CN104755498B - 用于检测叶酸受体1的诊断测定和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及结合至人叶酸受体1的抗体以及用于基于叶酸受体1的疗法的诊断测定。进一步提供使用所述抗体来监测疗法的方法。本发明提供用于检测样本中的FOLR1的方法并且可以用于例如对患者进行分级。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有叶酸受体1介导的疾病的患者的方法，所述方法包括：(a)测量取自患者的样本中的脱落叶酸受体1(FOLR1)表达水平或循环肿瘤细胞(CTC)上的FOLR1。

Description

用于检测叶酸受体1的诊断测定和试剂盒
发明领域
本发明的领域总体上涉及结合至人叶酸受体1(FOLR1)的抗体、检测FOLR1的方法、诊断及治疗癌症的方法以及用于基于FOLR1的疗法的诊断测定和试剂盒。
发明背景
癌症是发达国家中死亡的首要原因之一，仅美国每年就有超过一百万人被诊断出癌症并且有500,000人死亡。据估计总体上3人中有超过1人将在其寿命期间发展某种形式的癌症。存在超过200种不同类型的癌症，其中四种是乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌以及前列腺癌，它们占所有新发病例的超过一半(Jemal等人,2003,Cancer J.Clin.53:5-26)。
叶酸受体1(FOLR1)又名叶酸受体α或叶酸结合蛋白，它是在细胞质膜上表达的N-糖基化蛋白。FOLR1对叶酸以及若干还原的叶酸衍生物具有高亲和力。FOLR1介导生理叶酸，即5-甲基四氢叶酸，向细胞内部的递送。
FOLR1在大多数卵巢癌以及许多子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌及乳腺癌中过度表达，而FOLR1在正常组织上的表达只限于肾近端小管中的上皮细胞的顶膜、肺的肺泡性肺细胞、膀胱、睾丸、脉络丛以及甲状腺(Weitman SD,等人,Cancer Res 52:3396-3401(1992)；Antony AC,Annu Rev Nutr 16:501-521(1996)；Kalli KR,等人Gynecol Oncol108:619-626(2008))。FOLR1的这种表达模式使其成为用于FOLR1定向癌症疗法的合乎需要的靶标。
因为卵巢癌通常是无症状的直到晚期，所以它经常在晚期被诊断出并且当用当前可得的程序(通常是在外科去除组织之后施用化疗药物)治疗时具有不良预后(vonGruenigen V等人,Cancer 112:2221-2227(2008)；Ayhan A等人,Am J Obstet Gynecol196:81e81-86(2007)；Harry VN等人,Obstet Gynecol Surv 64:548-560(2009))。因此，存在对于用于卵巢癌的更有效治疗剂的明确未满足的医学需要。
用于检测脱落(shed)FOLR1的一些先前测定对FOLR1不具有足够的特异性。举例来说，一些测定不能区分FOLR1与其它叶酸受体家族成员(FOLR2、3及4)或报道总FBP值(叶酸结合蛋白)。另外，一些测定需要人样本(例如，血浆)用光酸洗涤步骤预处理以将叶酸从受体中分离。一些测定结果还可能由于抗体疗法与诊断抗体之间的竞争效应而具有不准确性。另外，许多可商购获得的试剂盒传统上在其试剂以及在其批次与批次稳定性方面是不可靠的。这些试剂盒的评估给出了各种各样的结果，并且意图仅供研究使用。许多需要人样本在分析之前被预稀释以降低由于“基质效应(matrix effect)”所引起的假阳性几率。因此，存在对于高灵敏性和精确性诊断测定作为用于基于FOLR1疗法的搭配的明确需要。
发明概述
本发明提供用于检测样本中的FOLR1的方法并且可用于例如对患者进行分级。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有叶酸受体1介导的疾病的患者的方法，所述方法包括：(a)使用不竞争性地抑制抗体huMov19与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段相对于参照样本中的脱落或CTC FOLR1水平测量取自患者的样本中的脱落叶酸受体1(FOLR1)表达水平或循环肿瘤细胞(CTC)上的FOLR1；以及(b)如果患者的脱落或CTC FOLR1水平升高，那么向患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；其中所述固定剂量的抗体或其片段有效地治疗疾病或病症。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)使用不竞争性地抑制抗体huMov19与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段相对于参照样本中的FOLR1水平测量患者的脱落或CTC FOLR1表达水平；以及(c)如果患者的脱落或CTC FOLR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率；其中患者的FOLR1水平的提高(例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落FOLR1的释放)或降低指示治疗功效。在另一实施方案中，如果患者的脱落或CTC FOLR1水平降低，那么增加后续固定剂量的量或频率；
在另一实施方案中，本发明提供一种减少患者中的FOLR1表达的方法，所述方法包括：(a)使用不竞争性地抑制抗体huMov19与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段相比于参照样本中的FOLR1水平测量取自患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的样本中的脱落或CTCFOLR1水平；以及(b)如果患者的脱落或CTC FOLR1水平升高，那么向患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；其中施用所述抗体或其抗原结合片段增加(例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落FOLR1的释放)或减少患者的FOLR1。
在另一实施方案中，本发明提供一种减少患者中的FOLR1表达的方法，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)相对于参照样本中的FOLR1水平测量患者的脱落或CTC FOLR1水平；以及(c)如果患者的脱落或CTC FOLR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率；其中施用所述抗体或其抗原结合片段提高(例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落FOLR1的释放)或降低患者的FOLR1水平。
在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一实施方案中，所述癌症是选自由以下组成的组的FOLR1升高的癌症：卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌以及乳腺癌。在另一实施方案中，所述癌症是铂抗性的或铂难治性的卵巢癌。
本发明还提供一种监测固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段在患者中的治疗功效的方法，所述方法包括：(a)使用不竞争性地抑制抗体huMov19与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段测量取自患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的样本中的第一脱落或CTC FOLR1水平；(b)向患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；(c)使用不竞争性地抑制抗体huMov19与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段在抗体施用之后测量取自患者的样本中的第二脱落或CTC FOLR1水平；以及(d)比较第二FOLR1水平与第一FOLR1水平；其中第一与第二FOLR1评分之间的增加(例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落FOLR1的释放)或减少指示治疗功效。
在一个实施方案中，FOLR1表达水平是在体液中测量。在另一实施方案中，所述体液是腹水。在另一实施方案中，所述体液是血清、血液或血浆。在另一实施方案中，FOLR1表达水平是在外周血液样本中测量。
在一个实施方案中，所述患者患有癌症。在另一实施方案中，所述癌症是选自由以下组成的组的FOLR1升高的癌症：卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌以及乳腺癌。在另一实施方案中，所述癌症是铂抗性的或铂难治性的卵巢癌。
在一个实施方案中，FOLR1表达是使用至少一种另外的抗FOLR1抗体或其抗原结合片段来测量。在另一实施方案中，FOLR1表达是使用两种抗FOLR1抗体或其抗原结合片段来测量。在另一实施方案中，抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段以约1.0至约10nM的Kd结合至人叶酸受体1。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段以约0.5nM至约5nM的Kd结合至人叶酸受体1。在另一实施方案中，结合亲和力是通过细胞计量术、Biacore、ELISA或放射免疫测定来测量。在另一实施方案中，细胞计量术是流式细胞术。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不结合叶酸受体2或叶酸受体3。
在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段被结合至固体支持物。在另一实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段被结合至微量滴定板。在另一实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段包括检测剂。在另一实施方案中，所述检测剂是生色检测剂、荧光检测剂、酶检测剂或电化学发光检测剂。在另一实施方案中，所述检测剂是辣根过氧化物酶(HRP)。
在一个实施方案中，FOLR1水平是使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或细胞计量术(例如，流式细胞术)来测定。在另一实施方案中，ELISA是夹心ELISA。
在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至与选自由以下组成的组的抗体相同的FOLR1表位：(a)包含SEQ ID NO:25的多肽和SEQ ID NO:29的多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:26的多肽和SEQ ID NO:30的多肽的抗体；(c)包含SEQ IDNO:27的多肽和SEQ ID NO:31的多肽的抗体；以及(d)包含SEQ ID NO:28的多肽和SEQ IDNO:32的多肽的抗体。
在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至FOLR1，其中所述抗体或其片段竞争性地抑制FOLR1结合选自由以下组成的组的抗体：(a)包含SEQID NO:25的多肽和SEQ ID NO:29的多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:26的多肽和SEQ IDNO:30的多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:27的多肽和SEQ ID NO:31的多肽的抗体；以及(d)包含SEQ ID NO:28的多肽和SEQ ID NO:32的多肽的抗体。
在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至FOLR1，其中所述抗体包含选自由以下组成的组的多肽序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ ID NO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQID NO:19、20和21；(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24；以及(e)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(d)的变体。
在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段被可检测地标记。
在一个实施方案中，所施用的抗体包括FOLR1抗体huMov19。
在一个实施方案中，huMov19作为抗体美登木素生物碱缀合物来施用。在一个实施方案中，抗体美登木素生物碱缀合物包含美登木素生物碱DM4以及可裂解的磺基-SPDB连接子(IMGN853)。
本发明还提供一种治疗患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)提交取自患者的样本用于测量FOLR1表达水平；(c)从所述测量的结果确定患者的脱落或CTC FOLR1水平相对于参照样本中的FOLR1水平是否升高；以及(d)如果患者的脱落或CTC FOLR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率。
本发明还提供一种治疗患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)提交取自患者的样本用于测量脱落或CTC FOLR1水平和与参照样本中的FOLR1水平相比较；以及(c)如果患者的脱落或CTC FOLR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率；其中患者的FOLR1水平的提高(例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落FOLR1的释放)或降低指示治疗功效。
在一个实施方案中，所施用的抗体包括FOLR1抗体huMov19。在另一实施方案中，huMov19作为抗体美登木素生物碱缀合物来施用。在一个实施方案中，抗体美登木素生物碱缀合物包含美登木素生物碱DM4以及可裂解的磺基-SPDB连接子(IMGN853)。
本发明还提供一种治疗患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包括：(a)从患有FOLR1介导的疾病或病症的患者获得样本，其中所述患者已接收固定剂量的调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)使用不竞争性地抑制抗体huMov19与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段测量来自样本中的脱落或CTC FOLR1水平；(c)确定患者的脱落或CTC FOLR1水平相对于参照样本中的FOLR1水平是否升高；以及(d)如果患者的脱落或CTCFOLR1水平升高，那么指示健康护理提供者增加后续固定剂量的量或频率；其中患者的FOLR1的增加(例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落FOLR1的释放)或减少指示治疗功效。
本发明还提供一种用于检测样本中的脱落或CTC FOLR1的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含：(a)针对人FOLR1的捕获抗体，其中所述捕获抗体或其抗原结合片段不竞争性地抑制huMov19与FOLR1的结合，以及(b)检测试剂。在另一实施方案中，所述试剂盒进一步包含所述捕获试剂的固体支持物。在另一实施方案中，所述捕获试剂被固定在固体支持物上。在另一实施方案中，所述捕获试剂被涂覆在微量滴定板上。在另一实施方案中，所述检测试剂是第二FOLR1抗体。在另一实施方案中，第一和/或第二FOLR1抗体包含选自由以下组成的组的多肽序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ ID NO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24；以及(e)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(d)的变体。
在一个实施方案中，检测试剂使用物种特异性抗体来检测。在另一实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于可检测的抗体的检测手段。在另一实施方案中，所述检测手段是比色的。在另一实施方案中，所述试剂盒进一步包含FOLR1多肽作为抗原标准。在另一实施方案中，FOLR1多肽是FOLR1-Fc。
本发明还提供一种特异性地结合至与选自由以下组成的组的抗体相同的FOLR1表位的抗体或其抗原结合片段：(a)包含SEQ ID NO:25的多肽和SEQ ID NO:29的多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:26的多肽和SEQ ID NO:30的多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:27的多肽和SEQ ID NO:31的多肽的抗体；以及(d)包含SEQ ID NO:28的多肽和SEQ ID NO:32的多肽的抗体。
本发明还提供一种特异性地结合至FOLR1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段竞争性地抑制选自由以下组成的组的抗体与FOLR1的结合：(a)包含SEQ ID NO:25的多肽和SEQ ID NO:29的多肽的抗体；(b)包含SEQ ID NO:26的多肽和SEQ ID NO:30的多肽的抗体；(c)包含SEQ ID NO:27的多肽和SEQ ID NO:31的多肽的抗体；以及(d)包含SEQID NO:28的多肽和SEQ ID NO:32的多肽的抗体。
本发明还提供一种特异性地结合至FOLR1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由以下组成的组的多肽序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ ID NO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24；以及(e)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(d)的变体。
