ES2665341T3 - Anticuerpo anti-DLK-1 humana con actividad antitumoral in vivo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo contra la Dlk-1 humana, en el que la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 y 89, y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 45.

Description

Anticuerpo anti-DLK-1 humana con actividad antitumoral in vivo

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-Dlk-1 humana que tienen actividad antitumoral y particularmente a anticuerpos anti-Dlk-1 humana que tienen actividad antitumoral in vivo. Además, la presente invención también se refiere a hibridomas que producen los anticuerpos mencionados anteriormente y a un uso de los anticuerpos mencionados anteriormente. 10

Antecedentes de la invención

La Dlk-1 humana (homólogo de tipo delta 1 (Drosophila); que se puede denominar en lo sucesivo como “hDlk-1”) es una proteína transmembrana de tipo I (de tipo transmembrana uno) con una longitud total de 383 restos de 15 aminoácidos que tiene 6 motivos de tipo EGF en su región extracelular. La región extracelular presenta homología con una familia Notch/Delta/Serrate. Un gen hDlk-1 ha sido clonado como una molécula expresada en una línea celular derivada de carcinoma de pulmón microcítico sensible a GRP (péptido liberador de gastrina) (Documento No de Patente 1), o como un factor para la supresión de la diferenciación de preadipocitos (Documento No de Patente 2). Desde el punto de vista de la homología de la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 con la de Delta que es un 20 ligando de un receptor Notch como un regulador de la diferenciación celular, tal Dlk-1 es citada generalmente con el símbolo génico, DLK1. También tiene algunos otros símbolos génicos tales como Pref-1 (Documento No de Patente 2), pG2 (Documento No de Patente 3), SCP-1 (Documento No de Patente 4) y ZOG (Documento No de Patente 5). Sin embargo, estos símbolos génicos indican básicamente la misma molécula.

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Por otra parte, hDlk-1 se escinde con una proteasa no identificada que corta en las proximidades de la membrana celular en la región extracelular de hDlk-1, y se secreta a continuación a la sangre. La hDlk-1 libre (región extracelular de hDlk-1) es una molécula idéntica a una glicoproteína llamada FA-1 (Antígeno fetal 1) (Documento No de Patente 6) que consiste en 225 a 262 restos de aminoácidos.

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El gen hDlk-1 y un producto génico del mismo se expresan en un alto nivel en las células no diferenciadas, altamente proliferativas, fetales. En particular, el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo son muy expresados en hígado fetal, riñón fetal, músculo esquelético fetal, cerebro fetal y similares. Después del nacimiento, sin embargo, la expresión de tal gen hDlk-1 y del producto génico del mismo puede no ser observado en la mayoría de los tejidos. En tejidos adultos normales, el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo se localizan en la glándula suprarrenal, la 35 placenta y la hipófisis (Documento de Patente 1, Documento No de Patente 2).

Además, incluso en tejidos maduros, la expresión de hDlk-1 se observó en células que se considera que son células madre no diferenciadas o células precursoras. Por ejemplo, se ha descrito que la expresión de hDlk-1 se ha observado en células ovales hepáticas que son indiferenciadas y son pluripotentes en el hígado adulto (Documentos 40 No de Patente 7 y 8) o en células madre mesenquimales que son las células madre de las células óseas/de cartílago/adiposas (Documento No de Patente 9) y en células precursoras del epitelio prostático en la capa de células basales de la próstata (Documento No de Patente 18). Además, también se ha descrito que, en el caso de las células madre mesenquimales de ratón, la Dlk-1 libre (región extracelular Dlk-1 de ratón) activa la ERK/MAP quinasa e induce la expresión de Sox-9, de modo que puede suprimirse la diferenciación de las células en adipocitos 45 y, al mismo tiempo, puede inducirse la diferenciación de las células en condrocitos, pero esa Dlk-1 libre suprime la diferenciación de las células en osteoblastos y la maduración de los condrocitos (Documentos No de Patente 19 y 20). Se ha sugerido que hDlk-1 está asociada con las propiedades de tales células madre de tejidos, tales como el mantenimiento de la capacidad de indiferenciación.

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Tal patrón de expresión de hDlk-1 restringido a las células fetales o células madre y una familia de genes/productos génicos que tienen motivos de tipo EGF (receptor Notch, ligando de Notch (Delta, Jagged, Serrate), etc.) generalmente controla el crecimiento o la diferenciación de células mediante la interacción intercelular a través de motivos de tipo EGF. Por lo tanto, se ha sugerido que hDlk-1 también tiene tales funciones. De hecho, se ha conocido que la expresión de hDlk-1 disminuye simultáneamente con la diferenciación de las células precursoras de 55 adipocitos y que la diferenciación en adipocitos se suprime, si el gen hDlk-1 se ve obligado a expresarse en las células precursoras de adipocitos (Documento No de Patente 2). Sin embargo, en la actualidad, los detalles con respecto a una molécula (un ligando) que interactúe con hDlk-1 son desconocidos.

Por otra parte, se ha descrito que el gen hDlk-1 y el producto génico del mismo se expresan con una alta frecuencia 60 en diversos tipos de cánceres o tumores. Los tipos de cáncer, en los que la expresión de hDlk-1 se ha confirmado hasta el momento, son: cánceres sólidos tales como tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis de tipo 1, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de hígado, cáncer de riñón y cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de mama y cáncer de páncreas (Documentos de Patente 1, 2, 4 y 5 y Documentos No de Patente 1, 3, 10, 11, 12, 13 y 14 y 21); y neoplasias sanguíneas tales como el síndrome mielodisplásico (Documento 65 de Patente 3 y Documentos No de Patente 15 y 16) y leucemia mielocítica aguda (Documento No de Patente 16). Se ha descrito que el crecimiento celular se acelera si se introduce un gen hDlk-1 en una célula K562 que es una línea celular de eritroleucemia (Documento No de Patente 16) y también que, si tal gen hDlk-1 se introduce en glioblastomas, provoca la desaparición de la inhibición por contacto de las células, así como la aceleración del crecimiento celular, de manera que se puede lograr la capacidad de crecimiento celular independiente del anclaje. Se ha sugerido la relación entre hDlk-1 y la carcinogénesis Documento No de Patente 17) 5

Convencionalmente, como anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 que muestran citotoxicidad en células de cáncer de hígado humano in vitro en presencia de complemento, se conocen anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 de rata 1C1, 4C4 y 31C4 (nombres de los clones) (Documento de Patente 1). Por otro lado, estos anticuerpos de clones también se sabe que son anticuerpos que no muestran actividad antitumoral (actividad inhibidora del crecimiento 10 tumoral) in vivo (en modelos de tratamiento con ratones portadores de células cancerosas humanas) (Documentos de Patente 4 y 5).

Documento de Patente 1: WO 2005/052156

Documento de Patente 2: WO 02/081625 15

Documento de Patente 3: Solicitud de patente japonesa abierta a consulta pública N.º 2001-269174

Documento de Patente 4: WO 2008/056833

Documento de Patente 5: WO 2009/116670

Documento No de Patente 1: Laborda, J. et al., J. Biol. Chem., vol. 268 (6), pp. 3817-3820 (1993)

Documento No de Patente 2: Smas, C. M. et al., Cell, vol. 73 (4), pp.725-734 (1993) 20

Documento No de Patente 3: Helman, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, pp. 2336-2339 (1987)

Documento No de Patente 4: Maruyama, K. et al., No publicado, Número de acceso Genebank D16847 (1993)

Documento No de Patente 5: Halder, S. K. et al., Endocrinology, vol. 139, pp. 3316-3328 (1998)

Documento No de Patente 6: Fay, T. N. et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 29, pp. 73-85 (1988)

Documento No de Patente 7: Tanimizu, N. et al., Gene Expression Patterns, vol. 5, pp. 209-218 (2004) 25

Documento No de Patente 8: Jensen, CH. et al., Am. J. Pathol., vol. 164 (4), pp.1347-1359 (2004)

Documento No de Patente 9: Abdallah, B. M. et al., J. Bone Miner. Res., vol. 19 (5), pp. 841-852 (2004)

Documento No de Patente 10: Jensen, C. H. et al., Br. J. Dermatol., vol. 140 (6), pp. 1054-1059 (1999)

Documento No de Patente 11: Jensen, C. H. et al., Tumour Biol., vol. 20 (5), pp. 256-262 (1999)

Documento No de Patente 12: Yin, D. et al., Int. J. Oncol., vol. 24 (4), pp. 1011-1015 (2004) 30

Documento No de Patente 13: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13), pp. 1852-1861 (2006)

Documento No de Patente 14: Fukuzawa, R. et al., J. Clin. Pathol., vol. 58, pp. 145-150 (2006)

Documento No de Patente 15: Miyazato, A. et al., Blood, vol. 98, pp. 422-427 (2001)

Documento No de Patente 16: Sakajiri, S. et al., Leukemia, vol. 19 (8), pp. 1404-1410 (2005)

Documento No de Patente 17: Yin, D. et al., Oncogene, vol. 25 (13), pp. 1852-1861 (2006) 35

Documento No de Patente 18: Ceder, J. A. et al., Eur. Urol., Vol. 54(6), pp. 1344-1353 (2008)

Documento No de Patente 19: Sul, HS., Mol. Endocrinol., Vol. 23 (11), pp. 1717-1725 (2009)

Documento No de Patente 20: Wang, Y. et al., Mol. Cell Biol., Vol. 30(14), pp. 3480-3492 (2010)

Documento No de Patente 21: Yanai, H. et al., J. Biochem., Vol. 148(1), pp. 85-92 (2010).

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Sumario de la invención

Como se describió anteriormente, en el caso de los tejidos normales, la expresión de hDlk-1 se restringe a las células embrionarias o a las células madre. Sin embargo, en el caso de tejidos cancerosos, hDlk-1 se expresa con una alta frecuencia en diversos tipos de células. Tal hDlk-1 es una proteína de la membrana celular/proteína 45 secretora. Basándose en estos hechos, se considera que hDlk-1 es una buena diana en el tratamiento de diversos tipos de tumores, etc. Cuando se elige como diana tal hDlk-1, se considera que es útil un anticuerpo anti-hDlk-1. Para ser utilizado como un anticuerpo para la terapia del cáncer, por ejemplo, el anticuerpo más deseablemente tiene la capacidad de retener una actividad de unión al antígeno estable en una formulación líquida y en sangre humana o de mono, así como mostrar una actividad antitumoral significativa mediante la administración del 50 anticuerpo solo en modelos de tratamiento de ratón portadores de cáncer humano

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-Dlk-1 humana que tenga actividad antitumoral y, en particular, un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana que tenga actividad antitumoral in vivo. Por otra parte, otro objeto de la presente invención es proporcionar un hibridoma que produzca el anticuerpo 55 anteriormente mencionado, un complejo del anticuerpo anteriormente mencionado y un agente, y similares. Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para el diagnóstico o tratamiento de un tumor, una composición farmacéutica para inducir apoptosis en células tumorales, un agente terapéutico anti-tumoral, un agente de diagnóstico tumoral, un agente para inducir apoptosis en células tumorales, un método para tratar tumores, un método para detectar tumores, un método para inducir apoptosis en células tumorales, un kit para 60 detectar o diagnosticar tumores y un kit para inducir apoptosis en células tumorales, cada uno de los cuales comprende el anticuerpo mencionado anteriormente, el complejo anteriormente mencionado o similares.

Los autores de la presente invención han realizado estudios exhaustivos dirigidos a la consecución de los objetos mencionados anteriormente. Como resultado, los autores de la presente invención han encontrado un anticuerpo 65 que reacciona específicamente con la Dlk-1 humana (concretamente, un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana) y que tiene actividad antitumoral (concretamente, un anticuerpo anti-Dlk-1 humanizado). Los inventores han confirmado que dichos anticuerpo y complejo tienen actividad antitumoral in vivo. Además los autores de la presente invención han logrado producir el anticuerpo mencionado anteriormente, que es un anticuerpo humanizado. Aún más, los autores de la presente invención también han encontrado que dichos anticuerpo y complejo son útiles para el tratamiento, diagnóstico y detección de un tumor, y la inducción de la apoptosis en células tumorales, 5 completando de este modo la presente invención.

Es decir, la presente invención es como se describe a continuación.

(1) Un anticuerpo contra Dlk-1 humana, en el que la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H 10 comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 y 89, y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 45.

El anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior es un anticuerpo que tiene una actividad antitumoral in vivo, por ejemplo. En la presente memoria, el tumor es al menos de un tipo seleccionado de, por ejemplo, el grupo que 15 consiste en cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neuroblastoma humano.

El anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior es un anticuerpo humanizado, por ejemplo.

El anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior es un anticuerpo monoclonal, por ejemplo.

El anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior es, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a al menos una 20 porción de una región que comprende aminoácidos en las posiciones 24 a 91 en la secuencia de aminoácidos de Dlk-1 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 2.

(2) Un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior incluyen un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 35, 40, 69, 73, 25 77, 81, 85 y 89, y un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 45; y un fragmento de anticuerpo que comprende tanto la secuencia de aminoácidos como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 y 89 y un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 45.

(3) Un complejo anticuerpo-agente, que comprende el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior y un 30 compuesto que tiene una actividad antitumoral y/o una actividad destructora de células.

(4) Un complejo fragmento de anticuerpo-agente, que comprende el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y un compuesto que tiene una actividad antitumoral y/o una actividad destructora de células.

(5) Una composición farmacéutica, que comprende al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) 35 anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores.

La composición farmacéutica de acuerdo con el apartado (5) anterior se usa en el tratamiento de tumores, por ejemplo, y un ejemplo particular de la composición farmacéutica es una composición farmacéutica, que no causa reducción de peso como efecto secundario. Además, la composición farmacéutica de acuerdo con el apartado (5) anterior se usa en el diagnóstico de tumores, por ejemplo. Además, la composición farmacéutica de acuerdo 40 con el apartado (5) anterior se usa en la inducción de apoptosis en células tumorales, por ejemplo.

(6) Un agente terapéutico anti-tumoral, que comprende al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores.

Un ejemplo del agente terapéutico anti-tumoral de acuerdo con el apartado (6) anterior es un agente terapéutico 45 anti-tumoral, que no causa reducción de peso como efecto secundario.

(7) Un agente para inducir apoptosis en células tumorales, que comprende al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores.

En la presente memoria, en la composición farmacéutica de acuerdo con el apartado (5) anterior, el agente 50 terapéutico anti-tumoral de acuerdo con el apartado (6) anterior y el agente inductor de apoptosis de acuerdo con el apartado (7) anterior, el tumor es al menos un tipo seleccionado de, por ejemplo, el grupo que consiste en cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neuroblastoma humano.

(8) Un método para tratar un tumor, que comprende administrar a un paciente al menos un tipo seleccionado del 55 grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores.

Un ejemplo del método de tratamiento de acuerdo con el apartado (8) anterior es un método de tratamiento, que no provoca reducción de peso como un efecto secundario.

(9) Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir al menos un tipo seleccionado del grupo que 60 consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores, para reaccionar con una muestra recogida de un cuerpo vivo; y detectar una señal o señales del anticuerpo y/o del fragmento de anticuerpo que ha reaccionado.

(10) Un método para inducir apoptosis en células tumorales, que comprende: permitir que al menos un tipo 65 seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores, reaccione con una muestra recogida de un cuerpo vivo; y detectar una señal o señales del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo que ha reaccionado.

En la presente memoria, en el método de tratamiento de acuerdo con el apartado (8) anterior, el método de detección de acuerdo con el apartado (9) anterior y el método de inducción de apoptosis de acuerdo con el 5 apartado (10) anterior, el tumor es al menos un tipo seleccionado de, por ejemplo, el grupo que consiste en de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neuroblastoma humano.

(11) Un kit para tratar, diagnosticar o detectar un tumor, que comprende al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con 10 el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores.

(12) Un kit para inducir apoptosis en células tumorales, que comprende al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en el anticuerpo de acuerdo con el apartado (1) anterior, el fragmento de anticuerpo de acuerdo con el apartado (2) anterior y el complejo de acuerdo con los apartados (3) o (4) anteriores.

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En la presente memoria, en los kits de acuerdo con los apartados (11) y (12) anteriores, el tumor es al menos un tipo seleccionado de, por ejemplo, el grupo que consiste en cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neuroblastoma humano.

Breve descripción de los dibujos 20

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc (SEQ ID NO: 12) de la región variable de cadena H (cadena pesada) (VH) del clon de anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 de ratón BA-1-3D y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma (SEQ ID NO: 13). El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y los péptidos señal (péptidos que consisten en 19 aminoácidos del extremo N-terminal de la secuencia de 25 aminoácidos putativa) se describen en cursiva. La glutamina (Q) con doble subrayado representa el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro de la VH de BA-1-3D. La secuencia de nucleótidos del ADNc del péptido maduro de BA-1-3D VH es que se muestra en la SEQ ID NO: 14, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 15. Se proporcionaron las secuencias de CDR (subrayadas) de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, 30 Quinta edición, Publicación NIH N.º 91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., 1991) Las secuencias de aminoácidos de CDR1 (DYAMH), CDR2 (VISTYYGNTNYNQKFKG) y CDR3 (GGLREYYYAMDY) de la VH de BA-1-3D son como se muestran en las SEQ ID NOS: 16 a 18, respectivamente.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc (SEQ ID NO: 19) de la región variable de cadena L (cadena ligera) (VL) del clon de anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 de ratón BA-1-3D y una secuencia de 35 aminoácidos putativa de la misma (SEQ ID NO: 20). El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y los péptidos señal (péptidos que consisten en 20 aminoácidos del extremo N de la secuencia de aminoácidos putativa) se describen en cursiva. El ácido aspártico con doble subrayado (D) representa el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro de BA-1-3D VL. La secuencia de nucleótidos del ADNc del péptido maduro de BA-1-3D VL es que se muestra en la SEQ ID NO: 21, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es 40 que se muestra en la SEQ ID NO: 22. Se proporcionaron las secuencias de CDR (subrayadas). de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH N.º 91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR1 (KSSQSLLNSSNQKNYLA), CDR2 (FASTRES) y CDR3 (QQHYSTPPT) de la VL de BA-1-3D son como se muestran en las SEQ ID NO: 23 a 25, respectivamente. 45

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 26) y la secuencia de aminoácidos de un gen de BA-1-3D VH que se ha diseñado de manera que se intercala entre un sitio SpeI (ACTAGT; subrayado) y un sitio HindIII (AAGCTT subrayado). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva (22 nucleótidos en el lado del extremo 3' terminal que incluye el sitio HindIII) indica una secuencia del intrón. Aparte de esto, la Figura 3 es la misma que se describe en la Figura 1. 50

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 27) y la secuencia de aminoácidos de un gen de BA-1-3D VL que se ha diseñado de manera que se intercala entre un sitio Nhel (GCTAGC; subrayado) y un sitio EcoRI (GAATTC) subrayado). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva (22 nucleótidos en el lado 3 'terminal que incluye el sitio EcoRI) indica una secuencia de intrón. Aparte de estos, la Figura 4 es la misma que se describe en la Figura 2. 55

La Figura 5 es una vista esquemática que muestra las estructuras de un vector de expresión para anticuerpos contra IgGa/κ BA-1-3D quiméricos y humanizados. En el sentido de las agujas del reloj a partir del sitio de la enzima de restricción para SalI, dicho vector de expresión comprende una unidad de traducción de la cadena H partiendo de un promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (CMV) y un potenciador (promotor de CMV) utilizado para el comienzo de la transcripción de un gen de la cadena H del anticuerpo. Al 60 promotor de CMV le sigue un exón de VH, los exones de CH1, una región bisagra, CH2 y CH3, e intrones intercalados entre los exones, y después del exón CH3, se liga una secuencia de poliadenilación. Después de la secuencia del gen de la cadena H, el vector comprende una unidad de traducción de cadena L que comienza con un promotor de CMV, un exón de VL, una parte de intrón y a continuación el exón de una región constante de la cadena κ humana (CL) y una secuencia de poliadenilación. A continuación, al gen de la cadena L le sigue un 65 segmento que comprende un promotor temprano de SV40 (promotor de SV40), un gen de la xantina guanina fosforribosil transferasa (gpt) de E. coli y el sitio de poliadenilación de SV40 (sitio poli(A) de SV40). Finalmente, el plásmido tiene una parte de un plásmido pUC19 que comprende el origen de replicación (ori pUC) y un gen de la β-lactamasa de E. coli.

La Figura 6 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de, BA-1-3D VH, dos tipos de BA-1-3D VH humanizado (HuBA-1-3D VH1 y HuBA-1-3D VH2) y U00503 VH como un aceptor . El resto de aminoácido se 5 indica con una sola letra, y el número indicado encima de cada secuencia se colocó de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991). Los subrayados en la secuencia de aminoácidos de la VH de BA-1-3D indican secuencias de CDR tal como se determina de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) (DYAMH, VISTYYGNTNYNQKFKG y GGLREYYYAMDY). Los subrayados en las secuencias de aminoácidos de HuBA-1-3D VH1 y HuBA-1-3D VH2 indican restos de aminoácidos que conservan los restos de aminoácidos en la misma 10 posición en la secuencia de aminoácidos de la correspondiente BA-1-3D VH de ratón, y se supone que estos restos de aminoácidos son importantes para la formación de las estructuras de las CDR. Las secuencias de CDR de U00503 VH no se muestran en la figura.

Debe observarse que la secuencia de aminoácidos de la BA-1-3D VH en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 15 (una secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 14), 15 la secuencia de aminoácidos de HuBA-1-3D VH1 en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 35 (una secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 34), la secuencia de aminoácidos de HuBA-1-3D VH2 en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 40 (una secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 39), y la secuencia de aminoácidos de U00503 VH en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 29 (una secuencia de nucleótidos que codifica 20 esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 28).

La Figura 7 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de, BA-1-3D VL, BA-1-3D VL humanizado (HuBA-1-3D VL) y Z46622 VL como un aceptor. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y el número indicado encima de cada secuencia se colocó de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991). Los subrayados en la secuencia de aminoácidos de BA-1-3D VL indican secuencias de CDR como se determina 25 de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) (KSSQSLLNSNSNQKNYLA, FASTRES y QQHYSTPPT). El subrayado en la secuencia de aminoácidos de HuBA-1-3D VL indica el resto de aminoácido que conserva el resto de aminoácido en la misma posición en la secuencia de aminoácidos de la correspondiente BA-1-3D VL de ratón, y este resto de aminoácido se supone que es importante para la formación de las estructuras de las CDR. Las secuencias de CDR de la VL de Z46622 VL no se muestran en la figura. 30

Debe observarse que la secuencia de aminoácidos de BA-1-3D VL en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 22 (una secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 21), el aminoácido la secuencia de HuBA-1-3D VL en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 45 (una secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 44), y la secuencia de aminoácidos de Z46622 VL en la figura es que se muestra en la SEQ ID NO: 31 (una secuencia de nucleótidos 35 que codifica esta secuencia es que se muestra en la SEQ ID NO: 30).

