BR112014026742B1 - Moléculas de anticorpo anti-gcc, sequências ácido nucleico, vetor, método de produção uma molécula de anticorpo e usos de uma molécula de anticorpo anti-gcc, kit e mistura de reação - Google Patents

Abstract

MOLÉCULAS DE ANTICORPO ANTI-GCC E USO DAS MESMAS PARA TESTE DE SUSCETIBILIDADE À TERAPIA DIRECIONADA AO GCC. A presente invenção se refere a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos que se ligam ao GCC. A invenção também fornece métodos de diagnóstico para identificar pacientes que devem receber uma terapia direcionada ao GCC utilizando os anticorpos anti-GCC fornecidos neste documento. As moléculas do anticorpo anti-GCC são úteis como moléculas de anticorpos nuas e como componentes de imunoconjugados. Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção apresenta imunoconjugados constituídos por uma molécula de anticorpo anti-GCC aqui descrits e um agente terapêutico ou rótulo. A invenção também apresenta métodos para usar as moléculas do anticorpo anti-GCC e imunoconjugados aqui descritos, por exemplo, para a detecção de GCC e de células ou tecidos que expressam GCC. Tais métodos são úteis, nomeadamente, para o diagnóstico, prognóstico, imageamento, ou estadiamento de uma doença mediada por GCC. Nesse sentido, em alguns aspectos, a invenção apresenta métodos de identificar um indivíduo para o tratamento com uma terapia de GCC-alvo, por exemplo, uma terapia de anticorpo anti- GCC, por exemplo, um imunoconjugado composto por um anticorpo anti-GCC conjugado com um (...).

Description

Pedidos Relacionados

[0001] O presente pedido reivindica o benefício de e prioridade para o Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/639.376, depositado em 27 de Abril de 2012. Todo o conteúdo do Pedido Provisório U.S. N. ° de série 61/639.376 é incorporado neste documento por referência.

Campo da Invenção

[0002] A invenção está relacionada a moléculas de anticorpos que ligam GCC, e métodos para usar as mesmas para selecionar pacientes para tratamento com uma terapia direcionada ao GCC, tal como um imunoconjugado que contém uma molécula de anticorpo anti-GCC, ou seu fragmento, conjugado a um agente tal como um agente terapeutico.

Fundamentos

[0003] O Guanilil ciclase C (“GCC”) é um receptor de superfície de célula de transmembrana que funciona na manutenção do fluido intestinal, da homeostase do eletrólito e do proliferação de célula, ver, por exemplo, Carrithers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3018-3020 (2003). O GCC é expressado nas células mucosais que revestem o intestino delgado, o intestine grosso e o reto (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)).). A expressão de GCC é mantida mediante a transformação neoplástica de células epiteliais intestinais, com expressão em todos os tumores coloretais primários e metastáticos (Carritherset al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)).

Resumo

[0004] A divulgação é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de novos anticorpos anti-GCC. Em conformidade, em um aspecto, a invenção apresenta uma molécula de anticorpo anti-GCC, conforme divulgado neste documento. As moléculas de anticorpo anti-GCC são úteis como moléculas de anticorpos não-atreladas e como componentes de imunoconjugados. Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção apresenta imunoconjugados constituídos por uma molécula de anticorpo anti-GCC aqui descrita e um agente terapêutico ou marcador. A invenção também apresenta métodos para usar as moléculas de anticorpo anti-GCC e imunoconjugados aqui descritos, por exemplo, para a detecção de GCC e de células ou tecidos que expressam GCC. Tais métodos são úteis, nomeadamente, para o diagnóstico, prognóstico, imageamento, ou estadiamento de uma doença mediada por GCC. Nesse sentido, em alguns aspectos, a invenção apresenta métodos de identificar um indivíduo para o tratamento com uma terapia direcionada ao GCC, por exemplo, uma terapia de anticorpo anti-GCC, por exemplo, um imunoconjugado composto por um anticorpo anti-GCC conjugado com um agente terapêutico. A invenção apresenta também um método in vitro ou in vivo de determinar se um sujeito tendo câncer é um candidato potencial para uma terapia direcionada ao GCC, por exemplo, uma terapia direcionada ao GCC descrita neste documento.

[0005] Os anticorpos anti-GCC, por exemplo, os anticorpos anti- GCC descritos neste documento, são também úteis, por exemplo, para modular uma atividade ou uma função de uma proteína GCC; e para o tratamento de uma doença mediada por GCC, como descrito neste documento. Em alguns aspectos, o tratamento inclui adquirir conhecimento e/ou avaliar uma amostra ou um assunto aos níveis de expressão de GCC determinados, e se o assunto expressar GCC, administrar então uma terapia direcionada a GCC, por exemplo, uma terapia direcionada a GCC descrita neste documento. Em outros aspectos, o método inclui gerar um relatório de tratamento personalizado, por exemplo, um relatório de tratamento direcionado a GCC, pela obtenção de uma amostra de um assunto e determinação de níveis de expressão do GCC, por exemplo, por um método de detecção descrito neste documento, por exemplo, usar um anticorpo anti- GCC descrito neste documento, e baseado na determinação, selecionar um relatório do tratamento direcionado ao assunto.

[0006] Em um outro aspecto, a invenção também apresenta ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes que codificam sequências de amino-ácido de molécula do anticorpo anti-GCC, assim como os vetores e as células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos, e métodos para produzir moléculas de anticorpo anti-GCC. São apresentadas também neste documento as misturas de reação e os kits que compreendem anticorpos anti-GCC, por exemplo, um imunoconjugado, descrito neste documento, assim como ensaios in vitro , por exemplo, compreendendo um anticorpo anti- GCC descrito neste documento, para detectar a expressão do GCC.

[0007] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas em sua totalidade por referências. Outros recursos, objetos e vantagens divulgados neste documento estarão evidentes a partir da descrição e das figuras, e a partir das reivindicações.

Breve Descrição das Figuras

[0008] Figura 1 é um mapa circular de um vetor de expressão de proteína usado para gerar uma proteína de fusão (hGCC-ECD-mFc) de camundongo fc (mFc) de domínio extracelular (ECD) de GCC humano (hGCC) da invenção.

[0009] As figuras 2A-2D retratam gráficos de barra que resumem a distribuição de contagem de H combinado/agregado (apical e citoplásmico) da expressão GCC através dos tipos do tumor dos pacientes de câncer selecionados para registro no estudo C26001, uma experimentação clínica de fase I de um imunoconjugado destinado a GCC. A figura 2A retrata a distribuição da contagem de H agregado combinado, dentre os pacientes de câncer coloretal selecionados; A figura 2B retrata a distribuição da contagem de H agregado combinado, dentre os pacientes de câncer gástrico selecionados; A figura 2C retrata a distribuição da contagem de H agregado combinado dentre os pacientes de câncer pancreático selecionados; A figura 2D retrata a distribuição da contagem de H agregado combinado dentre os pacientes de câncer de esôfago selecionados.

