarios que afectaban el hígado y el corazón. El paciente se trató entonces con anti inactivador de C1/CRP humano de cerdo durante 5 días empezando el primer día con 1 gramo de IgG de cerdo infundida I.V. y los siguientes días con 0,5 gramos de IgG de cerdo por día durante aproximadamente 2 semanas. La IgM en el suero del paciente empezó a incrementarse aproximadamente dos semanas después de la última infusión de IgG de cerdo. El tratamiento se paró entonces y se planificó para el paciente una reprogramación con una nueva serie de quimioterapia y el tratamiento con IgG de cerdo tuvo que pararse debido al desarrollo de anticuerpos frente a las proteínas de cerdo.
Antes del inicio del tratamiento, el paciente había desarrollado metástasis grandes en los pulmones y en el mediastino y se consideró subterminal. Durante el periodo de tratamiento con anti C1 IA/CRP de cerdo, las metástasis pulmonares parecían estables durante 2,5 meses. Después de los 2,5 meses durante los cuales el paciente no recibió ningún tratamiento, las metástasis pulmonares empezaron a progresar de nuevo. El paciente empezó entonces con quimioterapia con Adriamicina, sin embargo, las metástasis continuaron creciendo y el cáncer se diseminó al hígado. El paciente no respondió después de otro mes con Adriamicina. El paciente se volvió caquéctico y se consideró entonces terminal.
El inactivador de C1 y C4 no se midieron, porque en ese momento no tuvimos acceso al equipo previo de inmunoelectroforesis de Laurell. En su lugar, el paciente se ensayó usando una inmunodifusión doble de Mancini (véase doble de Mancini en la figura 5).
El ensayo de inmunodifusión doble de Mancini mostró que el suero del paciente antes del tratamiento con el anti C1 IA/CRP humano de cerdo mostraba un anillo de CRP muy significativo. Por el contrario, después del tratamiento, una muestra de suero del anillo de CRP disminuyó su tamaño. No se hizo ninguna medición del anillo de precipitación. Cuando el paciente volvió a empezar con la quimioterapia (Adriamicina) algunos días después, se repitió una nueva muestra de suero durante el periodo de quimioterapia mostró un anillo de CRP mayor que antes del primer tratamiento con anti C1IA/CRP de cerdo, sin embargo, no se hizo ninguna medición.
Conclusión
La conclusión de la monitorización anterior de C1 IA en suero y C4 en suero en el seguimiento de un paciente con cáncer durante un tratamiento del cáncer que combina tanto tratamiento quimioterapéutico, intervención quirúrgica como tratamiento del cáncer con desbloqueo inmune pareció ser muy útil en referencia a los resultados de los ensayos con el desarrollo y cambios en el cáncer durante los meses de seguimiento de los pacientes.
Debido a que encontramos posteriormente que el inmunógeno aislado de explantes de células de carcinoma no contenía realmente dos variantes de C1 IA, que fue nuestra interpretación temprana de las dos proteínas recogidas de los explantes clonados de carcinomas de varios pacientes, pero posteriormente las dos proteínas se separaron individualmente y parecieron ser una combinación de C1 IA y proteína C reactiva (CRP).
El anticuerpo IgG de cerdo usado para tratar a los 6 pacientes descritos (incluyendo el niño, véase el paciente No. 6) fue anti C1 IA/CRP como se indica en el ensayo doble de Mancini en la figura 5.
Por lo tanto, C1 IA y CRP, en nuestra opinión, deben haber estado relacionados de cerca con los explantes de carcinoma usados para el desarrollo del inmunógeno purificado usado para los cerdos.
La IgG anti C1 IA/CRP humano recombinante humana se desarrolla sobre la base de IgG1 e IgG3 en células humanas transfectadas (p. ej., línea celular subtipo HEK 293) para ser formulada para uso clínico en el tratamiento de pacientes con cánceres. El propósito es iniciar un estudio piloto y/o ensayo clínico de fase I o fase I/II en pacientes con cáncer avanzado y/o metástasis sin ningún otro tratamiento posible.
La IgG anti inactivador de C1/CRP humano recombinante humana (bien IgG1 o IgG3) se produce usando una metodología patentada con la IgG1 y/o IgG3 recombinante en células humanas transfectadas con el anticuerpo IgG usando cultivo celular en un "sistema de biorreactor de olas" cerrado y purificado en una sala de laboratorio limpia de Clase 3 aprobada, sometida a control de calidad y validación estrictas, y envasada como una preparación de IgG liofilizada.
El producto se ensayará para determinar su seguridad y toxicidad como se ha descrito previamente, y debido al hecho de que constituye IgG humana recombinante purificada con especificidad frente al inactivador de C1/CRP, se anticipa que este producto será tolerado sin la producción de anticuerpos frente a este tipo de IgG humana. Además, los estudios piloto previos que consistieron en la infusión intravenosa de IgG anti inactivador de C1/CRP humano de cerdo purificada usada en 1 a 3 dosis, no causó efectos secundarios o reacciones adversas. Sin embargo, el nivel de IgM se incrementó después del tratamiento con IgG de cerdo, previniendo un tratamiento adicional.
El anticuerpo "desbloqueante" anti C1IA/CRP humano recombinante puede administrarse siempre que el paciente se beneficie de este tratamiento. El "kit de ensayo de diagnóstico de bloqueo inmune" de Dana Genetic puede ser valioso para monitorizar los niveles de C1 IA, C4 y CRP en relación con la respuesta tumoral.
Una posible estrategia de tratamiento desbloqueante del cáncer de cerebro basada en la detección del inactivador de C1 en tumores de cerebro malignos primarios y secundarios.