La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 36) y la secuencia de aminoácidos de un gen HuBA-1-3D VH1 que se ha diseñado de manera que está intercalado entre un sitio SpeI (ACTAGT; subrayado) y un sitio HindIII (AAGCTT subrayado). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva (23 nucleótidos en el lado del extremo 3' que incluye el sitio HindIII) indica una secuencia del intrón. 40

La secuencia de nucleótidos del ADNc de HuBA-1-3D VH1 es que se muestra en la SEQ ID NO: 32, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 33. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y los péptidos señal (péptidos que consisten en 19 aminoácidos del extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos putativa) se describen en cursiva. La glutamina (Q) con doble subrayado representa el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro de HuBA-1-3D VH1. La 45 secuencia de nucleótidos del ADNc del péptido maduro de HuBA-1-3D VH1 es que se muestra en la SEQ ID NO: 34, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 35. Se proporcionaron las secuencias de CDR (subrayadas) de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH N.º1 91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR1 (DYAMH), CDR2 50 (VISTYYGNTNYNQKFKG) y CDR3 (GGLREYYYAMDY) de HuBA-1-3D VH1 son como se muestran en las SEQ ID NO: 16 a 18, respectivamente.

La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 41) y la secuencia de aminoácidos de un gen HuBA-1-3D VH2 que se ha diseñado de manera que se intercala entre un sitio SpeI (ACTAGT; subrayado) y un sitio HindIII (AAGCTT; subrayado). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva (23 nucleótidos en el lado del 55 extremo 3' terminal que incluye el sitio HindIII) indica una secuencia del intrón.

La secuencia de nucleótidos del ADNc de HuBA-1-3D VH2 es que se muestra en la SEQ ID NO: 37, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 38. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y los péptidos señal (péptidos que consisten en 19 aminoácidos del extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos putativa) se describen en cursiva. La glutamina (Q) con doble 60 subrayado representa el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro de HuBA-1-3D VH2. La secuencia de nucleótidos del ADNc del péptido maduro de HuBA-1-3D VH2 es que se muestra en la SEQ ID NO: 39, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 40. Se proporcionaron las secuencias de CDR (subrayadas) de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH N.º 91-3242, Departamento de Salud y 65 Servicios Humanos de los EE.UU., 1991) Las secuencias de aminoácidos de CDR1 (DYAMH), CDR2 (VISTYYGNTNYNQKFKG) y CDR3 (GGLREYYYAMDY) de HuBA-1-3D VH2 son como se muestran en las SEQ ID NOS: 16 a 18, respectivamente.

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 46) y la secuencia de aminoácidos de un gen HuBA-1-3D VL que se ha diseñado de manera que está intercalado entre un sitio NheI (GCTAGC; subrayado) y un sitio EcoRI (GAATTC) subrayado). La secuencia de nucleótidos descrita en cursiva (23 nucleótidos en el lado 5 3' terminal que incluye el sitio EcoRI) indica una secuencia de intrón.

La secuencia de nucleótidos del ADNc de HuBA-1-3D VL es que se muestra en la SEQ ID NO: 42, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 43. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y los péptidos señal (péptidos que consisten en 20 aminoácidos del extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos putativa) se describen en cursiva. El ácido aspártico (D) con doble 10 subrayado representa el resto de aminoácido N-terminal de un péptido maduro de HuBA-1-3D VL. La secuencia de nucleótidos del ADNc del péptido maduro de HuBA-1-3D VL es que se muestra en la SEQ ID NO: 44, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 45. Se proporcionaron las secuencias de CDR (subrayadas) de acuerdo con la definición de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH N.º 91-3242, Departamento de Salud y Servicios 15 Humanos de los EE.UU., 1991). Las secuencias de aminoácidos de CDR1 (KSSQSLLNSSNQKNYLA), CDR2 (FASTRES) y CDR3 (QQHYSTPPT) de HuBA-1-3D VL son como se muestran en las SEQ ID NO: 23 a 25, respectivamente.

La Figura 11 muestra las secuencias de nucleótidos de los cebadores de oligonucleótidos (CMV2, JNT026, JNT082, JNT097 y JNT098), que se usaron en la amplificación por PCR de los ADNc de la cadena H y la cadena 20 L y las reacciones de secuencia en los Ejemplos 4 de la presente solicitud. Las secuencias de nucleótidos de CMV2, JNT026, JNT082, JNT097 y JNT098 son como se muestran en las SEQ ID NO: 47 a 51, respectivamente.

La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 52) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) de la región codificante de la cadena H (cadena γ1) de un vector pChBA-1-3D. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”. “ 25

La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 54) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) de la región codificante de la cadena L (cadena κ) de un vector pChBA-1-3D. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”.

La Figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 56) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 57) de la región codificante de la cadena H (cadena γ1) de un vector pHuBA-1-3D-1. El resto de aminoácido se 30 indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”.

La Figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 58) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 59) de la región codificante de la cadena H (cadena γ1) de un vector pHuBA-1-3D-2. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”.

La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 60) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 35 61) de la región codificante de la cadena L (cadena κ) en cada uno de un vector pHuBA-1-3D-1, un vector pHuBA-1-3D-2, un vector pHuBA-1-3D-1-T73K y un vector pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K. En resumen, las cadenas L (cadenas κ) de los anticuerpos HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-2, HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K tienen la misma secuencia de nucleótidos y la misma secuencia de aminoácidos. En la figura, cada aminoácido se indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”. 40

La Figura 17 muestra la SDS-PAGE realizada en los anticuerpos purificados (carril 1: marcador de peso molecular (Patrón preteñido SeeBluePlus2 (Invitrogen)), carril 2: ChBA-1-3D, carril 3: HuBA-1-3D-1, carril 4: HuBA-1-3D-2, carril 5: HuBA-1-3D-1-T73K, y carril 6: HuBA-1-3D-1-A24G/T73K). La figura muestra los resultados obtenidos aplicando 7,5 μg de cada anticuerpo en gel NuPAGE Bis-Tris al 4 %-20 % en condiciones reducidas usando un tampón de migración MES-SDS (Invitrogen). Los valores numéricos en el lado izquierdo de 45 la figura indican pesos moleculares.

La Figura 18 muestra los resultados del ELISA con respecto a la actividad de unión de una proteína recombinante (hDlk-1-His) en la región extracelular de hDlk-1 a ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D -2. Se recubrió una placa de ELISA con cada uno de 1 μg/ml de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2. A continuación, se produjo una serie de dilución de hDlk-1-His (diluida 2 veces a partir de 1 μg/ml), y a continuación 50 se añadieron a la placa antes mencionada para la reacción. La unión de hDlk-1-His se detectó con un anticuerpo anti-etiqueta His con HRP.

La Figura 19 muestra los resultados del ELISA con respecto a la actividad de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a hDlk-1-His. Se recubrió una placa de ELISA con 0,5 μg/ml de hDlk-1-His. a continuación, se produjo una serie de dilución de los anticuerpos de prueba (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2) (diluida 55 en 2 veces a partir de 5 μg/ml), y a continuación se añadieron a la placa antes mencionada para la reacción. Los valores CE50 de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 se muestran en la figura.

La Figura 20 muestra los resultados del ELISA con respecto a la actividad de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a hDlk-1-His. Se recubrió una placa de ELISA con 0,05 μg/ml de hDlk-1-His. A continuación, se produjo una serie de dilución de los anticuerpos de prueba (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2) (diluida 60 en 2 veces a partir de 5 μg/ml), y a continuación se añadieron a la placa antes mencionada para la reacción.

La Figura 21 muestra los resultados de ELISA con respecto a la actividad de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-2, HuVH/MuVL (en la que la VL de HuBA-1-3D-2 (HuBA-1-3D VL) fue sustituida con la VL de BA-1-3D de ratón) y MuVH/HuVL (en el que la VH de HuBA-1-3D-2 (HuBA-1-3D VH2) fue sustituida por la VH de BA-1-3D de ratón) con hDlk-1-His. Se recubrió una placa de ELISA con 0,05 μg/ml de hDlk-1-His. A continuación, se produjo una 65 serie de dilución de 2 veces de un sobrenadante de cultivo de células, en el que cada uno de los anticuerpos de prueba (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-2, HuVH/MuVL y MuVH/HuVL) se habían expresado transitoriamente y a continuación se añadieron a la placa antes mencionada para la reacción.

La Figura 22 muestra las secuencias de aminoácidos de HuBA-1-3D VH1 y los mutantes de sustitución de aminoácidos de las mismas (V5Q a T73K/T75S). El aminoácido está indicado con una sola letra. En cada mutante de sustitución de aminoácidos, los mismos aminoácidos que los de HuBA-1-3D VH1 se indican con el 5 símbolo “-”, y solo los aminoácidos sustituidos se indican con letras simples. El número encima de cada secuencia indica un número de aminoácido (Kabat et al., 1991).

La Figura 23 muestra los resultados del ELISA con respecto a la actividad de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-A24G, HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K con hDlk-1-His. Se recubrió una placa de ELISA con 0,05 μg/ml de hDlk-1-His. A continuación, se produjo una serie de 2 veces de un sobrenadante de 10 cultivo de células, en el que cada uno de los anticuerpos de prueba (ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-A24G, HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K) se habían expresado transitoriamente, y a continuación se añadieron a la placa antes mencionada para la reacción.

La Figura 24 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 62) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 63) de la región codificante de la cadena H (cadena γ1) de pHuBA-1-3D-1-T73K. El resto de aminoácido se 15 indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”.

En la presente memoria, la secuencia de nucleótidos de ADNc (SEQ ID NO: 70) de la región variable de la cadena H (VH) de HuBA-1-3D-1-T73K es una secuencia que comprende nucleótidos en las posiciones 1 a 420 en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ. ID NO: 62, y la secuencia de aminoácidos putativa (SEQ ID NO: 71) de la VH de HuBA-1-3D-1-T73K es una secuencia que comprende aminoácidos en las 20 posiciones 1 a 140 en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 63. En la secuencia de aminoácidos putativa antes mencionada (SEQ ID NO: 71) de la VH de HuBA-1-3D-1-T73K, los péptidos que consisten en 19 aminoácidos del extremo N terminal son péptidos señal. La secuencia de nucleótidos del ADNc de un péptido maduro de HuBA-1-3D-1-T73K VH es que se muestra en la SEQ ID NO: 72, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 73. 25

La Figura 25 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 64) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 65) de la región codificante de la cadena H (cadena γ1) de pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K. El resto de aminoácido se indica con una sola letra, y la posición de un codón de terminación se indica con el símbolo “•”.

En la presente memoria, la secuencia de nucleótidos del ADNc (SEQ ID NO: 74) de la región variable de la cadena H (VH) de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K es una secuencia que comprende nucleótidos en las posiciones 1 a 30 420 en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 64, y la secuencia de aminoácidos putativa (SEQ ID NO: 75) de la VH de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K es una secuencia que comprende aminoácidos en las posiciones 1 a 140 en la secuencia de aminoácidos tal que se muestra en la SEQ ID NO: 65. En la secuencia de aminoácidos putativa antes mencionada (SEQ ID NO: 75) de la VH de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, los péptidos que consisten en 19 aminoácidos del extremo N terminal son péptidos señal. La secuencia de nucleótidos del 35 ADNc de un péptido maduro de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K es que se muestra en la SEQ ID NO: 76, y una secuencia de aminoácidos putativa de la misma es que se muestra en la SEQ ID NO: 77.

La Figura 26 muestra los resultados del ELISA con respecto a la actividad de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K con hDlk-1-His. Se recubrió una placa de ELISA con 0,05 μg/ml de hDlk-1-His. A continuación, se produjo una serie de dilución de dos veces de los anticuerpos de prueba 40 a partir de 5 μg/ml, y a continuación se añadieron a la placa antes mencionada para la reacción.

La Figura 27 muestra la estabilidad de la actividad de unión al antígeno de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en una formulación líquida. HuBA-1-3D-1-A24G/T73K se conservó en formulación líquida con diversos valores de pH a 40 °C durante 1 mes, y la actividad de unión del mismo se examinó a continuación mediante citometría de flujo y ELISA inmovilizado con antígeno. Se usó un anticuerpo que se había conservado en formulación líquida con 45 diversos valores de pH a -80 °C como producto de patrón de actividad.

Figura 27 (A): Usando 293 células que expresan constantemente hDlk-1, la actividad de unión al antígeno del anticuerpo se midió por citometría de flujo. El eje vertical indica un valor medio de intensidad fluorescente (MFI: fluorointensidad media), y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo.

Figura 27 (B): Usando un ELISA inmovilizado con antígeno recubierto con hDlk-1-His, se examinó la actividad de 50 unión al antígeno. El eje vertical indica la absorbancia, y el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo.

La Figura 28 muestra los resultados obtenidos mediante el análisis de la estabilidad de la actividad de unión al antígeno de un anticuerpo en plasma de mono cinomolgo. HuBA-1-3-D1-A24G/T73K se conservó a 37 °C en plasma de mono cinomolgo durante un período de incubación indicado en la figura. A continuación, se examinó la actividad de unión al antígeno del anticuerpo usando ELISA inmovilizado con antígeno recubierto con hDlk-1-55 His. El eje vertical indica el porcentaje de la actividad de unión al antígeno (valor de absorbancia) después de cada período de incubación, cuando el porcentaje de la actividad de unión al antígeno a las 0 h se define como 100 %. El eje horizontal indica el período de incubación.

La Figura 29 muestra la actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con xenoinjerto que usan células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano. 60

La Figura 29A muestra la formación de tumores a lo largo del tiempo en un grupo control (●: PBS) y en grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (○: 1 mg/kg, Δ: 5 mg/kg, □: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha en el eje horizontal indican los puntos temporales a los que se administró el anticuerpo. En todos los grupos de administración de anticuerpos, se observaron efectos antitumorales significativos (P <0,01 (mediante la prueba t de Student)) después del 13.º día (día 13) en comparación con el 65 grupo control.

La Figura 29B muestra el peso del tumor trazado de cada ratón en el momento del 23.º día (Día 23) (el último día del experimento) en la prueba de la Figura 29A. **P < 0,01 (según la prueba t de Student).

La Figura 30 muestra la actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento de xenoinjerto que usan células de neuroblastoma humano SK-N-F1.

La Figura 30A muestra la formación de tumores a lo largo del tiempo en un grupo control (●: PBS) y en grupos de 5 administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (○: 1 mg/kg, Δ: 5 mg/kg, □: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha en el eje horizontal indican los puntos temporales a los que se administró el anticuerpo. *P < 0,05, **P < 0,01 (según la prueba t de Student).

La Figura 30B muestra el peso tumoral trazado de cada ratón en el momento del 34.º día (día 34) (el último día del experimento) en la prueba de la Figura 30A. **P < 0,01 (según la prueba t de Student). 10

La Figura 31 muestra las actividades antitumorales de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K y Nexavar en modelos de tratamiento con xenoinjerto que usan células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano.

La Figura 31A muestra un cambio en el tiempo en los volúmenes tumorales de un grupo control (●: PBS) y grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (○: 0,1 mg/kg, Δ: 0,5 mg/kg, □: 1 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha en el eje horizontal indican la administración del anticuerpo. **P < 15 0,01 (según la prueba t de Student).

La Figura 31B muestra un cambio a lo largo del tiempo en los volúmenes tumorales de un grupo control (●: PBS) y grupos de administración de Nexavar (○: 40 mg/kg, Δ: 80 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha en el eje horizontal indican los puntos temporales a los que se administró Nexavar. *P < 0,05 (según la prueba t de Student). 20

La Figura 31C muestra un cambio en el tiempo en los pesos corporales de los ratones en los experimentos A y B. Tal cambio en los pesos corporales se muestra como el porcentaje del peso corporal en cada día de medición, cuando el peso corporal de cada ratón en el momento de la división en grupos se define al 100 % (un valor medio ± desviación estándar). *P < 0,05, **P < 0,01 (según la prueba t de Student).

La Figura 32 muestra la actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con 25 xenoinjerto que usan células HepG2/C3A de carcinoma hepatocelular humano.

La Figura 32A muestra un cambio a lo largo del tiempo en los volúmenes tumorales de un grupo control (●: PBS) y grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (○: 0,1 mg/kg, Δ: 0,5 mg/kg, □: 1 mg/kg, ◇: 5 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha en el eje horizontal indican la administración del anticuerpo. **P < 0,01 (según la prueba t de Student). 30

La Figura 32B muestra el peso del tumor trazado de cada ratón en el momento del 26.º día (día 26) (el día final del experimento) en la prueba de la Figura 32A. **P < 0,01 (según la prueba t de Student).

La Figura 33 muestra la actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento de xenoinjerto que usan células de cáncer de pulmón microcítico humano Lu-135.

La Figura 33A muestra un cambio en el tiempo en los volúmenes tumorales de un grupo control (●: PBS) y 35 grupos de administración HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (○: 1 mg/kg, Δ: 10 mg/kg) (un valor medio ± desviación estándar). Las puntas de flecha en el eje horizontal indican la administración del anticuerpo. **P < 0,05 (según la prueba t de Student).

La Figura 33B muestra el peso del tumor trazado de cada ratón en el momento del 34.º día (día 34) (el día final del experimento) en la prueba de la Figura 33A. **P < 0,05 (según la prueba t de Student). 40

La Figura 34 muestra fotografías en las que se detectó muerte celular causada por apoptosis en los cortes congelados de tumores de xenoinjerto después de la administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K a modelos de tratamiento con xenoinjerto usando células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano.

La Figura 34A muestra fotografías en las que se detectó muerte celular causada por apoptosis mediante tinción de TUNEL. Desde la izquierda, las fotografías muestran imágenes teñidas 48 horas después de la administración 45 de PBS, 24 horas después de la administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg) y 48 horas después de la administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg), respectivamente. Las células cancerosas en las que se observó tinción nuclear marrón oscuro indican células apoptóticas positivas para TUNEL (la lente objetivo de un microscopio: 400 veces).

La Figura 34B muestra fotografías en las que se detectó muerte celular causada por apoptosis mediante 50 inmunohistoquímica usando un anticuerpo anti-caspasa-3 escindido. Desde la izquierda, las fotografías muestran imágenes teñidas 48 horas después de la administración de PBS, 24 horas después de la administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg) y 48 horas después de la administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg), respectivamente. Las células cancerosas cuyo citoplasma se tiñó en marrón oscuro indican células apoptóticas activas con caspasa-3 positivo (la lente objetivo de un microscopio: 400 veces). 55

Descripción detallada de la invención

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle. No se pretende que las siguientes descripciones limiten el alcance de la presente invención. Aparte de los siguientes ejemplos, la presente invención se puede 60 modificar y se puede llevar a cabo, según sea apropiado, dentro de un rango que no perjudique el propósito de la presente invención.

La presente memoria descriptiva incluye todos los contenidos divulgados en la memoria descriptiva de la Solicitud de patente provisional de los Estados Unidos N.º 61/709.282 (presentada el 3 de octubre de 2012), que es un 65 documento de prioridad de la presente solicitud. Además, todas las publicaciones citadas en la presente memoria descriptiva, que incluyen documentos de la técnica anterior y documentos de patente tales como publicaciones de solicitudes abiertas a consulta pública y publicaciones de patentes, se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

1. Sumario de la presente invención 5

Como se describió anteriormente, la Dlk-1 humana (homólogo de tipo delta 1 (Drosophila); hDlk-1) es una proteína transmembrana de tipo I (de tipo transmembrana uno) con una longitud total de 383 restos de aminoácidos y esta proteína tiene 6 motivos de tipo EGF en su región extracelular. Se sabe que un gen hDlk-1 y un producto génico del mismo se expresan con una alta frecuencia en diversos tipos de células cancerosas o tumorales. En general, es 10 difícil de preparar y obtener un anticuerpo que exhiba actividad antitumoral in vivo. Por lo tanto, incluso si se produce un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1, este tiene actividad antitumoral in vitro pero no exhibe la actividad in vivo en muchos casos. Por otra parte, no se han aclarado el dominio funcional de hDlk-1 que actúa sobre el crecimiento de células cancerosas, un ligando (o un receptor) de hDlk-1, su ruta de transducción de la señal intracelular y similares. Por lo tanto, es sustancialmente imposible producir eficazmente un anticuerpo limitando su diana. En tales 15 circunstancias, en la presente invención, se ha obtenido con éxito un clon que tiene actividad antitumoral in vivo seleccionándolo a partir de un gran número de clones.

En primer lugar, basándose en la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos anti-hDlk-1 conocidos, los autores de la presente invención han descubierto que hDlk-1 se expresa en el cáncer de colon, el cáncer de mama y el cáncer de 20 páncreas, además de los cánceres y las células tumorales mencionados anteriormente, en los que se había confirmado previamente la expresión de hDlk-1.

A continuación, los autores de la presente invención han producido recientemente aproximadamente 100 clones de anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 con el fin de producir anticuerpos anti-hDlk-1 capaces de destruir las células 25 cancerosas que expresan hDlk-1 a nivel individual o inhibir el crecimiento del tumor, concretamente, anticuerpos anti-hDlk-1 que tienen actividad antitumoral in vivo. Posteriormente, los autores de la presente invención han evaluado los efectos farmacéuticos in vivo (acción anti-tumoral) de estos clones, utilizando ratones portadores de tumores establecidos mediante el trasplante de varios tipos de líneas celulares de cáncer por vía subcutánea en ratones atímicos. Como resultado, los autores de la presente invención han logrado obtener varios clones que 30 exhiben una actividad de inhibición del crecimiento tumoral significativa (nombre del clon: BA-1-3D, DI-2-14, 2-13, DI-6 y M3-1).

Por otra parte, entre los anticuerpos anti-hDlk-1 anteriormente mencionados, los autores de la presente invención han descubierto un anticuerpo que exhibe una actividad antitumoral significativa en modelos de tratamiento de ratón 35 portadores de cáncer usando células de cáncer humano, cuando se administra solo, lo que sería importante para el desarrollo de un anticuerpo terapéutico contra el cáncer, y los inventores también han desarrollado un anticuerpo humanizado del mismo. Además, los presentes inventores han añadido una modificación específica (mutación de sustitución de aminoácido) a este anticuerpo anti-hDlk-1 humanizado, de modo que han obtenido un anticuerpo anti-hDlk-1 humanizado modificado que tiene una avidez equivalente a la de un anticuerpo parental (BA-1-3D de ratón). 40 Además, los inventores han demostrado que este anticuerpo anti-hDlk-1 humanizado modificado conserva una actividad estable de unión al antígeno durante un largo período de tiempo en una formulación líquida y en sangre o plasma de mono o humano, etc.

