KR102643780B1 - 환자 샘플에서 엽산 수용체 1의 검출 방법 - Google Patents

환자 샘플에서 엽산 수용체 1의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플에서 인간 엽산 수용체 1의 검출을 위한 방법 및 키트에 일반적으로 관한 것이다. 인간 엽산 수용체 1의 펩티드가 추가 제공된다.

Description

환자 샘플에서 엽산 수용체 1의 검출 방법
발명의 분야
본 발명의 분야는 샘플에서 인간 엽산 수용체 1(FOLR1)의 검출을 위한 방법 및 키트에 일반적으로 관한 것이다.
발명의 배경
암은 선진국에서 사망의 주요 원인 중 하나이며, 미국에서만 1 백만 명이 넘는 사람들이 암으로 진단 받고, 매년 500,000 명이 사망한다. 전체적으로 3 명 중 1 명 이상은 일생 동안 어떤 형태의 암을 앓을 것으로 추정된다. 200 가지가 넘는 상이한 유형의 암이 있으며, 그 중 4 가지 유형(유방암, 폐암, 결장 직장암 및 전립선암)이 모든 새로운 사례의 절반 이상을 차지한다 (Jemal 외., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).
엽산 수용체-알파 또는 엽산결합 단백질로도 알려져 있는, 엽산 수용체 1 (FOLR1)은 세포의 혈장 막 상에 발현되는 N-당화된 단백질이다. FOLR1은 엽산 및 몇몇 환원된 엽산 유도체에 대해 높은 친 화력을 갖는다. FOLR1은 생리적 엽산, 5-메틸테트라하이드로폴레이트를 세포 내부으로 전달을 매개한다.
FOLR1은 대다수의 난소 암, 뿐만 아니라 많은 자궁암, 자궁내막 암, 췌장암, 신장암, 폐암 및 유방암에서 과발현되며, 정상 조직에서 FOLR1의 발현은 신장 근위 세관(tubules), 폐의 폐포 폐구(alveolar pneumocytes), 방광, 고환, 맥락막망(choroid plexus) 및 갑상선에서 상피 세포의 정점 막으로 제한된다(Weitman SD, 외., Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996); Kalli KR, 외. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). FOLR1의 이러한 발현 패턴은 FOLR1-지향된 암 요법에 대한 바람직한 표적이 된다.
난소암은 일반적으로 진행 단계까지 무증상이기 때문에, 대개 말기 단계에서 진단되며, 현재 이용 가능한 절차, 일반적으로 외과적 감축술(surgical de-bulking) 후, 화학요법적 약물로 치료될 경우 예후가 좋지 않다(von Gruenigen V 외., Cancer 112: 2221-2227 (2008); Ayhan A 외., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007); Harry VN 외., Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). 따라서, 난소암에 대한 보다 효과적인 치료법에 대한 명백한 충족되지 않은 의학적 필요가 존재한다.
방출(shed) FOLR1을 검출하기 위해 사용된 일부 기존 분석은 FOLR1에 특이성이 부족하다. 예를 들면, 일부 분석은 FOLR1과 다른 엽산 수용체 패밀리 구성원 (FOLR2, 3, & 4)간을 구별하지 못하거나, 또는 총 FBP (엽산 결합 단백질)에 대한 값을 보고하지 않는다. 또한, 일부 분석은 엽산을 수용체로부터 분리하기 위해, 인간 샘플 (가령, 혈장)을 가볍게 산 세척 단계로 전처리를 요구한다. 일부 분석 결과는 항체 요법과 진단 항체 사이의 경쟁적 효과로 인해 부정확 할 수도 있습니다. 또한, 시중에서 판매되는 많은 키트는 시약 및 로트-간(lot-to-lot) 안정성 모두에서 전통적으로 신뢰할 수 없다. 이들 키트의 평가 결과는 상당히 혼합된 결과이며, 연구용으로 만 사용된다. 많은 경우에 "매트릭스 효과(matrix effect)"로 인한 위양성(false positives) 가능성을 줄이기 위해, 분석전 사람 샘플을 미리 희석하는 것을 요구한다. 더욱이, 많은 현재 분석, 예를 들어 ELISA-기반 분석은 생리 학적 수준에서 방출 FOLR1의 변이를 구별할 정도의 충분한 감도를 제공하지 않으며, 위양성 결과로 인해 제한된다. 따라서, 환자 샘플에서 FOLR1을 검출하는 매우 감도가 높고, 정확한 방법이 명백히 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 샘플에서 FOLR1 검출 방법을 제공하고, 예를 들면, 샘플에 있는 인간 FOLR1 수준을 정량화하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 샘플에 있는 인간 엽산 수용체 1 (FOLR1)를 검출하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 고형 지지체에 결합된 면역 포획 시약으로 전술한 엽산 수용체 1 (FOLR1)을 포획하고; (b) 상기 고형 지지체로부터 FOLR1을 용리시키고; (c) 상기 용리된 FOLR1을 절단하고(digesting); 그리고 (d) 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC/MS) 분석을 상기 절단된 FOLR1에서 실행하고, 이때 전술한 FOLR1은 최소한 하나의 특징적(signature) FOLR1 펩티드의 크로마토그래피 분리 및 질량 분석적 반응을 모니터링함으로써 검출된다.
한 구체예에서, 상기 샘플내 FOLR1 수준은 LC/MS 분석에 의해 정량화된다. 한 구체예에서, 상기 샘플내 FOLR1 수준은 상기 샘플내 FOLR1 수준을 FOLR1의 참조 수준에 비교함으로써 정량화된다.
한 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 한 구체예에서, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 IMGN853의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않는다. 한 구체예에서, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 huMov19의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않는다. 한 구체예에서, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 제 2 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않고, 이때 상기 제 2 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 59의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 60의 VL CDR-2; 서열 번호: 61의 VL CDR-3; 서열 번호: 62의 가변 중쇄 (VH) CDR-1; 서열 번호: 64의 VH CDR-2; 그리고 서열 번호: 65의 VH CDR-3. 한 구체예에서, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 제 2 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않고, 이때 상기 제 2 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 56의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH), 그리고 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 58의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)을 포함한다. 한 구체예에서, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 제 2 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않고, 이때 상기 제 2 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: (i) American Type Culture Collection (ATCC)에 PTA-10772로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 중쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 (ii) ATCC에 PTA-10774로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 경쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 한 구체예에서, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 엽산의 결합에 의해 억제되지 않는다.
한 구체예에서, 상기 항체는 muFR1-9이다. 한 구체예에서, 상기 항체는muFR1-13이다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 1의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 2의 VH CDR-2; 서열 번호: 3의 VH CDR-3; 서열 번호: 13의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 14의 VL CDR-2, 그리고 서열 번호: 15의 VL CDR-3. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 4의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 5의 VH CDR-2; 서열 번호: 6의 VH CDR-3; 서열 번호: 16의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 17의 VL CDR-2, 그리고 서열 번호: 18의 VL CDR-3.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 25의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 25의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 26의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 26의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 25의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 26의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 33의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 37의 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 34의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 38의 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 약 1.0 nM 내지 약 10 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 약 0.5 nM 내지 약 5 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합한다.
한 구체예에서, 상기 고형 지지체는 질량 분석적면역분석 (MSIA) 마이크로컬럼(microcolumn)을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 고형 지지체는 자성 비드를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 고형 지지체로부터 FOLR1를 용리시키기 전, 최소한 하나의 세척 단계가 실행된다. 한 구체예에서, FOLR1을 상기 고형 지지체로부터 용리시키기 전, 2회 또는 그 이상의 세척 단계가 실행된다. 한 구체예에서, 상기 세척 단계는 상기 고형 지지체에 결합된 FOLR1에 세척 완충액, 염 용액, 및 계면활성제로 접촉시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, FOLR1는 상기 고형 지지체로부터 산성 용액에 의해 용리된다.
한 구체예에서, FOLR1은 FOLR1을 절단하기 전, 환원되고, 알킬화된다. 한 구체예에서, FOLR1은 트립신/Lys-C로 절단된다. 한 구체예에서, FOLR1의 절단으로 서열 번호: 42의 서열을 포함하는 펩티드가 생성된다. 한 구체예에서, FOLR1의 절단으로 서열 번호:43의 서열을 포함하는 펩티드가 생성된다. 한 구체예에서, FOLR1의 절단으로 서열 번호: 44의 서열을 포함하는 펩티드가 생성된다. 한 구체예에서, FOLR1의 절단으로 서열 번호: 45의 서열을 포함하는 펩티드가 생성된다.
한 구체예에서, FOLR1의 최소한 2개의 특징적 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다. 한 구체예에서, FOLR1의 최소한 3개의 특징적 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다. 한 구체예에서, FOLR1의 최소한 4개의 특징적 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다.
한 구체예에서, 상기 특징적 펩티드는 다음을 포함한다: (a) 서열 번호: 42의 서열을 포함하는 펩티드; (b) 서열 번호: 43의 서열을 포함하는 펩티드; (c) 서열 번호: 44의 서열을 포함하는 펩티드; 그리고 (d) 서열 번호: 45의 서열을 포함하는 펩티드.
한 구체예에서, 상기 샘플은 체액을 포함한다. 한 구체예에서, 상기체액은 혈장이다. 한 구체예에서, 상기 체액은 혈청이다. 한 구체예에서, 상기 체액은 복수액이다.
한 구체예에서, 상기 샘플은 말초 혈액 샘플을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 샘플은 암 환자로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 암은 난소암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 자궁내막암, 췌장암, 신장암, 폐암, 및 복막암으로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 상기 암은 난소암이다. 한 구체예에서, FOLR1 검출은 IMGN853 이 샘플 안에 존재하는 IMGN853에 의해 억제되지 않는다. 한 구체예에서, FOLR1 검출은 이 샘플 안에 존재하는 huMov19에 의해 억제되지 않는다.
한 구체예에서, FOLR1 검출은 이 샘플 안에 존재하는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 59의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 60의 VL CDR-2; 서열 번호: 61의 VL CDR-3; 서열 번호: 62의 가변 중쇄 (VH) CDR-1; 서열 번호: 64의 VH CDR-2; 그리고 서열 번호: 65의 VH CDR-3. 한 구체예에서, FOLR1 검출은 이 샘플 안에 존재하는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 56의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 58의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)을 포함한다. 한 구체예에서, FOLR1 검출은 이 샘플 안에 존재하는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: (i) American Type Culture Collection (ATCC)에 PTA-10772로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 중쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 (ii) ATCC에 PTA-10774로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 경쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
한 구체예에서, FOLR1 검출은 샘플 안에 존재하는 엽산에 의해 억제되지 않는다.
한 구체예에서, 상기 방법은 샘플 안에 최소한 0.5 ng/mL의 FOLR1를 검출할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 샘플 안에 최소한 0.3 ng/mL의 FOLR1를 검출할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 샘플 안에 최소한 0.25 ng/mL의 FOLR1를 검출할 수 있다.
한 구체예에서, 신호 대 잡음비율(signal-to-noise ratio)는 최소한 5이다. 한 구체예에서, 상기 신호-대-잡음 비율은 최소한 10이다.
한 구체예에서, FOLR1은 방출 FOLR1이다.
본 발명은 FOLR1의 신규한 펩티드를 또한 제공한다. 한 구체예에서, 펩티드는 서열 번호: 42의 서열로 구성된다. 한 구체예에서, 펩티드는 서열 번호: 43의 서열로 구성된다. 한 구체예에서, 펩티드는 서열 번호: 44의 서열로 구성된다. 한 구체예에서, 펩티드는 서열 번호: 45의 서열로 구성된다.