Hasta ahora, no se sabe si el diagnóstico de cualquier cambio en los pacientes con tumores de cerebro se refleja en el kit de ensayo de Dana Genetic para uso en suero.
Kurt Osther et al hicieron un estudio sobre el diagnóstico de la malignidad de tumores de cerebro. Se encontró que el inactivador de C1 recubría los cultivos de células malignas y determinados subcultivos explantados de biopsias obtenidas de un departamento de neurocirugía en Dinamarca ensayando varios tumores incluyendo tumores benignos y tumores de cerebro malignos primarios y secundarios. El ensayo de los cultivos y subcultivos celulares se basó en el uso de anti inactivador de C1 humano policlonal de conejo-FITC (anticuerpo conjugado con fluoresceína). Las células se midieron usando un Leitz MPV2 equipado para medir la inmunofluorescencia en células únicas en una capa celular sembrada en microportas de especímenes de biopsia de cerebro cultivados y subcultivados. El ensayo también incluyó un control adecuado de la especificidad del recubrimiento del C1 IA en las células (Osther K, Hoejgaard K, Dybkjaer E, Acta Neurol. Scand. (1974) 50: 681-689). Se demostró claramente que esta inmunofluorescencia, que representa el recubrimiento de C1 IA de las células, era reproducible.
Se investigaron los cultivos celulares de tumores de cerebro malignos primarios y tumores con una clasificación incierta según Kernohan (Zülch K, Atlas of Gross Neurosurgical Pathology, Kernohan classification from 1949, 1952, p32 - 33. (Autor y editor Klaus Zülch) Springer Verlag Berlin Heidelberg GmbH 1975), - de metástasis de carcinoma de cerebro maligno secundario, y de tumores de cerebro primarios benignos.
Un número de 7 de 8 astrocitomas de grado II-IV y un meningioma mostraron la presencia de recubrimiento de C1 IA de las células cerebrales según el diagnóstico histológico. Dos (2) astrocitomas (grado de Kernohan incierto) no mostraron ninguna célula recubierta con C1 IA.
Un número de 6 de 7 tumores de cerebro malignos secundarios, metástasis de varios carcinomas, mostraron células recubiertas con C1 IA.
Un número de 8 tumores benignos primarios no mostraron ninguna célula recubierta con C1 IA. Un paciente con tejido necrótico sin masa tumoral definida mostró células recubiertas con C1 IA.
Una diferencia importante entre los tumores de cerebro secundarios causados por carcinomas, y los tumores de cerebro malignos primarios
Este estudio de tumores de cerebro mostró indicaciones de que las metástasis de cerebro secundaras subcultivadas de carcinomas retenían las células recubiertas con C1 IA, mientras, de forma interesante, los astrocitomas malignos primarios, perdieron el recubrimiento de C1 IA en los subcultivos.
Además de perder el recubrimiento de C1 IA, los tumores de cerebro malignos primarios subcultivados cambiaron su apariencia asemejándose a fibroblastos. El medio de cultivo no reflejó las mismas condiciones biológicas cuando se compara con las condiciones presentes en el sistema SNC.
Tradicionalmente, se considera que los gliomas están confinados en el sistema nervioso central. (Jimsheleishvili S, Alshareef AT, Papadimitriou K, Bregy A, Shah AH, Graham RM, Ferraro N, Komotar RJ. J Cancer Res Clin Oncol.
2014 mayo; 140(5): 801-7). Incluso los tumores de cerebro altamente malignos tales como glioblastoma multiforme metastatizan raramente en el resto del organismo fuera del SNC. La razón podría deberse al hecho de que el entorno biológico para las células de tumor de cerebro primario fuera del SNC es diferente al del interior del SNC, de manera que el entorno fuera del SNC no es propicio para la expansión de tumores de cerebro primarios dificultando la capacidad de metástasis.
Los tumores de cerebro malignos primarios están normalmente bien vascularizados y tienen un borde del tumor especialmente bien vascularizado, los glioblastomas más malignos parecen tener frecuentemente necrosis en partes del tumor. Esto puede deberse al hecho de que la barrera hematoencefálica es extremadamente compleja. Podría postularse que la ausencia de un recubrimiento de C1 IA bloqueante en las células de tumor de cerebro liberadas fuera del sistema SNC podrían ser incapaces de sobrevivir, porque las células fuera del SNC cambian de comportamiento y pueden ser reconocidas por el sistema inmune y posteriormente ser lisadas y/o rechazadas.
Ejemplo 6: gliomas RG-2 de rata y NS-1 de rata
Estudios recientes han proporcionado una evidencia significativa de la presencia de proteína C reactiva y también la presencia de inhibidor de C1, también denominado inhibidor de C1 esterasa o inactivador de C1 (C1 IA) en las células cancerosas malignas y entre estas células cancerosas malignas, tumores de cerebro malignos tales como astrocitomas, también denominados gliomas o glioblastomas. Este nuevo descubrimiento también se ha identificado en gliomas de rata tales como glioma RG-2 (rata) y glioma NS-1 (rata) también denominado CNS-1.
Gliomas RG-2 de rata y NS-1 de rata
Estas células cancerosas malignas se han cultivado en cámaras semejantes a Leighton desechables como lo han sido los gliomas y glioblastomas humanos, tales como glioblastoma multiforme. Todos estos, también denominados astrocitomas en los laboratorios Rausing en la Universidad de Lund en el sur de Suecia.
