JP5914956B2 - 治療法 - Google Patents

Description

発明の分野

本願は、腫瘍性疾患を治療する方法及びこのような治療において使用するための組成物に関する。具体的には、癌の治療のための抗体に基づく治療法及び腫瘍細胞の化学療法治療への防御機構に対抗するための併用療法に関する。

発明の背景

プロテアーゼは、すべての遺伝子産物のおよそ２％を含む大きな群のタンパク質である（Ｒａｗｌｉｎｇｓ及びＢａｒｒｅｔｔ、１９９９）。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、すべての細胞及び生物が適切に機能するために不可欠なものである。タンパク質分解性プロセシング現象は、骨形成、創傷治癒、血管新生及びアポトーシスを含めた広範な範囲の細胞プロセスにおいて重要である。

リソソームシステインプロテアーゼは、最初、リソソームにおけるタンパク質の非選択的分解に関与する酵素であると考えられていた。今では、それは、いくつかの重要な細胞プロセスを担い、アポトーシス、抗原提示、凝固、消化、プロホルモンプロセシング及び細胞外マトリックスリモデリングにおいて役割を有することが知られている（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７）。

カテプシンＳ（Ｃａｔ Ｓ）は、リソソームシステインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーのメンバーである。今日までに、１１種のヒトカテプシンが同定されているが、各々の具体的なｉｎ ｖｉｖｏでの役割は、まだ調べられようとしているままである（Ｋａｔｕｎｕｍａら、２００３）。カテプシンＢ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｏ、Ｘ及びＣは、ほとんどの細胞で発現しており、このことは、タンパク質代謝回転の調節における役割の可能性を示唆するのに対し、カテプシンＳ、Ｋ、Ｗ及びＶは、特定の細胞及び組織に限定されており、このことは、それらはより特定の役割を有し得るということを示す（Ｋｏｓら、２００１；Ｂｅｒｄｏｗｓｋａ、２００４、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．２００４；３４２：４１−６９）。

Ｃａｔ Ｓは、最初、ウシリンパ節及び脾臓から同定され、ヒト型は、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ｓｈｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：７２５８−７２６２）。Ｃａｔ Ｓをコードする遺伝子は、染色体１ｑ２１に位置している。まず、Ｃａｔ Ｓ遺伝子によってコードされる９９６塩基対の転写物が、３７．５ｋＤａの分子量を有するプロセシングされていない前駆体タンパク質に翻訳される。このプロセシングされていないタンパク質は、３３１個のアミノ酸；１５個のアミノ酸のシグナルペプチド、９９個のアミノ酸のプロペプチド配列及び２１７個のアミノ酸のペプチドからなる。Ｃａｔ Ｓは、まず、シグナルペプチドを含んで発現され、これは、小胞体のルーメンに入った後に除去される。プロペプチド配列は、プロテアーゼの活性部位と結合し、酸性エンドソーム区画に輸送されるまでプロテアーゼを不活性にし、その後、プロペプチド配列が除去され、プロテアーゼが活性化される（Ｂａｋｅｒら、２００３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２８、９３−１０１）。

Ｃａｔ Ｓは、抗原添加に先立つ不変鎖の切断による主要組織適合抗原クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）媒介性抗原提示において、主要な酵素として同定されている。研究によって、Ｃａｔ Ｓに欠陥のあるマウスは、ＡＰＣによる外因性タンパク質を提示する能力に障害を有するということが示されている（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１９９９；１０：２０７−２１７）。不変鎖ＩｉのプロセシングにおけるＣａｔ Ｓの特異性によって、喘息及び自己免疫障害等の状態の治療におけるＣａｔ Ｓ特異的治療標的を考慮することができる（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９７）。

Ｃａｔ Ｓの病理学的関連 多数のヒト病的過程の根底には、プロテアーゼ制御の変質があることが多い。リソソームシステインプロテアーゼカテプシンＳの調節解除された発現及び活性は、神経変性疾患、自己免疫疾患及び特定の悪性腫瘍をはじめとするさまざまな状態と関係している。

Ｃａｔ Ｓの上方調節は、いくつかの神経変性疾患と関係している。アミロイドタンパク前駆体（ＡＰＰ）からのβペプチド（Ａβ）の産生において役割を有していると考えられており（Ｍｕｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５；３１１：２９９−３０５）、その発現は、アルツハイマー病及びダウン症候群の両方で上方調節されることがわかっている（Ｌｅｍｅｒｅら、１９９５）。Ｃａｔ Ｓはまた、多発性硬化症（ＭＳ）の発生に関与している潜在的な自己抗原であるミエリン塩基性タンパク質を分解する能力によって、多発性硬化症においても役割を有している可能性があり（Ｂｅｃｋら、２００１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；３１：３７２６−３７３６）、また、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）患者では、Ｃａｔ Ｓ発現は４倍を超えて増大していることがわかっている（Ｂａｋｅｒら、２００２）。

カテプシンＳは、アテローム硬化性及び血管形成術後の再狭窄において過剰発現されることが報告されている（Ｃｈｅｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６、１６８：６８５−６９４）。これらの状態では、ＣａｔＳは、血管平滑筋細胞表面上で、受容体としてのインテグリンαｖβ３と共存すると報告された。

血管新生、微小血管系の発達は、正常な発達及び創傷治癒などの多数の正常な生理学的プロセスのうちで、なくてはならないプロセスである。血管新生は、内皮細胞を刺激して、一次血管を形成することを特徴とし、そこには、内皮細胞、周囲の微小環境及びさまざまな血管新生促進因子及び血管新生抑制因子間の、解明されていない複雑な相互作用が存在している。しかし、制御されないか、又は不適切な血管新生は、腫瘍進行及び眼疾患をはじめとする広範な疾患の病理の根底にある因子として認められている。

ＣａｔＳの、血管新生との関係は、まず、ＣａｔＳ欠損内皮細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて示された（Ｓｈｉら、２００３）。微小血管内皮細胞（ＥＣ）は、プロテアーゼを分泌し、これによって、血管基底膜及び間質細胞外マトリックスの浸透が可能になることがわかっている。培養ＥＣの、炎症性サイトカイン又は血管新生因子での処理は、Ｃａｔ Ｓの発現を刺激し、その阻害によって微小管形成が減少した。ＣａｔＳ−／−マウスは、野生型対照と比較して、創傷修復の際に不完全な微小血管発達を示した（Ｓｈｉら、２００３）。

血管新生及び腫瘍成長におけるＣａｔＳの役割についてのさらなる試験は、膵島細胞癌のトランスジェニックマウスモデルにおいて実証された。ＣａｔＳ−／−マウスは、ＣａｔＳ＋／＋対照マウスと比較して、かなり小さい腫瘍及びより少ない血管新生性島しか発生しないことがわかった（Ｇｏｃｈｅｖａら、２００６）。続いて、この現象に裏づけを与える分子機構についての洞察が、ＣａｔＳは、血管新生抑制ペプチドを切断し、不活化でき、活性を有する血管新生促進断片の生成を促進できるという証拠によって提供された（Ｗａｎｇら、２００６）。

Ｃａｔ Ｓの役割はまた、特定の悪性腫瘍において調べられている。Ｃａｔ Ｓの発現は、正常組織と比較して、肺腫瘍及び前立腺癌切片において大幅に多いことがわかり（Ｋｏｓ ら、２００１、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００１）、Ｃａｔ Ｓは、腫瘍浸潤及び疾患進行において役割を有している可能性があると示唆された。

Ｃａｔ Ｓに関する最近の研究によって、ヒト星状細胞腫におけるその発現の重要性が実証された（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３）。免疫組織化学分析によって、ＷＨＯグレードＩ〜ＩＶの星状細胞腫生検組織のパネルにおいて、Ｃａｔ Ｓの発現が示されたが、正常星状細胞、ニューロン、乏突起膠細胞及び内皮細胞からはないようであった。Ｃａｔ Ｓ発現は、グレードＩＶ腫瘍において最大であるようであり、細胞外活性のレベルは、グレードＩＶ腫瘍に由来する培養物において最大であった。

Ｃａｔ Ｓは、ＥＣＭ高分子、例えば、ラミニン、コラーゲン、エラスチン及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解において活性があるとわかっている（Ｌｉｕｚｚｏら、１９９９）。Ｕ２５１ＭＧグレードＩＶ神経膠芽腫細胞株を用いる浸潤アッセイを用いて、Ｃａｔ Ｓ阻害剤ＬＨＶＳ２９の存在下で浸潤の６１％の減少が示された（Ｆｌａｎｎｅｒｙら、２００３）。

Ｃａｔ Ｓを特異的にターゲッティングする阻害剤の作製は、このプロテアーゼの活性と関連している症状の軽減のための治療薬として有望である。

腫瘍進行における異常な細胞外システインカテプシン活性の意味は、研究者にとって、特に興味の的であった。これらのリソソーム酵素の各々は、種々の腫瘍の進行に関与しているとされており、腫瘍細胞からのその異常に高い分泌は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解をもたらすと考えられている。ＥＣＭ成分、例えば、エラスチン及びコラーゲンのこの異常な分解は、これらの異常な細胞の、周囲の正常な組織への浸透及び浸潤を加速する。さらに、血管新生及びその他の分子のプロセシングにおける役割も不適切なカテプシン活性に起因している（Ｌａｈ及びＫｏｓ、１９９８ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．．３７９、１２５−３０；Ｆｏｌｋｍａｎ及びＩｎｇｂｅｒ、１９９２；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００１）。

多くの研究者が、細胞外タンパク質分解活性のこの破壊的な増大をもたらす発症機序に焦点を当ててきた。カテプシンは、ＥＣＭの成分、例えば、ラミニン、フィブロネクチン及びコラーゲンを分解するその能力によって直接的に、又は、タンパク質分解カスケードにおけるその他のプロテアーゼの活性化によって間接的に、ＥＣＭの分解に関与していると考えられている（Ｋｏｂｌｉｎｓｋｉら、２０００；Ｒａｏら、２００３）。

Ｃａｔ Ｓの阻害 プロテアーゼが過剰発現されている場合には、これらの酵素の活性を遮断するための阻害剤の開発に治療戦略の焦点が当てられてきた。カテプシンに対する特異的な小分子阻害剤の作製は、選択性及び特異性に関する問題のために、従来、難しいことであった。Ｗａｌｋｅｒら、によってＣａｔ Ｓに対する強力な可逆性阻害剤として開発されたジペプチドα−ケト−β−アルデヒドは、あまり効率的ではないもののＣａｔ Ｂ及びＬを阻害する能力を有しており（Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０００；７５：４０１−４０５）、また、Ｃａｔ Ｓ阻害剤４−モルホリン尿素−Ｌｅｕ−ホモＰｈｅ−ビニルスルホン （ＬＨＶＳ）もまた、高濃度で用いた場合にその他のカテプシンを阻害することがわかった（Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５；３８：３１９３−３１９６）。

癌の治療のために、広範な抗悪性腫瘍薬が開発されてきた。しかし、これらの化合物のうち多くが、治療戦略において上手く用いられているものの、多くの場合、特定の治療計画は、腫瘍の完全な排除をもたらさないか、又は、一時的に排除するに過ぎない。したがって、新規癌治療及び治療計画の開発は、依然として大いに必要とされている。

本明細書に記載されるように、本発明者らは、予期しないことに、カテプシンＳ（ＣａｔＳ）を腫瘍細胞株の細胞表面に見出すことができるということを発見した。本発明者らは、非関連腫瘍治療研究において、アイソタイプ対照としてＣａｔＳモノクローナル抗体を用いた場合に、抗体で腫瘍細胞が陽性に染色されることを見出した。

この分子が腫瘍細胞中のリソソームの内部に局在する、又は、このような細胞から分泌されるという当技術分野で一般に抱かれる考えに反して、カテプシンＳが腫瘍細胞の細胞表面に局在するという、本発明者らによる驚くべき発見は、細胞集団において腫瘍細胞を同定する手段を提供する。

