CN101466736B - 靶向组织蛋白酶s的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑制化疗诱导的肿瘤细胞表面组织蛋白酶S上调的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶S抑制剂到所述细胞。也提供了一种含有抗组织蛋白酶S的抗体的疗法，具体而言所述抗组织蛋白酶S的抗体不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性然而却抑制血管生成，以及提供了一种含有组织蛋白酶S抑制剂和治疗剂的联合治疗。

Description

靶向组织蛋白酶S的治疗
技术领域
本申请涉及治疗肿瘤性疾病的方法以及用于这种治疗的组合物。具体而言，其涉及用于治疗癌症的基于抗体的治疗，以及用于抵抗肿瘤细胞对于化疗的防御机制的联合治疗。 
背景技术
蛋白酶是一大组蛋白质，其占所有基因产物的大约2％(Rawlings andBarrett，1999)。蛋白酶催化肽键水解而因此对于所有细胞和生物体的正常功能是重要的。蛋白水解加工事件(event)在广泛的细胞进程、包括骨形成、创伤愈合、血管生成和细胞凋亡中具有重要性。 
最初认为溶酶体半胱氨酸蛋白酶是在溶酶体中负责蛋白质非选择性降解的酶。现在已知它们负责许多重要的细胞进程，在细胞凋亡、抗原递呈、血凝固、消化、激素原加工和细胞外基质重建中发挥作用(Chapman等，1997)。 
组织蛋白酶S(Cat S)是溶酶体半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的成员。截至目前，已鉴定了11种人组织蛋白酶，然而仍需测定每一种的具体体内作用(Katunuma等，2003)。组织蛋白酶B、L、H、F、O、X和C在大多数细胞中表达，提示在调节蛋白质转换中可能发挥作用，而组织蛋白酶S、K、W和V局限于特定的细胞和组织，指示其可能具有更特殊的作用(Kos等，2001；Berdowska，2004，Clinica Chimica Acta.2004；342：41-69)。 
Cat S最初从牛淋巴结和脾以及从人巨噬细胞cDNA文库克隆的人类形式中鉴定(Shi等，J Biol Chem.1992；267：7258-7262)。编码Cat S的基 因位于人染色体1q21上。由Cat S基因编码的996碱基对转录物最初翻译成具有37.5kDa分子量的未加工前体蛋白。所述未加工蛋白主要由331个氨基酸组成：15个氨基酸的信号肽、99个氨基酸的前肽序列和217个氨基酸的肽。Cat S最初与信号肽一起表达，进入内质网腔后所述信号肽被除去。前肽序列结合到蛋白酶活性位点，使其失活直到它被运输到酸性内涵体间隔，之后除去前肽序列，并且激活蛋白酶(Baker等，2003 Protein ExprPurif.28，93-101)。 
通过负载抗原前切割恒定链，Cat S被鉴定为在主要组织相容性复合物II类(MHC-II)中介导抗原递呈的关键酶。研究显示Cat S缺陷型小鼠通过APC递呈外源蛋白的能力受损(Nakagawa等，Immunity.1999；10：207-217)。Cat S在加工恒定链Ii中的特异性，允许Cat S在治疗例如哮喘和自身免疫性疾病等病症中，作为特异性的治疗靶点(Chapman等，1997)。 
Cat S的病理关联性
蛋白酶控制的改变经常成为许多人类病理过程的基础。溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶S失控的表达(deregulated expression)和活性，与一系列病症相关联，所述病症包括神经退化疾病、自身免疫性疾病和某些恶性肿瘤。 
Cat S上调与几种神经退化疾病相关联。它被认为在淀粉样前体蛋白(APP)里产生β肽(Aβ)中发挥作用(Munger等，Biochem.J.1995；311：299-305)并且显示它的表达在阿尔茨海默氏病和唐氏综合征中上调(Lemere等，1995)。通过Cat S降解髓磷脂碱蛋白(一种潜在自身抗原，牵涉于MS发病机理中(Beck等，2001，Eur.J.Immunol.2001；31：3726-3736))的能力，Cat S在多发性硬化症中也可发挥作用，在Creutzfeldt-Jakob病(CJD)患者中已显示Cat S表达增加超过4倍(Baker等，2002)。 
据报道血管成形术后组织蛋白酶S在动脉粥样硬化和再狭窄中过度表达(Cheng等，Am J Pathology，2006，168：685-694)。在这些病症中，据报道Cat S与整联蛋白ανβ3一起集中作为血管平滑肌细胞表面的受体。 
血管生成、微血管系统的发展是许多正常生理过程，例如正常发育和 创伤愈合内的必需的过程。血管生成的特征在于促进上皮细胞形成原始血管，其中一种不明确的复合相互作用存在于内皮细胞、周围的微环境和一系列促-和抗-血管生成因子之间。然而，不受控或不当的血管生成被认为是一系列广泛疾病、包括肿瘤发展和眼部疾病的病理学的根本因素。 
Cat S与血管生成的联系最初显示在体外使用的Cat S缺陷型内皮细胞中(Shi等，2003)。已显示微血管内皮细胞(EC)分泌蛋白酶，并且允许其穿透血管基底膜以及间隙的细胞外基质。用炎性细胞因子或血管生成因子处理培养的EC，刺激了Cat S的表达，并且它的抑制减少了微管形成。与野生型对照相比，Cat S-/-小鼠在创伤修复期显示缺陷的微血管发育(Shi等，2003)。 
Cat S在血管生成和肿瘤发展中的作用的进一步检验，在用于胰岛细胞癌的转基因小鼠模型中证明。已发现Cat S-/-小鼠与Cat S+/+对照小鼠相比形成明显较小的肿瘤和较少的血管生成胰岛(Gocheva等，2006)。洞察支撑这种表型的分子机制，其随后由下述证据提供：Cat S能切割和失活抗-血管生成肽并且促进有活性的前-血管生成片段(pro-angiogenic fragment)的产生(Wang等，2006)。 
在特殊的恶性肿瘤中也研究了Cat S的作用。与正常组织相比，在肺部肿瘤和前列腺癌切片中显示了Cat S的表达明显较高(Kos等，2001，Fernandez等，2001)，这因而提示Cat S可能在肿瘤侵袭和疾病发展中发挥作用。 
最近在Cat S方面的研究证明了它在人类星形细胞瘤中的表达的重要性(Flannery等，2003)。免疫组织化学分析显示了来源于WHO I到IV级的一组星形细胞瘤活检样品中Cat S的表达，但是在正常的星形细胞、神经元、少突胶质细胞和内皮细胞中无表达。在IV级肿瘤中Cat S表达出现最大值，并且在由IV级肿瘤衍生的培养物中胞外活性水平最高。 
已显示Cat S在降解例如层粘连蛋白、胶原、弹力蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖等ECM大分子中具有活性(Liuzzo等，1999)。使用U251MG IV级恶性胶质瘤细胞系的侵袭测定，在Cat S抑制剂LHVS29存在时显示侵袭下降61％(Flannery等，2003)。
特异性靶向Cat S的抑制剂的产生有作为治疗剂的潜力，用于缓解与这种蛋白酶活性有关的症状。 
在肿瘤发展中异常的细胞外半胱氨酸组织蛋白酶活性的牵涉，尤其成为研究者的焦点。这些溶酶体酶中的每一种都牵涉于各种肿瘤的发展中，认为在肿瘤细胞中它们的异常高分泌导致细胞外基质(ECM)的降解。这种ECM组分(例如弹力蛋白和胶原)的异常破坏加速了这些异常细胞对周围正常组织的渗透和侵入。此外，在血管生成和其他分子加工过程中的作用也归因于不当的组织蛋白酶的活性(Lah和Kos，1998 Biol Chem..379，125-30；Folkman和Ingber，1992；Fernandez等，2001)。 
大量研究集中在产生这种细胞外蛋白水解活性破坏性增加的根本机制上。组织蛋白酶被认为包括在ECM的降解过程中，直接通过它们的能力降解ECM组分例如层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原，或者间接通过激活蛋白水解级联中其他的蛋白酶进行(Koblinski等，2000；Rao等，2003)。 
Cat S的抑制
当蛋白酶过度表达时，治疗策略就集中在开发用于阻断这些酶活性的抑制剂。针对组织蛋白酶的特异性小分子抑制剂，由于选择性和特异性问题其产生在过去证明是困难的。二肽α-酮-β-醛作为针对Cat S的有效可逆抑制剂由Walker等开发，具有抑制Cat B和L的能力，虽然以较低效力(Walker等，Biochem.Biophys.Res.Comm.2000；75：401-405)，并且CatS抑制剂4-吗啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜(4-Morpholineurea-Leu-HomoPhe-vinylsulphone)(LHVS)当以较高浓度使用时也显示能抑制其他的组织蛋白酶(Palmer等，J.Med.Chem.1995；38：3193-3196)。 
已开发了广泛的抗肿瘤剂用于治疗癌症。虽然这些化合物中有许多已成功用于治疗策略，然而在许多情况下特定的治疗方案不会产生肿瘤的完全清除，或者仅是暂时地清除。因此这就非常需要开发新的癌症疗法和治疗方案。
发明概述 
如本文所描述，本发明人意外地发现组织蛋白酶S(Cat S)能在肿瘤细胞系的细胞表面发现。当采用Cat S单克隆抗体作为同种型对照时，在不相关的肿瘤治疗研究中本发明人发现肿瘤细胞以抗体阳性染色。 
本发明的发明人这个惊奇的发现，与本领域通常所执的观念相反：这种分子局限于肿瘤细胞的溶酶体的内部或者从这种细胞分泌；位于肿瘤细胞的细胞表面的组织蛋白酶S，提供了一种在细胞群体中鉴定肿瘤细胞的方法。 
相应地，在本发明的第一方面，提供了一种在细胞群体中鉴定肿瘤细胞的方法，所述方法包括使对于组织蛋白酶S具有结合特异性的配体与所述细胞群体接触并且确定配体与所述群体中细胞的结合存在与否，其中结合指示所述细胞群体内肿瘤细胞的存在。 
本发明第一方面的方法可以在体外执行。在另一个实施方式中，所述方法在体内执行。 
本发明也能采用细胞表面的Cat S作为生物标记，用于抗体递送的药物结合物。通过递送前体药物到细胞中能进一步地采用这种策略，所述前体药物被Cat S的酶活性特异性活化。 
在本发明的第二方面，提供了组织蛋白酶S作为用于肿瘤细胞的生物标记的用途。 
而且，本发明发明人发现用化疗剂治疗肿瘤衍生的细胞系，导致位于细胞表面的组织蛋白酶S增加。这暗示了化疗能因此结果相反地促进了ECM的降解，增加了异常细胞的侵袭性质。对于用此类化疗来治疗患者预期的结果，这种作用会有严重影响。 
然而，现有化疗剂的效力能通过靶向这种细胞表面的Cat S而改善。Cat S的抑制剂，例如小分子、肽/蛋白质或抗体，能与化疗剂联合使用以确保化疗不导致高侵袭性细胞亚群的产生。 
因此，在本发明的第三方面，提供了一种抑制化疗诱导的肿瘤细胞表面组织蛋白酶S上调的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶S抑制剂到所 述细胞。 
在本发明的第四方面提供了一种治疗肿瘤性疾病的方法，其包括同时、连续或单独施用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂。 
在本发明的第五方面提供了组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂在制备通过同时、连续或单独施用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂而用于治疗肿瘤性疾病的联合治疗的药物中的用途。 
在本发明的第六方面提供了一种药物组合物，其包括组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂。 
在本发明的一个实施方式中，组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂以其产生协同效应的浓度提供。 