본 발명은 샘플 안에 FOLR1을 검출하는 키트를 또한 제공한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 다음을 포함한다: FOLR1에 결합하는 면역포획 시약, 절단(digestion) 시약, 그리고 다음의 군에서 선택된 최소한 하나의 펩티드: a) 서열 번호: 42의 서열을 포함하는 펩티드; b) 서열 번호: 43의 서열을 포함하는 펩티드; c) 서열 번호: 44의 서열을 포함하는 펩티드; 그리고 d) 서열 번호: 45의 서열을 포함하는 펩티드.
한 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 muFR1-9이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 muFR1-13이다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:서열 번호: 1의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 2의 VH CDR-2; 서열 번호: 3의 VH CDR-3; 서열 번호: 13의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 14의 VL CDR-2, 그리고 서열 번호: 15의 VL CDR-3. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 4의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 5의 VH CDR-2; 서열 번호: 6의 VH CDR-3; 서열 번호: 16의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 17의 VL CDR-2, 그리고 서열 번호: 18의 VL CDR-3.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 25의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 25의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 26의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 26의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 25의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 26의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 33의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 37의 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합단편은 서열 번호: 34의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 38의 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 약 1.0 nM 내지 약 10 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 약 0.5 nM 내지 약 5 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합한다.
도 1은 FOLR1 면역포획-LC/MS 분석의 개략도를 나타낸다.
도 2는 대용(surrogate) 매트릭스에서 0.3 ng/mL의 낮은 수준의 가용성 FOLR1을 함유하는 샘플로부터 추출된 이온 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 정적인 인간 혈장샘플로부터 추출된 이온 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 상승된 가용성 FOLR1을 갖는 환자의 사전-투여 샘플로부터 추출된 이온 크로마토그램을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 환자 샘플 안에서 인간 엽산 수용체1 (FOLR1)을 검출하는 신규한 방법을 제공한다. FOLR1의 초기 면역포획 단계가 수행된 후, 포획된 FOLR1을 펩티드로 분해하고, 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC/MS)을 통한 펩티드의 정량적 분석이 이어진다. FOLR1에 대한 항-FOLR1 활성제 (예를 들어, 항체 huMov19, 예컨대, IMGN853을 포함하는 활성제)의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 항체는 본 발명의 면역포획 단계에서 유용하다. 항-FOLR1 활성제의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 항체는 항-FOLR1 활성제로 치료를 받았던 환자로부터의 샘플에서 FOLR1 (예를 들어, 방출 FOLR1)을 포획하는데 특히 유용하다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 FOLR1의 펩티드가 또한 개시되어있다. 이러한 펩티드는 LC/MS에 의해 환자 샘플에서 FOLR1의 수준을 검출하는데 유용하다. FOLR1-결합제 및 FOLR1 펩티드를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
I. 정의
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어 및 구문이 아래에 정의되어 있다.
본원에서 이용된, 용어 "인간 엽산 수용체 1," "FOLR1" 또는 "엽산 수용체 알파 (FR-α)"는 다른 언급이 없는 한, 임의의 고유의 인간 FOLR1을 지칭한다. 따라서, 이들 용어 모두는 본원에 표시된 단백질 또는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 "FOLR1", 프로세스안된 FOLR1 뿐만 아니라, 상기 세포로부터 가공에 의해 결과된 임의의 형태의 FOLR1을 포괄한다. 이 용어는 자연적으로 발생하는 FOLR1 변이체, 예를 들어 스플라이스(splice) 변이체 (FOLR2, FOLR3 또는 FOLR4를 포함하는 변이체 제외), 대립유전자(allelic) 변이체 및 이소형(isoforms)을 또한 포함한다. 본원에서 기술된 FOLR1 폴리펩티드는 다양한 원천, 이를 테면, 인간 조직 유형 또는 또다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 준비될 수 있다. FOLR1 서열의 예로는 NCBI 참조 번호 P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1, 그리고 NP_057936.1을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 인간 FOLR1 서열은 다음과 같다:
용어 "방출 항원" 및 "방출 FOLR1" ("sFOLR1" 또는 "sFRα")는 본원에서 호환된다. 이들 용어는 가용성이고, 세포와 연합(associated)되지 않은 FOLR1 단백질을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 세포외 도메인 (ECD) 및 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 링커를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방출 FOLR1은 오직 ECD만을 포함한다. FOLR1은 신호 펩티드 (아미노산 1-24) FOLR1 단백질 쇄 (아미노산 25-233 또는 234)와 절단될 수 있는 프로펩티드(아미노산 235 내지 257)를 포함한다. 방출 FOLR은 아미노산 1 내지 257, 1 내지 233, 1 내지 234, 25 내지 233, 25 내지 234 또는 이의 임의의 다른 단편들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 신호 서열은 절단된다. 다른 구체예들에서 ECD 및 GPI 부분은 막 (가령, 가용성 지질 유목부(raft))에 매립될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방출 FOLR1은 아미노산 1-233 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
용어 "항체"는 면역 글로불린 분자의 가변 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 항원 인지 부위를 통하여, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 전술한 것들의 조합과 같은 표적을 인지하고, 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 이용된, 용어 "항체"는 무손상(intact) 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 그리고 항체의 원하는 생물학적 활성을 나타낸다는 전제하에 임의의 기타 변형된 면역 글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 5 가지 주요 부류의 면역글로불린중 하나일 수 있다: 알파, 델타, 입실론, 감마, 그리고 뮤로 차례로 언급되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 정체성(identity)에 근거하여, IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM, 또는 이의 하위부류(동소형)(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2). 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고, 잘 알려진 하위단위(subunit) 구조 및 3-차원 구성을 갖는다. 항체는 네이키드(naked)이거나, 독소, 방사성동위원소 등과 같은 다른 분자에 접합될 수 있다.
용어 "항체 단편"이란 무손상 항체의 일부분을 지칭한다. "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부분을 지칭한다. 항원-결합 단편은 무손상 항체의 항원 결정성 가변 영역을 함유할 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편들, 선형(linear) 항체, 그리고 단일 쇄 항체들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "항-FOLR1 항체" 또는 "FOLR1에 결합하는 항체"란일반적으로 충분한 친화력으로 FOLR1에 결합하는 항체로써, 이 항체(가령, huMov19 (M9346A) 항체)는 FOLR1을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 무관한, 비-FOLR1 단백질에 대한 항-FOLR1 항체의 결합 정도는 예를 들어, 방사선면역분석법 (RIA)에 의해 측정될 때, FOLR1에 대한 이 항체의 결합에 대해 약 10% 미만일 수 있다.
용어 "IMGN853" (미르베투시마브 소라바탄신(mirvetuximab soravtansine)으로도 알려짐)은 huMov19 (M9346A) 항체, sulfoSPDB 링커, 그리고 DM4 메이탄시노이드를 함유하는, 본원에서 기술된 면역접합체(immunoconjugate)를 지칭한다. 서열 번호: 56-58의 폴리펩티드는 차례로 huMov19 (M9346A)의 중쇄 가변 도메인, 가변 도메인 경쇄 버젼 1.00, 그리고 huMov19의 가변 도메인 경쇄 버젼 1.60을 포함한다. 특정 구체예들에서, huMov19 (M9346A) 항체는 서열 번호:56의 가변 중쇄 서열 및 서열 번호:58의 경쇄 가변 서열(huMov19의 버젼 1.60)을 포함하는 항-FOLR1 항체다. DM4는 N2'-데아세틸-N2'-(4-멀캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)메이탄신을 지칭한다. "SulfoSPDB"는 N-숙시니미딜 4-(2-피리딜디티오)-2-술포부타노메이트) 링커를 지칭한다. 특정 구체예들에서, huMov19 (M9346A) 항체는 Budapest Treaty에 근거하여, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110에 위치한 American Type Culture Collection (ATCC)에 2010년 4월 7일자로 기탁되어, ATCC 기탁 번호 PTA-10772 및 PTA-10773 또는 10774를 갖는 플라스미드에 의해 인코드된다. 하기 서열 정보는 huMov19의 상보성 결정 영역 (CDRs), 가변 중쇄 및 경쇄, 그리고 온전한 중쇄 및 경쇄를 제공한다:
huMov19 가변 중쇄 (서열 번호: 56)
huMov19 가변 경쇄 버젼1.00 (서열 번호: 57)
huMov19 가변 경쇄 버젼 1.60 (서열 번호: 58)
huMov19 가변 경쇄 CDR1 (서열 번호: 59)
huMov19 가변 경쇄 CDR2 (서열 번호: 60)
huMov19 가변 경쇄 CDR3 (서열 번호: 61)
huMov19 가변 중쇄 CDR1 (서열 번호: 62)
huMov19 가변 중쇄 CDR2-Kabat 정의 (서열 번호: 63)
huMov19 가변 중쇄 CDR2-Abm 정의 (서열 번호: 64)
huMov19 가변 중쇄 CDR3 (서열 번호: 65)
huMov19 중쇄 아미노산 서열 (서열 번호: 66)
huMov19 경쇄 버젼 1.00 아미노산 서열 (서열 번호: 67)
huMov19 경쇄 버젼 1.60 아미노산 서열 (서열 번호: 68)
본원에 사용 된 용어 "면역접합체"또는 "접합체"는 세포 결합제 (즉, 항-FOLR1 항체 또는 이의 단편)에 연계된 화합물 또는 이의 유도체를 나타내며, 다음의 일반식으로 정의된다: C-L-A, 이때 C = 세포독소, L = 링커, 그리고 A = 항체 또는 이의 항원-결합 단편 가령, 항-FOLR1 항체 또는 항체 단편. 면역 접합체는 또한 상기 일반식의 역순으로 정의될 수 있다:A-L-C.
"링커"는 화합물, 일반적으로 약물 (예: 메이탄시노이드)을 세포 결합제 (예: 항 FOLR1 항체 또는 이의 단편)에 안정적이고, 공유적 방식으로 연결시킬 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성을 유지하는 조건 하에서, 예를 들어 이황화 결합 절단에 영향을 받거나, 또는 실질적으로 저항 일 수 있다. 적합한 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 디설파이드기와 티오에테르기을 포함한다.
"모노클로날" 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일 항원 결정 인자, 또는 에피토프를 매우 특이적으로 인지하고, 결합에 관여하는 동질성(homogeneous) 항체 또는 항원 결합 단편 집단을 지칭한다. 이는 상이한 항원 결정기를 지향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체와 대조된다. 용어 "모노클로날" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 무손상 및 전장 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 일부분을 포함하는 융합 단백질, 그리고 항원 인지 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 더욱이, "모노클로날" 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하이브리도마, 파아지 선별, 재조합 발현 및 이식유전자를 가진 동물을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 임의의 여러 방식으로 만들어진 항체 및 이의 항원 결합 단편을 지칭한다.
용어 "인간화된" 항체 또는 이의 항원-결합 단편이란 특이적 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 작은 비-인간(가령, 뮤린) 서열을 함유하는 이의 단편인 비-인간(가령, 뮤린) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이의 상보성 결정 영역 (CDR)이 비-인간 종(가령, 마우스, 렛, 토끼, 헴스터)의 CDR의 잔기로 대체되고, 원하는 특이성, 친화력, 그리고 능력 ("CDR 접합된")을 갖는 인간 면역글로블린이다(Jones 외., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 외., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 외., Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 경우들에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기들은 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 또는 단편에서 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fv 프레임워크 영역 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형되어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특이성, 친화력, 및/또는 능력을 개선하고, 최적화시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 함유하는 최소한 1개, 전형적으로 2개 또는 3개의 가변 도메인을 포함하지만, FR 모든 영역 또는 실질적으로 모든 영역은 인간 면역글로불린 콘센수스(consensus) 서열의 영역이다. 상기 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로블린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 최소한 일부분, 전형적으로 인간 면역글로블린의 것을 또한 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 만드는데 이용되는 방법의 예로는 U.S. 특허 5,225,539; Roguska 외., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), 그리고 Roguska 외., Protein Eng. 9(10):895-904(1996)에 기술된다. 일부 구체예들에서, "인간화된 항체"는 재포장된(resurfaced) 항체다.