したがって、本発明の第１の態様では、細胞集団において腫瘍細胞を同定する方法が提供され、前記方法は、カテプシンＳに対して結合特異性を有するリガンドを、前記細胞集団と接触させるステップと、リガンドと前記集団中の細胞の結合の有無を決定するステップとを含み、結合が、前記細胞集団内の腫瘍細胞の存在を示す。

本発明の第１の態様の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してよい。別の実施形態では、本方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施する。

本発明はまた、細胞表面ＣａｔＳが、抗体によって送達される薬物複合体を使用するためのバイオマーカーとして用いられることを可能にする。この戦略は、ＣａｔＳの酵素活性によって特異的に活性化されるプロドラッグの細胞への送達によって、さらに利用することができる。

本発明の第２の態様では、腫瘍細胞のバイオマーカーとしてのカテプシンＳの使用が提供される。

さらに、本発明者らは、化学療法薬での腫瘍由来細胞株の処理が、カテプシンＳの細胞表面局在化の増強をもたらすということを見出した。このことは、したがって、化学療法は、ＥＣＭの分解を逆効果に促進し、異常細胞の浸潤特性を増大させ得るということを示唆する。この作用は、このような化学療法を用いて治療されている患者の予後に重大な影響を有し得る。

しかし、既存の化学療法薬の効力は、この細胞表面ＣａｔＳをターゲッティングすることによって改善され得る。ＣａｔＳに対する阻害剤、例えば、小分子、ペプチド／タンパク質又は抗体を、化学療法薬と組み合わせて用いて、化学療法が、過度に浸潤性である細胞小集団の生成を確実にもたらさないようにすることができる。

したがって、本発明の第３の態様では、腫瘍細胞の表面上でのカテプシンＳの化学療法誘発性の上方調節を阻害する方法が提供され、前記方法は、前記細胞へのカテプシンＳ阻害剤の投与を含む。

本発明の第４の態様では、腫瘍性疾患を治療する方法であって、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の同時投与、逐次投与又は別個の投与を含む方法が提供される。

第５の態様では、本発明は、腫瘍性疾患の治療における、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の同時投与、逐次投与又は別個の投与による併用療法のための薬物の調製における、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の使用を提供する。

本発明の第６の態様では、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬を含む薬剤組成物が提供される。

本発明の一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬は、相乗作用を生じる濃度で提供される。

実施例に記載のとおり、化学療法薬によるカテプシンＳの上方調節は、１つのクラスの抗悪性腫瘍薬に限定されず、多数又はすべてのクラスに共通すると思われた。したがって、本発明の方法は、任意のクラスの化学療法薬を含む治療計画における用途を見出すことができる。例えば、本発明で使用することができる化学療法薬として、白金を基剤とする抗悪性腫瘍薬、代謝拮抗剤、ヌクレオシド類似体、チミジル酸合成酵素阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。

一実施形態では、化学療法薬は、白金を基剤とする抗悪性腫瘍薬、例えば、シスプラチン又はオキサリプラチンである。

別の特定の実施形態では、化学療法薬は、チミジル酸合成酵素阻害剤、例えば、５−ＦＵである。

別の特定の実施形態では、化学療法薬は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、ＣＰＴ−１１である。

任意の適したカテプシンＳ阻害剤を本発明において使用することができる。このような阻害剤は、例えば、小分子阻害剤、ペプチド若しくは抗体又は前記ペプチド若しくは抗体をコードする核酸分子であり得る。一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤は、小分子阻害剤、例えば、ジペプチドα−ケト−β−アルデヒド又は４−モルホリン尿素−Ｌｅｕ−ホモＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）である。別の実施形態では、カテプシンＳ阻害剤は、抗体分子、例えば、抗体又は抗体断片である。

ＧＢ０５０７２１９．４及びＧＢ０５０７２７２．３、国際公開第２００６／１０９０４５号からの優先権を主張する、本出願人の同時係属国際特許出願に詳述されるように、本発明者らは、新規クラスのカテプシンＳ抗体を同定し、この抗体は強力な抗タンパク質分解活性を有する。さらに、この抗体は、腫瘍浸潤及び血管新生に対して相当な阻害作用を有することが示されている。このクラスは、モノクローナル抗体１Ｅ１１によって示され、それについては、本発明者らは、抗体のＶＨ及びＶＬドメイン及びＣＤＲを同定している。これが、カテプシンＳのプロテアーゼ活性を直接的に阻害するカテプシンＳ特異的抗体の最初の実証であり、このようにして、このような抗体を、高い特異性と低い毒性を有し、癌治療薬から抗炎症剤まで広範に適用する活性を有する治療薬として使用することが独自に可能となる。

したがって、本発明の一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤は、抗体分子であり、カテプシンＳと結合し、そのタンパク質分解活性を阻害する。カテプシンＳのタンパク質分解作用を阻害できる抗体分子はいずれも、本発明のこのような態様において使用することができる。

本発明の一実施形態では、抗体分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１種のＣＤＲ、及び／又は配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなるアミノ酸配列を含む少なくとも１種のＣＤＲを含む抗原結合ドメインを含む。

配列番号１〜６に対応するアミノ酸配列は、以下のとおりである：配列番号１：ＳＹＤＭＳ配列番号２：ＹＩＴＴＧＧＶＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧ配列番号３ＨＳＹＦＤＹ配列番号４：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ配列番号５：ＫＶＳＮＲＦＳ配列番号６：ＳＱＴＴＨＶＰＰＴ

一実施形態では、抗体分子は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも１種、例えば、少なくとも２種又は３種すべて又はその変異体、並びに、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも１種、例えば、少なくとも２種又は３種すべて又はその変異体を含む抗原結合ドメインを含む。

別の実施形態では、抗体分子は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１種のＣＤＲ、及び／又は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１種のＣＤＲを含む抗原結合ドメインを含む。

特定の実施形態では、抗体分子は、アミノ酸配列配列番号５又はその変異体を有するＣＤＲ及び／又はアミノ酸配列配列番号６又はその変異体を有するＣＤＲを含む。

一実施形態では、抗体分子は、抗体ＶＨドメイン又は抗体ＶＬドメイン又は両方を含む。

一実施形態では、抗体分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも１種、例えば、２種若しくは３種のＣＤＲを含む抗体ＶＨドメインを有し、及び／又は、抗体ＶＬドメインは、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも１種、例えば、２種若しくは３種のＣＤＲを含む。

好ましい実施形態では、抗体ＶＬドメインは、アミノ酸配列配列番号８を含み、及び／又は抗体ＶＨドメインは、アミノ酸配列配列番号７を含む。配列番号７：ＶＱＬＱＥＳＧＧＶＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＹＩＴＴＧＧＶＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ配列番号８：ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＴＴＨＶＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ

抗体分子は、抗体、例えば、抗体全体であり得る。

代替の一実施形態では、抗体分子は、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖであり得る。

本発明で使用することができるさらなる抗体分子として、少なくとも１種のＣＤＲにおいて、５つ以下、例えば、４、３、２若しくは１つのアミノ酸置換がなされている、配列番号１、配列番号２、配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも１種、例えば、１種、２種若しくは３種及び／又は配列番号４、配列番号５、及び配列番号６からなるアミノ酸配列を有するＣＤＲのうち少なくとも１種、例えば、１種、２種又は３種を含み、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力を保持する抗体分子が挙げられる。

本発明の一実施形態では、本発明において使用するための抗体分子は、腫瘍細胞浸潤を阻害する能力を有する。

別の実施形態では、本発明において使用するための抗体分子は、血管新生を阻害する能力を有する。

上記のように、本発明者らは、驚くべきことに、腫瘍細胞では、カテプシンＳが細胞表面に局在し、さらに、化学療法薬にさらされた腫瘍細胞では、腫瘍細胞の表面上でのカテプシンＳ発現は上方調節されるということを示した。この実証及びカテプシンＳに対する抗体を用いて腫瘍細胞を同定できること、並びに、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の併用療法の使用はまた、腫瘍細胞において抗カテプシンＳ抗体を化学療法薬の不在下で使用し、ＡＤＣＣを誘導できるということを示唆する。

したがって、本発明の第７の態様では、腫瘍細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）反応を誘導する方法が提供され、前記方法は、前記細胞への、カテプシンＳと結合する抗カテプシンＳ抗体分子の投与を含む。

ＡＤＣＣを誘導することによって、腫瘍細胞を死滅させることができる。したがって、本発明の第８の態様では、腫瘍細胞を死滅させる方法が提供され、前記方法は、前記細胞への、カテプシンＳと結合する抗カテプシンＳ抗体分子の投与を含む。

本発明の第７及び第８の態様の方法は、必要に応じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよく、ｉｎ ｖｉｖｏで実施してもよく、又はｅｘ ｖｉｖｏで実施してもよい。

したがって、本発明の第９の態様では、被験体において腫瘍性疾患を治療する方法が提供され、前記方法は、前記被験体への、カテプシンＳと結合する抗カテプシンＳ抗体分子の投与を含む。

第１０の態様では、本発明は、腫瘍性疾患の治療のための薬物の調製における、カテプシンＳと結合する抗カテプシンＳ抗体分子の使用を提供する。

さらに、カテプシンＳは腫瘍細胞の表面に局在するということの実証から、抗腫瘍細胞作用を誘導するために、カテプシンＳと結合する抗体は、何らかの抗タンパク質分解活性を有する必要がないことが示唆される。

したがって、本発明の第７〜第１０の態様のいずれか１つの一実施形態では、その抗体分子は、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない。

本発明の第７〜第１０の態様のいずれか１つの一実施形態では、抗カテプシンＳ抗体分子を、別の化学療法薬不在下で、すなわち、本発明の第１〜第６の態様のいずれか１つの方法とは対照的に投与する。

上記のように、本発明の方法では、カテプシンＳのタンパク質分解作用を阻害しない抗カテプシンＳ抗体分子を使用してもよい。このような抗体分子の治療的使用は、実施例に記載されるような、このような抗カテプシンＳ抗体分子の抗血管新生作用の本発明者らによる実証によってさらに支持される。

具体的には、カテプシンＳに対して特異性を有するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しない抗体は、それでもなお、血管新生の強力な阻害剤として作用するということを、本発明者らははじめて示した。このことは、ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１３１４に記載されるように、カテプシンＳ活性の調節不全の病理学的効果に対抗するには、カテプシンＳのタンパク質分解作用を阻害する戦略が必要となると考えられていたことを考慮すると、本発明者らにとって特に驚くべきことであった。さらに、タンパク質を捕捉するための抗体の使用が、いくつかのタンパク質、例えば、ＶＥＧＦのための治療戦略として示唆されてきたが、このような戦略は、現在まで、カテプシンＳ活性と関連している疾患の治療には実行可能と考えられていない。

したがって、第１１の態様では、本発明は、血管新生と関連する状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法を提供し、前記方法は、前記患者への、抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸の投与を含み、前記抗体分子は、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

本発明の第１２の態様によれば、血管新生と関連する状態の治療のための薬物の調製における抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸の使用が提供され、前記抗体分子は、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

本発明のこれらの態様は、血管新生が疾患の病理において一定の役割を果たしている任意の疾患又は状態の治療において使用することができる。このような状態及び疾患として、それだけには限らないが、癌、炎症状態、例えば、炎症性筋疾患、リウマチ関節炎及び喘息、眼疾患及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる。

さらに、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない抗体分子は、それにもかかわらず、血管新生を阻害するということを実証することによって、カテプシンＳと関連しているその他の状態の治療におけるこのような抗体分子の使用が可能となる。

第１３の態様では、活性、例えば、カテプシンＳの異常な活性と関連する状態を、その治療を必要とする患者において治療する方法が提供され、前記方法は、抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸の投与を含み、前記抗体分子はカテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