如实施例中所描述，引起组织蛋白酶S上调的化疗剂不仅局限于一类抗肿瘤剂，而且存在于通常的许多或所有种类中。因此本发明的方法可用于涉及任何种类化疗剂的治疗方案。例如，可以用于本发明的化疗剂包括基于铂的抗肿瘤剂、抗代谢药、核苷类似物、胸苷酸合成酶抑制剂或拓扑异构酶抑制剂。 
在一个实施方式中，所述化疗剂是基于铂的抗肿瘤剂，例如顺铂或奥沙利铂。 
在另一个特定的实施方式中，所述化疗剂是胸苷酸合成酶抑制剂，例如5-FU。 
在另一个特定的实施方式中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂，例如CPT-11。 
本发明可以使用任何适合的组织蛋白酶S抑制剂。这种抑制剂例如可以是小分子抑制剂、肽或抗体、或者编码所述肽或抗体的核酸分子。在一个实施方式中，所述组织蛋白酶S抑制剂是小分子抑制剂，例如二肽α-酮-β-醛或者4-吗啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜(LHVS)。在另一个实施方式中，所述组织蛋白酶S抑制剂是抗体分子，例如抗体或抗体片段。
如本申请人的共同待决的国际专利申请(WO2006/109045，其要求GB0507219.4和GB0507272.3的优先权)所详述，本发明人鉴定了新种类的组织蛋白酶S抗体，所述抗体具有有效的抗蛋白水解活性。而且，已显示所述抗体对于肿瘤侵袭和血管生成具有明显的抑制作用。所述种类由单克隆抗体1E11举例说明，并且本发明人已鉴定了所述抗体的VH和VL区以及CDR。这是第一次证明组织蛋白酶S特异性抗体直接抑制组织蛋白酶S的蛋白酶活性，而且独特地能使这种抗体用作有活性的治疗剂，广泛地应用于从癌症治疗到抗炎剂的应用，具有高的特异性和低的毒性。 
相应地，在本发明的一个实施方式中，组织蛋白酶S抑制剂是抗体分子，其结合组织蛋白酶S并且抑制其蛋白水解活性。任何能够抑制组织蛋白酶S的蛋白水解效应的抗体分子，均可以用于本发明的这个方面。 
在本发明的一个实施方式中，抗体分子包括抗原结合区域，其包括至少一种具有选自由Seq ID No：1、Seq ID No：2和Seq ID No：3组成的组的氨基酸序列的CDR，和/或至少一种具有由Seq ID No：4、Seq ID No：5和Seq ID No：6组成的氨基酸序列的CDR。 
相应于SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列如下： 
Seq ID No：1：
SYDMS 
Seq ID No：2：
YITTGGVNTYYPDTVKG 
Seq ID No：3
HSYFDY 
Seq ID No：4：
RSSQSLVHSNGNTYLH 
Seq ID No：5：
KVSNRFS 
Seq ID No：6：
SQTTHVPPT 
在一个实施方式中，抗体分子包括抗原结合区域，其包括至少一种、例如至少2种或全部3种具有选自由Seq ID No：1、Seq ID No：2和Seq IDNo：3或其变体组成的组的氨基酸序列的CDR，以及包括至少一种、例如至少2种、例如全部3种具有选自由Seq ID No：4、Seq ID No：5和Seq IDNo：6或其变体组成的组的氨基酸序列的CDR。 
在另一个实施方式中，抗体分子包括抗原结合区域，其包括至少一种具有选自由Seq ID No：1、Seq ID No：2和Seq ID No：3组成的组的氨基酸序列的CDR，和/或至少一种具有选自由Seq ID No：4、Seq ID No：5和SeqID No：6组成的组的氨基酸序列的CDR。 
在一个特定的实施方式中，抗体分子包括CDR，所述CDR具有SEQID No：5或其变体的氨基酸序列，和/或所述CDR具有SEQ ID No：6或其变体的氨基酸序列。 
在一个实施方式中，抗体分子包括抗体VH区或抗体VL区，或其两者。 
在一个实施方式中，抗体分子含有抗体VH区，其包括至少一种、例如2种或3种具有选自由Seq ID No：1、Seq ID No：2和Seq ID No：3组成的组的氨基酸序列的CDR，和/或含有抗体VL区，其包括至少一种、例如2种或3种具有由Seq ID No：4、Seq ID No：5和SeqIDNo：6组成的氨基酸序列的CDR。 
在一个优选的实施方式中，抗体VL区包括Seq ID No：8的氨基酸序列，和/或抗体VH区包括Seq ID No：7的氨基酸序列。 
Seq ID No：7：
VQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYITTGGVNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSYFDYWGQGTTVTVSS 
Seq ID No：8：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKP GQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPPTFGSGTKLEIKR 
抗体分子可以是抗体，例如完整抗体。 
在一个替代的实施方式中，抗体分子可以是抗体片段例如scFv。 
本发明可以使用的进一步的抗体分子包括，含有至少一种例如1种、2种或3种CDR的抗体分子，所述CDR具有选自由Seq ID No：1、Seq IDNo：2和Seq ID No：3组成的组的氨基酸序列，和/或含有至少一种例如1种、2种或3种CDR的抗体分子，所述CDR具有由Seq ID No：4、Seq IDNo：5和Seq ID No：6组成的氨基酸序列，其中在至少一种CDR中进行5或更少，例如4、3、2或1个氨基酸置换，而且其中所述抗体分子保持抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性的能力。 
在本发明的一个实施方式中，用于本发明的抗体分子具有抑制肿瘤细胞侵袭的能力。 
在另一个实施方式中，用于本发明的抗体分子具有抑制血管生成的能力。 
如上文描述，本发明人令人惊奇地显示，在肿瘤细胞中组织蛋白酶S位于所述细胞表面，而且在经受化疗剂的肿瘤细胞中，所述肿瘤细胞表面组织蛋白酶S的表达上调。这证明，以及能使用抗组织蛋白酶S的抗体来鉴定肿瘤细胞，并且能使用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂的联合治疗，也提示了抗组织蛋白酶S的抗体可以在缺乏化疗剂的情况下使用，以在肿瘤细胞中诱导ADCC。 
相应地，在本发明的第七方面，提供了一种诱导抗肿瘤细胞的、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的方法，所述方法包括施用结合组织蛋白酶S的、抗组织蛋白酶S的抗体分子到所述细胞。 
通过诱导ADCC可以杀死肿瘤细胞。因此在本发明的第八方面，提供一种杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包括施用结合组织蛋白酶S的、抗组织蛋白酶S的抗体分子到所述细胞。 
如果需要，本发明的第七和第八方面的方法可以在体外、体内或间接 体内执行。 
相应地，在本发明的第九方面，提供了一种在受治疗者中治疗肿瘤性疾病的方法，所述方法包括施用结合组织蛋白酶S的、抗组织蛋白酶S的抗体分子到所述受治疗者。 
在本发明的第十方面，提供了结合组织蛋白酶S的、抗组织蛋白酶S的抗体分子在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物中的用途。 
而且，组织蛋白酶S位于肿瘤细胞表面的证明提示了，为诱导抗肿瘤细胞的效应，结合组织蛋白酶S的抗体无需具有任何抗蛋白水解的活性。 
因此，在本发明的第七至第十方面任一方面的一个实施方式中，其抗体分子不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
在本发明的第七至第十方面任一方面的一个实施方式中，在缺乏另一种化疗剂的情况下施用抗组织蛋白酶S的抗体分子，即与在本发明的第一至第六方面任一方面的方法相反。 
如上文描述，在本发明的方法中可以使用不抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的、抗组织蛋白酶S的抗体分子。如在实施例中描述的，本发明人所证明的这种抗组织蛋白酶S的抗体分子的抗血管生成效应，进一步支持了这种抗体分子的治疗用途。 
具体地，本发明人首次显示了对于组织蛋白酶S具有特异性、但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性的抗体，然而其充当血管生成的有效抑制剂。这尤其令本发明人感到惊奇，因为如PCT/GB2006/001314中描述，据信对于其抵抗组织蛋白酶S活性失调的病理效应，抑制组织蛋白酶S蛋白水解效应是所需的策略。此外，虽然使用抗体来隔离(sequester)蛋白质被建议为对于一些蛋白质的治疗策略，例如VEGF，然而这种策略至今为止对于在治疗与组织蛋白酶S活性有关的疾病中被认为是不可行的。 
相应地，在本发明的第十一方面，提供了一种在有相应治疗需要的患者中治疗与血管生成相关的病症的方法，所述方法包括施用抗体分子或编码所述抗体分子的核酸到所述患者，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。
依照本发明的第十二方面，提供了抗体分子或编码所述抗体分子的核酸在制备用于治疗与血管生成有关的病症的药物中的用途，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
本发明的这些方面可以用于治疗其中血管生成对病理有影响的任何疾病或病症。所述病症和疾病包括但不限于癌症、炎性病症例如多发性肌炎(inflammatory muscle disease)、类风湿性关节炎和哮喘、眼部疾病以及动脉粥样硬化。 
然而，特异性地结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性、然而却抑制血管生成的抗体分子的证明，使得这种抗体分子能用于治疗与组织蛋白酶S有关的其他病症。 
在第十三方面，提供了一种在有相应治疗需要的患者中，治疗与活性例如组织蛋白酶S异常活性有关的病症的方法，所述方法包括施用抗体分子或编码所述抗体分子的核酸，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
在第十四方面也提供了抗体分子或编码所述抗体分子的核酸在制备用于治疗与组织蛋白酶S异常活性有关的病症的药物中的用途，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
除了治疗肿瘤之外，本发明可以用于治疗与组织蛋白酶S异常活性有关的任何病症，具体而言是与组织蛋白酶S异常表达有关的病症。在一个实施方式中，如果组织蛋白酶S的蛋白水解活性高于一种病症不存在时的活性，例如与所述病症不存在时的活性相比，其中的蛋白水解活性至少高20％，例如至少高50％，例如至少高100％，至少高200％或至少高500％，那么这种病症就被认为与组织蛋白酶S异常活性有关。在一个实施方式中，如果组织蛋白酶S的表达高于一种病症不存在时的表达，例如与所述病症不存在时的表达相比，其中的表达是至少高20％，例如至少高50％，例如至少高100％，至少高200％或至少高500％，那么这种病症就被认为与组织蛋白酶S的异常表达有关。
例如，可使用本发明的病症包括但不限于，神经退化疾病例如阿尔茨海默氏病和多发性硬化症，自身免疫性疾病，和与过量、失控或不当的血管生成有关的其他疾病。 
在本发明第十一至第十四方面的任一方面中，可以使用任何适合的抗组织蛋白酶S的抗体分子，其不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性但其抑制血管生成。 
