WO2012108782A1 - Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты) - Google Patents

Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2012108782A1
WO2012108782A1 PCT/RU2011/000200 RU2011000200W WO2012108782A1 WO 2012108782 A1 WO2012108782 A1 WO 2012108782A1 RU 2011000200 W RU2011000200 W RU 2011000200W WO 2012108782 A1 WO2012108782 A1 WO 2012108782A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
growth factor
monoclonal antibody
fibroblast growth
cells
antibody according
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000200
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Илья Валерьевич ТИМОФЕЕВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Онкомакс"
Priority to US13/982,518 priority Critical patent/US20140105821A1/en
Priority to DE212011100195U priority patent/DE212011100195U1/de
Publication of WO2012108782A1 publication Critical patent/WO2012108782A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • Antibody that stops or slows the growth of a tumor
  • the invention relates to biotechnology, in particular to new antibodies, a method for suppressing tumor growth, based on blocking the pathway “human fibroblast growth factor / human receptor type 1 fibroblast growth factor (domains II and Schc)”, as well as a method for diagnosing malignant neoplasms.
  • the indicated pathological pathway leads to excessive proliferation of tumor cells and the formation of new vessels, which is accompanied by the growth of the primary tumor and metastases.
  • the described pathway is an independent mechanism of tumor resistance to drugs acting on other pathological pathways.
  • Blocking the pathway of fibroblast growth factor / receptor type 1 fibroblast growth factor type 1 by various substances that neutralize the receptor through binding to its domains II and Cc leads to a halt or slowdown of tumor growth.
  • this receptor can be used as a target for targeted delivery of diagnostic drugs, because is found in large numbers on the cells of many tumors.
  • An advantage of the invention is the development of new drugs for the diagnosis and treatment of diseases associated with excessive proliferation and neovascularization.
  • new blood vessels originates from the existing endothelium and is an important component of many diseases and disorders, including such as tumor growth and metastasis, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia, neovascular glaucoma, hemangiomas, immune transplant rejection cornea and other tissues, as well as chronic inflammation.
  • diseases and disorders including such as tumor growth and metastasis, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia, neovascular glaucoma, hemangiomas, immune transplant rejection cornea and other tissues, as well as chronic inflammation.
  • angiogenesis is especially important in the transition from hyperplasia to neoplasia, as well as for providing nutrition to a growing solid tumor (J. Folkman et al. Nature; 339, 58 (1989).
  • Angiogenesis also allows tumors to be in contact with the circulatory system of the host, as a result of which the direction of metastasis for the tumor cells can be determined.
  • the data confirming the role of angiogenesis in the metastasis of tumor cells were obtained, in particular, as a result of studies showing the relationship between the number and microvessel density in invasive breast cancer and the actual presence of distant metastases (N. Weidner et al. New Eng. J. Med., 324: 1 (1991).
  • FGF fibroblast growth factors
  • FGF belong to the family of heparin-binding polypeptides that modulate the functions of various cells.
  • RFF has a strong effect on the proliferation and differentiation of tumor and endothelial cells.
  • FRF heparin-binding polypeptides that modulate the functions of various cells.
  • FRF has a strong effect on the proliferation and differentiation of tumor and endothelial cells.
  • FRF heparin-binding polypeptides that modulate the functions of various cells.
  • FRFF 1-4 There are 4 types of RFF receptors (RFF 1-4). With FGF 1 binds not only the FGF 1 and 2, but most of the other members of this family, so that the role of this receptor in the signal transduction in the cell is considered to be the most significant.
  • FGFR1 consists of the supmembrane, intram Membrane and intracellular parts.
  • the supmembrane part of the receptor consists of 3 domains (D ⁇ - ⁇ ), similar to immunoglobulin.
  • FGF as a rule, interact with D II and III; heparan sulfate involved in the formation of the RFF / RFF 1 complex interacts with DZ.
  • Alternative mRNA splicing promotes the formation on the cell surface of several variants of F? PP (D Johnson, L. Williams. J Adv. Cancer Res., 60, 1 (1993); McKeehan et al. J Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol. , 59, 135 (1998).
  • the intracellular part of the receptor represented tyrosine kinase autophosphorylation at which there is a further signal transduction to the nucleus and cell division.
  • LMWH low molecular weight heparin
  • RRC metastatic renal cell carcinoma
  • KCRB-L01 Study of expression of FGFR in patients with renal cell carcinoma. Immunohistochemical analysis was performed on sections from paraffin tumor blocks of 140 patients with RCC. The results were compared with the expression of FRFR 40 healthy donors who are kidney biopsy was performed earlier for various reasons without the subsequent detect organ diseases. Expression ⁇ / ⁇ was detected in 98% of cases of primary kidney tumor cells and 82.5% of metastatic RCC in cells. In all cases, the staining intensity during immunohistochemical analysis was high (3+), which indicates a strong expression of the receptor. In 68%, nuclear staining was obtained. Expression of RFF 1 on the cells of healthy kidney tissue was detected in 1 case (2.5%>) due to staining of blood vessels. Thus, this study confirmed the assumption of the appearance and high expression of RGF 1 both on the cells of the primary tumor and in RCC metastases (I. Tsimafeyeu et al. ESMO-ECCO 09 (2009): table 1.
  • the concentration of RGF 1 and 2 was determined as the main factors with mitogenic activity in binding to RGF 1 in the blood plasma of 38 patients with metastatic RCC before the start of targeted therapy, with the progression of the disease on targeted therapy, as well as in blood plasma 38 healthy volunteers (ELISA method). It was found that in the blood of healthy people, the levels of both RFF were significantly lower compared with patients with metastatic RCC (table 2). The greatest differences were demonstrated for RFF 2 (p ⁇ 0.001).
  • VEGF sunitinib / sorafenib - vascular endothelial growth factor
  • FGF 1 antagonists including human monoclonal antibodies, can be used to inhibit tumor growth and its metastases.
  • the creation of conjugates of a monoclonal antibody (its fragments) to RGF 1 and contrast agents can be used in the diagnosis of malignant and other formations, the cells of which express RGF 1 in large numbers.
  • the aim of the invention was the creation of new antibodies for use in the method of suppressing tumor growth, which consists in blocking (neutralizing) domains II and SchF of RFF 1, as well as in the method of diagnosing tumors whose cells express RFF 1.
  • FRF 1 we mean the receptor corresponding to registration numbers in Uniprot international databases - PI 1362 and Entrez - 2260, namely its domains II and Cc (SEQ ID NO 12) were used as antagonist substances we synthesized highly specific neutralizing monoclonal antibody: 1) against FGFR1 domains II and Ric (10-1); 2) against FRF 1 and heparan sulfate (10-2).
  • monoclonal antibody is used hereinafter to mean an antibody obtained from a population of sufficiently homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies that make up the population are identical in their specificity and affinity, with the exception of possible naturally occurring mutations that may be present in minor quantities. Attention is drawn to the fact that as a result of such naturally occurring mutations monoclonal antibody composition of the present invention, which largely comprises an antibody capable of specifically binding the FGF-1 or complex ⁇ ⁇ / heparan sulfate or complexes FGF / or inhibit FGFR1 binding of FGF to FGF 1.
  • the term "monoclonal” indicates the nature of the antibody originating from a fairly homogeneous population of antibodies, but this does not mean that the antibodies must be produced in any particular way.
  • the monoclonal antibodies described in this invention can be obtained by hybridoma method (G. Koyeg, C. Milstein. J Nature 256, 495 (1975) or using methods using recombinant DNA (S. Cabilly et al. US Patent N 4816567).
  • lymphocytes When monoclonal antibodies are produced by the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal is immunized with an antigen by subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular injection to detect lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that specifically bind to the protein (s) used for immunization. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. Lymphocytes are then fused to myeloma cells using an appropriate agent, such as polyethylene glycol, to create a hybridoma cell (J. Goding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986).
  • an appropriate agent such as polyethylene glycol
  • FGF antigen 1 domains II and Ric
  • the antigen may be a fragment or part of the RFF 1 having one or more amino acid residues that are involved in the binding of the RFF.
  • hybridoma cells are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably should contain one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused, parental myeloma cells.
  • a suitable culture medium which preferably should contain one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused, parental myeloma cells.
  • the hybrid culture medium will usually contain hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), which substances inhibit the growth of cells that do not have GGFRT.
  • myeloma cells that fuse efficiently, maintain a stable high level of antibody expression in selected antibody producing cells, and are sensitive to media, such as, for example, HAT medium.
  • preferred cell lines are: murine myeloma lines, such as lines derived from murine tumors MORS-21 and MPC-11, which can be obtained from the Center for cell distribution of the Institute. Salk in San Diego (California, USA); SP-2 cells, which can be obtained from the American Type Culture Collection in Rockville (Maryland, USA); and cells P3X63Ag8U.l, described Yeltonom et al. (J Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978).
  • the described cell lines were human myeloma and heteromyeloma chelovechesko- mouse, capable of producing human monoclonal antibodies (D. Kozbor et al. J Immunol. 133, 3001 (1984); B. Brodeur, P. Tsang Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker Inc., New York, 1987).
  • the culture medium in which the hybridoma cells are grown is analyzed for the production of monoclonal antibodies directed against the corresponding antigen.