항체의 "가변 영역"이란 단독으로 또는 조합에 의해 이 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변(hypervariable) 영역으로도 알려진 3 개의 상보성 결정 영역 (CDRs)에 의해 연결된 4 개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 각 쇄의 CDRs은 FRs에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDRs과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDRs를 결정하는 데는 최소한 두 가지 기술이 있다: (1) 종-간(cross-species) 서열 변이에 기초한 접근법(가령, Kabat 외., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.), "Kabat"); 그리고 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근법(Al-lazikani 외, J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). 또한, 때때로 CDRs을 결정하기 위해 당업계에서 이들 두 접근법의 조합이 사용된다.
Kabat 번호매김 시스템은 가변 도메인에서 잔기를 언급할 때 일반적으로 이용된다(경쇄의 대략적으로 잔기 1-107과 중쇄의 잔기 1-113) (가령, Kabat 외., Sequences of Immunological Interest. (5th Ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) ("Kabat").
Kabat, 외에서와 같은 아미노산 위치 번호매김은 Kabat 외의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 번호매 시스템을 지칭한다(Sequences of Immunological Interest. (5th Ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), "Kabat"). 이 번호매김 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR에 상응하는 몇 개의 또는 추가 아미노산, 또는 이보다 짧은 삽입체를 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입 (Kabat에 따라, 잔기 52a)과 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (가령, Kabat에 따라, 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 번호매김은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 번호가 매겨진 서열의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Chothia는 대신 구조 루프(structural loops)의 위치를 나타낸다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kabat 번호매김 규칙을 사용하여, 번호 매겨진 Chothia CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 달라진다 (이것은 Kabat 번호매김 체계가 H35A와 H35B에 삽입을 배치하기 때문이고; 35A 또는 35B가 존재하지 않는다면, 이 루프는 32에서 끝나고; 오직 35A만 존재한다면, 이 루프는 33에서 끝나고; 35A와 35B가 모두 존재한다면, 이 루프는 34에서 끝난다). AbM 초 가변 영역은 Kabat CDRs와 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어가 이용된다
용어 "키메라(chimeric)" 항체 또는 이의 항원 결합 단편이란 아미노산 서열이 2 종 이상의 종으로부터 유래된 경우의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 한 종의 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 렛, 토끼 등)로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 영역에 상응하고, 한편 불변 영역은 다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열과 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 유발하지 않도록 한다.
용어 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정인자(antigenic determinant)"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 특정 항체에 의해 인지되고, 특이적으로 결합될 수 있는 항원 부분을 지칭한다. 상기 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3 차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산과 비-연속 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 유지되지만, 3 차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 형태에서 최소한 3개, 보다 일반적으로는 최소한 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
"결합 친화력"이란 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들면, 항체)와 이의 결합 짝 (예를 들면, 항체) 사이에 비공유 상호작용의 총 강도를 말한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "결합 친화력"이란 결합 쌍의 구성요소들간 (예를 들면, 항체와 항원)에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 명세서에서 설명된 것이 포함된 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은 친화력 항체는 일반적으로 항원을 천천히 결합 시키며 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화력 항체는 일반적으로 항원을 더 빨리 결합시키고 더 오랫동안 결합하는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적인 실시예들이 여기에 설명된다.
또는 결합 친화력을 지칭하기 위해 본원에서 사용될 때 "또는 더 나은(or better)"이란 분자와 이의 결합 파트너 사이의 더 강한 결합을 의미한다. 본원에서 사용될 때, "또는 더 나은"이란 더 작은 수치적 Kd 값으로 표시되는 더 강한 결합을 지칭한다. 예를 들어, "0.6 nM 또는 그 이상"의 항원에 대한 친화력을 갖는 항체, 항원에 대한 항체의 친화도는 <0.6 nM, 즉 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM 등, 또는 0.6 nM 미만의 임의의 값이다. 한 구체예에서, Kd에 의해 측정된 상기 항체의 친화력은 약 10-3 내지 약 10-12 M, 약 10-6 내지 약 10-11 M, 약 10-6 내지 약 10-10 M, 약 10-6 내지 약 10-9 M, 약 10-6 내지 약 10-8 M, 또는 약 10-6 내지 약 10-7 M일 것이다.
항체는 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 어느 정도까지 차단하는 정도로, 당해 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 "경쟁적으로 억제한다"라고 말한다. 경쟁적 억제란 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 분석에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대해 기준 항체의 결합을 최소한 90%, 최소한 80%, 최소한 70%, 최소한 60%, 또는 최소한 50%로 경쟁적으로 억제한다고 말할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "실질적으로 유사(substantially similar)" 또는 "실질적으로 동일한(substantially the same)"라는 문구는 2 개의 수치 값 (일반적으로, 본 발명의 항체와 관련된 하나의 수치와 기준/경쟁 항체와 관련된 다른 하나의 수치) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타내고, 당업자는 두 값 사이의 차이가 전술한 값(가령, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특성의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의도가 거의 없거나 또는 전혀 없다고 간주할 것이다. 예를 들면, 전술한 두 값의 차이는 기준/경쟁 항체의 값에 대한 함수로써, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만일 수 있다.
"단리된(isolated)" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리 뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되지 않는 형태로 정제된 것들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수한다.
본원에서 이용된, "실질적으로 순수한"이란 최소한 50% 순도(가령, 오염물이 없는), 최소한 90% 순도, 최소한 95% 순도, 최소한 98% 순도, 또는 최소한 99% 순도의 물질을 의미한다.
FOLR1의 용어 "증가된 발현"이란 기준 샘플, 기준 FOLR1 수준 또는 동일한 대상체로부터 검출된 기존의 FOLR1 수준과 비교하였을 때, 증가된 수준의 FOLR1 발현을 함유하는 샘플을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 환자 샘플에서 "증가된 FOLR1 단백질 수준"은 암이-아닌 기준 샘플에서 FOLR1 단백질 수준보다 높은 FOLR1 단백질 수준을 가질 수 있다. 환자 샘플에서 "증가된 FOLR1 단백질 수준"은 또한 예를 들어 암성(cancerous) 샘플에서의 FOLR1 단백질 수준과 동일한 FOLR1 단백질 수준을 가질 수 있다.
"기준 샘플"은 시험 샘플로부터 본 발명의 방법에서 얻어진 결과를 관련시켜, 비교하기 위해 사용될 수 있다. 기준 샘플은 세포 (예를 들어, 세포주, 세포 펠릿), 체액 또는 조직일 수 있다. "기준 샘플"에서의 FOLR1 수준은 FOLR1의 절대량 또는 상대량, 양의 범위, 최소량 및/또는 최대량, 평균량 및/또는 중간량일 수 있다. "기준 샘플"은 또한 테스트 샘플과 비교되는 FOLR1 발현의 기준선으로서 기능을할 수 있다. "기준 샘플"은 동일한 환자의 기존 샘플 또는 기선(baseline) 샘플, 정상 기준, 또는 관련 환자 집단으로부터의 기준을 포함할 수 있다. 일반적으로, FOLR1 수준은 표준 곡선의 값으로 표현된다. 표준 곡선은 샘플에서 FOLR1의 농도를 결정하기 위해 분석 데이터를 플로팅(plotting)하는 정량적 방법이다. 한 구체예에서, 기준 샘플은 정제된 FOLR1 또는 FOLR1-Fc를 포함하는 항원 표준이다. 본원에 기술된 검출 방법은 테스트 샘플 안에 있는 FOLR1의 발현 수준과 "기준 값" 또는 "기준 수준"의 비교와 관련될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기준 값은 기준 샘플 안에 있는 FOLR1의 발현 수준이다. 기준 값은 미리 결정된 값일 수 있고, 또한 테스트 샘플과 병행하여 시험된 기준 샘플 (예를 들어, 대조군 생물학적 샘플)로부터 결정될 수도 있다. 기준 값은 중앙값 또는 평균과 같은 단일 컷오프(cut-off) 값이거나, 또는 신뢰 구간(confidence interval)과 같은 값의 범위 일 수 있다. 암에 걸리기 쉬운 개인, 초기 또는 말기 암을 가진 개인, 남성 및/또는 여성 개인, 또는 암 요법을 받는 개인과 같은 다양한 하위그룹의 개인에 대한 기준 값을 설정할 수 있다. 정상적인 기준 샘플 또는 값과 양성 기준 샘플 또는 값의 예가 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 특정 구체예들에서 진핵 유기체와 같은 생물학적 기원의 샘플이다. 바람직한 구체예들에서, 상기 샘플은 인간 샘플이지만, 그러나, 동물 샘플이 본 발명의 실시에 또한 이용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 샘플의 비-제한적 공급원은 예를 들면, 고형 조직, 생검 흡인물, 복수, 유체 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨 생식기관의 외부 단편, 눈물, 타액, 젖, 종양, 기관, 세포 배양물 및/또는 세포 배양 성분을 포함한다. 본 발명은 이용가능한 물질의 양이 적은 복수와 같은 체액을 일반적으로 포함하는 암 샘플에 특히 유용하다. 상기 방법은 상이한 유형의 세포 또는 조직의 비교, 상이한 발달 단계의 비교, 그리고 질병 또는 이상의 존재 및/또는 이들 유형의 탐지 또는 결정을 포함하나, 이에 국한되지 않는 FOLR1의 발현 측면 또는 샘플의 상태를 검사하는데 사용될 수 있다.
본원에서 이용된, 용어 "포획(capture) 시약"이란 샘플 안에 표적 분자에 결합하고, 이를 포획할 수 있는 시약을 지칭하는데, 이때 적합한 조건하에서 포획 시약-표적 분자 복합체는 상기 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있다. 용어 "면역포획 시약"이란 샘플 안에 표적 분자에 결합하고, 이를 포획할 수 있는 면역학적 시약을 지칭하는데, 이때 적합한 조건하에서 포획 시약 표적 분자 복합체는 상기 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 항체 또는 항원-결합 단편이다. 한 구체예에서, 상기 포획 시약 또는 면역포획 시약은 면역고정화된다. 한 구체예에서, 상기 포획 시약 또는 면역포획 시약은 고형 지지체 상에 면역고정화된다.
본원에서 이용된, 용어 "검출가능한 항체"란 검출 수단에 의해 증폭된 표지를 통해 직접적으로, 또는 예를 들어 라벨된 다른 항체를 통해 간접적으로 검출될 수 있는 항체를 지칭한다. 직접 라벨링을 위해, 항체는 전형적으로 일부 수단에 의해 검출 될 수 있는 모이어티에 접합된다. 한 구체예에서, 상기 검출가능한 항체는 바이오티닐화된 항체이다.
본원에서 사용될 때, "라벨(label)"이라는 단어는 "라벨붙은(labeled)" 항체를 생성하기 위해, 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 상기 라벨은 그 자체로 (예를 들어, 방사성동위 원소 라벨 또는 형광 라벨) 검출될 수 있거나, 또는 효소 라벨의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"상관되다" 또는 "상관된"이란 어떤 식으로든 제 1 분석의 성능 및/또는 결과를 제 2 분석의 성능 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들면, 제 2 분석을 수행할 때, 제 1 분석 결과를 사용할 수 있고 및/또는 제 1 분석 결과를 사용하여 제 2 분석을 수행해야 하는지 여부 및/또는 제 2 분석 결과를 제 1 분석 결과를 비교할 수 있다.