这种抗体分子和编码这种抗体分子的核酸，构成独立的本发明的第十五方面。 
在本发明第十五方面的一个实施方式中，抗体分子是1E4抗体或其片段或变体。这种片段和变体优选地保持抑制血管生成的能力而不具有抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性的能力。 
在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体分子和用于本发明的抗体分子具有抑制肿瘤细胞侵袭的能力。 
依照本发明的第十六方面，提供了用于药物的抗体分子或编码所述抗体分子的核酸，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
本发明的第十七方面也提供了抗体分子或编码所述抗体分子的核酸在制备用于治疗与组织蛋白酶S活性有关的病症的药物中的用途，其中在制备用于治疗与组织蛋白酶S活性有关的病症的药物中，所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
本发明的另一个方面是一种药物组合物，其包括抗体分子或编码所述抗体分子的核酸，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
进一步地，药物组合物包括VEGF的抑制剂。 
进一步地，抑制剂是抗VEGF抗体。 
进一步地，药物组合物包括EGF受体的抑制剂。 
进一步地，抑制剂是抗EGF受体的抗体。 
本发明的另一个方面是一种抑制肿瘤细胞表面组织蛋白酶S表达的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶S抑制剂。 
本发明的另一个方面是一种在一组细胞、组织或器官中抑制血管生成的方法，所述方法包括施用抗体分子或编码所述抗体分子的核酸到所述细胞、组织或器官，其中所述抗体分子特异性结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。 
除非上下文另有说明，本发明每个方面优选的特征，可以视作是根据情况对其他每个方面作适当变动的特征。 
详述 
组织蛋白酶S抑制剂 
如上文描述，本发明可以使用任何适合的组织蛋白酶S抑制剂。这种抑制剂例如可以是小分子药物，例如二肽α-酮-β-醛。所述二肽α-酮-β-醛作为针对Cat S的有效可逆抑制剂由Walker等开发，并且显示抑制Cat B和L，虽然以较低效力(Walker等，2000)。可用于本发明的另一个组织蛋白酶S小分子抑制剂是4-吗啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜(LHVS)。可以使用的其他的组织蛋白酶S抑制剂例如是Thurmond等，J Med Chem.2004Sep23；47(20)：4799-801描述的非肽类组织蛋白酶S抑制剂。 
在另一个实施方式中，组织蛋白酶S抑制剂是抗体分子，例如抗体或抗体片段。 
在本发明的范围内，“抗体”应理解为指的是免疫球蛋白或其部分，或者任何含有结合区域的多肽，所述结合区域是抗体结合区域或者与其同源的区域。抗体包括但不限于单克隆、多克隆、单特异性和多特异性抗体及其片段，以及含有融合到另一个多肽的免疫球蛋白结合区域的嵌合抗体。 
完整(全)抗体包括由重链和轻链组成的免疫球蛋白分子，其中每条链均带有可变区，分别指定为VH和VL。可变区由3个互补决定区(CDR，也称为超变区)和4个框架区(FR)或支架组成。CDR形成与抗原分子互补的立体结构并且决定抗体的特异性。 
抗体片段可以保持完整抗体的结合能力并且可以用于替代完整抗体。相应地，除非上下文另有说明，出于本发明的目的，术语“抗体”应理解为包括抗体片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、dAb和Fv片段、scFv、双特异性scFv、双抗体、线性抗体(linear antibody)(参阅美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng 8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。 
Fab片段由完整的L链(VL和CL)以及VH和CH1组成。Fab′片段不同于Fab片段，其在CH1区的羧基端含有额外少量的残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab′)2片段包括两个二硫键连接的Fab 片段。 
Fd片段由VH和CH1区组成。 
Fv片段由单链抗体(single antibody)的VL和VH区组成。 
单链Fv片段是含有由连接体连接的VH和VL区的抗体片段，其能使scFv形成抗原结合位点(参阅Pluckthun在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体药理学)中的记载，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994))。 
双抗体是小的抗体片段，其通过用短的连接体(约5-10个残基)构建scFv片段(参阅前段)而制备，所述短的连接体在VH和VL区之间，这样产生了链间而不是链内配对的V区，形成多价体片段，即含有2个抗原结合位点的片段(参阅例如EP 404 097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))。 
片段进一步包括单个的CDR。 
在本发明的一个实施方式中，组织蛋白酶S抑制剂是抗体分子。在本发明的一些实施方式中，抗体分子是抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的抗体分子。这种适当的结合剂的一个例子是如本文描述的抗体1E11，而且在本申请人的共同待决的国际专利申请WO2006/109045中，要求GB0507219.4和GB0507272.3的优先权。本发明人鉴定了完整抗体1E11的VH和VL区的氨基酸序列。此外，本发明人鉴定了这种抗体的6种CDR(Seq IDNo：1、2、3、4、5和6)。 
如上文描述，用于本发明第一至第十方面任一方面的抗体分子，不局限于含有1E11抗体的特异性序列的抗体，和含有本文所公开序列的VH、VL和CDR，也延伸至例如抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的任何其他抗体。例如1E11的变体，其保持抑制Cat S的蛋白水解活性的能力，它可用于本发明的一些实施方式。因此，1E11抗体的CDR氨基酸序列(其中一个或多个氨基酸残基被修饰)也可以用作CDR序列。CDR变体的氨基酸序列中修饰的氨基酸残基，在整个CDR内优选地是30％或更少，更优选20％或更少，最优选10％或更少。这种变体可以使用本申请所教导内容以 及本领域已知技术来提供。CDR可以在含有抗体重链或轻链序列或其部分的框架结构中携带。优选地，这种CDR位于相应于天然存在的VH和VL区的CDR位置的位置。这种CDR的位置可通过如Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫重要的蛋白序列)，US Dept of Healthand Human Services，Public Health Service，Nat′lInst.of Health，NIH公布号第91-3242，1991以及在线www.kabatdatabase.comhttp://immuno.bme.nwu.edu描述的方式测定。 
此外，可以对可变区的框架区进行可选择地或另外的修饰。框架区的这种变化可以改善稳定性并且降低抗体的免疫原性。 
然而，如上文描述以及如实施例所显示，本发明人还显示了使用结合组织蛋白酶S但不抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的抗体分子，可以获得抗血管生成效应。这种抗体分子可以用于本发明的任一方面。 
用于本发明的抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与得自特殊物种的抗体或属于特殊抗体种类或亚类的抗体的相应序列一致或同源，而链的其余部分与得自另一个物种的抗体或属于另一个抗体种类或亚类的抗体的相应序列一致或同源，以及这种抗体的片段，只要其显示所需的生物活性(参阅美国专利第4,816,567号；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文所感兴趣的嵌合抗体包括“灵长源”抗体，其包括得自非人类灵长动物(例如旧大陆猴，猿等)的可变区抗原结合序列，以及人类恒定区序列。 
用于本发明的抗体分子可以以任何适合的方法天然地或合成地产生。这些方法可包括例如传统的杂交瘤技术(Kohler和Milstein(1975)Nature，256:495-499)，重组DNA技术(参阅例如美国专利第4,816,567号)，或者使用抗体文库的噬菌体展示技术(参阅例如Clackson等.(1991)Nature，352：624-628和Marks等.(1992)Bio/Technology，10：779-783)。其他的抗体产生技术在Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，编辑Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory，1999中描述。 
为引起能够结合抗原的淋巴细胞的产生，传统的杂交瘤技术通常包括用抗原免疫小鼠或其他动物。分离淋巴细胞并且与骨髓瘤细胞系融合而形 成杂交瘤细胞，其然后在抑制亲本骨髓瘤细胞但允许产生抗体的细胞生长的条件下培养。杂交瘤可以经受遗传突变，其会或不会改变所产生抗体的结合特异性。使用本领域已知的技术能产生合成的抗体(参阅例如，Knappik等，J.Mol.Biol.(2000)296，57-86和Krebs等，J.Immunol.Meth.(2001)215467-84)。 
可以使用任何适合的本领域已知技术对结合成分的VH、VL或CDR进行修饰，或者实际上在FR中进行。例如，通过引入CDR例如CDR3到缺乏这种CDR的VH或VL区，可以产生可变的VH和/或VL区。Marks等.(1992)Bio/Technology，10：779-783描述了一种改组技术，其中产生了缺乏CDR3的VH可变区的所有组成成分，然后将其与特定抗体的CDR3结合而产生新的VH区。使用类似的技术可以产生含有本发明的CDR衍生序列的新VH和VL区。 
相应地，用于本发明的抗体分子可以通过一种方法产生，其包括：(a)提供编码可变区核酸的初始所有组成成分，其中所述可变区包括将被替代的CDR1、CDR2或CDR3，或者所述核酸缺乏对于这种CDR的编码区；(b)将所述所有组成成分与供体核酸结合，所述供体核酸编码含有如SeqID No：1、2、3、4、5或6显示序列的氨基酸序列，使得供体核酸插入到所有组成成分中的CDR区，以提供编码可变区核酸的所有组成成分产物；(c)表达所有组成成分产物的核酸；(d)选择对于Cat S特异的特异性抗原结合片段；以及(e)回收特异性抗原结合片段或编码其的核酸。本方法可以包括任选的步骤：测试抗体分子对于抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的能力。 
用于产生本发明抗体的可选择的技术可以包括，编码VH或VL区基因的随机诱变，使用例如易错PCR(参阅Gram等，1992，PN.A.S.893576-3580)。另外地或可选择地，为了诱变可以靶向CDR，例如使用由Barbas等1991 PNAS 3809-3813和Scier 1996J Mol Biol 263 551-567中描述的分子进化方法。 
可以测试所产生的这种变体、抗体和片段对于Cat S的结合，以及抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的能力。