[0010] As figuras 3A - 3C retratam gráficos de barra, resumindo a distribuição da contagem de H agregado/combinado (apical e citoplásmica) da expressão GCC dentre várias micromatrizes específicas de tumor que foram selecionadas. Figura 3A retrata a distribuição da contagem de H agregado/combinado através de amostras dentre micromatrizes de tumor colorretal selecionadas para expressão de GCC; A figura 3B retrata a distribuição da contagem de H agregado combinado dentre amostras em uma micromatriz do tumor gástrico selecionada para expressão de GCC; A figura 3C retrata a distribuição da contagem de H agregado combinado dentre amostras em várias micromatrizes de tumor pancreático, selecionadas para a expressão do GCC.

Descrição Detalhada

[0011] Guanilil Ciclase (GCC) (conhecido também como STAR, Receptor ST, GUC2C, e GUCY2C) é um receptor de superfície de célula de transmembrana que funciona na manutenção do fluido intestinal, homeostase de eletrólito e proliferation de célula (Carrithers et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 3018-3020 (2003); Mann et al., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466 (1997); Pitari et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699 (2003)); GenBank Accession Num. NM_004963, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Esta função é mediada através de ligação de guanilina (Wiegand et al. FEBS Lett. 311:150-154 (1992)). GCC é também um receptor de enterotoxina estável no calor (ST, por exemplo, tendo uma sequência de aminoácidos de NTFYCCELCCNPACAGCY, NUM DE SEQ DE ID: 1) que é um peptídeo produzido por E. coli, bem como outros organismos infecciosos (Rao, M. C. Ciba Found. Symp. 112:74-93 (1985); Knoop F. C. and Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67 - 72 (1992)). Ligação do ST ao GCC ativa uma cascata de sinal que resulta na doença entérica, por exemplo, diaréia.

[0012] Seqüência de Nucleotídeopara GCC humano (GenBank Acesso No. NM_004963; NUM DE SEQ DE ID: 2): 1 gaccagagag aagcgtgggg aagagtgggc tgagggactc cactagaggc tgtccatctg 61 gattccctgc ctccctagga gcccaacaga gcaaagcaag tgggcacaag gagtatggtt 121 ctaacgtgat tggggtcatg aagacgttgc tgttggactt ggctttgtgg tcactgctct 181 tccagcccgg gtggctgtcc tttagttccc aggtgagtca gaactgccac aatggcagct 241 atgaaatcag cgtcctgatg atgggcaact cagcctttgc agagcccctg aaaaacttgg 301 aagatgcggt gaatgagggg ctggaaatag tgagaggacg tctgcaaaat gctggcctaa 361 atgtgactgt gaacgctact ttcatgtatt cggatggtct gattcataac tcaggcgact 421 gccggagtag cacctgtgaa ggcctcgacc tactcaggaa aatttcaaat gcacaacgga 481 tgggctgtgt cctcataggg ccctcatgta catactccac cttccagatg taccttgaca 541 cagaattgag ctaccccatg atctcagctg gaagttttgg attgtcatgt gactataaag 601 aaaccttaac caggctgatg tctccagcta gaaagttgat gtacttcttg gttaactttt 661 ggaaaaccaa cgatctgccc ttcaaaactt attcctggag cacttcgtat gtttacaaga 721 atggtacaga aactgaggac tgtttctggt accttaatgc tctggaggct agcgtttcct 781 atttctccca cgaactcggc tttaaggtgg tgttaagaca agataaggag tttcaggata 841 tcttaatgga ccacaacagg aaaagcaatg tgattattat gtgtggtggt ccagagttcc 901 tctacaagct gaagggtgac cgagcagtgg ctgaagacat tgtcattatt ctagtggatc 961 ttttcaatga ccagtacttt gaggacaatg tcacagcccc tgactatatg aaaaatgtcc 1021 ttgttctgac gctgtctcct gggaattccc ttctaaatag ctctttctcc aggaatctat 1081 caccaacaaa acgagacttt gctcttgcct atttgaatgg aatcctgctc tttggacata 1141 tgctgaagat atttcttgaa aatggagaaa atattaccac ccccaaattt gctcatgctt 1201 tcaggaatct cacttttgaa gggtatgacg gtccagtgac cttggatgac tggggggatg 1261 ttgacagtac catggtgctt ctgtatacct ctgtggacac caagaaatac aaggttcttt 1321 tgacctatga tacccacgta aataagacct atcctgtgga tatgagcccc acattcactt 1381 ggaagaactc taaacttcct aatgatatta caggccgggg ccctcagatc ctgatgattg 1441 cagtcttcac cctcactgga gctgtggtgc tgctcctgct cgtcgctctc ctgatgctca 1501 gaaaatatag aaaagattat gaacttcgtc agaaaaaatg gtcccacatt cctcctgaaa 1561 atatctttcc tctggagacc aatgagacca atcatgttag cctcaagatc gatgatgaca 1621 aaagacgaga tacaatccag agactacgac agtgcaaata cgacaaaaag cgagtgattc 1681 tcaaagatct caagcacaat gatggtaatt tcactgaaaa acagaagata gaattgaaca 1741 agttgcttca gattgactat tacaacctga ccaagttcta cggcacagtg aaacttgata 1801 ccatgatctt cggggtgata gaatactgtg agagaggatc cctccgggaa gttttaaatg 1861 acacaatttc ctaccctgat ggcacattca tggattggga gtttaagatc tctgtcttgt 1921 atgacattgc taagggaatg tcatatctgc actccagtaa gacagaagtc catggtcgtc 1981 tgaaatctac caactgcgta gtggacagta gaatggtggt gaagatcact gattttggct 2041 gcaattccat tttacctcca aaaaaggacc tgtggacagc tccagagcac ctccgccaag 2101 ccaacatctc tcagaaagga gatgtgtaca gctatgggat catcgcacag gagatcatcc 2161 tgcggaaaga aaccttctac actttgagct gtcgggaccg gaatgagaag attttcagag 2221 tggaaaattc caatggaatg aaacccttcc gcccagattt attcttggaa acagcagagg 2281 aaaaagagct agaagtgtac ctacttgtaa aaaactgttg ggaggaagat ccagaaaaga 2341 gaccagattt caaaaaaatt gagactacac ttgccaagat atttggactt tttcatgacc 2401 aaaaaaatga aagctatatg gataccttga tccgacgtct acagctatat tctcgaaacc 2461 tggaacatct ggtagaggaa aggacacagc tgtacaaggc agagagggac agggctgaca 2521 gacttaactt tatgttgctt ccaaggctag tggtaaagtc tctgaaggag aaaggctttg 2581 tggagccgga actatatgag gaagttacaa tctacttcag tgacattgta ggtttcacta 2641 ctatctgcaa atacagcacc cccatggaag tggtggacat gcttaatgac atctataaga 2701 gttttgacca cattgttgat catcatgatg tctacaaggt ggaaaccatc ggtgatgcgt 2761 acatggtggc tagtggtttg cctaagagaa atggcaatcg gcatgcaata gacattgcca 2821 agatggcctt ggaaatcctc agcttcatgg ggacctttga gctggagcat cttcctggcc 2881 tcccaatatg gattcgcatt ggagttcact ctggtccctg tgctgctgga gttgtgggaa 2941 tcaagatgcc tcgttattgt ctatttggag atacggtcaa cacagcctct aggatggaat 3001 ccactggcct ccctttgaga attcacgtga gtggctccac catagccatc ctgaagagaa 3061 ctgagtgcca gttcctttat gaagtgagag gagaaacata cttaaaggga agaggaaatg 3121 agactaccta ctggctgact gggatgaagg accagaaatt caacctgcca acccctccta 3181 ctgtggagaa tcaacagcgt ttgcaagcag aattttcaga catgattgcc aactctttac 3241 agaaaagaca ggcagcaggg ataagaagcc aaaaacccag acgggtagcc agctataaaa 3301 aaggcactct ggaatacttg cagctgaata ccacagacaa ggagagcacc tatttttaaa