Estas líneas celulares de glioma maligno se incubaron con anti proteína C reactiva humana de conejo, se encontró que reaccionaban de manera cruzada con la proteína C reactiva de rata. Se usó un anticuerpo secundario marcado con TRITS frente al anticuerpo de conejo para reaccionar con anticuerpos humanos unidos frente a la proteína C reactiva (rata). Véanse las figuras 6a y 6b muestra RG-2 de rata. Las células de glioma que han sido incubadas varias horas con anti proteína C reactiva humana policlonal de conejo (anti HU CRP), se lavaron con tampón PBS o medio de cultivo y después se incubaron con antisuero anti conejo conjugado con TRITS como un anticuerpo secundario para mostrar unión (véanse las células de RG-2 rojas mostradas en las figuras 6a-6b).
Incorporación de GFP en células de glioma RG-2 de rata
Como se observa en la figura 8, las células de glioma RG-2 se visualizan usando fluorescencia verde por la incorporación de GFP.
La visualización de las células de glioma RG-2 de rata se consigue mediante la colocalización de células de glioma positivas para el gen de RG-2 de rata GFP (vivas). Al mismo tiempo, la figura 9 muestra la presencia de recubrimiento de la proteína C reactiva en las células de glioma RG-2, según se tiñe con anti humano de conejo (anticuerpo anti humano que se sabe que reacciona de manera cruzada con anti CRP de rata y Ab secundario TRITS (cubierta externa roja).
Esta figura 8 muestra la fluorescencia verde especialmente visible en el núcleo y en el citoplasma de las células de glioma. El anticuerpo marcado con TRITS rojo aparece recubriendo la periferia de las células de glioma RG-2 proporcionando evidencia de una proteína C reactiva localizada en la membrana plasmática que reacciona con anti humano de conejo (que se sabe que reacciona de manera cruzada con anti proteína C reactiva de rata).
La importancia crucial de los descubrimientos de CRP y el inhibidor de C1 o inactivador de C1 (C1 IA) debe observarse desde el fondo del hecho de que se sabe que estos recientes experimentos con células de glioma de gliomas de rata son muy similares a los gliomas malignos humanos y se usan como un modelo en rata para gliomas humanos también denominado glioblastoma o glioblastoma multiforme.
Se identificó que el inhibidor de C1 esterasa también denominado inhibidor de C1 o inactivador de C1 (C1 IA) recubría las células de glioma tales como las células de glioma RG-2 como un descubrimiento importante de esta invención, así como los descubrimientos de la proteína C reactiva en células de glioma también son una parte muy importante de esta invención.
Ejemplo 7:
Gliomas RG-2 de rata y NS-1 de rata
Estas células cancerosas malignas han sido cultivadas en cámaras semejantes a Leighton desechables, como lo han sido los gliomas y glioblastomas humanos, tales como glioblastoma multiforme. Todos estos, también denominados astrocitomas en los laboratorios Rausing en la Universidad de Lund en el sur de Suecia.
Estas líneas celulares de glioma maligno se incubaron con anti proteína C reactiva humana de conejo, que se encontró que reaccionaba de manera cruzada con la proteína C reactiva de rata. Se usó un anticuerpo secundario marcado con TRITS frente al anticuerpo de conejo usado para reaccionar con anticuerpos humanos unidos frente a la proteína C reactiva (rata). Véanse las figuras 10 muestra células de glioma RG-2 de rata que han sido incubadas varias horas con anti proteína C reactiva humana policlonal de conejo (anti HU CRP), lavadas con tampón PBS o medio de cultivo y después incubadas con antisuero anti conejo conjugado con TRITS como un anticuerpo secundario para mostrar unión (véanse las células de RG-2 rojas mostradas en las figuras 10).
Figura 11a y 11b. Células de glioma NS-1 (CNS-1) expandidas en cámaras semejantes a Leighton desechables e incubadas con anti CRP humana de conejo (que se sabe que reacciona de manera cruzada con CRP de rata). El exceso de anticuerpo se eliminó por lavado en tampón (medio), y se añadió anti suero anti conejo secundario marcado con TRITS. Las células se lavaron entonces, y se sometieron a microscopía en campo oscuro con filtros de excitación que permiten la detección de TRITS. Las células muestran recubrimiento de anti CRP como evidencia de la presencia de CRP (rata) visualizada con el anticuerpo secundario marcado con TRITS frente a anticuerpo de conejo. Los núcleos de las células se observan como núcleos que típicamente aparecen como circulares más oscuros en las células.
Ejemplo 8:
Incorporación de GFP en células de glioma RG-2 de rata. Como se observa en la figura 12, las células de glioma RG-2 se visualizan usando la fluorescencia verde por incorporación de GFP.
Ejemplo 9:
La visualización de las células de glioma RG-2 de rata se consigue mediante la colocalización de células de glioma positivas para el gen de RG-2 de rata GFP (vivas). La figura 13 muestra la presencia del recubrimiento de proteína C reactiva en las células de glioma RG-2, como se evidencia incubando las células con anti humano de conejo, localizado en la membrana plasmática de las células (se sabe que el anticuerpo anti humano usado reacciona de manera cruzada con anti CRP de rata. Usando el método de inmunotinción en sándwich, un anticuerpo secundario TRITS muestra la unión "roja" de las membranas plasmáticas de las células.
Esta figura 13 muestra la fluorescencia verde causada por la incorporación de GFP en estas células y las hace visibles especialmente en el núcleo y en el citoplasma de las células de glioma. El anticuerpo marcado con TRITS rojo aparece recubriendo la periferia de las células de glioma RG-2 proporcionando evidencia de una proteína C reactiva (CRP) recubriendo la membrana plasmática, que reacciona con anti humano de conejo (que se sabe que reacciona de manera cruzada con anti proteína C reactiva de rata). El método consiste en fusionar la visibilidad de la tinción con GFP como fluorescencia verde, muy notoria en el núcleo de las células.