如本文描述，本发明人证明了可以用于本发明一些方面中的抗体分子具有抗蛋白水解效应。此外如实施例中描述，也证明了抗侵袭和抗血管生成活性。因而这就能使用本发明的抗体分子作为有活性的治疗剂。用于本发明的抗体分子可以是“裸露的”抗体分子。“裸露的”抗体分子是没有与“有活性的治疗剂”结合的抗体分子。在本发明的范围内，“有活性的治疗剂”是分子或原子，其结合到抗体部分(包括抗体片段，CDR等)而产生结合物。这种“有活性的治疗剂”的例子包括药物、毒素、放射性同位素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物和染料等。 
免疫结合物 
在本发明的另一个实施方式中，用于本发明一些实施方式中的抗体分子可以是免疫结合物的形式，其包括结合到“有活性的治疗剂”的抗体片段。治疗剂可以是化疗剂或另一种分子。 
产生免疫结合物的方法在本领域内是广泛知晓的，例如参阅美国专利第5,057,313号，Shih等，Int.J.Cancer 41：832-839(1988)；Shih等，Int.J.Cancer 46：1101-1106(1990)，Wong，Chemistry Of Protein Conjugation AndCross-Linking(蛋白结合和交联化学)(CRC Press 1991)；Upeslacis等，＂Modification of Antibodies by Chemical Methods＂in Monoclonal Antibodies：Principles And Applications(单克隆抗体中“化学方法修饰抗体”：原理和应用)，Birch等(编辑)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，＂Productionand Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，＂in MonoclonalAntibodies：Production，Engineering And Clinical Application(单克隆抗体中“合成肽-衍生的抗体的产生和表征”：产生、工程化和临床应用)，Ritter等(编辑)，第60-84页(Cambridge University Press 1995)。 
在期望采用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂的联合的本发明的那些方面中，可以使用含有抗组织蛋白酶S的抗体和化疗剂的免疫结合物。 
这种免疫结合物会有许多超过传统治疗的益处。组织蛋白酶S位于肿瘤细胞的证明使得能使用这种免疫结合物来将化疗剂靶向肿瘤细胞。靶向的化疗剂可以具有其细胞毒作用。其次，如上文描述，已发现常规使用的化疗剂引起肿瘤细胞(如结肠直肠肿瘤细胞)的细胞表面组织蛋白酶S的 上调。通过采用抗组织蛋白酶S的抗体和化疗剂的免疫结合物，免疫结合物的组织蛋白酶S的抗体部分会预期抵抗这种作用。而且，免疫结合物的抗体部分在体内与化疗剂相比会预期具有较长的活性半衰期，并且因而可以抵抗结合化疗剂而引起的组织蛋白酶S上调的效应。 
抗组织蛋白酶S的抗体分子和化疗剂的免疫结合物，构成了本发明的另一个方面。在一个实施方式中，通过蛋白酶例如组织蛋白酶，抗体分子从化疗剂中可切割出来。 
用于本发明的抗体分子可以包括进一步的修饰。例如抗体能被糖基化、聚乙二醇化、或者连接到白蛋白或非蛋白质聚合物。抗体分子可以是免疫结合物的形式。 
使用任何适合的方法，可以检验药剂例如小分子或抗体抑制组织蛋白酶S蛋白水解活性的能力。例如可以使用荧光测定。在这种测定中，可以使用任何适合的荧光底物，例如Cbz-Phe-Arg-AMC。如果药剂具有抑制组织蛋白酶S的活性而且达到统计学显著的量的能力，则药剂被认为抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性。例如在一个实施方式中，用作组织蛋白酶S抑制剂的药剂，当与适当的对照抗体相比时能够抑制至少10％，例如具有至少25％、50％、70％、80％或90％的抑制活性。 
使用本领域已知的任何适合的侵袭测定可以检验药剂抑制肿瘤细胞侵袭的能力。例如，使用如本领域已知的修改的博伊登室可以检验这种能力。使用任何适合的肿瘤细胞系可以检验抗体分子，例如前列腺癌细胞系例如pC3，星形细胞瘤细胞系例如U251mg，结肠直肠癌细胞系例如HCT116或者乳腺癌细胞系例如MDA-MB-231或MCF7。如果药剂具有抑制侵袭达到统计学显著的量的能力，则可以认为药剂抑制肿瘤细胞的侵袭。例如，在一个实施方式中，用作组织蛋白酶S抑制剂的药剂，当与适当的对照抗体相比时能够抑制至少10％，例如至少25％、50％、70％、80％或90％的侵袭。 
使用本领域已知的任何适合的测定可以检验药剂抑制血管生成的能力。例如，使用测定部分中描述的和/或如实施例中描述的测定、例如基于基质胶的测定，可以检验这种能力。
在本发明的某些方面，例如在测定细胞群体中肿瘤细胞存在的测定中，或者在体内测定细胞存在的诊断技术中可以使用标记的抗体分子。可以使用的标记包括放射标记，酶标记例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，或者生物素。 
核酸 
用于本发明的核酸可包括DNA或RNA。其可以重组、合成或通过本领域可用的任何方法产生，包括使用标准技术的克隆。 
核酸可以插入到任何适当的载体中，例如病毒(例如痘苗病毒，腺病毒等)、杆状病毒；酵母载体、噬菌体、染色体、人工染色体、质粒或粘粒DNA。载体可以用于将核酸引入到原核或真核的宿主细胞中。 
用于操纵核酸，例如制备核酸构建体、诱变、序列测定、引入DNA到细胞中和基因表达和分析蛋白质的已知技术和方案的更多详细内容参阅，例如，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现有实验方案)，第5版，Ausubel等编辑，John Wiley和Sons，2005和，Molecular Cloning：a Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)：第3版Sambrook等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001。 
化疗剂 
如上文描述，在本发明的一些实施方式中，化疗剂可以用于例如与组织蛋白酶S抑制剂的联合治疗方案中。在这些实施方式中，在本发明中可以使用任何适合的化疗剂。例如可以使用的药剂包括抗代谢药、核苷类似物、胸苷酸合成酶抑制剂、铂细胞毒素剂或拓扑异构酶抑制剂。在本发明中可以使用的胸苷酸合成酶抑制剂的例子包括5-FU、MTA和TDX。在一个实施方式中，胸苷酸合成酶抑制剂是5-FU。可以使用的抗代谢药的例子是拓优得(tomudex)(TDX)。可以使用的铂细胞毒素剂的例子包括顺铂和奥沙利铂。在本发明的一个实施方式中，化疗剂是顺铂。在本发明中可以使用任何适合的拓扑异构酶抑制剂。可以使用的核苷类似物的例子包括但不限于吉西他滨和阿糖胞苷。 
在本发明的一个特定实施方式中，化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。在本 发明中可以使用任何适合的拓扑异构酶抑制剂。在一个特定实施方式中，拓扑异构酶抑制剂是拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱。在本发明中可以使用的适合的拓扑异构酶I抑制剂是伊诺替康(irenotecan)(CPT-11)或它的活性代谢物SN-38。通过稳定可逆的共价反应中间体(指切割或切割复合物)，CPT-11特异性地在细胞周期的S期发挥作用，并且也可以诱导G2-M细胞周期停滞。 
另外的或者代替上文引用特异性药剂的、在本发明中可以使用的化疗剂可以包括烷化剂；烷基磺酸盐；氮丙啶；乙撑亚胺；methylamelamines；氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)；抗代谢物；叶酸类似物；嘌呤类似物；嘧啶类似物；雄激素；抗肾上腺素；叶酸补充剂(folic acid replenisher)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elfomithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；花菱草碱(ionidamine)；米托胍腙；米托蒽醌。 
在本发明的一个特定实施方式中，化疗剂是氟嘧啶例如5-FU或其代谢物。5-FU用于治疗多种癌症，包括胃肠癌、乳腺癌和头颈癌。5-FU在细胞内转变为氟代一磷酸脱氧尿苷FdUMP，FdUMP与5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2THF)一起与胸苷酸合成酶(TS)形成稳定的三元复合物，产生酶的抑制。通过CH2THF，TS催化一磷酸脱氧尿苷(dUMP)的还原甲基化作用而产生一磷酸脱氧胸苷(dTMP)和二氢叶酸(Longley等Nat Rev Cancer，3：330-338，2003)。因为这种反应提供了仅有的细胞内新生dTMP的来源，因而它对于DNA复制和修复是重要的，TS抑制产生DNA的破坏。对于5-FU也描述了细胞毒的非-TS-靶向机制，例如错掺氟代核苷酸到DNA和RNA中(Longley等Nat Rev Cancer，3：330-338，2003)。 
在参考特异性化疗剂的情况下，应理解可以使用保持所述特异性药剂抗肿瘤活性的类似物，所述类似物包括生物活性的衍生物和其大体上等价物。 
治疗 
“治疗”包括对人类或非人类动物有益的任何方案。治疗可以是关于现 存的病症或可以是预防性的(预防治疗)。治疗可以包含治愈、缓解或预防效果。 
“治疗癌症”包括治疗由癌生长和/或血管化引起的病症，并且包括治疗肿瘤增殖或肿瘤。使用本发明能够治疗肿瘤的例子，例如肉瘤(包含成骨和软组织肉瘤)、癌(例如乳腺、肺、膀胱、甲状腺、前列腺、结肠、直肠、胰腺、胃、肝、子宫、前列腺、子宫颈和卵巢癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌)、淋巴瘤(包含Hodgkin和非Hodgkin淋巴瘤)、成神经细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、维尔姆斯瘤和白血病(包含急性成淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病)、星形细胞瘤、神经胶质瘤和视网膜成神经细胞瘤。 
在一个实施方式中，本发明可以用于治疗结肠直肠肿瘤。 
本发明可特别用于治疗现有癌症并且用于预防初次手术治疗后癌症的复发。 
药物组合物 
根据本发明并且依照本发明使用的药物组合物可包括，除了有效成分以外的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液稳定剂或本领域技术人员广泛知晓的其他物质(参阅例如，(Remington：The Science and Practice ofPharmacy(雷明登氏：药剂学原理和实践)，第21版，Gennaro AR等编辑.，Lippincott Williams & Wilkins，2005)。所述物质可包括缓冲剂例如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂；防腐剂；蛋白质例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白类；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物；螯合剂；张力调节剂(tonicifier)和表面活性剂。 