[0013] Sequência de amino-ácidopara GCC humano (GenPept Accession No. NP_004954; NUM DE SEQ DE ID: 3): 1 mktllldlal wsllfqpgwl sfssqvsqnc hngsyeisvl mmgnsafaep lknledavne 61 gleivrgrlq naglnvtvna tfmysdglih nsgdcrsstc egldllrkis naqrmgcvli 121 gpsctystfq myldtelsyp misagsfgls cdyketltrl msparklmyf lvnfwktndl 181 pfktyswsts yvykngtete dcfwylnale asvsyfshel gfkvvlrqdk efqdilmdhn 241 rksnviimcg gpeflyklkg dravaedivi ilvdlfndqy fednvtapdy mknvlvltls 301 pgnsllnssf srnlsptkrd falaylngil lfghmlkifl engenittpk fahafrnltf 361 egydgpvtld dwgdvdstmv llytsvdtkk ykvlltydth vnktypvdms ptftwknskl 421 pnditgrgpq ilmiavftlt gavvllllva llmlrkyrkd yelrqkkwsh ippenifple 481 tnetnhvslk idddkrrdti qrlrqckydk krvilkdlkh ndgnftekqk ielnkllqid 541 yynltkfygt vkldtmifgv ieycergslr evlndtisyp dgtfmdwefk isvlydiakg 601 msylhsskte vhgrlkstnc vvdsrmvvki tdfgcnsilp pkkdlwtape hlrqanisqk 661 gdvysygiia qeiilrketf ytlscrdrne kifrvensng mkpfrpdlfl etaeekelev 721 yllvkncwee dpekrpdfkk iettlakifg lfhdqknesy mdtlirrlql ysrnlehlve 781 ertqlykaer dradrlnfml lprlvvkslk ekgfvepely eevtiyfsdi vgfttickys 841 tpmevvdmln diyksfdhiv dhhdvykvet igdaymvasg lpkrngnrha idiakmalei 901 lsfmgtfele hlpglpiwir igvhsgpcaa gvvgikmpry clfgdtvnta srmestglpl 961 rihvsgstia ilkrtecqfl yevrgetylk grgnettywl tgmkdqkfnl ptpptvenqq 1021 rlqaefsdmi anslqkrqaa girsqkprrv asykkgtley lqlnttdkes tyf

[0014] A proteína GCC tem alguns domínios geralmente aceitados, cada qual contribui uma função separável à molécula de GCC. As porções de GCC incluem uma seqüência de sinal (para dirigir a proteína à superfície de célula) do resíduo de amino-ácido 1 para cerca de o resíduo 23, ou o resíduo 1 para cerca de o resíduo 21 de SEQ. ID NO: 3 (excisado para maturação para produzir uma proteína madura funcional de cerca de resíduos de amino-ácido 22 ou 24 a 1073 do SEQ. ID NO: 3), um domínio extracelular para ligante, por exemplo, guanilina ou ST, ligando cerca de do resíduo de amino-ácido 24 para cerca de o resíduo 420, ou cerca de do resíduo 54 para cerca de o resíduo 384 de SEQ. ID NO: 3, um domínio de transmembrana cerca de do resíduo de amino-ácido 431 para cerca de o resíduo 454, ou cerca de do resíduo 436 para cerca de o resíduo 452 de SEQ. ID NO: 3, um domínio de homologia de quinase, previsto a ter a atividade de quinase de tirosina cerca de do resíduo de amino-ácido 489 para cerca de o resíduo 749, ou cerca de do resíduo 508 para cerca de o resíduo 745 do SEQ. ID NO: 3 e um domínio catalítico de guanilil ciclase cerca de do resíduo 750 para cerca de o resíduo 1007, ou cerca de do resíduo 816 para cerca de o resíduo 1002 de SEQ. ID NO: 3.

[0015] Em tecidos humanos normais, GCC é expressado nas células mucosais, por exemplo, nas membranas de borda em escova apicais, revestindo o intestino delgado, o intestine grosso e o reto (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). A expressão de GCC é mantida mediante a transformação neoplástica de células epiteliais intestinais, com expressão em todos os tumores coloretais primários e metastáticos (Carritherset al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Câncer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 16531661 (1994)). Células Neoplásticas do estômago, do esôfago e da junção gastroesofágica também expressam GCC (ver, por exemplo, Pat. U.S. Num. 6.767.704; Debruyne et al. Gastroenterology 130:1191-1206 (2006)). A expressão e associação específicas de tecido com câncer, por exemplo, de origem gastrointestinal, (por exemplo, câncer coloretal, câncer do estômago, câncer do esôfago ou câncer do intestino delgado), podem ser exploradas para o uso de GCC como um marcador diagnóstico para esta doença (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Câncer 41: 1618-1627 (2005)). Adicionalmente, conforme demonstrado nos exemplos neste documento, diversos tipos diferentes de câncer de origem não-gastrointestinal foram observados expressando GCC, incluindo mas não limitados a câncer pancreático, câncer de pulmão, a sarcomas de tecido macio (por exemplo,leiomiossarcoma e rabdomiossarcoma) gastrointestinais ou tumores neuroendócrinos broncopulmonares e tumores neuroectodérmicos. Como uma proteína de superfície de célula, GCC pode também servir como um objetivo diagnóstico ou terapêutico para proteínas de ligação do receptor tais como anticorpos ou ligantes. No tecido intestinal normal, o GCC é expressado no lado apical das junções apertadas de célula epitelial que formam uma barreira impermeável entre o ambiente luminal e o compartimento vascular (Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873); Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026 (1987)). Desta maneira, a administração intravenosa sistêmica de uma terapêutica proteina ligando ao GCC tem o efeito mínimo nos receptores intestinais do GCC, enquanto tem acesso às células neoplásticas do sistema gastrointestinal, incluindo células de câncer de cólon invasivas ou metastáticas, tumores de cólon extraintestinais ou metastáticos, tumores de esôfago ou tumores de estômago, adenocarcinoma na junção gastroesofágica. Adicionalmente, o GCC internaliza através de endocitose mediada por receptor mediante à ligação do ligante (Buc et al. Eur J Câncer 41: 1618-1627 (2005); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995)).