"암" 및 "암성(cancerous)"이라는 용어는 세포 집단이 조절불능의 세포 성장을 특징으로 하는 포유 동물의 생리학적 상태을 지칭하거나 또는 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 이러한 암의 더 구체적인 예로는 편평 세포 암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 암종, 복막암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장 직장암, 내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간(hepatic) 암종, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 상기 암은 FOLR1을 발현시키는 암일 수 있다.
"종양 "및 "신생물(neoplasm)"이란 과도한 세포 성장 또는 증식, 예를 들어 전-암성 병변을 포함한, 양성 (비-암성) 또는 악성(암성)의 조직 덩어리를 지칭한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법적 등가물은 비-종양형성 세포 및 종양형성 줄기 세포(암 줄기 세포) 둘 모두를 종양 또는 전-암성 병변으로부터 유래된 세포의 전체 집단을 지칭하는데, 이들은 종양 세포 집단 덩어리를 포함한다. 본원에서 이용된, "종양 세포"라는 용어는 암 줄기 세포로부터 이들 종양 세포를 구별하기 위하여, 재생 및 분화 능력이 결여된 종양 세포만을 언급할 때, "비-종양형성"이라는 용어로 변형될 것이다.
용어 "대상"은 특정 치료를 받는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 및 이와 유사한 것들을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유 동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상" 및 "환자"는 인간 대상과 관련하여 본원에서 호환적으로 사용된다.
"약제학적 제형(formulation)"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없는 독성을 갖는 추가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다. 이러한 제형은 멸균될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체의 "유효량(effective amount)"은 구체적으로 명시된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적으로 그리고 통상적인 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 것으로, 본 명세서에서 호환된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하고; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 컨쥬게이션과 같은 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산을 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함) 및 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 이 정의 안에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체 기반이기 때문에, 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 단일 쇄, 또는 연합된 쇄로 발생될 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질은 비-자연발생적이다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질은 다른 자연적으로 발생되는 성분들로부터 정제된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질은 재조합적으로 만들어진다.
2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 내용에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이란 서열 동일성의 일부로서 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 대응성을 위해 비교되고 정렬될 때 (필요한 경우, 갭을 도입), 동일하거나 특정 비율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 둘 또는 그 이상의 서열 또는 준서열을 지칭한다. 동일성 백분율은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 또는 육안으로 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있다. 서열 정렬 알고리즘의 이러한 비-제한적인 한 가지 예는 Karlin 외, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268에 기술된 알고리즘, Karlin 외., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877에서 변형되고, 그리고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된 (Altschul 외., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402) 알고리즘이다. 특정 구체예들에서, 갭이 끼어있는(Gapped) BLAST는 Altschul 외., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul 외., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)에서 기술된 바와 같이 이용되거나, 또는 Megalign (DNASTAR)는 서열을 정렬시키는데 이용될 수 있는 추가적으로 공개적으로 이용가능한 소프트웨어다. 특정 구체예들에서, GCG 소프트웨어에서 GAP 프로그램을 이용하여 두 뉴클레오티드 간의 동일성 백분율이 결정된다(가령, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 90의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치 이용). 특정 대체 구체예들에서, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘이 편입된 (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 두 아미노산 서열 간에 동일성 백분율을 결정할 수 있다 (가령, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치와 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중치 사용). 대안으로, 특정 구체예들에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Myers 및 Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 예를 들면, ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)을 이용하고, 그리고 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 그리고 갭 패널티 4와 함께, PAM120을 이용하여 동일성 백분율이 결정될 수 있다. 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위한 적절한 매개변수는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예들에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 매개변수들이 이용된다. 특정 구체예들에서, 제 1 아미노산 서열에 대한 제 2 서열 아미노산의 동일성 백분율 "X"는 100 x (Y/Z)로 산출되는데, 이때, Y는 첫 번째와 두 번째 서열의 정렬(육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 정합(matches)으로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Z는 상기 제 2 서열에서 잔기의 총 수를 나타낸다. 제 1 서열의 길이가 제 2 서열보다 긴 경우, 제 1 서열과 제 2 서열의 동일성 백분율은 제 2 서열과 제 1 서열의 동일성 백분율보다 클 것이다.
비-제한적인 예로써, 특정 구체예들에서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드가 기준 서열에 대하여 특정 서열 동일성 백분율 (가령, 최소한 80% 동일한, 최소한 85% 동일한, 최소한 90% 동일한, 그리고 일부 구체예들에서, 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함)을 보유하는 지는 Bestfit 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용하여 결정한다. Bestfit은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)의 국소 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이에서 최상의 상 동성 세그먼트를 찾는다. 특정 서열이 예를 들어, 본 발명에 따른 기준 서열과 95 % 동일한 지를 결정하기 위해, Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 동일성 백분율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고, 기준 서열에서 뉴클레오티드의 총 수의 최대 5 %의 상동성 갭이 허용되도록 매개변수들이 설정된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 2개 핵산 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 육안 검사에 의해 측정될 때, 최대 대응성을 위해 비교되고 정렬될 때, 이들은 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 그리고 일부 구체예들에서 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 특정 구체예들에서, 최소한 약 10개, 약 20개, 약 40-60개 잔기 길이 또는 이 범위의 안의 임의의 값, 또는 60-80개 이상의 더 긴 영역, 최소한 약 90-100개의 잔기, 또는 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 같은 비교되는 서열의 전장에 걸친 서열 또는 실질적으로 동일한 서열의 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다.
"보존적 아미노산 치환"이란 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 당분야에 정의된 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성한 측쇄 (가령, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 예를 들면, 티로신을 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 서열에서 보존적 치환은 이들 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 항원, 가령, FOLR1에 대해 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체의 결합이 없어지지 않는다. 항원-결합을 없애지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 식별하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(가령, Brummell 외., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi 외. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 그리고 Burks 외. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997) 참고).
본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수("a", "an" 및 "the")형은 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다는 것으로 주지되어야 한다.
본 명세서에서 "포함하는"이라는 언어는 구체예들이 기술되는 경우, 그렇지 않으면 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 관점에서 설명된 유사한 구체예들이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
따라서, 구절에서 사용된 용어 "및/또는", 이를 테면 "A 및/또는 B"는 "A와 B", "A 또는 B", "A", 및 "B"를 포함한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 구체예를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
II. FOLR1-결합제
인간 FOLR1에 특이적으로 결합하는 제제는 본 발명의 방법들을 실행하는데 유용하다. 이러한 제제는 본원에서 "FOLR1-결합제"라고 지칭된다. 본 발명의 방법을 실행하는데 유용한 FOLR1-결합제는 가령, WO 2014/036495 및 WO 2015/031815(본원의 참고자료에 이들의 전문이 편입됨)에서 기술된다.
상기 FOLR1-결합제는 muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, muFR1-64, 그리고 FOLR1-2.1("IMGN 353.2-1," "353.2-1," "2.1," 또는 "muFRIHC2-1"로도 지칭됨)의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함하는 제제를 포함한다. CDR 서열 muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, FOLR1-2.1는 다음의 표 1 및 2에서 기술된다.
FOLR1 결합 분자는 muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, muFR1-64, 또는 FOLR1-2.1 ("IMGN 353.2-1," "353.2-1," "2.1," 또는 "muFRIHC2-1"로도 지칭됨)의 CDRs를 포함하는 FOLR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편일 수 있고, 이때 CDR당 최대 4개 (가령, 0, 1, 2, 3, 또는 4)의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
폴리펩티드는 본원에서 기술된 개별 가변 경쇄 또는 가변 중쇄중 하나를 포함할 수 있다. 항체 및 폴리펩티드는 또한 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 모두 포함할 수 있다. 뮤린 muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, 그리고 FOLR1-2.1 (also referred to as "IMGN 353.2-1," "353.2-1," "2.1," 또는 "muFRIHC2-1"로도 지칭됨) 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열은 하기 표 3 및 4에 제공된다.
다음을 포함하는 폴리펩티드가 또한 제시된다: (a) 서열 번호:25-28에 대하여 최소한 약 90% 서열 동일성을 갖고; 및/또는 (b) 서열 번호:29-32에 대하여 최소한 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:25-32에 대하여 최소한 약 95%, 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 번호:25-28에 대하여 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 (b) 서열 번호:29-32에 대하여 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 번호:25-28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 번호:29-32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체이며 및/또는 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 특이적으로 결합하는 뮤린, 키메라, 또는 인간화된 항체다. 특정 구체예들에서, 서열 번호:25-32에 대하여 특정 서열 동일성 백분율을 갖는 폴리펩티드는 오로지 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호:25-32와 상이하다.
폴리펩티드는 본원에서 기술된 개별 경쇄 또는 중쇄중 하나를 포함할 수 있다. 항체 및 폴리펩티드는 경쇄와 중쇄를 모두 포함할 수 있다. 뮤린 muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, 그리고 FOLR1-2.1 ("IMGN 353.2-1," "353.2-1," "2.1," 또는 "muFRIHC2-1"로도 지칭됨) 항체의 경쇄 및 가변 쇄 서열은 하기 표 5 및 6에 제시된다. 특정 구체예들에서, 항-FOLR1 항체는2013년 4월 16일자로 ATCC에 기탁되고, ATCC 기탁 번호 PTA-120197 ("FOLR1-2.1," 또한 "IMGN 353.2-1," "353.2-1," "2.1," 또는 "muFRIHC2-1"로도 지칭됨)을 갖는 하이브리도마에 의해 만들어진 항체다.
다음을 포함하는 폴리펩티드가 또한 제시된다: (a) 서열 번호:33-36에 대하여 최소한약 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 번호:37-40 에 대하여 최소한약 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:33-40에 대하여 최소한 약 95%, 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 번호:33-36에 대하여 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 (b) 서열 번호:37-40에 대하여 최소한 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 (a) 서열 번호:33-36의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 번호:37-40의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체이며 및/또는 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 특이적으로 결합하는 뮤린, 키메라, 또는 인간화된 항체다. 특정 구체예들에서, 서열 번호:33-40에 대하여 특정 서열 동일성 백분율을 갖는 폴리펩티드는 오로지 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 번호:33-40과 상이하다.
특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 huMov19가 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하지 않는다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 IMGN853의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않는다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 huMov19의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않는다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 59의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 60의 VL CDR-2; 서열 번호: 61의 VL CDR-3; 서열 번호: 62의 가변 중쇄 (VH) CDR-1; 서열 번호: 64의 VH CDR-2; 그리고 서열 번호: 65의 VH CDR-3. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 56의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH), 그리고 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 58의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL)을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 FOLR1에 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않으며, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: (i) American Type Culture Collection (ATCC)에 PTA-10772로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 중쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 (ii) ATCC에 PTA-10774로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 경쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드 FOLR1에 엽산의 결합에 의해 억제되지 않는다.
항원에 대한 항체의 친화력 또는 항원항체결합력(avidity)은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 가령, 세포계산법 (유동 세포계산법 포함), 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 또는 방사능면역분석 (RIA), 또는 동역학 (가령, 표면 플라스몬 공명 분광법 (BIACORE™) 분석)에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 직접 결합 분석 뿐만 아니라 경쟁적 결합 분석 포멧이 바로 이용될 수 있다. (예를 들면, Berzofsky, 외., "Antibody-Antigen 상호작용s," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992) 참고; 그리고 본원에 기술된 방법들. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화력은 상이한 조건 (가령, 염 농도, pH, 온도) 하에서 측정될 때 가변적일 수 있다. 따라서, 친화력 및 기타 항원-결합 매개변수 (가령, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 항체 및 항원의 표준화된 용액 그리고 당분야에 공지된 표준화된 완충액, 및 본원에서 기술된 완충액로 이루어진다.