药物组合物也可含有一种或多种为治疗特殊适应症所需选择的另外的有效化合物，优选具有互补活性(complementary activity)，所述活性不会不利地影响本发明组合物的活性。例如，在治疗癌症中，在使用联合方案的情况下，除了组织蛋白酶S抑制剂之外(例如抗组织蛋白酶S的抗体分子和化疗剂)，制剂或试剂盒可包括另外的组分，例如第二种或另一种 组织蛋白酶S抑制剂，第二种或另一种化疗剂，或者靶向组织蛋白酶S之外的靶的抗体(例如靶向影响特殊癌症生长的生长因子)。 
有效成分(例如抗体分子和/或化疗剂)可经由微球、微囊脂质体(microcapsules liposome)和其他微粒递药系统给药。例如，如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊)，在胶体给药系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、毫微型颗粒和毫微型胶囊)或在粗乳状液中，有效成分可被包埋入所制备的微囊。关于更多详细内容，参阅Remington：the Science and PracticeofPharmacy(雷明登氏：药剂学原理和实践)，第21版，Gennaro AR等编辑.，Lippincott Williams & Wilkins，2005。 
持续释放制剂可用来递送活性剂。适合的持续释放制剂例子包括固体疏水聚合物(含有抗体)的半渗透基质，所述基质具有成形物品(shapedarticle)形式，例如膜、栓剂或微囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L谷氨酸乙酯共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解乳酸-羟乙酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。 
如上文描述的核酸也可用在治疗方法中。使用本领域任何适合的已知技术可将用于本发明的核酸递送到目的细胞中。使用体内或间接体内技术可将核酸(任选地包含在载体中)递送到患者的细胞中。对于体内技术，可使用病毒载体(例如腺病毒、单纯疱疹I型病毒或腺相关病毒)转染和基于脂质的体系(例如，用于脂质介导基因转移的有用脂质是DOTMA、DOPE和DC-胆固醇)(参阅例如，Anderson等，Science 256：808-813(1992).也可参阅WO 93/25673)。 
在间接体内技术中，把核酸引入到患者分离细胞中，将修饰过的细胞施用到患者，直接地或者例如被多孔膜包裹植入患者中(参阅例如美国专利第4,892,538和5,283,187号)。引入核酸到有活力细胞中的可用技术可包括使用逆转录病毒载体、脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀等方法。 
结合成分、药剂、产物或组合物可用局部方式施用到肿瘤位点或其他所需位点，或者可以以靶向肿瘤或其他细胞的方式递送。通过使用靶向系统例如抗体或细胞特异性配体，靶向治疗可用来更特异地递送活性剂到某些类型细胞中。多种原因期望实现靶向，例如如果药剂具有不可接受的毒性，或如果是非如此需要过高剂量，或如果是非如此不能进入靶细胞。 
试剂盒 
本发明进一步延伸至含有组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂的药物试剂盒，其通过同时、连续或单独施用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂而用于联合治疗，选择地含有用于(a)和(b)单独、连续或同时施用的说明书。 
剂量 
本发明的和用于本发明的组织蛋白酶S抑制剂、抗组织蛋白酶S的抗体和/或化疗剂，以适宜条件、以“治疗有效量”适当地施用到个体，这对于个体足以显示益处。实际给药方案取决于许多因素，包括被治疗的病症，其严重度、被治疗的患者、所使用的药剂，并由医师酌情处理。 
在联合治疗方案中采用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂的实施方式中，组织蛋白酶S抑制剂可以与化疗剂同时、单独或连续施用。在单独或连续施用的情况下，它们可以在任何适当的时间内，例如彼此在1、2、3、6、12、24、48或72小时内施用。在优选的实施方式中，它们彼此可以在6小时内，优选地在2小时内，更优选地在1小时内，最优选地在20分钟内施用。 
在联合治疗方案中在采用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂的一个实施方式中，以产生协同效应的剂量施用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂。即以增强比(potentiating ratio)施用。本发明范围内的术语“增强比”用于指示组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂以一种比例存在，使得它们联合的细胞毒活性高于单独组分的活性，或者高于基于单个组分活性的它们的联合而预期具有的加和活性。 
因此在增强比情况下，单个组分协同地发挥作用。 
使用许多方法可以定义协同效应。 
例如，使用如Romaneli(Cancer Chemother Pharmacol，41：385-390， 1998)修改的Kern方法(Cancer Res，48：117-121，1988)，协同效应可以定义为高于加和(unity)的RI。对于A和B的联合，RI可以计算为预期存活细胞(Se/定义为单独用药物A观察到的存活结果和单独用药物B观察到的存活结果)与观察到的存活细胞(Sobs)的比率(RI＝Sexp/Sobs)。 
协同效应可以随后定义为高于加和的RI。 
在另一个方法中，依照Chou和Talalay的方法(Adv Enzyme Regul，22：27-55，1984)通过计算合用指数(CI)可以测定协同效应。1、<1和>1的CI值分别指示累加效应、协同效应和反协同效应。 
在本发明的一个实施方式中，组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂以足以产生小于1、优选地小于0.85 CI的浓度存在。 
优选地，协同效应使用由Romaneli(1998a，b)修改的Kern方法被定义为高于加和的RI。对于A和B的联合，RI可以计算为预期存活细胞(Sep，定义为单独用药物A观察到的存活结果和单独用药物B观察到的存活结果)与观察到的存活细胞(Sobs)的比率(RI＝Se/Sobs)。协同效应可以随后定义为高于加和的RI。 
在本发明的一个实施方式中，所述组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂以足以产生高于1.5、例如高于2.0、例如高于2.25RI的浓度提供。 
在本发明的一个实施方式中，在用于治疗肿瘤细胞时，联合的药物因而产生了协同效应。 
测定 
对化疗剂响应而引起肿瘤细胞的细胞表面组织蛋白酶S上调的测定，使得能够提供检测化疗剂是否在患者组织中具有这种效应的测定。因此在本发明的另一个方面，提供了一种方法，其用于体外评估得自受治疗者的肿瘤细胞对化疗剂存在的应答，以预测在体内肿瘤细胞对用化疗剂治疗的应答，所述方法包括： 
(a)提供得自受治疗者的含有肿瘤细胞的体外样品； 
(b)将肿瘤细胞的所述样品的一部分接触所述化疗剂；
(c)对比所述细胞表面组织蛋白酶S的表达与未接触所述化疗剂的所述样品对照部分中的组织蛋白酶S的表达；其中在接触所述化疗剂的样品部分中增加的表达指示对于所述化疗剂具有敏感性。 
在本发明这个方面优选的实施方式中，接触所述化疗剂的样品的表达如果是未接触所述化疗剂的所述样品的对照部分中一种或多种基因的表达的至少3倍、优选地至少4倍、更优选地至少5倍、甚至更优选地至少7倍、仍旧更优选地至少10倍，最优选地至少12倍的话，那么表达就被认为是加强了。 
这种测定可以用于确定在具体患者中使用化疗剂和组织蛋白酶S抑制剂的联合治疗的适合性。 
这种方法可选择地或另外地用于监控疾病的发展，例如在不同时间使用活检样品。在这种实施方式中，是将组织蛋白酶S的表达与较早时间点(例如在之前的天、周或月)从相同组织获得的样品的表达比较，而不是将组织蛋白酶S的表达与未接触所述化疗剂的对照样品的表达比较。 
肿瘤或癌症的性质会决定用于本发明方法的样品的性质。样品可以是例如，得自肿瘤组织活检的样品、骨髓活检的样品或者循环肿瘤细胞(例如血)的样品。可选择地，例如在肿瘤是胃肠道肿瘤情况下，肿瘤细胞可以从粪便样品中分离。肿瘤细胞的其他来源可以包括血浆、血清、脑脊液、尿、间隙液和腹水等。 
例如，实体瘤可以在含有抗生素的完全组织培养基中收集。 
细胞可以从肿瘤样品中手工挑出，或者在需要的情况下，通过与胶原酶/DNA酶共同孵育而酶促解聚，并且悬浮在含有例如人或动物血清的适当的培养基中。 
在其他的实施方式中，可以分离活检样品并且冷冻或固定在例如福尔马林的固定剂中。然后在后续阶段可以检验样品的基因表达水平。 
在本发明的一些实施方式中，可能期望检验组织蛋白酶S的抗体分子或联合治疗对于细胞活力、增殖或血管生成的效应。使用本领域任何已知的方法可以检验这些效应。一些适合的测定在实施例中描述。其他的包括：
细胞活力和增殖测定 
可以检验抗体对于肿瘤细胞的细胞毒和增殖作用，例如，如先前描述能检验对于U251mg星形细胞瘤细胞的作用。简单地说，细胞以每孔1 x 104细胞/200μl的终浓度加入96孔微量滴定板(Corning Costar)。加入适当浓度的单克隆抗体(100nM)或仅有载体的对照培养基。板分别在37℃和5％CO2条件孵育24、48、72和96小时。孵育后，加入10μl的10mg/ml MTT并且进一步在37℃和5％CO2条件孵育2小时。小心除去培养基并且将甲臜(formazan)结晶溶解在100μl/孔的DMSO中。按上文描述来测量吸光度并且结果以相对于每种仅有载体对照的细胞活力和增殖百分比表示。所有检验以4个重复进行。 
可以使用许多测定来研究分子对于血管生成的效应。在实施例中描述了主动脉环模型。其他的包括： 
创伤测定 
这种体外迁移是Ashton等描述方法(1999)的改进版。将HMEC-1铺板到载玻片单个室中并且过夜生长达到90％汇合。除去培养基并且创伤单细胞层。单细胞层用新鲜培养基重新补充并且加入所需量的抗体达到所需终浓度。 
直到创伤完全闭合才在固定时间点除去载玻片，然后在4％PBS缓冲的低聚甲醛中固定。“创伤”闭合的程度由中立的研究者通过显微镜来盲评(blindly assess)，并且在放大20倍(Olympus BX 50)情况下使用标定的目镜测微尺(1mm/100μm刻度)来定量。抗体治疗的载玻片中的闭合程度与时间匹配假治疗对照(time matched sham treated control)进行对比，并且计算了创伤闭合对比于时间匹配对照(time matched control)的抑制％。 
海绵测定(sponge assay) 
聚醚海绵皮下植入到C57黑鼠中并且在隔日用10ng bFGF或10ngbFGF+抗体注射。治疗14天后，收获海绵，切开并且用H&E(A)染色。 
氧诱导视网膜病变(OIR)新生小鼠模型
本研究中采用的氧诱导视网膜病变的动物模型是由Smith等描述，并且其现在广泛地用于研究对于视网膜新生血管生成的抗血管生成治疗的检验(Smith等，1994)。成窝出生后小鼠和它们的哺乳母鼠在出生后第7天(P7)被安置在75％氧环境下，并且在P12返回室内空气。组织内氧过多的5天期间中央视网膜毛细血管床(central retinal capillary bed)经受了血管退化并且停止发育。在返回室内空气时中央视网膜变得显著缺氧，这与VEGF家族的血管源性生长因子的增加有关。强力的新生血管生成反应跟着发生在P15的视网膜外新生血管的生成。新生血管生成在P17达到最大化并且在P21之后退化。 