  • the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is high.
  • FIG. 1 Differences in FRF2 concentrations in patients with metastatic RCC with the progression of the disease and clinical effect in the treatment of targeted agents.
  • FIG. 1 Differences in expression between human FGFR1 renal cancer cell lines (Caki-1) and prostate cancer (Dul45). Analysis Western Blotting (3 levels for each line). Overexpression of FGF 1 on cells was determined in a standard Western blot analysis. The highest level of expression of RFF 1 was detected on cells of the Caki-1 human renal cell carcinoma cell line (more than 95%), the lowest - on Dul45 human prostate cancer cells (10-fold differences).
  • Fig.Z Inhibition of the growth of cell colonies under the action of a monoclonal antibody against domains II and Schw FRF.P1.
  • FIG. 4 Inhibition of the growth of cell colonies under the action of a monoclonal antibody against a complex of FRF 1 and heparan sulfate. 1 - cells without the addition of RFF and 10-1;
  • FIG. 5 Blocking autophosphorylation of RFFR1. 1 - cells without the addition of RFF and antibodies;
  • FIG. 6 Overexpression of RFF-1 on bovine endothelial cells (Western blotting method).
  • FIG. 8 The dynamics of tumor growth in mice from the treatment and control groups. In those mice that were injected with monoclonal antibodies blocking FGF 1, the tumor volume was significantly less than in mice from the control group.
  • the present invention includes the monoclonal antibody, e.g., Yu-1 / IO-2, which showed high specificity (5x10 "9) binding to these antigens defined by the standard method" VYUSSZHE ".
  • a prerequisite for the presence of said antibodies is a hypervariable region CDRs 1 -3 with the sequences presented in the sequence list under numbers 1–3.
  • the sequences of the variable domains of the heavy chains can vary depending on whether they represent parts of the mouse, chimeric, humanized of a fully or completely human antibody. Such sequence variants are, for example, SEQ ID NO: 4, 5, 6.
  • SEQ ID NO: 7 represents the constant domain of the heavy chain of human IgGl antibodies.
  • SEQ ID NO: 8 represents the constant domain of the heavy chain of IgGl mouse antibodies
  • SEQ ID NOS: 9-1 1 are light chain variants which may be part of antibodies suitable for carrying out the invention In other words, antibodies bind at least one of these antigens in a binding assay and are capable of inhibiting biological activity FRF.R1. High specificity and strong blocking of the pathway are ensured due to the simultaneous binding to domains II and Cc of this receptor.
  • clones can be subcloned by limited dilution and grown by standard methods (J. Goding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)
  • Suitable culture media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (SIMD) or RPMI-1640 medium
  • hybridoma cells can be grown in vivo in animals as ascites tumors.
  • Monoclonal antibodies produced by subclones are separated from the culture medium, ascites fluid or plasma by conventional immunoglobulin purification methods, such as, for example, A-Sepharose protein, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.
  • DNA encoding the monoclonal antibodies described in this invention can be easily isolated and sequenced by conventional methods (for example, using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chain of murine antibodies).
  • Hybridoma cells were used as a DNA source. After isolation of the DNA may be placed into expression vectors, which are then transfected into host cells such as simian COS cell lines, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that in some situations do not otherwise produce immunoglobulin protein, in order to achieve synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells.
  • DNA may be optionally modified in order to alter the nature of the immunoglobulin produced by expression of that DNA.
  • humanized forms of murine antibodies can be obtained.
  • individual amino acids from the base region (FR) of the murine antibody are also substituted for the corresponding amino acid residues of the human antibody (P. Carter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 89, 4285 (1992); P. Carter et al. J Biotechnology 10, 163 (1992).
  • Chimeric forms of murine antibodies can also be obtained by replacing homologous murine DNA sequences with a sequence encoding separate regions of human immunoglobulin constant chains (heavy and light) (S. Cabilly et al. US Patent N 4816567; S Morrison et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984).
  • Antibodies of the invention include murine antibodies (IgG). However, other forms of antibodies may be obtained - “humanized”, as well as fully human, that only reflects the percentage of the human protein and does not affect the specificity of binding to the antigen, i.e. evidence of the method of the present invention.
  • antibodies e.g., IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM
  • subclasses of immunoglobulins as well as antibody fragments (e.g., Fab, F (ab ') 2 and Fv), with the ability to bind FGF 1 and exhibiting antagonism to the biological activity of the path of FGF / FGF 1, which is tested in this invention.
  • the monoclonal antibodies will show an affinity for the immunizing antigen in the amount of at least 10 '9 (P. Munson, D. Rodbard. J Anal. Biochem. 107, 220 (1980).
  • the monoclonal antibodies will inhibit mitogenic or angiogenic activity of RFF 1 by at least 90%, as determined, for example, by analysis of cell survival or proliferation in vitro, as described in our studies KCRB-L03 (Example 1) and KCRB-L04 (Example 2).
  • monoclonal antibodies do not react with all molecular and molecular components. forms f? For example, it is desirable to obtain a monoclonal antibody that is capable of specifically binding only to the FGF 1 II and Schc domains, and not to domain I or other receptor domains and isoforms. For this, immunization was carried out with the extracellular part of RFFR1, including domains II and Cc. The necessary molecular forms of the antibody are easily determined by comparing ELISA assays or by comparing the immunoprotection of various RFF 1 polypeptides. This makes it possible to immunize with various RFF isoforms /.
  • RFF 1 can be blocked by other known methods, in particular, inhibitors created by chemical synthesis.
  • any RFF / RFF 1 antagonist is administered to a mammal, preferably a human, in a pharmaceutically acceptable form, including intravenous, as well as the following routes: intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutaneous, intraarticular, inturtisinovial, intracranial, oral, local or inhaled.
  • Antagonists can also be administered by intratumoral, peritumoral, intrafocal and focal pathways to provide local action along with a systemic therapeutic effect.
  • Such administration forms include pharmaceutically acceptable carriers that are inherently neither toxic nor therapeutic. Examples of such carriers are ion exchange agents, alum, aluminum stearate, lecithin, plasma proteins (such as human plasma protein), buffering agents such as phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids, water, salts or electrolytes such as protamine sulfate, sodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride, zinc salts, colloidal silicon oxide, magnesium trisilicate, polyvinylpyrrolidone, cellulose-based substances and polyethylene glycol.
  • Carriers for local or gel-based forms of antagonist include polysaccharides such as sodium carboxymethylcellulose or methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylates, polyoxyethylene-polyoxypropylene block polymers, polyethylene glycol and alcohols.
  • conventional dosage forms are used. Such forms include, for example, microcapsules, nanocapsules, liposomes, patches, inhalation preparations, aerosols, sublingual tablets, and sustained release preparations.
  • Antagonist in such preparations will usually be contained in a concentration of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.
  • sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing an antagonist; such matrices have a certain shape, for example, it can be films or microcapsules.
  • sustained release matrices include polyesters, hydrogels [eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate)] described by Langer et al. (J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981) and Langer (Chem. Tech. 12 (1982), or poly (vinyl alcohol), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and gammaethyl L-glutamate described by Sidman et al.
  • stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilization to remove acidic solutions, controlling moisture, using appropriate additives and developing specific polymer matrix compositions.
  • Antagonistic sustained release formulations of the anti- ⁇ agent also include antagonistic antibodies embedded in liposomes.
  • Liposomes containing antagonists can be obtained by methods known in the art, such as those described by Epstein et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 82, 3688 (1985); Huang et al. (Rgoss. Nat. Acad. Sci. 77, 4030 (1980); US Pat. No. 4,485,045 and US Pat. No. 4,544,545.
  • Liposomes are generally small (about 200-800 angstroms) and belong to a single layer type in which the lipid content is higher than 30 mol% cholesterol; the selected ratio may vary to select the optimal therapy conditions. Long circulating liposomes are covered by US Pat. No. 5,013,556.
  • Another way of using this invention is the incorporation of the antagonist of the path ⁇ / ⁇ ⁇ into products having a specific shape. Such products can be used to modulate endothelial cell growth and angiogenesis. In addition, such products can be used to modulate the invasion of tumors and metastases.
  • an antagonist When preventing or treating a disease, the required dose of an antagonist will depend on the type of disease, on its severity and course, on whether antibodies are administered for prophylactic or therapeutic purposes, on previous therapy, on the patient’s medical history and his response to the antagonist, and on the instructions of the patient a doctor.
  • the antagonist can be administered to the patient in various ways, at a time, or as a series of appointments.
  • FGF / FGF 1 antagonists can be used to treat various neoplastic and non-neoplastic diseases and disorders.
  • Neoplasms and related conditions that can be treated with this include renal cell carcinoma, lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial hyperplasia, endometriosis, fibrosarcoma, choriosarcoma, head tumors and neck, hepatoblastoma, Kaposi’s sarcoma, melanoma, skin cancer, hemangioma, cavernous hemangioma, hemangioblastoma, pancreatic cancer, retinoblastoma, astrocytoma, glioblastoma, schwan, oligodendroglioma, medulloblastoma, neuroblastoma, rhabdomy Osarcoma, osteogenic sarcoma,