在一个实施方案中，所述抗体包含与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性的多肽序列：(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；(b)SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:30；(c)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:31；以及(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。在另一实施方案中，所述多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少95％同一性：(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；(b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30；(c)SEQ ID NO:27和SEQID NO:31；以及(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。在另一实施方案中，所述多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少99％同一性：(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；(b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30；(c)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:31；以及(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠的、非人的、人源化的、嵌合的、表面重构的或人的。在另一实施方案中，所述抗体结合至人FOLR1而不是FOLR2或FOLR3。在另一实施方案中，所述抗体是全长抗体或抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四抗体、三抗体、双抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
本发明还提供一种特异性地结合FOLR1的多肽，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ ID NO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24；以及(e)包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的(a)至(d)的变体。在另一实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性的序列：(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；(b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30；(c)SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:31；以及(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。在另一实施方案中，所述序列与选自由以下组成的组的序列具有至少95％同一性：(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；(b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30；(c)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:31；以及(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。在另一实施方案中，所述序列与选自由以下组成的组的序列具有至少99％同一性：(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；(b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30；(c)SEQID NO:27和SEQ ID NO:31；以及(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。
在一个实施方案中，所述抗体或多肽以约1.0至约10nM的Kd结合至人叶酸受体1。在另一实施方案中，所述抗体或多肽以约1.0nM或更佳的Kd结合至人叶酸受体1。在另一实施方案中，结合亲和力通过细胞计量术、Biacore、ELISA或放射免疫测定来测量。在另一实施方案中，细胞计量术是流式细胞术。
本发明还提供一种检测样本中的FOLR1表达的方法，所述方法包括将样本与本发明的抗体或其抗原结合片段或多肽接触。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段被可检测地标记。在另一实施方案中，所述标记选自由以下组成的组：免疫荧光标记、化学发光标记、发磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶态金颗粒、有色颗粒以及磁性颗粒。在另一实施方案中，FOLR1表达通过放射免疫测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫沉淀测定、化学发光测定或免疫组织化学测定来测定。在另一实施方案中，FOLR1表达使用循环肿瘤细胞(CTC)测定来测定，其中CTC从血液、血浆或血清的样本中富集并且使用本发明的抗体或其抗原结合片段针对FOLR1表达进行染色。适用于CTC测定的抗体的非限制性实例包括FR1-9和FR1-13。使用本发明抗体的CTC测定可适用于鉴别可能对基于FOLR1的疗法有反应的受试者。
本发明还提供一种产生本发明的抗体或其抗原结合片段或多肽的分离的细胞。
本发明还提供一种制备本发明的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，所述方法包括(a)培养表达本发明的抗体或其抗原结合片段或多肽的细胞。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗癌症的方法中使用，其中已在所述活性剂的施用之前使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽在来自受试者的癌性样本中测量到增加的FOLR1蛋白表达。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，所述方法包括：(a)使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽测量患者样本中的FOLR1蛋白水平；以及(b)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么向患者施用固定剂量的活性剂。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的所述活性剂；(b)使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽测量患者的FOLR1蛋白水平；以及(c)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，其中(a)使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽将取自患者的样本中所测量的FOLR1蛋白水平与参照FOLR1蛋白水平相比较；以及(b)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么施用固定剂量的所述活性剂，其中所述活性剂的施用降低FOLR1蛋白水平。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，其中患者中表达FOLR1的细胞减少，其中(a)向患者施用固定剂量的所述活性剂；(b)使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽将从患者获得的样本中所测量的FOLR1蛋白水平与参照FOLR1蛋白水平相比较；以及(c)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率；其中所述活性剂的施用降低FOLR1蛋白水平。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于监测固定剂量的活性剂在患者中的治疗功效的方法中使用，所述方法包括：(a)使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽测量来自患有FOLR1介导的疾病或病症的患者的样本中的第一FOLR1蛋白水平；(b)向患者施用固定剂量的活性剂；(c)使用本文所提供的的抗体、其抗原结合片段或多肽在活性剂施用之后测量取自患者的样本中的第二FOLR1蛋白水平；以及(d)比较第二FOLR1蛋白水平与第一FOLR1蛋白水平；其中第一与第二FOLR1蛋白水平之间的减少指示治疗功效。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗患者的FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的所述活性剂；(b)提交取自患者的样本用于使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽来测量FOLR1蛋白水平；(c)从所述测量结果确定患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平是否升高；以及(d)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么增加后续固定剂量的量和/或频率。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，所述方法包括：(a)向患有FOLR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的所述活性剂；(b)提交取自患者的样本用于使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽来测量FOLR1蛋白水平并且比较所测量的FOLR1蛋白水平与参照FOLR1蛋白水平；以及(c)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率；其中患者的FOLR1水平的降低指示治疗功效。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，所述方法包括：(a)从患有FOLR1介导的疾病或病症的患者获得样本，其中所述患者已接收固定剂量的所述活性剂；(b)使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽测量来自样本的FOLR1蛋白水平；(c)确定患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平是否升高；(d)如果患者的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高，那么增加或指示健康护理提供者增加后续固定剂量的量和/或频率；其中患者的FOLR1的降低指示治疗功效。
本发明还提供一种包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，所述活性剂是供在用于治疗FOLR1介导的疾病或病症的方法中使用，其中已在所述活性剂的施用之前使用本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽在来自受试者的样本中测量到增加的FOLR1表达。
在一些实施方案中，所测量的FOLR1蛋白是脱落FOLR1。在一些实施方案中，所测量的FOLR1蛋白是循环肿瘤细胞上。
在一些实施方案中，FOLR1蛋白水平在体液中测量。在一些实施方案中，所述体液是腹水。在一些实施方案中，所述体液是血清、血液或血浆。在一些实施方案中，FOLR1蛋白水平在外周血液样本中测量。
在一些实施方案中，所述患者患有癌症。在一些实施方案中，FOLR1介导的疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是选自由以下组成的组的FOLR1升高的癌症：卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌以及乳腺癌。在一些实施方案中，卵巢癌是铂抗性的或铂难治性的。在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。
在一些实施方案中，FOLR1蛋白水平使用特异性地结合FOLR1的两种不同抗体或其抗原结合片段或多肽来测量。在一些实施方案中，用于检测FOLR1蛋白的抗体、其抗原结合片段或多肽被结合至固体支持物。在一些实施方案中，所述固体支持物是微量滴定板。
在一些实施方案中，用于检测FOLR1蛋白的抗体、其抗原结合片段或多肽包括检测剂。在一些实施方案中，所述检测剂是生色检测剂、荧光检测剂、酶检测剂或电化学发光检测剂。在一些实施方案中，所述检测剂是辣根过氧化物酶(HRP)。
在一些实施方案中，FOLR1蛋白水平使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。在一些实施方案中，ELISA是夹心ELISA。
在一些实施方案中，所述活性剂包括FOLR1抗体huMov19。在一些实施方案中，huMov19缀合至细胞毒性剂。在一些实施方案中，huMov19作为抗体美登木素生物碱缀合物施用，所述缀合物进一步包含美登木素生物碱DM4和可裂解的磺基-SPDB连接子(IMGN853)。
本发明还提供本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽用作诊断剂。
本发明还提供一种抗体、其抗原结合片段或多肽，它们是提供在例如不竞争性地抑制包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂与FOLR1结合的抗体或其抗原结合片段中，所述抗体、其抗原结合片段或多肽是供在用包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂治疗FOLR1介导的疾病或病症中使用和/或用于监测固定剂量的包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂的治疗功效。
本发明还提供本文所提供的抗体、其抗原反应片段或多肽，它们是供在诊断以下各项的方法中使用：(i)FOLR1介导的疾病或病症和/或(ii)对用固定剂量的包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂治疗FOLR1介导的疾病或病症有反应和/或(iii)用固定剂量的包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂的治疗的治疗功效。在一些实施方案中，所述抗体、其抗原结合片段或多肽是供在诊断患有癌症的患者的所述癌症的方法中使用。在一些实施方案中，所述癌症与升高的FOLR1水平有关。在一些实施方案中，所述抗体、其抗原结合片段或多肽包括检测剂。在一些实施方案中，所述检测剂是生色检测剂、荧光检测剂、酶检测剂或电化学发光检测剂。
本发明还提供以下方法，其中FOLR-1介导的疾病是癌症，其中所述活性剂包括IMGN853，并且其中所述脱落FOLR1蛋白水平使用利用至少两种不竞争性地抑制活性剂与FOLR1的结合的抗FOLR1抗体的ELISA测定来测量，其中所述至少两种抗FOLR1各自包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ IDNO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；以及(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24。
本发明还提供以下方法，其中FOLR-1介导的疾病是癌症，其中所述活性剂包括IMGN853，其中不竞争性地抑制活性剂结合至FOLR1的抗FOLR1抗体包含以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ ID NO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；或(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQID NO:22、23和24；并且其中FOLR1蛋白通过细胞计量术来检测。
在所述方法的一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是铂抗性的或铂难治性的。在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。在一些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。
本发明还提供以下活性剂，其中FOLR-1介导的疾病是癌症，其中所述活性剂包括IMGN853，并且其中所述脱落FOLR1蛋白水平使用利用至少两种不竞争性地抑制活性剂与FOLR1的结合的抗FOLR1抗体的ELISA测定来测量，其中所述至少两种抗FOLR1各自包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ IDNO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；以及(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24。
本发明还提供以下活性剂，其中FOLR-1介导的疾病是癌症，其中所述活性剂包括IMGN853，并且其中所述脱落FOLR1蛋白水平使用利用至少两种不竞争性地抑制活性剂与FOLR1的结合的抗FOLR1抗体的ELISA测定来测量，其中所述至少两种抗FOLR1各自包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1、2和3及SEQ ID NO:13、14和15；(b)SEQ IDNO:4、5和6及SEQ ID NO:16、17和18；(c)SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:19、20和21；以及(d)SEQ ID NO:10、11和12及SEQ ID NO:22、23和24。
在所述活性剂的一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是铂抗性的或铂难治性的。在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。在一些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。
本发明还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向脱落FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高的患者施用包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，其中使用本文所提供的抗体、抗原结合片段或多肽测量患者的FOLR1蛋白水平。