Como puede verse en la figura 13, un descubrimiento importante de esta invención, así como los descubrimientos de la proteína C reactiva en células de glioma RG-2 de rata, es también una parte muy importante de esta invención. Esto también se encontró en otros tipos de células de glioma de rata tales como células de NS-1 de rata. Es, por lo tanto, evidente que estas células de glioma de rata (ejemplificadas usando células de glioma RG-2, y NS-1 para estas investigaciones). Esto es un anticipo de lo que se encontrará en el recubrimiento de células de glioma/glioblastoma humano. De nuevo, estos descubrimientos indican la importancia significativa de la presencia de estas proteínas, inactivador de C1, y proteína C reactiva (CRP) en determinadas células cancerosas y proporciona una evidencia significativa del hecho de que no es, de hecho, la reacción del complemento en sí misma la que promueve el crecimiento de la célula tumoral en estos casos, sino que, absolutamente por primera vez, se muestra que las células cancerosas tales como, por ejemplo, gliomas y glioblastomas utilizan métodos que inhiben el sistema del complemento para matar o lisar las células cancerosas dificultando que tenga lugar la reacción del complemento ya en el inicio de la actividad del complemento en respuesta a posibles anticuerpos dificultando que esta actividad tenga lugar, concretamente dificultando que el complejo C1qrs, que constituye la ruta clásica normal, se disocie en C1r y C1s
Ejem plo 10:
Se identificó que el inhibidor de C1 esterasa también denominado inhibidor de C1 o inactivador de C1 (C1 IA) recubría las células de glioma tales como las células de glioma RG-2. Como se observa en la figura 14, el inactivador de C1 está recubriendo las células de glioma RG-2 de rata. La tinción con Dapi se usó para mostrar los núcleos. La tinción con Dapi azul junto con anti C1 IA (y realizada usando inmunotinción en sándwich con anticuerpo secundario en sándwich que estaba marcado con TRITS proporcionó evidencia de que los núcleos de estas células de glioma de rata no se tiñen con anti inactivador de C1, pero la membrana plasmática de la célula de glioma de rata está expresando inactivador de C1 como se pone de manifiesto por la coloración de TRITS (rojo).
Ejemplo 11:
La importancia crucial de los descubrimientos del inhibidor de C1 o inactivador de C1 (C1 IA) deben observarse desde el fondo del hecho de que se sabe que estos recientes experimentos con células de glioma de gliomas de rata son muy similares a los gliomas malignos humanos y parecen tener el mismo tipo de recubrimiento en la membrana de las células de glioma que el glioma/glioblastoma humano como se indica en las figuras 16a, 16b, y 16c.
Por lo tanto, hemos usado un modelo de glioma de rata (realmente, dos modelos de glioma de rata, uno denominado RG-2 y uno denominado NS-1) para comparar lo que pasará cuando se anticipa lo que pasará con gliomas humanos también denominados glioblastoma o glioblastoma multiforme que tienen este idéntico recubrimiento de inhibidor de proteasa, que es una de las dianas para el tratamiento de glioma/glioblastoma humano descrito en esta invención. Por lo tanto, se ensayó una serie de 3 células de glioma/glioblastoma humano diferentes usando inmunotinción sin la permeabilización de las células en glioma de rata o en glioma/glioblastoma humano.
Fibroblastos cutáneos benignos humanos (dérmicos) incubados con un anti inactivador de C1 y con anticuerpo secundario marcado con FITC mostrando una diferencia definida a diferencia de las células cancerosas (p. ej., glioma de rata y glioma/glioblastoma humano). Los descubrimientos en las células hay una débil expresión de C1-IA en el núcleo de células de fibroblastos, pero no en el citoplasma o superficie de las células. Si se compara esta imagen con imágenes previas de células de glioblastoma humano y células de rata GFP hay una fuerte expresión de C1-IA en el citoplasma o membrana celular, pero no en el núcleo en las células cancerosas. Un C1 IA débil está localizado definitivamente en el núcleo y no en la membrana plasmática. En este ensayo, las células no se trataron con una etapa de permeabilización (véase la figura 17).
Cuando los fibroblastos cutáneos benignos humanos se incubaron con anti CRP y secundario marcado en sándwich solo hay una señal muy débil indicando ausencia de unión específica de CRP en la superficie de estas células benignas. Sin etapa de permeabilización (véase la figura 18).
Respecto a los descubrimientos en fibroblastos cutáneos humanos respecto al inhibidor de C1 (C1IA)
Como describen Gulati et al aparte del el inhibidor de C1 (C1IA), el componente C1r, C1s del complemento sintetizado por todos los tipos de células de muchas células no malignas. En nuestra invención, una mayor cantidad de C1 IA en las células cancerosas puede inhibir que el complejo C1qrs se disocie en C1q, C1r y C1s. En las células benignas, las tasas de secreción de C1r y C1s fueron aproximadamente equimolares en fibroblastos y en las células mesenquimales humanas disociadas, condrocitos, mientras que la tasa de secreción para C1s superó la de C1r en los otros tipos celulares (Gulati P, Lemercier C, Guc D, Lappin D, Whaley K. Regulation of the synthesis of C1 subcomponents and C1-inhibitor. Behring Inst Mitt. 1993 dic; (93): 196-203).
Según estos autores, que examinaron la síntesis de C1q, C1r, C1s e inhibidor de C1 en células HepG2, células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC), fibroblastos (cutáneos y de la membrana sinovial), condrocitos y monocitos y C1q (se encontró que solo era sintetizado por monocitos) - C1r, C1s e inhibidor de C1 se sintetizaron por todos los tipos celulares. Las relaciones molares de C1s a C1r fueron aproximadamente 2:1 para células HepG2, 5:1 para monocitos y 10:1 para HUVEC. La estimulación con interferón-gamma dio lugar a una expresión incrementada de las cuatro proteínas. La relación C1s:C1r no se alteró en condrocitos o fibroblastos, pero se acercó a la unidad en HepG2, monocitos y HUVEC, debido a la estimulación relativamente mayor de la expresión del gen de C1r.