  • the method can be used for non-oncological diseases that can be treated, including such as rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic and other retinopathies, fibroplasias, neovascular glaucoma, thyroid hyperplasias (including Grave’s disease), transplantation of the cornea and other tissues, chronic inflammation, pneumonia, nephrotic syndrome, ascites, preeclampsia, pericardial effusion (for example, associated with pericarditis) and pleural effusion.
  • non-oncological diseases including such as rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic and other retinopathies, fibroplasias, neovascular glaucoma, thyroid hyperplasias (including Grave’s disease), transplantation of the cornea and other tissues, chronic inflammation, pneumonia, nephrotic syndrome, ascites, preeclampsia, peri
  • the initial dose for administration to the patient will be from 1 ⁇ g / kg to 15 mg / kg and can be administered by one or many separate administrations or by continuous infusion.
  • a typical daily dose may vary from about 1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg or more, depending on the above factors.
  • the treatment is repeated until the desired suppression of the symptoms of the disease is achieved.
  • other dosage regimens may also be used. The success of treatment is easily determined by conventional methods and analyzes, for example, X-ray imaging of tumors.
  • the effectiveness of the antagonist of the FGF / FGF / H pathway in the prevention or treatment of diseases can be improved by administering the antagonist serially or in combination with another substance effective for this purpose, such as tumor necrosis factor, interferons, interleukins; antibodies and inhibitors capable of neutralizing or inhibiting the angiogenic activity of the growth factor of endothelial cells of blood vessels and its receptors and / or growth factor of hepatocytes and / or epidermal growth factor and its receptors and / or placental growth factor and / or mTOR and / or other intracellular kinases or one or more conventional therapeutic substances, such as, for example, alkylating compounds, folic acid antagonists, nucleic acid metabolism antimetabolites, antibiotics, pyrimidine analogs, 5-fluoroura yl, purine nucleosides, amines, amino acids, triazole nucleosides, or corticosteroids.
  • another substance effective for this purpose such as tumor necrosis factor, interfer
  • a tumor vascularization is attacked.
  • One or more antagonists of RFF / RFF 1 is administered to a patient with a tumor in therapeutically effective doses determined, for example, by observing tumor necrosis or its metastatic foci, if any. Such therapy continues until further improvement ceases to be observed or clinical examination indicates that the tumor or its metastases have disappeared.
  • one or more of the substances described above (o) are administered and hyperthermia or radiation therapy is used. Since the effectiveness of additional substances will vary, it is advisable to compare their effect on the tumor by standard matrix screening. Repeated administration of an antagonist of FGF / FGF 1 and an additional agent until it is achieved desired clinical effect. Alternatively, the antagonist (s) of FGF / FGF 1 are administered together and, if desired, together with additional substances.
  • antibodies to RFF 1 and also to its domains II and Gc can be used.
  • Antibodies should usually be labeled with a residue that is easy to detect. This can be any residue that, directly or indirectly, can produce a detectable signal.
  • it can be radioisotopes, such as 3 H , 4 C, 32 P, 35 S, 125 1; a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin; labels labeled with radioisotopes, such as, for example, I, P, C or H, or enzymes, such as alkaline phosphatase, betagalactosidase or horseradish peroxidase.
  • Antibodies of the present invention or FGFR1 can be used in the diagnosis of human and mammalian tumors.
  • the antibody or RFF 1 labeled with a detectable residue is introduced into the patient, preferably into the circulatory system, and the presence and location of the labeled antibody or receptor in the patient's body is analyzed.
  • Such visualization can be used, for example, in determining the stage of the disease and in the treatment of neoplasms.
  • An antibody or RFF 1 is labeled with any residue found in mammals by methods known in the art, such as nuclear magnetic resonance, radiological, etc.
  • Example 1 (Results of the study KCRB-L03): analysis of the survival or proliferation of cells in vitro, impaired function of FGFR1 when adding a monoclonal antibody that blocks FGFR1 domains II and Sch
  • both monoclonal antibodies (10-1 and 10-2) completely inhibited the ability of added FGF 2 to support the growth and survival of renal cell cancer cells (more than 90%). There were no significant differences in the activity of 10-1 and 10-2.
  • a monoclonal antibody to FGFR1 without neutralizing ability (Abeam) did not cause changes in cell survival.
  • the suppression of mitogenic activity depends on the dose of the agent that blocks the pathway of RFF / RFFR1 (the higher the dose, the lower the mitogenic activity).
  • the general conclusion of this example while blocking domains II and Cc of FGFR1, strong inhibition of tumor cell growth is achieved.
  • the antibody 10-1 was added to the described cells, and after 1.5 hours - RFF 2, 10 ng / ml. Cultivation took place for 5 minutes at a temperature of 37C. Then the cells were washed and lysed in a special lysis buffer (50 mmol HEPES (pH 7.4), 150 mmol NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5 mmol MgCl 2 , protease inhibitors and 2 mmol sodium vanadate). The lysate was incubated on ice for 30 minutes, and then it was centrifuged (13,000 rpm, for 10 minutes at 4 ° C).
  • a special lysis buffer 50 mmol HEPES (pH 7.4), 150 mmol NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5 mmol MgCl 2 , protease inhibitors and 2 mmol sodium vanadate.
  • Protein concentration in the lysate was measured in a Coomassie Plus assay (Pierce). Following this, immunoprecipitation / Western blotting was performed. These methods were performed according to the standard protocol (Santa Cruz Biotechnology, USA) using 1 mg of a monoclonal antibody to bind FGFR1 (control antibody; Santa Cruz Biotechnology) and anti-phosphotyrosine (4G10) antibodies. The obtained samples were used for electrophoresis, followed by identification of co-precipitated proteins in Western blotting. Part of the cells without the addition of RFF 2 and antibodies was used for control.
  • Example 1 shows that cells of human renal cell carcinoma in the presence of FGF 2 proliferate, and when the target receptor is blocked, FGF.P1 (only domains II and Schc) and impaired function cease to multiply and lose mitogenic activity. Moreover, in example 1, it was demonstrated that cells in the absence of RFF 2 also do not proliferate and this indicates its mitogenic value (if the RFF 2 is bound, the cells will also not proliferate).
  • Example 2 Results of the KCRB-L04 study: analysis of the survival or proliferation of endothelial cells in vitro, impaired function of FGFR1 on endotheliocytes with the addition of a monoclonal antibody blocking FGFR1.
  • EECs were seeded with a density of 5x10 4 cells / ml in 12-well plates. 10 ng / ml FGF 2 was added to each well in the presence or absence of different concentrations of monoclonal antibodies to FGFR1, as well as an extraneous monoclonal antibody without neutralizing activity to FGF 1 (Abeam). After culture growth for 5 days, the cells in each well were counted using a computer program on a Hewlett Packard Scanjet analyzer (USA). As an additional control, ECECs were grown in the absence of FRF 2.
  • both monoclonal antibodies to the FGF-1 inhibited the ability of added FGF 2 to support the growth and survival of the bovine KEKN.
  • a monoclonal antibody without neutralizing activity (Abeam) had no effect on cells.
  • Example 2 demonstrates that when the ⁇ / ⁇ / ⁇ pathway is blocked, endothelial cells cease to multiply and lose their mitogenic activity, which can lead to impaired angiogenesis in the tumor.
  • Example 3 (Research Results KCRB-L05): Inhibition of tumor growth in vivo when blocking the pathway of RFF / RFFR1.
  • mice Female mice (Beige / nude) aged 5-6 weeks (acquired in Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, USA) 2x10 6 Caki-1 tumor cell line of human renal cell carcinoma were administered subcutaneously in 100 ul of saline phosphate buffer (PBS ). After tumor growth was established, the mice were divided into 3 groups.
  • PBS saline phosphate buffer
  • the first (treatment) group of mice was injected intraperitoneally 2 times a week with a monoclonal antibody 10-1 to FGF.P1 at a dose of 100 ⁇ g / kg.
  • the second (treatment) group of mice was injected intraperitoneally 2 times a week with a monoclonal antibody of 10-2 to ⁇ / ⁇ / heparan sulfate at a dose of 100 ⁇ g / kg.
  • a third (control) group of mice was injected with saline. Each group included 15 mice.
  • Tumor size was measured every 5 days, and at the end of the study, the tumors were excised and weighed.
  • FIG. 8 The effect of monoclonal antibodies / physiological saline on the growth (volume) of tumors is shown in Figure 8.
  • the figure shows that in those mice that were injected with monoclonal antibodies that block RFF 1, the tumor volume was significantly less than in mice from the control group.
  • the weight (median) of the tumor in the mice of the control group was significantly higher compared to the mice of the treatment groups (p ⁇ 0.001).
  • the number of lung metastases was also significantly higher in mice of the control group (p ⁇ 0.01).
  • mice that received neutralizing monoclonal antibodies starting from the first week after inoculation with Caki-1 cells, the tumor growth rate was significantly slower than in mice that were injected with saline.
  • Antibodies include both murine and chimeric and humanized.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описано антитело специфически связывающее домены II и Шс ФРФР1 или с комплексом рецептора 1 типа фактора роста фибробластов и гепаран-сульфата. Представлен способ подавления роста опухоли, основанный на блокировании пути «человеческий фактор роста фибробластов / человеческий рецептор 1 типа фактора роста фибробластов (домены II и Шс)», включающий введение описанного антитела. Предложен коньюгат моноклонального описанного антитела и контрастных веществ, предназначенный для использования в диагностике злокачественных и других образований, клетки которых экспрессируют ФРФР1 в большом количестве. Также предложен способ диагностики злокачественных новообразований. Изобретение позволяет блокировать путь «фактор роста фибробластов / рецептор 1 типа фактора роста фибробластов» через связывание с доменами II и Шс ФРФР1, что приводит к остановке или замедлению роста опухоли. Изобретение предоставляет новые препараты для диагностики и лечения заболеваний, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией.