2. Preparación del anticuerpo anti-hDlk-1 45

(1) Preparación del antígeno

La información relativa a la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de hDlk-1 se divulga como “Número de acceso: NP_003827” en el sitio web del NCBI (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), por ejemplo. Además, la 50 información referente a una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) que codifica la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 se divulga como “Número de acceso: NM_003836” en el mismo sitio web anterior.

Como antígeno, se puede utilizar un polipéptido o péptido (al que a veces se puede hacer referencia simplemente como “péptido”) que comprende al menos una porción de (toda o una parte de) la secuencia de aminoácidos de 55 hDlk-1 y preferiblemente, se puede utilizar un péptido que comprende al menos una porción de (toda o una parte de) la secuencia de aminoácidos de la región extracelular (FA-1) de hDlk-1. Como se indicó anteriormente, la región extracelular de hDlk-1 comprende 6 motivos de tipo EGF (EGF-1 a EGF-6). Esta región indica una región que comprende los aminoácidos en las posiciones 24 a 244 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y, preferentemente, una región que consiste en los aminoácidos de la “posición 24” a las posiciones “248-285” 60 (aproximadamente 225 a 262 restos de aminoácidos) en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

En la presente memoria, en el caso de un péptido utilizado como antígeno, la longitud de la “al menos una porción de la secuencia de aminoácidos” mencionada no está particularmente limitada. Por ejemplo, es preferible una región que comprende uno o dos o más de los 6 motivos de tipo EGF. Los ejemplos más preferibles incluyen una región 65 que comprende EGF-1 y EGF-2 (es decir, una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 24 a 91 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2), una región que comprende EGF-3 y EGF-4 (es decir, una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 92 a 167 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2) y una región que comprende EGF-4, EGF y EGF-5-6 (es decir, una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 131 a 244 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2).

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Como método para preparar un péptido utilizado como antígeno, se puede aplicar ya sea una síntesis química, o una síntesis mediante medios de ingeniería genética utilizando Escherichia coli o similares. Se pueden aplicar métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

En el caso de realizar una síntesis química de péptidos, se puede sintetizar un péptido de este tipo por medio de 10 métodos bien conocidos para la síntesis de péptidos. Como tal síntesis, se pueden aplicar un método de síntesis en fase sólida o un método de síntesis en fase líquida. Se pueden utilizar aparatos de síntesis de péptidos disponibles en el mercado (por ejemplo, PSSM-8, etc.; fabricado por Shimadzu Corp.).

En el caso de la síntesis de un péptido por medio de ingeniería genética, se diseña y sintetiza en primer lugar el 15 ADN que codifica el péptido. El diseño y la síntesis del ADN pueden llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un método de PCR, usando un vector que comprende un gen hDlk-1 completo o similar como molde y también usando cebadores diseñados de tal manera que se pueda sintetizar una región de ADN deseada con los mismos. A continuación, el ADN sintetizado de este modo se liga a un vector adecuado para obtener un vector recombinante utilizado en la expresión de una proteína. Este vector recombinante se introduce a continuación en un hospedador 20 de manera que se pueda expresar en el mismo dicho gen de interés, con el fin de obtener un transformante (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

Como vector, se pueden utilizar un fago o un plásmido susceptibles de replicación autónoma en microorganismos 25 hospedadores. Adicionalmente, también se puede utilizar un vector de virus de animal o virus de insecto. Para la preparación de un vector recombinante, el ADN purificado se puede escindir con enzimas de restricción adecuadas, la porción de ADN obtenida se puede insertar a continuación en el sitio de restricción del ADN del vector adecuado, etc., y después se puede ligar a un vector. El tipo de un hospedador utilizado en la transformación no está particularmente limitado, siempre y cuando sea susceptible de expresar un gen de interés. Los ejemplos de tal 30 hospedador incluyen bacterias (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras, células animales (células COS, células CHO, etc.), células de insectos e insectos. También es posible utilizar un mamífero tal como una cabra como un hospedador. Se conoce un método para introducir un vector recombinante en un hospedador.

El transformante anteriormente mencionado se cultiva y un péptido utilizado como antígeno se recoge a continuación 35 del cultivo. El término “cultivo” se utiliza para significar uno cualquiera de (a) un sobrenadante de cultivo y (b) células cultivadas, una masa de células cultivadas, o un producto disgregado de las mismas.

Después de la finalización del cultivo, cuando se produce el péptido de interés en las células bacterianas (cuerpos bacterianos) o en las células, tales células bacterianas o células se disgregan y a continuación se extrae un péptido. 40 Por otro lado, se produce un péptido de interés fuera de la célula bacteriana o de las células, la solución de cultivo se utiliza directamente, o las células bacterianas o las células se eliminan mediante centrifugación o similar. A continuación, se aplican por separado o combinados métodos bioquímicos comunes utilizados en el aislamiento y la purificación de péptidos, tales como precipitación con sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, con el fin de aislar y purificar un péptido de interés. 45

En la presente invención, también se puede obtener un péptido utilizado como un antígeno mediante traducción in vitro utilizando un sistema de síntesis sin células. En este caso, se pueden aplicar dos tipos de métodos, concretamente, un método que utiliza ARN como molde y un método que utiliza ADN como molde (transcripción/traducción). Como tal sistema de síntesis sin células, se pueden utilizar sistemas comercializados, 50 tales como el sistema Expressway™ (Invitrogen), PURESYSTEM (marca registrada; Post Genome Institute Co., Ltd.) y el sistema TNT (marca registrada; Promega).

El péptido obtenido de esta manera también puede estar unido a una proteína vehículo adecuada, tal como albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH), tiroglobulina humana, o 55 gammaglobulina de pollo.

Además, tal antígeno de este tipo puede ser un péptido, que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción, sustitución o adición de uno o múltiples aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 (SEQ ID NO: 2) o la secuencia parcial anteriormente mencionada de la misma. Por ejemplo, 60 también se puede utilizar un péptido, que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción de uno o múltiples (preferiblemente uno o varios (por ejemplo de 1 a 10 y más preferiblemente de 1 a 5)) aminoácidos, una sustitución de uno o múltiples (preferiblemente uno o varios (por ejemplo de 1 a 10 y más preferiblemente de 1 a 5)) aminoácidos por otros aminoácidos, o una adición de uno o múltiples (preferiblemente uno o varios (por ejemplo de 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5)) aminoácidos, con respecto a la secuencia de 65 aminoácidos de hDlk-1 o una secuencia parcial de la misma.

En la presente invención, un ejemplo de un gen que se va a introducir en las células o similares es un gen que codifica una proteína hDlk-1, un fragmento parcial de la misma, una proteína mutante de la misma, o un fragmento de la misma. Como tal gen, se puede utilizar, por ejemplo, un gen que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia parcial de la misma.

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Además, como tal gen que se va a introducir en las células o similar, también se puede utilizar una secuencia de nucleótidos, que hibrida con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas y codifica una proteína que tiene actividad hDlk-1, o una secuencia parcial de la misma.

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La expresión “condiciones rigurosas” se utiliza para referirse a las condiciones aplicadas al lavado después de la hibridación, que consisten en una concentración de sal (sodio) del tampón de entre 10 y 500 mM y una temperatura entre 42 °C y 72 °C y preferiblemente consisten en la concentración de sal de tampón anteriormente mencionada de entre 50 y 300 mM y una temperatura entre 55 °C y 68°C.

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La mutación puede introducirse en un gen mediante métodos conocidos tales como un método Kunkel o un método de ADN dúplex discontinuo (Gapped Duplex), utilizando kits de introducción de mutación que utilizan mutagénesis dirigida al sitio, tales como GeneTailor™ Site Directed Mutagenesis System (fabricado por Invitrogen) o TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Prime STAR (marca registrada) Mutagenesis Basal Kit, Mutan-Super Express Km, etc.; fabricado por Takara Bio Inc.). 20

(2) Preparación del anticuerpo policlonal

El antígeno preparado se administra a un mamífero para la inmunización. El tipo de tal mamífero no está particularmente limitado. Los ejemplos de tal mamífero incluyen una rata, un ratón y un conejo. Entre otros, es 25 preferible un ratón.

La dosis del antígeno por animal se puede determinar, según sea apropiado, dependiendo de la presencia o ausencia de un coadyuvante. Los ejemplos de tal coadyuvante incluyen coadyuvante completo de Freund (FCA), coadyuvante incompleto de Freund (FIA) y un coadyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización se puede 30 llevar a cabo mediante la inyección del antígeno en la vena, la almohadilla plantar, el tejido subcutáneo, la cavidad abdominal, etc. Además, el intervalo de inmunización no está particularmente limitado. La inmunización se lleva a cabo de 1 a 10 veces y preferiblemente 2 o 3 veces, a intervalos de varios días a varias semanas y preferiblemente a intervalos de 1 semana. De tres a siete días después de la inmunización final, se mide el título de anticuerpo por medio de inmunoensayo enzimático (ELISA o EIA), radioinmunoensayo (RIA), etc. El día en el que se obtiene un 35 título de anticuerpos deseado, se extrae sangre y a continuación se obtiene el antisuero. En el caso en el que un anticuerpo se debe purificar con el método mencionado anteriormente para recoger el anticuerpo, se selecciona apropiadamente un método adecuado entre los métodos conocidos tales como un método de precipitación con sal de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad, o estos métodos se pueden utilizar combinados, para purificar el anticuerpo. A continuación, la reactividad 40 de un anticuerpo policlonal contenido en el antisuero se mide mediante ELISA, etc.

(3) Preparación del anticuerpo monoclonal

(3-1) Recogida de las células productoras de anticuerpos 45

El tipo del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención no está limitado. Es preferible un anticuerpo monoclonal.

El antígeno preparado se administra a un mamífero tal como una rata, un ratón o un conejo para la inmunización. La dosis del antígeno por animal se puede determinar, según sea apropiado, dependiendo de la presencia o ausencia 50 de un coadyuvante. En la presente memoria se utilizan los mismos coadyuvantes que se han descrito anteriormente. Asimismo, en la presente memoria se aplican los mismos métodos de inmunización que se han descrito anteriormente. De uno a sesenta días, y preferiblemente de uno a catorce días después de la inmunización final, se recogen las células productoras de anticuerpos. Los ejemplos de tales células productoras de anticuerpos incluyen células de bazo, células de ganglios linfáticos y células de sangre periférica. Entre otras, son preferibles las células 55 de los ganglios linfáticos y las células de bazo.

(3-2) Fusión celular

Con el fin de obtener un hibridoma (una línea celular productora de anticuerpos), la fusión celular se lleva a cabo 60 entre las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma. Como células de mieloma que se van a fusionar con las células productoras de anticuerpos, fácilmente disponibles, se pueden utilizar líneas celulares establecidas, tales como las líneas de células de animales tales como ratones. En cuanto a las líneas celulares disponibles, son preferibles aquellas que tienen selectividad por fármacos, no pueden sobrevivir en un medio selectivo HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) cuando están en un estado no fusionado y pueden 65 sobrevivir en el mismo solo cuando se fusionan con células productoras de anticuerpos.

Los ejemplos de las células de mieloma utilizadas en la presente memoria incluyen líneas celulares de mieloma de ratón tales como P3-X63-Ag8.653, P3-X63-Ag8(X63), P3-X63-Ag8.U1(P3U1), P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) y Sp2/0-Ag14(Sp2/0). Tales células de mieloma se pueden seleccionar, siempre que se tenga en consideración la compatibilidad con las células productoras de anticuerpos, según sea apropiado.

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Posteriormente, las células de mieloma se fusionan con las células productoras de anticuerpo para la fusión celular. Para este tipo de fusión celular, las células productoras de anticuerpos a una densidad celular de 1 x 106 a 1 x 107 células/ml se mezclan con células de mieloma a una densidad celular de 2 x 105 a 2 x 106 células/ml, en un medio utilizado para células animales que no contiene suero, tal como DMEM o un medio RPMI-1640. La proporción de células entre dichas células productoras de anticuerpos y tales células de mieloma (células productoras de 10 anticuerpos:células de mieloma) no está limitada. En general, tal proporción celular se encuentra preferiblemente entre 1:1 y 10:1 y más preferiblemente 3:1. Posteriormente, se lleva a cabo una reacción de fusión en presencia de un promotor de la fusión celular. En cuento a tal promotor de la fusión celular. Como promotor de la fusión celular se puede utilizar polietilenglicol que tiene un peso molecular medio entre 1.000 y 6.000 dalton (D) o similares, por ejemplo. Además, las células productoras de anticuerpos se pueden fusionar con células de mieloma usando un 15 dispositivo de fusión celular comercializado que utiliza la estimulación eléctrica (p. ej., electroporación).

(3-3) Selección del hibridoma y clonación

Un hibridoma de interés se selecciona a partir de células obtenidas después del tratamiento de fusión celular. Como 20 método de selección, una suspensión de células se diluye con un medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal o similar, según sea apropiado y la solución diluida se dispersa a continuación en una placa de microtitulación. Se añade un medio selectivo a cada pocillo y se lleva a cabo el cultivo a continuación, mientras que el medio selectivo se cambia apropiadamente por uno fresco. Como resultado, las células que crecen aproximadamente 14 días después del comienzo del cultivo en el medio selectivo pueden obtenerse en forma de hibridomas. 25

Posteriormente, se analiza la presencia o ausencia de un anticuerpo contra hDlk-1 en un sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento. Dicha selección de los hibridomas se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos ordinarios y por lo tanto el tipo del método de selección no está particularmente limitado. Por ejemplo, una porción del sobrenadante del cultivo de los hibridomas en crecimiento contenidos en el pocillo se puede recoger y tales 30 hibridomas se pueden seleccionar a continuación mediante ELISA, EIA, RIA, etc.

Las células fusionadas se pueden clonar mediante dilución limitante o similar. Un anticuerpo que presenta una fuerte reactividad con hDlk-1 se determina por medio de citometría de flujo o similar, y se selecciona y un hibridoma que produce el anticuerpo se establece como clon. 35

(3-4) Recogida del anticuerpo monoclonal

Como método de cultivo de los hibridomas establecidos y posterior recogida del anticuerpo monoclonal a partir del cultivo obtenido, se puede adoptar un método de cultivo celular común, un método de formación de ascitis, etc. El 40 término “cultivo” se utiliza para indicar que se permite desarrollar un hibridoma en una placa de cultivo o botella de cultivo, o que se permite que prolifere un hibridoma en la cavidad abdominal de un animal, como se describe a continuación.

En el método de cultivo celular, los hibridomas se pueden cultivar en un medio de cultivo celular animal tal como un 45 medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal al 10 %, un medio MEM o un medio sin suero en condiciones de cultivo comunes (p. ej., 37 °C, concentración de CO2 al 5 %) durante 7 a 14 días y a continuación se puede obtener un anticuerpo del sobrenadante del cultivo.

En el método de formación de ascitis, los hibridomas se administran a una densidad celular de aproximadamente 1 x 50 107 células en la cavidad abdominal de un animal de la misma especie que el mamífero del que derivan las células de mieloma, con el fin de provocar la proliferación de una gran cantidad de hibridomas. A continuación, la ascitis se recoge preferiblemente de 2 a 3 semanas más tarde.

En el caso en el que un anticuerpo debe ser purificado en el método anteriormente mencionado para recoger el 55 anticuerpo, un método adecuado se selecciona apropiadamente a partir de métodos conocidos, tales como un método de precipitación con sal sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel y cromatografía de afinidad, o estos métodos se utilizan combinados, con el fin de purificar el anticuerpo anteriormente mencionado.

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(3-5) Selección del clon que tiene actividad antitumoral

El anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención es un anticuerpo que tiene actividad antitumoral in vivo.

En la presente memoria, la expresión “actividad antitumoral” se utiliza para indicar la actividad de destrucción de 65 células tumorales (células cancerosas) o la inhibición del crecimiento tumoral. En la presente invención, como tal actividad antitumoral es preferible, por ejemplo, la actividad de inhibición de la angiogénesis tumoral. Por otra parte, los tipos de tumores humanos (células tumorales), sobre los que el anticuerpo de la presente invención es capaz de manifestar actividad antitumoral, incluyen: los tumores humanos conocidos antes mencionados en los que se había confirmado la expresión de hDlk-1 (específicamente, cánceres sólidos tales como tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, neurofibromatosis tipo 1, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de hígado, cáncer de riñón y 5 cánceres de ovario, y neoplasias sanguíneas tales como el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda); y cáncer de colon humano, cáncer de mama humano y cáncer de páncreas humano en los que la expresión de hDlk-1 ha sido recientemente confirmada por los autores de la presente invención. De estos, son particularmente preferibles uno o dos o más tipos seleccionados de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de hígado humano, cáncer de pulmón microcítico y neuroblastoma humano. 10

La presencia de la actividad antitumoral in vivo se puede confirmar utilizando un ratón que porta cáncer, en el que se han trasplantado subcutáneamente las células tumorales deseadas, y a continuación administrando el anticuerpo obtenido al ratón. En este caso, el anticuerpo se puede administrar al ratón inmediatamente después del trasplante de las células tumorales (un modelo de prevención), o el anticuerpo se puede administrar también al ratón después 15 de que el tumor ha crecido hasta un volumen deseado después del trasplante (un modelo de tratamiento). El método de administración no está limitado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar a la cavidad abdominal del ratón una vez cada 3 días a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal a través de administración intraperitoneal. En el caso del modelo de prevención, la presencia o ausencia de actividad antitumoral y su nivel se pueden evaluar en función de la frecuencia de la formación del tumor y del volumen del tumor. En el caso del modelo de tratamiento, la 20 presencia o ausencia de actividad antitumoral y el nivel de las mismas se pueden evaluar en función del volumen del tumor.

En la presente invención, los ejemplos preferidos de un anticuerpo anti-hDlk-1 que tiene actividad antitumoral in vivo incluyen un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: BA-1-3D) producido por un hibridoma que tiene el 25 N.º de acceso FERM BP-11337, un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: M3-1) producido por un hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-10707, un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: DI-2-14) producido por un hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-10899 y un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 (nombre del clon: DI-6) producido por un hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-10900. Además, se puede utilizar preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-hDlk-1 con el nombre de clon DI-2-14 como anticuerpo que 30 tiene una alta actividad antitumoral in vivo.

En la presente memoria, el hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-11337 se ha denominado “Hibridoma de Ratón-Ratón: BA-1-3D”, y se ha depositado en el Organismo Internacional para el Depósito de Patentes (IPOD), Instituto Nacional de Ciencia Industrial Avanzada y Tecnología (AIST Tsukuba Central de 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, 35 Ibaraki, Japón, Código postal: 305 a 8566), el 1 de febrero de 2011. El hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-10707 se ha denominado “Hibridoma de Ratón-Ratón: M3-1”, y se ha depositado en el en el mismo instituto nacional indicado anteriormente, el 18 de octubre de 2006. El hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-10899 se ha denominado “Hibridoma de Ratón-Ratón DI-2-14” y se ha depositado en el en el mismo instituto nacional indicado anteriormente el 21 de agosto de 2007. El hibridoma que tiene el N.º de acceso FERM BP-10900 se ha 40 denominado “Hibridoma de Ratón-Ratón DI-6”, y se ha depositado en el en el mismo instituto nacional indicado anteriormente el 21 de Agosto de 2007.

Otros ejemplos preferidos del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención incluyen un anticuerpo anti-hDlk-1 en el que las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H, son las secuencias de 45 aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NOS: 16 a 18, respectivamente, y/o un anticuerpo anti-hDlk-1 en el que las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L, son las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NOS: 23 a 25 respectivamente. La región V de la cadena H antes mencionada consiste preferiblemente, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 y particularmente preferiblemente consiste en la SEQ ID NO: 15 (péptido maduro). La región V de la cadena L antes 50 mencionada consiste preferiblemente, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 20 y particularmente preferiblemente consiste en la SEQ ID NO: 2 (péptido maduro).

Otro ejemplo preferido más del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención es un anticuerpo anti-hDlk-1 que se une a un sitio (p.ej. un epítopo) al cual se une (reconoce) un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que 55 tiene el N.º de acceso FERM BP-11337, FERM BP-10707, FERM BP-10899 o FERM BP-10900.

(3-6) Epítopo del anticuerpo anti-hDlk-1

Un epítopo (un determinante antigénico) del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención no está limitado siempre 60 que sea al menos una porción de hDlk-1 como antígeno. Por ejemplo, tal epítopo es preferiblemente al menos una porción de una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 24 a 91 (una región que comprende el EGF-1 a EGF-2 de hDlk-1), una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 92 a 167 (una región que comprende el EGF-3 a EGF-4 de hDlk-1), o una región que consiste en los aminoácidos de las posiciones 131 a 244 (una región que comprende el EGF-4 a EGF-6 de hDlk-1), en la secuencia de aminoácidos de hDlk-1 que se 65 muestra en la SEQ ID NO: 2. Entre otras, es más preferible una región que comprende el EGF-1 a EGF-2 de hDlk-1. Un anticuerpo anti-hDlk-1 que reconoce (se une a) dichas regiones tiene una alta actividad de internalización en las células tumorales, por ejemplo, y por lo tanto, es extremadamente útil como un inmunoconjugado tal como se describe más adelante.

(4) Anticuerpo y fragmento de anticuerpo genéticamente recombinante 5

(4-1) Anticuerpo genéticamente recombinante

En una realización preferida del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención, se proporciona un anticuerpo genéticamente recombinante. El tipo de tal anticuerpo genéticamente recombinante no está limitado. Los ejemplos 10 incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

Un anticuerpo quimérico (es decir, un anticuerpo quimérico humanizado) es un anticuerpo formado por ligación (conjugación) de la región variable de un anticuerpo derivado de ratón con la región constante de un anticuerpo derivado de ser humano (consultar Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, (1984), etc.). Cuando se produce tal 15 anticuerpo quimérico, el anticuerpo ligado de este modo se puede construir fácilmente mediante una técnica de recombinación genética. Como tales regiones variables del anticuerpo derivado de ratón utilizado en la presente memoria, la región V de la cadena H consiste preferiblemente, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 13, y particularmente preferiblemente consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 15 (péptido maduro), y la región V de la cadena L consiste preferiblemente, por ejemplo, en 20 la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 20, y particularmente preferiblemente consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 22 (péptido maduro).