En 2002, aislé el ARN total de 4 cultivos de condroblastos humanos recogidos de explantes celulares del tejido del cartílago de la rodilla de cuatro (4) pacientes, dos con defectos en el cartílago de grado III (sin osteoartritis, y dos con grado IV (con cambios osteoartríticos incipientes).
El ARN total de los condroblastos del cóndilo femoral de estos cuatro pacientes se aisló y se sometió a análisis por Gene Chip de Affymetrix ensayando alrededor de 12.000 genes en el Department of Inflammatory Research del Profesor Klaus Bendtsen, Rigshospitalet, Copenhague.
El método de ensayo usando matriz Genchip de Affymetrix se describe por encima en las figuras 19 y 20.
En esta biblioteca, ensayé estos condroblastos humanos (que se asemejan a condrocitos) y obtuve una lectura sobre los genes activados y no activados. Usé una proteína con gen no activado concretamente colágeno de tipo X, que pareció tener valores de lectura bajos por debajo de un límite arbitrario de 100 (<90). Entre estos muchos genes, identifiqué el componente C1q del complemento y revisé la lectura en los 4 pacientes, que mostraron lo siguiente.
Ejemplo 12:
Matriz de Gene Chip de Affymetrix
Biblioteca de la matriz Gene Chip del sistema del complemento en células mesenquimales humanas no malignas
En esta biblioteca, ensayamos estos condroblastos humanos que se cultivaron y después de haber alcanzado el
70 % de confluencia en matraces Falcon de 25 cc, se recogió el ARNt en el medio sin suero y se llevó al Institute for Inflammatory Research, Rigshospital (Danish University Hospital), Copenhague, el departamento encabezado por el Profesor Klaus Bendtsen. Se ensayaron 12.600 ADNc. Estas células mesenquimales humanas (que se asemejan a condrocitos) se ensayaron en un chip que contenía aproximadamente una lectura en genes activados y no activados.
Usé una proteína con gen no activado concretamente colágeno de tipo X, que pareció tener valores de lectura bajos por debajo de un límite arbitrario de 100 (<90).
Entre estos muchos genes identificados en la matriz de gene chip estaban varios de los componentes del complemento. Uno fue el componente C1q del complemento y revisé la lectura. Esta contiene información génica de 4 pacientes, donde las células mesenquimales derivan de biopsias de cartílago del cóndilo de la rodilla de los pacientes en una zona no portante, y donde las células se habían cultivado en medio sin suero fetal de ternera donde las células se cultivaron hasta el 70 % de confluencia, el ARNm total se recogió y se preparó para análisis por Gene chip de Affymetrix - esto se preparó en el Institute for Inflammatory Research del Profesor Klaus Bendtsens en Panum Institute, Copenhague, con una ID codificada como sigue: KM, HL, MT, e IB, que mostró lo siguiente.
Ejemplo 12a:
El inhibidor de C1 (inactivador de C1 (C1 IA)):
El primer gen de interés ensayado en las células mesenquimales humanas es el inhibidor de C1 (inactivador de C1 (C1 IA) (una proteína que se sabe que está presente en células tales como fibroblastos, y entre otras cosas, en condroblasto (-condrocitos), etc., Este se identificó después de una búsqueda en la matriz Gene Chip entre ~12.600 genes. La lectura del inhibidor de C1, C1 IA en los 4 pacientes, mostrado en la figura 21.
Ejemplo 12b:
Componente C1q del complemento:
Entre estos muchos genes identifiqué el componente C1q del complemento y revisé la lectura en los 4 pacientes como se muestra en la figura 22. La lectura mostró que el gen de C1q tenía una señal muy baja y muy por debajo del límite rojo, donde cualquier señal por debajo de este límite se considera un gen inactivo, que se mostró como sigue respecto a C1q en células mesenquimales humanas benignas.
Ejemplo 12c:
Componente C1r del complemento:
El siguiente gen de interés y examinado usando la matriz Gene Chip en células mesenquimales de los cuatro (4) pacientes enumerados (codificados) fue C1r (disociado del complejo C1qrs) que identifiqué y revisé la lectura de C1r en los 4 pacientes, que mostró el > 1 log sobre la línea límite, lo que implica que el gen de C1r estaba activado (véase la figura 23).
La interpretación de la actividad génica encontrada en células mesenquimales humanas tales como condroblastos en el Ejemplo 12b de que C1q no estaba disociado y de que se encontró que C1r era activo, lo más probablemente en un estado estacionario, lo más probablemente equilibrado por la actividad génica en las células del inhibidor del complejo C1, inhibidor de C1 (también denominado inactivador de C1 (C1 IA). Como puede observarse, aparentemente no está teniendo lugar una reacción antígeno anticuerpo en estas células, también indicado por el hecho de que C1r no ha activado C4 (véase el ejemplo 12d).
Usando el análisis por Gene Chip de Affymetrix, encontré que C1q no está activado en condroblastos. El método para recoger los condroblastos de explantes de cartílago humano fue una tecnología descrita por Kurt Osther et al. y publicada en 2006 (Osther K, Storgaard P, Clausen CI The Rationale to use Explant Cultures for ACI. (en Basic Science and Clinical Repair and Reconstruction of Articular Cartilage defects: Current Status and Prospects, Zanasi S, Brittberg M, Nehrer S, Marcacci M, editores), p313-319, Timeo Bologna 2006).