分割未固定的神经视网膜并且使其在RIPA缓冲液中经受超声波破碎。对于结合HP-蛋白的量化，制备P13和P17小鼠的视网膜样品用于HP酶联竞争免疫吸附测定法(ELISA)。简单地说，双份100μl样品或者标准样品在96孔聚苯乙烯测定板(Corning Inc.，Corning，NY)中在PBS/5％吐温20中连续稀释，并且用25μl抗HP的兔多克隆抗体(1∶3300，在PBS/5％吐温中)在37℃孵育1小时。然后将每孔中的物质转移到预包被有固相抗原(1∶5000，在碳酸盐缓冲液中，pH 9.6)的NUNC C96 Maxisorp板4℃过夜，并且用1％明胶封闭1小时。固相和可溶抗原间的竞争在37℃进行1小时，在此之后孔用PBS/5％吐温4x5分钟洗，然后在每孔中加入100μl1∶2000的碱性磷酸酶山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich)。然后用PBS/5％吐温4x5分钟洗板，并且在每孔加入100μl 1mg/ml的碱性磷酸酶底物，溶解在10％二乙醇胺缓冲液(pH 9.6)中的六水合4-硝基苯磷酸二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate)(Sigma-Aldrich)。用Safire微板读数仪(Tecan Instruments)在405nm处在2小时内每5分钟测量随后反应的显色，并且使用Magellan 3软件分析反应动力学。通过对比Lineweaver-Burk酶动力学标准曲线测定结合HP-1的样品，并且以样品的蛋白浓度比率表示。用于测定的固相抗原是HP，其还原性地结合到牛血清白蛋白。使用Student’s t检验进行统计分析，并且P值＜0.05认为具有显著性。 
附图简述 
现在在下述非限制性例子中进一步描述本发明。参考附图，其中： 
图1说明在有/没有48小时CPT11治疗情况下，在HCT116细胞和RKO细胞中Cat S RNA表达的分析。 
图2说明在有/没有48小时CPT11治疗情况下，在HCT116+/+细胞、RKO+/+细胞和HT29 p53突变细胞中，Cat S和γ微管蛋白表达的蛋白质Western点杂交分析。 
图3说明未治疗(3A)和CPT11治疗48小时(3B)的RKO+/+细胞，以及未治疗(3C)和CPT11治疗48小时(3D)的HCT116+/+细胞的细胞表面表达的Cat S的流式细胞检测分析。细胞用Cat S单克隆抗体(绿色-每个图上较低的峰(斜条纹))和同种型匹配对照(红色-每个图左侧高的峰(垂直条纹))染色。 
图4说明未治疗(4A)和CPT11治疗48小时(4B)的H630细胞的细胞表面表达的Cat S的流式细胞检测分析。细胞用Cat S单克隆抗体(绿色-每个图上的双峰(斜条纹))和同种型匹配对照(红色-每个图左侧单个较高的峰(垂直条纹))染色。 
图5说明了显示使用1E11的Cat S单克隆抗体的免疫细胞化学分析结果的照片，揭示Cat S表达位于HCT116细胞的细胞表面。右侧组显示流式细胞检测分析的结果，在HCT116细胞中观察到在用Cat S染色的情况下，比用同种型对照增加了38％的荧光强度。 
图6说明在结肠直肠癌活检样品以及在正常脾和结肠样品中，Cat S表达的免疫组化检测结果。 
图7说明与对照(非肿瘤细胞)相比，在HCT116+/+、结肠直肠癌细胞中Cat S和β3整联蛋白RNA表达的分析。在35个PCR循环后分析RNA水平。 
图8a说明未治疗和治疗的(Cat S 1E11+5Fu(IC50))异种移植瘤模型中的肿瘤上，Cat S 1E11的mAb的定位的免疫组化检测。黑色(棕色)染色指示阳性染色。 
图8b说明未治疗和治疗的(Cat S 1E11+5Fu(IC50))异种移植瘤模型中的肿瘤上，Cat S 1E11的mAb的定位的免疫组化检测。黑色(棕色) 染色指示阳性定位。 
图9显示在异种移植瘤模型的器官中经过9天给药方案(Cat S 1E11+5Fu(IC50))后，肠和肝切片的照片。 
图10说明在5-Fu治疗的肿瘤切片中Cat S表达的免疫组化检测。切片用小鼠IgG1同种型对照或Cat S 1E11 MAb染色。 
图11.在未治疗和5-Fu治疗(15mg/kg)的肿瘤切片中Cat S表达的免疫组化检测。切片用Cat S 1E11 mAb染色。 
图12说明在未治疗和CPT-11治疗(15mg/kg)的肿瘤切片中Cat S表达的免疫组化检测。切片用Cat S 1E11 mAb染色。 
图13说明在未治疗和5-Fu治疗的肿瘤切片中Cat S表达的免疫组化检测。切片用小鼠IgG同种型对照(R&D Systems)或Cat S 1E11 mAb染色。 
图14说明在对照(小鼠IgG1+5-Fu)和治疗的(Cat S 1E11+5Fu(IC50))肿瘤切片中细胞凋亡的检测。切片用抗裂解细胞凋亡蛋白酶-3(Cell Signalling Technology)染色。 
图15a显示在仅有载体对照、同种型对照、抗组织蛋白酶S的抗体(mAb1)或抗组织蛋白酶S的抗体(mAb2)中培养的HMEC细胞的照片； 
图15b说明了图示，其说明在1E11(靠上的组)或1E4(下面的组)存在的情况下，观察到的毛细血管细胞分支的抑制。 
图16a说明在对照抗体和抗组织蛋白酶S的抗体1E11存在下(以60、300和600nM浓度)培养的主动脉的切片的照片。 
图16b(左上)说明了图示，其概述了抗体对如图16a中显示的血管长度的影响。 
图16b(右上)说明了图示，其概述了抗体对如图16a中显示的血管数量的影响。 
图16b(下图)说明了图示，其概述了抗体对如图16a中显示的最大血管长度的影响。 
图17a(1)和a(2)说明在对照抗体和抗组织蛋白酶S的抗体1E11 存在下(以1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml以及100ug/ml，1ug/ml浓度)培养的主动脉的切片分别在放大4倍和20倍情况下的照片。 
图17b说明了曲线图，其概述在图17a说明的实验中抗体对血管数量、平均血管长度和最大血管长度的影响。 
图18说明1E11抑制性抗体的VH和VL链的氨基酸序列，并且CDR以加粗和下划线突出显示，其从VH和VL区的DNA测序而确定。 
材料和方法
细胞系和培养条件
HCT116(p53野生型)人结肠直肠腺癌细胞系维持在McCoys培养基中(Invitrogen，UK)。RKO(p53野生型)、H630(p53突变型)和HT29(p53突变型)结肠直肠腺癌细胞系维持在Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基中(DMEM，Invitrogen，UK)。所有的培养基用10％FCS、1％pen/strep和1％L-谷氨酰胺(都是Invitrogen，UK)补充。 
用化疗剂处理细胞系
将对数生长期的细胞以～20％的汇合程度接种到6孔组织培养板，并且过夜孵育以允许细胞粘合到板上。孔用CPT11(Irinotecan)和5-Fu(Flourouracil)在不同浓度(包括7.5μM)维持48小时治疗。在对照孔的化疗被盐水替代。 
Western点杂交
在用如先前描述的含有蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Calbiochem，UK)的RIPA缓冲液裂解之前，细胞在PBS中洗涤(以1500rpm离心5分钟)。全细胞裂解产物以相同浓度上样到12％SDS-PAGE胶上。在以20V维持45分钟半干地转移到硝酸纤维素膜(BioRad，UK)以前，以50V过夜跑胶。使用PBS(3％奶粉)封闭硝酸纤维素膜约1小时，并且用PBS(0.01％吐温)洗涤3次，每次5分钟。膜然后用在PBS(3％奶粉)中1:1000稀释的Cat S Mab(1E4Mab或1E11Mab)探测1小时。加入在PBS(3％奶 粉)中1:5000稀释1小时的结合HRP的山羊抗鼠二抗(secondary goat antimouse-HRP conjugated antibody)(BioRad，UK)之前，膜用PBS(0.01％吐温)洗涤3次，每次5分钟。在这之后在PBS(0.01％吐温)中洗3次每次5分钟。使用Super Signal kit(Pierce)，膜通过ECL(增强化学发光)‘显影’。在曝光照相底片不同时间之前，膜在ECL溶液中孵育5分钟。在洗涤和干燥前，照相底片在显影液(Sigma，UK)中洗1分钟，然后以水洗涤并且再用定影液(Sigma，UK)洗涤1分钟。 
流式细胞术
使用刮器从组织培养板中收集细胞并且在PBS(0.01％吐温)中洗3次(以1500rpm离心5分钟)。将约5 x 105细胞放置在适当的标记管中。细胞用50μl抗Cat S或同种型对照(Sigma，UK)在室温下孵育1小时。孵育后每管在PBS(0.01％吐温)中洗3次(以1500rpm离心5分钟)。样品然后与1:15稀释的结合FITC的山羊抗鼠二抗(Sigma，UK)孵育(样品保持在室温下的黑暗环境中)。孵育后每管在PBS(0.01％吐温)中洗3次(以1500rpm离心5分钟)。使用Cyan流式细胞仪(Dako，UK)立即分析之前，在0.5ml PBS中重悬样品。 
RT-PCR
使用PTC225梯度循环仪(MJ Research Incorporated)进行RT-PCR。使用RNA STAT-60试剂(Tel-Test Friendswood，USA)依照厂商的技术说明书收集RNA，并且使用1ug RNA和逆转录酶试剂盒(GIBCO Invitrogen，Paisley，UK)合成cDNA。用于RT-PCR的引物组是Cat S正向引物5′-ACTCAG AAT GTG AAT CAT GGT G-3′和Cat S反向引物5′-TTC TTG CCATCC GAA TAT ATC C-3′，以及β3整联蛋白引物5′-CCTACATGACCGAAAATACCT-3′和5′-AATCCCTCCCCACAAATACTG-3′。使用biomix PCR混合物(Bioline，UK)分析基因表达，所述混合物含有25ulBiomix；1.5μl正向引物；1.5μl反向引物；2μl cDNA和20μl dH2O。PCR条件由初始的变性步骤95℃ 10分钟，随后的32或45个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 90秒，以及72℃ 10分钟的最后延伸组成。在UV盒上分析之前，得自32和45个循环反应的5μl扩增产物上样到1.5％琼 脂糖凝胶(0.001％溴化乙锭)并以90V跑胶40分钟。 
异种移植瘤模型
用2 x 106HCT116+/+人结肠直肠腺癌细胞植入6-8周大的雌性SCID小鼠的每个胁。收获对数生长期的HCT116细胞，在PBS中洗涤并且在HBSS中重悬。它们与等体积的基质胶混合以达到5 x 106细胞/ml的终浓度。植入后第5天小鼠被随机地分配到治疗组中，并且用有/没有5Fu的Cat S Mab或同种型对照Mab(10mg/kg)的各种方案治疗(15mg/kg每天，或70mg/kg每周二次)。所有的药物通过快速浓注施用。在不同的时间点杀死动物并且取出肿瘤用于分析。 
免疫组化 
福尔马林固定的异种移植物/器官组织样品的石蜡包埋，切片和组织切片的H&E(苏木精和曙红)染色，按先前描述的内容进行。使用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶法(Vectorlabs ABC Kit)进行免疫染色。 
简单地说，切片脱蜡要经过从二甲苯到酒精到流水。内源性过氧化物酶活性通过与含3％H2O2的甲醇孵育10分钟而被封闭。切片然后在柠檬酸盐缓冲液pH6.0中煮沸22分钟。在室温下在5％正常马血清封闭液中进行20分钟孵育。切片与一抗在4℃过夜孵育。以相同的稀释度使用合适的同种型对照，其作为一抗使用。 
对于过氧化物酶染色，切片与生物素化的全-特异性(pan-specific)二抗(Vector Laboratories)在室温下孵育30分钟，之后与Vectastain Elite ABC试剂(Vector Laboratories)在室温下再孵育30分钟。对于显色，切片用3，3′-二氨基联苯胺染色并且用Gill′s II苏木精溶液复染。 