Description

Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли
(варианты).
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новым антителам, способу подавления роста опухоли, основанному на блокировании пути «человеческий фактор роста фибробластов/человеческий рецептор 1 типа фактора роста фибробластов (домены II и Шс)», а также способу диагностики злокачественных новообразований. Указанный патологический путь приводит к избыточной пролиферации опухолевых клеток и образованию новых сосудов, что сопровождается ростом первичной опухоли и метастазов. Кроме того, описанный путь является независимым механизмом устойчивости опухоли к препаратам, воздействующим на другие патологические пути. Блокирование пути «фактор роста фибробластов/рецептор 1 типа фактора роста фибробластов» различными субстанциями, нейтрализующими рецептор через связывание с его доменами II и Шс, приводит к остановке или замедлению роста опухоли. Кроме того, данный рецептор может использоваться как мишень для целенаправленной доставки диагностических препаратов, т.к. находится в большом количестве на клетках многих опухолей. Преимущество изобретения заключается в разработке новых препаратов для диагностики и лечения заболеваний, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией.
Известно, что в основе развития злокачественных новообразований лежит избыточная пролиферация клеток, а также образование кровеносных сосудов в опухоли, через которые происходит ее питание (ангиогенез).
Образование новых кровеносных сосудов происходит из уже существующего эндотелия и является важным компонентом многих заболеваний и нарушений, в том числе таких, как рост и метастазирование опухолей, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, иммунное отторжение трансплантированной роговицы и других тканей, а также хронические воспаления.
В случае роста опухолей ангиогенез имеет особенно важное значение при переходе от гиперплазии к неоплазии, а также для обеспечения питания растущей солидной опухоли (J. Folkman et al. Nature; 339, 58 (1989). Ангиогенез также позволяет опухолям находиться в контакте с кровеносной системой хозяина, в результате чего могут быть определены направления метастазирования для клеток опухоли. Данные, подтверждающие роль ангиогенеза в метастазировании клеток опухоли, были получены, в частности, в результате исследований, показавших зависимость между количеством и плотностью микрососудов в инвазивном раке молочной железы и фактическим наличием дистантных метастазов (N. Weidner et al. New Eng. J. Med., 324: 1 (1991).
По многочисленным имеющимся данным пролиферация клеток опухоли, равно как и эндотелиальных клеток может быть вызвана различными полипептидами, которые естественным образом встречаются в природе. Одним из них является семейство факторов роста фибробластов (ФРФ). Впервые ФРФ был обнаружен в экстрактах гипофиза в 1973 году (Н. Armelin. PNAS 70, 9 (1973).
ФРФ относятся к семейству гепарин-связывающих полипептидов, модулирующих функции различных клеток. ФРФ оказывает сильное влияние на пролиферацию и дифференцировку опухолевых и эндотелиальных клеток. В настоящее время выделяют 23 члена семейства ФРФ (ФРФ 1-23). Каждый член семейства имеет свои функциональные особенности. Наиболее хорошо изучены ФРФ 1 и 2 типов (кислый и основной). Для того чтобы оказать воздействие на клетки, ФРФ должен связаться с рецептором на ее поверхности. Существуют 4 типа рецепторов ФРФ (ФРФ 1-4). С ФРФ 1 связываются не только ФРФ 1 и 2, но и большинство других членов этого семейства, поэтому роль этого рецептора в проведении сигнала в клетку считается наиболее значимой.
ФРФР1 состоит из надмембранной, внутримембранной и внутриклеточной частей. Надмембранная часть рецептора состоит из 3 доменов (Д Ι-ΠΙ), подобных иммуноглобулину. ФРФ, как правило, взаимодействуют с Д II и III; гепаран-сульфат, участвующий в формировании комплекса ФРФ/ФРФ 1, взаимодействует с ДЗ. Альтернативный мРНК сплайсинг способствует образованию на поверхности клетки нескольких вариантов Ф?ФР\ (D Johnson, L. Williams. J Adv. Cancer Res., 60, 1 (1993); McKeehan et al. J Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 59, 135 (1998). Внутриклеточная часть рецептора представлена тирозинкиназой, при аутофосфорилировании которой происходит дальнейшее проведение сигнала в ядро и деление клетки.
Изучая в рандомизированном исследовании эффекты низкомолекулярного гепарина (НМГ) у пациентов с метастатическим почечноклеточным раком (ПКР), авторы доказали, что гепарин влияет на выживаемость пациентов и частоту ответов на иммунотерапию. Мы предположили, что НМГ может связывать ФРФ, взаимодействовать с его рецептором (ФРФ 1), другими гепаран/гепарин-связываюшими факторами (И. В. Тимофеев и соав. Российский онкологический журнал, N°5 (2008); I. Tsimafeyeu et al. J. Clin. Oncology 25, 18S (2007). В другом исследовании мы показали, что у пациентов с метастатическим ПКР в 40% случаев встречаются нарушения в системе гемостаза, что также может быть вызвано повышенным образованием ФРФ и экспрессией ФРФ 1 (I. Tsimafeyeu et al. J. Experimental & Clinical Cancer Research, 28, 30 (2009). В дальнейших собственных исследованиях KCRB-L01 и KCRB-L02 мы изучали значение комплекса ФРФ/ФРФ 1 в развитии П Р.
KCRB-L01 : Изучение экспрессии ФРФР у пациентов с почечноклеточны раком. Иммуногистохимический анализ проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей 140 больных ПКР. Результаты сравнивали с экспрессией ФРФР у 40 здоровых доноров, которым ранее была произведена биопсия почки по разным причинам без последующего обнаружения заболеваний органа. Была выявлена экспрессия ΦΡΦ/Ί в 98% случаев на клетках первичной опухоли почки и в 82,5% случаев на клетках метастазов ПКР. Во всех случаях интенсивность окрашивания при иммуногистохимическом анализе была высокой (3+), что свидельствует о сильной экспрессии рецептора. В 68% - получено ядерное окрашивание. Экспрессия ФРФ 1 на клетках здоровой ткани почки выявлена в 1 случае (2,5%>) за счет окрашивания сосудов. Таким образом, данное исследование подтвердило предположение о появлении и высокой экспрессии ФРФ 1 как на клетках первичной опухоли, так и в метастазах ПКР (I. Tsimafeyeu et al. ESMO-ECCO 09 (2009): таблица 1.
В исследовании KCRB-L02 определяли концентрацию ФРФ 1 и 2, как основных факторов, обладающих митогенной активностью при связывании с ФРФ 1, в плазме крови 38 больных метастатическим ПКР до начала таргетной терапии, при прогрессировании болезни на таргетной терапии, а также в плазме крови 38 здоровых добровольцев (методом ELISA). Было установлено, что в крови здоровых людей уровни обоих ФРФ были достоверно ниже по сравнению с больными метастатическим ПКР (таблица 2). Наибольшие различия были продемонстрированы для ФРФ 2 (р<0,001).
При прогрессировании заболевания на таргетной терапии (сунитиниб, сорафениб) происходило достоверное повышение ФРФ 2 - более чем на 50% (р<0,001) и ФРФ 1 - более чем на 30% (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем ФРФ. При эффективности таргетной терапии изменение уровня обоих ФРФ достоверно не наблюдалось (р=0,3). Медиана концентрации ФРФ 2 в плазме пациентов при прогрессировании болезни и без - достоверно отличалась (ρΟ,ΟΟΙ, фигура 1).
Кроме того, в этом исследовании анализировался уровень мишени для сунитиниба/сорафениба - фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС). Статистических различий в концентрации ФРЭС в плазме пациентов с ПКР при прогрессировании болезни на терапии и исходным уровнем (р=0,2), а также корреляции с обоими ФРФ (р>0,1) не выявлено.
Таким образом, результаты исследований KCRB-L01 и KCRB-L02 свидетельствуют о том, что патологический путь ФРФ/ФРФ 1 является не только независимым в развитии ПКР, но может определять устойчивость к существующей таргетной терапии опухолей. Другие авторы также показали значение ФРФ/ФРФ 1 при развитии таких опухолей, как немелкоклеточньш рак легкого, рак молочной железы, рак желудка и пищевода, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, опухоли головы и шеи, меланома (С. Behrens et al. J Clinical cancer research 14, 19 (2008); M. Koziczak et al. J Oncogene, 23, 20 (2004); K. Freier J Oral Oncology 43, 1 (2007); E. Shin et al. J Cancer Res Clin Oncol. 126, 9 (2000); K. Sugiura et al. J Oncology reports 17, 3 (2007); E. Devilard et al. J BMC Cancer 6, 272 (2006); G. Lefevre et al. J Investigative Ophthalmology and Visual Science 50 (2009).
Основываясь на вышеизложенном, мы предположили, что блокирование пути ФРФ/ФРФ 1 может привести к нарушению пролиферации опухолевых клеток и ингибированию ангиогенеза. Антагонисты ФРФ 1, в том числе человеческие моноклональные антитела, могут быть использованы для подавления роста опухоли и ее метастазов. Кроме того, создание конъюгатов моноклонального антитела (его фрагментов) к ФРФ 1 и контрастных веществ, может использоваться в диагностике злокачественных и других образований, клетки которых экспрессируют ФРФ 1 в большом количестве.
Целью изобретения являлся создание новых антител для использования в способе подавления роста опухоли, заключающемся в блокировании (нейтрализации) доменов II и Шс ФРФ 1, а также в способе диагностики опухолей, клетки которых экспрессируют ФРФ 1.
Для проверки гипотезы и достижения целей были проведены исследования KCRB- L03, KCRB-L04 и KCRB-L05.
Во всех указанных исследованиях для блокирования ФРФ 1 (под ФРФ 1 далее понимается рецептор, соответствующий регистрационным номерам в международных базах Uniprot - PI 1362 и Entrez - 2260, а именно его домены II и Шс (SEQ ID NO 12 ) в качестве веществ-антагонистов использовались синтезированные нами высокоспецифичные нейтрализующие моноклональные антитела: 1) против доменов ФРФР1 II и Шс (10-1); 2) против ФРФ 1 и гепаран-сульфата (10-2).
Термин "моноклональное антитело" используется здесь и далее для обозначения антитела, полученного из популяции достаточно однородных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны в своей специфичности и сродству, за исключением возможных, естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Необходимо обратить внимание на то, что в результате подобных, естественно встречающихся, мутаций состав моноклональных антител в данном изобретении, которое в большинстве своем содержит антитела, способные специфически связывать ФРФ 1 или же комплекс ΦΡΦ Ι/гепаран- сульфат или комплексы ФРФ/ФРФР1 или препятствовать связыванию ФРФ с ФРФ 1. Таким образом, термин "моноклональное" указывает на характер антитела, происходящего из достаточно однородной популяции антител, но здесь не имеется в виду, что антитела должны производиться каким-либо определенным путем. Например, моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, могут быть получены гибридомным методом (G. КоЫег, С. Milstein. J Nature 256, 495 (1975) или с применением методов, использующих рекомбинантную ДНК (S. Cabilly et al. U.S. Patent N 4816567).