また、第１４の態様として、カテプシンＳの異常な活性と関連する状態の治療のための薬物の調製における、抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸の使用も提供され、前記抗体分子は、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

腫瘍の治療と同様に、本発明は、カテプシンＳの異常な活性が関連している任意の状態、特に、カテプシンＳの異常な発現と関連する状態の治療において用いてもよい。一実施形態では、状態は、カテプシンＳのタンパク質分解活性が、前記状態の不在下より高い場合に、例えば、タンパク質分解活性が、前記状態の不在下よりも少なくとも２０％高い、例えば、少なくとも５０％高い、例えば、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高いか、又は少なくとも５００％高い場合に、カテプシンＳの異常な活性と関連していると考えられる。一実施形態では、状態は、カテプシンＳの発現が前記状態の不在下でよりも高い場合に、例えば、発現が、前記状態の不在下よりも少なくとも２０％高い、例えば、少なくとも５０％高い、例えば、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高いか、又は少なくとも５００％高い場合にカテプシンＳの異常な発現と関連していると考えられる。

例えば、本発明を使用することができる状態としては、それだけには限らないが、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び多発性硬化症、自己免疫障害及び過度の、調節解除された、又は不適切な血管新生と関連しているその他の疾患が挙げられる。

本発明の第１１〜第１４の態様のいずれかでは、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害しないが血管新生を阻害する任意の適した抗カテプシンＳ抗体分子を使用してもよい。

このような抗体分子及びこのような抗体分子をコードする核酸は、本発明の第１５の独立した態様を構成する。

本発明の第１５の態様の一実施形態では、抗体分子は、１Ｅ４抗体又はその断片又は変異体である。このような断片及び変異体は、血管新生を阻害する能力を保持するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力を有さないことが好ましい。

本発明の一実施形態では、本発明の抗体分子及び本発明において使用するための抗体分子は、腫瘍細胞浸潤を阻害する能力を有する。

本発明の第１６の態様によれば、医療で使用するための抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸が提供され、前記抗体分子は、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

また、本発明によって、第１７の態様として、カテプシンＳの活性と関連する状態の治療のための薬物の調製における、抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸の使用が提供され、前記抗体分子は、カテプシンＳの活性と関連する状態の治療のための薬物の調製において、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

本発明の別の態様は、抗体分子又は前記抗体分子をコードする核酸を含む薬剤組成物であり、前記抗体分子は、カテプシンＳと特異的に結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない。

本発明の各態様の好ましい特徴は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、変更すべきところは変更して、その他の態様の各々についてと同様である。

４８時間のＣＰＴ１１処理を施した／施さない、ＨＣＴ１１６細胞及びＲＫＯ細胞におけるＣａｔＳ ＲＮＡ発現の分析を示す図である。 ４８時間のＣＰＴ１１処理を施した／施さない、ＨＣＴ１１６＋／＋細胞、ＲＫＯ＋／＋細胞及びＨＴ２９ ｐ５３突然変異細胞における、ＣａｔＳ及びγチューブリンタンパク質発現のウエスタンブロット解析を示す図である。 未処理の（３Ａ）及びＣＰＴ１１ ４８時間処理した（３Ｂ）ＲＫＯ＋／＋細胞、並びに、未処理の（３Ｃ）及びＣＰＴ１１ ４８時間処理した（３Ｄ）ＨＣＴ１１６＋／＋細胞でのＣａｔＳ細胞表面発現のフローサイトメトリーによる分析を示す図である。細胞は、ＣａｔＳモノクローナル抗体（緑色−各グラフでの低いピーク（斜線模様））及びアイソタイプ対応対照（赤色−各グラフの左側の高いピーク（縦線模様））で染色した。 未処理の（４Ａ）及びＣＰＴ１１ ４８時間処理した（４Ｂ）Ｈ６３０細胞でのＣａｔＳ細胞表面発現のフローサイトメトリーによる分析を示す図である。細胞を、ＣａｔＳモノクローナル抗体（緑色−各グラフでの２つのピーク（斜線模様））及びアイソタイプ対応対照（赤色−各グラフの左側の１つの高いピーク（縦線模様））で染色した。 １Ｅ１１ ＣａｔＳモノクローナル抗体を用いる免疫細胞化学的分析の結果を示す写真であり、これは、Ｃａｔｓ発現がＨＣＴ１１６細胞の細胞表面に局在するということを示す。右側のパネルは、フローサイトメトリー分析の結果を示し、これでは、ＣａｔＳについて染色されたＨＣＴ１１６細胞において、アイソタイプ対照との比較で蛍光強度の３８％の増大が観察された。 結腸直腸癌生検における、及び正常脾臓及び結腸試料における、ＣａｔＳ発現の免疫組織化学的検出の結果を示す図である。 対照（非腫瘍細胞）と比較した、ＨＣＴ１１６＋／＋、結腸直腸の癌細胞における、ＣａｔＳ及びβ３インテグリンＲＮＡ発現の分析を示す図である。ＲＮＡレベルは、３５サイクルのＰＣＲ後に分析した。 未処理及び処理（ＣａｔＳ １Ｅ１１＋５Ｆｕ（ＩＣ５０））異種移植モデルにおける腫瘍へのＣａｔＳ １Ｅ１１ ｍＡｂ局在の免疫組織化学的検出を示す図である。暗い（褐色の）染色は、陽性の染色を示す。 未処理及び処理（ＣａｔＳ １Ｅ１１＋５Ｆｕ（ＩＣ５０））異種移植モデルにおける腫瘍へのＣａｔＳ １Ｅ１１ ｍＡｂ局在の免疫組織化学的検出を示す図である。暗い（褐色の）染色は、陽性の局在を示す。 異種移植モデル臓器における、９日の薬物投与計画後（ＣａｔＳ １Ｅ１１＋５Ｆｕ（ＩＣ５０））の胃及び肝臓切片の写真である。 ５−Ｆｕ処理腫瘍切片におけるＣａｔＳ発現の免疫組織化学的検出を示す図である。切片は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照又はＣａｔＳ １Ｅ１１ ＭＡｂを用いて染色した。 未処理及び５−Ｆｕ処理（１５ｍｇ／ｋｇ）腫瘍切片におけるＣａｔＳ発現の免疫組織化学的検出を示す図である。切片は、ＣａｔＳ １Ｅ１１ ｍＡｂを用いて染色した。 未処理及びＣＰＴ−１１処理（１５ｍｇ／ｋｇ）腫瘍切片におけるＣａｔＳ発現の免疫組織化学的検出を示す図である。切片は、ＣａｔＳ １Ｅ１１ ｍＡｂを用いて染色した。 未処理及び５−Ｆｕ処理腫瘍切片におけるＣａｔＳ発現の免疫組織化学的検出を示す図である。切片は、マウスＩｇＧアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＣａｔＳ １Ｅ１１ ｍＡｂを用いて染色した。 対照（マウスＩｇＧ１＋５−Ｆｕ）及び処理（ＣａｔＳ １Ｅ１１＋５Ｆｕ（ＩＣ５０）腫瘍切片におけるアポトーシス検出を示す図である。切片は、抗切断型カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて染色した。 ビヒクルのみの対照、アイソタイプ対照、抗カテプシンＳ抗体（ｍＡｂ１）又は抗カテプシンＳ抗体（ｍＡｂ２）において培養したＨＭＥＣ細胞の写真である。 １Ｅ１１（上部パネル）又は１Ｅ４（下部パネル）の存在下で観察される毛細血管細胞分岐の阻害を示すグラフを示す図である。 対照抗体及び６０、３００及び６００ｎＭ濃度の抗カテプシンＳ抗体１Ｅ１１の存在下で培養した大動脈の切片の写真である。 上部左側：図１６ａに示される血管の長さに対する抗体の作用を要約するグラフである。上部左側：図１６ａに示される血管の長さに対する抗体の作用を要約するグラフである。下部：図１６ａに示される最大血管長に対する抗体の作用を要約するグラフである。 対照抗体及び１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌの濃度の抗カテプシンＳ抗体ＩＥ１１の存在下で培養した大動脈の切片の、倍率×４の写真である。 対照抗体及び１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌの濃度の抗カテプシンＳ抗体ＩＥ１１の存在下で培養した大動脈の切片の、倍率×２０の写真である。 図１７ａにおいて示される実験における、細管の数、平均細管長及び最大細管長に対する抗体の作用を要約するグラフである。 １Ｅ１１阻害抗体のＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す図であり、ＶＨ及びＶＬ領域のＤＮＡ配列決定から決定されるＣＤＲが太字及び下線で強調されている。

詳細な説明

カテプシンＳ阻害剤
上記のように、本発明では、任意の適したカテプシンＳ阻害剤を使用することができる。阻害剤は、例えば、小分子医薬品、例えば、ジペプチドα−ケト−β−アルデヒドであり得る。ジペプチドα−ケト−β−アルデヒドは、Ｗａｌｋｅｒらによって、Ｃａｔ Ｓに対する強力な可逆性阻害剤として開発され、あまり効率的ではないもののＣａｔ Ｂ及びＬを阻害することがわかっている（Ｗａｌｋｅｒら、２０００）。本発明において使用してもよいカテプシンＳの別の小分子阻害剤として、４−モルホリン尿素−Ｌｅｕ−ホモＰｈｅ−ビニルスルホン（ＬＨＶＳ）がある。使用してもよいその他のカテプシンＳ阻害剤として、例えば、Ｔｈｕｒｍｏｎｄら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００４年９月２３；４７（２０）：４７９９−８０１に記載される非ペプチドカテプシンＳ阻害剤がある。

別の実施形態では、カテプシンＳ阻害剤は、抗体分子、例えば、抗体又は抗体断片である。

本発明との関連で、「抗体」とは、免疫グロブリン若しくはその一部、又は、抗体結合ドメインであるか、抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを含む任意のポリペプチドを指すと理解されなければならない。抗体は、それだけには限らないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性の、多特異性の抗体及びその断片及び別のポリペプチドと融合している免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体を含む。

完全な（全）抗体は、重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリン分子を含み、その各々は、それぞれ、ＶＨ及びＶＬと呼ばれる可変領域を含む。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域としても知られる）と、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）又は足場からなる。ＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。

抗体の断片は、完全な抗体の結合能力を保持し得、完全な抗体の代わりに使用してもよい。したがって、本発明の目的上、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「抗体」は抗体断片を包含すると理解されなければならない。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、直鎖抗体（米国特許第５、６４１、８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照のこと）、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

Ｆａｂ断片は、ＶＨ及びＣＨｌと一緒に、Ｌ鎖全体（ＶＬ及びＣＬ）からなる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨｌドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基、例えば、抗体ヒンジ領域に由来する１個又は複数のシステインを有することによってＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つのジスルフィド結合されているＦａｂ断片を含む。

Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる。

Ｆｖ断片は、単一の抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる。

一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）は、リンカーによって接続されているＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片であり、これによってｓｃＦｖが抗原結合部位を形成するのが可能となる。（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）参照のこと）。

二重特異性抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を含み、その結果、Ｖドメインの鎖間だけでなく鎖内対形成も達成され、結果として多価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片が得られるよう、ｓｃＦｖ断片（前節参照のこと）を構築することによって調製される小さな抗体断片である（例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）参照のこと）。

断片によってさらに包含されるものとして個々のＣＤＲがある。

本発明の一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤は、抗体分子である。本発明のいくつかの実施形態では、抗体分子は、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する抗体分子である。このような適した結合物質の一例として、本明細書並びにＧＢ０５０７２１９．４及びＧＢ０５０７２７２．３からの優先権を主張する本出願人の同時係属国際特許出願国際公開第２００６／１０９０４５号パンフレットに記載される抗体１Ｅ１１がある。本発明者らは、完全な抗体１Ｅ１１のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を同定した。さらに、本発明者らは、この抗体の６種のＣＤＲ（配列番号１、２、３、４、５及び６）を同定した。