本发明还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向循环肿瘤细胞上的FOLR1蛋白水平相对于参照FOLR1蛋白水平升高的患者施用包括调节FOLR1活性的抗体或其抗原结合片段的活性剂，其中使用本文所提供的抗体、抗原结合片段或多肽测量患者的FOLR1蛋白水平。在一些实施方案中，所述活性剂包括IMGN853。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是铂抗性的或铂难治性的。在一些实施方案中，所述癌症是NSCLC。在一些实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。
本发明还提供本文所提供的抗体、其抗原结合片段或多肽用于体外测量样本中的FOLR1蛋白水平的用途。
附图简述
图1.FOLR1脱落抗原测定的示意图。
图2.(A)Mov19竞争ELISA测定的示意图。(B)通过夹心ELISA使用Mov19测定muFR1-13的结合亲和力。
图3.(A)用于确定非竞争性FOLR1结合表位的直接结合竞争ELISA的示意图。(B)用于筛选以Mov19结合干扰抗FOLR1抗体的竞争ELISA结果的对数转换图。
图4.用于筛选以muFR1-13结合干扰抗FOLR1抗体的竞争ELISA结果的对数转换图。
图5.通过夹心ELISA测定的抗FOLR1抗体的结合亲和力。
图6.通过(A)流式细胞术和(B)夹心ELISA两者测定的FR1-13的结合亲和力。
图7.通过夹心ELISA测定的(A)抗体结合至FOLR2和(B)抗体结合至FOLR3的结果的对数转换图。
图8.叶酸预结合至FOLR1对使用FR1-9和FR1-13检测脱落FOLR1抗原的影响。
图9.对人腹水样本中FOLR1的存在以及干扰性测定蛋白的存在的分析。
图10.对正常人混合血浆样本中FOLR1的存在以及干扰性测定蛋白的存在的分析。
图11.使用FOLR1夹心ELISA测定人卵巢患者血浆样本中的FOLR1浓度。
图12.基于连续稀释的纯化FOLR1-Fc融合蛋白标准的4PL S形剂量反应曲线拟合来内插FOLR1在患者样本中的量的示意图。
图13.使用具有一定范围的FOLR1表达水平的细胞系对抗FOLR1抗体的滴定。对于每种细胞系及稀释，进行一式三份染色。针对FRA表达测量平均荧光强度(MFI)并且取平均值且显示于表中(误差代表SEM)。
图14.显示使用抗FOLR1抗体的最佳稀释的细胞系中的FOLR1表达的直方图。
图15.显示抗FOLR1抗体与IMGN853之间的竞争的图。
发明详述
本发明提供一种检测患者样本中的脱落人叶酸受体1(FOLR1)或循环肿瘤细胞上的FOLR1的新型方法。FOLR1可以使用不竞争性地抑制抗FOLR1活性剂(例如，包括抗体huMov19的活性剂)与FOLR1结合的抗体来检测。不竞争性地抑制抗FOLR1活性剂的结合的抗体尤其适用于检测来自已用抗FOLR1活性剂治疗的患者的样本中的FOLR1(例如，脱落FOLR1或循环肿瘤细胞上的FOLR1)。脱落FOLR1或循环肿瘤细胞上的FOLR1可用于监测或确定治疗功效，或对以FOLR1过度表达为特征的癌症的治疗有反应的可能性。还公开了新型FOLR1结合多肽，如抗体，其适用于脱落FOLR1检测方法以及另外的FOLR1检测方法(例如，用于膜结合和细胞关联的FOLR1的IHC及CTC测定)中。还提供相关多肽及多核苷酸、包含FOLR1结合剂的组合物以及制备FOLR1结合剂的方法。另外，本文所提供的方法可以用于患者分级。
I.定义
为了便于理解本发明，许多术语和短语定义如下。
除非另有陈述，如本文所用的术语“人叶酸受体1”、“FOLR1”或“叶酸受体α(FR-α)”是指任何天然的人FOLR1。因此，所有这些术语可以是指如本文所示的蛋白质或核酸序列。术语“FOLR1”包括“全长的”未加工的FOLR1以及由细胞内的加工得到的任何形式的FOLR1。术语还涵包括FOLR1的天然存在的变体，例如，剪接变体(包括FOLR2、FOLR3或FOLR4的那些变体除外)、等位基因变体以及同工型。本文所述的FOLR1多肽可从多种来源分离，例如从人组织类型或从另一来源，或通过重组或合成方法来制备。FOLR1序列的实例包括但不限于NCBI参考号P15328、NP_001092242.1、AAX29268.1、AAX37119.1、NP_057937.1以及NP_057936.1。人FOLR1序列如下：
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS(SEQ ID NO：49)，
术语“脱落抗原”与“脱落FOLR1”在本文中可互换使用。这些术语是指可溶性的并且与细胞不关联的FOLR1蛋白。在一些实施方案中，它包含细胞外结构域(ECD)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接子。在一个实施方案中，脱落FOLR1仅包含ECD。FOLR1包含信号肽(氨基酸1-24)、FOLR1蛋白链(氨基酸25-233或234)以及可被裂解的前肽(氨基酸235至257)。脱落FOLR可以包含氨基酸1至257、1至233、1至234、25至233、25至234或其任何其它片段。在一些实施方案中，信号序列被裂解。在其它实施方案中，ECD和GPI部分可以包埋于膜(例如，可溶性脂筏)中。在一个实施方案中，脱落FOLR1可以包含氨基酸1-233或其片段。
术语“抗体”意指经由免疫球蛋白分子可变区内部的至少一个抗原识别位点识别并且特异性地结合至靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。如本文所用，术语“抗体”包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体如双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体呈现所需生物活性即可。抗体可以是五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM或其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)，基于分别称为α、δ、ε、γ以及μ的其重链恒定结构域的身份。不同类别的免疫球蛋白具有不同的及公认的亚单位结构以及三维构型。抗体可以是裸的或缀合至其它分子如毒素、放射性同位素等。
在一些实施方案中，抗体是非天然存在的抗体。在一些实施方案中，抗体是从天然组分中纯化的。在一些实施方案中，抗体是重组产生的。在一些实施方案中，抗体是由杂交瘤产生的。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其所结合的抗原如FOLR1的生物活性的抗体。在某一实施方案中，阻断抗体或拮抗剂抗体大体上或完全抑制抗原的生物活性。理想地，生物活性降低了10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
术语“抗FOLR1抗体”或“结合至FOLR1的抗体”是指能够以足够的亲和力结合FOLR1以使得抗体适用作靶向FOLR1时的诊断剂和/或治疗剂的抗体。抗FOLR1抗体结合至不相关的非FOLR1蛋白的程度小于抗体结合至FOLR1的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合至FOLR1的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，抗FOLR1抗体不结合FOLR2、FOLR3、FOLR4或叶酸。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大体上同源的抗体群体获得的抗体，即包含除可能的突变(例如，天然存在的突变，其可能少量存在)外群体一致的单个抗体。因此，修饰语“单克隆”指示所述抗体并非不同抗体的混合物的特性。在某些实施方案中，这类单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中结合靶标的多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单一结合靶标的多肽序列的方法而获得。举例来说，所述选择方法可以是从多个克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择一个独特的克隆。应理解，选定的靶标结合序列可以进一步被改变例如以改进对靶标的亲和力、人源化靶标结合序列、改进其在细胞培养中的产生、降低其体内免疫原性、生成多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体制剂的有利之处还在于其通常不被其它免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”指示抗体是从大体上同源的抗体群获得的特性，并且不被解释为需要通过任何特殊方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制得，所述技术包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))以及用于在具有部分或所有人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；及5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
术语“人源化抗体”是指非人(例如，鼠)抗体形式，它们是含有最小非人(例如，鼠)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力及能力的非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR残基替换(Jones等人,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536)。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)被来自具有所需特异性、亲和力及能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。人源化抗体可以进一步通过取代Fv构架区中和/或所替换的非人残基内部的另外残基来修饰以精制和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。一般说来，人源化抗体将包含大体上所有至少一个，且通常两个或三个可变结构域，其含有所有或大体上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR区，而所有或大体上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539或5,639,641中。“表面重构”抗体一般涉及鉴别轻链及重链两者中的可变区构架表面残基并且用人等同物来替换它们。表面重构抗体的方法已经提供在例如Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)及Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)中，所述文献以引用的方式全部并入本文。
抗体的“可变区”是指单独或以组合形式的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由四个通过三个互补决定区(CDR)连接的构架区(FR)组成，所述互补决定区又称为高变区。在每条链中的CDR是通过FR紧密接近地保持在一起并且用来自另一条链的CDR促成抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于杂交物种序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,BethesdaMd.))；以及(2)基于抗原抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。另外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
当参考可变结构域中的残基时(轻链的大致残基1-107和重链的残基1-113)，一般使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
如Kabat中所编号的氨基酸位置是指在Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中的用于编辑抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入其中的片段。例如，重链可变结构域可以在H2的残基52之后包括单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后包括插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b及82c等)。通过将抗体的同源序列区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规则编号时的Chothia CDR-H1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入物置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在的话，那么环在32处结束；如果仅35A存在，那么环在33处结束；如果35A和35B都存在的话，那么环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折中，并且通过Oxford Molecular的AbM抗体模型软件来使用。
术语“人抗体”意指由人产生的抗体或具有使用本领域中已知的任何技术制得的对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的这个定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如像包含鼠轻链及人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自于两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区对应于源自一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)具有所需特异性、亲和力及能力的抗体的可变区，而恒定区是与源自另一(通常人)物种的抗体中的序列同源以避免在那一物种中引发免疫应答。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用并且是指抗原能够被识别并由特定抗体特异性地结合的部分。当抗原是多肽时，表位可以从通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸及非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性之后得以保持，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性之后丧失。表位通常包括独特空间构造中的至少3个，并且更通常至少5或8-10个氨基酸。
“结合亲和力”一般是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指出，如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体与抗原)的元件之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域中已知的一般方法(包括本文所述的那些)来测量。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原并且趋于容易地分离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且趋于保持更长久的结合。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，其中任何一种都可以用于本发明的目的。具体的说明性实施方案在本文中描述。
当在本文中使用时“或更佳”是指表示分子与其结合配偶体之间的更强结合的结合亲和力。当用于本文中时“或更佳”是指由较小的Kd数值表示的更强结合。例如，对抗原具有“0.6nM或更佳”的亲和力的抗体意味着抗体对抗原的亲和力<0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM等，或小于0.6nM的任何值。在一个实施方案中，如通过Kd所确定的抗体亲和力将在10-3至约10-12M之间、约10-6至约10-11M之间、约10-6至约10-10M之间、约10-6至约10-9M之间、约10-6至约10-8M之间或约10-6至约10-7M之间。
如本文所用的短语“大体上类似”或“大体上相同”表示在两个数值(一般一个与本发明抗体有关并且另一个与参照/比较抗体有关)之间的足够高程度的相似性，这样使得本领域技术人员在由两个值(例如，Kd值)度量的生物学特征的情况下将所述两个值之间的差异考虑为几乎没有或没有生物学和/或统计显著性。所述两个值之间的差异小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、或小于约10％，随参照/比较抗体的值而变化。
被“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈天然未被发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已经被纯化至不再呈其天然被发现形式的程度的物质。在一些实施方案中，被分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是大体上纯的。
如本文所用，“大体上纯的”是指至少50％纯的(即，不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的材料。
术语FOLR1的“增加的表达”是指与参照样本、参照FOLR1水平或从同一受试者检测的前一FOLR1水平相比含有升高的FOLR1表达水平的样本。因此，例如，在患者样本中“提高的FOLR1蛋白水平”可以具有比非癌性参照样本中的FOLR1蛋白水平更高的FOLR1蛋白水平。在患者样本中“提高的FOLR1蛋白水平”还可以例如具有等于癌性样本中的FOLR1蛋白水平的FOLR1蛋白水平。在一些实施方案中，检测到“提高的FOLR1蛋白水平”，其中患者的FOLR1蛋白水平超过例如从同一受试者检测到的前一FOLR1水平至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或至少约25％、至少约30％或至少约50％。在循环肿瘤细胞测定中，“提高的FOLR1蛋白水平”可以是指其中FOLR1在更大百分比的细胞上检测到的样本或其中FOLR1在细胞上以更高水平检测到的样本。因此，在一些实施方案中，在CTC测定中检测到“提高的FOLR1蛋白水平”，其中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或至少约25％、至少约30％或至少约50％多的细胞显示FOLR1表达。另外，在一些实施方案中，在CTC测定中检测到“提高的FOLR1蛋白水平”，其中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％或至少约25％、至少约30％或至少约50％多的FOLR1在细胞上被检测到。