[0016] Anticorpos policlonais criados contra o domínio extracelular de GCC (Nandi et al. Protein Expr. Purif. 8:151-159 (1996)) foram capazes de inibir o peptídeo ST ligando ao GCC humano e de rato e inibir a produção de cGMP mediada por ST pelo GCC humano.

[0017] GCC tem sido caracterizada como uma proteína envolvida em cânceres incluindo cânceres de cólon. Ver também, Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Câncer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995). As moléculas de anticorpo dirigidas ao GCC podem portanto ser usadas sozinhas ou em forma não- conjugada para inibir as células câncerígenas expressando GCC. Adicionalmente, as moléculas de anticorpo dirigidas ao GCC podem ser usadas de forma não-atrelada ou de marcadora, para detectar as células câncerígenas expressando GCC. As moléculas de anticorpo anti-GCC da invenção podem ligar o GCC humano. Em algumas modalidades, uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção pode inibir a ligação de um ligante, por exemplo, guanilina ou enterotoxina estável por calor ao GCC. Em outras modalidades, uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção não inibe a ligação de um ligante, por exemplo, guanilina ou enterotoxina estável por calor ao GCC.

[0018] Os anticorpos monoclonais específicos para o GCC incluem o GCC: B10 (Nandi et al., J. Cell. Biochem. 66:500-511 (1997)), GCC:4D7 (Vijayachandra et al. Biochemistry 39:16075-16083 (2000)) e GCC:C8 (Bakre et al. Eur. J. Biochem. 267:179-187 (2000)). GCC: B10 tem uma cadeia leve de kappa e um isotipo IgG2a reage de forma cruzada ao GCC de camundongo, porco e macaco. GCC:B10 liga-se aos primeiros 63 amino-ácido do domínio intracelular de GCC, especificamente aos resíduos 470-480 de SEQ. ID NO: 3 (Nandi et al. Protein Sci. 7:2175-2183 (1998)). GCC:4D7 liga-se ao domínio de homologia de quinase, dentro dos resíduos 491-568 de GCC (Bhandari et al. Biochemistry 40:9196-9206 (2001)). GCC:C8 Liga-se ao domínio semelhante a quinase de proteína na porção citoplásmica do GCC.

Definições

[0019] A menos que definido de outra forma neste documento, todos os termos técnicos e científicos usados em conexão com a presente invenção terão os significados como comumente entendidos por aqueles ordinariamente versados na técnica. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, célula e cultura de tecidos, biologia molecular e proteína e química oligo- ou polinucleotídica e hibridização descrita neste documento são aquelas conhecidas e usadas na arte. Os números de ascensão de GenBank ou de GenPept e as seqüências de ácido nucleico e peptídeo úteis podem ser encontrados na página da web mantida pelo National Center forBiotechnological Information, Bethesda Md. Técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, e cultura, transformação e transfecção de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou conforme comumente se realiza na técnica ou conforme descrito neste documento. As técnicas e os procedimentos precedentes geralmente são realizados de acordo com métodos convencionais conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas durante o presente relatório descritivo. Ver por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)) ou ver, em geral, Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas de laboratório de, descritos neste documento são conhecidos na técnica. Ademais, a menos que seja exigido o contrário pelo contexto, os termos no singular devem incluir as pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

[0020] Conforme usado neste documento, o termo "molécula de anticorpo" refere-se a um anticorpo, imunoglobulina ou peptídeo(s) de anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno de qualquer um dos antecedentes, por exemplo, de um anticorpo. As moléculas de anticorpo incluem moléculas de anticorpo de cadeia única, por exemplo, scFv, ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883), e moléculas de anticorpo de domínio único, ver, e.g., WO9404678. Embora não dentro do termo "moléculas de anticorpo", a invenção inclui também "análogo(s) de anticorpo", outros suportes não-anticorpos baseados em proteína de molécula, por exemplo, as proteínas e/ou os imunoconjugados de fusão que usam CDRs para prover ligação específica de antígeno.

[0021] Uma "molécula de anticorpo anti-GCC" refere-se a uma molécula de anticorpo (isto é, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo ou análogo de anticorpo) que interaja com ou reconheça, por exemplo, ligações (por exemplo, ligações especificamente) a GCC, por exemplo, GCC humano. Moléculas de anticorpo anti-gcc exemplares são tais como aquelas resumidas nas tabelas 1 e 2.

[0022] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo", "peptídeo(s) de anticorpo) ou "imunoglobulina" referem-se a proteinas e glicoproteínas de cadeia única, cadeia dupla, multi-cadeia. O termo anticorpo inclui os anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, CDR-enxertados e os anticorpos humanos ou humanizados, todos os quais são discutidos mais detalhadamente em outra parte deste documento. São incluídos também dentro do termo os anticorpos de camelídeos, ver, por exemplo, US2005/0037421, e os nanocorpos, por exemplo, IgNARs (anticorpos do tubarão), ver, por exemplo, WO03/014161. O termo "anticorpo" inclui também o as variantes sintética e geneticamente manipuladas.

[0023] Conforme usado neste documento, o termo "fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo referem-se, por exemplo, a Fab, Fab', F(ab') 2, e fragmentos de Fv, anticorpos de cadeia única, anticorpos de cadeia pesadas funcionais (nanocorpos), assim como qualquer porção de um anticorpo que tem uma especificidade direcionada a pelo menos um epitopo desejado, que compete com o anticorpo intacto para a ligação específica (por exemplo, um fragmento que tem seqüências CDR suficientes e que tem seqüências de framework suficientes para ligar especificamente a um epitopo). Por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno pode competir para ligar a um epitopo que liga o anticorpo do qual o fragmento foi derivado. Derivado, como usado neste e em contextos similares, não implica nenhum método ou processo particular de derivação, mas pode se referir meramente à similaridade de seqüência. Fragmentos de ligação podem ser produzidos por técnicas recombinantes ou por clivagem química ou enzimática de anticorpos intactos. O termo, fragmento de ligação ao antígeno, quando usado com uma única cadeia, por exemplo, uma cadeia pesada, de um anticorpo que tem uma cadeia leve e uma pesada significa que o fragmento da cadeia é suficiente tal que quando combinado com uma região variável completa da outra cadeia, por exemplo, a cadeia leve, ele permitirá ligar pelo menos 25, 50, 75, 85 ou 90% daquilo visto com o todo da região variável pesada e leve.