Cuando se produce un anticuerpo humanizado, una región determinante de la complementariedad (CDR) se trasplanta de la región variable de un anticuerpo de ratón a la región variable de un anticuerpo humano, con el fin de 25 producir una región variable reconstruida, en la cual una región marco (FR) deriva de la humana y la CDR deriva de la del ratón (lo que se denomina injerto de CDR (trasplante de CDR)). Posteriormente, la región variable humana reconstruida, humanizada de este modo se liga a una región constante humana. En la presente memoria, como tal regiones variables humanas reconstruidas humanizadas, la región V de la cadena H consiste preferiblemente, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 33, y particularmente preferiblemente 30 consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35 (péptido maduro), o preferiblemente consiste, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 38, y particularmente preferiblemente consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40 (péptido maduro). Por otro lado, la región V de la cadena L consiste preferiblemente, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 43, y particularmente preferiblemente consiste en la secuencia de aminoácidos que se 35 muestra en la SEQ ID NO: 45 (péptido maduro). Como método para producir tales anticuerpos humanizados, cabe citar por ejemplo, Nature, 321, 522-525 (1986)); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)); Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)); Publicación de patente JP (Kohyo) N.º 4-502408 A (1992) (Patente japonesa N.º 2828340; Queen et al.), etc. El tipo de secuencia de CDR derivada de ratón que puede usarse en la presente memoria para el anticuerpo anti-hDlk-1 humanizado de la presente invención no está limitado. Como ejemplos 40 preferidos de dichas secuencias de CDR derivadas de ratón, las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEQ ID NO: 16 a 18 son preferibles como las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H (en este orden), y las secuencias de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NOS: 23 a 25 son preferibles como las CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L (en este orden).

45

Además, la presente invención incluye aminoácidos modificados, en los cuales un aminoácido(s) (preferiblemente uno a varios, y más preferiblemente uno o dos aminoácidos) en una parte de la región V (excluyendo una secuencia CDR) de la cadena H o la cadena L del anticuerpo humanizado mencionado anteriormente está sustituido con otros aminoácidos.

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Los ejemplos preferidos de dichos aminoácidos modificados incluyen aminoácidos modificados, en los cuales uno o dos aminoácidos en la región V de la cadena H (excluyendo una secuencia CDR) del anticuerpo humanizado mencionado anteriormente están sustituidos con otros aminoácidos. Los ejemplos preferidos de los aminoácidos así sustituidos incluyen aquellos en los cuales la región V de la cadena H es la siguiente:

55

(1-1) la región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 67 (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 66), y que consiste particularmente en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 69 (péptido maduro) (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 68);

(1-2) la región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 71 (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 70), y que consiste particularmente en la secuencia de aminoácidos 60 que se muestra en la SEQ ID NO: 73 (péptido maduro) (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 72);

(1-3) la región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 75 (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 74), y que consiste particularmente en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 77 (péptido maduro) (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 76);

(2-1) la región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 65 79 (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 78), y que consiste particularmente en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 81 (péptido maduro) (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 80);

(2-2) la región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 83 (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 82), y que consiste particularmente en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 85 (péptido maduro) (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 84); o

(2-3) la región V de la cadena H que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5 87 (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 86), y que consiste particularmente en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89 (péptido maduro) (la secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 88). De estas, las secuencias de aminoácidos de acuerdo con los apartados (1-3) y

(2-3) anteriores son más preferibles. Por lo tanto, un anticuerpo anti-hDlk-1 humanizado modificado, en el cual la región V de la cadena H se modifica en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con uno cualquiera de los 10 apartados (1-1) a (2-3) anteriores y la región V de la cadena L consiste en la secuencia de aminoácidos antes mencionada que se muestra en la SEQ ID NO: 43, y particularmente consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 45 (péptido maduro), es un anticuerpo humanizado que tiene una avidez mucho más alta (actividad de unión al antígeno), y por ejemplo, este anticuerpo es capaz de retener una actividad de unión a las células cancerosas, en cuya superficie el nivel de expresión del antígeno es bajo. 15 Además, el anticuerpo anti-hDlk-1 humanizado modificado es capaz de conservar una actividad estable de unión al antígeno durante un largo período de tiempo en una formulación líquida, en sangre de mono o humana (plasma), etc.

En la presente memoria, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 67 de 20 acuerdo con el apartado (1-1) anterior, la alanina (A) en la posición 43 está sustituida con glicina (G) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 33; y con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 69 de acuerdo con el apartado (1-1) anterior, la alanina (A) en la posición 24 está sustituida con glicina (G) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35 (péptido maduro).

25

Además, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 71 de acuerdo con el apartado (1-2) anterior, la treonina (T) en la posición 93 está sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 33; y con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 73 de acuerdo con el apartado (1-2) anterior, la treonina (T) en la posición 74 está sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35 (péptido maduro). 30

Además, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 75 de acuerdo con el apartado (1-3) anterior, la alanina (A) en la posición 43 está sustituida con glicina (G) y la treonina (T) en la posición 93 está sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 33; y con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 77 de acuerdo con el apartado (1-3) 35 anterior, la alanina (A) en la posición 24 está sustituida con glicina (G) y la treonina (T) en la posición 74 es sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 35 (péptido maduro).

Además, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 79 de acuerdo con el apartado (2-1) anterior, la alanina (A) en la posición 43 está sustituida con glicina (G) en la secuencia de 40 aminoácidos que se muestra en la SEQ. ID NO: 38; y con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 81 de acuerdo con el apartado (2-1) anterior, la alanina (A) en la posición 24 está sustituida con glicina (G) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40 (péptido maduro).

Además, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 83 de acuerdo con el 45 apartado (2-2) anterior, la treonina (T) en la posición 93 está sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ. ID NO: 38; y con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 85 de acuerdo con el apartado (2-2) anterior, la treonina (T) en la posición 74 está sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40 (péptido maduro).

50

Además, con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 87 de acuerdo con el apartado (2-3) anterior, la alanina (A) en la posición 43 está sustituida con glicina (G) y la treonina (T) en la posición 93 está sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 38; y con respecto a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89 de acuerdo con el apartado (2-3) anterior, la alanina (A) en la posición 24 está sustituida con glicina (G) y la treonina (T) en la posición 74 está 55 sustituida con lisina (K) en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 40 (péptido maduro).

En general, en el caso de un anticuerpo humano (un anticuerpo humano completo), su estructura que comprende una región hipervariable que es el sitio de unión al antígeno de una región V, otras partes de la región V y una región constante es la misma que la estructura del anticuerpo de un ser humano. Sin embargo, tal sitio hipervariable 60 también puede derivar de otros animales. Se conoce públicamente una técnica de producción de un anticuerpo humano y se ha establecido un método para la producción de secuencias génicas que son comunes en seres humanos mediante ingeniería genética. Un anticuerpo humano se puede conseguir, por ejemplo, por medio de un método que utiliza un ratón productor de un anticuerpo humano que tiene fragmentos cromosómicos humanos que comprenden los genes de la cadena H y la cadena L del anticuerpo humano (consultar Tomizuka, K. et al., Nature 65 Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et al, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. y Iijima, S. eds), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727, etc.), o mediante un método de obtención de un anticuerpo humano derivado de presentación en fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (consultar Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203; Siriwardena, 5 D. et. al., Ophtalmology, (2002) 109 (3), 427-431, etc.).

En el caso del anticuerpo quimérico, el anticuerpo humanizado y el anticuerpo humano anteriormente mencionados, la cadena de azúcar unida mediante N-glicósido en la región Fc de anticuerpo es preferiblemente, por ejemplo, una cadena de azúcar, en la que la fucosa no se une a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la misma. Un 10 ejemplo específico es un anticuerpo que consiste en moléculas de anticuerpos genéticamente recombinantes, que tienen, en la región Fc de las moléculas de anticuerpo, una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa no se une a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido a través de un enlace α. Dicho anticuerpo es capaz de mejorar significativamente la actividad ADCC. Este punto (las características de la cadena de azúcar unida mediante N-glicósido en la región Fc de anticuerpo) es 15 preferible también para el anticuerpo policlonal y el anticuerpo monoclonal mencionados anteriormente.

(4-2) Fragmento de anticuerpo

El fragmento de anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención está incluido en el anticuerpo de la presente 20 invención. En la presente memoria, el fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene actividad de unión a hDlk-1 y actividad antitumoral in vivo, como en el caso del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención (que incluye anticuerpos humanizados y similares, distintos de los anticuerpos de ratón).

El fragmento de anticuerpo significa una región de una porción de un anticuerpo policlonal anti-hDlk-1 o anticuerpo 25 monoclonal anti-Dlk-1 (concretamente, un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención). Los ejemplos de un fragmento de tal anticuerpo incluyen péptidos que comprenden, como al menos una porción del mismo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv (fragmento variable de anticuerpo), un anticuerpo de cadena sencilla (una cadena H, una cadena L, una región V de la cadena H y una región V de la cadena L, etc.), scFv, diacuerpo (dímero de scFv), dsFv (una región V estabilizada por disulfuro) y una región determinante de la 30 complementariedad (CDR).

El Fab es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión al antígeno, que se forma uniendo aproximadamente una mitad de la porción N-terminal de la cadena H y toda la cadena L a través de un enlace disulfuro, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de moléculas de 35 anticuerpo con una proteasa, la papaína. Además, también es posible producir tales Fab insertando ADN que codifica el Fab de un anticuerpo en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico e introduciendo a continuación el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.

40

El F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 100.000 que tiene actividad de unión al antígeno, cuyo tamaño es ligeramente mayor que el Fab que se une a Fab a través de un enlace disulfuro en la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos por tratamiento de moléculas de anticuerpo con una proteasa, la pepsina. Además, también es posible producir tales F(ab')2 mediante enlace tioéter o disulfuro de Fab, como se describe más adelante. 45

El Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 que tiene actividad de unión al antígeno, que se forma escindiendo el enlace disulfuro en la región bisagra de F(ab')2 mencionado anteriormente. Además, también es posible producir tal Fab' insertando el ADN que codifica el fragmento Fab' de un anticuerpo en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico y a continuación 50 introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.

El scFv es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión al antígeno, que es un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH formado por la unión de una sola región V de la cadena H (VH) a una sola región V de la cadena L (VL) utilizando un conector peptídico adecuado (P). Tal scFv puede producirse obteniendo ADNc que codifica la VH y la 55 VL de un anticuerpo, construyendo el ADN que codifica el scFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.

El diacuerpo es un fragmento de anticuerpo formado por la dimerización de scFv, que tiene actividades de unión al 60 antígeno divalentes. Tales actividades de unión al antígeno divalentes pueden ser idénticas entre sí, o también pueden ser diferentes entre sí. Tal diacuerpo puede producirse obteniendo ADNc que codifica la VH y la VL de un anticuerpo, construyendo ADN que codifica scFv de tal manera que la longitud de la secuencia de aminoácidos de P sea de 8 restos o menos, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el 65 ADN se exprese en los mismos.

El dsFv es un fragmento de anticuerpo formado mediante la unión de polipéptidos, en el que un resto de aminoácido en cada una de VH y VL ha sido sustituido por un resto de cisteína entre sí a través de un enlace disulfuro entre los restos de cisteína. El resto de aminoácido que se va a sustituir por restos de cisteína se puede seleccionar basándose en la estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo de acuerdo con el método de Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994). Tal dsFv puede producirse obteniendo ADNc que codifica VH y VL de un 5 anticuerpo, construyendo ADN que codifica dsFv, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector en un procariota o un eucariota con el fin de permitir que el ADN se exprese en los mismos.

Un péptido que comprende las CDR comprende al menos una región de las CDR (CDR 1 a 3) de VH o VL. Múltiples 10 péptidos que comprenden las CDR se pueden unir entre sí, directamente o a través de un conector peptídico adecuado. Tal péptido que comprende las CDR se puede producir construyendo ADN que codifica la VH y VL de un anticuerpo, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas y a continuación introduciendo el vector de expresión en un procariota o un eucariota, así como permitiendo que el ADN se exprese en los mismos. Por otra parte, tal péptido que comprende las CDR también se puede producir 15 mediante métodos de síntesis química tales como un método Fmoc (un método con fluorenilmetiloxicarbonilo) y un método tBoc (un método con t-butiloxicarbonilo).

El fragmento de anticuerpo de la presente invención, tal cual, puede ser un fragmento de anticuerpo, que comprende una parte o toda la región Fc del anticuerpo en el que la fucosa no se une a N-acetilglucosamina en el extremo 20 reductor de una cadena de azúcar unida mediante N-glicósido. Por otro lado, el fragmento de anticuerpo de la presente invención también puede ser una proteína de fusión, en la que el fragmento de anticuerpo antes mencionado se fusiona con una parte o toda la región Fc del anticuerpo en el que fucosa no se une a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de una cadena de azúcar conectada mediante N-glicósido. Tal fragmento de anticuerpo es capaz de mejorar significativamente la actividad de ADCC y por lo tanto es preferible. 25

El tipo del fragmento de anticuerpo de la presente invención no está limitado. Los ejemplos específicos del presente fragmento de anticuerpo incluyen fragmentos de anticuerpos que comprenden, como al menos una porción de los mismos, las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NOS: 16 a 18 (CDR 1 a 3 de la región V de la cadena H). Específicamente, ejemplos de tales fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de anticuerpos que 30 comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos (la región V de la cadena H) que se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO: 13 (en particular, SEQ ID NO: 15), SEQ ID NO: 33 (en particular, SEQ ID NO: 35), SEQ ID NO: 38 (en particular, SEQ ID NO: 40), SEQ ID NO: 67 (en particular, SEQ ID NO: 69), SEQ ID NO: 71 (en particular, SEQ ID NO: 73), SEQ ID NO: 75 (en particular, SEQ ID NO: 77), SEQ ID NO: 79 (en particular, SEQ ID NO: 81), SEQ ID NO: 83 (en particular, SEQ ID NO: 85) y SEQ ID NO: 87 (en particular, SEQ ID NO: 89). Además, otros ejemplos 35 específicos de los presentes fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpos que comprenden, como al menos una porción de los mismos, la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NOS: 23 a 25 (CDR 1 a 3 de la región V de la cadena L). Un ejemplo específico es un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos (la región V de la cadena L) que se muestra en la SEQ ID NO: 20 (en particular, SEQ ID NO: 22) o SEQ ID NO: 43 (en particular, SEQ ID NO: 45) 40

En lo sucesivo, en las descripciones de la presente memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos anteriormente mencionados están también incluidos en el anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención.

3. Preparación del complejo de anticuerpo-agente 45

Como producto inmunoconjugado preparado utilizando el anticuerpo anti-hDlk-1 anteriormente mencionado de la presente invención, se puede proporcionar un complejo de anticuerpo-agente, que comprende el anticuerpo anteriormente mencionado y un compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células. Hay que señalar que un complejo formado preparando previamente cada una de la molécula de anticuerpo mencionada 50 anteriormente y el compuesto mencionado anteriormente que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células, por separado y combinándolos a continuación se denomina generalmente producto inmunoconjugado. Por otro lado, un complejo obtenido ligando una toxina proteica utilizada como tal compuesto que tiene actividad antitumoral y/o actividad destructora de células a un gen de anticuerpo en un gen de acuerdo con una técnica de recombinación genética, de manera que le permita expresarse como una sola proteína (una proteína de fusión), se 55 denomina generalmente inmunotoxina.

Los ejemplos de un compuesto que tiene actividad antitumoral incluyen doxorrubicina, caliqueamicina, mitomicina C y auristatina E.

60

Los ejemplos de un compuesto que tiene la actividad destructora de células incluyen saporina, lisina, exotoxina de Pseudomonas y toxina de la difteria. De éstos, se utilizan preferiblemente saporina y exotoxina de pseudomonas.

Un método para producir un complejo de anticuerpo-agente no está limitado. Por ejemplo, se aplica un método de acoplamiento de un anticuerpo con un agente a través de un enlace disulfuro o un enlace hidrazona. 65

El anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención anteriormente mencionado es excelente en términos de actividad de internalización en células tumorales diana que expresan hDlk-1. Por lo tanto, combinando previamente un compuesto que tiene actividad antitumoral y actividad destructora de células con el anticuerpo anti-hDlk-1, tal compuesto puede actuar directamente y muy selectivamente sobre las células tumorales. El complejo de anticuerpo-agente de la presente invención es extremadamente excelente en términos de capacidad de liberación del agente a 5 las células tumorales diana.

La actividad de internalización en las células se puede evaluar marcando fluorescentemente un anticuerpo con rodamina o similar y a continuación observar el comportamiento migratorio y la localización del anticuerpo utilizando un microscopio de fluorescencia o similar. 10

Por otra parte, en la presente invención, además del complejo de anticuerpo-agente antes mencionado, también se puede proporcionar un complejo de fragmento de anticuerpo-agente, en el cual el fragmento de anticuerpo antes mencionado se utiliza en lugar de un anticuerpo. Con respecto a los detalles de tal complejo de fragmento de anticuerpo-agente, se pueden aplicar, según sea apropiado, las descripciones del complejo anticuerpo-agente 15 anteriormente mencionado.

En lo sucesivo, en las descripciones de la presente memoria descriptiva, tal complejo de fragmento de anticuerpo-agente está también incluido en el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención.

20

4. Composición farmacéutica

El anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención son útiles como principios activos contenidos en una composición farmacéutica.

25

La composición farmacéutica es útil como una composición farmacéutica para tratar y/o diagnosticar un tumor. Es decir, el anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo anticuerpo-agente de la presente invención son útiles como principios activos contenidos en un agente terapéutico tumoral o un agente de diagnóstico tumoral. En la presente memoria, el tratamiento de un tumor incluye la inhibición de la angiogénesis tumoral (en lo sucesivo, lo mismo se aplica a lo largo de la presente memoria). 30

El anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo anticuerpo-agente de la presente invención son preferibles porque no provocan efectos secundarios tales como la reducción de peso cuando se usan en el tratamiento de un tumor.

Además, la presente composición farmacéutica es útil como una composición farmacéutica utilizada en la inducción 35 de apoptosis en células tumorales. Es decir, el anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo anticuerpo-agente de la presente invención son útiles como principios activos contenidos en un agente para inducir apoptosis en células tumorales.

Es preferible proporcionar la composición farmacéutica de la presente invención en forma de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención 40 como principio o principios activos y que comprende adicionalmente un vehículo farmacológicamente aceptable.

Las enfermedades diana (tumores), a los que se aplica la composición farmacéutica de la presente invención, incluyen: los tumores humanos conocidos anteriormente mencionados, en los cuales ya se ha confirmado la expresión de hDlk (específicamente cánceres sólidos tales como tumor neuroendocrino, neuroblastoma, glioma, 45 neurofibromatosis tipo 1, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de hígado, cáncer de riñón y de ovario, y neoplasias sanguíneas, tales como el síndrome mielodisplásico y la leucemia mielocítica aguda); y cáncer de colon humano, cáncer de mama humano y cáncer de páncreas humano, en los cuales la expresión de hDlk-1 fue confirmada por primera vez por los inventores de la presente invención. Entre otros, son particularmente preferibles uno o dos o más tipos seleccionados de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de 50 páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neurocitoma humano. Dicha enfermedad diana puede ser una única enfermedad, o pueden desarrollarse dos o más enfermedades en combinación.

Los ejemplos del “vehículo farmacológicamente aceptable” incluyen un excipiente, un diluyente, un expansor, un disgregante, un estabilizador, un conservante, un tampón, un emulsionante, un agente aromático, un agente 55 colorante, un edulcorante, un espesante, un corrector, un solubilizante y otros aditivos. Utilizando uno o más tipos de tales vehículos, se puede preparar una composición farmacéutica en forma de un inyectable, un agente líquido, una cápsula, una suspensión, una emulsión, un jarabe, etc. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía oral o parenteral. Otra forma para la administración parenteral es un inyectable que comprende uno o más principios activos, que se prepara por medio de un método habitual. Tal inyectable se puede producir disolviendo o 60 suspendiendo el presente anticuerpo en un vehículo farmacológicamente aceptable, tal como una solución salina normal o agua destilada comercializada utilizada para el inyectable.

En particular, cuando un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención (particularmente, un fragmento de anticuerpo con un bajo peso molecular) se administra a un organismo vivo, se 65 puede utilizar un sistema de dispersión coloidal además de los componentes anteriormente mencionados. Se prevé que tal sistema de dispersión coloidal tenga un efecto de mejora de la estabilidad de un compuesto (un fragmento de anticuerpo) en un organismo vivo o un efecto de transporte eficaz de tal compuesto a un órgano, tejido, o célula específicos. El tipo de tal sistema de dispersión coloidal no está limitado, con tal de que se utilice comúnmente. Un ejemplo de tal sistema de dispersión coloidal es un sistema de dispersión que comprende, como base, polietilenglicol, un complejo macromolecular, un añadido macromolecular, una nanocápsula, microesferas, perlas y 5 lípidos incluyendo un emulsionante de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los ejemplos preferidos de un sistema de dispersión coloidal incluyen múltiples liposomas y las vesículas de membrana artificial, que tienen un efecto de transporte eficaz de tal compuesto a un órgano, tejido, o célula específicos (Mannino et al., Biotechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23, 119; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698). 10

La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención difiere dependiendo de la edad, el sexo, el peso corporal y los síntomas del paciente, los efectos terapéuticos, el método de administración, el tiempo de tratamiento, los tipos de anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo de anticuerpo-agente de la presente invención contenido en la composición farmacéutica, etc. En general, la presente composición farmacéutica se puede administrar en el 15 intervalo entre 600 μg y 6.000 mg por adulto por administración. Sin embargo, la dosis no está limitada al intervalo anteriormente mencionado.

En un caso en el que la composición farmacéutica se administra en forma de un inyectable, por ejemplo, se puede administrar a una dosis de 10 µg a 100 mg, o de 30 μg a 100 mg, o de 50 μg a 100 mg, o de 100 μg a 100 mg, por 20 administración y por peso corporal de un paciente humano, o puede administrarse a una dosis en un intervalo en el cual los límites inferiores de las dosis mencionadas anteriormente se combinan según corresponda (p. ej. de 30 μg a 200 μg o de 100 μg a 500 μg), una vez o dividida en varias administraciones, como una dosis diaria media. Los ejemplos de la forma de dosificación incluyen inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal. De éstas, es preferible la inyección intravenosa. Además, tal 25 inyectable se puede preparar en forma de un diluyente no acuoso (p. ej., polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, alcoholes tales como etanol, etc.), una suspensión, o una emulsión. Tal inyectable se puede esterilizar mediante esterilización mecánica utilizando un filtro, la mezcla de un microbicida, etc. El inyectable se puede producir en forma de un inyectable que se prepara antes de su uso. Es decir, una composición sólida esterilizada se prepara mediante un método de liofilización o similares, y la composición se disuelve a continuación 30 en agua destilada esterilizada utilizada para inyectables u otros disolventes antes de su uso, de modo que se puede utilizar a continuación.