“参照样本”可用于关联和比较在本发明方法中从测试样本获得的结果。参照样本可以是细胞(例如，细胞系、细胞沉淀)、体液或组织。在“参照样本”中的FOLR1水平可以是FOLR1的绝对或相对量、量的范围、最小和/或最大量、平均量和/或中值量。“参照样本”还可以充当测试样本与其所比较的FOLR1表达的基线。“参照样本”可以包括来自同一患者的在先样本或基线样本、正常参照或来自相关患者群体的参照。一般说来，FOLR1水平可以表示为标准曲线中的值。标准曲线是确定样本中FOLR1的浓度的绘制测定数据的定量方法。在一个实施方案中，参照样本是包含纯化的FOLR1或FOLR1-Fc的抗原标准。本发明的诊断方法涉及测试样本中的FOLR1表达水平与“参照值”或“参照水平”之间的比较。在一些实施方案中，参照值是参照样本中的FOLR1的表达水平。参照值可以是预定值并且还可以从与测试样本并行测试的参照样本(例如，对照生物样本)中确定。参照值可以是单一的截止值，如中值或平均值或值的范围，如置信区间。参照值可以针对个体的不同亚组来确立，如易患癌症的个体、患有早期或晚期癌症的个体、男性和/或女性个体、或正经历癌症疗法的个体。正常参照样本或值以及阳性参照样本或值的实例在本文中描述。
术语“一抗”在本文中是指在样本中特异性地结合至靶标蛋白抗原的抗体。一抗一般是用于ELISA测定中的第一抗体。在一个实施方案中，一抗是用于IHC程序中的唯一抗体。术语“二抗”在本文中是指特异性地结合至一抗从而在一抗与随后的试剂(如果有的话)之间形成桥接的抗体。二抗一般是用于免疫组织化学程序中的第二抗体。
如本文所用，“免疫组织化学”是指用于分析例如细胞或组织的组织化学及免疫学方法。因此，术语“免疫组织化学”、“免疫细胞化学”以及“免疫化学”可互换使用。
本发明的“样本”或“生物样本”在具体实施方案种具有生物学来源，如来自真核生物。在优选的实施方案中，样本是人样本，但动物样本也可用于本发明的实践中。用于本发明中的样本的非限制性来源包括例如实体组织、活体检查吸出物、腹水、体液提取物、血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部区域、呼吸道、肠道及泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、肿瘤、器官、细胞培养物和/或细胞培养成分。本发明尤其适用于一般包括如腹水的体液的癌症样本，其中可得到的材料的量较小。所述方法可用于检查FOLR1表达的方面或样本的状况，包括但不限于比较不同类型的细胞或组织、比较不同的发育阶段、以及检测或确定疾病或异常的存在和/或类型。
如本文所用，术语“捕获试剂”是指能够结合并捕获样本中的靶标分子以使得在适合的条件下所述捕获试剂-靶标分子复合物可以从其余的样本中分离的试剂。在一个实施方案中，捕获试剂被固定。在一个实施方案中，在夹心免疫测定中的捕获试剂是针对靶标抗原的一种抗体或不同抗体的混合物。
如本文所用，术语“可检测的抗体”是指能够直接地经由通过检测手段扩增的标记检测或间接地经由例如被标记的另一抗体检测的抗体。对于直接标记，抗体通常通过某种手段缀合至可检测的部分。在一个实施方案中，可检测的抗体是生物素化抗体。
当用于本文中时词语“标记”是指直接或间接地缀合至抗体上以便生成“标记的”抗体的可检测的化合物或组合物。标记可以自身是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
如本文所用，术语“检测手段”是指在本文中用于检测ELISA中可检测抗体的存在的部分或技术并且包括扩增固定的标记(如捕获在微量滴定板上的标记)的检测剂。在一个实施方案中，检测手段是荧光检测剂，如抗生物素蛋白或链霉亲和素。
通常，“夹心ELISA”采用以下步骤：(1)用捕获抗体涂覆微量滴定板；(2)添加样本，并且存在的任何抗原结合至捕获抗体；(3)添加检测抗体并且结合至抗原；(4)添加酶连接的二抗并且结合至检测抗体；以及(5)添加底物并且通过酶转化成可检测的形式。
“关联(correlate)”或“关联(correlating)”意味着以任何方式比较第一分析的性能和/或结果与第二分析的性能和/或结果。举例来说，可以在进行第二分析时使用第一分析的结果和/或可以使用第一分析的结果以确定是否进行第二分析和/或可以比较第一分析的结果与第二分析的结果。在一个实施方案中，增加的FOLR1表达与靶向FOLR1的抗癌疗法的有效性的可能性的增加有关。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述其中细胞群以失控的细胞生长为特征的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。这类癌症的更具体实例包括内皮、间充质或上皮起源的癌症，如肺癌(例如，鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、间皮瘤以及肺鳞状细胞癌)、腹膜癌(例如原发性腹膜癌)、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌(例如，子宫内膜腺癌)或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌(例如，恶性胶质瘤、脉络丛肿瘤)及各种类型的头颈癌、以及血管和输卵管肿瘤。癌症还包括含有具有升高的FOLR1表达水平的细胞的癌症。这类FOLR1升高的癌症包括但不限于卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌以及乳腺癌。
“肿瘤”和“赘生物”是指由过度的细胞生长或增殖引起的任何组织肿块，它是良性(非癌性)或恶性的(癌性)，包括癌前病变。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”以及语法等同物是指源自肿瘤或癌前病变的总细胞群体，包括构成大部分肿瘤细胞群体的非致瘤细胞以及致瘤干细胞(癌症干细胞)。如本文所用，当仅指的是缺乏更新及分化能力的那些肿瘤细胞时，术语“肿瘤细胞”将由术语“非致瘤的”来修饰以区分那些肿瘤细胞与癌症干细胞。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等，其将是具体治疗的接受者。通常，术语“受试者”与“患者”在关于人受试者时在本文可互换使用。
术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效的这类形式的制剂，并且其不含对将要施用制剂的受试者有不可接受的毒性的另外组分。这类制剂可以是无菌的。
如本文所公开的抗体的“有效量”是足以执行特别陈述的目的的量。“有效量”在涉及所陈述的目的时可以凭经验并且以常规方式来确定。
术语“治疗有效量”或“固定剂量”是指抗体或其它药物在受试者或哺乳动物中有效“治疗”疾病或病症的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞数目；缩小肿瘤大小；抑制(即在某种程度上减缓并且在某一实施方案中终止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即在某种程度上减缓并且在某一实施方案中终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；在某种程度上减轻与癌症有关的一种或多种症状；和/或产生有利的应答，如延长的无进展存活(PFS)、无病存活(DFS)或总存活(OS)、完全应答(CR)、部分应答(PR)或在一些情况下稳定的疾病(SD)、进行性疾病(PD)的减少、减少至进展的时间(TTP)、在卵巢癌的情况下CA125减少、或其任何组合。参见本文中“治疗”的定义。在某种程度上，药物可以防止生长和/或杀死存活的癌细胞，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。“预防有效量”是指在剂量上有效并且对于一定时段必需以获得所需预防结果的量。通常但不一定，由于预防剂量在疾病之前或早期用于受试者中，所以预防有效量将小于治疗有效量。
PFS、DFS以及OS可以通过由美国国家癌症研究所以及批准新药的美国食品和药品管理局设立的标准来测量。参见Johnson等人,(2003)J.Clin.Oncol.21(7):1404-1411。
“无进展存活”(PFS)是指从登记到疾病进展或死亡的时间。PFS一般使用Kaplan-Meier方法以及实体肿瘤(RECIST)1.1标准中的应答评估标准来测量。一般说来，无进展存活是指其中患者保持活着而无癌症恶化的情况。
“至肿瘤进展的时间”(TTP)被定义为从登记到疾病进展的时间。TTP一般使用RECIST 1.1标准来测量。
“完全应答”或“完全缓解”或“CR”指出响应于治疗，肿瘤或癌症的所有迹象消失。这并不总是意味癌症已经被治愈。
“部分应答”或“PR”是指响应于治疗，一个或多个肿瘤或病变的尺寸或体积减小，或癌症在体内的程度减轻。
“稳定的疾病”是指不进展或复发的疾病。在稳定的疾病中，既不存在符合部分应答的足够的肿瘤缩小也不存在符合进行性疾病的足够的肿瘤增大。
“进行性疾病”是指又一个新病变或肿瘤出现和/或现存的非靶标病变明确进展。进行性疾病还可以是指从治疗开始以来肿瘤生长超过20％，这是由于肿块的增大或肿瘤的扩散。
“无病存活”(DFS)是指患者保持无病的治疗期间和之后的时间长度。
“总存活”(OS)是指从患者登记到死亡或在最后得知活着的日期时检查的时间。OS包括与初次或未治疗个体或患者相比的预期寿命的延长。总存活是指其中患者例如从诊断或治疗之时以来保持活着持续所限定时段，如一年、五年等的情况。
“CA125水平的下降”可以根据妇科癌症组间(GCIG)指南来评定。例如，CA125水平可以在治疗之前测量以确立基线CA125水平。CA125水平可以在治疗期间或之后测量一次或多次，并且CA125水平与基线水平相比随着时间的降低被视为CA125水平的降低。
术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“以治疗”或“减轻”或“以减轻”是指1)治愈、减缓、减轻所诊断的病理状况或病症的症状和/或停止其进展的治疗性措施，以及2)预防和/或减慢所靶向的病理状况或病症的发展的防治或预防性措施。因此，那些需要治疗者包括那些已经具有病症者；那些倾于具有病症者；以及那些病症有待被预防者。在某些实施方案中，如果患者显示出以下一个或多个，那么受试者根据本发明方法针对癌症被成功地进行了“治疗”：恶病质减少、存活时间增加、至肿瘤进展的时间延长、肿瘤肿块减小、肿瘤负荷较少和/或至肿瘤转移的时间延长、至肿瘤复发的时间延长、肿瘤应答、完全应答、部分应答、稳定的疾病、进行性疾病、无进展存活(PFS)、总存活(OS)，每一个都通过由美国国家癌症研究所以及批准新药的美国食品和药品管理局设立的标准来测量。参见Johnson等人，(2003)J.Clin.Oncol.21(7):1404-1411。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，那么可以在聚合物的装配之前或之后对核苷酸结构给予修饰。核苷酸的序列可以间隔有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合之后，如通过与标记组分缀合来进一步被修饰。其它修饰类型包括例如“帽(cap)”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如像具有不带电键合的那些(例如。甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)及具有带电键合的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬垂部分的那些，例如像蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂的那些(例如，吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、含有烷化剂的那些、具有修饰的连接物的那些(例如，α端基异构核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基都可被例如膦酸酯基、磷酸酯基替换，被标准保护基保护或被活化以准备与另外的核苷酸的另外的键合，或者可以缀合至固体支持物。5'及3'端OH可被磷酸化或被胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基还可以衍生成标准保护基。多核苷酸还可以含有一般在本领域中已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟代-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物及无碱基核苷类似物如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团替换。这些替代的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被以下基团替代的实施方案：P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)，其中R或R'各自独立地是H或取代或未被取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有键都需要相同。前面的描述适用于本文所提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”意指能够在宿主细胞中递送和表达一个或多个目标基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，如生产者细胞。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文可互换使用是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以间隔有非氨基酸。术语还包括已经天然地或通过以下干预被修饰的氨基酸聚合物：例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰，如与标记组分缀合。例如，含有氨基酸的一或多个类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽也包括所述定义中。应当理解，因为本发明的多肽是基于抗体，所以在某些实施方案中所述多肽可以单链或相关的链形式存在。在一些实施方案中，多肽、肽或蛋白质是非天然存在的。在一些实施方案中，多肽、肽或蛋白质是从其它天然存在的组分中纯化的。在一些实施方案中，多肽、肽或蛋白质是重组产生的。
在两个或更多个核酸或多肽的情形中术语“同一”或“同一性”百分比是指当进行最大对应性比较和比对(必要时引入缺口)时，相同或具有相同的指定百分比的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的部分。同一性百分比可以使用序列比较软件或算法或通过目测检查来测量。各种算法及软件在本领域中是已知的，它们可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。序列比对算法的一个这类非限制性实例是在Karlin等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中所述的算法，如在Karlin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中所修改，并且并入NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等人,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)。在某些实施方案中，有缺口的BLAST可以如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述来使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的另外的公众可利用的软件程序。在某些实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或90的缺口权重和1、2、3、4、5或6长度权重)来测定。在某些替代实施方案中，合并有Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG软件包中的GAP程序可用于测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5的长度权重)。或者，在某些实施方案中，核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比是使用Myers和Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))来测定。例如，同一性百分比可以使用ALIGN程序(2.0版)以及使用具有残基表、12的缺口长度罚分以及4的缺口罚分的PAM120来测定。通过特定比对软件进行最大比对的适当参数可以由本领域技术人员来确定。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方案中，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性百分比“X”被计算为100×(Y/Z)，其中Y是被评定为在第一与第二序列的比对(如通过目测检查或特定序列比对程序来比对)中完全相同匹配的氨基酸残基的数目并且Z是第二序列中的总残基数目。如果第一序列的长度比第二序列更长，那么第一序列与第二序列的同一性百分比将比第二序列与第一序列的同一性百分比更大。
作为非限制性实例，任何具体的多核苷酸是否与参照序列具有某一序列同一性百分比(例如，至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、并且在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％或99％同一)在某些实施方案中可以使用Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Unix第8版,Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)来确定。Bestfit使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482 489(1981)的局部同源算法来找出两个序列之间的最佳同源区段。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定具体的序列是否例如根据本发明与参照序列具有95％同一性时，设定参数以使得同一性百分比是对全长参照核苷酸序列计算的并且允许同源性中的缺口不超过参照序列中总核苷酸数目的5％。
在一些实施方案中，当按照最大对应来比较和比对时，本发明的两个核酸或多肽大体上同一，意味着它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、并且在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％、99％核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较算法或通过目测检查来测量。在某些实施方案中，同一性存在于长度为至少约10个、约20个、约40-60个残基或其间的任何整数值的序列区域上，或超过60-80个残基的区域、至少约90-100个残基上，或序列在所比较的全长序列上大体上同一，例如像核苷酸序列的编码区。
“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基用具有类似侧链的另一氨基酸残基来替换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，将苯丙氨酸取代为酪氨酸是保守取代。在某些实施方案中，在本发明的多肽和抗体序列中的保守取代不消除含有氨基酸序列的多肽或抗体结合至抗原，即多肽或抗体所结合至的FOLR1。鉴别不排除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。