При получении моноклональных антител гибридомным методом мышь или другое подходящее животное-хозяин иммунизируется антигеном посредством подкожной, внутриперитонеальной или внутримышечной инъекции с целью выявить лимфоциты, которые производят или же способны производить антитела, специфически связывающиеся с белком(ами), использованным(и) для иммунизации. В качестве альтернативы, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с использованием соответствующего агента, например такого, как полиэтиленгликоль, чтобы создать гибридомную клетку (J. Goding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986).
В данном изобретении таким антигеном является ФРФ 1 (домены II и Шс) или же комплекс ΦΡΦ Ι/гепаран-сульфат. Антиген может представлять собой фрагмент или часть ФРФ 1, обладающие одним или несколькими аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании ФРФ.
Приготовленные таким образом гибридомные клетки высеваются и выращиваются в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно должна содержать одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. Например, в случае, если в родительских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ или ГФРТ), культуральная среда для гибридом обычно будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), каковые вещества препятствуют росту клеток, не обладающих ГГФРТ.
Предпочтительно выбирать такие клетки миеломы, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антител в отобранных клетках, производящих антитела, и являются чувствительными к средам, таким, например, как среда HAT. Среди таких клеток предпочтительными клеточными линиями являются: мышиные линии миеломы, такие как линии, происходящие от мышиных опухолей МОРС- 21 и МРС-11, которые можно получить из Центра распределения клеток Института им. Солка в Сан-Диего (Калифорния, США); клетки SP-2, которые можно получить из Американской коллекции типовых культур в Роквилле (Мэриленд, США); и клетки P3X63Ag8U.l , описанные Йелтоном и др. (J Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978). Кроме того, были описаны клеточные линии человеческой миеломы и человеческо- мышиной гетеромиеломы, способные производить человеческие моноклональные антитела (D. Kozbor et al. J Immunol. 133, 3001 (1984); В. Brodeur, P. Tsang Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51 -63 (Marcel Dekker Inc., New York, 1987).
Культурная среда, в которой выращиваются клетки гибридомы, подвергается анализу для производства моноклональных антител, направленных против соответствующего антигена. Предпочтительно, чтобы специфичность связывания моноклональных антител, производимых клетками гибридомы, была высокой.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Различия в концентрации ФРФ2 у пациентов с метастатическим ПКР с прогрессированием болезни и с клиническим эффектом при лечении таргетными препаратами.
Фиг.2. Отличия в экспрессии ФРФР1 между человеческими клеточными линиями почечноклеточного рака (Caki-1) и рака предстательной железы (Dul45). Анализ Вестерн- Блоттинг (по 3 уровня для каждой линии). Гиперэкспрессия ФРФ 1 на клетках определялась в стандартном анализе Вестерн-блоттинг. Самый высокий уровень экспрессия ФРФ 1 был выявлен на клетках линии человеческого почечноклеточного рака Caki-1 (более 95%), самый низкий - на клетках человеческого рака предстательной железы Dul45 (различия в 10 раз).
Фиг.З. Ингибирование роста колоний клеток под действием моноклонального антитела против доменов II и Шс ФРФ.Р1.
1 - клетки без добавления ФРФ и 10-1 ;
2 - Ю-1 в концентрации 0,6 нмоль;
3 - 10-1 в концентрации 4 нмоль;
4 - 10-1 в концентрации 50 нмоль;
5 - клетки с добавалением антитела без нейтрализующей активности в концентрации 50 нмоль
Моноклональное антитело против доменов II и Шс ФРФ 1 (10-1) полностью ингибирует способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Моноклональное антитело к ФРФ 1 без нейтрализующей способности (Abeam) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФР1 (чем выше доза, тем выше митогенная активность). Фиг. 4. Ингибирование роста колоний клеток под действием моноклонального антитела против комплекса ФРФ 1 и гепаран-сульфата. 1 - клетки без добавления ФРФ и 10-1 ;
2 - 10-2 в концентрации 0,6 нмоль;
3 - 10-2 в концентрации 4 нмоль;
4 - 10-2 в концентрации 50 нмоль;
5 - клетки с добавалением антитела без нейтрализующей активности в концентрации 50 нмоль
Моноклональное антитело против комплекса ФРФ 1 и гепаран-сульфата (Ю-2) полностью ингибирует способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Моноклональное антитело к ΦΡΦ/Ί без нейтрализующей способности (Abeam) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФ 1 (чем выше доза, тем выше митогенная активность).
Фиг. 5. Блокирование аутофосфорилирования ФРФР1 . 1 - клетки без добавления ФРФ и антител;
2 - клетки с добавлением ФРФ, без антител;
3 - клетки с добавлением ФРФ и контрольного антитела (Santa Cruz Biotechnology);
4 - клетки с добавлением ФРФ и Ю-1 в концентрации 50 нмоль;
5 - клетки с добавлением ФРФ и 10-1 в концентрации 20 нмоль;
6 - клетки с добавлением ФРФ и 10-1 в концентрации 4 нмоль;
7 - клетки с добавлением ФРФ и 10-1 в концентрации 2 нмоль;
8 - клетки с добавлением ФРФ и 10-1 в концентрации 0,6 нмоль.
Показано, что моноклональное антитело 10-1 вызывает нарушение процессов фосфорилирования ФРФ 1 , тогда как контрольное антитело анти-ΦΡΦ Ι (Santa Cruz Biotechnology, США) не препятствовало нарушению фосфорилирования рецептора. Концентрации блокирующего агента (в данном случае 10-1) влияют на фосфорилирование ФРФ 1 : чем выше концентрация, тем больше эффект.
Фиг. 6. Гиперэкспрессия ФРФ 1 на бычьих эндотелиальных клетках (метод Вестерн - блоттинга).
Фиг.7. Ингибирование роста колоний клеток под действием блокирующих моноклональных антител (10-1 и 10-2). 1 - клетки без добавления ФРФ и антител;
2 - 10-2 в концентрации 50 нмоль: снижение митогенной активности на 97,4%
3 - Ю-1 в концентрации 50 нмоль: снижение митогенной активности на 95,8%
4 - клетки с добавалением антитела без нейтрализующей активности в концентрации 50 нмоль
Оба моноклональных антитела к ФРФ 1 ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание бычьих КЭКН. Моноклональное антитело без нейтрализующей активности (N°4) не оказывало никакого действия на клетки. Фиг. 8. Динамика роста опухоли у мышей из лечебных и контрольной групп. У тех мышей, которым были введены моноклональные антитела, блокирующие ФРФ 1, объем опухоли был значительно меньше, чем у мышей из контрольной группы.
Осуществление изобретения
Данное изобретение включает те моноклональные антитела, например, Ю- 1/IO-2, которые показали высокую специфичность (5x10"9) связывания с указанными антигенами, определенную по стандартной методике «ВЮССЖЕ». Обязательным условием для указанных антител является наличие гипервариабельных участков CDRs 1-3 с последовательностями, представленными в списке последовательностей под номерами 1- 3. Последовательности вариабельных доменов тяжёлых цепей могут варьировать в зависимости от того, представляют ли они части мышиного, химерного, гуманизированного или полностью человеческого антитела. Такие варианты последовательностей представлены, например, SEQ ID NO: 4, 5, 6. SEQ ID NO: 7 представляет константный домен тяжёлой цепи антитела человека IgGl . SEQ ID NO: 8 представляет константный домен тяжёлой цепи антитела мыши IgGl . SEQ ID NO: 9-1 1 представляют собой варианты лёгких цепей, которые могут входить в состав антител, подходящих для осуществления изобретения. Другими словами, антитела связывают по меньшей мере один из этих антигенов при анализе связывания и способны ингибировать биологическую активность ФРФ.Р1. Высокая специфичность и сильное блокирование пути обеспечиваются благодаря одновременному связыванию с доменами II и Шс данного рецептора.
После определения клеток гибридомы, которые производят антагонистические антитела желаемой специфичности, сродства и активности, клоны могут быть субклонированы методом ограниченных разбавлений и выращены стандартными методами (J. Goding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). К подходящим культуральным средам относятся, например, среда Игла, модифицированная Дулбекко (СИМД), или среда RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут выращиваться in vivo в животных как асцитные опухоли.
Моноклональные антитела, продуцированные субклонами, отделяются от культуральной среды, асцитной жидкости или плазмы путем использования обычных методов иммуноглобулинной очистки, таких как, например, белок А-Сефароза, гидроксилапатитная хроматография, электрофорез в гелях, диализ или аффинная хроматография.
ДНК, кодирующая моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, может быть с легкостью выделена и секвенирована обычными методами (например, с использованием олигонуклеотидных проб, способных связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепу мышиных антител). В качестве источника ДНК использовались клетки гибридомы. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфецируются в клетки хозяина, такие как обезьяньи клетки линии COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в иной ситуации не продуцируют иммуноглобулинный белок, для того чтобы достигнуть синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина.
ДНК может быть модифицирована по выбору для того, чтобы изменить характер иммуноглобулина, продуцируемого экспрессией этой ДНК. Так, например, могут быть получены гуманизированные формы мышиных антител. В некоторых вариантах отдельные аминокислоты из базовой области (FR) мышиного антитела также замещаются на соответствующие аминокислотные остатки человеческого антитела (P. Carter et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 89, 4285 (1992); P. Carter et al. J Biotechnology 10, 163 (1992). Химерные формы мышиных антител могут быть получены также путем замещения гомологичных мышиных последовательностей ДНК на последовательность, кодирующую отдельные области человеческих постоянных цепей иммуноглобулина (тяжелой и легкой) (S. Cabilly et al. U.S. Patent N 4816567; S. Morrison et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984).
Антитела по данному изобретению включают мышиные антитела (IgG). Однако могут быть получены другие формы антител - «гуманизированные», а также полностью человеческие, что лишь отражает процент человеческого белка и не влияет на специфичность связывания с антигеном, т.е. доказательства способа настоящего изобретения.