한 측면에서, 결합 분석은 표면에서 FOLR1 항원을 발현시키는 세포 상에서 세포계산법 (가령, 유동세포계산법)을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들면, FOLR1-양성 세포, 이를 테면 SKOV3은 100 μL FACS 완충액 (2% 정상적인 염소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 샘플 당 1 x105 세포를 이용하여, 항-FOLR1 항체 농도를 가변화시키면서 항온처리되었다. 이어서, 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 100 μL의 FITC-접합된 염소-항-마우스 또는 염소-항-인간 IgG-항체와 함께 1 시간 동안 항온처리하였다(이를 테면, FACS 완충액 안에 예를 들면 Jackson Laboratory로부터 구할 수 있는 것의 6 μg/mL). 세포를 다시 펠렛화하고, FACS 완충액으로 세척하고, 1 % 포름알데히드를 함유하는 200μL의 PBS에 재현탁시켰다. 예를 들어, HTS 멀티웰 샘플러(multiwell sampler)와 함께 FACSCalibur 유동 세포계산기를 사용하여 샘플을 획득하고 CellQuest Pro (이들 모두 BD Biosciences, San Diego, US의 제품)를 사용하여 분석하였다. 각각의 샘플에 대해 FL1 (MFI)에 대한 평균 형광 강도를 추출하고, 세미-로그 플롯에서 항체 농도에 대해 플롯팅하여 결합 곡선을 생성하였다. 시그모이드(sigmoidal) 용량-반응 곡선은 결합 곡선에 대하여 피팅하고, EC50 값은 디폴트 매개변수와 함께, GraphPad Prism v4와 같은 프로그램을 사용하여 산출된다(GraphPad 소프트웨어, San Diego, CA). EC50 값은 각각의 항체에 대한 겉보기 해리 상수(apparent dissociation constant) "Kd"또는 "KD"에 대한 척도로 사용될 수 있다.
단일클론 항체는 이를 테면, Kohler and Milstein(1975) Nature, 256:495에서와 같은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 이용하여 준비될 수 있다. 상기 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역접종 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생산을 유도하기 위하여 상기에서 기술된 바와 같이 면역접종된다. 림프구는 시험관내에서 또한 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구를 분리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하고,이어서 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선별될 수 있다. 면역침전, 면역블랏팅 또는 시험관내 결합 분석(가령, 방사능면역분석 (RIA); 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA))에 의해 결정된 바와 같이, 선택된 항원을 특이적으로 지향하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 표준 방법(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 이용하여 시험관내 배양 또는 동물에서 복수 종양과 같이 생체내에서 번식될 수 있다. 상기 모노클로날 항체는 배양 배지로부터 정제되거나, 폴리클로날 항체에서 기술된 바와 같이 복수액으로부터 정제될 수 있다.
대안으로 모노클로날 항체는 U.S. 특허 4,816,567에서 기술된 재조합 DNA 방법을 이용하여 또한 만들어질 수 있다. 모노클로날 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 분리되고, 이의 서열은 통상적인 절차를 사용하여 결정된다. 그 다음 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현벡터 안으로 클론되며, 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역들로블린 단백질을 만들지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질 감염 될 때, 모노클로날 항체는 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 원하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 단편은 (McCafferty 외., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson 외., 1991, Nature, 352:624-628; 그리고 Marks 외., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597)에서 기술된 바와 같이, 원하는 종의 CDRs를 발현시키는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다
모노클로날 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)은 대체 항체를 만들기 위하여 재조합 DNA 기술을 이용하여 상이한 다수의 방식에서 추가 변형될 수 있다. 일부 구체예들에서, 예를 들면, 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인들은 1) 예를 들면, 키메라 항체를 만들기 위하여 인간 항체의 이들 영역에 대신하여, 또는 2) 융합 항체를 만들기 위하여 비-면역글로블린 폴리펩티드에 대해 대체될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 불변 영역은 모노클로날 항체의 원하는 항체 단편을 만들기 위하여 절두되거나(truncated) 또는 제거된다. 가변 영역의 부위-지향된 또는 고-밀도 돌연변이생성을 이용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화력 등을 최적화시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 인간 FOLR1에 대한 모노클로날 항체는 인간화된 항체다. 특정 구체예들에서, 이러한 항체는 인간 대상에게 투여될 때, 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키기 위하여 치료요법적으로 이용된다.
비-인간 또는 인간항체를 공작하거나, 인간화시키거나 또는 재포장하는 방법을 이용할 수 있고, 이들은 당분야에 공지되어 있다. 인간화된, 재포장된 또는 유사하게 공작된 항체는 비-인간, 예를 들어 마우스, 렛, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유 동물인 공급원으로부터의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되는 잔기에 의해 대체되며, 이는 통상적으로 공지된 인간 서열의 "도입" 가변, 불변 또는 기타 도메인으로부터 유래된다.
이러한 도입된 서열은 당업계에 공지된 바와 같이 면역 원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화력, 결합-속도(on-rate), 해리-속도(off-rate), 항원항체결합력, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 강화 또는 변형하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 FOLR1 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다. 따라서, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되는 반면, 가변 영역 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
항체는 또한 선택적으로 인간 FOLR1에 대한 높은 친화력 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 조작된 인간화된, 재포장된, 공작된 또는 인간 항체일 수 있다. 이 목적을 이루기 위하여, 인간화된(또는 인간) 또는 공작된 항-FOLR1 항체 및 재포장된 항체들은 부모의 공작된, 그리고 인간화된 서열의 3-차원 모델을 사용하여, 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 그리고 공작된 생성물을 분석하는 공정에 의해 임의선택적으로 제조될 수 있다. 3-차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3-차원 형태적 구조를 설명하고, 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 가령, 후보 면역글로블린이 이의 항원, 가령, FOLR1에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 프레임워크(FR) 잔기는 콘센수스(consensus) 및 도입된 서열로부터 선택되고 결합되어, 표적 항원 (들)에 대한 증가된 친화력과 같은 원하는 항체 특성이 달성된다.
본원에서 기술된 항체의 인간화, 재포장 또는 공작은 당분야에 공지된 임의의 방법, 이를 테면, Winter (Jones 외., Nature 321:522 (1986); Riechmann 외., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen 외., Science 239:1534 (1988)), Sims 외., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter 외., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta 외., J. Immunol. 151:2623 (1993), Roguska 외., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), Roguska 외., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), U.S. 특허 번호 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT/:US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; W090/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; 그리고 7,342,110, (이들 각각은 본원에서 언급된 참조문헌을 포함하여, 참고자료에 전적으로 편입됨)에서 기술된 것을 포함하나, 이에 국한되지 않은 방법에 의해 실시될 수 있다.
본원에서 기술된 FOLR1에 특이적으로 결합하는 제제는 또한 항체 단편을 포괄한다. 항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술들이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체 (가령, Morimoto 외., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan 외., 1985, Science, 229:81)의 단백질분해성 절단을 통하여 유도된다. 특정 구체예들에서, 항체 단편은 재조합에 의해 만들어진다. Fab, Fv, 및 scFv 항체 단편은 대장균 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고, 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 더 많은 양의 이들 단편의 생산이 허용된다. 이러한 항체 단편은 상기에서 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 또한 단리될 수 있다. 상기 항체 단편은 예를 들면, U.S. 특허 5,641,870에서 기술된 바와 같은 선형 항체일 수 있고, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체는 인간 FOLR1의 폴리펩티드와 항체의 회합을 제공하는 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액 성 반응을 일으키고 원하는 종양 연합된 항원에 대해 면역글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 임의의 유형의 포유 동물을 포함하거나, 또는 이로부터 유래될 수 있다. 이와 같이, 변형된 항체의 가변 영역은 예를 들어, 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크(macaques) 등) 또는 이리(lupine) 기원의 것일 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형된 면역글로블린의 가변 영역과 불변 영역은 인간이다. 다른 구체예들에서, 양립가능한(compatible) 항체의 가변 영역 (보통 비-인간 공급원에서 유래)은 분자의 결합 특성을 개선하거나 분자의 면역원성을 감소시키도록 특이적으로 맞춤화되거나 또는 공작될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 유용한 가변 영역은 도입된 아미노산 서열의 포함을 통해 인간화되거나, 또는 달리 변경될 수 있다.
특정 구체예들에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다에서의 가변 도메인은 하나 또는 그 이상의 CDRs의 최소한 부분적 대체에 의해, 그리고 필요한 경우, 부분적 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화(changing)에 의해 변경된다. CDRs이 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 하위클래스의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDRs는 상이한 클래스의 항체 및 특정 구체예들에서 상이한 종의 항체로부터 유래될 것이라는 것도 상상된다. 하나의 가변 도메인의 항원-결합 능력을 다른 도메인으로 전달하기 위해, 모든 CDRs을 공여체(donor) 가변 영역으로부터의 완전한 CDRs로 대체할 필요는 없다. 오히려, 항원-결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있다. 미국 특허 번호 미국 특허 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762는 일상적인 실험을 수행하거나, 또는 시험 및 오류 시험을 수행함으로써 면역원성이 감소된 기능성 항체를 수득하는 것은 당업자의 능력 내에 속할 것이다.
그럼에도 불구하고 가변 영역에 대한 대안으로, 고유의 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체와 비교할 때, 증가된 종양 국소화 또는 감소된 혈청 반감기와 같은 원하는 생화학적 특성을 제공하기 위해, 본원에서 개시된 변형된 항체들은 불변 영역 도메인의 최소한 하나 또는 그 이상의 분획이 결손되거나 또는 그렇지 않으면 변경된 항체(가령, 전장의 항체 또는 이의 면역반응성 단편들)를 포함할 것이라는 것을 당업자는 인지할 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명에 양립가능한 불변 영역으로의 변형은 하나 또는 그 이상의 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3 개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 또는 그 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전적으로 결손된 변형된 불변 영역이 고려된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 항체는 도메인 결손된 구조체 또는 변이체를 포함하며, 이때 전체 CH2 도메인이 제거되었다 (ΔCH2 구조체). 일부 구체예들에서, 생략된 불변 영역 도메인은 절대적 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 유연성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개의 잔기)로 대체될 것이다.
특정 구체예들에서, 상기 변형된 항체는 해당 변형된 항체의 힌지 영역에 직접적으로 CH3 도메인을 융합시키도록 공작될 수 있음을 주지할 것이다. 다른 구조체에서, 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 양립가능한 구조체들이 발현될 수 있는데, 이때, CH2 도메인이 결실되고, 나머지 CH3 도메인 (변형된 또는 비-변형된)이 5-20개 아미노산 스페이서에 의해 힌지 영역에 결합된다. 이러한 스페이서는 예를 들어, 불변 도메인의 조절 요소들이 자유롭게 접근가능하거나, 또는 힌지 영역의 유연성이 유지되도록 하기 위하여 추가될 수 있다. 그러나, 아미노산 스페이서는 경우에 따라 면역원성이고, 구조체에 대해 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있음을 주지해야 한다. 따라서, 특정 구체예들에서, 구조체에 첨가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 원하는 생화학적 특성을 유지하기 위해 상대적으로 비-면역 원성이거나, 또는 심지어 모두 함께 제거될 것이다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에, 본원에 개시된 항체는 소수 또는 심지어 단일 아미노산의 부분 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, CH2 도메인의 선택된 영역에서 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시켜, 종양 국소화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 조절될 작동체 기능 (예를 들어, 보체 C1Q 결합)을 제어하는 하나 또는 그 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 삭제하는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 이러한 부분적인 결실은 대상 불변 영역 도메인과 관련된 기타 바람직한 기능을 무손상 그대로 유지하면서, 항체 (혈청-반감기)의 선택된 특성을 개선시킬 수 있다. 더욱이, 상기에서 암시한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성된 구조체의 프로파일을 향상시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이와 관련하여, 변형된 항체의 구성 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위 (예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공된 활성을 파괴하는 것이 가능할 수 있다. 특정 구체예들은 작동체 기능의 감소 또는 증가와 같은 바람직한 특성을 향상시키거나, 또는 보다 많은 세포 독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 하나 또는 그 이상의 아미노산을 불변 영역에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 개시된 항체는 또한 본원에 제시된 키메라, 인간화된, 그리고 인간 항체, 또는 이의 항체 단편들과 실질적으로 상동인 변이체 및 등가물을 포함한다. 이들은 예를 들어, 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들면, 보존적 치환은 하나의 아미노산을 동일한 일반 클래스 안에 있는 또다른 아미노산, 예를 들어, 하나의 산성 아미노산을 또다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도된 것은 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 개시된 FOLR1-결합제의 폴리펩티드는 인간 FOLR1에 대한 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능의 현저한 영향 없이, 가변적일 수 있음이 관련 기술 분야에서 인지될 것이다. 따라서, 본원에 개시된 FOLR1-결합제는 인간 엽산 수용체 단백질에 대하여 실질적인 활성을 나타내는 폴리펩티드, 또는 이의 단편의 변형을 또한 포함한다. 이러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역전(inversions), 반복 및 유형 치환(type substitutions)을 포함한다.