上記のように、本発明の第１〜第１０の態様のいずれか１つにおいて使用するための抗体分子は、本明細書に開示される配列を有する１Ｅ１１抗体、ＶＨ、ＶＬ及びＣＤＲの特定の配列を有する抗体に限定されず、例えば、カテプシンＳタンパク質分解活性を阻害する任意のその他の抗体にも及ぶ。例えば、Ｃａｔ Ｓのタンパク質分解活性を阻害する能力を維持する１Ｅ１１の変異体も、本発明のいくつかの実施形態において使用することができる。したがって、１個又は複数のアミノ酸残基が修飾されている１Ｅ１１抗体のＣＤＲアミノ酸配列も、ＣＤＲ配列として使用してもよい。ＣＤＲ変異体のアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸残基は、全ＣＤＲ内の３０％以下であることが好ましく、２０％以下がより好ましく、１０％以下が最も好ましい。このような変異体は、本願の教示及び当技術分野で公知の技術を用いて提供できる。ＣＤＲは、抗体重鎖若しくは軽鎖配列又はその一部を含むフレームワーク構造中に保持される場合もある。このようなＣＤＲは、天然に存在するＶＨ及びＶＬドメインのＣＤＲの位置に対応する位置に位置付けられることが好ましい。このようなＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健社会福祉省、公衆衛生局、国立衛生研究所、ＮＩＨ公報第９１−３２４２、１９９１及びｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕにてオンラインで記載のように決定してもよい。

さらに、修飾は、代替的に又は付加的に、可変領域のフレームワーク領域になされていてもよい。フレームワーク領域におけるこのような変化は、安定性を改善し、抗体の免疫原性を低下させ得る。

しかし、上記のように、また、実施例に示されるように、本発明者らはまた、抗血管新生作用は、カテプシンＳと結合するが、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害しない抗体分子を用いて達成できるということを示した。このような抗体分子は本発明の任意の態様において使用することができる。

本発明において使用するための抗体として、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は、特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖（両鎖）の残部は、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、及び、所望の生物活性を示す限り、このような抗体の断片が挙げられる（米国特許第４、８１６、５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照のこと）。本明細書において注目されるキメラ抗体として、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む「霊長類化」抗体が挙げられる。

本発明において使用するための抗体分子は、任意の適した方法で、天然に、又は合成のいずれかによって作製してよい。このような方法として、例えば、従来のハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９９）、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許第４，８１６、５６７号を参照のこと）又は抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８及びＭａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３参照のこと）が挙げられる。その他の抗体作製技術は、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９９に記載されている。

従来のハイブリドーマ技術は、通常、抗原を用いてマウス又はその他の動物を免疫化し、抗原と結合可能なリンパ球の生成を誘発することを含む。このリンパ球を、単離して、骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成し、次いで、これを、親骨髄腫細胞の増殖は阻害するが、抗体産生細胞の増殖は可能にする条件で培養する。ハイブリドーマは、遺伝子突然変異に供してもよく、これは、産生される抗体の結合特異性を変更する場合もしない場合もある。合成抗体は、当技術分野で公知の技術を用いて作製することができる（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６、５７−８６及びＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（２００１）２１５４ ６７−８４参照のこと）。

修飾は、当技術分野で公知の任意の適した技術を用いて、結合メンバーのＶＨ、ＶＬ若しくはＣＤＲにおいて、又は、実際にはＦＲにおいて行うことができる。例えば、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を、このようなＣＤＲを欠くＶＨ又はＶＬドメインに導入することによって可変ＶＨ及び／又はＶＬドメインを作製してもよい。Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３には、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを作製し、次いで、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせて新規ＶＨ領域を作製するシャッフリング技術が記載されている。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ由来配列を含む新規ＶＨ及びＶＬドメインを作製してもよい。

したがって、本発明に使用するための抗体分子は、（ａ）可変ドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し、可変ドメインが、置き換えられる予定のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３を含むか、又は核酸がこのようなＣＤＲをコードする領域を欠くことと、（ｂ）レパートリーを、本明細書において配列番号１、２、３、４、５又は６として示される配列を有するアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせ、その結果、ドナー核酸が、レパートリー中のＣＤＲ領域に挿入されて、可変ドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供することと、（ｃ）生成物レパートリーの核酸を発現させることと、（ｄ）ＣａｔＳに特異的な特異的抗原結合断片を選択することと、（ｅ）特異的抗原結合断片又はそれをコードする核酸を回収することとを含む方法によって作製してもよい。この方法は、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力について抗体分子を試験するという任意のステップを含み得る。

本発明において使用するための抗体を作製する代替技術は、例えば、エラープローンＰＣＲを用いる、ＶＨ又はＶＬドメインをコードする遺伝子（複数の遺伝子）のランダム突然変異誘発を含み得る（Ｇｒａｍら、１９９２、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８９ ３５７６−３５８０参照のこと）。付加的に又は代替的に、ＣＤＲは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、１９９１ ＰＮＡＳ ３８０９−３８１３及びＳｃｉｅｒ １９９６ Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２６３ ５５１−５６７によって記載される、分子進化アプローチを用いる突然変異誘発の標的であり得る。

このような変異体を作製した後、抗体及び断片を、ＣａｔＳとの結合について、また、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力について試験してもよい。

本明細書に記載されるように、本発明者らは、本発明のいくつかの態様において使用してもよい抗体分子は、抗タンパク質分解作用を有するということを実証した。さらに、抗浸潤及び抗血管新生活性も、実施例において記載されるように実証した。したがって、これによって、本発明の抗体分子の、活性を有する治療薬としての使用が可能となる。本発明において使用するための抗体分子は、「裸の」抗体分子であり得る。「裸の」抗体分子とは、「活性を有する治療薬」とコンジュゲートしていない抗体分子である。本願との関連で、「活性を有する治療薬」とは、抗体部分（例えば、抗体断片、ＣＤＲなど）とコンジュゲートして複合体を作製している分子又は原子である。このような「活性を有する治療薬」の例として、薬物、毒素、放射性同位体、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、色素などが挙げられる。

免疫複合体
本発明の別の実施形態では、本発明のいくつかの実施形態において使用するための抗体分子は、「活性を有する治療薬」とコンジュゲートしている抗体断片を含む免疫複合体の形であり得る。治療薬は、化学療法薬又は別の分子であり得る。

免疫複合体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，０５７，３１３号、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４６：１１０１−１１０６（１９９０）、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５）中、Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）中、Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」参照のこと。

本発明のそれらの態様では、カテプシンＳ阻害剤及び化学治療薬の組合せを用いることが望まれる場合には、抗カテプシンＳ抗体及び化学療法薬を含む免疫複合体を用いてもよい。

このような免疫複合体は、従来の治療を上回るいくつかの利点を有する。カテプシンＳが腫瘍細胞上に局在しているということを実証することによって、腫瘍細胞に化学療法薬をターゲッティングするための、このような免疫複合体の使用が可能となる。ターゲッティングされる化学療法薬は、その細胞傷害作用を有し得る。第２に、上記のように、従来用いられている化学治療薬は、腫瘍細胞、例えば、結腸直腸の腫瘍細胞の細胞表面上でカテプシンＳの上方調節を引き起こすということがわかった。抗カテプシンＳ抗体及び化学療法薬の免疫複合体を用いることによって、免疫複合体のカテプシンＳ抗体部分がこの作用に対抗すると期待される。さらに、免疫複合体の抗体部分は、化学療法薬よりも、身体において長期の活性半減期を有し、そのため、結合している化学療法薬によって引き起こされるカテプシンＳ上方調節の作用に対抗し得ると期待される。

抗カテプシンＳ抗体分子及び化学療法薬からなる免疫複合体は、本発明のさらなる態様を形成する。一実施形態では、抗体分子は、プロテアーゼ、例えば、カテプシンによって化学療法薬から切断可能である。

本発明において使用するための抗体分子は、さらなる修飾を含み得る。例えば、抗体は、グリコシル化、ペグ化していてもよいし、又は、アルブミン若しくは非タンパク質性ポリマーと結合していてもよい。抗体分子は、免疫複合体の形であってもよい。

薬剤、例えば、小分子又は抗体の、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する能力は、任意の適した方法を用いて試験してよい。例えば、蛍光アッセイを用いてもよい。このようなアッセイでは、任意の適した蛍光物質、例えば、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いてよい。薬剤は、カテプシンＳのタンパク質分解活性を統計的に有意な量で阻害する能力を有する場合に、カテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害すると考えられる。例えば、一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤として用いるための薬剤は、適当な対照抗体と比較した場合に、阻害活性を、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、５０％、７０％、８０％又は９０％阻害できる。

薬剤の、腫瘍細胞浸潤を阻害する能力は、当技術分野で公知の任意の適した浸潤アッセイを用いて試験してよい。例えば、このような能力は、当技術分野で公知の、改変されたＢｏｙｄｅｎチャンバーを用いて試験してよい。抗体分子は、任意の適した腫瘍細胞株、例えば、前立腺癌細胞株、例えば、ｐＣ３、星細胞腫細胞株、例えば、Ｕ２５１ｍｇ、結腸直腸の癌細胞株、例えば、ＨＣＴ１１６又は乳癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１若しくはＭＣＦ７を用いて試験してよい。薬剤は、浸潤を統計的に有意な量で阻害する能力を有する場合に、腫瘍細胞浸潤を阻害すると考えてよい。例えば、一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤として使用するための薬剤は、適当な対照抗体と比較した場合に、浸潤を、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２５％、５０％、７０％、８０％又は９０％阻害できる。

薬剤の、血管新生を阻害する能力は、当技術分野で公知の任意の適したアッセイを用いて試験してよい。例えば、このような能力は、アッセイの節に記載されるアッセイ及び／又は実施例に記載されるアッセイ、例えば、マトリゲルベースのアッセイを用いて試験してよい。

本発明の特定の態様では、例えば、細胞集団において腫瘍細胞の存在を調べるためのアッセイでは、又はｉｎ ｖｉｖｏで細胞の存在を調べるための診断技術では、標識された抗体分子を使用してもよい。用いてもよい標識として、放射標識、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はビオチンが挙げられる。

核酸 本発明において使用するための核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。組換えによって、合成によって、又は当業者にとって利用可能な任意の手段、例えば、標準技術を用いるクローニングによって作製してもよい。

核酸は、任意の適当なベクター、例えば、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）、バキュロウイルス、酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド又はコスミドＤＮＡに挿入してよい。宿主細胞に核酸を導入するためにベクターを用いてもよく、宿主細胞は原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。

核酸の操作のための、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現並びにタンパク質の解析における、既知技術及びプロトコールに関するさらなる詳細については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２００５及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１参照のこと。

化学療法薬
上記のように、本発明のいくつかの実施形態では、例えば、カテプシンＳ阻害剤を用いる併用療法計画において、化学療法薬を使用してもよい。このような実施形態では、本発明において任意の適した化学療法薬を使用してもよい。例えば、使用してもよい薬剤として、代謝拮抗剤、ヌクレオシド類似体、チミジル酸合成酵素阻害剤、白金細胞傷害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。本発明において使用することができるチミジル酸合成酵素阻害剤の例として、５−ＦＵ、ＭＴＡ及びＴＤＸが挙げられる。一実施形態では、チミジル酸合成酵素阻害剤は、５−ＦＵである。使用することができる代謝拮抗剤の一例として、トムデックス（ＴＤＸ）がある。使用することができる白金細胞傷害剤の例として、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられる。本発明の一実施形態では、化学療法薬は、シスプラチンである。本発明では、任意の適したトポイソメラーゼ阻害剤を用いてよい。使用することができるヌクレオシド類似体の例として、それだけには限らないが、ゲムシタビン及びシタラビンが挙げられる。