Кроме того, для блокирования ФРФ.Р1 и его доменов могут быть легко получены все виды, классы антител (например, IgA, IgD, lgE, IgG и IgM) и подклассы иммуноглобулинов, а также и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')2 и Fv), обладающие способностью связывать ФРФ 1 и проявляющие антагонизм по отношению к биологической активности пути ФРФ/ФРФ 1, которая проверена в данном изобретении.
В случае предпочитаемого варианта данного изобретения моноклональные антитела будут проявлять сродство к иммунизирующему антигену в размере, по меньшей мере, 10'9 (P. Munson, D. Rodbard. J Anal. Biochem. 107, 220 (1980). Кроме того, моноклональные антитела будут ингибировать митогенную или ангиогенную активность ФРФ 1 по крайней мере на 90%, как определяется, например, анализом выживания или пролиферации клеток in vitro, подобно описанному в наших исследованиях KCRB-L03 (Пример 1) и KCRB-L04 (Пример 2).
Для терапевтических и диагностических применений желательно, чтобы моноклональные антитела реагировали не со всеми компонентами и молекулярными формами Ф?ФР\ . Например, желательно получить моноклональное антитело, которое способно специфически связываться только с доменами ФРФ 1 II и Шс, а не с доменом I или другими доменами и изоформами рецептора. Для этого иммунизация производилась экстрацеллюлярной частью ФРФР1, включающей домены II и Шс. Необходимые молекулярные формы антитела легко определяются путем сравнения анализов ELISA или путем сравнения иммуноприпитации различных полипептидов ФРФ 1. Это дает возможность иммунизации различными изоформами ФРФ/ .
ФРФ 1 может быть заблокирован и другими известными способами, в частности, ингибиторами, созданными путем химического синтеза.
Терапевтическое использование способа блокирования пути ФРФ/ФРФР1
Для использования способа, описанного в настоящем изобретении, в терапевтической практике любые антагонисты ФРФ/ФРФ 1 вводятся млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой форме, включая введение внутривенно, а также следующими путями: внутримышечной, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, внуртисиновиальным, внутриоболочечным, оральным, локальным или ингаляционным.
Антагонисты также могут вводиться внутриопухолевым, околоопухолевым, внутриочаговым и околоочаговым путями для обеспечения локального действия наряду с системным терапевтическим действием. Подобные формы введения включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своей природе не обладают ни токсическим, ни терапевтическим действием. Примерами таких носителей являются ионообменные вещества, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы (такие, как белок плазмы человека), буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных овощных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества с целлюлозной основой и полиэтиленгликоль.
Носители для локальной или основанной на геле форм антагонистов включают полисахариды, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или метилцеллюлозы, поливинилпирролидон, полиакрилаты, полимеры полиоксиэтиленполиоксипропиленового блока, полиэтиленгликоль и спирты. Для введения во всех случаях используются обычные лекарственные формы. К таким формам относятся, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные препараты, аэрозоли, подъязычные таблетки и препараты с постоянным высвобождением вещества. Антагонист в таких препаратах будет обычно содержаться в концентрации примерно от 0,1 мг/мл до 100 мг/мл.
Подходящие примеры препаратов с постоянным высвобождением вещества включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антагонист; подобные матрицы имеют определенную форму, например это могут быть пленки или микрокапсулы. К примерам матриц с постоянным высвобождением относятся полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат)], описанные Лангером и др. (J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981) и Лангером (Chem. Tech. 12 (1982), или поли(винилалкоголь), полилактиды (Патент США N 3773919), сополимеры L- глутаминовой кислоты и гаммаэтил-Ь-глутамата, описанные Сидман и др. (Biopolymers 22, 547 (1983), недеградируемый этиленвинилацетат (Лангер и др. см. выше), деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как Lupron Depot™ (инъецируемые микросферы, состоящие из полимеров молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-О-(-)- 3-гидроксибутировой кислоты. В то время как такие полимеры, как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, способны к постоянному высвобождению молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные полипептидные антагонисты остаются в организме на долгое время, они могут денатурировать или агрегироваться в результате воздействия влаги при температуре 37°С, что ведет к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. С целью стабилизации могут быть разработаны разумные стратегии, в зависимости от действующего механизма. Например, если обнаружен механизм агрегации, выражающийся в формировании межмолекулярной S-S-связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации с целью удаления кислых растворов, контролирования влажности, использования соответствующих добавок и разработки специфических полимерных матричных составов.
Антагонистические составы с постоянным высвобождением анти-ΦΡΦΡΙ агента включают также антагонистические антитела, заключенные в липосомах. Липосомы, содержащие антагонисты, могут быть получены известными в данной области методами, например, описанными Эпстейном и др. (Proc. Nat. Acad. Sci. 82, 3688 (1985); Хуанг и др. (Ргосс. Nat. Acad. Sci. 77, 4030 (1980); Патент США N 4485045 и Патент США N 4544545. Липосомы, как правило, имеют небольшую величину (величиной около 200-800 ангстрем) и принадлежат к однослойному типу, в котором содержание липидов выше, чем 30 мол.% холестерина; выбранное соотношение может изменяться для подбора оптимальных условий терапии. Липосомы с продолжительным сроком циркуляции покрываются Патентом США N 5013556.
Еще одним путем использования данного изобретения является инкорпорирование антагониста пути ΦΡΦ/ΦΡΦ Ί внутрь изделий, имеющих определенную форму. Такие изделия могут быть использованы для модулирования роста клеток эндотелия и ангиогенеза. Кроме того, такие изделия могут быть использованы для модулирования инвазии опухолей и метастазов.
Возможна конъюгация антагониста пути ΦΡΦ/ΦΡΦ/Ί и другого лечебного средства.
При профилактике или лечении заболевания необходимая доза антагониста будет зависеть от типа заболевания, от его степени серьезности и протекания, от того, вводятся ли антитела с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, от истории болезни пациента и его реакции на антагонист и от указаний лечащего врача. Антагонист может вводиться пациенту различными способами, единовременно или в качестве серии назначений.
Антагонисты ФРФ/ФРФ 1 могут быть использованы для лечения различных неопластических и ненеопластических заболеваний и нарушений. Неоплазмы и близкие состояния, которые поддаются такому лечению, включают почечноклеточный рак, рак легких, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, рак печени, рак яичников, рак шейки матки, рак эндометрия, гиперплазию эндометрия, эндометриоз, фибросаркомы, хориосаркомы, опухоли головы и шеи, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, рак кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, рак поджелудочной железы, ретинобластомы, астроцитому, глиобластому, шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркому, рак мочевого пузыря и другие уротелиальные опухоли, опухоль Вильмса, рак предстательной железы, аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами.
Возможно применение способа при неонкологических заболеваниях, которые поддаются лечению, включая такие как ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетические и другие ретинопатии, фиброплазии, неоваскулярную глаукому, тироидные гиперплазии (в том числе болезнь Граве), трансплантацию роговицы и других тканей, хронические воспаления, воспаление легких, нефротический синдром, асцит, преэклампсию, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот. В зависимости от типа заболевания и от степени его серьезности первоначальная доза для введения пациенту будет составлять от 1 мкг/кг до 15 мг/кг и может вводиться путем одного или многих отдельных введений или путем постоянного вливания. Обычная дневная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг и более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней и более, в зависимости от условий, лечение повторяется, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов болезни. Однако могут использоваться и другие режимы дозировки. Успех лечения легко определяется обычными методами и анализами, например, методами рентгено-визуализации опухолей.
В соответствии с другим применением изобретения эффективность антагониста пути ФРФ/ФРФ/Ч в предотвращении или лечении болезней может быть улучшена путем введения антагониста серийно или же в комбинации с другим веществом, эффективным для данной цели, таким как фактор некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины; антитела и ингибиторы, способный нейтрализовать или ингибировать ангиогенную активность фактора роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и его рецепторов и/или фактора роста гепатоцитов и/или эпидермального фактора роста и его рецепторов и/или фактора роста плаценты и/или mTOR и/или других внутриклеточныз киназ или одно или более обычных терапевтических веществ, таких как, например, алкилирующие соединения, антагонисты фолиевой кислоты, антиметаболиты метаболизма нуклеиновых кислот, антибиотики, аналоги пиримидинов, 5-флюороурацил, пуриновые нуклеозиды, амины, аминокислоты, триазольные нуклеозиды или кортикостероиды. Подобные вещества могут присутствовать во вводимом составе или могут вводиться отдельно. Кроме того, антагонист пути ФРФ/ФРФР1 может вводиться серийно или же в комбинации с радиологическим лечением, которое может включать как иррадиацию, так и введение радиоактивных веществ.
В соответствии с одним из применений изобретения при комбинированной терапии подвергается атаке васкуляризация опухоли. Один или более антагонист ФРФ/ФРФ 1 вводятся пациенту с опухолью в терапевтически эффективных дозах, определенных, например, при наблюдении некроза опухоли или ее метастазных фокусов, если они имеются. Такая терапия продолжается до тех пор, пока не перестает наблюдаться дальнейшее улучшение или клиническое обследование показывает, что опухоль или ее метастазы исчезли. При прогрессировании болезни вводится одно или несколько описанных выше веществ(о) и применяется гипертермия или лучевая терапия. Поскольку эффективность дополнительных веществ будет варьировать, желательно сравнить их влияние на опухоль путем стандартного матричного скрининга. Производится повторное введение антагониста ФРФ/ФРФ 1 и дополнительного агента, пока не будет достигнут желаемый клинический эффект. В альтернативном случае антагонист(ы) ФРФ/ФРФ 1 вводятся совместно и, при желании, вместе с дополнительными веществами.