[0024] O termo "constelação de ligação de antígeno de CDRs" ou "um número de CDRs suficiente para permitir ligação" (e linguagem similar), conforme usado neste documento, refere-se a CDRs suficiente de uma cadeia, por exemplo, a cadeia pesada, tal que quando colocados em um framework e combinados com uma região variável completa da outra cadeia, ou com uma porção da região variável da outra cadeia de comprimento similar e tendo o mesmo número de CDRs, por exemplo, a cadeia leve, que permitirá ligar, por exemplo, pelo menos 25, 50, 75, 85 ou 90% daquilo visto com o todo da região variável pesada e leve.

[0025] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo que seja derivado de um anticorpo não-humano, por exemplo, coelho, roedor (por exemplo, murina), carneiro ou cabra, que retêm ou retêm substancialmente as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo parental mas é menos imunogênica nos seres humanos. Humanizado conforme usado neste documento é destinado a incluir anticorpos desimunizados. Tipicamente, os anticorpos humanizados incluem CDRs não-humanos ou framework derivado de humanos e regiões constantes.

[0026] O termo anticorpo "modificado", comfrome usado neste documento, refere-se aos anticorpos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os anticorpos expressados usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeiro, anticorpos isolados de uma recombinante, biblioteca de anticorpos combinatórios, anticorpos isolados de um animal não-humano (por exemplo, um coelho, um rato, um camundongo, um carneiro ou uma cabra) que seja transgênico para genes imunoglobulinos humanos ou anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por qualquer meio que envolva splicing de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos modificados incluem anticorpos humanizados, enxertados por CDR (por exemplo, um anticorpo tendo CDRs de um primeiro anticorpo e uma região da framework de uma fonte diferente, por exemplo, um segundo anticorpo ou uma framework de consenso), quiméricos, gerados in vitro(por exemplo, por exibição de fago), e podem opcionalmente incluir regiões variáveis ou constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humanas ou os genes de imunoglobulinas humanos ou anticorpos que foram preparados, expressados, criados ou isolados por qualquer meio envolva o splicing de sequências de gene de imunoglobulinas humanas a sequências de imunoglobulina alternativas. Em modalidades, uma molécula modificada de anticorpo inclui uma molécula de anticorpo que tem uma mudança da seqüência de um anticorpo de referência.

[0027] O termo "anticorpo monoespecífico" refere-se a um anticorpo ou preparação de anticorpos que exibe uma especificidade de ligação única e afinidade por um epitopo em particular. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal." O termo "anticorpo biespecífico" ou "anticorpo bifuncional" refere-se a um anticorpo que exibe a especificidade de ligação dupla para dois epitopos, onde cada local de ligação difere-se e reconhece um epítopo diferente.

[0028] Os termos "anticorpo não-conjugado" e "anticorpo não- atrelado" são usados permutavelmente para se referir a uma molécula de anticorpo que não é conjugada a uma fração do não-anticorpo, por exemplo, um agente ou um marcador.

[0029] Cada um dos termos "imunoconjugado", "conjugado de anticorpo-droga" e "conjugado de anticorpo" são usados permutavelmente e se referem a uma molécula de anticorpo que não é conjugada a uma fração do não-anticorpo, por exemplo, um agente ou um marcador. O termo "agente" é usado neste documento para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extcamundongo feito de materiais biológicos. O termo "agente terapêutico" refere-se a um agente que tenha atividade biológica. Agentes terapêuticos exemplares são agentes quimioterapêuticos.

[0030] O termo "agente anti-câncer" ou "agente quimioterapêutico" é usado neste documento para se referir aos agentes que têm a propriedade funcional de inibir um desenvolvimento ou progressão de um neoplasma em um humano, particularmente uma lesão maligna(câncerígena), tal como um carcinoma, sarcoma, linfoma, ou inibir a leucemia de metástase ou de angiogênese é frequentemente uma propriedade de agentes anti-câncer ou quimioterapeuticas. Um agente quimioterapêutico pode ser um agente citotóxico ou citostático. O termo "agente citostático" refere-se a um agente que inibe ou suprime o crescimento de célula e/ou a multiplicação de célula.