本発明の特定の実施形態では、化学療法薬はトポイソメラーゼ阻害剤である。本発明では、任意の適したトポイソメラーゼ阻害剤を使用することができる。特定の実施形態では、トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシンである。本発明において使用することができる、適したトポイソメラーゼＩ阻害剤として、イレノテカン(irenotecan)（ＣＰＴ−１１）又はその活性代謝産物ＳＮ−３８がある。ＣＰＴ−１１は、切断又は切断複合体と呼ばれる可逆性共有結合反応中間体を安定化させることによって、細胞周期のＳ相において特異的に作用し、また、Ｇ２−Ｍ細胞周期停止を誘導する場合もある。

上記の特定の薬剤に加えて、又は、その代わりに本発明において使用することができる化学療法薬として、アルキル化剤；アルキルスルホネート；アジリジン；エチレンイミン；メチラメラミン；ナイトロジェンマスタード；ニトロソ尿素；代謝拮抗剤；葉酸類似体；プリン類似体；ピリミジン類似体；アンドロゲン；抗副腎；葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン；エダトレキサート；デホファミン(defofamine)；デメコルチン；ジアジクオン(diaziquone)；エフローミチン(elfomithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(ionidamine)；ミトグアゾン；ミトキサントロンがあり得る。

本発明の特定の実施形態では、化学療法薬は、フルオロピリミジン、例えば、５−ＦＵ又はその代謝産物である。５−ＦＵは、多数の癌、例えば、胃腸癌、乳癌及び頭頸部癌の治療において用いられる。５−ＦＵは、細胞内で、フルオロデオキシウリジンモノホスフェートＦｄＵＭＰに変換され、これが、５、１０−メチレンテトラヒドロホレート（ＣＨ２ＴＨＦ）と一緒になって、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）とともに安定な三重複合体を形成し、その結果、酵素阻害をもたらす。ＴＳは、ＣＨ２ＴＨＦによるデオキシウリジンモノホスフェート（ｄＵＭＰ）の還元的メチル化を触媒して、デオキシチミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰ）とジヒドロホレートとを生成する（Ｌｏｎｇｌｅｙら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、３：３３０−３３８、２００３）。この反応は、ＤＮＡ複製及び修復にとって必須である、ｄＴＭＰの唯一のｄｅ ｎｏｖｏ細胞内供給源を提供するので、ＴＳ阻害は、ＤＮＡ損傷をもたらす。５−ＦＵについては、細胞傷害性のＴＳに従わない機序、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡへのフルオロヌクレオチドの誤取り込みも記載されている（Ｌｏｎｇｌｅｙら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、３：３３０−３３８、２００３）。

特定の化学療法薬を参照する場合には、特定の薬剤の抗腫瘍活性を保持する類似体、例えば、生物学的に活性を有する誘導体及びその実質的な等価物も用いてよいということは理解しなければならない。

治療
「治療」は、ヒト又は非ヒト動物に恩恵を与え得る任意の投与計画を含む。治療は既存の状態に関するものである場合も、予防的なもの（予防的治療）である場合もある。治療は、治癒的作用、軽減作用又は予防的作用を含み得る。

「癌の治療」は、癌性増殖及び／又は血管新生化によって引き起こされる状態の治療を含み、また、腫瘍性増殖又は腫瘍の治療を含む。本発明を用いて治療できる腫瘍の例として、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫をはじめとする肉腫、癌腫、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、リンパ腫、例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、骨髄腫、ウィルムス腫瘍及び白血病、例えば、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病、星細胞腫、神経膠腫及び網膜芽細胞腫がある。

一実施形態では、結腸直腸腫瘍を治療するために、本発明を使用することができる。

本発明は、既存の癌の治療において、また初期治療又は手術後の癌の再発の予防において特に有用であり得る。

薬剤組成物
本発明の、及び本発明に従って使用するための薬剤組成物は、有効成分のほかに、製薬上許容される賦形剤、担体、バッファー安定化剤又は当業者に周知のその他の物質を含み得る（例えば、（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５参照のこと。）。このような物質として、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などのバッファー；抗酸化物質；保存料；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート剤；等張化剤(tonicifiers)及び界面活性剤があり得る。

本薬剤組成物はまた、好ましくは、本発明の組成物の活性に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する、治療されている個々の適応症のために必要に応じて選択される１種又は複数のさらなる活性化合物を含み得る。例えば、癌の治療では、併用計画投与が用いられる場合には、製剤又はキットは、カテプシンＳ阻害剤、例えば、抗カテプシンＳ抗体分子及び化学療法薬に加えて、さらなる成分、例えば、第２の、若しくはさらなるカテプシンＳ阻害剤、第２の、若しくはさらなる化学療法薬又はカテプシンＳ以外の標的に対する抗体、例えば、特定の癌の増殖に影響を及ぼす増殖因子に対する抗体を含み得る。

有効成分（例えば、抗体分子及び／又は化学療法薬）は、ミクロスフェア、マイクロカプセルリポソーム、その他の微粒子送達系によって投与してもよい。例えば、有効成分を、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）における、又はマクロエマルションにおける、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクレート）マイクロカプセルによって調製できるマイクロカプセル内に封入してもよい。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５参照のこと。

活性薬剤の送達に、徐放製剤を用いてもよい。徐放製剤の適した例として、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品の形、例えば、フィルム、坐剤又はマイクロカプセルである。徐放マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌグルタメートの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸共重合体及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

上記のように、核酸はまた、治療の方法において使用してもよい。本発明において使用するための核酸は、当技術分野で公知の任意の適した技術を用いて注目する細胞に送達してよい。核酸（ベクターに含まれていてもよい）は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ技術を用いて患者の細胞に送達してよい。ｉｎ ｖｉｖｏ技術については、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型又はアデノ随伴ウイルス）及び脂質ベースの系（例えば、脂質媒介性遺伝子導入に有用な脂質として、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌがある）を用いるトランスフェクションを用いてよい（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３（１９９２）参照のこと。国際公開第９３／２５６７３号パンフレットも参照のこと）。

ｅｘ ｖｉｖｏ技術では、核酸を、患者の単離細胞に導入し、患者に修飾された細胞が直接的に投与されるか、又は、例えば、多孔質膜内に被包され、これが患者に埋め込まれる（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号及び同第５，２８３，１８７号参照のこと）。生細胞に核酸を導入するために利用可能な技術として、レトロウイルスベクター、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用があり得る。

結合メンバー、薬剤、製剤又は組成物は、腫瘍部位若しくはその他の所望の部位に限局される方法で投与してもよいし、又は、腫瘍若しくはその他の細胞を標的とする方法で送達してもよい。ターゲッティング系、例えば、抗体又は細胞特異的リガンドを用いることによって、ターゲッティング療法を用いて、活性薬剤をより特異的に特定の細胞種に送達してもよい。種々の理由のために、例えば、薬剤が容認しがたく毒性である場合には、又はさもなければ、あまりにも高い投与量を必要とする場合には、又はそうでなくとも、標的細胞に入ることができない場合には、ターゲッティングが望ましい場合がある。

キット
本発明は、さらに、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の、同時投与、逐次投与又は別個の投与による併用療法のための、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬を含み、場合により、（ａ）及び（ｂ）の別個の投与、逐次投与又は同時投与のための使用説明書を含む薬剤キットにまで及ぶ。

用量
本発明の及び本発明において使用するためのカテプシンＳ阻害剤、抗カテプシンＳ抗体及び／又は化学療法薬は、必要に応じて、個体に「治療上有効な量」で適宜投与され、これは個体に、有益性を示すのに十分である。実際の投与計画は、治療されている状態、その重篤度、治療されている患者、用いられている薬剤をはじめとする、いくつかの因子に応じて異なり、また、医師の判断に従う。

併用療法計画において、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の両方が用いられる実施形態では、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬は、化学療法薬と同時投与してもよいし、別個に投与してもよいいし、逐次投与してもよい。それらは、別個に又は逐次投与される場合には、任意の適した時間内に、例えば、互いに、１、２、３、６、１２、２４、４８又は７２時間内に投与してよい。好ましい実施形態では、それらは、互いに６以内、好ましくは、２以内、より好ましくは、１以内、最も好ましくは、２０分以内に投与される。

併用療法計画において、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の両方が用いられる一実施形態では、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬は、相乗作用が生じる用量で投与される。

すなわち、増強比で投与される。本発明に関連して、用語「増強比」とは、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬が、組合せの細胞傷害活性が、いずれかの成分単独のもの又は個々の成分の活性に基づいた組合せについて予測される相加的な活性よりも高いような比で存在することを示すよう用いられる。

したがって、増強比では、個々の成分は相乗的に作用する。

相乗効果は、いくつかの方法を用いて定義することができる。

例えば、相乗効果は、Ｒｏｍａｎｅｌｉによって改変された（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４１：３８５−３９０、１９９８）、Ｋｅｒｎの方法を用いて（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４８：１１７−１２１、１９８８）、単一よりも大きなＲＩとして定義することができる。ＲＩは、Ａ及びＢの組合せについて観察された細胞生存（Ｓｏｂｓ）に対する、期待される細胞生存（Ｓｅ／薬物Ａ単独を用いて観察された生存及び薬物Ｂ単独を用いて観察された生存の積として定義される）の比として算出できる（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）。

その結果、相乗効果は、単一よりも大きなＲＩとして定義することができる。

別の方法では、相乗効果は、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの方法（Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ、２２：２７−５５、１９８４）に従って、組合せ指標（ＣＩ）を算出することによって調べることができる。１、＜１及び＞１というＣＩ値は、それぞれ、相加作用、相乗作用及び拮抗作用を示す。

本発明の実施形態では、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬は、１未満の、好ましくは、０．８５未満のＣＩを生じるのに十分な濃度で存在する。

相乗効果は、Ｒｏｍａｎｅｌｉによって改変されたＫｅｒｎの方法（１９９８ａ、ｂ）を用いて、単一よりも大きいＲＩとして定義されることが好ましい。ＲＩは、Ａ及びＢの組合せについての観察された細胞生存（Ｓｏｂｓ）に対する、期待される細胞生存（薬物Ａ単独を用いて観察された生存及び薬物Ｂ単独を用いて観察された生存の積として定義される、Ｓｅｐ）の比として算出できる（ＲＩ＝Ｓｅ／Ｓｏｂｓ）。その結果、相乗効果は、単一よりも大きなＲＩとして定義することができる。

本発明の一実施形態では、前記カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬は、１．５よりも大きな、例えば、２．０よりも大きな、例えば、２．２５よりも大きなＲＩを生じるのに十分な濃度で提供される。

本発明の一実施形態では、組み合わせた薬物は、したがって、腫瘍細胞を治療するために用いられると相乗作用を生じる。

アッセイ
化学療法薬に応じて腫瘍細胞の細胞表面上でカテプシンＳが上方調節されるということを決定することによって、化学療法薬が、患者の組織においてこのような効果を有するかどうかを調べるアッセイを提供することが可能となる。 したがって、本発明のさらなる態様では、化学療法薬の存在に対する被験体由来の腫瘍細胞の反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価して、化学療法薬を用いた治療に対するｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の反応を予測する方法であって、（ａ）腫瘍細胞を含有する被験体由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ試料を提供するステップと、（ｂ）前記腫瘍細胞の試料の一部を、前記化学療法薬に曝露するステップと、（ｃ）前記細胞の表面上でのカテプシンＳの発現を、前記化学療法薬に曝露されていない前記試料の対照部分におけるカテプシンＳの発現と比較するステップとを含み、前記化学療法薬に曝露された試料の一部における発現増強が、前記化学療法薬に対する感受性を示す方法が提供される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態では、前記化学療法薬に曝露された試料における発現が、前記化学療法薬に曝露されていない前記試料の対照部分における１種又は複数の遺伝子のものよりも、少なくとも３倍、好ましくは、少なくとも４倍、より好ましくは、少なくとも５倍、さらにより好ましくは、少なくとも７倍、さらにより好ましくは、少なくとも１０倍、最も好ましくは、少なくとも１２倍である場合に増強されていると考えられる。