폴리펩티드 및 유사체는 정상적으로 단백질의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 향상시킬 수 있다. 모이어티들은 또한 단백질 및 이와 유사한 것등의 임의의 바람직한 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 검토는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)에서 찾아볼 수 있다.
III. 검출 방법
본 발명의 방법은 샘플에서 인간 FOLR1을 검출하기 위한 다-단계 접근법을 제공한다. 구체적으로, 샘플에서 FOLR1을 농축시키기기 위해, 초기 면역포획 단계를 수행한 다음, FOLR1을 펩티드로 절단하고, 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC/MS)에 의해 분석한다. LC/MS에 의한 펩티드의 분석은 예를 들어, FOLR1-발현시키는 암 환자의 샘플에서 FOLR1의 수준을 비롯한, 이 샘플에 존재하는 FOLR1의 수준을 정량적으로 더 측정할 수 있게 한다. 일부 구체예들에서, 샘플에 있는 인간 엽산 수용체 1 (FOLR1)를 검출하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 고형 지지체에 결합된 면역 포획 시약으로 전술한 엽산 수용체 1 (FOLR1)을 포획하고; (b) 상기 고형 지지체로부터 FOLR1을 용리시키고; (c) 상기 용리된 FOLR1을 절단하고(digesting); 그리고 (d) 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC/MS) 분석을 상기 절단된 FOLR1에서 실행하고, 이때 전술한 FOLR1은 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드의 크로마토그래피 분리 및 질량 분석적 반응을 모니터링함으로써 검출된다. FOLR1의 검출을 위한 다른 공지된 방법과 비교하여, 본 발명의 방법은 향상된 감도 및 선택성의 이점을 제공한다.
일부 구체예들에서, FOLR1을 함유하는 샘플은 체액을 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 체액은 혈장, 혈청, 또는 복수액일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 샘플은 혈장이다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 말초 혈액 샘플을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플은 암 환자로부터 획득된다. 추가의 구체예들에서, 암은 난소암, 폐암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 유방암, 뇌암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종, 자궁내막암, 복막암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 상기 암은 난소암이다. 특정 구체예들에서, 상기 암은 자궁내막암이다. 특정 구체예들에서, 상기 암은 폐암이다. 특정 구체예들에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암이다. 특정 구체예들에서, 상기 비-소 세포 폐암은 폐의 선암종이다.
a. 면역포획
초기 면역포획 단계는 고형 지지체에 결합된 면역포획 시약을 사용하여 샘플에서 수행된다. 상기 면역포획 시약은 예를 들어, FOLR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하여 FOLR1에 결합하는 임의의 면역학적 시약일 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편이 면역포획 시약으로 사용되는 경우, 항체 또는 항원-합 단편의 FOLR1에 대한 결합은 IMGN853과 같은 항체-기반 활성제가 샘플 안에 FOLR1에 결합함으로써, 경쟁적으로 억제되지 않을 수 있다. 더욱이, 항체 또는 항원-결합 단편이 면역포획 시약으로 이용될 때, FOLR1에 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 결합은 이 샘플 안에 존재하는 엽산에 의해 억제되지 않을 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 상기 항체 muFR1-9이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 항체 muFR1-13이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 muFR1-53이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 항체 muFR1-62이다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 1의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 2의 VH CDR-2; 서열 번호: 3의 VH CDR-3; 서열 번호: 13의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 14의 VL CDR-2, 그리고 서열 번호: 15의 VL CDR-3을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 4의 VH CDR-1; 서열 번호: 5의 VH CDR-2; 서열 번호: 6의 VH CDR-3; 서열 번호: 16의 VL CDR-1; 서열 번호: 17의 VL CDR-2; 그리고 서열 번호: 18의 VL CDR-3을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 7의 VH CDR-1; 서열 번호: 8의 VH CDR-2; 서열 번호: 9의 VH CDR-3; 서열 번호: 19의 VL CDR-1; 서열 번호: 20의 VL CDR-2; 그리고 서열 번호: 21의 VL CDR-3을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 10의 VH CDR-1; 서열 번호: 11의 VH CDR-2; 서열 번호: 12의 VH CDR-3; 서열 번호: 22의 VL CDR-1; 서열 번호: 23의 VL CDR-2; 그리고 서열 번호: 24의 VL CDR-3을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 25의 VH와 서열 번호: 29의 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 26의 VH와 서열 번호: 30의 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 27의 VH와 서열 번호: 31의 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 28의 VH와 서열 번호: 32의 VL을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 25의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 VH와 서열 번호: 29의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 25의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 29의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 26의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 30의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 26의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 30의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 27의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 31의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 27의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 31의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 28의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 32의 서열에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 28의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 32의 서열에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다.
한 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 33의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 37의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합단편이다. 또다른 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 34의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 38의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합단편이다. 또다른 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 35의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 39의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합단편이다. 또다른 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 36의 중쇄와 서열 번호: 40의 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 약 1.0 nM 내지 약 10 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 약 0.5 nM 내지 약 5 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 바이오티닐화된다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 바이오틴-스트렙타아비빈 상호작용을 통하여 고형 지지체에 결합된다. 일부 구체예들에서, 상기 고형 지지체는 질량 분석적 면역분석 (MSIA) 마이크로컬럼이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 자성 비드를 포함한다.
초기 면역포획 단계를 실행하기 위하여, FOLR1을 함유하는 샘플은 고형 지지체에 결합된 면역포획 시약과 함께 항온처리된다. 세척 단계를 상기 면역포획 단계이후에 실행하여, 포획된 FOLR1을 추가 정제한다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플을 면역포획 시약과 함께 항온처리 후, 포획된 FOLR1을 용리시키기 전에 한번 또는 그 이상의 세척 단계가 실행된다. 일부 구체예들에서, 포획된 FOLR1을 용리시키기 전에, 2회 또는 그 이상의 세척 단계가 실행된다. 일부 구체예들에서, 포획된 FOLR1에서 최소한 2회, 최소한 3회, 최소한 4회, 최소한 5회, 최소한 6회, 최소한 7회, 최소한 8회, 최소한 9회, 또는 최소한 10회의 세척 단계가 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 세척 단계는 포획된 FOLR1에 세척 완충액을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세척 완충액은 시판되는 이용가능한 세척 완충액이다. 일부 구체예들에서, 상기 세척 단계는 포획된 FOLR1에 염 용액 및 계면활성제를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 염 용액은 400 mM NaCl이며, 계면활성제는 0.1% Tween 20이다.
면역포획 후 FOLR1은 용리 단계를 실행함으로써, 상기 고형 지지체로부터 방출된다. 일부 구체예들에서, 상기 용리 단계는 포획된 FOLR1에 산성 용액을 접촉시킴으로써 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 산성 용액은 시판되는 이용가능한 용액이다. 일부 구체예들에서, 용출물은 중화 완충액을 추가함으로써 중성 pH로 만든다. 일부 구체예들에서, 중화 완충액은 pH 8의 500 mM 중탄산암모늄염이다. 일부 구체예들에서, 상기 중화 완충액은 시판되는 이용가능한 완충제이다.
b. 액체 크로마토그래피-질량 분광법
면역포획 및 용리 후, 생성된 FOLR1 단백질은 펩티드로 절단되고, 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC/MS)에 의해 분석된다. 일부 구체예들에서, FOLR1-함유 용액은 알킬화되고, LC/MS에 의해 분석되기 전, 환원된다. 일부 구체예들에서, FOLR1은 메탄올로 알킬화된다. 일부 구체예들에서, FOLR1은 FOLR1에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 함유하는 용액에 접촉시킴으로써, 환원된다. 일부 구체예들에서, 100 mM TCEP를 함유하는 용액을 이용하여 FOLR1을 환원시킨다. 일부 구체예들에서, 알킬화 및 환원 후, FOLR1-함유하는 용액에 시스테인 차단 시약이 추가된다. 일부 구체예들에서, 상기 시스테인 차단 시약은 요오드아세타미드 (IAM)이다. 일부 구체예들에서, 100 mM IAM을 함유하는 용액이 FOLR1-함유하는 용액에 추가된다.
알킬화 및 환원 후, FOLR1은 펩티드로 절단된다. 일부 구체예들에서, FOLR1은 트립신으로 절단된다. 일부 구체예들에서, FOLR1은 Lys-C로 절단된다 일부 구체예들에서, FOLR1은 트립신 및 Lys-C의 혼합물로 절단된다. 일부 구체예들에서, FOLR1은 30 ng/μL 트립신/Lys-C를 함유하는 50mM 중탄산 암모늄 용액을 FOLR1을 접촉시킴으로써 절단된다.
트립신/Lys-C에 의한 FOLR1의 절단은 LC/MS에 의한 샘플의 정량적 분석 실행에 있어서 유용한 펩티드를 만든다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 단리된 특징적 펩티드는 FOLR1의 절단 산물로 제공된다. FOLR1의 절단에 의해 만들어진 특징적 펩티드는 하기 표 7에 제공된다.
FOLR1을 펩티드로 절단한 후, 당해 펩티드-함유하는 용액은 LC/MS 분석으로 준비된다. 일부 구체예들에서, LC/MS 분석 전, 펩티드-함유 용액에 계면활성제가 추가된다. 일부 구체예들에서, 상기 계면활성제는 질량 분광 분석용으로 제형화된 시판되는 시약이다. 일부 구체예들에서, 계면활성제와의 반응은 10% 포름산의 추가에 의해 중단된다(quenched).
LC/MS 분석을 위하여 샘플을 절단하고, 준비한 후, 당해샘플을 LC/MS 기구안에 주입하고, 분석한다. 일부 구체예들에서, 최소한 2개의 특징적 FOLR1의 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다. 일부 구체예들에서, 최소한 3개의 특징적 FOLR1의 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다. 일부 구체예들에서, 최소한 4개의 특징적 FOLR1의 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다. 일부 구체예들에서, 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링되는 최소한 4개의 특징적 펩티드는 다음을 포함한다: 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 그리고 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 갖는 펩티드. 일부 구체예들에서, FOLR1 수준의 정량적 분석이 LC/MS 분석에 의해 제공된다. 추가 구체예들에서, 상기 샘플내 FOLR1 수준은 상기 샘플내 FOLR1 수준을 FOLR1의 참조 수준에 비교함으로써, 정량화된다. LC/MS 분석에 의한 분석 방법은 당분야에 잘 공지된 것으로써, 가령, Yang 외. Scientific Reports. 2015 November 17; 5:16733; doi10.1038/srep16733에서 기술된다.