[0031] "Agentes citotóxicos" refere-se aos compostos que causam a morte de célula primeiramente por interferir diretamente com o funcionamento de célula, including, mas não limitado a, agentes de alquilação, inibidores de fator de necrose de tumor, intercaladores, inibidores de microtúbulos, inibidores de quinase, inibidores de proteassoma e inibidores da topoisomerase. Uma "carga tóxica", conforme usado neste documento refere-se a uma quantidade suficiente de agente citotóxico que, quando imposta a uma célula, resulta em morte celular. A imposição de uma carga tóxica pode ser realizada pela administração de uma quantidade suficiente de imunoconjugados compreendendo um fragmento de antígeno de ligação ou anticorpo da invenção e um agente citotóxico. A imposição de uma carga tóxica pode também ser realizada pela administração de uma quantidade suficiente de um imunoconjugado compreendendo um agente citotóxico, em que o imunoconjugado compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno secundário que reconhece e liga um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Como usado neste documento, a frase, uma seqüência "derivada de" ou "específica para uma sequência designada" refere-se a uma seqüência que compreende uma seqüência contígua de cerca de pelo menos 6 nucleotídeos ou pelo menos 2 aminoácidos, cerca de pelo menos 9 nucleotídeos, ou pelo menos 3 aminoácidos, cerca de pelo menos 10-12 nucleotídeos ou 4 aminoácidos, ou cerca de pelo menos 15-21 nucleotídeos ou aminoácidos correspondentes 5-7, ou seja, idênticos ou complementares a, por exemplo, uma região contígua da sequência designada. Em certas modalidades, a sequência compreende o todo de uma sequência designada de aminoácido ou nucleotídeo. A seqüência pode ser complementar (no caso de uma seqüência de polinucleotídeo) ou idêntica a uma região da seqüência que seja exclusiva a uma seqüência em particular, conforme determinado pelas técnicas conhecidas na técnica. As regiões das quais as sequências podem ser derivadas, incluem mas não são limitadas a regiões que codificam epitopos específicos, regiões que codificam CDRs, regiões que codificam sequências de framework, regiões que codificam regiões de domínio constante, regiões que codificam regiões de domínio variável, assim como regiões não-traduzidas e/ou não-transcritas. A seqüência derivada não será necessariamente derivada fisicamente da sequência de interesse sob estudo, mas pode ser gerada em qualquer maneira, incluindo, mas não limitado a, a síntese química, replicação, transcrição inversa ou transcrição, que é baseado na informação provida pela sequência de bases da(s) região (ões) a partir da qual o polinucleótideo é derivado. Dessa maneira, pode representar um sentido ou uma orientação de anti-sentido do polinucleotídeo original. Além disso, as combinações de regiões que correspondem àquela da sequência designada podem ser modificadas ou combinadas em maneiras conhecidas na técnica, consistentes com o uso pretendido. Por exemplo, uma seqüência pode compreender duas ou mais sequências contíguas, cada uma compreendendo parte de uma seqüência designada, e são interrompidas com uma região que não seja idêntica à sequência designada mas destinada a representar uma sequência derivada da sequência designada. No que diz respeito às moléculas de aticorpo, "derivadas destes" inclui uma molécula de anticorpo que é funcionalmente ou estruturalmente relacionada a um anticorpo de comparação, por exemplo, "derivadas deste" inclui uma molécula de anticorpo que tem similar ou substancialmente a mesma sequência ou estrutura, por exemplo, tendo os mesmos ou similares CDRs, frameworks ou regiões variáveis. "Derivado deste" para um anticorpo inclui também resíduos, por exemplo, um ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais resíduos, que podem ou não podem ser contíguos, mas são definidos ou identificados de acordo com um esquema de numeração ou uma homologia à estrutura geral do anticorpo ou uma proximidade tridimensional, isto é, dentro de um CDR ou de uma região de framework, de uma sequência de comparação. O termo "derivado deste" não é limitado ao derivado fisicamente deste, mas inclui geração por qualquer maneira, por exemplo, pelo uso da informação de sequência de um anticorpo de comparação para projetar um outro anticorpo.

[0032] Conforme usado neste documento, a frase "codificado por" refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que codifique para uma sequência de polipeptídeo, em que a seqüência de polipeptídeo ou uma porção deste contém uma sequência de amino-ácido de pelo menos de 3 a 5 aminoácidos, pelo menos 8 a 10 aminoácidos, ou pelo menos 15 a 20 aminoácidos de um polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico.

[0033] Conforme usado neste documento, o termo “câncer colorretal”, também conhecido comumente como o câncer de colo ou câncer de intestino, refere-se a câncer de crescimento descontrolado de célula no colo ou no reto (partes do intestine grosso), ou no apêndice.

[0034] Os termos “câncer de estômago” e “câncer gástrico” são usados neste documento permutavelmente.

[0035] Calculações de "homologia" entre duas sequências podem ser feitas conforme segue. As sequências são alinhadas para finalidades de comparação ideais (por exemplo, espaços podem ser introduzidos em um ou ambos o primeiro e segundo amino-ácido ou ácido nucleico para o alinhamento ideal e as sequências não-homólogas podem ser ignoradas para finalidades de comparação). O comprimento de uma sequência de referência alinhada para finalidades da comparação é pelo menos 30%, 40%, ou 50%, pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como usado neste documento a "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente à "homologia" do aminoácido ou ácido nucleico). A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de espaços, e o comprimento de cada espaço, que necessitam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências.

[0036] A comparação de sequências e determinação da identidade percentual entre as duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. A homologia percentual entre duas sequências de amino-ácido pode ser determinada usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o algorítimo Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970), que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de espaço de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. O percentual de homologia entre duas sequências de nucleotídeo pode também ser determinado usando o programa GAP no pacote de software GCG (Accelerys, Inc. San Diego, Califórnia), usando uma matriz de NWSgapdna.CMP e um peso de espaço de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um conjunto exemplar dos parâmetros para a determinação de homologia é uma matriz de pontuação de Blossum 62 com uma penalidade de espaçõ de 12, uma uma penalidade de extensão de espaço 4, e uma penalidade de espaço do frameshift de 5.

[0037] Como usado neste documento, o termo "hibridiza sob condições de alto rigor" descreve condições para hibridização e lavagem. A orientação para a realização de reações de hibridização pode ser encontrada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Os métodos aquosos e não aquosos são descritos nessa referência e também podem ser usados. Condições específicas de hibridação referidas neste documento são as seguintes: 1)Condições de hibridação de baixo rigor em 6X citrato de sódio/cloreto de sódio (SSC) a cerca de 45 ° C, seguido de duas lavagens em 0.2 X SSC, 0,1% SDS, pelo menos a 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55 ° C, para condições de baixo rigor); 2) condições de hibridização de rigor médio em 6XSSC a cerca de 45 ° C, seguido de uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1%SDS a 60°C; 3) condições de hibridização de alto rigor em 6X SSC em cerca de 45°C, seguido de uma ou mais lavagens em 0.2X SSC, 0,1% SDS a 65°C; e 4) condições de hibridação de muito alto rigor são fosfato de sódio 0,5 M, 7% SDS a 65°C, seguido de uma ou mais lavagens em 0.2X SSC, 1% SDS a 65°C. Condições de rigor muito alto (4) são muitas vezes as condições preferenciais e aquelas que devem ser usadas a menos que especificado o contrário.

[0038] Compreende-se que os anticorpos e seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção podem ter as substituições de aminoácido conservativas ou não-essencias adicionais, que não têm um efeito substancial nas funções do polipeptídeo. Se uma substituição em particular será tolerada ou não, ou seja, não vai afetar adversamente as propriedades biológicas desejadas, tais como a atividade de ligação, pode ser determinado conforme descrito em Bowie, J U et al. Science 247:1306-1310 (1990) or Padlan et al. FASEB J. 9:133-139 (1995). Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram bem definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas ( por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[0039] Um resíduo "não-essential" de amino-ácido é um resíduo que pode ser alterado da sequência do tipo selvagem do agente de ligação, por exemplo, o anticorpo, sem abolir ou, sem substancialmente alterar uma atividade biológica, visto que um resíduo de amino-ácido essencial resulta em tal mudança. Em um anticorpo, um resíduo de amino-ácido essencial pode ser uma especificidade que determina o resíduo (SDR).