このようなアッセイを用いて、個々の患者における化学療法薬及びカテプシンＳ阻害剤を用いる併用療法の適合性を調べることができる。

本方法を代替的に又は付加的に用いて、例えば、種々の時点の生検試料を用いて疾患進行をモニターすることができる。このような実施形態では、前記化学療法薬に曝露されていない対照試料に対してカテプシンＳの発現を比較する代わりに、カテプシンＳの発現を、より以前の時点、例えば、数日、数週又は数ヶ月以前の同一組織から得られた試料に対して比較する。

腫瘍又は癌の性質は、本発明の方法に用いられる試料の性質を決定する。試料は、例えば、腫瘍組織生検、骨髄生検又は例えば、血液中の循環腫瘍細胞から得た試料であり得る。又は、例えば、腫瘍が胃腸腫瘍である場合には、腫瘍細胞は、便試料から単離してもよい。腫瘍細胞のその他の供給源として、血漿、血清、脳脊髄液、尿、間質液、腹水液などが挙げられる。

例えば、固形腫瘍は、抗生物質を含む完全組織培養培地において集めることができる。

細胞は、腫瘍試料から手作業によってはがすか、必要に応じて、コラゲナーゼ／ＤＮアーゼとともにインキュベーションすることによって酵素によって脱凝集させ、例えば、ヒト又は動物血清を含有する適当な培地に懸濁してもよい。

その他の実施形態では、生検試料を、単離して凍結するか、固定液、例えば、ホルマリン中に固定してもよい。次いで、試料を、後の段階で遺伝子の発現レベルについて試験してもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、細胞生存、増殖又は血管新生に対する、カテプシンＳ抗体分子又は併用療法の作用を試験することが所望される場合がある。これらの作用は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて試験してよい。いくつかの適したアッセイが、実施例に記載されている。その他のものとして、以下が挙げられる：

細胞生存及び増殖アッセイ
腫瘍細胞に対する、抗体の細胞傷害効果及び増殖促進効果を試験でき、例えば、先に記載されるように、Ｕ２５１ｍｇ星細胞腫細胞で試験できる。手短には、細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）のウェルあたり終濃度１×１０４個細胞／２００μｌになるまで加える。適当な濃度のモノクローナル抗体（１００ｎＭ）又はビヒクルのみの対照培地を加える。プレートを、３７℃及び５％ＣＯ２で、それぞれ２４、４８、７２及び９６時間インキュベートする。インキュベートした後、ｌ０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴを加え、３７℃及び５％ＣＯ２でさらに２時間インキュベートする。培地を注意深く除去し、ホルマザン結晶を１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯに溶解する。上記のように吸光度を測定し、結果を、各ビヒクルのみの対照と比較した細胞生存及び増殖のパーセンテージとして表す。すべての試験は、４つ組で実施する。

いくつかのアッセイを用いて、血管新生に対する分子の作用を調べることができる。実施例では、大動脈輪モデルが記載されている。その他のものとして、以下が挙げられる：

創傷アッセイ
このｉｎ ｖｉｔｒｏ遊走は、Ａｓｈｔｏｎらによって記載された方法（１９９９）の改変された形である。ガラススライド上の個々のチャンバーにＨＭＥＣ−１を播き、９０％の集密度まで一晩増殖させる。培地を除去し、単層を傷つける。単層に新鮮培地を再補給し、必要な最終濃度を得るのに必要な容積の抗体を加える。

スライドを、創傷が完全に閉じるまで、定められた時点で回収し、次いで、４％ ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定する。「創傷」閉鎖の程度を、独立した調査者によって顕微鏡によって盲検的に評価し、２０×倍率で、目盛定めされた接眼目盛付レンズ（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を用いて定量する（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ ５０）。抗体処理スライドにおける閉鎖の程度を、時間の対応した偽処理された対照と比較し、時間の対応した対照と比較した損傷閉鎖の阻害％を算出する。

スポンジアッセイ
ポリエーテルスポンジを、Ｃ５７ブラックマウスに皮下移植し、隔日で１０ｎｇのｂＦＧＦ又は１０ｎｇのｂＦＧＦ＋抗体を注射する。１４日の処理の後、スポンジを回収し、切片にし、Ｈ＆Ｅ（Ａ）で染色する。

酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）新生仔マウスモデル
本調査に用いた酸素誘導性網膜症の動物モデルは、Ｓｍｉｔｈらによって記載され、現在では、網膜新血管形成に対する抗血管新生治療を試験する研究のために広く用いられているものである（Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。同腹仔の出生後のマウス及びその授乳している雌親を、出生後７日（Ｐ７）に７５％酸素に入れ、Ｐ１２に大気に戻す。５日間の酸素過剰の間は、中心網膜毛細血管床が血管退縮を受け、発達を停止する。大気に戻すと、中心網膜は、ＶＥＧＦファミリーの血管原性増殖因子の増加に関連してある程度低酸素になる。積極的な新生血管応答に、Ｐ１５まで過剰の網膜新血管発生が後に続く。新血管形成は、Ｐ１７で最大であり、Ｐ２１の後、後退する。

固定していない神経網膜を解剖し、ＲＩＰＡバッファー中で超音波破壊にかける。ＨＰ−タンパク質結合の定量のために、ＨＰ競合酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法のために、Ｐ１３及びＰ１７マウスから網膜試料を調製する。手短には、１００μｌの試料又は標準物質を、２つ組で、９６ウェルポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）においてＰＢＳ／５％ Ｔｗｅｅｎ２０で段階希釈し、２５μｌのＨＰに対するウサギポリクローナル抗体（ＰＢＳ／５％ Ｔｗｅｅｎ中、１：３３００）とともに３７℃で１時間インキュベートする。次いで、各ウェルの内容物を、固相抗原（炭酸バッファー、ｐＨ９．６中、１：５０００）を用いて４℃で一晩プレコーティングされており、１％ゼラチンで１時間ブロッキングされているＮＵＮＣ Ｃ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに移す。固相と可溶性抗原の間の競合を、３７℃で１時間進行させ、その後、ウェルをＰＢＳ／５％Ｔｗｅｅｎを用いて５分で４回洗浄し、各ウェルに１００μｌの１：２０００アルカリホスファターゼヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加える。次いで、プレートを、ＰＢＳ／５％Ｔｗｅｅｎを用いて５分で４回洗浄し、各ウェルに１００μｌの１０％ジエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．６）に溶解した１ｍｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ基質、４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩・六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加える。その後の反応物の着色を、Ｓａｆｉｒｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で、５分毎に２時間４０５ｎｍで測定し、Ｍａｇｅｌｌａｎ３ソフトウェアを用いて反応動態を分析する。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ酵素反応速度標準曲線に対して比較することによって、試料ＨＰ−１結合を求め、試料タンパク質濃度の割合として表す。アッセイに用いる固相抗原は、ＨＰであり、これはウシ血清アルブミンに還元的に結合されている。スチューデントのＴ検定を用いて統計分析を実施し、Ｐ値＜０．０５を有意と考える。

本発明をここで、以下の限定されない実施例においてさらに記載する。添付の図面が参照される。

材料及び方法細胞株及び培養条件
ＨＣＴ１１６（ｐ５３野生型）ヒト結腸直腸腺癌細胞株を、ＭｃＣｏｙｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）で維持した。ＲＫＯ（ｐ５３野生型）、Ｈ６３０（ｐ５３突然変異体）及びＨＴ２９（ｐ５３突然変異体）結腸直腸腺癌細胞株は、「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）で維持した。すべての培地には、１０％ ＦＣＳ、１％ ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１％ Ｌ−グルタミン（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を補給した。

細胞株の化学療法薬での処理
対数増殖期の細胞を、６ウェルの組織培養プレートに、約２０％の集密度で播種し、一晩インキュベートして、プレートに接着させた。ウェルを、種々の濃度（７．５μＭを含む）のＣＰＴ１１（イリノテカン）及び５−Ｆｕ（フルオロウラシル）で４８時間処理した。対照ウェルでは、化学療法を生理食塩水に置き換えた。

ウェスタンブロッティング
細胞を、ＰＢＳで洗浄し（１５００ｒｐｍで５分、遠心分離）、その後、上述のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＫ）を含有するＲＩＰＡバッファーに溶解した。全細胞溶解物を、等濃度で１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルを、５０Ｖで一晩流し、その後、２０Ｖで４５分間、ニトロセルロースメンブランに半乾燥トランスファーした（ＢｉｏＲａｄ、ＵＫ）。このニトロセルロースメンブランを、ＰＢＳ（３％粉ミルク）を用いて約１時間ブロッキングし、ＰＢＳ（０．０１％ ｔｗｅｅｎ）で５分間、３回洗浄した。次いで、このメンブランを、ＰＢＳ（３％粉ミルク）で１：１０００希釈したＣａｔＳ Ｍａｂ（１Ｅ４ Ｍａｂ又は１Ｅ１１ Ｍａｂ）を用いて１時間プローブした。このメンブランを、ＰＢＳ（０．０１％ ｔｗｅｅｎ）で５分間、３回洗浄し、その後、ＰＢＳ（３％粉ミルク）で１：５０００希釈した二次ヤギ抗マウスＨＲＰ結合抗体（ＢｉｏＲａｄ、ＵＫ）を１時間加えた。次いで、これをＰＢＳ（０．０１％ ｔｗｅｅｎ）で各５分間、３回洗浄した。このメンブランを、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、ＥＣＬ（増強化学発光）によって「発現させた」。このメンブランを、ＥＣＬ溶液中で５分間インキュベートし、その後、写真用フィルムに種々の時間曝露した。写真用フィルムを、現像溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）で１分間洗浄し、水ですすぎ、定着液（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）でやはり１分間洗浄し、その後、すすぎ、乾燥させた。

フローサイトメトリー
細胞を、スクレーパーを用いて組織培養プレートから回収し、ＰＢＳ（０．０１％ ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した（１５００ｒｐｍで５分遠心分離）。およそ５×１０５個の細胞を、適切にラベルをつけた試験管に入れた。細胞を、５０μｌの抗ＣａｔＳ又はアイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）とともに室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、各試験管を、ＰＢＳ（０．０１％ ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した（１５００ｒｐｍで５分遠心分離）。次いで、試料を、１：１５希釈のＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）とともにインキュベートした（試料は暗所、室温で維持した）。インキュベーション後、各試験管を、ＰＢＳ（０．０１％ ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した（１５００ｒｐｍで５分遠心分離）。試料を、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、その後、シアンフローサイトメーター（Ｄａｋｏ、ＵＫ）を用いて即時分析した。

ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＴＣ ２２５ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて実施した。ＲＮＡは、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＵＳＡ）を用い、製造業者の使用説明書に従って回収し、１μｇのＲＮＡと逆転写酵素キット（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーセットは、ＣａｔＳフォワードプライマー５’− ＡＣＴ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＧＴ Ｇ−３’及びＣａｔＳリバースプライマー５’−ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＣＣ ＧＡＡ ＴＡＴ ＡＴＣ Ｃ−３’及びβ３インテグリンプライマー５’−ＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＣＣＴ−３’及び５’−ＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＴＧ−３’であった。遺伝子発現は、２５μｌ Ｂｉｏｍｉｘ；１．５μｌのフォワードプライマー；１．５μｌのリバースプライマー；２μｌのｃＤＮＡ；２０μｌのｄＨ２Ｏを含有するｂｉｏｍｉｘ ＰＣＲ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＵＫ）を用いて分析した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の最初の変性ステップと、それに続く、９５℃で３０秒間；５５℃で３０秒；７２℃で９０秒の３２又は４５サイクルのいずれか、７２℃で１０分間の最終伸長からなっていた。３２及び４５サイクルの反応から得られた増幅産物のうち５μｌを、１．５％アガロースゲル（０．００１％エチジウムブロマイド）にロードし、これを、９０Ｖで４０分間流し、その後ＵＶボックス上で分析した。