如本公开及权利要求书中所用，除非上下文中另外清楚地指出，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数形式。
应当理解，当实施方案在本文中用语言“包含”来描述时，也提供依据“由...组成”和/或“基本上由...组成”来描述的其它类似实施方案。
如在短语如“A和/或B”中所用的术语“和/或”在本文中意图包括“A和B”、“A或B”、“A”以及“B”。同样地，如在短语如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”意图包括以下实施方案中的每一个：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
II.脱落抗原测定
抗体美登木素生物碱缀合物(AMC)IMGN853包含FOLR1结合的单克隆抗体huMov19(M9346A)，其缀合至美登木素生物碱DM4(N(2′)-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登木素)，经由可裂解的磺基-SPDB(4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯)连接子来连接。IMGN853和huMov19描述于同时待审的美国申请公布号2012/0009181中，所述申请以引用的方式全部并入本文。FOLR1抗原含有由Mov19识别的单一表位。在一个实施方案中，huMov19抗体包含具有以下序列的重链和轻链：
SEQ ID NO：46：huMov19vHC
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：47-huMov19 vLCv1.00
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：48-huMov 19vLCv1.60
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR。
huMov19抗体由2010年4月7日保藏在美国典型菌种保藏中心(ATCC)的编号为PTA-10772和PTA-10773或-10774的质粒所编码。
在一些实施方案中，抗FOLR1活性剂如IMGN853调节FOLR1活性，例如降低FOLR1蛋白的活性。
IMGN853目前在临床开发中用于各种治疗性适应症，包括FOLR1阳性卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫内膜样癌、肾癌以及其它上皮恶性肿瘤。卵巢癌呈现最大的FOLR1外显率并且被视为以IMGN853来治疗的主要适应症(Antony AC.Ann Rev Nutr 16:501–21(1996)；Yuan Y等人Hum Pathol 40(10):1453-1460(2009))。
测量患者血浆样本中的循环抗原(脱落抗原)水平可以帮助鉴别更可能对AMC治疗有反应的患者群体。已经报道高水平的脱落抗原显著地影响治疗性抗体的药物动力学(Tolcher A.等人20th Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics；2008年10月21-24日；Geneva,Switzerland:EORTC-NCI-AACR,第163页,#514；Baselga J,等人J Clin Oncol 14:737-744(1996))。很可能来自患者血浆样本的脱落抗原水平将根据如抗原靶标、疾病适应症以及疾病进程的因素可变。目前，在与实体肿瘤表达的相关性受限时，IMGN853的疾病适应症中的脱落抗原水平不能被充分检查。尽管已经报道在卵巢腺癌中FOLR1的升高，但数据表明它在其它FOLR1+肿瘤适应症如小细胞肺癌中不升高(MantovaniLT,等人Eur J Cancer 30A(3):363-9(1994)；Basal E,等人PLoS ONE 4(7):e6292(2009))。本发明方法允许在高叶酸的存在下检测FOLR1受体。前述测定已在测定的设计中使用Mov19。因为IMGN853含有Mov19并且在一个实施方案中是本发明的靶向疗法，所以方法在其中IMGN853在检测FOLR1之前施用的实施方案中在Mov19的存在或不存在下检测FOLR1是极为重要的。使用Mov19的前述测定具有竞争性作用并且将在接受IMGN853治疗的患者中检测到显著较少或无FOLR1。
在一个实施方案中，用于检测人来源的流体样本中的FOLR1的本发明方法使用传统的夹心ELISA形式(图1)。在一个实施方案中，所述方法使用FOLR1的捕获试剂(即，抗体、其它蛋白)，所述FOLR1连接于固体支持物上。在一个实施方案中，所述固体支持物是微量滴定板。为此，样本(腹水、血液、血清、血浆等)是在不稀释的情况下添加，并且通过不干扰第一捕获试剂的结合的不同检测剂(不同的抗体或蛋白质)来检测。然后检测剂通过使用第二检测剂(生物素/链霉亲和素，抗人第二单或多克隆抗体等)来检测，所述第二检测剂可以结合至第一检测剂超过一次，由此放大检测信号。第二检测剂然后通过利用一些其它手段(例如，TMB/过氧化物酶、闪烁计数、荧光探针等)来定量。另外，所述测定检测FOLR1并且不会因为存在Mov19、IMGN853、其它FOLR1家族成员或叶酸而受到负面影响。
本发明的测定包括选择合格的患者以接受基于FOLR1的疗法的测定以及监测患者反应的测定。在疗法选择之前进行用于反应预测的测定，并且脱落FOLR1的水平可能影响疗法决定。对于监测患者反应，在开始疗法时进行测定以确立FOLR1在样本中的基线(或预定)水平。然后测定同一样本并且将FOLR1水平与基线或预定水平相比较。如本文所用，术语“预定水平”一般是指用于通过将测定结果与预定水平比较来评定诊断结果的测定截止值，并且其中预定水平已经与各种临床参数(例如，监测受试者是否正用已实现有效药物血液水平的药物进行治疗，监测接受用抗癌药物的癌症治疗的受试者的反应，监测肿瘤在接受针对所述肿瘤的治疗的受试者中的反应等)相关或相关联。预定水平可以是绝对值或通过减去在疗法起始之前从患者获得的值而被标准化的值。可以使用的预定水平的一个实例是从一个或多个可任选患有一种或多种疾病或病状的受试者获得的基线水平。测定的生物标志物水平与基线或预定水平的比较(或信息分析)可以由自动系统如软件程序或智能系统来完成，所述自动系统是进行测定的设备(例如，计算机平台)的一部分或与其兼容。或者，这个比较或信息分析可以由医师来完成。在一个实施方案中，当水平保持相同或降低时，疗法可以是有效的并且可以继续。当发生比基线水平(或预定水平)显著的提高时，患者可能是无反应的。在另一实施方案中，脱落FOLR1水平的提高可能指示增加的细胞死亡以及增加的脱落FOLR1的释放。在这个实施方案中，脱落FOLR1的增加指示治疗功效。因此，在一些实施方案中，测量脱落FOLR1并且测量细胞死亡。用于测量细胞死亡的测定在本领域中是已知的并且包括例如检测M30-抗原(半胱天冬酶裂解的细胞角蛋白)、DNA损伤标志物如γ-H2AX、或细胞的形态特征如破碎的和/或凝缩的DAPI-染色核。
本发明的测定可以通过任何蛋白质测定方法进行。适用于本发明中的蛋白质测定方法在本领域中是众所周知的并且包括免疫测定方法，所述方法涉及特异性未标记的或标记的抗体或蛋白质与FOLR1的所表达的蛋白质或片段的结合。有用的免疫测定方法包括使用本领域中已知的任何形式进行的液相测定，如但不限于Biacore、时间分辨荧光能量传递(TR-FRET)、ELISA形式(夹心、正向和反向竞争性抑制)或荧光偏振形式以及固相测定如免疫组织化学。以下所提供的FOLR-1结合剂尤其适用于这些免疫测定方法。
III.FOLR1结合剂
本发明提供特异性地结合人FOLR1的试剂。这些试剂在本文被称为“FOLR1结合剂”。
FOLR1结合剂包括包含muFR1-9、muFR1-13、muFR1-53、muFR1-62以及muFR1-64的重链和轻链CDR序列的FOLR1结合剂。CDR序列muFR1-9、muFR1-13、muFR1-53以及muFR1-62描述于以下表1和2中。
表1：可变重链CDR氨基酸序列
表2：可变轻链CDR氨基酸序列
FOLR1结合分子可以是特异性地结合至FOLR1的抗体或抗原结合片段，所述FOLR1包含muFR1-9、muFR1-13、muFR1-53、muFR1-62或muFR1-64的CDR，每个CDR具有最多四(即，0、1、2、3或4)个保守氨基酸取代。
多肽可以包含本文所述的单个可变轻链或可变重链中的一个。抗体和多肽还可以包含可变轻链及可变重链两者。鼠muFR1-9、muFR1-13、muFR1-53以及muFR1-62抗体的可变轻链及可变重链序列提供于以下表3和4中。
表3：可变重链氨基酸序列
表4：可变轻链氨基酸序列
还提供包括以下各项的多肽：(a)与SEQ ID NO:25-28具有至少约90％序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO:29-32具有至少约90％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，多肽包括与SEQ ID NO:25-32具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，多肽包括(a)与SEQ ID NO:25-28具有至少约95％序列同一性的多肽，和/或(b)与SEQ ID NO:29-32具有至少约95％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，多肽包括(a)具有SEQ ID NO:25-28的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:29-32的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，多肽是特异性地结合FOLR1的抗体和/或多肽。在某些实施方案中，多肽是特异性地结合FOLR1的鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:25-32具有某一百分比的序列同一性的多肽与SEQ ID NO:25-32的不同仅在于保守氨基酸取代。
多肽可以包含本文所述的单个轻链或重链中的一个。抗体及多肽还可以包含轻链及重链两者。鼠muFR1-9、muFR1-13、muFR1-53以及muFR1-62抗体的轻链及可变链序列提供于以下表5和6中。
表5：全长重链氨基酸序列
表6：全长轻链氨基酸序列
还提供包括以下各项的多肽：(a)与SEQ ID NO:33-36具有至少约90％序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO:37-40具有至少约90％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，多肽包括与SEQ ID NO:33-40具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，所述多肽包括(a)与SEQ ID NO:33-36具有至少约95％序列同一性的多肽，和/或(b)与SEQ ID NO:37-40具有至少约95％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，多肽包括(a)具有SEQ ID NO:33-36的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQ ID NO:37-40的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，多肽是特异性地结合FOLR1的抗体和/或多肽。在某些实施方案中，多肽是特异性地结合FOLR1的鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:33-40具有某一百分比的序列同一性的多肽与SEQ ID NO:33-40的不同仅在于保守氨基酸取代。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用本领域中众所周知的任何适合的方法以实验方式测定，所述方法例如细胞计量术(包括流式细胞术)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)、或动力学(例如，表面等离子体共振光谱法(BIACORETM)分析)。可以容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式。(参见，例如Berzofsky,等人,"Antibody-Antigen Interactions,"Fundamental Immu nology,Paul,W.E.编,RavenPress:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:NewYork,N.Y.(1992)；以及本文所述的方法。所测量的具体抗体抗原相互作用的亲和力如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量的话可以变化。因此，亲和力及其它抗原结合参数(例如，KD或Kd、Kon、Koff)的测量是用抗体和抗原的标准化溶液、及如本领域中已知的标准化缓冲液和如本文所述的缓冲液来进行。
一方面，结合测定可以在表面上表达FOLR1抗原的细胞上使用细胞计量术(例如流式细胞术)来进行。举例来说，将FOLR1阳性细胞如SKOV3在100μL FACS缓冲液(补充有2％正常山羊血清的RPMI-1640培养基)中每份样本使用1×105个细胞与变化浓度的抗FOLR1抗体来孵育。然后，将细胞沉淀，洗涤并且与100μL的FITC缀合的山羊抗小鼠或山羊抗人IgG抗体(如可从例如杰克逊实验室获得，6μg/mL在FACS缓冲液中)孵育1小时。将细胞再次沉淀，用FACS缓冲液洗涤并且再悬浮于含有1％甲醛的200μL PBS中。将样本例如使用具有HTS多孔采样器的FACSCalibur流式细胞仪获取并且使用CellQuest Pro(所有都来自BDBiosciences,San Diego,US)来分析。对于每个样本，输出针对FL1的平均荧光强度(MFI)并且将其在半对数图中针对抗体浓度来绘制以生成结合曲线。将S形剂量反应曲线拟合结合曲线并且EC50值使用程序如具有默认参数的GraphPad Prism v4(GraphPad软件,SanDiego,CA)来计算。EC50值可以用作表观解离常数“Kd”或每个抗体的“KD”的度量。
单克隆抗体可以使用杂交瘤方法，如由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495所述的那些方法来制备。使用杂交瘤方法，将小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物如上所述进行免疫以引发淋巴细胞产生将特异性地结合至免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以进行体外免疫。免疫之后，将淋巴细胞分离并使用例如聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞，然后这些细胞可以从未融合的淋巴细胞及骨髓瘤细胞中被选出。如通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定(例如，放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))所测定产生特异性地针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤可以然后使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)体外培养繁殖或者作为腹水肿瘤在动物体内繁殖。单克隆抗体可以随后从培养基中纯化或如针对多克隆抗体所述从腹水中纯化。
或者，单克隆抗体还可以使用如美国专利4,816,567中所述的重组DNA方法来制备。将编码单克隆抗体的多核苷酸如通过RT-PCR，使用特异性地扩增编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸引物从成熟的B细胞或杂交瘤细胞中分离，并且其序列是使用常规程序来测定。然后将所分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆至适合的表达载体中，所述表达载体当转染至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中时，单克隆抗体是由宿主细胞生成。而且，所需物种的重组单克隆抗体或其片段可以如所述(McCafferty等人,1990,Nature,348:552-554；Clackson等人,1991,Nature,352:624-628；以及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)从表达所需物种的CDR的噬菌体展示文库中分离。
编码单克隆抗体的多核苷酸可以进一步使用DNA重组技术以许多不同的方式被修饰以生成替代的抗体。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以针对以下被取代：1)例如人抗体的那些区域以生成嵌合抗体，或2)非免疫球蛋白多肽以生成融合抗体。在一些实施方案中，恒定区是截短的或被除去以生成单克隆抗体的所需抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一些实施方案中，针对人FOLR1的单克隆抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，治疗性地使用这类抗体以当向人受试者施用时降低抗原性及HAMA(人抗小鼠抗体)反应。
用于工程改造、人源化或表面重构非人或人抗体的方法也可以被使用并且在本领域中是众所周知的。人源化的、表面重构的或类似工程改造的抗体可以具有一个或多个来自以下非人来源的氨基酸残基，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物。这些非人氨基酸残基被经常称为“输入”残基的残基替代，所述输入残基通常取自已知人序列的“输入”可变、恒定或其它结构域。
这类输入的序列可用于降低免疫原性或减少、增加或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或如本领域中已知的任何其它适合的特征。一般说来，CDR残基直接地并最主要涉及对FOLR1结合的影响。因此，部分或全部非人或人CDR序列得以维持，而可变区和恒定区的非人序列可以被人或其它氨基酸替换。
抗体还可任选是人源化抗体、表面重构的抗体、工程改造的抗体或人抗体，其被工程改造同时保留对于抗原FOLR1的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这个目标，人源化(或人)或工程改造的抗FOLR1抗体及表面重构的抗体可以任选地通过分析亲本序列的方法以及各种概念上人源化及工程改造的产物使用亲本的、工程改造的及人源化序列的三维模型来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可利用的并且为本领域技术人员所熟知。说明并展示所选候选免疫球蛋白序列的很可能的三维构象结构的计算机程序是可利用的。通过观察这些展示结果允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原如FOLR1的结合能力的残基。以这种方式，构架(FR)残基可从共有和输入序列中被选出并组合以便获得所需抗体特征，如对于靶标抗原的增加的亲和力。