[0040] Conforme usado neste documento, o termo "isolado" refere-se ao material que é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele for de ocorrência natural). Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo ocorrendo natrualmente presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou DNA ou polipeptídeo, separado de algum ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural, são isolados. Tal polinucleotídeo ou polipeptídeo poderia ser parte de um vetor e/ou tal polinucleotídeo ou polipeptídeo poderia ser parte de uma composição, por exemplo, uma mistura, solução ou suspensão ou compreender uma célula isolada ou uma célula cultivada que compreende o polinucleotídeo ou o polipeptídeo, e ser ainda isolado em que o vetor ou a composição não são parte de seu ambiente natural.

[0041] Conforme usado neste documento, o termo "replicão" refere-se a qualquer elemento genético, tal como um plasmídeo, um cromossomo ou a um vírus, que se comporta como uma unidade autônoma de replicação de polinucleotídeo dentro de uma célula.

[0042] Conforme usado neste documento, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma situação em que componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar em sua maneira pretendida. Portanto, por exemplo, uma sequência de controle "operacionalmente ligada" a uma sequência de codificação é ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é atingida em condições compatíveis com as sequências de controle.

[0043] Conforme usado neste documento, o termo "vetor" refere- se a um replicão em que outro segmento polinucleotídeo é anexado, com o fim de, por exemplo, provocar a replicação e/ou expressão do segmento anexado.

[0044] Conforme usado neste documento, o termo "sequência de controle" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo que é necessária para efetuar a expressão de uma sequência de codificação à qual ele é ligado. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Em procariotes, tais sequências de controle incluem geralmente um promotor, um local de ligação ribosomal e terminadores e, em alguns exemplos, intensificadores. O termo "sequências de controle" destina-se, portanto, a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder.

[0045] Conforme usado neste documento, o termo "produto purificado" refere-se a uma preparação do produto que foi isolado dos constituentes celulares com os quais o produto é normalmente associado e/ou de outros tipos de células que podem estar presentes na amostra do interesse.

[0046] Conforme usado neste documento, o termo "epitopo" refere-se a uma determinado de proteína capaz de ligar-se especificamente a um anticorpo. Determinantes epitópicos geralmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Alguns epitopos são epitopos lineares, enquanto outros são epitopos conformacionais. Um epitopo linear é um epitopo em que uma seqüência primária de amino-ácido contíguo compreende o epitopo reconhecido. Um epitopo linear inclui tipicamente pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos contíguos. Um epitopo conformacional pode resultar de pelo menos duas situações, como: a) uma seqüência linear que seja exposta somente ao anticorpo ligando-se a determinadas conformações de proteína, por exemplo, dependentes de ligação por ligante, ou dependente da modificação (por exemplo, fosforilação) por sinalização de moléculas; ou b) uma combinação de características estruturais de mais de uma parte da proteína, ou em proteínas de multisubunidades, de mais de uma subunidade, em que as características estão em proximidade suficientemente próxima ao espaço 3-dimensional participando da ligação.

[0047] Conforme usado neste documento, o isotipo refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgA, IgE ou IgG) que é codificada por genes de região constantes de cadeia pesada.

[0048] Conforme usado neste documento, os termos "agente detectável", "marcador" ou "marcados" são usados para referir-se à modalidade de um marcador detectável em um polipeptídeo ou em uma glicoproteína. Vários métodos de marcar polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Os exemplos das marcadors para polipeptídeos incluem, mas não estão limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, índio (111 In), iodo (131 I ou 125 I), ítrio (90 Y) , lutécio (177 Lu), actínio (225 Ac), bismuto (212 Bi ou 213 Bi), enxofre (35 S), carbono (14 C), trítio (3 H), ródio (188 Rh), tecnécio (99 mTc), praseodímio, ou fósforo (32 P), ou um radionuclídeo-emissor de pósitrons, como por exemplo, carbono-11 (11 C), potássio-40 (40 K), nitrogênio-13 (13 N), oxigênio- 15 (15 O) 9, flúor-18 (18 F), gálio-68 (68 Ga) e iodo-121 (121 I)), marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, substâncias fosforecentes de lantanídeos), marcadores enziméticos (por exemplo, peroxidase de rábano, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos de biotinil (que podem ser detectados por uma avidina marcada, por exemplo, uma molécula que contém uma fração de estreptavidina e um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétricos), e epítopos de polipéptidos pré- determinados, reconhecidos por um relatório secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epitopo) .. Em algumas modalidades, os marcadores são unidos por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial de impedimento estérico.

[0049] Conforme usado neste documento, "ligamento específico", "liga-se especificamente a" ou "especificidade de ligação" significam, para uma molécula de anticorpo anti-GCC, que a molécula de anticorpo liga a GCC, por exemplo, proteína humana do GCC, com afinidade maior do que com uma proteína anti-GCC, por exemplo, BSA. Tipicamente uma molécula anti-GCC tem um Kd para a proteína não-GCC, por exemplo, BSA, que é maior que 2, maior que 10, maior que 100, mais maior que 1.000 vezes, maior que 104, maior que 105, ou maior que 10 6 vezes seu Kd para GCC, por exemplo, proteína humana de GCC. Em determinação de Kd, a K Kd para GCC e a proteína não-GCC, por exemplo, BSA, devem ser feitas nas mesmas condições.

[0050] O termo “afinidade” ou “afinidade de ligação” refere-se à constante da associação aparente ou Ka. O Ka é o recíproco da constante de dissociação (Kd). Um anticorpo pode, por exemplo, ter uma afinidade de ligação de pelo menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 e 1011 M-1 para uma molécula alvo em particular. Uma ligação de afinidade mais alta de um anticorpo a um primeiro alvo relativo a um segundo alvo pode ser indicada por um KA mais elevado (ou um valor numérico menor KD) para ligar o primeiro alvo do que o KA (ou valor numérico KD) para ligar o segundo alvo. Nesses casos, o anticorpo tem a especificidade para o primeiro alvo (por exemplo, uma proteína em uma primeiro conformação ou sua imitação) relativo ao segundo alvo (por exemplo, a mesma proteína em uma segundo conformação ou sua imitação; ou uma segunda proteína). As diferenças em afinidade de ligação (por exemplo, por especifidade ou outras comparações) podem ser pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, ou 105vezes.

[0051] A afinidade de ligação pode ser determinada por uma variedade de métodos incluindo diálise de equilíbrio, ligação equilíbrio, filtração de gel, ELISA, ressonância 19act cc superficial , ou espectroscopia (por exemplo, usando um teste de fluorescência). Por exemplo, a afinidade relativa de uma molécula de anticorpo anti-GCC pode ser medida a partir das medidas de ELISA contra a proteína GCC (por exemplo, o imunogene usado para criar moléculas de anticorpo anti-GCC), por medidas de FACS com o GCC que expressa células.