染色使用切割的细胞凋亡蛋白酶-3多克隆抗体(Cell SignallingTechnology)，依照厂商的技术说明书进行。对于抗体定位的检测，在先前施用到异种移植瘤模型后，不需要一抗孵育的步骤。 
对于AccuMaxTM Array载玻片，依照厂商的技术说明书使用1:100稀释的Cat S单克隆抗体和生物素化的马的二抗(Vector Laboratories，CA)进行染色。在封固(mounting)和分析前载玻片用苏木精复染。
共聚焦显微镜
对于表达Cat S的HCT116细胞的染色使用如前所述的Cat S单克隆抗体。细胞在盖玻片上生长，使用冰冷的丙酮固定并且与1:100稀释的Cat S抗体孵育。用PBS洗涤盖玻片并且与抗鼠AlexaFluor
Figure 198284DEST_PATH_G2007800213966D0033153751QIETU
 488标记的二抗孵育。再次用PBS洗涤盖玻片，使用PermaFluor封固剂封固并且通过共聚焦显微镜显像。 
毛细血管样血管生成的测定 
Cat S mAb对于内皮细胞血管生成的影响按如下方式评估。二百微升的基质胶(10mg/ml)加入到预冷却的48孔板中，在4℃孵育10分钟并且随后允许在37℃聚合1小时。细胞在含有200nM适当抗体的内皮生长细胞培养基MV(Promocell)中悬浮。每孔加入五百微升(1 x 105细胞)。关于对照，细胞与含有适当体积PBS的、仅有载体的对照培养基孵育。在37℃和5％CO2条件孵育24h后，使用Nikon Eclipse TE300显微镜观察细胞。 
细胞活力和增殖测定 
如先前描述能检验Cat S单克隆抗体对于U251mg星形细胞瘤细胞的细胞毒和增殖作用。简单地说，细胞以每孔1 x 104细胞/200μl的终浓度加入96孔微量滴定板(Corning Costar)。加入适当浓度的单克隆抗体(100nM)或仅有载体的对照培养基。板分别在37℃和5％CO2条件孵育24、48、72和96小时。孵育后，加入10μl的10mg/ml MTT并且进一步在37℃和5％CO2条件孵育2小时。小心除去培养基并且将甲臜结晶溶解在100μl/孔的DMSO中。按上文描述来测量吸光度并且结果以相对于每种仅有载体对照的细胞活力和增殖的百分比表示。所有检验以4个重复进行。 
创伤测定 
这些研究中使用的体外迁移测定是Ashton等描述方法(1999)的改进版。HMEC-1铺板到载玻片单个室中并且过夜生长达到90％汇合。除去培养基并且创伤单细胞层。单细胞层用新鲜培养基重新补充并且加入所需量的抗体达到所需终浓度。 
直到创伤完全闭合才在固定时间点除去载玻片，然后在4％PBS缓冲 的低聚甲醛中固定。“创伤”闭合的程度由中立的研究者通过显微镜来盲评，并且在放大20倍(Olympus BX 50)情况下使用标定的目镜测微尺(1mm/100μm刻度)来定量。抗体治疗的载玻片中的闭合程度与时间匹配假治疗对照进行对比，并且计算了创伤闭合对比于时间匹配对照的抑制％。 
大鼠主动脉模型 
处死雄性Wistar大鼠，无菌地取出胸主动脉并且切成1cm厚的环。在无菌培养基中洗环十次以除去任何细菌，并且包埋到24孔板的基质胶中。孔用2ml的培养基和增加浓度的抗体补充。板孵育8天并且孵育后基质胶和环在4％PBS缓冲的低聚甲醛中固定并且储存在PBS中。血管生成的程度由中立的研究者通过显微镜来盲评，并且在放大20倍(Olympus BX 50)情况下使用标定的目镜测微尺(1mm/100μm刻度)来定量。测量了每个视野内的血管长度、最大血管长度和血管数量的范围，并且与时间匹配假对照进行对比，并且计算了抑制％。 
海绵测定 
聚醚海绵皮下植入到C57黑鼠中并且在隔日用10ng bFGF或10ngbFGF+抗体注射。治疗14天后，收获海绵，切开并且用H&E(A)染色。 
氧诱导视网膜病变(OIR)新生小鼠模型 
本研究中采用的氧诱导视网膜病变的动物模型是由Smith等描述，并且其现在广泛地用于研究对于视网膜新生血管生成的抗血管生成治疗的检验(Smith等，1994)。成窝出生后小鼠和它们的哺乳母鼠在出生后第7天(P7)被安置在75％氧环境下，并且在P12返回室内空气。组织内氧过多的5天期间中央视网膜毛细血管床经受了血管退化并且停止发育。在返回室内空气时中央视网膜变得显著缺氧，这与VEGF家族的血管源性生长因子的增加有关。强力的新生血管生成反应跟着发生在P15的视网膜外新生血管的生成。新生血管生成在P17达到最大化并且在P21之后退化。 
分割未固定的神经视网膜并且使其在RIPA缓冲液中经受超声波破碎。对于结合HP-蛋白的量化，制备P13和P17小鼠的视网膜样品用于HP酶联竞争免疫吸附测定法(ELISA)。简单地说，双份100μl样品或者标准样品在96孔聚苯乙烯测定板(Corning Inc.，Corning，NY)中在PBS/5％吐温20中连续稀释，并且用25μl抗HP的兔多克隆抗体(1∶3300，在PBS/5％吐温中)在37℃孵育1小时。然后将每孔中的内含物转移到预包被有固相抗原(1∶5000，在碳酸盐缓冲液中，pH 9.6)的NUNC C96 Maxisorp板4℃过夜，并且用1％明胶封闭1小时。固相和可溶抗原间的竞争在37℃进行1小时，在此之后孔用PBS/5％吐温4x5分钟洗涤，然后在每孔中加入100μl 1∶2000的碱性磷酸酶山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich)。然后用PBS/5％吐温4x5分钟洗板，并且在每孔加入100μl 1mg/ml的碱性磷酸酶底物，溶解在10％二乙醇胺缓冲液(pH 9.6)中的六水合4-硝基苯磷酸二钠盐(Sigma-Aldrich)。用Safire微板读数仪(Tecan Instruments)在405nm处在2小时内每5分钟测量随后反应的显色，并且使用Magellan 3软件分析反应动力学。通过对比Lineweaver-Burk酶动力学标准曲线测定结合HP-1的样品，并且以样品的蛋白浓度比率表示。用于测定的固相抗原是HP，其还原性地结合到牛血清白蛋白。使用Student’s t检验进行统计分析，并且P值＜0.05认为具有显著性。 
结果 
本项研究研究了结肠直肠癌细胞系上的Cat S表达，以及化疗诱导Cat S表达的能力。本研究进一步检验了抗Cat S特异性单克隆抗体对于肿瘤发展的影响以及体外和体内的活力。 
实施例1至3 
对在mRNA、蛋白和细胞表面水平的Cat S表达进行检测。 
实施例1 
RT半定量PCR用于检测在有/没有7.5μM CPT11治疗情况下，4种结肠直肠细胞系(HCT116+/+、RKO+/+、H630 p53突变型和HT29 p53突变型)中Cat S的mRNA水平。在32和45个PCR循环之后，分析RNA水平以确定治疗和未治疗样品之间表达中的相对差异。所有4种细胞系均显示了Cat S的基础表达，而HCT116+/+和RKO+/+细胞系显示了对于化疗(如图1中显示)的响应而产生表达的增加。 
实施例2 
通过对从3种细胞系(HCT116+/+、RKO+/+和HT29)制备的全细胞裂解产物制品进行Western点杂交分析，在蛋白水平检测Cat S表达。关于HCT116+/+和RKO+/+细胞系的全细胞裂解产物，在有/没有48小时CPT11治疗(7.5μM)的样品上制备。所有3种细胞系显示Cat S的阳性表达(图2)，在治疗和未治疗的HCT116+/+或RKO+/+样品之间，全蛋白表达水平没有明显差异。 
实施例3 
使用流式细胞仪检测Cat S的细胞表面表达。在有/没有CPT11治疗情况下，分析HCT116+/+、RKO+/+和H630 p53突变型细胞的细胞表面的表达。RKO+/+细胞系显示38％的阳性的基础的细胞表面表达，在化疗诱导后(图3A-B)其增加至49％。HCT116+/+细胞系显示39％的阳性的基础的细胞表面表达，在化疗诱导后(图3C-D)其增加至59％。H630 p53突变型细胞系显示37％的阳性的基础的细胞表面表达，在化疗诱导后(图4A-B)其增加至41％。 
实施例4 
使用共聚焦显微镜进一步确认肿瘤细胞表面组织蛋白酶S的存在。对于表达Cat S的HCT116细胞的染色使用如前所述的Cat S单克隆抗体。结果显示在图5中。使用1E11的Cat S单克隆抗体的免疫细胞化学分析揭示了Cat S表达位于HCT116细胞的细胞表面，这也通过流式细胞检测分析而确认，其中在HCT116细胞中观察到在用Cat S染色的情况下，比用同种型对照增加了38％的荧光强度。 
实施例5 
相反，结肠的正常切片没有显示、如对于结肠直肠癌所证明的细胞表面组织蛋白酶S的表达。图6显示在结肠直肠癌活检样品中Cat S表达的免疫组化检测结果。使用抗成熟的人Cat S蛋白酶的单克隆抗体，对组织切片进行Cat S表达的染色。人结肠正常切片的染色证明了对于Cat S产生 略微的染色或没有染色，而结肠直肠癌活检切片对于Cat S产生深的染色。 
实施例6 
据报道血管成形术后在动脉粥样硬化和再狭窄中，组织蛋白酶S与整联蛋白ανβ3共同存在(co-localise)，作为血管平滑肌细胞表面的受体(Cheng等，Am J Pathology，2006，168：685-694)。 
本发明人研究了本文所证明的肿瘤细胞表面组织蛋白酶S的定位是否与这种整联蛋白有关。如在图7中显示，其显示了在结肠直肠癌细胞HCT116+/+中Cat S和β3整联蛋白RNA表达的分析结果。在35个PCR循环后，尽管组织蛋白酶S强烈表达，但没有证明β3整联蛋白RNA的表达，显示肿瘤细胞的细胞表面组织蛋白酶S的定位在动脉粥样硬化条件下与血管平滑肌细胞中整联蛋白的表达不相关。 
实施例7 
然后使用化疗剂5Fu和组织蛋白酶S抑制性抗体1E11(本文也指的是Cat S Mab)，进行了联合治疗效果的研究。 
如在共同待决的PCT申请WO2006/109045(其内容通过引用并入本文，并且其要求GB0507219.4和GB0507272.3的优先权)中显示，这种抗体具有有效的抑制活性。在使用荧光底物的荧光测定中，所述抗体抑制CatS的蛋白水解活性。在使用PC3前列腺癌细胞系、U251mg星形细胞瘤细胞系、HCT116结肠直肠癌细胞系、MDMB231乳腺癌细胞系和MCF7乳腺癌细胞系的侵袭测定中，所述抗体进一步还显示有效地抑制肿瘤细胞的侵袭。此外，在基质胶测定中证明了这种抗体的抗血管生成效应，其中所述抗体显示抑制了毛细血管生成(参阅下文)。 
在结肠直肠癌异种移植瘤模型中进行了Cat S体内表达的研究。模型用化疗剂5Fu、CPT-11和奥沙利铂(15mg/kg-70mg/kg剂量)单独治疗，或者与10mg/kg的1E11Cat S单克隆抗体联合治疗。治疗后石蜡包埋的组织切片用于抗体位置的检测。从Cat S Mab与5-Fu联合治疗的动物中获得的肿瘤样品IgG染色阳性(图8a和8b)，显示Cat S Mab能成功地靶向阳性表达的肿瘤细胞。
实施例8 
治疗后检测所有主要小鼠器官的构造变化。没有观察到病理变化的征兆。图9显示在异种移植瘤模型器官中9天给药方案(Cat S 1E11+5Fu(IC50))后肠和肝切片的照片。体内研究表示用10mg/kg的1E11 Mab与化疗联合的重复治疗没有有害的毒性作用(图9)。 
实施例9 
使用1E11mAb染色肿瘤切片以检测Cat S表达(图10)。小鼠IgG同种型用作对照。图11和13显示，从用5-Fu治疗的小鼠中获得的肿瘤切片观察到Cat S表达的上调，图12显示从用CPT-11治疗的小鼠中获得的切片具有相似的结果。 
实施例10 
使用抗切割细胞凋亡蛋白酶-3多克隆抗体检测联合治疗对于肿瘤组织的影响(图14)。在治疗的组织中观察到细胞凋亡蛋白酶3活性的增加，指示Cat SMab对细胞凋亡有影响。 
实施例11 Cat S抗体能抑制人内皮细胞中血管样的形成 