本发明抗体的人源化、表面重构或工程改造可以使用任何已知方法来进行，如但不限于以下文献中所述的那些方法：Winter(Jones等人,Nature 321:522(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988))；Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993)；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)；Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)；美国专利号5,639,641；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567；PCT/:US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；EP 229246；7,557,189；7,538,195；以及7,342,110，上述文献各自以引用的方式全部并入本文，包括这些文献中所引用的参考文献。
在某些替代的实施方案中，FOLR1的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域中已知的各种技术直接制备。可以生成体外免疫或从产生针对靶标抗原的抗体的免疫个体分离的永生化的人B淋巴细胞(参见，例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boemer等人,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；以及美国专利5,750,373)。而且，人抗体可以选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达人抗体，如例如Vaughan等人,1996,Nat.Biotech.,14:309-314，Sheets等人,1998,Proc.Nat'l.Acad.Sci.,95:6157-6162，Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381，以及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581中所述。用于生成和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利号5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；及7,264,963；以及Rothe等人,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(每个文献以引用的方式全部并入)中。亲和力成熟策略及链改组策略(Marks等人,1992,Bio/Technology 10:779-783，全部以引用的方式并入)在本领域中是已知的并且可以被用于生成高亲和力的人抗体。
人源化抗体还可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备，所述转基因小鼠能够在免疫后在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生全套人抗体。这种方法描述于美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；以及5,661,016中。
本发明还包括特异性地识别人叶酸受体1的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性地识别并结合至少两个不同表位的抗体。不同的表位可以在相同的分子(例如，相同的人叶酸受体1)内或在不同分子上，例如，抗体可以特异性地识别并结合人叶酸受体1以及例如1)白细胞上的效应分子如T细胞受体(例如，CD3)或Fc受体(例如，CD64、CD32或CD16)或2)如下详细描述的细胞毒性剂。
示例性双特异性抗体可以结合至两个不同表位，其中至少一个来源于本发明的多肽。或者，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合至白细胞上的触发分子如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体的臂组合以便将细胞防御机制集中于表达具体抗原的细胞。双特异性抗体还可以用于使细胞毒性剂针对表达具体抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂以及结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。用于制备双特异性抗体的技术在本领域中是常见的(Millstein等人,1983,Nature305:537-539；Brennan等人,1985,Science 229:81；Suresh等人,1986,Methods inEnzymol.121:120；Traunecker等人,1991,EMBO J.10:3655-3659；Shalaby等人,1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruber等人,1994,J.Immunol.152:5368；以及美国专利5,731,168)。具有二价以上的抗体也可以考虑。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991))。因此，在某些实施方案中，FOLR1的抗体是多特异性的。
在某些实施方案中，提供一种抗体片段以例如增加肿瘤穿透。已知用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段经由蛋白水解消化完整的抗体而获得(例如Morimoto等人,1993,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；Brennan等人,1985,Science,229:81)。在某些实施方案中，抗体片段是重组产生的。Fab、Fv以及scFv抗体片段可以全部在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达并且由其分泌，由此允许产生大量这些片段。这类抗体片段还可以从以上所论述的抗体噬菌体文库中分离。抗体片段还可以是线性抗体，如例如美国专利5,641,870中所述，并且可以是单特异性或双特异性的。用于产生抗体片段的其它技术对于本领域技术人员来说显而易见。
根据本发明，技术可适用于产生对人叶酸受体1有特异性的单链抗体(参见美国专利号4,946,778)。另外，方法可适用于构建Fab表达文库(Huse,等人,Science 246:1275-1281(1989))以允许快速并有效的鉴别对叶酸1受体具有所需特异性的单克隆Fab片段、或其衍生物、片段、类似物或同系物。抗体片段可以通过包括但不限于以下的本领域中的技术产生：(a)通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段的二硫桥而生成的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而生成的Fab片段；以及(d)Fv片段。
可能进一步期望的是，尤其在抗体片段的情况下，修饰抗体以便延长其血清半衰期。这可以例如通过借助于抗体片段中适当区域的突变将补救受体结合表位并入抗体片段中或者通过将表位并入肽标签中然后将肽标签融合至抗体片段的末端或中间(例如，通过DNA或肽合成)来实现。
异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体由两个共价结合的抗体构成。这类抗体已经例如打算将免疫细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)。可以预期抗体可使用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的那些)进行体外制备。例如，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的适合试剂的实例包括亚氨基硫醇酯及甲基-4-巯基丁基亚胺酸酯。
出于本发明的目的，应当理解，修饰的抗体可以包含任何类型的可变区，所述可变区提供抗体与人FOLR1多肽的缔合。就此而言，可变区可包括或源自于任何类型的哺乳动物，所述哺乳动物可被诱导发生体液应答并生成针对所需肿瘤相关抗原的免疫球蛋白。因而，修饰的抗体的可变区可以是例如人、鼠、非人灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或狼来源的。在一些实施方案中，修饰的免疫球蛋白的可变区及恒定区两者都是人的。在其它实施方案中，相容的抗体(通常源自非人来源)的可变区可以被工程改造或特别定制以改善分子的结合特性或降低免疫原性。在这方面，适用于本发明中的可变区可以是人源化的或另外通过包含输入的氨基酸序列而被改变。
在某些实施方案中，在重链和轻链中的可变结构域是通过至少部分替换一个或多个CDR并且必要时通过部分构架区替换和序列变化来改变。虽然CDR可以源自与构架区所来源的抗体相同类别或甚至亚类的抗体，但可以设想CDR将源自不同类别的抗体并且在某些实施方案中源自不同物种的抗体。可能不必用来自供体可变区的完整CDR替换所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移到另一个。相反，可能仅需要将维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基转移。考虑到美国专利号5,585,089、5,693,761以及5,693,762中所阐述的说明，通过进行常规实验或通过尝试错误试验来获得具有降低的免疫原性的功能性抗体将在本领域技术人员的能力范围内。
本领域技术人员应当理解，不管可变区如何变化，本发明的修饰的抗体将包括如下抗体(例如，全长抗体或其免疫活性片段)，其中一个或多个恒定区结构域的至少一个部分已经缺失或另外改变以便提供所需的生物化学特征，如当与包含天然或未改变的恒定区、免疫原性大致相同的抗体相比时增强的肿瘤定位或降低的血清半衰期。在一些实施方案中，修饰的抗体的恒定区将包括人恒定区。符合本发明的恒定区的修饰包括插入、缺失或取代在一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸。也就是说，本文所公开的修饰的抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定结构域(CL)中的一个或多个的改变或修饰。在一些实施方案中，涵盖修饰的恒定区，其中一个或多个结构域部分地或全部缺失。在一些实施方案中，修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域已经被除去(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中，去除的恒定区结构域将被短的氨基酸间隔区(例如，10个残基)替换以提供一般由缺失的恒定区所赋予的某些分子柔性。
注意到在某些实施方案中，修饰的抗体可以被工程改造以将CH3结构域直接融合至各个修饰的抗体的铰链区。在其它构建体中，在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间提供肽间隔区可能合乎需要。例如，可以表达相容性构建体，其中CH2结构域已经缺失并且剩余的CH3结构域(修饰或未修饰的)与具有5-20个氨基酸的间隔区的铰链区相连。可添加这类间隔区以例如确保恒定结构域的调控元件保持自由和易接近或者铰链区保持柔性。然而，应当注意，氨基酸间隔区可以在一些情况下被证明是有免疫原性的并且引发针对构建体的不需要的免疫应答。因此，在某些实施方案中，添加至构建体中的任何间隔区将是相对无免疫原性的，或甚至可以完全忽略，以便维持修饰的抗体的所需的生物化学品质。
除缺失完整的恒定区结构域之外，应当理解，本发明的抗体可以通过部分缺失或取代几个或甚至单一氨基酸来提供。例如，在CH2结构域的所选区域中单一氨基酸的突变可足以显著减少Fc结合并且进而增强肿瘤定位。类似地，仅仅缺失一个或多个恒定区结构域中控制有待调控的效应功能(例如，补体C1Q结合)的一部分可能是合乎需要的。恒定区的这类部分缺失可以改善抗体的所选特征(血清半衰期)，而剩下的其它合乎需要的功能与该恒定区结构域完整有关。此外，如上所提及，所公开抗体的恒定区可以经由突变或取代一个或多个增强所得构建体性能的氨基酸来修饰。在这方面，可能破坏由保守的结合位点(例如，Fc结合)所提供的活性，而大体上维持修饰的抗体的构型和免疫原性性能。某些实施方案可以包括将一个或多个氨基酸添加恒定区中以增强合乎需要的特征，如降低或提高效应功能或提供更多细胞毒素或碳水化合物附着。在这类实施方案中，插入或复制源自所选恒定区结构域的特异性序列可能是合乎需要的。
本发明进一步包括与本文所阐述的嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体或其抗体片段大体上同源的变体和等同物。这些可以含有例如保守取代突变，即由类似氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指一个氨基酸被相同一般类别内的另一氨基酸取代，如例如一个酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代、一个碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代或一个中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中众所周知的。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，包括针对人FOLR1的抗体或其片段。在本领域中将公认的的是本发明的一些氨基酸序列可以在不显著影响蛋白质的结构或功能的情况下变化。因此，本发明进一步包括多肽的变化形式，其显示实质活性或包括针对人叶酸受体蛋白的抗体或其片段的区域。这类突变体包括缺失、插入、倒位、重复以及类型取代。
所述多肽及类似物可以进一步被修饰以含有通常不是蛋白质部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可以改善所述蛋白质的溶解性、生物半衰期或吸收。所述部分还可以降低或消除蛋白质的任何不合需要的副作用等等。那些部分的综述可见于REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES,第20版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)中。
本文所述的分离多肽可以通过本领域中已知的任何适合的方法产生。这类方法的范围是从直接蛋白质合成方法到构建编码分离多肽序列的DNA序列以及在适合的转化宿主中表达那些序列。在一些实施方案中，DNA序列通过分离或合成编码目标野生型蛋白质的DNA序列使用重组技术构建。任选地，所述序列可以通过位点特异性诱变被诱变以提供其功能性类似物。参见，例如Zoeller等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81:5662-5066(1984)以及美国专利号4,588,585。
在一些实施方案中，编码目标多肽的DNA序列将使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建。这类寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列并且选择那些在其中将产生目标重组多肽的宿主细胞中有利的密码子来设计。标准方法可以应用于合成编码目标分离多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可用于构建反向翻译的基因。此外，可以合成含有编码具体的分离多肽的核苷酸序列的DNA低聚物。例如，可以合成编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸并且然后连接。单个寡核苷酸通常含有用于互补装配的5'或3'突出。
一旦装配(通过合成、定点诱变或另一方法)，编码具体的目标分离多肽的多核苷酸序列就将被插入表达载体中并且可操作地连接至适于在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。适当的装配可以通过核苷酸测序、限制性图谱以及在适合的宿主中表达生物活性多肽来确认。如本领域中众所周知的，为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，所述基因必须可操作地连接至在所选的表达宿主中起作用的转录及翻译表达控制序列。
在某些实施方案中，重组表达载体用于扩增和表达编码针对人FOLR1的抗体或其片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码抗FOLR1抗体的多肽链或其片段的合成的或源自cDNA的DNA片段，所述DNA片段与源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调控元件可操作地连接。转录单位一般包含具有以下的装配物：(1)具有基因表达调控作用的遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)被转录成mRNA并且翻译成蛋白质的结构或编码序列，以及(3)适当的转录及翻译起始和终止序列，如下文所详细描述。这类调控元件可以包括操纵子序列来控制转录。另外可以并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力以及促进识别转化体的选择基因。DNA区当其在功能上彼此相关时被可操作地连接。举例来说，信号肽(分泌性前导序列)的DNA可操作地连接至多肽的DNA，如果所述信号肽被表达为参与所述多肽的分泌的前体；启动子可操作地连接至编码序列，如果所述启动子控制序列的转录；或核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果所述核糖体结合位点被定位成允许翻译。旨在用于酵母表达系统中的结构元件包括能够使翻译的蛋白质通过宿主细胞进行细胞外分泌的前导序列。或者，当重组蛋白在无前导或转运序列的情况下表达时，其可以包括N端甲硫氨酸残基。这个残基可以任选地随后从表达的重组蛋白中裂解以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以采用广泛多种表达宿主/载体组合。用于真核宿主的有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物、更宽宿主范围的质粒，如M13及丝状单链DNA噬菌体。
用于表达FOLR1结合多肽或抗体(或用作抗原的FOLR1蛋白)的适合的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或杆菌。高级真核细胞包括如下所述的确立的哺乳动物起源的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。供细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主使用的适当克隆和表达载体是由Pouwels等人(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)描述，其相关公开内容特此以引用的方式并入。关于蛋白质产生(包括抗体产生)方法的附加信息可见于例如美国专利公布号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501以及国际专利公布号WO 04009823中，每个专利特此以引用的方式全部并入本文。