異種移植モデル
６〜８週齢の雌のＳＣＩＤマウスに、２×１０６個のＨＣＴ１１６＋／＋ヒト結腸直腸腺癌細胞を、各側腹部に移植した。対数増殖期のＨＣＴ１１６細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁した。それらを、等容積のマトリゲルと混合して、最終濃度５×１０６個細胞／ｍｌとした。マウスを、移植の５日目に処理群に無作為に分け、５Ｆｕ（１５ｍｇ／ｋｇ毎日又は７０ｍｇ／ｋｇ週２回）を施すか／施さない、ＣａｔＳ Ｍａｂ又はアイソタイプ対照 Ｍａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の種々の投与計画で処理した。すべての薬物を、ボーラス注射によって投与した。種々の時点で動物を屠殺し、分析のために腫瘍を採取した。

免疫組織化学
ホルマリン固定された異種移植片／臓器組織試料のパラフィン包埋、切片切断及び組織切片のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色は、先に記載されるとおり実施した。免疫染色は、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ法を用いて実施した（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ ＡＢＣキット）。

手短には、切片を、キシレンからアルコール、流水に通すことによって脱パラフィンした。メタノール中、３％ Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベーションすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。次いで、切片を、クエン酸バッファー、ｐＨ６．０中で２２分間煮沸した。５％正常ウマ血清ブロッキング溶液中でのインキュベーションを、室温で２０分間実施した。切片を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。適当なアイソタイプ対照を、一次抗体と同一の希釈で用いた。

ペルオキシダーゼ染色のために、切片を、ビオチン化汎特異的二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに、室温で３０分間インキュベートし、続いて、ベクタステインＥｌｉｔｅ ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに、室温でさらに３０分間インキュベートした。可視化するために、切片を３，３’−ジアミノベンジジンで染色し、ＧｉｌｌのＩＩヘマトキシリン溶液で対比染色した。切断型カスパーゼ−３ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた染色を、製造業者の使用説明書に従って実施した。抗体局在の検出のために、異種移植モデルへの先の投与後に、一次抗体インキュベーションステップは必要でなかった。

ＡｃｃｕＭａｘ（商標）アレイスライドを、ＣａｔＳモノクローナル抗体及び二次ビオチン化ウマ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）の１：１００希釈を用い、製造業者の使用説明書に従って染色した。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、その後、マウントして分析した。

共焦点顕微鏡
前記のように、ＣａｔＳモノクローナル抗体を用いてＣａｔＳ発現についてＨＣＴ１１６細胞を染色した。細胞をガラスカバースリップ上で増殖させ、氷冷アセトンを用いて固定して１：１００希釈のＣａｔＳ抗体とともにインキュベートした。カバースリップをＰＢＳですすぎ、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識二次抗体とともにインキュベートした。ＰＢＳを用いてカバースリップを再度洗浄し、ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒマウント媒体を用いてマウントして共焦点顕微鏡によって可視化した。

毛細血管様管形成アッセイ
ＣａｔＳ ｍＡｂの、内皮細胞管形成に対する作用を、以下のとおりに評価した。２００マイクロリットルのマトリゲル（１０ｍｇ／ｍｌ）を、予備冷却した４８ウェルプレートに適用し、４℃で１０分間インキュベートし、次いで、３７℃で１時間重合させた。細胞を、２００ｎＭの適当な抗体を含有する内皮増殖細胞培地ＭＶ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）に懸濁した。各ウェルに５００マイクロリットル（１×１０５個細胞）を加えた。対照として、適当な容積のＰＢＳを含有するビヒクルのみの対照培地とともに細胞をインキュベートした。３７℃及び５％ ＣＯ２で２４時間インクキュベートした後、細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００顕微鏡を用いて見た。

細胞生存及び増殖アッセイ
Ｕ２５１ｍｇ星細胞腫細胞に対する、ＣａｔＳモノクローナル抗体の細胞傷害効果及び増殖増殖促進効果は、先に記載したとおり試験できる。手短には、細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）のウェルあたり終濃度１×１０４個細胞／２００μｌになるまで加える。適当な濃度のモノクローナル抗体（１００ｎＭ）又はビヒクルのみの対照培地を加える。プレートを、３７℃及び５％ ＣＯ２で、それぞれ、２４、４８、７２及び９６時間インキュベートする。インキュベーション後、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴを加え、３７℃及び５％ ＣＯ２でさらに２時間インキュベートする。培地を注意深く除去し、ホルマザン結晶を１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯに溶解する。吸光度を上記のように測定し、結果を、各ビヒクルのみの対照に対する細胞生存及び増殖のパーセンテージとして表す。すべての試験は、４つ組で実施する。

創傷アッセイ これらの研究に用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎらによって記載された方法（１９９９）の改変された形である。ガラススライド上の個々のチャンバーにＨＭＥＣ−１を播き、９０％コンフルエンスまで一晩増殖させる。培地を除去し、単層を傷つける。単層に新鮮培地を再補給し、必要な最終濃度を得るのに必要な容積の抗体を加える。

スライドを、創傷が完全に閉じるまで、定められた時点で取り出し、次いで、４％ ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定する。「創傷」閉鎖の程度を、独立した調査者によって顕微鏡によって盲検的に評価し、２０×倍率で、目盛定めされた接眼目盛付レンズ（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を用いて定量する（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ ５０）。抗体処理スライドにおける閉鎖の程度を、時間の対応した偽処理された対照と比較し、時間の対応した対照と比較した損傷閉鎖の阻害％を算出する。

ラット大動脈モデル 雄のウィスターラットを安楽死させ、胸部大動脈を無菌的に採取し、１ｃｍ厚の環の切片にする。これらの環を滅菌培地で１０回洗浄して細菌をいずれも除去し、２４ウェルプレート上でマトリゲルに包埋する。これらのウェルに、２ｍｌの培地及び漸増濃度の抗体を補給する。プレートを８日間インキュベートし、インキュベーション後、マトリゲル及び環を、４％ ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで保存する。血管発生の程度を、独立した調査者によって顕微鏡によって盲検的に評価し、２０×倍率で、目盛定めされた接眼目盛付レンズ（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を用いて定量する（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ ５０）。各視野において、血管長、最大血管長及び血管数の程度を測定し、時間の対応した偽対照と比較し、阻害％を算出する。

スポンジアッセイ
ポリエーテルスポンジを、Ｃ５７ブラックマウスに皮下移植し、隔日で１０ｎｇのｂＦＧＦ又は１０ｎｇのｂＦＧＦ＋抗体を注射する。１４日の処理の後、スポンジを回収し、切片にし、Ｈ＆Ｅ（Ａ）で染色する。

酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）新生仔マウスモデル
本調査に用いた酸素誘導性網膜症の動物モデルは、Ｓｍｉｔｈらによって記載され、現在では、網膜新血管形成に対する抗血管新生治療を試験する研究のために広く用いられているものである（Ｓｍｉｔｈら、１９９４）。同腹仔の出生後のマウス及びその授乳している雌親を、出生後７日（Ｐ７）に７５％酸素に入れ、Ｐ１２に大気に戻す。５日間の酸素過剰の間は、中心網膜毛細血管床が、血管退縮を受け、発達を停止する。大気に戻すと、中心網膜は、ＶＥＧＦファミリーの血管原性増殖因子の増加に関連してある程度低酸素になる。積極的な新生血管応答に、Ｐ１５まで過剰の網膜新血管発生が後に続く。新血管形成は、Ｐ１７で最大であり、Ｐ２１の後、後退する。

固定していない神経網膜を解剖し、ＲＩＰＡバッファー中で超音波破壊にかける。ＨＰ−タンパク質結合の定量のために、ＨＰ競合酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法のために、Ｐ１３及びＰ１７マウスから網膜試料を調製する。手短には、１００μｌの試料又は標準物質を、２つ組で、９６ウェルポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）においてＰＢＳ／５％ Ｔｗｅｅｎ２０で段階希釈し、２５μｌのＨＰに対するウサギポリクローナル抗体（ＰＢＳ／５％ Ｔｗｅｅｎ中、１：３３００）とともに、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、各ウェルの内容物を、固相抗原（炭酸バッファー中、１：５０００、ｐＨ９．６）を用いて４℃で一晩プレコーティングされており、１％ゼラチンで１時間ブロッキングされているＮＵＮＣ Ｃ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに移す。固相と可溶性抗原の間の競合を、３７℃で１時間進行させ、その後、ウェルをＰＢＳ／５％Ｔｗｅｅｎを用いて５分で４回洗浄し、各ウェルに１００μｌの１：２０００アルカリホスファターゼヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加える。次いで、プレートを、ＰＢＳ／５％Ｔｗｅｅｎを用いて５分で４回洗浄し、各ウェルに１００μｌの１０％ジエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．６）に溶解した、１ｍｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ基質、４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩・六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加える。その後の反応物の着色を、Ｓａｆｉｒｅマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で、５分毎に２時間４０５ｎｍで測定し、Ｍａｇｅｌｌａｎ３ソフトウェアを用いて反応動態を分析する。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ酵素反応速度標準曲線に対して比較することによって、試料ＨＰ−１結合を調べ、試料タンパク質濃度の割合として表す。アッセイに用いる固相抗原は、ＨＰであり、これはウシ血清アルブミンに還元的に結合されている。スチューデントのＴ検定を用いて統計分析を実施し、Ｐ値＿０．０５を有意と考える。

結果
この研究では、結腸直腸癌細胞株に対するＣａｔＳの発現及び化学療法の、ＣａｔＳ発現を誘導する能力を調べた。さらに、腫瘍の発生、並びに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ両方における生存に対する、抗ＣａｔＳ特異的モノクローナル抗体の作用を調べた。

実施例１〜３
ｍＲＮＡ、タンパク質及び細胞表面レベルでＣａｔＳ発現を調べた。 実施例１：ＲＴ半定量的ＰＣＲを用いて、ＣａｔＳのｍＲＮＡレベルを、７．５μＭ ＣＰＴ１１処理を施してか／施さずに、４種の結腸直腸細胞株（ＨＣＴ１１６＋／＋、ＲＫＯ＋／＋、Ｈ６３０ ｐ５３突然変異体及びＨＴ２９ ｐ５３突然変異体）において調べた。３２及び４５サイクルのＰＣＲ後にＲＮＡレベルを分析し、処理及び未処理試料間の発現における相対的差異を調べた。４種の細胞株すべてがＣａｔＳの基礎発現を示したが、図１に示されるように、ＨＣＴ１１６＋／＋及びＲＫＯ＋／＋細胞株の両方は、化学療法に応じて発現の増大を示した。

実施例２：３種の細胞株（ＨＣＴ１１６＋／＋、ＲＫＯ＋／＋及びＨＴ２９）から作製した全細胞溶解物調製物でウエスタンブロット解析を実施することによって、タンパク質レベルでＣａｔＳ発現を調べた。ＨＣＴ１１６＋／＋及びＲＫＯ＋／＋細胞株の両方について、４８時間のＣＰＴ１１処理（７．５μＭ）を施した／施さない試料で全細胞溶解物を調製した。３種の細胞株すべてがＣａｔＳの陽性発現を示し（図２）、全タンパク質発現レベルでは、処理及び未処理ＨＣＴ１１６＋／＋又はＲＫＯ＋／＋試料間に、明らかな相違がないことは明らかである。