Además, encontré que C1r estaba elevado significativamente en estos condroblastos humanos, lo que es consistente con los resultados publicados por Gulati P et al. usando los métodos descritos por ese grupo en 1993 (Gulati P, Lemercier C, Guc D, Lappin D, Whaley K. Regulation of the synthesis of C1 subcomponents and C1-inhibitor. Behring Inst Mitt. 1993 dic; (93): 196-203). Esto se corresponde globalmente con mi teoría postulada acerca de la diferencia a este respecto, cuando se comparan estos tipos de células benignas con glioma/glioblastoma.
Respecto a los descubrimientos en condroblastos humanos de actividad génica basada en resultados sobre el ensayo de cuatro (4) condroblastos humanos (~condrocitos) respecto al componente C4, C5, C6, C7, C8, y C9 del complemento una continuación de análisis de gene chip de los componentes del complemento en células mesenquimales benignas tales como condroblastos (~condrocitos), donde el aislamiento de los condroblastos del cartílago recogido del cóndilo femoral de 4 pacientes, donde dos de estos pacientes tenían defectos en el cartílago de grado III (no osteoartrítico) y dos tenían defectos en el cartílago de grado IV (osteoartritis incipiente). No hay evidencia de que la proteína C reactiva (CRP) esté recubriendo estas células mesenquimales, al contrario que los descubrimientos en células de carcinoma humano y que ahora se ha demostrado que recubre células de glioblastoma NS de rata y en glioblastomas humanos.
En 2002, aislé el ARN total de 4 cultivos de condroblastos humanos recogidos de explantes celulares del tejido del cartílago de la rodilla de 4 pacientes, dos con defectos en el cartílago de grado III (sin osteoartritis, y dos con grado IV (con cambios osteoartríticos incipientes).
El ARN total de los condroblastos del cóndilo femoral de estos cuatro pacientes se aisló y se sometió a análisis por Gene Chip de Affymetrix ensayando alrededor de 12.000 genes en el Department of Inflammatory Research del Profesor Klaus Bendtsen, Rigshospitalet, Copenhague.
Ejemplo 12d:
Componente C4b del complemento U24578: genes de RP1 humano y precursor de C4B del complemento (C4B) Gen de C4b
Este gen codifica la forma básica del factor 4 del complemento, parte de la ruta de activación clásica. La proteína se expresaría como un precursor de cadena única que había tenido lugar una reacción antígeno anticuerpo en el tejido del que derivaron estas células mesenquimales benignas. De otra forma, podría haberse producido una disociación de C4 para activar adicionalmente en componente C2 del complemento, si se hubiera producido una escisión proteolítica en un trímero de cadenas alfa, beta, y gamma antes de la secreción. El trímero habría proporcionado una superficie para la interacción entre el complejo antígeno-anticuerpo y otros componentes del complemento, por ejemplo, mostrando unión de alguna parte de la molécula C4 a una superficie celular.
La cadena alfa no se escindió para liberar la anafilotoxina C4, de otra forma un mediador de la inflamación local. Este gen se localiza en la región del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase III en el cromosoma 6. Existen haplotipos variados de esta agrupación de genes, de manera que los individuos pueden tener 1, 2, o 3 copias de este gen. Además, este gen existe como una forma larga y una forma corta debido a la presencia o ausencia de un retrovirus HERV-K endógeno de 6,4 kb en el intrón 9.
Entre estos genes, también he identificado el componente C4b del complemento y revisé la lectura de los 4 pacientes, mostrado en la figura 24.
Ejemplo 12e:
C5 también abarca las siguientes subunidades de C5
Resumen
El gen de C5 codifica un componente del sistema del complemento, una parte del sistema inmune innato, que juega un papel importante en la inflamación, homeostasis del huésped, y defensa del huésped frete a patógenos. Si ha tenido lugar el producto de escisión macromolecular C5b todo la vía de C5b a C9 en una superficie celular haciendo que tenga lugar un complejo de ataque a la membrana (MAC) que mata a la célula. Las mutaciones en este gen causan deficiencia del componente 5 del complemento, una enfermedad caracterizada por infecciones bacterianas recurrentes. Véase la figura 25.
Ejemplo 12f:
Componente C6 del complemento
Este gen codifica un componente de la cascada del complemento. La proteína, componente C6 del complemento, es una proteína unida a una superficie celular cuando está activada y es parte del complejo de ataque a la membrana que puede incorporarse en la membrana celular y causar la lisis celular. Las mutaciones en este gen están asociadas con deficiencia del componente 6 del complemento. Se han descrito variantes de transcritos que codifican la misma proteína. Véase la figura 26.
Ejemplo 12g:
Componente C7 del complemento
Resumen
C7 es un componente del sistema del complemento. Participa en la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC). Las personas con deficiencia de c 7 son propensas a infección bacteriana. Véase la figura 27.
Ejemplo 12h:
Componente C8 (beta) del complemento
Este gen codifica una de las tres subunidades de la proteína del componente 8 (C8) del complemento. No hay actividad génica de C8 en estas células mesenquimales. C8 está compuesto por cantidades equimolares de subunidades alfa, beta y gamma, que están codificadas por tres genes separados. C8 es un componente del complejo de ataque a la membrana, que media la lisis celular, e inicia la penetración en la membrana del complejo. La proteína media la interacción de C8 con el precursor del complejo de ataque a la membrana C5b-7. En los seres humanos, la deficiencia de esta proteína está asociada con un riesgo incrementado de infecciones por meningococos. El corte y empalme alternativo da lugar a múltiples variantes de transcritos. Véase la figura 28.