La presente invención proporciona el uso del anticuerpo anti-hDlk-1 y/o complejo de anticuerpo-agente anteriormente mencionados de la presente invención en la producción de un fármaco (un agente) para el tratamiento 35 de un tumor, el diagnóstico de un tumor y/o la inducción de apoptosis en las células tumorales. Además, la presente invención proporciona el anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo de anticuerpo-agente anteriormente mencionados de la presente invención, los cuales se usan para el tratamiento de un tumor, el diagnóstico de un tumor y/o la inducción de apoptosis en células tumorales.

40

Además, la presente invención proporciona un método para tratar un tumor, un método para diagnosticar un tumor y/o un método para inducir apoptosis en células tumorales, que comprende usar (es decir, administrar a pacientes) el anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo anticuerpo-agente anteriormente mencionados de la presente invención. Además, la presente invención también proporciona el uso del anticuerpo anti-hDlk-1 y/o el complejo de anticuerpo-agente anteriormente mencionados de la presente invención para el tratamiento de un tumor, el diagnóstico de un 45 tumor y/o la inducción de apoptosis en células tumorales.

5. Método para la detección de tumores

El método para la detección de un tumor de la presente invención (que puede ser un método para diagnosticar un 50 tumor) se caracteriza por que comprende permitir que el mencionado anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención reaccione con una muestra obtenida de un organismo vivo (denominada en lo sucesivo muestra biológica) y detectar una señal del anticuerpo que ha reaccionado.

Como se describió anteriormente, puesto que se ha confirmado que hDlk-1 se expresa específicamente en diversos 55 tipos de células tumorales, se puede utilizar hDlk-1 y en particular, hDlk-1 libre (una porción de la región extracelular de hDlk-1) como marcador para diversos tipos de tumores. En particular, tal hDlk-1 se puede utilizar preferiblemente como marcador para el cáncer de colon humano, el cáncer de mama humano y el cáncer de hígado humano.

Por lo tanto, se permite que el anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención reaccione con una muestra biológica y 60 a continuación se detecta una señal del anticuerpo que ha reaccionado, con el fin de detectar un tumor. La señal de anticuerpo obtenida se puede utilizar como un indicador de la cantidad de un antígeno en la muestra biológica (es decir, la cantidad de hDlk-1 o la cantidad de hDlk-1 libre). En la detección del tumor utilizando el anticuerpo de la presente invención, primero, se permite que una muestra biológica recogida como analito de un sujeto, tal como un corte de un tejido o sangre que se utiliza como diana de ensayo, se una al anticuerpo de la presente invención por 65 medio de una reacción antígeno-anticuerpo. Con posterioridad, basándose en los resultados de la medición de la cantidad de anticuerpo unido, se mide la cantidad de un antígeno de interés contenido en la muestra biológica. Esta medición puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos de inmunoensayo conocidos. Por ejemplo, se pueden utilizar un método de inmunoprecipitación, un método de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, inmunonefelometría, un método de transferencia Western, citometría de flujo y similares. En el radioinmunoensayo, se utiliza un anticuerpo marcado y por lo tanto una señal de anticuerpo se expresa como la cantidad de anticuerpo 5 marcado que se detecta directamente. Por otra parte, se puede utilizar un anticuerpo cuya concentración o título de anticuerpos sea conocida como una solución patrón y de este modo una señal del anticuerpo diana se puede expresar como un valor relativo. Es decir, tanto la solución patrón como el analito se pueden medir utilizando un dispositivo de medición y una señal de anticuerpo en una muestra biológica se puede expresar como un valor relativo al valor de la solución patrón que se utiliza como criterio. Los ejemplos de tales radioinmunoensayos 10 incluyen el método ELISA, el método EI, el método RIA, el inmunoensayo de fluorescencia (FIA) y el inmunoensayo de luminiscencia. De éstos, el método ELISA es particularmente preferible puesto que es simple y muy sensible.

En la presente invención, el estado de tumor se puede evaluar o diagnosticar, utilizando el resultado de detección obtenido por medio del método de detección antes mencionado como indicador. Por ejemplo, cuando el resultado de 15 la detección excede de un valor estándar predeterminado, el estado de tumor se define como tumor positivo y cuando el resultado de la detección es menor que el valor estándar predeterminado, éste se define como tumor negativo. En el caso del tumor positivo, se determina que se podría haber desarrollado un cierto tipo de tumor y por lo tanto se puede evaluar el estado del tumor. La expresión “estado del tumor” se utiliza en la presente memoria para significar la presencia o ausencia del desarrollo de tumor, o el grado de progresión del mismo. Por lo tanto, los 20 ejemplos específicos del estado del tumor incluyen la presencia o ausencia de desarrollo del tumor, el grado de progresión del mismo, el grado de malignidad, la presencia o ausencia de metástasis y la presencia o ausencia de recurrencia.

En la evaluación anteriormente mencionada, en cuanto al estado del tumor que se va a evaluar, solo se puede 25 seleccionar un estado a partir de los ejemplos mencionados anteriormente, o se pueden combinar y seleccionar múltiples ejemplos. La presencia o ausencia del tumor se pueden evaluar mediante la determinación de si el tumor se ha desarrollado o no, con referencia al valor estándar predeterminado utilizado como límite, basándose en el resultado de detección obtenido. El grado de malignidad se utiliza como un indicador que indica el grado de progreso del cáncer. Basándose en el resultado de la detección, el tumor diana se puede clasificar en un cierto estadio de la 30 enfermedad y se puede evaluar. Por otra parte, el cáncer temprano y el cáncer avanzado se pueden distinguir entre sí y en ese caso se pueden evaluar. Por ejemplo, también es posible determinar el tumor diana como cáncer temprano o cáncer avanzado, utilizando el resultado de la detección como indicador. La metástasis tumoral se puede evaluar determinando si ha aparecido neoplasia o no en un sitio aparte de la posición de la lesión inicial, utilizando el resultado de la detección como indicador. La recurrencia se puede evaluar mediante la determinación 35 de si el resultado de la detección ha superado o no el valor estándar predeterminado de nuevo después de la etapa de intervalo o de remisión.

6. Kit para la detección o el diagnóstico de tumores y kit para el tratamiento de tumores o inducción de apoptosis en las células tumorales 40

El anticuerpo anti-hDlk-1 de la presente invención se puede proporcionar en forma de un kit para detectar un tumor o un kit para o diagnosticar un tumor. Además, el anticuerpo anti-hDlk-1 y el complejo anticuerpo-fármaco de la presente invención se puede proporcionar en la forma de un kit para el tratamiento de un tumor o un kit para la inducción de apoptosis en células tumorales. 45

El kit de la presente invención comprende una sustancia marcadora, un reactivo en fase sólida sobre el cual se ha inmovilizado el anticuerpo o el anticuerpo marcado, etc., así como el anticuerpo antes mencionado. Una sustancia marcadora que marca el anticuerpo significa una sustancia marcada con una enzima, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, etc. El kit de la presente invención también puede comprender otros 50 reactivos utilizados para llevar a cabo la detección de la presente invención, además de los elementos integrantes mencionados anteriormente. Por ejemplo, cuando tal sustancia marcadora es una sustancia de marcado enzimático, el kit de la presente invención puede comprender un sustrato enzimático (un sustrato cromogénico, etc.), una solución disolvente del sustrato enzimático, una solución de parada de la reacción enzimática, un diluyente utilizado para analitos, etc. Además, el presente kit puede comprender adicionalmente diversos tipos de tampones, agua 55 esterilizada, diversos tipos de recipientes de cultivo de células, diversos tipos de reactores (un tubo Eppendorf, etc.), un agente de bloqueo (un componente del suero tal como albúmina de suero bovino (BSA), leche desnatada, o suero de cabra), un agente de lavado, un agente tensioactivo, varios tipos de placas, un antiséptico tal como azida de sodio, un manual de funcionamiento experimental (instrucciones), etc.

60

El kit de la presente invención se puede utilizar eficazmente para llevar a cabo el método de detección de un tumor, el método de tratamiento de un tumor y el método para la inducción de apoptosis en células tumorales de la presente invención anteriormente descrito, etc. Por lo tanto, el presente kit es extremadamente útil.

En lo sucesivo, la presente invención se describirá más específicamente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, 65 no se pretende que estos ejemplos limiten el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Clonación del gen del anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana de ratón (clon BA-1-3D) y determinación de las secuencias de la región variable

5

Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-Dlk-1 humana de ratón, clon BA-1-3D (IgG2a de ratón) que exhibía una actividad inhibidora del crecimiento tumoral significativa en el documento WO 2008/056833 (como se describe anteriormente, Documento de Patente 4) y en el documento WO 2009/116670 (como se describió anteriormente, Documento de Patente 5) (en lo sucesivo denominado “ratón BA-1-3D”). Un hibridoma que genera el BA-1-3D de ratón se le denomina “Hibridoma de ratón-ratón BA-1-3D” y ha sido depositado en el Depositario del Organismo 10 Internacional de Patentes (IPOD), Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Tsukuba AIST Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japón, código postal: 305-8566) el 1 de febrero de 2011 (número de acceso: FERM BP-11337).

El hibridoma generador de BA-1-3D de ratón mencionado anteriormente se cultivó a 37 °C en un medio RPMI-1640 15 que contenía un 20 % de suero bovino fetal (FBS; HyClone), piruvato sódico 1 mM, penicilina 100 unidades/ml, 100 μg/ml de estreptomicina y 1 x Hybridoma Fusion and Cloning Supplement (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en un incubador con 7,5 % de CO2. El ARN total fue extraído de 107 hibridomas usando un reactivo TRIzol (Invitrogen), y después, usando cebadores oligo dT, se sintetizó el ADNc a partir del ARN total empleando el kit de amplificación de ADNc SMARTer RACE (Clontech, Mountain View, CA) de acuerdo con el método incluido en el kit. Utilizando el 20 ADNc así sintetizado como molde, se clonaron los genes que codifican la región variable de la cadena H (VH) y la región variable de la cadena L (VL) del BA-1-3D de ratón mediante un método de PCR que emplea ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs, Beverly, MA). En el método de PCR, se utilizó como cebador 5'

Universal Primer A Mix (UPM) o Nested Universal Primer A (NUP) incluido con el kit. Por otro lado, como cebador 3' para la amplificación de VH, se utilizó un cebador que tiene una secuencia complementaria a la región constante de 25 γ2a de ratón, y como cebador 3' para la amplificación de VL, se utilizó un cebador que tiene una secuencia complementaria a la de la región constante κ de ratón.

Cebador 5' (Cebador F; Universal Primer A Mix (UPM)):

30

Largo:

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (SEQ ID NO: 3)

Corto: 35

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID NO: 4)

Cebador 5' (Cebador F; Nested Universal Primer A (NUP)):

40

5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' (SEQ ID NO: 5)

Cebador 3' (cebador R):

VH: 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3' (SEQ ID NO: 6) 45

VL: 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 7)

La reacción de PCR se llevó a cabo con la siguiente composición de una solución de reacción en las siguientes condiciones de reacción usando cada uno de los cebadores mencionados anteriormente.

50

<Composición de la solución de reacción>

ADNc molde

2,5 µl

5x Tampón PrimeSTAR (Mg2+ plus):

10 µl

dNTP 2,5 mM:

4 µl

Phusion ADN polimerasa (2,0 U/µl):

0,5 µl

10x UPM o NUP:

5 µl

Cebador R (10 µM):

1 µl

Agua esterilizada

27 µl

Total

50 µl

<Condiciones de reacción>

55

Después de completar la reacción a 94 °C (10 seg), un ciclo que consiste en “desnaturalización/disociación térmica: 98 °C (10 seg) → Hibridación: 60 °C (5 seg) → Síntesis/elongación: 72 °C (60 segundos)” se repitió 30 veces (un total de 30 ciclos). Finalmente, la reacción se llevó a cabo a 72 °C (3 min).

Los ADNc sintetizados de VH y VL (BA-1-3D VH y BA-1-3D VL) del BA-1-3D de ratón se subclonaron en un vector pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen), y se determinaron las secuencias de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de clones de VH y clones de VL se decodificaron, y se identificaron las secuencias de nucleótidos típicas de las regiones variables de la cadena H y la cadena L de ratón. La Figura 1 y la Figura 2 muestran las secuencias de nucleótidos de ADNc consenso de BA-1-3D VH y BA-1-3D VL y sus secuencias de aminoácidos 5 putativas.

Ejemplo 2

Construcción del vector de expresión quimérico ratón/humano BA-1-3D IgG1/κ 10

Se generó un gen que codifica BA-1-3D VH (gen BA-1-3D VH) como un exón, al que se añadió una señal de un donante de corte y empalme derivada de la secuencia de células JH4 de la línea germinal de ratón y a cuyos ambos extremos se añadieron sitios de enzimas de restricción. Específicamente, el gen se sintetizó de acuerdo con un método de PCR usando el ADNc del gen VH BA-1-3D como molde. Durante la reacción de PCR, se utilizó un 15 cebador 5', al que se había añadido un sitio SpeI como sitio de enzima de restricción para ser insertado en un vector de expresión de célula animal, y un cebador 3', al que se había añadido un sitio HindIII como sitio de enzima de restricción.

Cebador 5' (cebador F): 20

5'-GCAACTAGTACCACCATGGGTTGGAGCTGTATC-3' (SEQ ID NO: 8) (Subrayado: sitio SpeI)

Cebador 3' (cebador R):

25

5'-GGGAAGCTTGAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3' (SEQ ID NO: 9) (Subrayado: sitio HindIII)

La reacción de PCR se llevó a cabo con la siguiente composición de una solución de reacción en las siguientes condiciones de reacción, usando cada uno de los cebadores mencionados anteriormente (SEQ ID NOS: 8 y 9). 30

<Composición de la solución de reacción>

ADNc molde

1,0 µl

5x Tampón PrimeSTAR (Mg2+ plus):

10 µl

dNTP 2,5 mM:

4 µl

Phusion ADN polimerasa (2,0 U/µl):

0,5 µl

Cebador F (10 µM):

3 µl

Cebador R (10 µM):

1,0 µl

Agua esterilizada

30,5 µl

Total

50 µl

<Condiciones de reacción> 35

Un ciclo que consiste en “Desnaturalización/disociación térmica: 98 °C (10 segundos) → Hibridación: 57 °C (10 segundos) → Síntesis/elongación: 72 °C (60 segundos)” se repitió 35 veces (un total de 35 ciclos).

Asimismo, se generó un gen que codifica BA-1-3D VL (gen BA-1-3D VL) como un exón, al que se añadió una señal 40 de un donante de corte y empalme derivada de la secuencia de células germinales de ratón Jκ5 y a cuyos extremos se añadieron sitios de la enzima de restricción. Específicamente, el gen se sintetizó de acuerdo con un método de PCR usando el ADNc del gen BA-1-3D VL como molde. Durante la reacción de PCR, se añadió un cebador 5', al que se había añadido un sitio NheI como un sitio de enzima de restricción para insertarlo en un vector de expresión de célula animal, y un cebador 3', al que se había añadido un sitio EcoRI como sitio de enzima de restricción. 45

Cebador 5' (cebador F):

5'-GCTGCTAGCACCACCATGGAATCACAGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 10) (Subrayado: sitio NheI)

50

Cebador 3' (cebador R):

5'-GCAGAATTCAGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC-3' (SEQ ID NO: 11) (Subrayado: sitio EcoRI)

55

La reacción de PCR se llevó a cabo con la siguiente composición de una solución de reacción en las siguientes condiciones de reacción, usando cada uno de los cebadores mencionados anteriormente (SEQ ID NOS: 10 y 11).

<Composición de la solución de reacción>

ADNc molde

1,0 µl

5x Tampón PrimeSTAR (Mg2+ plus):

10 µl

dNTP 2,5 mM:

4 µl

Phusion ADN polimerasa (2,0 U/µl):

0,5 µl

Cebador F (10 µM):

3 µl

Cebador R (10 µM):

1,0 µl

Agua esterilizada

30,5 µl

Total

50 µl

<Condiciones de reacción>

5

Un ciclo que consiste en “Desnaturalización/disociación térmica: 98 °C (10 segundos) → Hibridación: 57 °C (10 segundos) → Síntesis/elongación: 72 °C (60 segundos)” se repitió 35 veces (un total de 35 ciclos).

Los genes BA-1-3D VH y BA-1-3D VL así generados que tienen funciones como exones se muestran en la Figura 3 y en la Figura 4, respectivamente. 10

Los genes BA-1-3D VH y BA-1-3D VL generados se subclonaron cada uno en un vector pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen), y luego se determinaron las secuencias de nucleótidos de los mismos. Posteriormente, utilizando un sitio SpeI/HindIII para la inserción del gen BA-1-3D VH y también utilizando un sitio NheI/EcoRI para la inserción del gen BA-1-3D VL, estos genes se insertaron cada uno en un vector de expresión de célula animal. (Figura 5) que 15 tiene las regiones constantes de la cadena γ1 y la cadena κ humanas, para generar así un vector de expresión quimérico ratón-humano BA-1-3D IgG1/κ (ChBA-1-3D) (pChBA-1-3D).

Ejemplo 3

20

Generación de genes BA-1-3D VH y VL humanizados

El diseño de humanización de BA-1-3D VH y BA-1-3D VL se llevó a cabo de la siguiente manera según el método de Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989). Primero, se llevó a cabo mediante ordenador el modelado molecular de las estructuras tridimensionales de las regiones variables del anticuerpo BA-1-3D, y luego se 25 identificaron los aminoácidos en una región marco relevante para la formación de estructuras CDR. Al mismo tiempo, se realizó una búsqueda de homología entre las regiones variables de BA-1-3D y las secuencias de la región variable de los genes del anticuerpo humano, para seleccionar el ADNc (U00503 VH) con el número de acceso GenBank: U00503 (Huang y Stollar, J. Immunol. 151: 5290, 1993) como un aceptor para proporcionar una región marco (FR) necesaria para la humanización de BA-1-3D VH. Del mismo modo, se seleccionó el ADNc (Z46622 VL) 30 con el número de acceso de GenBank: Z46622 (Giachino et al., J. Exp. Medicina. 181: 1245, 1995) como un aceptor para proporcionar una región marco (FR) necesaria para la humanización de BA-1-3D VL.

Para la humanización de BA-1-3D VH, la secuencia de CDR de BA-1-3D VH se trasplantó primero en la posición correspondiente en U00503 VH como un aceptor. Posteriormente, como resultado del análisis de estructuras 35 tridimensionales mediante modelado por ordenador realizado en las regiones variables BA-1-3D de ratón, con respecto a los restos de aminoácidos en la región FR (isoleucina (I) en la posición 48, lisina (K) en la posición 66, alanina (A) en la posición 67, y valina (V) en la posición 71), que son adyacentes a las CDR de BA-1-3D VH y se supone que juegan un papel importante en el mantenimiento de las estructuras, se conservaron las de BA-1-3D VH y otras regiones FR se sustituyeron con las de las secuencias aceptoras humanas. Los números de posición de los 40 restos de aminoácidos en VH se usaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH N.º 91-3242, U. S. Department of Health and Human Services, 1991). El BA-1-3D VH humanizado así generado se denominó HuBA-1-3D VH1.

La lisina (K) en la posición 66 en BA-1-3D VH es adyacente a las secuencias de CDR. Como resultado del análisis 45 más detallado de las regiones variables BA-1-3D mediante modelado por ordenador, se sugirió que la lisina (K) en la posición 66 en HuBA-1-3D VH1 podría sustituirse con arginina (R) en una posición correspondiente a U00503 VH sin afectar a la afinidad por el antígeno. Por lo tanto, con el fin de reducir la inmunogenicidad potencial, BA-1-3D VH humanizado, en el que la lisina (K) en la posición 66 de HuBA-1-3D VH1 fue sustituida con arginina (R), también se produjo. El BA-1-3D VH humanizado así sustituido se denominó HuBA-1-3D VH2. 50

La alineación de las secuencias de aminoácidos de BA-1-3D VH, HuBA-1-3D VH1, HuBA-1-3D VH2 y U00503 VH se muestra en la Figura 6.

Igualmente, para la humanización de BA-1-3D VL la secuencia de CDR de BA-1-3D VL se trasplantó a la posición 55 correspondiente en Z46222 VL como un aceptor. Posteriormente, como resultado del análisis de estructuras tridimensionales mediante modelado por ordenador realizado en regiones variables BA-1-3D de ratón, con respecto a un resto de aminoácido en la región FR (valina (V) en la posición 48), que es adyacente a las CDR de BA-1-3D VL y se supone que juega un papel importante en el mantenimiento de las estructuras, se conservó la de BA-1-3D VL y se sustituyeron otras regiones FR con las de las secuencias aceptoras humanas. Los números de posición de los restos de aminoácidos en VL se usaron de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Quinta edición, Publicación NIH N.º 91-3242, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU. 1991). El BA-1-3D VL humanizado así producido se denominó HuBA-1-3D VL. 5

La alineación de las secuencias de aminoácidos de BA-1-3D VL, HuBA-1-3D VL y Z46622 VL se muestra en la Figura 7.

Los genes que codifican HuBA-1-3D VH1 y HuBA-1-3D VH2 se generaron por síntesis génica (GenScript USA, 10 Piscataway, NJ) como exones, cada uno de los cuales comprendía un péptido señal de BA-1-3D VH de ratón y una señal de donante de corte y empalme derivada de una secuencia de una línea germinal humana JH3, a cuyos extremos se añadieron los sitios de enzima de restricción adecuados para la inserción de un vector de expresión de célula animal (SpeI añadido en el lado 5' terminal y HindIII añadido en el lado 3' terminal). Las secuencias génicas del gen HuBA-1-3D VH1 así generado y el gen HuBA-1-3D VH2, y las secuencias de aminoácidos de HuBA-1-3D 15 VH1 y HuBA-1-3D VH2, se muestran en la Figura 8 y en la Figura 9, respectivamente.

Asimismo, se generó un gen que codifica HuBA-1-3D VL por síntesis génica (GenScript USA, Piscataway, NJ) como un exón, que comprendía un péptido señal de BA-1-3D VL de ratón y una señal de donante de corte y empalme derivada de una secuencia de una línea germinal humana Jκ2 y a cuyos extremos se añadieron sitios de enzimas de 20 restricción adecuados para la inserción de un vector de expresión de célula animal (Nhel añadido al lado 5' terminal y EcoRI añadido al lado 3' terminal). La secuencia génica del gen HuBA-1-3D VL así generado y la secuencia de aminoácidos de HuBA-1-3D VL se muestran en la Figura 10.