実施例３：ＣａｔＳの細胞表面発現を、フローサイトメトリーを用いて調べた。ＨＣＴ１１６＋／＋、ＲＫＯ＋／＋及びＨ６３０ ｐ５３突然変異細胞を、ＣＰＴ１１処理を施してか／施さずに細胞表面発現について分析した。ＲＫＯ＋／＋細胞株は３８％陽性基礎細胞表面発現を示し、これは化学療法誘導後に４９％に増大した（図３Ａ〜Ｂ）。ＨＣＴ１１６＋／＋細胞株は３９％陽性基礎細胞表面発現を示し、これは化学療法誘導後に５９％に増大した（図３Ｃ〜Ｄ）。Ｈ６３０ ｐ５３突然変異細胞株は３７％陽性基礎細胞表面発現を示し、これは化学療法誘導後に４１％に増大した（図４Ａ〜Ｂ）。

実施例４ 腫瘍細胞の細胞表面上でのカテプシンＳの存在を、共焦点顕微鏡を用いてさらに確認した。前記のようにＣａｔＳモノクローナル抗体を用いてＣａｔＳ発現についてＨＣＴｌｌ６細胞を染色した。結果を図５に示す。１Ｅ１１ ＣａｔＳモノクローナル抗体を用いる免疫細胞化学的分析は、ＣａｔＳ発現がＨＣＴｌｌ６細胞の細胞表面に局在していることを示し、このことは、フローサイトメトリー分析によっても確認され、これでは、ＣａｔＳについて染色されたＨＣＴ１１６細胞において、アイソタイプ対照と比較して蛍光強度の３８％増大が観察された。

実施例５ 対照的に、結腸の正常切片は、結腸直腸癌について実証される細胞表面上でのカテプシンＳの発現を示さない。図６は、結腸直腸癌生検におけるＣａｔＳ発現の免疫組織化学的検出の結果を示す。組織切片を、成熟ヒトＣａｔＳプロテアーゼに対して作製されたモノクローナル抗体を用いて、ＣａｔＳ発現について染色した。ヒト結腸の正常切片の染色は、ＣａｔＳについてほとんど又は全く染色を示さなかったのに対し、結腸直腸癌生検切片は、ＣａｔＳの濃い染色を有していた。

実施例６ カテプシンＳは、アテローム性動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄において、血管平滑筋細胞表面上で受容体としてのインテグリンαｖβ３と共局在化すると報告されている（Ｃｈｅｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６、１６８：６８５−６９４）。

本発明者らは、本明細書において実証された腫瘍細胞の表面上でのカテプシンＳの局在が、このようなインテグリンと関連しているかどうかを調べた。ＨＣＴ１１６＋／＋、結腸直腸癌細胞における、３５サイクルのＰＣＲ後のＣａｔＳ及びβ３インテグリンＲＮＡ発現の分析の結果を示す図７に示されるように、カテプシンＳは強力に発現されるが、β３インテグリンＲＮＡ発現は示されず、このことは、腫瘍細胞の細胞表面上でのカテプシンＳの局在は、アテローム性動脈硬化症の状態下の血管平滑筋細胞におけるその発現と関係ないことを示す。

実施例７ 次いで、化学療法薬５Ｆｕ及びカテプシンＳ阻害抗体１Ｅ１１（本明細書では、ＣａｔＳ Ｍａｂとも呼ばれる）を用いる併用療法の効果に対する研究を実施した。

ＧＢ０５０７２１９．４及びＧＢ０５０７２７２．３からの優先権を主張する、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属ＰＣＴ出願国際公開第２００６／１０９０４５号パンフレットに示されるように、この抗体は強力な阻害活性を有する。蛍光性基質を用いる蛍光分析では、抗体は、ＣａｔＳのタンパク質分解活性を阻害する。さらに、ＰＣ３前立腺癌細胞株、Ｕ２５１ｍｇ星細胞腫細胞株、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞株、ＭＤＭＢ２３１乳癌細胞株及びＭＣＦ７乳癌細胞株を用いる浸潤アッセイにおいて、この抗体は腫瘍細胞浸潤をも強く阻害することがわかった。さらに、マトリゲルアッセイにおいて、この抗体の抗血管新生作用が実証され、これでは、抗体は毛細血管細管形成を阻害することがわかった（後記参照のこと）。

ＣａｔＳのｉｎ ｖｉｖｏ発現への研究を、結腸直腸癌の異種移植モデルで実施した。化学療法薬５Ｆｕ、ＣＰＴ−１１及びオキサリプラチン（１５ｍｇ／ｋｇ−７０ｍｇ／ｋｇ用量）を単独又は１０ｍｇ／ｋｇ １Ｅ１１ ＣａｔＳモノクローナル抗体と組み合わせて用い、モデルを処理した。処理後の抗体局在について、パラフィン包埋した組織切片を調べた。５−Ｆｕと組み合わせたＣａｔＳ Ｍａｂで処理した動物から得た腫瘍試料は、ＩｇＧについて陽性に染色され（図８ａ及び８ｂ）、このことは、ＣａｔＳ Ｍａｂは、陽性に発現する腫瘍細胞に上手く向けられ得るということを示す。

実施例８ 処理後の構築上の変化について、すべての主要なマウス臓器を調べた。病理学的変化の徴候は見られなかった。図９は、異種移植モデル臓器における、９日の薬物投与計画（ＣａｔＳ １Ｅ１１＋５Ｆｕ（ＩＣ５０））後の胃及び肝臓切片の写真を示す。ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、化学療法と組み合わせた１０ｍｇ／ｋｇの１Ｅ１１ Ｍａｂでの反復処理が不都合な毒性作用を有さないことを示唆する（図９）。

実施例９ １Ｅ１１ ｍＡｂを用いて腫瘍切片を染色し、ＣａｔＳ発現を検出した（図１０）。マウスＩｇＧアイソタイプを対照として用いた。図１１及び１３は、５−Ｆｕで処理したマウスから得た腫瘍切片においてＣａｔＳ発現の上方調節が観察されることを示すと共に、図１２は、ＣＰＴ−１１で処理したマウスから得られた切片における同様の結果を示す。

実施例１０ 腫瘍組織に対する併用療法の効果を、抗切断型カスパーゼ−３ポリクローナル抗体を用いて調べた（図１４）。処理組織においてカスパーゼ３活性の増大が観察され、このことは、ＣａｔＳ Ｍａｂが、アポトーシスに対する影響を有していることを示す。

実施例１１ ＣａｔＳ抗体はヒト内皮細胞において管様形成を阻害し得る Ｇｒａｎｔら、（Ｃｅｌｌ １９８９年９月８日；５８（５）：９３３−４３）によって記載されるマトリゲル形態形成アッセイを用い、内皮細胞が形成する管様構造が、個々の細胞から伸びた浸潤芽とともに近隣の内皮細胞と接触を形成するのを可能にするマトリゲル上で培養したヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を用いて毛細血管細管形成アッセイを実施した。図１５ａは、２種のＣａｔＳ抗体（１Ｅ１１及び１Ｅ４）又はアイソタイプ対照の存在下でＨＭＥＣ細胞を培養した場合の結果を示す。広範囲の管様構造が、ビヒクルのみの対照及びアイソタイプ対照抗体（２００ｎＭ）パネルで表れるが、この管形成は、１Ｅ１１（ｍＡｂ１）又は１Ｅ４（ｍＡｂ２）抗体（２００ｎＭ）の存在下ではほとんど完全に消滅する。次いで、これらの結果を定量化して図１５ｂに示したが、これは、１Ｅ１１（上部パネル）又は１Ｅ４（下部パネル）の存在下で観察される毛細血管細胞分岐の阻害を示す。

両抗体はこれまでに、ＣａｔＳと特異的に結合し、その他のカテプシン、特に、ＣａｔＳと最大の相同性を有するものと交差反応性がないことがわかっている。抗体１Ｅ１１及び１Ｅ４は両方とも、ＣａｔＳの触媒活性を阻害するその能力に特徴があり、１Ｅ１１は、ＣａｔＳの活性を特異的に阻害できるが、１Ｅ４は、識別可能な効果はない。したがって、毛細血管−管アッセイから得た結果は、阻害又は非阻害ＣａｔＳ ｍＡｂのいずれかによって、内皮細胞から分泌された活性を有するＣａｔＳを捕捉することは、内皮細胞の、管様構造への遊走及び配置を妨げるのに十分であるということを示す。

実施例１２ ＣａｔＳ抗体はラット大動脈弓ｅｘ ｖｉｖｏモデルにおいて管様形成を阻害できる 血管新生におけるＣａｔＳのさらなる役割を評価するために、ｅｘ ｖｉｖｏラット大動脈弓アッセイを実施した。大動脈の切片（１ｍｍ）を、阻害抗体及び適当な対照の存在下、マトリゲルの薄層内で培養した。対照と比較した、血管の数、平均血管長及び最大血管長の減少を測定することによって、大動脈からの管様血管の形成を７日後にモニターして定量した。

図１６は、ＣａｔＳ １Ｅ１１抗体の存在下での管形成の有意な阻害を示す。管セグメントの写真が、図１６ａに示されており、結果は図１６ｂに要約されている。ラット大動脈輪セグメントの、最大６００ｎＭの１Ｅ１１とのインキュベーションは、総血管数、平均血管長及び最大血管長の８０％を超える減少をもたらした（図１６ｂ）。

図１７は、ＣａｔＳ １Ｅ１１抗体の存在下での反復実験における管形成の有意な阻害を示す。環セグメントの写真が、図１７ａに示されており、結果は図１７ｂに要約されている。ラット大動脈輪セグメントの、最大１０μｇ／ｍｌの１Ｅ１１とのインキュベーションは、総血管数の７０％の減少、並びに、平均血管長及び最大血管長両方の６０％の減少をもたらした。

この明細書において言及されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。記載される本発明の実施形態への種々の改変及び変化は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される発明は、このような具体的な実施形態に過度に制限されてはならないということは理解されなければならない。実際、記載される、本発明を実施する様式の種々の改変は、当業者に明らかであり、本発明によって対象とされるものとする。

参考文献
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Claims (6)

1. カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の同時投与、逐次投与又は別個の投与による腫瘍性疾患の併用治療のための医薬の調製におけるカテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の使用であって、
   前記カテプシンＳ阻害剤が、抗カテプシンＳ抗体であり、
   前記抗カテプシンＳ抗体は、腫瘍細胞の表面上で発現するカテプシンＳと結合し、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害するものであり、
   前記化学療法薬が、代謝拮抗剤、ヌクレオシド類似体、チミジル酸合成酵素阻害剤、白金細胞傷害剤及びトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選ばれる、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の使用。
2. カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬を含む薬剤組成物であって、
   前記カテプシンＳ阻害剤が、抗カテプシンＳ抗体であり、
   前記抗カテプシンＳ抗体は、腫瘍細胞の表面上で発現するカテプシンＳと結合し、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害するものであり、
   前記化学療法薬が、代謝拮抗剤、ヌクレオシド類似体、チミジル酸合成酵素阻害剤、白金細胞傷害剤及びトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選ばれる、薬剤組成物。
3. カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬の同時投与、逐次投与又は別個の投与による併用療法のための、カテプシンＳ阻害剤及び化学療法薬を含む薬剤キットであって、
   前記カテプシンＳ阻害剤が、抗カテプシンＳ抗体であり、
   前記抗カテプシンＳ抗体は、腫瘍細胞の表面上で発現するカテプシンＳと結合し、カテプシンＳのタンパク質分解活性は阻害するものであり、
   前記化学療法薬が、代謝拮抗剤、ヌクレオシド類似体、チミジル酸合成酵素阻害剤、白金細胞傷害剤及びトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選ばれる、キット。
4. 前記抗カテプシンＳ抗体が、抗カテプシンＳ抗体分子及び化学療法薬の免疫複合体に含まれる、請求項２に記載の薬剤組成物。
5. 前記抗カテプシンＳ抗体が、抗カテプシンＳ抗体分子及び化学療法薬の免疫複合体に含まれる、請求項３に記載の薬剤キット。
6. 前記抗カテプシンＳ抗体が、抗カテプシンＳ抗体分子及び化学療法薬の免疫複合体に含まれる、請求項１に記載の使用。

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