Ejemplo 12i:
Componente C8 alfa del complemento
C8 (alfa) es un componente del sistema del complemento y contiene tres polipéptidos, alfa, beta y gamma. Este gen, que no está activado en estas células mesenquimales, codifica la subunidad alfa de C8. C8, cuando está activado, participa en la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC). El MAC se ensambla en las membranas bacterianas para formar un poro, que permite la disrupción de la membrana de una célula o bacteria. Las mutaciones en este gen causan deficiencia del C8 alfa-gamma del complemento. Véase la figura 29.
Ejemplo 12 j:
Componente C9 del complemento
Cuando está activado, este gen codifica el componente final del sistema del complemento. Participa en la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC). El MAC se ensambla en las membranas bacterianas para formar un poro, que permite la disrupción de la organización de la membrana bacteriana. Las mutaciones en este gen causan deficiencia del componente C9. Véase la figura 30.
Ejemplo 12k:
Proteína C reactiva (CRP)
La CRP se encuentra, en algunos casos, presente en relación con la activación del sistema del complemento y en conexión con dicha activación. He encontrado que, en el caso de glioma NS1 y RG2 de rata maligno, así como células de glioma/ glioblastoma humano en cultivo, tanto el inhibidor de C1 (inactivador de C1) como CRP están ambos recubriendo estas células como se indica en las figuras previas usando métodos de inmunotinción. Véase la figura 31.
Resumen
No se encontró ninguna evidencia de reacción de la proteína C reactiva (CRP) en las células mesenquimales como se observa en la figura 31.
Cuando está activado, este gen que codifica la proteína C reactiva del sistema del complemento puede ocurrir durante la activación de la ruta clásica del sistema del complemento es una función biológica muy conocida y directa de CRP (Pepys MB, Hirschfield GM, C-reactive protein: a critical update. J Clin Invest 2003; 111: 1805-12). Por el contrario, durante la activación inducida por CRP del complemento y opsonización de células apoptóticas, los macrófagos que fagocitan activamente reducen la expresión de IL-12 y de esta manera suprimen a los linfocitos T {Kim SJ, Gershov D, Ma X, Brot N, Elkon KB. Opsonization of apoptotic cells and its effect on macrophage and T cell immune responses, Ann NY Acad Sci 2003;987:68-78). Los resultados sugieren que CRP unida a una superficie proporciona sitios de unión secundarios para H, dando lugar lo más probablemente a una mayor regulación de la amplificación de la ruta alternativa.
Mediante esta acción, la CRP amplifica directamente y facilita la inmunidad innata, un proceso que ya se ha asociado con el inicio y progresión de varas afecciones inflamatorias, enfermedad cardiovascular, cáncer, La proteína C reactiva (CRP) es una sustancia producida por el hígado en respuesta a la inflamación. Otros nombres para CRP son proteína C reactiva de alta sensibilidad (hs-CRP) y proteína C reactiva ultrasensible (us-CRP).
La proteína C reactiva (CRP) es una proteína sérica de fase aguda y un mediador de la inmunidad innata. La CRP se une a polisacáridos microbianos y a ligandos expuestos en las células dañadas. La unión de CRP a estos sustratos activa la ruta clásica del complemento dando lugar a su captación por células fagocítcas. La activación del complemento por CRP está restringida a C1, C4, C2 y C3 con poco consumo de C5-9.
Un alto nivel de CRP en la sangre es un marcador de cualquier afección que cause inflamación, desde una infección respiratoria superior a cáncer. Los niveles altos de CRP pueden indicar que hay inflamación en las arterias del corazón, lo que puede significar un mayor riesgo de ataque al corazón. Es importante recordar, sin embargo, que la CRP es un ensayo extremadamente inespecífico y puede estar elevada en cualquier afección inflamatoria. Como parte de esta invención, parece que CRP está recubriendo realmente las células cancerosas tales como células de glioma de rata en cultivo y tales como cultivos de células de glioblastoma humano, como puede observarse en los ejemplos de inmunotinción anteriores.
La CRP puede incluso prevenir la formación del complejo de ataque a la membrana a través de C5b a C9 (MAC). La reacción de MAC no tiene lugar aparentemente en el glioma maligno de rata y glioma/glioblastomas humanos, mientras C5b a C9 se ensambla normalmente en membranas bacterianas para formar un poro, lo que permite la disrupción de la organización de la membrana bacteriana. Las mutaciones en este gen causan deficiencia del componente C9.
Escaneo preliminar de factores del complemento en pacientes con glioblastoma,
Micromatriz de ARNm Henrietta_2_Oscar,
Paciente AMN con glioblastoma
Paciente DZ con glioblastoma
ARNm No. de acceso NCBI AA144838. inhibidor de proteinasa de serina (o cisteína), clado G (inhibidor de C1), miembro 1.
Ejemplo 13:
El ensayo de ARNm se ha hecho en dos pacientes con glioblastoma, donde las células de un paciente con código AMN y paciente con código DZ se ensayaron para determinar la presencia de recubrimiento de inhibidor de C1 (C1 IA), teñidas con anti C1 IA humano y anticuerpo secundario marcado con FITC en sándwich en el Ejemplo 11.
Los resultados de este ejemplo muestran ARNm hecho por ensayo en micromatriz (Henrietta_2_Oscar AMN y DZ. Véase la figura 32).
Ejemplo 14:
Los mismos dos pacientes con glioblastoma con código AMN y DZ se ensayaron en un ensayo de micromatriz de ARNm para determinar algunos componentes del complemento, incluyendo ARNm del precursor del componente C1r del complemento, C4a, C2 y C5 se presenta en pasos logarítmicos. Véanse las figuras 33-36.