Posteriormente, utilizando un sitio SpeI/HindIII para la inserción de los genes HuBA-1-3D VH1 y VH2, y también 25 utilizando un sitio NheI/EcoRI para la inserción del gen HuBA-1-3D VL, estos sitios se insertaron cada uno en un animal vector de expresión de célula animal (Figura 5) que tiene las regiones constantes de la cadena γ1 humana y la cadena κ. Específicamente, una combinación del gen HuBA-1-3D VH1 con el gen HuBA-1-3D VL y una combinación del gen HuBA-1-3D VH2 con el gen HuBA-1-3D VL se insertaron cada uno en el vector de expresión antes mencionado. Por lo tanto, se generaron un vector de expresión (pHuBA-1-3D-1) para expresar un anticuerpo 30 humanizado BA-1-3D IgG1/x (HuBA-1-3D-1) constituido por HuBA-1-3D VH1 y HuBA-1-3D VL, y un vector de expresión (pHuBA-1-3D-2) para expresar un anticuerpo humanizado BA-1-3D IgG1/κ (HuBA-1-3D-2) constituido por HuBA-1-3D VH2 y HuBA-1- 3D VL, fueron generados.

Ejemplo 4 35

Generación de líneas celulares NSO que producen de manera estable anticuerpos BA-1-3D quiméricos de ratón-humano (ChBA-1-3D) y anticuerpos BA-1-3D humanizados (HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2)

Una línea de células de mieloma de ratón NS0 (Colección Europea de Cultivos de Células Animales, Salisbury, 40 Wiltshire, RU) se cultivó a 37 °C en un medio DME que contenía 10 % de suero bovino fetal en un incubador con 7,5 % de CO2. Con el fin de generar líneas celulares capaces de producir de forma estable ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2, se transfectaron 20 μg de cada uno de los vectores de expresión génica del anticuerpo (pChBA-1-3D, pHuBA-1-3D-1 y pHuBA-1-3D-2) (previamente linealizado con una enzima de restricción FspI) en células NS0 (aproximadamente 107 células) por electroporación de acuerdo con el método de Bebbington et al. (Bio/Technology 45 10: 169-175, 1992). Cuarenta y ocho horas después, el medio se intercambió con un medio selectivo (un medio DME que contenía FBS al 10 %, suplemento de medio HT (Sigma, St. Louis, MO), xantina 0,25 mg/ml y 1 μg/ml de ácido micofenólico) y después, aproximadamente diez días después, se analizó la presencia o ausencia de un anticuerpo producido en un sobrenadante de cultivo.

50

Se detectaron ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 en el sobrenadante del cultivo y se midieron mediante un método de ELISA tipo sándwich. Específicamente, se añadió un anticuerpo policlonal específico de la cadena Fcγ de IgG humana de cabra (Sigma) diluido con PBS a una concentración de 1/2.000 en una cantidad de 100 μl por pocillo a una placa de 96 pocillos, de modo que la placa de 96 pocillos se recubrió con el anticuerpo mencionado anteriormente a 4 °C durante la noche. Después de eso, la placa se lavó con un tampón de lavado (PBS + Tween 20 55 0,05 %). Posteriormente, se añadieron 300 μl de un tampón de bloqueo (PBS + leche desnatada 2 % + Tween 20 0,05 %) a cada pocillo, de modo que la placa se bloqueó con el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la placa se lavó con un tampón de lavado y luego se añadieron a cada pocillo 100 μl de un sobrenadante de cultivo diluido a una dilución de dilución adecuada con un tampón ELISA (PBS + leche desnatada 1 % + Tween 20 0,025 %). La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 60 hora. Se usó un anticuerpo anti-IgG1/k humano o humanizado como patrón. La mezcla de reacción se lavó con un tampón de lavado. A continuación, se añadieron 100 μl de un anticuerpo policlonal anti-cadena kappa humana de cabra conjugado con HRP (Southern Biotech) que se había diluido con un tampón ELISA a una concentración de 1/2.000 como anticuerpo de detección para cada pocillo, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, lo resultante se lavó con un tampón de lavado, y luego se añadieron 100 μl de un sustrato 65 ABTS a cada pocillo para realizar una reacción de color. Después, se añadieron 100 μl de ácido oxálico 2 % a cada pocillo para terminar la reacción. Seguidamente se midió la absorbancia a 405 nm.

NS0-ChBA-1-3D 2A4, NS0-HuBA-1-3D-1 2D2 y NS0-HuBA-1-3D-2 3F7 se establecieron como líneas celulares NS0 que producen de forma estable anticuerpos ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2, respectivamente, y estas líneas celulares se aclimataron a un medio sin suero (Hybridoma SFM (Invitrogen)). 5

Las secuencias de la cadena H y de la cadena L de anticuerpos producidos por las líneas celulares individuales NS0-ChBA-1-3D 2A4, NS0-HuBA-1-3D-1 2D2 y NS0-HuBA-1-3D-2 3F7 fueron confirmadas por secuenciación del ADNc. Específicamente, primero se extrajo el ARN total de cada línea celular usando un reactivo TRIzol (Invitrogen) y, a continuación, usando cebadores oligo dT, se sintetizó el ADNc a partir del ARN total empleando SuperScript III 10 First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo con el método incluido en el kit. Posteriormente, la región codificante de una cadena γ1 humana se amplificó por PCR usando CMV2 y JNT098 como cebadores, y la secuenciación se llevó a cabo usando CMV2, JNT082, JNT097 y JNT098 como cebadores. Asimismo, la región codificante de una cadena κ1 humana se amplificó por PCR usando CMV2 y JNT026 como cebadores, y la secuenciación se llevó a cabo usando CMV2 y JNT026 como cebadores. Debe observarse que los cebadores 15 mencionados anteriormente (CMV2, JNT026, JNT082, JNT097 y JNT098) consisten cada uno en las secuencias de nucleótidos mostradas en la Figura 11.

Como resultado, las secuencias de ADNc de la cadena H y de la cadena L de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 producidas por las líneas celulares NS0 antes mencionadas se apareaban completamente con las 20 correspondientes secuencias del ADNc de los vectores pChBA-1-3D, pHuBA-1-3D-1 y pHuBA-1-3D-2 (Figuras 12 a 16).

Ejemplo 5

25

Purificación de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2

Cada una de las líneas celulares NS0-ChBA-1-3D 2A4, NS0-HuBA-1-3D-1 2D2 y NS0-HuBA-1-3D-2 3F7 se cultivaron utilizando un frasco giratorio. Como medio, se usó Hybridoma-SFM (Invitrogen). En la etapa en la que se había alcanzado una densidad celular de aproximadamente 1 × 106 células/ml, se añadió 60 mg/ml de hidrolizado de 30 soja ultrafiltrado (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) (que se había disuelto en medio SFM4MAb (HyClone)) en una cantidad de 1/10 a las células. A continuación, el cultivo celular se llevó a cabo hasta que el porcentaje de células vivas fue del 50 % o menos. Se recuperó un sobrenadante de cultivo por centrifugación y filtración, y el sobrenadante celular recuperado se cargó en una columna de Proteína A-Sefarosa (HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ). La columna se lavó con PBS y luego se llevó a cabo la elución con Glicina-HCl 0,1 M 35 (pH 3,0). El anticuerpo se neutralizó con Tris-HCl 1M (pH 8,0), y el tampón se reemplazó entonces con PBS por diálisis. La concentración del anticuerpo se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm (1 mg/ml = 1,4 DO). Con respecto al rendimiento del anticuerpo por cultivo de 500 ml de cada línea celular NS0, se obtuvieron 6,1 mg de cada uno de ChBA-1-3D, 5,0 mg de HuBA-1-3D-1 y 3,8 mg de HuBA-1-3D-2.

40

Los anticuerpos purificados ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reducidas de acuerdo con un método ordinario. Como resultado, se confirmó una banda de cadena H de aproximadamente 50 kDa y una banda de cadena L de aproximadamente 25 kDa en todos los anticuerpos (Figura 17). Además, todos los anticuerpos tenían una pureza del 95 % o más después de la purificación.

45

Ejemplo 6

Caracterización de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2

La actividad de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a un antígeno (Dlk-1 humana) se analizó usando 50 tres tipos diferentes de formatos de ELISA.

Como primer formato de ELISA, se llevó a cabo un ELISA para analizar una reacción monovalente de antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2, que se habían diluido cada uno con PBS a una concentración de 1 μg/ml, se añadieron cada uno en una cantidad de 100 μl/pocillo a una placa de 96 pocillos, 55 seguido de un recubrimiento a 4 °C durante la noche. La placa se lavó con un tampón de lavado y luego se bloqueó con un tampón de bloqueo. A continuación, la placa se lavó de nuevo con un tampón de lavado. Se produjo una serie de diluciones mezclando una proteína recombinante de la región extracelular hDlk-1 (hDlk-1-His) (Nakamura and Tajima, US2009/0326205 A1) con un tampón ELISA por dilución doble a partir de una concentración de 1 μg/ml, y luego se añadió la proteína recombinante así diluida en una cantidad de 100 μl/pocillo a la placa, seguido de 60 reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, la placa se lavó con un tampón de lavado, y se añadió un anticuerpo anti-etiqueta His de ratón conjugado con HRP (Hypromatrix, Worcester, MA) que se había diluido con un tampón ELISA a una concentración de 1/2.000 en una cantidad de 100 μl/pocillo a la placa, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, el resultante se lavó con un tampón de lavado, y luego se añadieron 100 μl de un sustrato ABTS a cada pocillo para realizar una reacción de color. 65 Después, se añadieron 100 μl de ácido oxálico 2 % a cada pocillo para terminar la reacción. Seguidamente, se midió la absorbancia a 405 nm. Como resultado, las curvas de unión de hDlk-1-His a ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 se superpusieron completamente (Figura 18). Por lo tanto, se demostró que la afinidad antigénica de HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 retenía la afinidad antigénica de ChBA-1-3D, y que se logró con éxito la humanización de BA-1-3D.

5

Como segundo formato de ELISA, se añadió hDlk-1-His, que se había diluido con PBS a una concentración de 0,5 μg/ml, en una cantidad de 100 μl/pocillo a una placa de 96 pocillos, seguido de recubrimiento a 4 °C durante la noche. La placa se lavó con un tampón de lavado y luego se bloqueó con un tampón de bloqueo. A continuación, la placa se lavó con un tampón de lavado de nuevo. ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2, en cada uno de los cuales se produjo una serie de dilución de dos veces con un tampón ELISA a partir de una concentración de 5 μg/ml, 10 se añadieron cada uno en una cantidad de 100 μl/pocillo a la placa, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, la placa se lavó con un tampón de lavado, y se añadió un anticuerpo policlonal anti-cadena kappa humana de cabra conjugado con HRP que se había diluido con un tampón ELISA a una concentración de 1/2.000 en una cantidad de 100 μl/pocillo a la placa, seguido de la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se llevó a cabo una reacción de color por el mismo método que el 15 descrito anteriormente. Como resultado, se determinó que los valores CE50 de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 eran 116 ng/ml, 148 ng/ml y 154 ng/ml, respectivamente (Figura 19), y los anticuerpos humanizados HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 mostraron ambos una afinidad antigénica equivalente a la de ChBA-1-3D.

Como tercer formato de ELISA, se diluyó hDlk-1-His para recubrir una placa de 96 pocillos hasta una concentración 20 de 1/10, y luego se añadió 0,05 μg/ml de hDlk-1-His en una cantidad de 100 μl/pocillo a la placa de 96 pocillos, seguido de un recubrimiento a 4 °C durante la noche, para producir una placa ELISA recubierta con una baja concentración de hDlk-1-His. Además de las operaciones antes mencionadas, la unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a hDlk-1-His se midió de la misma manera que en el segundo formato de ELISA. Como resultado, las actividades de unión de HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 se redujeron inesperadamente en comparación con ChBA-25 1-3D (Figura 20).

Como se demostró en el primer formato de ELISA, las actividades de unión monovalente de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a hDlk-1-His no fueron sustancialmente diferentes entre sí (Figura 18). Además, como se demostró en el segundo formato de ELISA, incluso en el caso del ELISA que implica el recubrimiento con una alta 30 concentración de hDlk-1-His, las actividades de unión de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a la proteína hDlk-1-His no fueron sustancialmente diferentes entre sí (Figura 18). En consecuencia, se consideró que los resultados del tercer formato de ELISA con respecto a una reducción en las actividades de unión de HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 a una baja concentración de hDlk-1-His en comparación con ChBA-1-3D (Figura 20) se obtuvieron como consecuencia de una reducción de la avidez (actividad de unión a antígeno) causada por una reducción de la 35 flexibilidad en el movimiento de los dos brazos de unión de un anticuerpo humanizado a un antígeno. Como en el caso del segundo formato de ELISA, cuando la densidad de un antígeno es alta, todos los ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 pueden unirse divalentemente a un antígeno. En consecuencia, sus actividades de unión se detectan a niveles equivalentes (Figura 19). Como en el caso del ELISA de tercer formato, cuando la densidad de un antígeno es baja, ChBA-1-3D puede unirse divalentemente a un antígeno. Sin embargo, HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-40 2 solo se pueden unir monovalentemente a un antígeno debido a su reducida avidez. Por lo tanto, se consideró que HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2 mostraron actividades de unión a antígeno menores que las de ChBA-1-3D.

Ejemplo 7

45

Generación de mutantes de anticuerpo BA-1-3D humano y caracterización

Para determinar VH o VL, que causa una reducción en la avidez de HuBA-1-3D-1 y HuBA-1-3D-2, se llevó a cabo el siguiente experimento. En primer lugar, se sustituyó un fragmento del gen VBA HuBA-1-3D VL (Figura 10) intercalado entre los sitios de enzima de restricción NheI y EcoRI en un vector pHuBA-1-3D-2 con el fragmento NheI-50 EcoRI (Figura 4) de BA-1-3D VL de ratón para generar así un vector de expresión (pHuVH2/MuVL) constituido por HuBA-1-3D VH2 y BA-1-3D VL de ratón, concretamente, con VH humanizada y VL de ratón (HuVH/MuVL). A continuación, se sustituyó un fragmento del gen HuBA-1-3D VH2 (Figura 9) intercalado entre los sitios de restricción de la enzima SpeI e HindIII en un vector pHuBA-1-3D-2 con el fragmento SpeI-HindIII (Figura 3) de BA-1-3D VH de ratón para generar así un vector de expresión (pMuVH/HuVL) constituido por BA-1-3D VH de ratón y HuBA-1-3D VL, 55 concretamente, con VH de ratón y VL humanizada (MuVH/HuVL).

Posteriormente, los vectores de expresión pChBA-1-3D, pHuBA-1-3D-2, pHuVH2/MuVL y pMuVH/HuVL se transfectaron cada uno en células HEK293 utilizando reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el método incluido con el reactivo. Las células resultantes se cultivaron a 37 °C en un medio DME que contiene suero 60 fetal bovino 10 % en un incubador con CO2 7,5 durante varios días, y luego se recuperó un sobrenadante de cultivo. La concentración de un anticuerpo en el sobrenadante del cultivo se midió mediante el ELISA tipo sándwich mencionado anteriormente. La actividad de unión de cada uno de ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-2, HuVH2/MuVL y MuVH/HuVL a hDlk-1 se midió mediante el tercer formato de ELISA anteriormente mencionado (es decir, ELISA en el que hDlk-1-His se recubrió en una concentración de 0,05 μg/ml en la placa). Como resultado, las actividades de 65 unión de HuVH2/MuVL y HuBA-1-3D-2 a hDlk-1-His fueron débiles, mientras que la actividad de unión de MuVH/HuVL a hDlk-1-His fue equivalente a la de ChBA-1-3D (Figura 21). Por lo tanto, se demostró que HuBA-1-3D VL no contribuye a una reducción de la avidez y que HuBA-1-3D VH causa tal reducción en la avidez.

Para recuperar la avidez reducida, se realizó la sustitución de aminoácidos en HuBA-1-3D VH1. Como se muestra en la Figura 6, un total de 23 aminoácidos (número de aminoácidos 5, 9, 11, 12, 13, 16, 20, 24, 38, 40, 41, 42, 43, 5 44, 73, 75, 82a, 82b, 83, 85, 87, 89 y 108 (que fueron asignados de acuerdo con las definiciones de Kabat et al., (1991)) fueron diferentes entre las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de HuBA-1-3D VH1 y BA-1-3D VH de ratón. Por lo tanto, se generó un vector de expresión para un mutante (mutante pHuBA1-3D-1), en el que los aminoácidos con estos números de aminoácido en HuBA-1-3D VH1 se sustituyeron con los aminoácidos correspondientes en BA-1-3D VH de ratón. 10

Cabe señalar que, con respecto a los números de aminoácidos en las alineaciones que se muestran en la Figura 6, también hay números asignados que son similares a, pero se distinguen de 52 u 82 (por ejemplo, 52a, 82a, etc.), tales como 52 y 52a, 82 y 82a, 82b y 82c (esto también se aplica a la Figura 22). Por consiguiente, los números de aminoácidos usados en la Figura 6 (y Figura 22) son diferentes de los números de aminoácidos en las secuencias 15 de aminoácidos (SEQ ID NOS: 15, 35, 40, 67 y 73) de péptidos maduros de VH en cada figura. Dado que los números de los aminoácidos sustituidos se indican en función de las descripciones de los números de aminoácidos en la Figura 6 (y la Figura 22) (por ejemplo, T73K, etc.) en la presente memoria descriptiva y dibujos, por ejemplo, el aminoácido en la posición 73 en la Figura 6 (y la Figura 22) corresponde al aminoácido en la posición 74 en las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOS: 15, 35 y 40) de los péptidos maduros de VH en las Figuras 1, 8 y 9 (lo 20 mismo se aplica a los aminoácidos con otros números de aminoácidos o los números de aminoácidos de VL).

En la presente memoria, cada mutante de sustitución de aminoácido puede prepararse a partir del ADN que lo codifica basándose en los conocimientos técnicos comunes de una persona experta en la materia con respecto a la tecnología de recombinación génica. Para preparar cada mutante de sustitución, se puede introducir una mutación 25 en el ADN mediante métodos conocidos tales como un método de Kunkel o un método del ADN dúplex discontinuo, utilizando kits de introducción de mutaciones que utilizan mutagénesis dirigida al sitio, como el sistema de mutagénesis dirigida al sitio GeneTailor™ ( fabricado por Invitrogen) o el sistema de mutagénesis dirigida al sitio TaKaRa (Prime STAR (marca registrada) Mutagenesis Basal kit, Mutan-Super Express Km, etc., fabricado por Takara Bio Inc.). Se puede preparar un vector de expresión para cada mutante de sustitución, por ejemplo, 30 introduciendo una mutación en el ADN que codifica HuBA-1-3D VH1 en un vector pHuBA1-3D-1.

La Figura 22 muestra los nombres de los 23 tipos generados de mutantes HuBA-1-3D VH1 (V5Q a T73K/T75S) y las secuencias de aminoácidos de los mismos (en las que solo se muestran los aminoácidos que son diferentes a los de la secuencia de aminoácidos de HuBA-1-3D VH1). 35

Los vectores de expresión para los mutantes individuales pHuBA-1-3D-1 se transfectaron cada uno en células HEK293, y luego, usando un sobrenadante de cultivo, se midió la actividad de unión de cada anticuerpo con sustitución de aminoácidos con hDlk-1 mediante el tercer formato de ELISA (es decir, el ELISA en el que se recubre la placa con una baja concentración de hDlk-1-His (0,05 μg/ml). Entre los 23 tipos de mutantes HuBA-1-3D VH1, se 40 encontró que un mutante T73K (HuBA-1-3D-1-T73K) en el que la treonina (T) con el número de aminoácido número 73 se sustituyó con lisina (K), recuperaba su actividad de unión al antígeno, parcialmente pero aparentemente. Además, también se encontró que un mutante A24G (HuBA-1-3D-1-A24G) en el que la alanina (A) con el número de aminoácido 24 se sustituyó con glicina (G) también recuperaba su actividad de unión al antígeno (Figura 23). De los otros 21 tipos de mutantes, ninguno recuperó su actividad de unión al antígeno, en comparación con HuBA-1-3D-1, 45 o bien la actividad de unión al antígeno recuperada solo se observaba ligeramente.

Además, para recuperar la avidez reducida de HuBA-1-3D-1, se realizó una sustitución de dos aminoácidos (A24G/T73K), en la cual se combinó la sustitución de aminoácidos A24G con la sustitución de aminoácidos T73K, para generar un mutante (Figura 22). Además, anteriormente ya se había descrito que el 5.º aminoácido (V) y el 75.º 50 aminoácido (T) estaban situados cerca del 73.º aminoácido en la estructura tridimensional de una región variable, y que el 11.º aminoácido (V) está contenido en una articulación esférica entre la VH y la CH de una cadena γ (Landolfi et al., J. Immunol. 166: 1748, 2001). Por lo tanto, se generaron los mutantes (V5Q/T73K, V11L/T73K y T73K/T75S), en los cuales el 5.º, 11.º y 75.º aminoácidos se sustituyeron con otros aminoácidos, así como la sustitución de T73K (Figura 22). Estos mutantes de sustitución de aminoácidos y sus vectores de expresión se prepararon por el mismo 55 método que para la preparación de los 23 tipos de mutantes de sustitución de aminoácidos antes mencionados.

Los vectores de expresión (pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K, pHuBA-1-3D-1-V5Q/T73K, pHuBA-1-3D-1-V11L/T73K y pHuBA-1-3D-1-T73K/T75S) para los 4 tipos de mutantes de sustitución de dos aminoácidos antes mencionados (HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, HuBA-1-3D-1-V5Q/T73K, HuBA-1-3D-1-VIIL/T73K and HuBA-1-3D-1-T73K/T75S) y los 60 vectores de expresión pChBA-1-3D y pHuBA-1-3D-1 se transfectaron cada uno en células HEK293, y luego, usando un sobrenadante de cultivo, se midió la actividad de unión de cada anticuerpo con sustitución de aminoácido a hDlk-1 mediante el tercer formato de ELISA (es decir, el ELISA en el cual la placa se recubrió con una baja concentración de hDlk-1-His (0,05 μg/ml)). Como resultado, entre los 4 tipos de mutantes antes mencionados, el mutante A24G/T73K (HuBA-1-3D-1-A24G/T73K) exhibió una fuerte actividad de unión a hDlk-1-His, que era equivalente a 65 ChBA-1- 3D (Figura 23) y otros 3 tipos de mutantes apenas mejoraron a partir del mutante T73K (HuBA-1-3D-1-T73K) como un mutante de sustitución de un aminoácido.

Ejemplo 8

Expresión, purificación y caracterización de HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5

Los vectores de expresión (pHuBA-1-3D-1-T73K y pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K) para HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K como anticuerpos mutantes se transfectaron en células NS0 mediante el mismo método que el descrito en el Ejemplo 4, de modo que se pudo establecer una línea celular NS0 (NS0-HuBA-1-3D-1-T73K 3E12) que producía de forma estable las líneas celulares HuBA-1-3D-1-T73K y NS0 (NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 2G3, 10 NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5C7 yNS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5F9) que producen de forma estable HuBA -1-3D-1-A24G/T73K. Las líneas celulares establecidas se adaptaron a un medio sin suero (Hybridoma SFM (Invitrogen)).