Использование в диагностике
В диагностике могут быть использованы антитела к ФРФ 1 и также к его доменам II и Шс. Антитела обычно должны быть помечены остатком, который легко обнаружить. Это может быть любой остаток, который, прямо или косвенно, может продуцировать обнаруживаемый сигнал. Например, это могут быть радиоизотопы, такие как 3Н, ,4С, 32Р, 35S, 1251; флюоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как изотиоцианат флюоресцеина, родамин или люциферин; метки, помеченные радиоизотопами, такими как, например, I, Р, С или Н, или ферменты, такие как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или пероксидаза хрена.
Здесь может применяться любой известный в данной области метод для конъюгирования отдельных антител к обнаруживаемым остаткам, включая описанные методы Хантером и др. (J Nature 144, 945 (1 62); Дэвидом и др. (J Biochemistry 13, 1014 (1974); Пейном и др. (J Immunol. Meth. 40, 219 (1981) и Нигреном (J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982).
Антитела данного изобретения или ФРФР1 могут быть использованы в диагностике опухолей человека и млекопитающих. При этом антитело или ФРФ 1, помеченные обнаруживаемым остатком, вводится пациенту, предпочтительно в кровеносную систему, и анализируется присутствие и местонахождение меченого антитела или рецептора в организме пациента. Такая визуализация может использоваться, например, при определении стадии заболевания и при лечении неоплазм. Антитело или ФРФ 1 метятся любым остатком, обнаружимым в организме млекопитающих, известными в этой области методами, например ядерным магнитным резонансом, радиологическим методом и т.д.
Ниже в качестве примеров представлены некоторые доказательства способа подавления роста опухоли, заключающегося в блокировании (нейтрализации) ФРФ 1, а также способа диагностики опухолей, клетки которых экспрессируют ФРФР1. Нижеследующие примеры предлагаются только в качестве иллюстрации и не должны восприниматься как в чем-либо ограничивающие настоящее изобретение.
Пример 1 (Результаты исследования KCRB-L03): анализ выживания или пролиферации клеток in vitro, нарушение функции ФРФР1 при добавлении моноклоналъного антитела, блокирующего ФРФР1 домены II и Шс
Для выбора модели клеточной линии были изучены различные линии клеток на предмет гиперэкспрессии ФРФ 1 : 1) человеческого почечноклеточного рака Caki-1
2) человеческого рака молочной железы MCF7
3) человеческого рака предстательной железы Dul45
4) человеческого немелкоклеточного рака легкого А549
Гиперэкспрессия ФРФР1 на клетках определялась в стандартном анализе Вестерн- блоттинг. Общий уровень экспрессии ФРФР1 на клетках составил 40%. Самый высокий уровень экспрессия ФРФР1 был выявлен на клетках линии человеческого почечноклеточного рака Caki-1 , самый низкий - на клетках человеческого рака предстательной железы Dul45 (различия в 10 раз): фигура 2.
Основываясь на полученных данных, линия человеческого почечноклеточного рака Caki-1 была отобрана для дальнейших исследований.
Клетки были высеяны с плотностью 104 клеток/мл в 6-луночных пластинках. В каждую лунку были добавлены нейтрализующие моноклональные антитела 10-1 и 10-2 в равном объеме и различных концентрациях. Также в качестве контроля к части культуры было добавлено постороннее моноклональное антитело без нейтрализующей способности (приобретенное в Abeam). После инкубации в каждую лунку был добавлен ФРФР2 по 10 нг/мл. В качестве дополнительного контроля часть клеток выращивалась в отсутствие как атител, так и ФРФ 2. После роста культуры в течение 3 недель клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Hewlett Packard Scanjet (США).
Как показано на фигурах 3 и 4, оба моноклональных антитела (10-1 и 10-2) полностью ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание клеток линии почечноклеточного рака (более чем на 90%). Достоверных различий в активности 10-1 и 10-2 выявлено не было. Моноклональное антитело к ФРФР1 без нейтрализующей способности (Abeam) не вызвало изменений в выживаемости клеток. В опыте было выявлено, что подавление митогенной активности зависит от дозы агента, блокирующего путь ФРФ/ФРФР1 (чем выше доза, тем ниже митогенная активность). Общий вывод по данному примеру: при одновременном блокировании доменов II и Шс ФРФР1 достигается сильное ингибирование роста опухолевых клеток.
Также в данном примере мы показываем, что блокирование рецептора фактора роста фибробластов приводит к нарушению аутофосфорилирования рецептора, что отражает его функциональное значение.
Для этого к описанным клеткам было добавлено антитело 10-1 и через 1,5 часа - ФРФ 2, 10 нг/мл. Культивирование происходило в течение 5 минут при температуре 37С. Затем клетки были промыты и лизированы в специальном буффере для лизиса (50 ммоль HEPES (pH 7,4), 150 ммоль NaCl, 10% глицерол, 1% Тритон Х- 100, 1,5 ммоль MgCl2, ингибиторы протеазы и 2 ммоль натрия ванадат). Инкубация лизата проводилась на льду в течении 30 минут, а затем он был центрифугирован (13000 оборотов в минуту, в течение 10 минут при температуре 4°С). Концентрация белка в лизате была измерена в анализе Кумасси Плюс (Pierce). После этого проводились иммунопреципитация/Вестерн-блоттинг. Эти методы выполнялись по стандартному протоколу (Santa Cruz Biotechnology, США) с использованием 1 мг моноклонального антитела для связывания ФРФР1 (контрольное антитело; Santa Cruz Biotechnology), и анти-фосфотирозин (4G10) антител. Полученные пробы использовали для электрофореза с последующим выявлением копреципитированных белков в Вестерн-блоттинге. Часть клеток без добавления ФРФ 2 и антител использовалась для контроля.
Результаты представлены на фигуре 5. Показано, что моноклональное антитело 10-1 вызывает нарушение процессов фосфорилирования ФРФ 1, тогда как контрольное антитело анти-ΦΡΦ Ι (Santa Cruz Biotechnology, США) не препятствовало нарушению фосфорилирования рецептора. Концентрации блокирующего агента (в данном случае 10- 1) влияют на фосфорилирование ФРФ 1 : чем выше концентрация, тем больше эффект.
Таким образом, пример 1 (исследование KCRB-L03) показывает, что клетки человеческого почечноклеточного рака в присутствии ФРФ 2 пролифирируют, а при блокировании рецептора-мишени ФРФ.Р1 (только доменов II и Шс) и нарушении его функции, перестают размножаться и теряют митогенную активность. Более того, в примере 1 продемонстрировано, что клетки в отсутствии ФРФ 2 также не пролиферируют и это свидетельствует о его митогенном значении (если ФРФ 2 связать, клетки также не будут пролиферировать).
Пример 2 (Результаты исследования KCRB-L04): анализ выживания или пролиферации эндотелиальных клеток in vitro, нарушение функции ФРФР1 на эндотелиоцитах при добавлении моноклонального антитела, блокирующего ФРФР1.
Для анализа выживания эндотелиальных клеток в среде ФРФ и при блокировании ФРФР1 был проведен подобный эксперимент, что и при блокировании фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, описанный в документе (Rockwell; Patricia et al. US 20090022716).
В качестве модели эндотелиоцитов использовались бычьи клетки капиллярного эндотелия коры надпочечников (КЭКН) (N. Ferrara et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 5773 (1987) В начале мы выявили высокую экспрессию ФРФ 1 на КЭКН в стандартном анализе Вестерн-блоттинг (фигура 6).
Затем КЭКН были высеяны с плотностью 5x104 клеток/мл в 12-луночных пластинках. В каждую лунку было добавлено 10 нг/мл ФРФ 2 в присутствии или в отсутствие различных концентраций моноклональных антител к ФРФР1 , а также постороннего моноклонального антитела без нейтрализующей активности к ФРФ 1 (Abeam). После роста культуры в течение 5 дней клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Hewlett Packard Scanjet (США). В качестве дополнительного контроля КЭКН выращивались в отсутствие ФРФ 2.
Как показано на фигуре 7, оба моноклональных антитела к ФРФ 1 ингибировали способность добавленного ФРФ 2 поддерживать рост и выживание бычьих КЭКН. Моноклональное антитело без нейтрализующей активности (Abeam) не оказывало никакого действия на клетки.
Таким образом, пример 2 демонстрирует, что при блокировании пути ΦΡΦ/ΦΡΦ/Ί эндотелиальные клетки перестают размножаться и теряют митогенную активность, что может приводить к нарушению ангиогенеза в опухоли.
Пример 3 (Результаты исследования KCRB-L05): Ингибирование роста опухоли in vivo при блокировании пути ФРФ/ФРФР1.
Самкам мышей (Beige/nude) возрастом 5-6 недель (приобретенным в Harlan Sprague Dawley, Inc. (Индианаполис, США) были подкожно введены 2x106 опухолевых клеток линии человеческого почечноклеточного рака Caki-1 в 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (ФРФБ). После того, как установился рост опухоли, мыши были разделены на 3 группы.
Первой (лечебной) группе мышей вводили интраперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело 10-1 к ФРФ.Р1 в дозе 100 мкг/кг. Второй (лечебной) группе мышей вводили интраперитонеально 2 раза в неделю моноклональное антитело 10-2 к ΦΡΦ/Ί/гепаран-сульфату в дозе 100 мкг/кг. Третьей (контрольной) группе мышей вводился физиологический раствор. Каждая группа включала 15 мышей.
Величина опухоли измерялась каждые 5 дней, и по завершении исследования опухоли были вырезаны и взвешены.
Влияние моноклональных антител/физиологического раствора на рост (объем) опухолей показан на фигуре 8. На рисунке видно, что у тех мышей, которым были введены моноклональные антитела, блокирующие ФРФ 1, объем опухоли был значительно меньше, чем у мышей из контрольной группы. Вес (медиана) опухоли мышей контрольной группы был достоверно выше по сравнению с мышами лечебных групп (р<0,001). Количество метастазов в легкие также было достоверно выше у мышей контрольной группы (р<0,01).
У тех мышей, которые получали нейтрализующие моноклональные антитела, начиная с первой недели после инокуляции клетками Caki-1, скорость роста опухолей была значительно более медленной, чем у мышей, которым вводили физиологический раствор.
На основании этих данных был сделал вывод об эффективности способа подавления роста опухоли in vivo путем блокирования пути ФРФ/ФРФ 1 (через блокирование доменов II и Шс ФРФР1).
Заявитель подтверждает, что он получил несколько гибридомных линий, продуцирующих антитела, пригодные для реализации заявленного изобретения. Ниже заявитель приводит последовательности относящиеся к полученным им антителам. Антитела включают как мышиные, так и химерные и гуманизированные.