일부 구체예들에서, 상기 샘플에 있는 FOLR1의 검출은 상기 샘플안에 존재하는 IMGN853에 의해 억제되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플에 있는 FOLR1의 검출은 상기 샘플안에 존재하는 huMov19에 의해 억제되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 샘플에 있는 FOLR1의 검출은 상기 샘플안에 존재하는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 59의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 60의 VL CDR-2; 서열 번호: 61의 VL CDR-3; 서열 번호: 62의 가변 중쇄 (VH) CDR-1; 서열 번호: 64의 VH CDR-2; 그리고 서열 번호: 65의 VH CDR-3. 일부 구체예들에서, 상기 샘플 안에 FOLR1의 검출은 이 샘플 안에 존재하는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호: 56의 서열을 갖는 VH와 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 58의 서열을 갖는 VL을 포함한다. 일부 구체예들에서, FOLR1 검출은 이 샘플 안에 존재하는 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 억제되지 않고, 이때 전술한 항체 또는 항원-결합 단편은 다음을 포함한다: (i) American Type Culture Collection (ATCC)에 PTA-10772로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 중쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 그리고 (ii) ATCC에 PTA-10774로 기탁된 플라스미드에 의해 인코드된 경쇄의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구체예들에서, 상기 샘플에 있는 FOLR1의 검출은 상기 샘플안에 존재하는 엽산에 의해 억제되지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 0.5 ng/mL의 FORL1이 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 0.3 ng/mL의 FORL1이 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 0.25 ng/mL의 FORL1이 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 0.2 ng/mL의 FORL1이 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 0.15 ng/mL의 FORL1이 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 5의 신호-대-잡음 비율이 관찰된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 6의 신호-대-잡음 비율이 관찰된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 7의 신호-대-잡음 비율이 관찰된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 8의 신호-대-잡음 비율이 관찰된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 9의 신호-대-잡음 비율이 관찰된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법의 실행에 의해 최소한 10의 신호-대-잡음 비율이 관찰된다.
IV. 키트
편의상, 본 발명의 분석 방법은 키트 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키트는 (a) FOLR1에 결합하는 면역포획 시약일 수 있는 제 1 시약; 및 (b) 포획된 FOLR1을 펩티드로 절단시킬 수 있는 절단 시약의 기본 요소들이 포함된 포장된 조합이다. 상기 키트는 FOLR1로부터 유래된 최소한 하나의 펩티드를 더 포함할 수 있다. 이들 기본 요소는 상기 및 하기 실시예들에서 정의된다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 추가 구체예에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 1의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 2의 VH CDR-2; 서열 번호: 3의 VH CDR-3; 서열 번호: 13의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 14의 VL CDR-2, 그리고 서열 번호: 15의 VL CDR-3을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 4의 VH CDR-1; 서열 번호: 5의 VH CDR-2; 서열 번호: 6의 VH CDR-3; 서열 번호: 16의 VL CDR-1; 서열 번호: 17의 VL CDR-2; 그리고 서열 번호: 18의 VL CDR-3을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 7의 VH CDR-1; 서열 번호: 8의 VH CDR-2; 서열 번호: 9의 VH CDR-3; 서열 번호: 19의 VL CDR-1; 서열 번호: 20의 VL CDR-2; 그리고 서열 번호: 21의 VL CDR-3을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 10의 VH CDR-1; 서열 번호: 11의 VH CDR-2; 서열 번호: 12의 VH CDR-3; 서열 번호: 22의 VL CDR-1; 서열 번호: 23의 VL CDR-2; 그리고 서열 번호: 24의 VL CDR-3을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 25의 VH와 서열 번호: 29의 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 26의 VH와 서열 번호: 30의 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 27의 VH와 서열 번호: 31의 VL을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 28의 VH와 서열 번호: 32의 VL을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 25-28중 임의의 하나에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 VH를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 25-28중 임의의 하나에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 VH를 포함하는 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 29-32중 임의의 하나에 대하여 최소한 90% 동일성을 갖는 VL을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 29-32중 임의의 하나에 대하여 최소한 95% 동일성을 갖는 VL을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 33의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 37의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 34의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 38의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 35의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 39의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 서열 번호: 36의 중쇄 및 서열 번호: 40의 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 muFR1-9이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 muFR1-13이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 약 1.0 nM 내지 약 10 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 다른 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 약 0.5 nM 내지 약 5 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 바이오티닐화된다.
일부 구체예들에서, 상기 키트는 포획시약을 위한 고형 지지체를 더 포함하고, 이것은 별도의 요소로 제공되거나, 또는 포획 시약이 이미 고정되어있을 수 있다. 따라서, 키트에서 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정될 수 있거나, 또는 키트에 포함되거나 키트와 별도로 제공된 이러한 지지체에 고정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 고형 지지체는 질량 분석적 면역분석 (MSIA) 마이크로컬럼을 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 고형 지지체는 자성 비드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 고형 지지체는 스트렙타아비딘으로 피복된다. 일부 구체예들에서, 상기 면역포획 시약은 바이오틴-스트렙타아비빈 상호작용을 통하여 고형 지지체에 부착된다.
일부 구체예들에서, 상기 키트는 최소한 하나의 FOLR1 펩티드를 더 함유하고, 구체예들에서액체 크로마토그래피-질량 분광법 분석에서 표준으로 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서 상기 키트는 서열 번호:42의 서열을 포함하는 펩티드를 함유한다. 일부 구체예들에서 상기 키트는 서열 번호:43의 서열을 포함하는 펩티드를 함유한다. 일부 구체예들에서 상기 키트는 서열 번호:44의 서열을 포함하는 펩티드를 함유한다. 일부 구체예들에서 상기 키트는 서열 번호: 45의 서열을 포함하는 펩티드를 함유한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 액체 크로마토그래피-질량 분광법 분석에서 표준으로 이용될 수 있는 4개의 특징적 펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 4개의 특징적 펩티드는 1) 서열 번호: 42의 서열을 포함하는 펩티드; 2) 서열 번호: 43의 서열을 포함하는 펩티드; 3) 서열 번호: 44의 서열을 포함하는 펩티드; 그리고 4) 서열 번호: 45의 서열을 포함하는 펩티드로 구성된다.
키트는 전형적으로 표준으로 삼는 FOLR1 또는 FOLR1 펩티드, 뿐만 아니라, 안정화제, 세척 및 배양 완충액 및 이와 유사한 것 등과 같은 다른 첨가제, 분석을 수행하기 위한 설명서를 포함한다. 이 키트에는 시료의 FOLR1 수준을 정량적으로 측정하기 위한 지침도 포함되어 있다.
상기 키트의 성분들은 예정된 비율로 제공될 것이며, 분석의 감도를 실질적으로 최대화시키기 위한 용액내 시약의 농도를 제공하기 위하여 적합하게 변화되는 다양한 시약의 상대적 양이 제공된다. 특히, 시약은 부형제를 비롯한, 일반적으로 동결 건조된 건조 분말로서 제공될 수 있으며, 이는 용해시 테스트될 샘플과 조합하기에 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다.
본 발명의 구체예들은 본 발명의 방법을 상세하게 설명하는 다음의 비-제한적인 실시예들을 참조하여 추가로 정의될 수 있다. 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서, 재료 및 방법 모두에 대한 많은 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예들
본 명세서에 기술된 실시예 및 구체예들은 단지 예시적인 목적이며, 그에 대한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 이들은 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1
sFRα 면역포획-LC/MS 분석
ELISA-기반 분석이 개발되었고, WO 2014/036495에 기술되어 있다. 이 분석은 FOLR1-Fc (huFOLR1과 뮤린 IgG2A 힌지, CH2, CH3의 융합 펩티드), 포획 항체로써 muFR1-9, 그리고 바이오티닐화된 muFR1-13이 피복된 ELISA를 이용하여 실행되었다. 높은 신호 대 잡음비율, 인간 혈장 샘플에서 최소의 매트릭스 효과, 검출의 높은 반복성 및 정밀도, 최저 검출 한계를 갖는 재현가능한 신호 기준을 갖는 체계적인 접근법에 의해 이 분석은 최적화되었다. 선택된 최적의 ELISA 조건은 무시할 수 있는/낮은 잡음을 갖고, 25ng/mL 정도의 낮은 sFRα도 검출했다. 최적화된 조건에도 불구하고, 이 ELISA 분석은 sFRα 수준 및 질환 상태의 상관 분석을 허용하기 위하여, 정상 대상들에서 sFRα 수준과 난소암 환자에서 sFRα 수준의 분포 범위를 구별하는데 충분한 감도를 제공하지 못하였다.
2 가지 상이한 인간 FRα-특이적 마우스모노클로날 항체를 이용한 좀더 최근의 ELISA-기반 분석(Kurosaki 외., Int. J. Cancer. 2016 April 15; 138(8): 1994-2002에서 보고됨)은 임상적으로 악성 난소 종양을 갖는 것으로 의심되는 환자의 혈청에서 sFRα의 수준을 조사하고, sFRα를 난소 암의 진단 마커로서 평가하기 위하여 개발될었다. 이 ELISA 분석은 최저 측정기 (250 pg/mL)에 대해 250-8000 pg/mL의 역동적 범위 및 3.4의 신호 대 잡음비를 가졌다. 이 ELISA 분석은 보다 민감한 sFRα 검출 역동적 범위를 제공하지만, ELISA 판독값(readouts)은 일반적으로 450nm에서 분광 광도계로 측정되고, 620nm에서 흡광도에 대해 보정되고, 따라서 선택적이지 않으며, 더 잘못된 위양성(false positive) 결과를 생성할 수 있다.
본 발명의 분석은 민감도 및 선택성 모두에 대한 기준을 충족하도록 개발되었다. LC/MS 단계에 의한 특징적 펩티드의 정확한 측정은 전형적인 ELISA 방법에 의해 제공되지 않은 제 2 수준의 선택성을 제공한다. 또한, 면역포획-LC/MS 분석에 의해 제공되는 sFRα 검출의 민감성 및 선택성은 이 분석이 sFRα를 난소암 환자에 대한 예측 및/또는 예후 바이오마커로서 탐색하는데 유용하게 한다.
도 1에 나타낸 분석은 바이오티닐화된 포획 항체 (가령, 본 발명의 항체, 이를 테면, muFR1-9 또는 muFR1-13 항체) 용액을 스트렙타아비딘-피복된 면역포획 배지 (MSIA 마이크로컬럼 또는 자성 비드)와 함께 항온처리하는 단계, 샘플을 면역포획 배지와 함께 항온처리하는 단계, 세척 상기 면역포획 배지를 세척 완충액, 염 용액, 그리고 계면활성제로 세착하는 다중 세척 단계, 상청액은 버리는 단계, 산성 용액으로 면역포획 배지로부터 sFRα를 방출시키는 단계, 그리고 sFRα 용액을 중화시키는 단계에 이어서 환원 및 알킬화 단계를 포함한다. 상기 샘플은 그 다음 트립신/Lys-C으로 절단되고, 분석을 위하여 LC/MS에 주입된다. 상이한 4가지 특징적 sFRα 펩티드가 선택되고, LC/MS 분석 단계에서 모니터링된다. 구체적으로, 서열 번호: 42의 펩티드는 단백질 농도 보고에 이용되며, 서열 번호: 43-45의 펩티드는 확인용으로 이용되었다.