Las secuencias de la cadena H y la cadena L de un anticuerpo producido por cada una de estas líneas celulares 15 NS0-HuBA-1-3D-1-T73K 3E12, NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 2G3, NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5C7 and NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 5F9 se confirmaron mediante secuenciación de ADNc que era el mismo método que el descrito en el Ejemplo 4. Las secuencias de ADNc de la cadena H y la cadena L de HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K producidas por las líneas celulares NS0 mencionadas anteriormente se aparearon completamente con las correspondientes secuencias del ADNc de los vectores pHuBA-1-3D-1-T73K y pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K, 20 respectivamente (Figuras 16, 24 y 25).

Las células NS0-HuBA-1-3D-1-T73K 3E12 y las células NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 2G3 se cultivaron en un medio Hybridoma SFM por el mismo método que el descrito en el Ejemplo 5, y a continuación, se purificaron HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de cada sobrenadante de cultivo usando una columna de Proteína A. El 25 HuBA-1-3D-1-T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K purificados se sometieron a SDS-PAGE en condiciones reducidas. Como resultado, se confirmó una cadena H de aproximadamente 50 kDa y una cadena L de aproximadamente 25 kDa (Figura 17), y la pureza de cada anticuerpo fue del 95 % o más.

Posteriormente, se analizó la avidez (actividad de unión al antígeno) del ChBA-1-3D, HuBA-1-3D-1, HuBA-1-3D-1-30 T73K y HuBA-1-3D-1-A24G/T73K purificados a un antígeno mediante el tercer formato de ELISA anteriormente mencionado, en el cual hDlk-1-His se revistió en una concentración baja (0,05 μg/ml) en una placa de 96 pocillos. Como resultado, la actividad de unión al antígeno de HuBA-1-3D-1-T73K fue más fuerte que la de HuBA-1-3D-1, pero fue más débil que la del anticuerpo ChBA-1-3D. Por otro lado, el valor CE50 de HuBA-1-3D-A24G/T73K fue de 35,5 ng/ml, el cual era próximo al valor CE50 de ChBA-1-3D (25,4 ng/ml). Por lo tanto, se demostró que HuBA-1-3D-35 1-A24G/T73K tenía una avidez mejorada, la cual se redujo en HuBA-1-3D-1, y por lo tanto que HuBA-1-3D-1-A24G/T73K adquirió una actividad de unión al antígeno equivalente a la de ChBA-1-3D (Figura 26).

Ejemplo 9

40

Generación de línea celular NS0 de alta producción de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K

La transfección del vector pHuBA-1-3D-1-A24G/T73K en células NS0, la construcción de una línea celular estable y la adaptación de la línea celular a un medio sin suero (Hybridoma SFM) se llevaron a cabo de la misma manera que se describió en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 8. NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 8A3, una de las líneas celulares NS0 45 establecidas de alta producción del anticuerpo HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, se cultivó en 37 °C en 40 ml de un medio Hybridoma SFM que contiene L-glutamina 2 mM y solución de Pluronic F-68 0,1 % (Sigma) en un matraz Erlenmeyer de plástico de 250 ml en un incubador con CO2 5 % , usando un agitador rotatorio y a un número de revoluciones de 100 rpm.

50

En el momento en que la densidad celular alcanzaba aproximadamente 2 x 106 células/ml, se añadió 35 mg/ml de Cell Boost 4 (HyClone) en una cantidad de 1/10 y una solución de Pluronic F-68 0,1 %. Dos días más tarde, se añadió 60 mg/ml de hidrolizado de soja ultrafiltrado (Irvine Scientific) diluido con un medio SFM4MAb (HyClone) en una cantidad de 1/10 y una solución de Pluronic F-68 0,1 % al medio, y el cultivo se continuó hasta que se obtuvo un porcentaje de células vivas de 50 % o menos. La concentración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en el sobrenadante del 55 cultivo fue de 73 μg/ml.

Las secuencias de las cadenas H y L de un anticuerpo producido por células NS0-HuBA-1-3D-1-A24G/T73K 8A3 se confirmaron por secuenciación de ADNc, que era el mismo método que el descrito en el Ejemplo 4. Las secuencias así confirmadas se aparearon completamente con las correspondientes secuencias del ADNc del vector pHuBA-1-60 3D-1-A24G/T73K (Figuras 16 y 25).

Ejemplo 10

Examen de la estabilidad de unión al antígeno de HuBA-1-3-D-1-A24G/T73K 65

La estabilidad de unión al antígeno de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K como anticuerpo mutante se examinó mediante una prueba acelerada en una formulación líquida y una prueba de conservación en plasma de mono cinomolgo.

En primer lugar, se llevó a cabo una prueba acelerada en una formulación líquida de la siguiente manera. HuBA-1-3D-1-A24G/T73K se conservó en 3 tipos de tampones con diferentes valores de pH a 40 °C durante 1 mes. El 5 tampón utilizado fue una solución que contenía glutamato de sodio 10 mM (Wako), D-sorbitol 262 mM (Wako) y Polisorbato 0,05 mg/ml (Wako), y esta solución se ajustó para tener 3 tipos de valores de pH, concretamente, pH 4,0, 5,5 y 7,0. Las concentraciones del anticuerpo en los tampones que tienen diferentes valores de pH fueron 0,977 mg/ml (pH 4,0), 0,996 mg/ml (pH 5,5) y 0,959 mg/ml (pH 7,0), y la conservación se inició a 40 °C. Después de la finalización de la conservación, cada muestra se conservó a -80 °C hasta la medición de la actividad de unión al 10 antígeno. Además, como producto patrón de la actividad, se utilizó una muestra preparada conservando a -80 °C una solución de anticuerpo antes de la conservación a 40 °C durante 1 mes. Para la medición de la actividad de unión al antígeno, se llevaron a cabo análisis FACS y ELISA inmovilizado con antígeno. El análisis de FACS se llevó a cabo usando células HEK293-hDlk-1 preparadas permitiendo que un gen Dlk-1 humana de longitud completa se exprese de manera estable en células HEK293 (Nakamura y Tajima, US2009/0326205 A1). Las células se 15 eliminaron de la placa de cultivo mediante un tratamiento con tripsina. A una suspensión celular de 5 × 105 células, se añadieron 100 μl de una solución de anticuerpo preparada diluyendo la muestra de prueba acelerada o el producto patrón de actividad a una concentración de 10, 3, 1, 0,3 o 0,1 μg/ml con un medio que contenía FCS 10 % como anticuerpo primario. La mezcla obtenida se incubó a 4 °C durante 20 minutos. A continuación, el producto de reacción se lavó con 1 ml de un medio que contenía FCS 10 % y al resultante se añadió 100 μl de una solución de 20 anticuerpo secundario que contenía un anticuerpo anti-Fc IgG humana marcado con biotina diluido 2000 veces (Rockland) y PE marcado con estreptavidina (BD Pharmingen) diluido 500 veces. La mezcla obtenida se incubó a 4 °C durante 20 minutos, y el producto de reacción se lavó después nuevamente con 1 ml de un medio que contenía FCS al 10 %. Después de eso, la muestra que contenía las células marcadas se suspendió en 1 ml de PBS que contenía FCS 1 % y EDTA 2 mM y la suspensión obtenida se analizó a continuación utilizando FACSCalibur (Becton 25 Dickinson). Como resultado de la prueba acelerada a 40 °C durante 1 mes, las muestras exhibieron una actividad de unión al antígeno equivalente a la del producto patrón de actividad conservado a -80 °C en todos los tampones examinados con 3 tipos de valores de pH (Figura 27A).

Además, la medición de la actividad de unión al antígeno se llevó a cabo mediante ELISA inmovilizado con antígeno. 30 El ELISA inmovilizado con antígeno se llevó a cabo de la siguiente manera. Una placa de 96 pocillos (BD FALCON) se recubrió con una proteína recombinante de la región extracelular de hDlk-1 (hDlk-1 His) que se había diluido con PBS a una concentración de 3 μg/ml en una cantidad de 50 μl/pocillo (4 °C, durante la noche). A continuación, la placa se lavó con un tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 0,01 %) y se añadió un tampón de bloqueo (PBS que contenía leche desnatada 2 % y Tween 20 0,05 %) en una cantidad de 200 μl/pocillo a la placa, con el fin 35 de bloquearlo (temperatura ambiente, 1 hora). Después de lavar la placa con un tampón de lavado, se diluyó un anticuerpo de prueba con un tampón ELISA (PBS que contiene leche desnatada 1 % y Tween 20 0,025 %) a concentraciones de 1, 0,1, 0,03, 0,01 y 0,001 μg/ml, y después se añadió a cada solución de anticuerpo en una cantidad de 50 μl/pocillo a la placa (temperatura ambiente, 2 horas). A continuación, la placa se lavó con un tampón de lavado y, como anticuerpo de detección, se añadió entonces un anticuerpo anti-cadena κ humana de cabra 40 marcado con HRP (Southern Biotech) que se había diluido 2.000 veces con un tampón ELISA en una cantidad de 50 μl/pocillo a la placa (temperatura ambiente, 1 hora). La placa se lavó con un tampón de lavado, y luego se añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; SIGMA) como una solución de sustrato en una cantidad de 50 μl/pocillo a la placa para realizar una reacción de color. Se añadió ácido sulfúrico 1 M en una cantidad de 25 μl/pocillo a la placa para terminar la reacción. Posteriormente, empleando el lector de microplacas iMark (Bio Rad), se midió la absorbancia a 45 450 nm usando la absorbancia a 655 nm como referencia. Como resultado, al igual que con los resultados del análisis FACS, no se observó una disminución en la actividad debido a la conservación a 40 °C durante 1 mes en los tampones con los 3 tipos diferentes de valores de pH (Figura 27B).

A partir de estos resultados, quedó claro que HuBA-1-3D-1-A24G/T73K conserva una actividad de unión al antígeno 50 estable en una formulación líquida.

A continuación, se examinó la actividad de unión al antígeno de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en plasma de mono cinomolgo mediante ELISA inmovilizado con antígeno. El plasma de mono cinomolgo utilizado fue plasma combinado, tratado con heparina, que se adquirió en Japan SLC, Inc. A continuación, el plasma de mono cinomolgo 55 se conservó a -80 °C antes de su uso. Cuando se usó, el plasma de mono cinomolgo descongelado se centrifugó con una centrífuga pequeña (Beckman) a 12.000 rpm durante 5 minutos, y luego se usó el sobrenadante obtenido. Se preparó una muestra para usar en ELISA inmovilizado con antígeno de la siguiente manera. HuBA-1-3D-1-A24G/T73K se mezcló con plasma de mono cinomolgo para preparar una solución de 10 μg/ml de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, y la solución se incubó a 37 °C durante 1, 6, 24, 48 horas y 7 días. Las muestras que se habían 60 incubado durante diferentes períodos de tiempo se conservaron a -80 °C antes de la medición. Como producto patrón de actividad, se usó una muestra inmediatamente después de prepararse como una solución 10 μg/ml de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K. Tras la medición de la actividad de unión al antígeno, las muestras de medición descongeladas se centrifugaron cada una con una centrífuga pequeña (Beckman) a 12.000 rpm durante 5 minutos, y los sobrenadantes obtenidos se usaron a continuación. El ELISA inmovilizado con antígeno se llevó a cabo de la 65 siguiente manera. Una placa de 96 pocillos (BD FALCON) se recubrió con una proteína recombinante (hDlk-1 His) de la región extracelular de hDlk-1 que se había diluido con PBS a una concentración de 3 μg/ml en una cantidad de 50 μl/pocillo. (4 °C, durante la noche). A continuación, la placa se lavó con un tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 0,05 %) y se añadió un tampón de bloqueo (PBS que contenía caseína 1 %) en una cantidad de 200 μl/pocillo a la placa, para bloquearla (temperatura ambiente, 1 hora). Después de lavar la placa con un tampón de lavado, la muestra de medida se diluyó con un tampón de bloqueo a una concentración de 0,1 μg/ml, y la solución 5 diluida se añadió luego en una cantidad de 50 μl/pocillo a la placa (temperatura ambiente, 1 hora). Posteriormente, la placa se lavó con un tampón de lavado y para la detección de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, se añadió un anticuerpo anti-cadena κ humana de cabra marcado con HRP (Southern Biotech) que se había diluido 2.000 veces con un tampón de bloqueo en una cantidad de 50 μl/pocillo a la placa (temperatura ambiente, 1 hora). La placa se lavó con un tampón de lavado y luego se añadió TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; SIGMA) como una solución de sustrato en 10 una cantidad de 50 μl/pocillo a la placa para realizar una reacción de color. Se añadió ácido sulfúrico 1 M en una cantidad de 25 μl/pocillo a la placa para terminar la reacción. A continuación, empleando el lector de microplacas iMark o el lector de microplacas Modelo 550 (Bio Rad), se midió la absorbancia a 450 nm usando la absorbancia a 655 nm como referencia. Como resultado, no se observó una disminución significativa en la actividad de unión al antígeno en HuBA-1-3D-1-A24G/T73K incluso después de la incubación durante 7 días (Figura 28). Por 15 consiguiente, se demostró que HuBA-1-3D-1-A24G/T73K puede conservar una actividad de unión al antígeno estable en plasma de mono cinomolgo. Estos resultados sugirieron que HuBA-1-3D-1-A24G/T73K podría conservar una actividad de unión al antígeno estable también en plasma humano (en sangre humana).

Ejemplo 11 20

Actividad antitumoral del anticuerpo anti-Dlk-1 humana humanizado (HuBA-1-3D-1-A24G/T73K) in vivo (Este título también se aplica a los Ejemplos 11 a 16)

<Actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con xenoinjerto de células HepG2 de 25 carcinoma hepatocelular humano>

La actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K in vivo se examinó con modelos de tratamiento con xenoinjertos que usan células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano, en las cuales hDlk-1 se expresó endógenamente en la superficie celular de las mismas. 30

Se trasplantaron células HepG2 (5 × 106 células) en el subcutis del flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembra de 7 semanas de edad (Día 0). Nueve días después del trasplante (día 9), cuando el volumen del tumor medio alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (grupo de administración PBS, N = 8, 96,6 ± 11,0 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso corporal) 35 (N = 8, 96,2 ± 8,5 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 96,3 ± 8,6 mm3) y un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 96,2 ± 8,5 mm3). A partir del mismo día, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a los ratones a intervalos de una vez cada 3 días.

40

Como resultado, el 23.º día (día 23) después del trasplante de células cancerosas, el volumen del tumor fue de 900,1 ± 248,6 mm3 en el grupo control, mientras que se observó una actividad antitumoral extremadamente alta (actividad inhibidora de la formación tumoral) en todos los grupos de administración HuBA-1-3D-1-A24G/T73K con diferentes dosis. Es decir, el volumen del tumor fue de 93,4 ± 47,3 mm3 en el grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 89,6 %, P <0,01 en la prueba t de Student), fue de 102,6 ± 39,7 mm3 en el grupo de 45 administración de 5 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 88,6 %, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 140,6 ± 55,0 mm3 en el grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 84,4 %, P <0,01 mediante la prueba t de Student) (Figura 29A).

Del mismo modo, con respecto al peso del tumor en el 23.º día (día 23) después del trasplante de células 50 cancerosas, el peso tumoral fue 0,440 ± 0,105 g en el grupo control, mientras que se observó una actividad antitumoral extremadamente alta (actividad inhibidora de la formación tumoral) en todos los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K con diferentes dosis. Es decir, el peso tumoral fue de 0,030 ± 0,026 g en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso corporal) (tasa inhibitoria: 93,2 %, P <0,01 en la prueba t de Student) , fue de 0,042 ± 0,026 g en el grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal 55 (tasa inhibitoria: 90,5 %, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 0,065 ± 0,039 g en el grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 85,1 %, P <0,01 en la prueba t de Student) (Figura 29B).

Ejemplo 12

60

<Actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con xenoinjerto de células SK-N-F1de neuroblastoma humano SK-N-F1>

La actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K in vivo se examinó con modelos de tratamiento con xenoinjerto usando células de neuroblastoma humano SK-N-F1, en las cuales hDlk-1 se expresó endógenamente en 65 la superficie celular de las mismas.

Células SK-N-F1 (aproximadamente 5 × 106 células) se trasplantaron en el subcutis del flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembra de 7 semanas de edad (Día 0). Trece días después del trasplante (día 13), cuando el volumen del tumor promedio alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (grupo de administración de PBS, N = 8, 91,7 + 18,3 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 91,9 + 16,9 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 91,5 ± 16,5 mm3), y un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 90,2 + 11,7 mm3). A partir del mismo día, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a los ratones a intervalos de una vez cada 3 días.

Como resultado, en el 34.º día después del trasplante de las células cancerosas (día 34), el volumen del tumor fue 10 de 1231,6 ± 411,1 mm3 en el grupo control, mientras que se observó una actividad antitumoral dependiente de la dosis (actividad inhibidora de la formación tumoral) en los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K. Es decir, el volumen del tumor fue de 713,6 ± 343,8 mm3 en el grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 42,1 %, P <0,05 en la prueba t de Student), fue de 317,0 ± 160,6 mm3 en el grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 74,3 %, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 189,0 ± 104,0 15 mm3 en el grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 84,7 %, P <0,01 en la prueba t de Student) (Figura 30A).

Del mismo modo, con respecto al peso del tumor en el 34.º día (día 34) después del trasplante de células cancerosas, el peso tumoral fue de 0,584 ± 0,213 g en el grupo control, mientras que se observó una actividad 20 antitumoral dependiente de la dosis (actividad inhibidora de la formación tumoral) en los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K. Es decir, el peso tumoral fue de 0,379 ± 0,183 g en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso corporal) (tasa inhibitoria: 64,8 %), fue de 0,165 ± 0,115 g en el grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 71,8 %, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 0,093 ± 0,059 g en el grupo de administración de 10 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 84,1 %, P <0,01 en la 25 prueba t de Student) (Figura 30B).

[Ejemplo 13]

<Evaluación de la eficacia farmacológica de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K a dosis bajas en modelos de tratamiento con 30 xenoinjerto de células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano, y comparación con las eficacias farmacológicas del agente antineoplásico existente>

La actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K in vivo se examinó con modelos de tratamiento con xenoinjerto usando células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano, en las cuales hDlk-1 se expresaba 35 endógenamente en la superficie celular de las mismas. Al mismo tiempo, se comparó HuBA-1-3D-1-A24G/T73K con el “Nexavar” existente (comprimidos de tosilato de sorafenib, Bayer) aprobado como agente terapéutico para el cáncer de hígado, en términos de actividad antitumoral.

Se trasplantaron células HepG2 (5 × 106 células) en el subcutis del flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-40 scid hembra de 7 semanas de edad (Día 0). Diez días después del trasplante (día 10), cuando el volumen del tumor medio alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo de control (grupo de administración PBS, N = 8, 107,0 ± 16,8 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0,1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 108,0 ± 13,9 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0,5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 107,9 ± 10,5 mm3), y un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso 45 corporal) (N = 8, 107,9 ± 10,0 mm3). A partir del mismo día, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a los ratones a intervalos de una vez cada 3 días. Además, con respecto a un grupo de administración de Nexavar (40 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 107,7 ± 9,7 mm3) y un grupo de administración de Nexavar (80 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 107,9 ± 9,6 mm3), desde el mismo día, el agente se administró por vía oral a los ratones en un ciclo que consistía en 5 días a la semana de administración y 2 días a la semana de retirada del fármaco. 50

Como resultado, el 28.º día (día 28) después del trasplante de células cancerosas, el volumen del tumor fue de 945,2 ± 562,1 mm3 en el grupo de control, mientras que fue de 219,4 ± 182,8 mm3 en el grupo de administración de 0,5 mg/kg de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (tasa inhibitoria: 76,8 %, P <0,01 en la prueba t de Student) y fue de 116,5 ± 69,2 mm3 en el grupo de administración de 1 mg/kg de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (tasa inhibitoria: 87,7 %, P <0,01 55 en la prueba t de Student) (Figura 31A). Por lo tanto, se observó una actividad antitumoral extremadamente alta incluso a una dosis baja (0,5 mg/kg) en los casos de los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K. La actividad antitumoral en los grupos de administración de Nexavar fue más débil que en los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K. No se observó una actividad antitumoral significativa en el grupo de administración de 40 mg/kg de Nexavar (588,0 ± 314,0 mm3) en comparación con el grupo de control, y fue de 384,1 ± 190,4 mm3 60 incluso en el grupo de administración de 80 mg/kg de Nexavar (tasa inhibitoria: 59,4 %, P <0,05 en la prueba t de Student) (Figura 31B).

Como indicador de los efectos secundarios, con respecto a un cambio en los pesos corporales de los ratones después del trasplante de células cancerosas, se estableció el valor medio de los pesos corporales de los ratones en 65 cada grupo en el momento de la agrupación (Día 10) al 100 %, y se examinó la tasa de aumento de los pesos corporales de los ratones en cada grupo a lo largo del tiempo hasta el 28.º día (día 28). En el grupo control, se observó una disminución en el peso corporal de los ratones con el crecimiento del tumor (93,0 ± 8,5 %, N = 8, día 28). En los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K, que exhibieron efectos antitumorales, no se observó una disminución tal de los pesos corporales de los ratones (grupo de administración de 0,5 mg/kg: 99,0 ± 10,0 %, grupo de administración de 1 mg/kg: 100,0 ± 4,2 %). En los grupos de administración de Nexavar, se 5 observó una disminución en los pesos corporales con el tiempo, y la tasa de disminución del peso corporal el día 28 fue de 83,0 ± 5,2 % en el grupo de administración de 40 mg/kg de Nexavar (N = 8, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 80,0 ± 7,7 % en el grupo de administración de 80 mg/kg de Nexavar (N = 7, P <0,05 en la prueba t de Student) (Figura 31C). A partir de los resultados anteriores, se hizo evidente que el anticuerpo HuBA-1-3D-1-A24G/T73K tiene una actividad de inhibición casi completa del crecimiento tumoral incluso cuando se administra a 10 una dosis tan baja como 0,5 mg/kg de peso corporal. Además, también quedó claro que el anticuerpo HuBA-1-3D-1-A24G/T73K exhibe una fuerte actividad antitumoral cuando se compara con Nexavar, un agente terapéutico existente para el cáncer de hígado, y no causa efectos secundarios.