还有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以进行哺乳动物细胞中重组蛋白的表达，因为这类蛋白一般被正确地折叠、适当地修饰并且完全起作用。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由Gluzman所述(Cell 23:175,1981)的猴肾细胞的COS-7系以及其它细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件如复制起点、连接至待表达的基因的适合的启动子及增强子、及其它5'或3'侧翼非转录序列、及5'或3'非翻译序列，如必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统是由Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)综述。
由转化的宿主产生的蛋白质可以根据任何适合的方法纯化。这类标准方法包括色谱法(例如，离子交换、亲和力以及定大小柱色谱法)、离心、差别溶解性或通过任何其它用于蛋白质纯化的标准技术。亲和力标签如六组氨酸、麦芽糖结合结构域域、流感包衣序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以连接于蛋白质上以允许通过适当的亲和柱来容易地纯化。分离的蛋白质还可以使用如蛋白水解、核磁共振以及x-射线晶体学的技术在物理上进行表征。
例如，来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液可以使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元来首先浓缩。浓缩步骤之后，可将浓缩物施加到适合的纯化基质。或者，可以采用阴离子交换树脂，例如具有悬垂的二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或通常用于蛋白质纯化中的其它类型。或者，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括各种不溶性基质，其包含磺丙基或羧甲基基团。最后，可以采用一个或多个采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有悬垂甲基或其它脂族基团的硅胶)的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)步骤来进一步纯化FOLR1结合剂。还可以采用呈各种组合形式的一些或所有前述纯化步骤来提供同源重组蛋白。
在细菌培养物中产生的重组蛋白可以例如通过从细胞沉淀中初始提取，然后进行一个或多个浓缩、盐析、水相离子交换或尺寸排阻色谱法步骤来分离。可以采用高效液相色谱法(HPLC)用于最终纯化步骤。在重组蛋白的表达中使用的微生物细胞可以通过包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞溶解剂的任何便利方法来破碎。
用于纯化抗体及其它蛋白质的本领域中已知的方法还包括例如在美国专利公布号2008/0312425、2008/0177048及2009/0187005中描述的那些，每个专利特此以引用的方式全部并入本文。
IV.多核苷酸
在某些实施方案中，本发明包括多核苷酸，所述多核苷酸包括编码特异性地结合人FOLR1受体的多肽或这类多肽的片段的多核苷酸。例如，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码人FOLR1的抗体或编码这类抗体的片段的核酸序列。本发明的多核苷酸可以呈RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成DNA；并且可以是双链或单链的，并且如果是单链，那么可以是编码链或非编码(反义)链。在一些实施方案中，多核苷酸是缺乏一个多内源内含子的cDNA或DNA。
在一些实施方案中，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是重组产生的。
在某些实施方案中，多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，多核苷酸是大体上纯的。在一些实施方案中，多核苷酸是从天然组分中纯化的。
本发明提供一种多核苷酸，其包括编码包含选自由SEQ ID NO:1-40组成的组的序列的多肽的多核苷酸。还提供一种多核苷酸，其编码与SEQ ID NO:1-40具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。
在某些实施方案中，多核苷酸包含融合于与多核苷酸同一阅读框中的成熟多肽的编码序列，所述多核苷酸有助于例如多肽从宿主细胞的表达和分泌(例如，作为分泌序列起作用的前导序列以用于控制多肽从细胞的转运)。具有前导序列的多肽是前蛋白并且可以具有由宿主细胞所裂解的前导序列以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码原蛋白，其是成熟蛋白加上另外的5'氨基酸残基。具有原序列的成熟蛋白是原蛋白并且是无活性形式的蛋白。一旦原序列被裂解，活性的成熟蛋白就保留。
在某些实施方案中，多核苷酸包含融合于与标志物序列同一阅读框中的成熟多肽的编码序列，所述标志物序列允许例如用于纯化编码的多肽。例如，标志物序列在细菌宿主的情况下可以是由pQE-9载体供应的六组氨酸标签以提供对融合至标志物的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时，标志物序列可以是源自流感血球凝集素蛋白的血球凝集素(HA)标签。
本发明进一步涉及编码例如片段、类似物及衍生物的上文所述多核苷酸的变体。
多核苷酸变体可以含有在编码区、非编码区或这两者中的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变编码多肽的特性或活性的变化。在一些实施方案中，核苷酸变体是通过因遗传密码的简并性所致的沉默取代而产生。多核苷酸变体可以由于多种原因而产生，例如以便优化特定宿主的密码子表达(通过细菌宿主如大肠杆菌将人mRNA中的密码子改变成那些优选的)。
还提供包含本文所述的多核苷酸的载体及细胞。
V.检测
当使用夹心ELISA形式时，捕获抗体将是未被标记的。检测抗体将被直接标记或通过添加(在洗掉过量的检测抗体之后)摩尔过量的针对第一抗体的第二标记抗体来间接检测。
用于检测抗体的标记是不干扰FOLR1抗体结合的任何可检测的功能体。适合的标记的实例是那些已知用于免疫测定中的许多标记，包括可以被直接检测的部分，如荧光染料、化学发光及放射性标记；以及如酶的部分，其必须反应或衍生以便被检测。这类标记的实例包括放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、荧光素酶，例如荧光虫荧光素酶及细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶及黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢的酶偶合以氧化染料前体如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉亲和素、生物素/链霉亲和素-β-半乳糖苷酶及MUG、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等。如上所述，荧光检测是一个实例。
可以利用常规方法来将这些标记共价结合至蛋白质或多肽上。例如，偶合剂如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双酰亚胺酸酯、双重氮化联苯胺等可用于用上述荧光、化学发光及酶标记来标记抗体。参见，例如美国专利号3,940,475(荧光分析)及3,645,090(酶)；Hunter等人Nature 144:945(1962)；David等人Biochemistry 13:1014-1021(1974)；Pain等人J.Immunol.Methods 40:219-230(1981)；以及Nygren J.Histochem.和Cytochem.30:407-412(1982)。在某些实施方案中，本文的标记是荧光的以使放大性和敏感性提高到8pg/ml，更优选地带有链霉亲和素-β-半乳糖苷酶的生物素及MUG以放大信号。在某些实施方案中，使用比色标记，例如，其中可检测的抗体是生物素化的并且检测手段是抗生物素蛋白或链霉亲和素-过氧化物酶及3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
这类标记(包括酶)缀合至抗体是对于免疫测定技术领域中的普通技术人员来说标准的操纵程序。参见，例如O'Sullivan等人"Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,"Methods in Enzymology,J.J.Langone和H.Van Vunakis编,第73卷(Academic Press,New York,N.Y.,1981),第147-166页。
在添加最后标记的抗体之后，结合抗体的量是通过以下操作来测定：经由洗涤除去过量的未结合的标记抗体，然后使用适于标记的检测方法测量连接的标记的量并且将所测量的量与生物样本中脱落FOLR1或循环肿瘤细胞上FOLR1的量相关联。例如，在酶的情况下，显色并测量的颜色的量可以是存在的脱落FOLR1或循环肿瘤细胞上存在的FOLR1的量直接测量。具体地说，如果HRP是标记，那么颜色可以使用底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺在450nm吸光度下检测。
VI.循环肿瘤细胞测定
本文所述的抗FOLR1抗体还可在循环肿瘤细胞测定中用于检测FOLR1。循环肿瘤细胞(CTC)是从肿瘤上脱落进入脉管系统中并在血流中循环的细胞。CTC以极低浓度存在于循环中。一般说来，CTC是通过本领域中已知的各种技术从患者血液或血浆中富集。CTC可以使用包括但不限于以下的本领域中已知的方法针对特异性标志物进行染色：基于细胞计量术的方法(例如流式细胞术)及基于IHC的方法。CTC可以针对只有肿瘤细胞才有的蛋白质标志物进行染色，这允许鉴别CTC并且将其与正常血细胞区别开。CTC还可以使用包括但不限于FR1-9和FR1-13的本发明抗体针对FOLR1进行染色。CTC分析还可包括CTC数目和/或FOLR1阳性CTC数目的定量分析。在本发明中，本文所述的FOLR1抗体可用来对从患有癌症的受试者分离的CTC染色以测量CTC中存在的FOLR1。表达FOLR1的CTC的增加可以帮助鉴别受试者患有可能对基于FOLR1的疗法有反应的癌症或允许用FOLR1抗体或免疫缀合物优化治疗方案。CTC FOLR1定量可以提供有关肿瘤阶段、对疗法的反应和/或疾病进展的信息。它可以用作预后、预测或药效学生物标志物。另外，CTC针对包括但不限于FOLR1的具体标志物的染色可以单独或与固体活组织检查样本的另外的肿瘤标志物分析组合用作液体活组织检查。
VII.试剂盒
为方便起见，本发明的测定方法可以试剂盒形式提供。这类试剂盒是包括以下基本要素的包装的组合：(a)第一试剂，其可以是捕获试剂，包含针对人FOLR1的单克隆抗体；和/或(b)第二试剂，其是检测试剂。检测试剂也可以包含FOLR1单克隆抗体，但是还可以包含结合至FOLR1的可检测的(标记或未标记的)抗体。这些基本要素在上文和以下实施例中被定义。
在其中第一试剂和第二试剂是结合至FOLR1的抗体、其抗原结合片段或多肽的一个实施方案中，第一和第二试剂是不同的抗体、其抗原结合片段或多肽。在一个实施方案中，第一试剂结合至与第二FOLR1试剂不同的FOLR1表位。在一个实施方案中，第一试剂或第二试剂都不竞争性地抑制活性剂(例如，包括huMOv19抗体或其抗原结合片段的活性剂)结合至FOLR1。
在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含所述捕获试剂的固体支持物，所述固体支持物可以作为单独的要素提供或者捕获试剂已经被固定在其上。因此，试剂盒中的捕获抗体可以被固定在固体支持物上，或者它们可以被固定在以试剂盒容纳或与试剂盒分开提供的这类支持物上。
在一个实施方案中，所述捕获试剂涂覆在微量滴定板上。检测试剂可以是直接检测的标记抗体或通过针对在不同物种中产生的未标记抗体的标记抗体而检测的未标记抗体。当标记是酶时，试剂盒通常将包括酶所需的底物和辅因子，并且当标记是荧光团时，试剂盒通常将包括提供可检测的发色团的染料前体。当检测试剂是未标记的时，所述试剂盒可以进一步包含用于可检测的抗体的检测手段，如针对未标记的抗体的标记抗体，例如呈荧光检测形式。当标记是酶时，所述试剂盒通常将包括酶所需的底物和辅因子，当标记是荧光团时，所述试剂盒通常将包括提供可检测的发色团的染料前体并且当标记是生物素时，所述试剂盒通常将包括抗生物素蛋白，如抗生物素蛋白、链霉亲和素或缀合至HRP或β-半乳糖苷酶的链霉亲和素以及MUG。
在一个实施方案中，捕获试剂是FOLR1抗体FR1-9并且检测试剂是FOLR1抗体FR1-13。在另一实施方案中，FR1-13是生物素化的。
所述试剂盒通常还含有用于进行测定的说明书和/或FOLR1蛋白或其片段(例如，FOLR1细胞外结构域或FOLR1细胞外结构域以及GPI连接结构域的全部或一部分)作为抗原标准以及其它添加剂如稳定剂、洗涤及孵育缓冲液等。在一个实施方案中，FOLR1抗原标准是FOLR1-Fc免疫粘附素。所述试剂盒还可以包括用于FOLR1表达的检测及评分的说明书。
试剂盒的组分将以预定比率提供，其中各种试剂的相对量适当地变化以提供实质上使测定的灵敏度最大化的试剂在溶液中的浓度。具体地，试剂可以干燥粉末形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其一旦溶解将提供具有适当浓度的试剂溶液以便与待测试的样本组合。
本公开的实施方案可以进一步通过参考以下非限制性实施例来定义，所述实施例详细描述本公开的某些抗体的制备以及使用本公开的抗体的方法。对于本领域技术人员来说显而易见的是，对材料和方法的许多修改可以在不偏离本公开范围的情况下实践。
实施例
应当理解，本文所述的实施例及实施方案仅为了说明性目的并且鉴于此的各种修改或变化将会被本领域技术人员想到并且将包括在本申请的精神及范围内。
实施例1
鼠抗FOLR1抗体的开发
存在两种不同的免疫/筛选系列。在第一系列中，用大约5×106个表达FOLR1的KB细胞(American Tissue Culture Collection,ATCC CCL-17)对小鼠进行皮下免疫。在第二系列中，将在其表面上表达人FOLR1的300-19细胞用于免疫小鼠。为了制备这些细胞，从NCBI网站(登记NP_057937)获得人FOLR1氨基酸序列，然后对其进行密码子优化并且通过Blue Heron生物技术来合成，侧接EcoRI和Xba1限制酶切位点以便于克隆至pSRa哺乳动物表达载体中。将300-19细胞，即一种源自Balb/c小鼠的前B细胞(Reth等人,Nature,317:353-355(1985))用pSRa-FolR1表达质粒转染以便在细胞表面上稳定表达高水平的人FOLR1。将本领域技术人员已知的标准免疫方案(例如像ImmunoGen,Inc.所使用的那些)应用于两个系列中。免疫的小鼠为杂交瘤生成而处死之前3天用抗原加强。根据标准动物方案收集来自小鼠的脾脏，例如在两个无菌的磨砂显微镜载玻片之间磨碎组织以获得于RPMI-1640培养基中的单一细胞悬浮液。将脾细胞离心，沉淀，洗涤并且使用聚乙二醇-1500(Roche 783 641)与鼠骨髓瘤如例如P3X63Ag6.653细胞(Kearney等人,J.Immunol.,123:1548-1550(1979))融合。将融合的细胞再悬浮于含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶(HAT)(Sigma H-0262)的RPMI-1640选择培养基中并且在37℃和5％CO2下在96孔平底培养板(Corning-Costar 3596，0.2ml细胞悬浮液/孔)中针对生长进行选择。孵育5天之后，将0.1ml培养上清液从每个孔中除去并且替换为含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶(HT)补充物(SigmaH-0137)的0.1ml RPMI-1640培养基。继续在37℃和5％CO2下孵育直到已为抗体筛选准备好杂交瘤克隆。还可以使用免疫及杂交瘤产生的其它技术，包括在Langone等人(编,"Immunochemical Techniques,Part I",Methods in Enzymology,Academic Press,第121卷,Florida)以及Harlow等人("Antibodies:A Laboratory Manual"；Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1988))中描述的那些。
实施例2
杂交瘤筛选和选择
将用人FOLR1转染的FOLR1-300-19细胞及KB细胞相应地用于第一及第二系列的筛选。对来自杂交瘤的培养上清液针对小鼠单克隆抗体的分泌通过流式细胞术进行筛选，所述单克隆抗体结合至FOLR1阳性细胞如表达FOLR1的300-19细胞或KB细胞，而不结合至FOLR1阴性细胞如非转染的300-19细胞。将0.1ml杂交瘤上清液在0.1ml FACS缓冲液(补充有2％正常山羊血清的RPMI-1640培养基)中与FOLR1阳性细胞或非转染的300-19细胞(每份样本1×105个细胞)孵育3小时。然后，将细胞离心，沉淀，洗涤并且与0.1mlPE缀合的山羊抗小鼠IgG-抗体(如可从例如杰克逊实验室获得，6μg/mL，在FACS缓冲液中)孵育1小时。将细胞再次离心，沉淀，用FACS缓冲液洗涤并且再悬浮于含有1％甲醛的0.2ml PBS中。将细胞相关的荧光使用具有HTS多孔采样器的FACSCalibur流式细胞仪或FACS阵列流式细胞仪进行测量并且使用CellQuest Pro(所有都来自BD Biosciences,San Diego,US)来进行分析。将阳性杂交瘤克隆通过有限稀释进行亚克隆。通过流式细胞术将显示与亲本细胞相同的针对FOLR1的反应性的来自每个杂交瘤的一个亚克隆选出用于后续分析。培养稳定的亚克隆并且使用商用的同种型试剂(Roche 1493027)鉴别每种所分泌的抗FOLR1抗体的同种型。鼠抗体是如上所述从澄清的杂交瘤培养基中纯化的蛋白A。这些抗体被称作FR-1抗体。
一个克隆，muFR1-13被鉴别为以下抗FOLR1克隆：(1)不竞争或阻碍Mov19同时结合至相同抗原，以及(2)如通过常见的流式细胞术技术所证明对靶标具有高结合特异性(图2A和2B)。这两个特征是这种测定的开发过程中所必需的，并且因此克隆muFR1-13被选出用于所述测定中。
从剩余的64个抗FOLR1克隆板来看，第二抗体是保持muFR1-13所必需的相同标准的测定所需要的。另外，第二抗体不能竞争或阻碍muFR1-13同时结合至相同抗原(即Mov19、muFR1-13以及最终的克隆必须具有完全明显分离的表位)。为了满足这些条件，对65个抗叶酸克隆的剩余板进行一系列竞争ELISA实验(图3A)。如果抗体与被检测的抗体共享相同或空间上类似的表位，那么观察到信号的减少(图3B)。使用这种方法，64个所测试的抗体中有5个被鉴别为具有与Mov19竞争的表位，且因此将其从进一步的考虑中除去。
重复相同的方法，用muFR1-13缀合的生物素取代Mov19缀合的生物素(图4)。使用这种方法，6个另外的克隆被鉴别为具有与muFR1-13竞争的表位，且因此将其从进一步的考虑中除去。在剩余的53个克隆中，还有13个克隆显示具有较差的亲和力并且将其排除而不加以考虑。