샘플 준비하는 동안 분석 성능을 개선시키기 위한 최적화 단계에는 면역포획 효과를 개선시키기 위한 조건을 변형시키고, 혈장 매트릭스로부터 잠재적 간섭을 제거하기 위한 세척 절차의 개선, 그리고 효소를 이용한 절단 효과를 개선시키기 위하여 조건들을 변경시키는 것을 포함한다. LC/MS 동안 최적화 단계는 양호한 크로마토그래피 분리 및 질량 분석적 반응을 제공하는 특징적 펩티드 서열을 확인하는 것을 포함한다. 면역포획을 위한 자동화 옵션은 MSIA 마이크로컬럼 기술 및 자성 비드 프로세싱으로 평가되었다. 두 옵션 모두 96-웰 플레이트 사용과 호환되어, 샘플 처리량(throughput)을 크게 개선했으며, 두 자동화 플랫폼 모두에서 유사한 감도가 관찰되었다. 항원-고갈된 혈장 또는 대용 매트릭스를 이용한 분석에서 평가가 또한 실행되었다.
작업 분석 매개변수는 다음과 같다: 8.5 시간의 면역포획 및 효소적 절단을 포함하는 샘플 프로세싱, 샘플당 10분의 LC/MS 분석, 5% BSA에서 준비된 계측 표준, PBS (대용 매트릭스, 0.65 ng/mL 내지 40.63 ng/mL), 샘플 용적 0.3mL, LLOQ 수준에서 4가지 특징적 펩티드에 대한 S/N은 >10, LLOQ(±25%)을 제외한 명목(nominal) 값의 ±20%의 STD 수용 기준, ±20%의 명목값의 QC 수용 기준.
실시예 2
sFRα 면역포획-LC/MS 분석을 이용한 인간 혈장 샘플의 데이터 분석
0.3 ng/mL의 대용 매트릭스에서 낮은 수준의 sFRα를 함유하는 샘플에서 sFRα의 수준을 측정하기 위해 상기 매개변수들을 사용하는 실험을 설계하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이들 실험 결과는 상기 면역포획-LC/MS 분석으로 매우 낮은 수준의 sFRα를 측정할 수 있음이 증명된다. 정상적인 인간 혈장 샘플에서 sFRα 수준을 측정하기 위한 실험들이 또한 계획되었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대략 0.5 ng/mL에서 볼 수 있는 sFRα의 내생적 수준은 면역포획-LC/MS 분석에서 측정될 수 있다. 도 4는 상승된 sFRα를 갖는 환자 사전-투여량 샘플로부터 추출된 이온 크로마토그램을 도시한다. 이 실험의 결과는 상승된 수준의 sFRα를 갖는 환자 혈장 샘플이 내생적 수준의 정상 인간 혈장 샘플의 샘플과 명확하게 구별될 수 있음을 입증한다.
혈장 샘플에서 FRα-표적화 면역접합체인 IMGN853 존재하여 분석 내성을 테스트하기 위한 실험들이 계획되었다. 혈장에서 예상된 Cmax 농도의 IMGN853이 스파이크된 낮은 수준, 중간 수준 그리고 높은 수준의 sFRα QC 샘플이 준비되었고, 그리고 IMGN853 없는 혈장에서 준비된 sFRα QC 샘플과 비교되었다. QC 샘플 세트에서 간섭이 관찰되지 않았으며, 두 샘플 세트 모두 유사한 반응을 갖는다.
이들 실험 결과에서 본 발명의 면역포획-LC/MS 분석은 민감도를 증가시켰고 (0.3ng/mL, 최소한 10의 신호-대-잡음 비율, 가령, 당분야의 ELISA 분석과 비교하여 2-배 더 민감) FRα-표적화 면역접합체의 존재 및 부재하에 인간 혈장 샘플에서 sFRα를 측정하기 위한 선택성이 강화됨을 보여주었다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 및 수탁 번호/데이터베이스 서열 (폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 둘 다 포함)은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 또는 수탁 번호/데이터베이스 서열이 구체적이며, 개별적으로 참고자료에 편입된 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Immunogen, Inc. <120> METHODS FOR DETECTION OF FOLATE RECEPTOR 1 IN A PATIENT SAMPLE <130> 2921.095PC01 <150> 62/554,532 <151> 2017-09-05 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 muFR1-9 <400> 1 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 muFR1-9 <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 muFR1-13 <400> 3 Glu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 muFR1-13 <400> 4 Arg Tyr Ser Val His 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 muFR1-13 <400> 5 Met Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Val Phe Lys Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 muFR1-13 <400> 6 Phe Asp Gly Lys Val Ser Trp Phe 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Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (80)

  1. 다음을 포함하는, 샘플 내 인간 엽산 수용체 1 (FOLR1)를 검출하는 방법:
    (a) 방출(shed) 인간 FOLR1을 고형 지지체에 결합된 면역포획 시약으로 포획하고, 이때 상기 면역포획 시약은 FOLR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고;
    (b) 상기 고형 지지체로부터 포획된 FOLR1 을 용리시키고;
    (c) 상기 용리된 FOLR1를 절단하여 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드를 생성하고; 그리고
    (d) 상기 절단된 FOLR1에 대해 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC/MS) 분석을 실행하고, 이때 상기 방출 FOLR1은 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드의 크로마토그래피 분리 및 질량 분석적 반응을 모니터링함으로써 탐지되고, 상기 방법은 샘플 내 0.5 ng/mL 의 FOLR1을 검출할 수 있다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 샘플 내 방출 FOLR1 수준은 상기 LC/MS 분석에 의해 정량화되는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 샘플 내 방출 FOLR1 수준은 샘플 내 FOLR1 수준을 FOLR1의 참조 수준에 비교함으로써 정량화되는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, FOLR1에 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 IMGN853의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않거나 또는 FOLR1에 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 huMov19의 결합에 의해 경쟁적으로 억제되지 않는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, FOLR1에 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 FOLR1에 엽산의 결합에 의해 억제되지 않는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    (a) 서열 번호: 1의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 2의 VH CDR-2; 서열 번호: 3의 VH CDR-3; 서열 번호: 13의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 14의 VL CDR-2, 및 서열 번호: 15의 VL CDR-3; 또는
    (b) 서열 번호: 4의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 5의 VH CDR-2; 서열 번호: 6의 VH CDR-3; 서열 번호: 16의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 17의 VL CDR-2, 및 서열 번호: 18의 VL CDR-3을 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은:
    (a) 서열 번호: 25의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL);
    (b) 서열 번호: 26의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL);
    (c) 서열 번호: 33의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 37의 서열을 갖는 경쇄; 또는
    (d) 서열 번호: 34의 서열을 갖는 중쇄와 서열 번호: 38의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1.0 nM 내지 10 nM의 Kd로 인간 FOLR1에 결합하는, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 고형 지지체는 질량 분석적 면역분석 (MSIA) 마이크로컬럼 또는 자성 비드를 포함하는, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 고형 지지체로부터 FOLR1를 용리시키기 전 최소한 한번의 세척 단계가 실행되는, 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 고형 지지체로부터 FOLR1를 용리시키기 전 2회 또는 그 이상의 세척 단계가 실행되는, 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 세척 단계는 상기 고형 지지체에 결합된 FOLR1에 세척 완충액, 염 용액, 및 계면활성제로 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, FOLR1은 상기 고형 지지체로부터 산성 용액으로 용리되는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 FOLR1은 FOLR1를 절단하기 전, 환원되고, 알킬화되는, 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 용리된 FOLR1은 트립신 및/또는 Lys-C로 절단되는, 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드가:
    (a) 서열 번호: 42;
    (b) 서열 번호: 43;
    (c) 서열 번호: 44; 및/또는
    (d) 서열 번호: 45
    의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 최소한 2개, 최소한 3개, 또는 최소한 4개의 특징적 FOLR1의 펩티드가 LC/MS 분석 단계에서 모니터링되는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 최소한 4개의 특징적 펩티드가 다음을 포함하는 방법:
    (a) 서열 번호:42의 서열을 포함하는 펩티드;
    (b) 서열 번호:43의 서열을 포함하는 펩티드;
    (c) 서열 번호:44의 서열을 포함하는 펩티드; 및
    (d) 서열 번호:45의 서열을 포함하는 펩티드.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 체액을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 체액은 혈장, 혈청 또는 복수액인, 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 방출 FOLR1은 상기 고형 지지체로부터 산성 용액으로 용리되고, 상기 FOLR1은 FOLR1를 절단하기 전, 환원되고 알킬화되고, 상기 용리된 FOLR1은 트립신 및/또는 Lys-C로 절단되는, 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 방출 FOLR1은 상기 고형 지지체로부터 산성 용액으로 용리되고, 상기 FOLR1은 FOLR1를 절단하기 전, 환원되고 알킬화되고, 상기 용리된 FOLR1은 트립신 및/또는 Lys-C로 절단되는, 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 샘플인, 방법.
  24. 청구항 19에 있어서, 상기 샘플은 암 환자로부터 수득되는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 암은 난소암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 자궁내막암, 췌장암, 신장암, 폐암, 및 복막암으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, FOLR1 검출은 샘플 내 존재하는 IMGN853에 의해 억제되지 않거나 또는 FOLR1 검출은 샘플 내 존재하는 huMov19에 의해 억제되지 않는, 방법.
  27. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, FOLR1 검출은 샘플 내 존재하는 엽산에 의해 억제되지 않는, 방법.
  28. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내 최소한 0.25 ng/mL 의 FOLR1를 검출할 수 있는, 방법.
  29. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내 최소한 0.3 ng/mL 의 FOLR1를 검출할 수 있는, 방법.
  30. 다음을 포함하는, 샘플 내 인간 엽산 수용체 1 (FOLR1)를 검출하는 방법:
    (a) 방출(shed) 인간 FOLR1 을 고형 지지체에 결합된 면역포획 시약으로 포획하고, 이때 상기 면역포획 시약은 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고:
    (i) 서열 번호: 1의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 2의 VH CDR-2; 서열 번호: 3의 VH CDR-3; 서열 번호: 13의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 14의 VL CDR-2, 및 서열 번호: 15의 VL CDR-3; 또는
    (ii) 서열 번호: 4의 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 5의 VH CDR-2; 서열 번호: 6의 VH CDR-3; 서열 번호: 16의 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 (CDR)-1; 서열 번호: 17의 VL CDR-2, 및 서열 번호: 18의 VL CDR-3;
    (b) 상기 고형 지지체로부터 포획된 FOLR1 을 용리시키고;
    (c) 상기 용리된 FOLR1를 절단하여 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드를 생성하고; 그리고
    (d) 상기 절단된 FOLR1에 대해 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC/MS) 분석을 실행하고, 이때 상기 방출 FOLR1은 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드의 크로마토그래피 분리 및 질량 분석적 반응을 모니터링함으로써 탐지되고, 상기 방법은 샘플 내 0.5 ng/mL 의 FOLR1 을 검출할 수 있다.
  31. 다음을 포함하는, 샘플 내 인간 엽산 수용체 1 (FOLR1)를 검출하는 방법:
    (a) 방출(shed) 인간 FOLR1 을 고형 지지체에 결합된 면역포획 시약으로 포획하고, 이때 상기 면역포획 시약은 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고:
    (i) 서열 번호: 25의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 29의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL); 또는
    (ii) 서열 번호: 26의 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH)와 서열 번호: 30의 서열을 갖는 가변 경쇄 (VL);
    (b) 상기 고형 지지체로부터 포획된 FOLR1 을 용리시키고;
    (c) 상기 용리된 FOLR1를 절단하여 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드를 생성하고; 그리고
    (d) 상기 절단된 FOLR1에 대해 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC/MS) 분석을 실행하고, 이때 상기 방출 FOLR1은 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드의 크로마토그래피 분리 및 질량 분석적 반응을 모니터링함으로써 탐지되고, 상기 방법은 샘플 내 0.5 ng/mL 의 FOLR1 을 검출할 수 있다.
  32. 청구항 30 또는 31에 있어서, 상기 최소한 하나의 특징적 FOLR1 펩티드가:
    (a) 서열 번호: 42;
    (b) 서열 번호: 43;
    (c) 서열 번호: 44; 및/또는
    (d) 서열 번호: 45
    의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
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