Ejemplo 14 15

<Evaluación de las eficacias farmacológicas de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con xenoinjerto de células HepG2/C3A de carcinoma hepatocelular humano>

La actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K sobre el cáncer de hígado se examinó con modelos de 20 tratamiento con xenoinjerto utilizando células HepG2/C3A de carcinoma hepatocelular humano (ATCC, N.º Cat. CRL-10741).

Se trasplantaron células HepG2/C3A (5 × 106 células) en el subcutis del flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembra de 7 semanas de edad (Día 0). Diez días después del trasplante (día 10), cuando el volumen del 25 tumor medio alcanzó 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo control (grupo de administración de PBS, N = 8, 120,8 ± 22,6 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0,1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 120,4 ± 18,4 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (0,5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 120,1 ± 18,8 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 120,3 ± 18,8 mm3), y un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 30 120,6 ± 21,0 mm3). A partir del mismo día, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a los ratones a intervalos de una vez cada 3 días.

Como resultado, el 26.º día (día 26) después del trasplante de células cancerosas, el volumen del tumor fue de 637,6 ± 353,9 mm3 en el grupo de control (N = 8), mientras que se observó una actividad antitumoral 35 estadísticamente significativa en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de 1 mg/kg de peso corporal y en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de 5 mg/kg. El volumen del tumor fue de 132,9 ± 266,1 mm3 en el grupo de administración de 1 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 79,2 %, N = 8, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 128,0 ± 75,6 mm3 en el grupo de administración de 5 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 79,9 %, N = 8, P <0,01 en la prueba t de Student) (Figura 32A). 40

Del mismo modo, con respecto al peso del tumor en el 26.º día (día 26) después del trasplante de células cancerosas, el peso tumoral fue de 0,624 ± 0,381 g en el grupo control, mientras que fue de 0,107 ± 0,117 g en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de 1 mg/kg (tasa inhibitoria: 82,9 %, P <0,01 en la prueba t de Student), y fue de 0,079 ± 0,056 g en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de 5 mg/kg de peso 45 corporal (tasa inhibitoria: 87,3 %, P <0,01 en la prueba t de Student), y por lo tanto, se confirmó una actividad antitumoral extremadamente fuerte (Figura 32B).

Ejemplo 15

50

<Evaluación de las eficacias farmacológicas de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con xenoinjerto de células Lu-135 de cáncer de pulmón microcítico humano>

La actividad antitumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en el cáncer de pulmón microcítico se examinó con modelos de tratamiento con xenoinjerto utilizando células humanas de cáncer de pulmón microcítico Lu-135 (adquiridas en 55 Health Science Research Resources Bank, Japón Health Sciences Foundation, N.º Cat JCRB0170), en las cuales hDlk-1 se expresó endógenamente en la superficie celular de las mismas.

Se trasplantaron células Lu-135 (5 × 106 células) en el subcutis del flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-scid hembra de 7 semanas de edad (Día 0). Diez días después del trasplante (día 10), cuando el volumen del tumor 60 medio alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en un grupo control (grupo de administración de PBS, N = 8, 100,9 ± 12,7 mm3), un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (1 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 100,6 ± 8,1 mm3), y un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (10 mg/kg de peso corporal) (N = 8, 102,9 ± 12,0 mm3). A partir del mismo día, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a los ratones a intervalos de una vez cada 3 días. Como resultado, en el 34.º día (día 34) después del trasplante de células 65 cancerosas, el volumen del tumor fue de 972,7 ± 266,8 mm3 en el grupo de control, mientras que fue de 631,9 ± 218,9 mm

Del mismo modo, con respecto al peso del tumor en el 34.º día (día 34) después del trasplante de células cancerosas, el peso tumoral fue de 0,632 ± 0,177 g en el grupo control, mientras que fue de 0,429 ± 0,161 g en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de 1 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 32,1 %, P <0,05 en la prueba t de Student), y fue de 0,420 ± 0,178 g en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K de 10 10 mg/kg de peso corporal (tasa inhibitoria: 33,5 %, P <0,05 en la prueba t de Student). Por lo tanto, se confirmó una actividad antitumoral estadísticamente significativa en los grupos de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (Figura 33B).

Ejemplo 16 15

<Inducción de apoptosis en células cancerosas mediante la administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K en modelos de tratamiento con xenoinjerto de células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano>

A continuación, con respecto al mecanismo de acción de la actividad antitumoral exhibida por HuBA-1-3D-1-20 A24G/T73K, se examinó la apoptosis de células cancerosas en tumores de xenoinjerto después de la administración del anticuerpo mediante un método TUNEL y un método inmunohistoquímico usando un anticuerpo anti-caspasa-3 escindida.

Se trasplantaron células HepG2 (5 × 106 células) en el subcutis del flanco derecho de cada uno de los ratones NOD-25 scid hembra de 7 semanas de edad. Cuando el volumen del tumor promedio alcanzó 200 mm3, los ratones se dividieron en un grupo control (grupo de administración de PBS) y un grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg de peso corporal). Cuarenta y ocho horas después de la administración de PBS, se recuperaron tumores de xenoinjerto del grupo control (N = 3). Veinticuatro y cuarenta y ocho horas después de la administración del anticuerpo, se recuperaron tumores de xenoinjerto del grupo de administración de HuBA-1-3D-1-30 A24G/T73K (N = 3 en cada tiempo). Los tumores de xenoinjerto así recuperados se incluyeron en el Compuesto O.C.T. (Tissue-Tek O.C.T. Compound, Funakoshi), y los bloques congelados se prepararon a continuación en nitrógeno líquido. Los cortes congelados de los tumores de xenoinjerto se produjeron en un criostato y la apoptosis de las células cancerosas se detectó mediante el método TUNEL de acuerdo con un método descrito en TumorTACS™ In Situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen, 4815-30-K). 35

Los cortes congelados preparadas se secaron completamente al aire a temperatura ambiente, y luego se rehidrataron con una serie de etanol, seguido de inmovilización con PBS que contenía formaldehído 3,7 % (Wako, 064-00406). El resultante se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos dos veces, y luego se permeabilizó con Cytonin (Trevigen, 4876-05-01). Posteriormente, el resultante se lavó dos veces con agua 40 destilada a temperatura ambiente durante 2 minutos y luego se trató con una solución preparada añadiendo una solución de peróxido de hidrógeno (Wako, 081-04215) a metanol hasta una concentración final del 3 % a temperatura ambiente durante 5 minutos, para eliminar la peroxidasa endógena. A continuación, el residuo se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 1 minuto, y luego se pretrató con una solución preparada diluyendo 10 veces 10 x TdT Tampón marcador (Trevigen, 4810-30-02) con agua destilada (en lo sucesivo referido como “1 × TdT 45 Tampón marcador”). El resultante se dejó reaccionar con Labeling Reaction Mix producido mezclando TdT dNTP Mix (Trevigen, 4810-30-04), 50 × Mn2+ (Trevigen, 4810-30-14), TdT Enzyme (Trevigen, 4810-30-05) y 1 × TdT Tampón marcador, de acuerdo con un manual de instrucciones incluido en el TumorTACS™ In Situ Apoptosis Detection Kit a

37 °C durante 1 hora, y se añadió dNTP marcado con biotina al ADN fragmentado. Posteriormente, la mezcla de reacción se dejó reaccionar con una solución preparada diluyendo 10 veces 10 x tampón de detención (Trevigen, 50 4810-30-03) con agua destilada a temperatura ambiente durante 5 minutos, para terminar la reacción de marcado. A continuación, la mezcla de reacción se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 2 minutos dos veces, y luego se dejó reaccionar con una solución preparada diluyendo 50 veces Strep-HRP (Trevigen, 4800-30-06) con PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos, formando así un complejo ABC. El complejo ABC así obtenido se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 2 minutos dos veces, y el desarrollo de color se llevó a cabo utilizando una 55 solución DAB preparada mezclando PBS, DAB (Trevigen, 4800-30-09) y una solución de peróxido de hidrógeno 30 % de acuerdo con un manual de instrucciones incluido en el TumorTACS™ In Situ Apoptosis Detection Kit. Después de la confirmación del desarrollo del color, la mezcla de reacción se lavó con agua desionizada durante 2 minutos 4 veces, y el núcleo se tiñó con verde metilo 1 % (Trevigen, 4800-30-18). Posteriormente, el resultante se deshidrató con etanol, luego se penetró con xileno, y luego se montó en Entellan New (MERCK, 1079610100), seguido de 60 observación bajo un microscopio. Un corte de tejido, en el que el 10 % o más de todas las células cancerosas se tiñeron en el corte de tejido, se definió como un corte positivo.

Como resultado, en tumores de xenoinjerto en el grupo de control (grupo de administración de PBS, N = 3), no se observaron células cancerosas en las que se indujo la apoptosis positiva a TUNEL. Por el contrario, en el grupo de 65 administración de HubA-1-3D-1-A24G/T73K de 5 mg/kg de peso corporal, 24 horas después de la administración del anticuerpo, se observaron células cancerosas en las que se indujo apoptosis positiva a TUNEL. Cuarenta y ocho horas después de la administración del anticuerpo, dicha apoptosis se observó en el 30 % o más de todas las células cancerosas en los tres casos (Figura 34A).

Asimismo, la apoptosis de células cancerosas en tumores de xenoinjerto se examinó mediante inmunotinción con 5 caspasa-3 activada. Los cortes congelados se fijaron por tratamiento con PBS que contenía paraformaldehído 4 % (Wako, 160-16061) a 4 °C durante 15 minutos. El resultante se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos dos veces, y luego se trató a temperatura ambiente durante 10 minutos con una solución preparada añadiendo una solución de peróxido de hidrógeno (Wako, 081-04215) a metanol hasta una concentración final del 3 %, para eliminar la peroxidasa endógena. A continuación, el resultante se lavó con PBS a temperatura ambiente 10 durante 5 minutos dos veces, y luego se bloqueó con PBS que contenía 1,5 % de suero de cabra normal (Vector, S-1000) (durante 1 hora a temperatura ambiente).

Posteriormente, el resultante se dejó reaccionar con un anticuerpo anti-caspasa-3 escindida (Cell Signaling Technology, N.º cat 9661) que se había diluido 600 veces con un tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche, y 15 luego se le permitió reaccionar con Reactivo de polímero ChemMate EnVision (DAKO, K5027) a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, el resultante se lavó con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos tres veces, y seguidamente se llevó a cabo el desarrollo de color utilizando la solución Histofine Peroxidase Substrate Simple Stain DAB (Nichirei Bioscience, 415171). El resultante se lavó con agua desionizada durante 5 minutos, y el núcleo se tiñó luego con la Solución de Hematoxilina de Mayer (Wako, 131-09665). Posteriormente, la 20 resultante se deshidrató con etanol, luego se penetró con xileno, y luego se montó en Entellan New (MERCK, 1079610100), seguido de observación bajo un microscopio. Un corte de tejido, en el cual el 10 % o más de todas las células cancerosas se tiñeron en el corte de tejido, se definió como un corte positivo.

Como resultado, en tumores de xenoinjerto en el grupo de control (grupo de administración de PBS, N = 3), no se 25 detectó caspasa-3 activada. Por el contrario, en el grupo de administración de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K (5 mg/kg de peso corporal), 24 horas después de la administración del anticuerpo, se indujo apoptosis caspasa-3 positiva en células cancerosas en 2 de 3 casos, y 48 horas después de la administración del anticuerpo, dicha inducción de la apoptosis activada por caspasa-3 positiva en células cancerosas se observó en los 3 casos. En particular, en los tumores de xenoinjerto 48 horas después de la administración del anticuerpo, se observó muerte celular causada 30 por apoptosis activada por caspasa-3 positiva en 80 % o más de todas las células cancerosas (Figura 34B).

A partir de los resultados anteriores, quedó claro que HuBA-1-3D-1-A24G/T73K induce la muerte celular causada por la apoptosis en células HepG2 de carcinoma hepatocelular, y se demostró que este es al menos uno de los mecanismos de acción de la actividad anti-tumoral de HuBA-1-3D-1-A24G/T73K. 35

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se pueden proporcionar anticuerpos anti-hDlk-1 que tienen una actividad antitumoral, específicamente, anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 que tienen una actividad antitumoral significativa 40 in vivo incluso mediante la administración de anticuerpos solos, y particularmente, los anticuerpos mencionados anteriormente, que son anticuerpos humanizados. Además, entre los anticuerpos humanizados, la presente invención puede proporcionar anticuerpos monoclonales anti-hDlk-1 humanizados de tipo sustitución de aminoácidos, que se han modificado para tener una mayor avidez (actividad de unión al antígeno).

45

Además, la presente invención puede proporcionar hibridomas que producen los anticuerpos mencionados anteriormente, y un complejo de los anticuerpos mencionados anteriormente y diversos tipos de agentes.

Además, la presente invención también puede proporcionar una composición farmacéutica para diagnosticar o tratar un tumor, una composición farmacéutica para inducir apoptosis en células tumorales, un agente terapéutico anti-50 tumoral, un agente de diagnóstico tumoral, un agente para inducir apoptosis en células tumorales, un método para tratar un tumor, un método para detectar un tumor, un kit para detectar o diagnosticar un tumor y un kit para inducir apoptosis en células tumorales, cada uno de los cuales comprende el anticuerpo mencionado anteriormente, el complejo mencionado anteriormente o similar.

55

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS

SEQ ID NOS: 3 a 11

ADN sintéticos

SEQ ID NO: 26

ADN recombinante

SEQ ID NO: 27

ADN recombinante

SEQ ID NO: 32

ADN recombinante

SEQ ID NO: 33

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 34

ADN recombinante

SEQ ID NO: 35

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 36

ADN recombinante

SEQ ID NO: 37

ADN recombinante

SEQ ID NO: 38

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 39

ADN recombinante

SEQ ID NO: 40

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 41

ADN recombinante

SEQ ID NO: 42

ADN recombinante

SEQ ID NO: 43

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 44

ADN recombinante

SEQ ID NO: 45

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 46

ADN recombinante

SEQ ID NOS: 47 a 51

ADN sintéticos

SEQ ID NO: 52

ADN recombinante

SEQ ID NO: 53

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 54

ADN recombinante

SEQ ID NO: 55

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 56

ADN recombinante

SEQ ID NO: 57

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 58

ADN recombinante

SEQ ID NO: 59

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 60

ADN recombinante

SEQ ID NO: 61

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 62

ADN recombinante

SEQ ID NO: 63

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 64

ADN recombinante

SEQ ID NO: 65

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 66

ADN recombinante

SEQ ID NO: 67

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 68

ADN recombinante

SEQ ID NO: 69

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 70

ADN recombinante

SEQ ID NO: 71

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 72

ADN recombinante

SEQ ID NO: 73

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 74

ADN recombinante

SEQ ID NO: 75

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 76

ADN recombinante

SEQ ID NO: 77

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 78

ADN recombinante

SEQ ID NO: 79

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 80

ADN recombinante

SEQ ID NO: 81

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 82

ADN recombinante

SEQ ID NO: 83

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 84

ADN recombinante

SEQ ID NO: 85

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 86

ADN recombinante

SEQ ID NO: 87

Proteína recombinante

SEQ ID NO: 88

ADN recombinante

SEQ ID NO: 89

Proteína recombinante

Listado de secuencias

<110> LivTech, Inc.

5

<120> ANTICUERPO ANTI-DLK-1 CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL IN VIVO

<130> PCT13-0032

<150> US61/709.282 10

<151>

<160> 89

<170> PatentIn versión 3.5 15

<210> 1

<211> 1532

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (154)..(1305) 5

<400> 1

<210> 2

<211> 383

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 2

10

<210> 3

<211> 45

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético

10

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220>

<223> ADN sintético

<400> 4

10

<210> 5

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> ADN sintético

<400> 5 20

<210> 6

<211> 20

<212> ADN 25

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético

30

<400> 6

<210> 7

<211> 21 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético 40

<400> 7

<210> 8 45

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 50

<223> ADN sintético

<400> 8

55

<210> 9

<211> 47

<212> ADN

<213> Artificial

60

<220>

<223> ADN sintético

<400> 9

<210> 10

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético 10

<400> 10

<210> 11 15

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20

<223> ADN sintético

<400> 11

25

<210> 12

<211> 420

<212> ADN

<213> Mus musculus

30

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 12 35

<210> 13

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Mus musculus

<400> 13

10

<210> 14

<211> 363

<212> ADN

<213> Mus musculus

5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 14 10

<210> 15

<211> 121 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

20

<210> 16

<211> 5

<212> PRT 5

<213> Mus musculus

<400> 16

10

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus 15

<400> 17

20

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 18

<210> 19 30

<211> 399

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220> 35

<221> CDS

<222> (1)..(399)

<400> 19

<210> 20

<211> 133

<212> PRT 5

<213> Mus musculus

<400> 20

<210> 21

<211> 339

<212> ADN 5

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(339) 10

<400> 21

<210> 22

<211> 113

<212> PRT 5

<213> Mus musculus

<400> 22

<210> 23

<211> 17

<212> PRT 5

<213> Mus musculus

<400> 23

10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus 15

<400> 24

20

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

25

<400> 25

<210> 26

<211> 455

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<400> 26

<210> 27 15

<211> 434

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20

<223> ADN recombinante

<400> 27

25

<210> 28

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(354)

<400> 28

5

<210> 29

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<400> 29

<210> 30

<211> 345

<212> ADN 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(345) 10

<400> 30

<210> 31

<211> 115

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 32 15

<210> 33

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 33

<210> 34

<211> 363

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 34 15

<210> 35

<211> 121 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

5

<400> 35

<210> 36 10

<211> 456

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15

<223> ADN recombinante

<400> 36

<210> 37

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 37 15

<210> 38

<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial

5

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

<400> 38

10

<210> 39

<211> 363

<212> ADN 15

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

20

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 39 25

<210> 40

<211> 121 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante) 10

<400> 40

<210> 41

<211> 456

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<400> 41

<210> 42 15

<211> 399

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

<220>

<221> CDS 5

<222> (1)..(399)

<400> 42

10

<210> 43

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial 15

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

<400> 43 20

<210> 44

<211> 339

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(339)

<400> 44 15

<210> 45

<211> 113

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 45

<210> 46

<211> 435

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<400> 46

<210> 47 15

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20

<223> ADN sintético

<400> 47

25

<210> 48

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético

<400> 48

5

<210> 49

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 10

<220>

<223> ADN sintético

<400> 49 15

<210> 50

<211> 19

<212> ADN 20

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético

25

<400> 50

<210> 51

<211> 18 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN sintético 35

<400> 51

<210> 52 40

<211> 1413

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 45

<223> ADN recombinante

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1413) 50

<400> 52

<210> 53

<211> 470

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 53

<210> 54

<211> 723

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(723)

10

<400> 54

<210> 55

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante) 5

<400> 55

<210> 56

<211> 1413

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1413)

<400> 56 15

<210> 57

<211> 470

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 57

<210> 58

<211> 1413

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1413)

<400> 58 15

<210> 59

<211> 470

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 59

<210> 60

<211> 723

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(723)

<400> 60 15

<210> 61

<211> 240

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

<400> 61

5 <210> 62

<211> 1413

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220>

<223> ADN recombinante

<220>

<221> CDS 10

<222> (1)..(1413)

<400> 62

15

<210> 63

<211> 470

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 63

<210> 64

<211> 1413

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1413)

<400> 64 15

<210> 65

<211> 470

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 65

<210> 66

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 66 15

<210> 67

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 67

<210> 68 15

<211> 363

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

10

<400> 68

<210> 69 15

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

<400> 69

<210> 70

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 70 15

<210> 71

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 71

<210> 72

<211> 363

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 72 15

<210> 73

<211> 121

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 73

<210> 74

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 74 15

<210> 75

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 75

<210> 76

<211> 363

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 76 15

<210> 77

<211> 121

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 77

<210> 78

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 78 15

<210> 79

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 79

<210> 80

<211> 363

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 80 15

<210> 81

<211> 121

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 81

<210> 82

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 82 15

20 <210> 83

<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial

5

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

<400> 83

10

<210> 84

<211> 363

<212> ADN 15

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

20

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 84 25

<210> 85

<211> 121

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 85

<210> 86

<211> 420

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(420)

<400> 86 15

<210> 87

<211> 140

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 87

<210> 88

<211> 363

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> ADN recombinante

10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(363)

<400> 88 15

<210> 89

<211> 121

<212> PRT 5

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética (proteína recombinante)

10

<400> 89

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo contra la Dlk-1 humana, en el que la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 35, 40, 69, 73, 77, 81, 85 y 89, y la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L comprende la secuencia de aminoácidos 5 que se muestra en la SEQ ID NO: 45.
2. 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, el cual:

   (a) tiene una actividad antitumoral in vivo; y/o 10

   (b) se une a al menos una porción de una región que comprende aminoácidos en las posiciones 24 a 91 en la secuencia de aminoácidos de la Dlk-1 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 2.
3. 3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo monoclonal. 15
4. 4. Un complejo, que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un compuesto que tiene una actividad antitumoral y/o una actividad destructora de células.
5. 5. Una composición farmacéutica, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de 20 las reivindicaciones 1 a 3 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 6.
6. 6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el complejo de acuerdo con la reivindicación 4 o la composición de acuerdo con la reivindicación 5, para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico de un tumor. 25
7. 7. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el complejo de acuerdo con la reivindicación 4 o la composición de acuerdo con la reivindicación 5, para su uso en un método de inducción de apoptosis en células tumorales.

   30
8. 8. El anticuerpo, composición o complejo para su uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neuroblastoma humano.
9. 9. Un agente terapéutico antitumoral, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de 35 las reivindicaciones 1 a 3 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 4.
10. 10. La composición de acuerdo con la reivindicación 5 o el agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 9, que no causa reducción de peso como efecto secundario.

    40
11. 11. Un agente adecuado para inducir apoptosis en células tumorales, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 4.
12. 12. Un kit adecuado para tratar, diagnosticar o detectar un tumor o para inducir apoptosis en células tumorales, que comprende al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y el complejo 45 de acuerdo con la reivindicación 4.
13. 13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, el complejo de acuerdo con la reivindicación 4, la composición de acuerdo con la reivindicación 10, el agente terapéutico de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, el agente inductor de apoptosis de la reivindicación 11 o el kit de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el tumor es al menos uno 50 de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico humano y neuroblastoma humano.
14. 14. Un método para detectar un tumor, que comprende: permitir que al menos uno del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y el complejo de acuerdo con la reivindicación 4, reaccione con una 55 muestra recogida de un cuerpo vivo; y detectar una señal o señales del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo reaccionado.
15. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el tumor es al menos uno de cáncer de colon humano, cáncer de mama humano, cáncer de hígado humano, cáncer de páncreas humano, cáncer de pulmón microcítico 60 humano y neuroblastoma humano.