如图1所示使用类似的ELISA形式筛选剩余的40个克隆。或者将40个克隆代替图中的muFR1-9涂覆在测定板上，并且如图5中所示分析所得结合曲线。含有最低一半最大反应(EC50)的抗体被认为具有对FOLR1的最高结合特异性，且因此被选出作为用于测定的首要候选物。一旦新的更高质量的材料可供用于测试，在这种方法中所测定的最高4个克隆的结合亲和力则是在约1-5×10-9M的范围内。
实施例3
鼠单克隆抗体纯化
抗体是使用标准方法，例如像蛋白A或G色谱法(HiTrap蛋白A或G HP,1mL,Amersham Biosciences)从杂交瘤亚克隆上清液中纯化。简言之，通过添加1/10体积的1MTris/HCl缓冲液(pH 8.0)为色谱法准备上清液。将pH被调整的上清液经由0.22μm滤膜过滤并且上样至用结合缓冲液(PBS，pH 7.3)平衡的柱上。用结合缓冲液洗涤柱直到获得稳定的基线，其中在280nm下无吸光度。用含有0.15M NaCl的0.1M乙酸缓冲液(pH 2.8)使用0.5mL/min的流速洗脱抗体。收集大约0.25mL的洗脱份并且通过添加1/10体积的1M Tris/HCl(pH8.0)来中和。将峰洗脱份针对1×PBS透析两次过夜并且通过经由0.2μm滤膜过滤来灭菌。纯化的抗体是通过在A280下的吸光度来定量。
实施例4
通过流式细胞术的结合表征
结合特异性是使用纯化抗体通过流式细胞术来测试。将每个抗体在0.1ml FACS缓冲液(补充有2％正常山羊血清的RPMI-1640培养基)中与表达FOLR1的300-19细胞或非转染的300-19细胞(每份样本1×105个细胞)孵育3小时。然后，将细胞沉淀，洗涤并且与0.1ml的FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(如可从例如杰克逊实验室获得，6μg/mL在FACS缓冲液中)孵育1小时。将细胞再次沉淀，用FACS缓冲液洗涤并且再悬浮于含有1％甲醛的200μL PBS中。将样本使用具有HTS多孔采样器的FACSCalibur流式细胞仪或FACS阵列流式细胞仪获取并且使用CellQuest Pro(所有都来自BD Biosciences,San Diego,US)来分析。抗FOLR1抗体的FACS直方图显示荧光偏移，而亲本300-19细胞则没有。而且，当任何一个细胞系仅与单独FITC缀合的山羊抗人IgG抗体孵育时，没有检测到明显的荧光偏移。
实施例5
muFR1-9和FR1-53的VL和VH区的克隆以及测序
总细胞RNA是使用RNeasy试剂盒(QIAgen)根据制备商方案从5×106个杂交瘤细胞中制备。cDNA随后使用SuperScript II cD NA合成试剂盒(Invitrogen)从总RNA合成。用于在源自杂交瘤细胞的cDNA上的第一轮简并PCR反应的程序是基于以下文献中所述的方法：Wang等人(2000)J Immunol Methods.1月13日；233(1-2):167-77)以及Co等人(1992)JImmunol.2月15日；148(4):1149-54))。VH序列是使用以下简并引物通过PCR来扩增：EcoMH1CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQ ID NO:45)、EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQ ID NO:41)以及BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO:42)。VL序列是使用以下简并引物通过PCR来扩增：SacIMKGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQ ID NO:43)及HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO:44)。(混合碱基定义如下：N＝G+A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T)。
然后将PCR反应混合物在1％低熔点的琼脂糖凝胶上电泳，切下300至400bp条带，使用Zymo DNA微型柱纯化，并且发送给Agencourt Biosciences用于测序。将相应的5'及3'PCR引物用作测序引物以对可变区cDNA从两个方向上测序。VH及VL区的氨基酸序列通过用VectorNTI软件翻译DNA测序结果而获得。
初步的可变区cDNA序列包括源自简并PCR引物而非鼠抗体mRNA的5'端序列，因此与小鼠抗体种系序列的序列比较便于鉴别和除去这些测序人工产物。利用NCBI IgBlast网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索初步的抗体cDNA序列所来源的鼠种系序列，并且将源自引物的5'端序列替换为相应的种系序列。然后将被清理的可变区序列与鼠κ及IgG1恒定区的NCBI参照序列组合(分别是登记AJ294736.1和D78344.1)以装配预期的全长鼠抗体序列。然后计算预期的鼠FR1-9及FR1-53轻链及重链的分子量并且将其与通过液相色谱/质量分光光度分析(LC/MS)所测量的质量相比较。
根据如上所述的方法对鼠FR1-9轻链进行测序的初始工作被证明是不成功的，因此采用替代方法。与FR1-9有关的杂交瘤的轻链序列被用于设计KS77LC前导PCR引物(ttttgagctctggattccagcctccagaggt)以便与FR1-9轻链构架的推定前导序列退火。这个前导引物PCR反应和测序如上所述进行并且产生编码匹配通过LC/MS所测量的FR1-9轻链质量的轻链的完整cDNA序列。
实施例6
FOLR1 Fc融合对照样本
将人叶酸受体1 Fc融合分子作为替代的可溶性抗原来源构建到一般源自人乳的人叶酸结合蛋白中。将在以上免疫实施例中所述的人FolR1 cDNA的氨基末端用EcoRI及Pst1限制性消化从全长序列中切下。这个片段含有编码从N端信号肽到紧邻huFolR1(NCBI登记NM_016731.2)的GPI键合位点上游的残基的233个氨基酸的cDNA。Pst1至BamHI寡核苷酸连接子帮助在pmuFc2ANL-EK哺乳动物表达质粒中与鼠IgG2A铰链、CH2以及CH3抗体恒定区序列(NCBI登记P01863)同框克隆FolR1片段。然后通过在哺乳动物宿主细胞系如HEK-293T或CHO细胞中的瞬时或稳定转染表达人FolR1-Fc融合蛋白。因为475个氨基酸的融合蛋白含有鼠IgG2A恒定区，所以根据如上所述的标准鼠抗体纯化程序纯化分子。
实施例7
脱落抗原ELISA测定
为了确保材料如所期望的那样连续工作，通过本领域中已知的ELISA和流式细胞术方法针对结合对所有抗体进行筛选。使用利用本领域中已知的体外细胞培养技术培养的表达FOLR1的人T47D细胞进行流式细胞术。抗体结合于这些细胞并且在FACScalibur机器上使用山羊抗鼠的Alexa-fluor 488检测抗体间接地检测(图6A-B)。相同的方法被应用于其它抗体，并且已经确定最终所选的抗体FR1-13及FR1-9通过两种方法分别显示大约1-3×10-9M及2-4×10-9的结合亲和力。
重要的是所述测定仅检测FOLR1，而不检测FOLR2或尤其是FOLR3(通常在人血浆中作为脱落蛋白被发现)，因为Mov19仅对FOLR1有特异性。为了确定这点，通过可商购获得的ELISA试剂盒筛选上面的4个克隆(图7A-B)。阳性对照检测抗体显示高于背景的阳性信号，指示检测出FOLR2或FOLR3。剩余的抗体(FR1-9、FR1-53、FR1-62、FR1-64以及Mov19)在测定中不产生信号，且因此不结合至FOLR2或FOLR3。
另外，结合至FOLR1的叶酸的存在可能潜在地遮蔽所选抗体的表位。为了确保所述测定能在人血液中在生理量的叶酸中检测FOLR1，将叶酸与FOLR1标准纯化蛋白预孵育并且添加至测定板中。如图8所示，叶酸的存在与不包含叶酸的阳性对照相比对测定的检测亲和力具有可以忽略的影响。因此，得出结论所述测定可以甚至在结合的叶酸的存在下检测FOLR1。
因为所有上面的4个抗体克隆(FR1-9、53、62或64)都显示不干扰Mov19或FR1-13的结合，并且因为在FOLR2、FOLR3或叶酸的存在下没有观察到不利的结合特性，所以原始64个克隆中的这四个候选物对于在测定中的使用是可行的。在这四个克隆中，可以确定克隆FR1-9及FR1-53与FR1-62及FR1-64相比具有更高的结合亲和力。从其亲代杂交瘤产生FR1-53抗体始终以较差的产率产生并且因此为了便于抗体产生、抗体纯度及单体百分比更高而挑选出克隆FR1-9。
在努力优化测定时，使用系统化方法，其中FR1-9、生物素化的FR1-13、Strp-HRP的浓度及相应的孵育时间是使用FOLR1-Fc融合蛋白作为抗原标准来优化的。FOLR1-Fc融合是huFOLR1与鼠IgG2A铰链、CH2、CH3的融合肽。用于确立优化条件的标准是可再现的信号，其具有高信噪比、在人血浆样本中的最小基质效应、高可重复性及精确性以及最低的检测极限。
更具体地说，通过用muFR1-9以2μg/mL下涂覆测定板并且孵育来进行测定。用非特异性蛋白阻断之后，将样本(包括抗原标准及人血浆样本)添加至测定板中以便孵育。然后洗涤板并且将muFR1-13b检测抗体(2μg/mL)添加至每个孔中。添加摩尔过量的链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(1:5,000)之前再次洗涤板。添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)之前再次洗涤板。TMB与过氧化物酶反应以形成蓝色，其中强度与存在于样本中的FOLR1的量相称。用含酸溶液终止反应，这将颜色转变为黄色。然后在spectramax板读数仪上读取测定以确定每个样本中颜色反应的强度(吸光度)。必要时，使用4PL方程式：Y＝底部+(顶部–底部)/1+10^((LogEC50-X)*Hill斜率，针对所有稀释系列，用Graphpad Prism v5.04软件生成S形剂量-反应(可变斜率)曲线。
为了确定最终ELISA形式的适当性，对人卵巢癌患者血浆与非肿瘤来源的人腹水样本进行测试。在具有腹水但不具有肿瘤的患者中，针对FOLR1的存在对15份样本进行分析。在所有15份样本中通过测定没有检测到FOLR1，并且由于基质效应没有观察到假阳性(图9)。或者，这些腹水样本具有添加至其中的纯化的人FOLR1蛋白，并且进行后续检测。如通过测定所确定的FOLR1蛋白的回收率大于已知添加数量的85％(未图示)。因此，假定在非肿瘤相关人腹水(甚至没有样本的稀释)中不存在干扰蛋白质。
相同的分析在混合的正常人血浆(混合的是n＝10位患者/批)中进行。通过测定没有检测到内源性FOLR1，并且在添加有纯化的huFOLR1-Fc蛋白的非稀释的人血浆样本中没有发现干扰蛋白质(图10)。人卵巢癌血浆样本是由丹纳-法伯癌症研究所(Dana FarberCancer Institute)或麻省总医院(Mass General Hospital)提供。迄今为止所分析的72份样本中有7份样本被鉴别为具有在0.7至30.6nM范围内的可检测水平的FOLR1。这些数据的代表性分析显示于图11中。此处，八份样本中有三份含有可检测水平的FOLR1，对于样本PB105、PB106以及PB109分别显示0.74、0.91以及30.6nM。用于内插来自使用huFOLR1-Fc生成的相关标准曲线的这些数据的方法显示于图12中。
实施例8
循环肿瘤细胞测定
具有变化水平的FOLR1表达的三个细胞系被选为代表高表达(KB)、低表达(OVCAR3)以及无表达(A549)。滴定未标记的FR1-9及FR1-13以及商用的抗FOLR1抗体(“商用的FRA”)，并且使用激光扫描细胞计量术(LSC)检测在所选的细胞系上针对每个抗体确定最佳滴定。荧光被测量为平均荧光强度(MFI)并且显示于图13中。所有三个抗体显示叶酸受体在KB细胞中的表达。针对每个抗体的最佳稀释鉴别如下：对于商用FRA是1:5，对于muFR1-9是1:100并且对于muFR1-13是1:200。在所测试的抗体中，商用抗体给出最佳信号背景比(8.0比4.07(muFR1-9)及4.19(muFR1-13))，但仅muFR1-9显示在OVCAR3细胞中的信号(信号比A549细胞强约30％)。参见图14。
对于包括用IMGN853监测治疗或功效的应用来说，为供CTC测定中的使用而选择的抗体将不会与IMGN853的抗体组分(即huMov19(M9346A))竞争结合至FOLR1。进行竞争测定以确定任何抗体是否与IMGN853抗体竞争结合至FOLR1。对于这些测定，将A549(阴性)及KB(高表达者)细胞用M9346A抗体或媒介物单独处理。然后将细胞洗涤并且用三个抗体中的每一个染色，并且使用LSC分析表达。结果提供于图15中。浅色条(左)代表单独媒介物，并且深色条(右)代表IMGN853处理的细胞。如果存在与治疗剂IMGN853的竞争，那么在KB细胞中深色条(右)将低于浅色条(左)。图15中的结果显示商用的FRA抗体竞争结合IMGN853(FRA信号有约66％下降)，而muFR1-9和muFR1-13抗体不受IMGN853处理的影响。
总而言之，这些结果表明muFR1-9及muFR1-13不与IMGN853竞争，从而使得其成为供在用IMGN853治疗之后监测体液(例如血液或血浆)、循环肿瘤细胞或组织样本中的FOLR1水平的测定中使用的更合乎需要的候选物。另外，muFR1-9更加敏感并且显示检测具有低表达水平的OVCAR3细胞中的表达的独特能力并且是用于这些类型测定的优选候选抗体。
实施例9
检测从NSCLC及卵巢癌患者分离的循环肿瘤细胞(CTC)中的FOLR1
血液样本是从卵巢癌或NSCLC癌症患者中在以下时间点采集：筛选(基线之前最多28天)；基线；周期3之前；以及周期4结束时。CTC是从样本中富集并且针对CK、CD45、核以及FOLR1使用上文实施例8中所述的抗体及稀释物来染色。CTC(即，CK+/CD45-有核细胞)的数目、CK-/CD45-有核细胞的数目、FOLR1在CTC上的表达、CK-/CD45-有核细胞的数目以及FOLR1阳性CTC及CK-/CD45-有核细胞的百分比是通过LSC针对每份样本进行测定。将数据用于确定在IMGN853的I期临床试验期间在不同时间点FOLR1在CTC中的表达水平。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请、因特网站点及登记号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列两者)特此均以引用的方式出于所有目的全部并入，其并入的程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、因特网站点或登记号/数据库序列被具体地并个别地指明以引用的方式并入一样。

Claims (17)

1.一种特异性地结合FOLR1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别包含SEQ ID NO:1、2和3的CDR1、CDR2、CDR3序列的重链可变区以及分别包含SEQ ID NO:13、14和15的CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变区；
(b)分别包含SEQ ID NO:4、5和6的CDR1、CDR2、CDR3序列的重链可变区以及分别包含SEQ ID NO:16、17和18的CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变区；
(c)分别包含SEQ ID NO:7、8和9的CDR1、CDR2、CDR3序列的重链可变区以及分别包含SEQ ID NO:19、20和21的CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变区；以及
(d)分别包含SEQ ID NO:10、11和12的CDR1、CDR2、CDR3序列的重链可变区以及分别包含SEQ ID NO:22、23和24的CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段分别包含选自由以下组成的组的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29；
(b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30；
(c)SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:31；以及
(d)SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是分离的小鼠的、人源化的、嵌合的、表面重构的或人的。
4.一种核酸分子，其编码如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.一种细胞，其产生如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)培养如权利要求5所述的细胞；以及(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体或其抗原结合片段。
7.一种用于检测样本中的FOLR1蛋白的免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含：(a)第一试剂，其中所述第一试剂是如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及(b)第二试剂，其中所述第二试剂是检测试剂。
8.包括特异性结合FOLR1的抗体或其抗原结合片段的活性剂在制备用于治疗癌症患者的药物中的用途，其中所述治疗包括使用如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段来检测取自患者的样本中的升高的FOLR1蛋白水平。
9.包括特异性结合FOLR1的抗体或其抗原结合片段的活性剂在制备用于治疗具有脱落FOLR1蛋白的癌症患者的药物中的用途，其中使用如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段检测脱落FOLR1。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述活性剂包含重链可变区序列为SEQ IDNO:46和轻链可变区序列为SEQ ID NO:48的FOLR1抗体或其抗原结合片段。
11.权利要求10所述的用途，其中所述活性剂包含FOLR1抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含与保藏在美国典型菌种保藏中心(ATCC)的PTA-10772质粒所编码的重链氨基酸序列相同的氨基酸序列以及所述轻链包含与保藏在ATCC的PTA-10774质粒所编码的轻链氨基酸序列相同的氨基酸序列。
12.权利要求10所述的用途，其中所述活性剂包含缀合到细胞毒性剂的FOLR1抗体或其抗原结合片段。
13.权利要求11所述的用途，其中所述活性剂包含缀合到细胞毒性剂的FOLR1抗体或其抗原结合片段。
14.权利要求12所述的用途，其中所述活性剂包含经由可裂解的磺基-SPDB连接子缀合到美登木素生物碱DM4的FOLR1抗体或其抗原结合片段。
15.权利要求13所述的用途，其中所述活性剂包含经由可裂解的磺基-SPDB连接子缀合到美登木素生物碱DM4的FOLR1抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求12所述的用途，其中所述癌症是卵巢癌、子宫内膜癌或腹膜癌。
17.权利要求8所述的用途，其中所述样本是体液样本。
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