Conclusión
Cuando se estudió la actividad génica del sistema del complemento en células mesenquimales humanas usando análisis por matriz Gene Chip de Affymetrix, no hubo ninguna evidencia de activación de los componentes del complemento aparte de C1r, que lo más probablemente no está dando lugar a ninguna activación de la ruta clásica del complemento, debido lo más probablemente a ausencia de reacción antígeno anticuerpo de tipo IgG, especialmente encontré que C4 no está activado en IgG1, IgG3, IgM y otros componentes de anticuerpo en los condroblastos (~condrocitos). El método para recoger los condroblastos de explantes de cartílago humano fue una tecnología descrita por Kurt Osther et al. y publicada en 2006 (Osther K, Storgaard P, Clausen CI The Rationale to use Explant Cultures for ACI. (en Basic Science and Clinical Repair and Reconstruction of Articular Cartilage defects: Current Status and Prospects, Zanasi S, Brittberg M, Nehrer S, Marcacci M, editores), p313-319, Timeo Bologna 2006).
Además, encontré que C5, C6, C7, C8, y C9 en estos condroblastos humanos no están activados en estas células mesenquimales benignas humanas (condroblasto), lo que es consistente en los 4 análisis diferentes Gene de Affymetrix realizados. Esto se corresponde globalmente con mi teoría postulada acerca de la diferencia a este respecto en células benignas tales como, por ejemplo, células mesenquimales, cuando se comparan estos tipos de células benignas con glioma/glioblastoma.
Ejemplo 15:
Se incubaron células de glioma GFP de rata y células de glioma RG2 o GM1 de rata a una concentración de ~5.000 células en anti humano de conejo (anticuerpo anti humano que reacciona de manera cruzada con C1 IA de rata, o CRP de rata o mezcla de C1 IA de rata/CRP de rata) a 37 grados C durante 2 horas, después, las células se inyectaron en el lóbulo parietal derecho del cerebro (3-4 ratas en cada grupo). Las células se lavaron en tampón PBS pH 7,4 antes de la inyección, lo que es un procedimiento muy delicado (Universidad de Lund, Laboratorio Rausing; el estudio fue aprobado previamente por el comité ético apropiado en Suecia).
Las ratas se mantuvieron entonces en jaulas bajo 24 horas de observación por personal cualificado. Cuando las ratas desarrollaron los síntomas clásicos de tumor de cerebro con síntomas clínicamente de deterioro, incluyendo síntomas neurológicos, las ratas se sometieron a eutanasia y se indicó el número de días de supervivencia hasta la enfermedad.
Los cerebros se retiraron para estudios futuros. El objetivo de este estudio fue principalmente identificar si los anticuerpos presentes después de la inyección de células de glioma tratadas en el cerebro de las ratas se retendrían. Sin embargo, pareció haber signos de alguna prolongación de la supervivencia en las ratas tratadas frente a las ratas que recibieron 5.000 células de glioma de rata no tratadas.
Debido a que los anticuerpos se producen en conejos, es decir, una especie diferente, es posible que las inmunoglobulinas de conejo xenogénicas puedan inducir eventualmente una reacción inmune limitada y de esta manera pueden ser capaces de inducir una reacción inmune innata debido a la reacción xenogénica en la rata. Así, la pequeña prolongación de la supervivencia en las ratas tratadas con anticuerpo frente a las no tratadas puede inducir una reacción del complemento, porque las células preincubadas estaban recubiertas con anti C1 IA y anti CRP, lo que permitiría entonces que el sistema del complemento se activara. Algunas de las células recubiertas inyectadas en la rata pueden ser así capaces de inducir el sistema del complemento de las ratas. Por lo tanto, la preincubación de las células gliales inyectadas en las ratas puede sugerir que es posible desbloquear el recubrimiento del inhibidor de C1 (C1 IA) en las células y desbloquear el bloqueo de CRP en el C3b mediante el bloque de otra forma natural observado por CRP a través de su unión al Factor H y siguiendo el bloqueo de C3b.
Así, hay una indicación de una supervivencia prolongada en los animales que recibieron células gliales que se petrataron con anti C1 IA y CRP, como se muestra por una prolongación ligeramente significativa de la vida cuando se compara con las ratas que recibieron células gliales no tratadas, con un valor p= 0,3.
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen a la proteína C reactiva humana (anti-CRP) para uso en el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas, inhibiendo el crecimiento del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas y/o inhibiendo la proliferación del cáncer seleccionado del grupo que consiste en glioblastomas, oligodendroglioma y astrocitomas en un individuo.
2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en donde el uno o más anti-CRP es IgG anti-CRP o IgM anti-CRP y en donde la una o más IgG anti-CRP se selecciona del grupo que consiste en IgG1 anti-CRP, IgG2 anti-CRP, IgG3 anti-CRP, IgG4 anti-CRP y mezclas de las mismas.
3. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende además, como el ingrediente activo, uno o más anticuerpos que se unen al inactivador de 1 del complemento humano (anti-C1 IA) y/o uno o más anticuerpos que se unen al componente 4 del complemento humano (anti-C4) y un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
4. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde: - el uno o más anti-C1 IA es IgG anti-C1 IA y/o IgM anti-C1 IA y en donde la una o más IgG anti-C1 IA se selecciona del grupo que consiste en IgG1 anti-C1 IA, IgG2 anti-C1 IA, IgG3 anti-C1 IA, IgG4 anti-C1 IA y mezclas de los mismos, y
- el uno o más anti-C4 es IgG anti-C4 y/o IgM anti-C4 y en donde la una o más IgG anti-C4 se selecciona del grupo que consiste en IgG1 anti-C4, IgG2 anti-C4, IgG3 anti-C4, IgG4 anti-C4 y mezclas de los mismos.
5. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el uno o más anticuerpos se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo heteroquimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo oligoclonal.
6. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en donde la CRP humana comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.
7. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 3, en donde el C1 IA humano comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
8. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 3, en donde el C4 humano comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
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