使用由Grant等(Cell 1989 Sep 8；58(5)：933-43)描述的基质胶形态发生测定(matrigel morphogenesis assay)，用在基质胶上培养的人微血管内皮细胞(HMEC)进行毛细血管形成测定，使得内皮细胞形成血管样结构，并且侵袭芽(invasive sprout)从单个细胞延伸出以接触附近的内皮细胞。图15a说明在两种Cat S抗体(1E11和1E4)或同种型对照存在下，培养的HMEC细胞的结果。广泛的血管样结构明显地存在于仅有载体对照和同种型对照抗体(200nM)的组中；然而在1E11(mAb1)或1E4(mAb2)抗体(200nM)存在下，这种血管生成几乎被完全消除。这些结果随后如在图15b中定量显示，其说明在1E11(靠上的组)或1E4(靠下的组)存在下，观察到毛细血管细胞分支的抑制。 
两种抗体先前显示特异性结合Cat S而与其他组织蛋白酶、具体而言指与Cat S具有最高同源性的那些，没有交叉反应性。抗体1E11和1E4两者特征在于它们抑制Cat S催化活性的能力；1E11能特异性地抑制Cat S 的活性而1E4没有可辨别的效应。因此，毛细血管测定的结果显示从内皮细胞分泌的有活性的Cat S被抑制性或非抑制性Cat S mAb的隔离，足以防止内皮细胞形成血管样结构的迁移和排列(migration and arrangement)。 
实施例12 在大鼠主动脉弓间接体内模型中Cat S抗体能抑制血管样生成 
为进一步评估Cat S在血管生成中的作用，进行间接体内大鼠主动脉弓测定。主动脉的切片(1mm)在抑制性抗体和适当对照存在下，在基质胶薄层内培养。监控主动脉中血管样管的生成，并且在7天后通过测量与对照相比的血管数量、平均血管长度和最大血管长度的减少而量化。 
图16说明在Cat S 1E11抗体存在下血管生成的显著抑制。环切片的照片显示在图16a中而结果概述在图16b中。大鼠主动脉环切片与最高达600nM的1E11共同孵育，导致血管总数、平均血管长度和最大血管长度超过80％的减少(图16b)。 
图17说明在Cat S 1E11抗体存在下的重复实验中血管生成的显著抑制。环切片的照片显示在图17a中而结果概述在图17b中。大鼠主动脉环切片与高达10μg/ml的1E11共同孵育，导致血管总数70％的减少，并且导致平均血管长度和最大血管长度60％的减少。 
所有涉及本说明书的文献通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神情况下，可以制定对于本领域技术人员明显可知的本发明所描述实施方式的各种修改和变化。尽管本发明已联系具体优选的实施方式进行描述，但是应理解如权利要求所述本发明不应不当地受限于这些具体的实施方式。实际上，对于本领域技术人员明显可知的、执行本发明所描述实施方式的各种修改，都预期包括在本发明中。 
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序列表
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     谢恩.奥维尔
     朱莉.葛姆雷
     乔奎因.托马斯
     罗伯塔.波尔登
     克里斯多佛.斯科特
     达雷格.麦克米尔
     詹姆士.约翰斯顿
<120>靶向组织蛋白酶S的治疗
<130>P45224.Wo.01
<150>GB0607158.3
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<151>2006-10-12
<160>12
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>CDR氨基酸序列
<400>1
Ser Tyr Asp Met Ser
1               5
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>CDR氨基酸序列
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1               5                   10                  15
Gly
<210>3
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>CDR氨基酸序列
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<213>小鼠
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<223>CDR氨基酸序列
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>CDR氨基酸序列
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1               5
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<212>PRT
<213>小鼠
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<223>CDR氨基酸序列
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>VH区氨基酸序列
<400>7
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
            20                  25                  30
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
        35                  40                  45
Tyr Ile Thr Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg His Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>8
<211>113
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<223>VL区氨基酸序列
<400>8
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>有义Cat S特异性引物
<400>9
actcagaatg tgaatcatgg tg
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反义Cat S特异性引物
<400>10
ttcttgccat ccgaatatat c
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<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>β3整联蛋白引物
<400>11
cctacatgac cgaaaatacc t
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>β3整联蛋白引物
<400>12
aatccctccc cacaaatact g

Claims (15)

1.组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂在制备用于通过同时、连续或单独施用所述组织蛋白酶S抑制剂和所述化疗剂的联合治疗的药物中的用途，其中所述组织蛋白酶S抑制剂是抗组织蛋白酶S抗体或其片段，或编码所述组织蛋白酶S抗体或其片段的核酸；其中所述组织蛋白酶S抗体或其片段结合组织蛋白酶S并且抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性，其中所述抗组织蛋白酶S抗体或片段包括抗体VH区，所述抗体VH区以氨基酸序列SeqID No：1、Seq ID No：2和Seq ID No：3分别作为CDR1、2和3的CDR，其中所述抗组织蛋白酶S抗体或片段包括抗体VL区，所述抗体VL区包括以氨基酸序列Seq ID No：4、Seq ID No：5和Seq ID No：6分别作为CDR1、2和3的CDR，其中所述化疗剂选自由胸苷酸合成酶抑制剂和拓扑异构酶抑制剂组成的组。
2.一种药物组合物，其包括组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂，其中所述组织蛋白酶S抑制剂是抗组织蛋白酶S抗体或其片段，或编码所述组织蛋白酶S抗体或其片段的核酸；其中所述组织蛋白酶S抗体或其片段结合组织蛋白酶S并且抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性，其中所述抗组织蛋白酶S抗体或片段包括抗体VH区，所述抗体VH区以氨基酸序列Seq ID No：1、Seq ID No：2和Seq ID No：3分别作为CDR1、2和3的CDR，其中所述抗组织蛋白酶S抗体或片段包括抗体VL区，所述抗体VL区包括以氨基酸序列Seq ID No：4、Seq ID No：5和Seq ID No：6分别作为CDR1、2和3的CDR，其中所述化疗剂选自由胸苷酸合成酶抑制剂和拓扑异构酶抑制剂组成的组。
3.一种药物试剂盒，其包括通过同时、连续或单独施用组织蛋白酶S抑制剂和化疗剂而用于联合治疗的所述组织蛋白酶S抑制剂和所述化疗剂，其中所述组织蛋白酶S抑制剂是抗组织蛋白酶S抗体或其片段，或编码所述组织蛋白酶S抗体或其片段的核酸；其中所述组织蛋白酶S抗体或其片段结合组织蛋白酶S并且抑制组织蛋白酶S的蛋白水解活性，其中所述抗组织蛋白酶S抗体或片段包括抗体VH区，所述抗体VH区以氨基酸序列Seq ID No：1、Seq ID No：2和Seq ID No：3分别作为CDR1、2和3的CDR，其中所述抗组织蛋白酶S抗体或片段包括抗体VL区，所述抗体VL区包括以氨基酸序列Seq ID No：4、Seq ID No：5和Seq ID No：6分别作为CDR1、2和3的CDR，并且其中所述化疗剂选自由胸苷酸合成酶抑制剂和拓扑异构酶抑制剂组成的组。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体VH区由氨基酸序列SeqID No：7组成。
5.根据权利要求1或4所述的用途，其中所述抗体VL区由氨基酸序列Seq ID No：8组成。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述抗体VH区由氨基酸序列Seq ID No：7组成。
7.根据权利要求2或6所述的药物组合物，其中所述抗体VL区由氨基酸序列Seq ID No：8组成。
8.根据权利要求3所述的药物试剂盒，其中所述抗体VH区由氨基酸序列Seq ID No：7组成。
9.根据权利要求3或8所述的药物试剂盒，其中所述抗体VL区由氨基酸序列Seq ID No：8组成。
10.根据权利要求1或4所述的用途，其中所述化疗剂选自由5-FU、CPT-11和SN-38组成的组。
11.根据权利要求5所述的用途，其中所述化疗剂选自由5-FU、CPT-11和SN-38组成的组。
12.根据权利要求2或6所述的药物组合物，其中所述化疗剂选自由5-FU、CPT-11和SN-38组成的组。
13.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述化疗剂选自由5-FU、CPT-11和SN-38组成的组。
14.根据权利要求3或8所述的药物试剂盒，其中所述化疗剂选自由5-FU、CPT-11和SN-38组成的组。
15.根据权利要求9所述的药物试剂盒，其中所述化疗剂选自由5-FU、CPT-11和SN-38组成的组。
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