Claims

Формула
1. Моноклональное антитело, содержащее гипервариабельный участок CDR 1-3, представленный SEQ ID NO: 1 и/или 2 и/или 3, обладающее аффинностью не менее
2x10"9 в отношении доменов II и Шс рецептора 1 типа фактора роста фибробластов, или его фрагмент, что приводит к остановке или торможению роста опухоли.
2. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что ингибирует митогенную активность рецептора 1 типа фактора роста фибробластов не менее чем на 90%.
3. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что содержит аминокислотную последовательность домена Fc тяжелой цепи одного из: IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM.
4. Моноклональное антитело по п.1 , отличающееся тем, что оно является химерным, или гуманизированным, или полностью человеческим антителом.
5. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что является антагонистом взаимодействия фактора роста фибробластов и рецептора 1 типа фактора роста фибробластов.
6. Моноклональное антитело, содержащее гипервариабельный участок CDR 1-3, представленный SEQ ID NO: 1 и/или 2 и/или 3, обладающее аффинностью не менее
2x10"9 в отношении комплекса рецептора 1 типа фактора роста фибробластов и гепаран- сульфата, или его фрагмент, что приводит к остановке или торможению роста опухоли.
7. Моноклональное антитело по п.6, отличающееся тем, что ингибирует митогенную активность рецептора 1 типа фактора роста фибробластов или его комплекса с гепаран- сульфатом не менее чем на 90%.
8. Моноклональное антитело по п.6, отличающееся тем, что содержит аминокислотную последовательность домена Fc тяжелой цепи одного из: IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM.
9. Моноклональное антитело по п.6, отличающееся тем, что оно является химерным, или гуманизированным, или полностью человеческим антителом.
10. Моноклональное антитело по п.6, отличающееся тем, что является антагонистом взаимодействия фактора роста фибробластов и рецептора 1 типа фактора роста фибробластов.
11. Способ подавления роста опухоли, заключающийся в блокировании (нейтрализации) доменов II и Шс рецептора 1 типа фактора роста фибробластов или комплекса рецептора 1 типа фактора роста фибробластов и гепаран-сульфата путем введения реципиенту моноклонального антитела по п.1 или п.6.
12. Коньюгат моноклонального антитела по п.1 или п.6 или его фрагмента, содержащего антигенсвязывающую область, и контрастных веществ, предназначенный для использования в диагностике злокачественных и других образований, клетки которых экспрессируют ФРФ 1 в большом количестве.
13. Применение антитела по п.1 или п.6 или коньюгата по п.12 для диагностики злокачественных новообразований у человека , самостоятельно или в сочетании с другими диагностическими процедурами.
PCT/RU2011/000200 2011-02-07 2011-03-30 Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты) WO2012108782A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/982,518 US20140105821A1 (en) 2011-02-07 2011-03-30 Antibody that stops or slows tumour growth (variants)
DE212011100195U DE212011100195U1 (de) 2011-02-07 2011-03-30 Antikörper, der das Tumorwachstum stoppt oder verzögert (Varianten)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011104017 2011-02-07
RU2011104017/10A RU2440142C1 (ru) 2011-02-07 2011-02-07 Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты), способ подавления роста опухоли, способ диагностики злокачественных образований

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012108782A1 true WO2012108782A1 (ru) 2012-08-16

Family

ID=45785607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000200 WO2012108782A1 (ru) 2011-02-07 2011-03-30 Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты)

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20140105821A1 (ru)
DE (1) DE212011100195U1 (ru)
RU (1) RU2440142C1 (ru)
WO (1) WO2012108782A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066452A3 (en) * 2013-11-01 2015-06-04 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating pediatric cancers
WO2017100642A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to egfr and/or erbb3 blockade
WO2018095932A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Merck Patent Gmbh Monoclonal antibody directed to fgfr1

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2530762C2 (ru) * 2012-12-14 2014-10-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ диагностики мультиформной глиобластомы с помощью мрт
RU2634573C1 (ru) * 2016-07-05 2017-10-31 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Осетинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ стратификации риска поражения сердечно-сосудистой системы у пациентов с хронической болезнью почек
EP3544998A1 (en) * 2016-11-22 2019-10-02 Merck Patent GmbH Monoclonal antibody directed to fgfr1

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US20030108545A1 (en) 1994-02-10 2003-06-12 Patricia Rockwell Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist
IL159177A0 (en) * 2001-06-20 2004-06-01 Prochon Biotech Ltd Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
US20070274981A1 (en) * 2003-10-16 2007-11-29 Imclone Systems Incorporation Fibroblast Growth Factor Receptor-1 Inhibitors and Methods of Treatment Thereof
EP2083081A1 (en) * 2005-07-22 2009-07-29 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
MX2009003938A (es) * 2006-10-27 2009-04-24 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados y sus usos.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 11 May 2000 (2000-05-11), Database accession no. AAA86297.1 *
DATABASE GENBANK 21 December 2003 (2003-12-21), Database accession no. AAR32638.1 *
DATABASE GENBANK 22 October 2001 (2001-10-22), Database accession no. AAA65944.1 *
GORBENKO OLENA ET AL.: "Monoclonal Antibodies with Selective Specificity Towards Different Glycosylation Isoforms of FGFR1", HYBRIDOMA, vol. 28, no. 4, 2009, pages 287 - 293 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066452A3 (en) * 2013-11-01 2015-06-04 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating pediatric cancers
WO2017100642A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to egfr and/or erbb3 blockade
WO2018095932A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Merck Patent Gmbh Monoclonal antibody directed to fgfr1

Also Published As

Publication number Publication date
RU2440142C1 (ru) 2012-01-20
US20140105821A1 (en) 2014-04-17
DE212011100195U9 (de) 2014-06-26
DE212011100195U1 (de) 2013-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100335584B1 (ko) 혈관내피세포성장인자에대한길항제
RU2440142C1 (ru) Антитело, останавливающее или замедляющее рост опухоли (варианты), способ подавления роста опухоли, способ диагностики злокачественных образований
NZ305699A (en) Vascular endothelial cell growth factor (VEGF) antagonists useful for the treatment of age-related macular degeneration
KR20080073766A (ko) 암 치료를 위한, 안지오포이에틴-2 길항자와 ｖｅｇｆ-ａ,ｋｄｒ 및/또는 ｆｌｔ1 길항자의 조합물
JP2011504092A (ja) 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）の血管新生誘発性アイソフォームに特異的な抗体
TW200948380A (en) Combination of HGF inhibitor and PTEN agonist to treat cancer
US20170260278A1 (en) Methods of inhibiting pathological angiogenesis with doppel-targeting molecules
CN113939309A (zh) 使用sEphB4-HSA融合蛋白治疗癌症
US8487083B2 (en) Monoclonal antibodies capable of simultaneously binding domains II and IIIc of type 1 fibroblast growth factor receptor
KR20100102152A (ko) Ｅｇｆｌ8 길항제를 사용하여 혈관신생을 억제하는 방법
JP2013224307A (ja) 治療法
US10294295B2 (en) Methods for modulating angiogenesis of cancers refractory to anti-VEGF treatment
US10202459B2 (en) Methods of inhibiting pathological angiogenesis with doppel-targeting molecules
CN103403030A (zh) 治疗和诊断疾病的方法
Lin et al. TGFBIp mediates lymphatic sprouting in corneal lymphangiogenesis
TWI609692B (zh) 新穎ｓｔｉｐ１多肽及其用途
BR112020013912A2 (pt) Métodos e terapia de combinação para o tratamento de câncer
CN116744970A (zh) 包含sfrp2拮抗剂的组合物和方法
EA016172B1 (ru) Способ подавления роста опухоли путем блокирования рецептора фактора роста фибробластов и способ диагностики злокачественных новообразований
CA2756851A1 (en) Therapeutic agent for cancer having reduced sensitivity to molecular target drug and pharmaceutical composition for enhancing sensitivity to molecular target drug
ES2502217T3 (es) Antagonistas de NLRR-1 y sus usos
KR102207221B1 (ko) 도펠-타겟팅 분자를 이용한 병리학적 신생혈관 생성을 억제하는 방법
US11020478B2 (en) Methods for modulating angiogenesis of cancers refractory to anti-VEGF treatment
KR100315613B1 (ko) 혈관 내피 세포 성장 인자에 대한 길항제
TW202333728A (zh) 螺環芳基磷氧化物與抗ｖｅｇｆ抗體的聯用藥物組合物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11858279

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13982518

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 212011100195

Country of ref document: DE

Ref document number: 2120111001957

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11858279

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1