[0052] Condições exemplares para a avaliação de ligação de afinidade estão no TRIS-tampão (50mM TRIS, 150mM NaCl, 5mM CaCl2 a pH7,5). Estas técnicas podem ser usadas para medir a concentração de proteína ligada e em ligação livre em função da concentração de proteína de ligação (ou o alvo). A concentração de proteína de ligação ligada ([Bound]) é relacionada à concentração de proteína de ligação livre ([Free]) e à concentração de locais de ligação para a proteína de ligação no alvo onde (N) é o número de locais de ligação por molécula alvo pela seguinte equação: [Bound] = N • [Free]/((1/KA) + [Free]).

[0053] Mas, não é sempre necessário fazer uma determinação exata de KA, já que às vezes é suficiente obter uma medida quantitativa de afinidade, por exemplo, determinada usando um método tal como a análise ELISA ou FACS, é proporcional a KA, e assim pode ser usado para comparações, tais como determinar se uma afinidade mais elevada é, por exemplo, mais alta em dobro, para obter uma medida qualitativa de afinidade, ou para obter um inferência de afinidade, por exemplo, pela atividade em um teste funcional, por exemplo, um teste in vitro ou teste in vivo . A afinidade de moléculas de anticorpo anti-GCC pode também ser medida usando uma tecnologia tal como a Análise Biomolecular de interação (BIA) em tempo real (ver, por exemplo, Sjolander, S, e Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 e Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Conforme usado neste documento, "BIA" ou "ressonância plasmônica de superfície" é uma tecnologia para estudar interações biospecíficas em tempo real, sem marcar quaisquer dos interagentes (por exemplo, BIACORETM). Mudanças na massa na superfície de ligação (indicativo de um evento de ligação) resultam em alterações do índice de refração de luz próximo à superfície (o fenômeno ótico de ressonância plasmônica de superfície (SPR)), resultando em um sinal detectável que pode ser usado como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas.

[0054] A medida de afinidade de moléculas de anticorpo anti-GCC usando um sistema de BIACORETM T100 (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey) é descrita no exemplo 1 no Pedido de Patente US N° 2011/0110936, todo o conteúdo deste é aqui incorporado por referência. Brevemente, um anticorpo anti-GCC (Preparação A) é diluído a uma concentração apropriada (por exemplo, 20 μg/mL) em 10mM de acetato de sódio, pH 4,0 e um controle/referência de anticorpo (Preparação B) é diluído a uma concentração apropriada (por exemplo, 10 μg/mL) em 10mM de acetato de sódio, pH 4,0. Cada anticorpo é covalentemente imobilizado a diversos chips de CM4 BIACORE usando o acoplamento de amina padrão. Para cada chip de CM4 preparada, anticorpo de Preparação A é imobilizado sobre duas células de fluxo em torno de 75-100 RU enquanto o anticorpo de preparação B é imobilizado a uma célula de fluxo em torno de 70-80 RU. A quarta célula de fluxo restante de cada chip de CM4 é usada como a célula de fluxo de referência. A concentração de proteína GCC pode ser determinada usando os métodos detalhados por Pace et al. em Protein Science, 4:2411 (1995) e Pace e Grimsley em Current Protocols in Protein Science 3.1.1-3.1.9 (2003).. Para cada chip CM4 preparado, proteína GCC é injetada por 2 minutos em uma faixa de concentração de 202 nM -1,6 nM (2.vezes. diluição serial) seguido de uma dissociação de 7 minutos. As amostras são injetadas aleatoriamente em três exemplares com diversos ciclos de injeção de tampão intercalados para dupla referência. Para obter dados mais significativos da taxa de dissociação de deterioração, três injeções adicionais de proteína 101 nM GCC adicionais e três injeções de tampão adicionais são executadas com uma injeção de 2 minutos e um tempo de dissociação de 4 horas. Uma taxa de fluxo de 100 μL/min é usada para todas os experimentos, e todas as superfícies são regeneradas com pulso de 20 segundos de 10 mM de glicina- HCl (pH 2,0). Todas as amostras são preparadas no tampão em execução (por exemplo, solução salina, tamponada com Hepes, 0,005% polisorbato 20, pH 7,4 (HBS-P)) com 100 ug / ml de BSA adicionado. Todos os dados de sensorgrama (representação gráfica de ressonância plasmônica de superfície versus tempo) podem ser processados com software Scrubber 2.0 (BioLogic Software, Campbell, Australia) e encaixado de maneira geral em um modelo de interação 1:1 incluindo um termo para a constante de transporte de massa km usando o software CLAMPTM (Myszka and Morton Trends Biochem. Sci. 23:149-150 (1998)).

[0055] Conforme usado neste documento, o termo "tratar" ou "tratamento" é definido como a administração de uma molécula de anticorpo anti-GCC para um assunto, por exemplo, um paciente, ou administração, por exemplo, pela aplicação, a um tecido isolado ou célula de um sujeito que é retornado para o sujeito. A molécula de anticorpo anti-GCC pode ser administrada sozinha ou em combinação com um segundo agente. O tratamento pode ser para curar, recuperar, atenuar, aliviar, alterar, remediar, paliar, melhorar ou afetar o distúrbio, os sintomas do distúrbio ou a predisposição para o distúrbio, por exemplo, um câncer. Embora não deseja- se ser limitado pela teoria, acredita-se que o tratamento cause a inibição, a ablação, ou morte de uma célula in vitro ou in vivo, ou de outra forma reduzir a capacidade de uma célula, por exemplo, uma célula aberrante, para mediar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio, tal como aqui descrito (por exemplo, um câncer) ..

[0056] Conforme usado neste documento, o termo "sujeito" é pretendido a incluir mamíferos, primatas, seres humanos e animais não- humanos. Por exemplo, um sujeito pode ser um paciente (por exemplo, um paciente humano ou um paciente veterinário), que tem um câncer, em que pelo menos algumas das células expressam GCC, tal como um câncer de origem gastrointestinal (por exemplo, câncer colorretal, câncer do estômago, câncer de intestino delgado, ou câncer de esôfago), câncer pancreático, câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma), sarcoma de tecidos moles (por exemplo, leiosacroma ou rabdomiossarcoma), tumores neuroendócrinos (por exemplo, gastrointestinais ou broncopulmonares), ou tumores neuroectodérmicos; um sintoma de tais cânceres que expressam gcc; ou uma predisposição para tais cânceres expressando gcc. Como um outro exemplo, o assunto pode ser um paciente que tem um distúrbio gastrointestinal em que pelo menos algumas das células do sistema gastrointesinal expressem GCC, tais como a síndrome inflamatória intestinal , a doença de Crohn e a constipação. Como outro exemplo, o assunto pode ser um paciente que tem um distúrbio neurológico em que pelo menos alguns neurônios dentro do sistema nervoso central do paciente expressam o GCC, tal como a doença de Parkinson. O termo "animais não-humanos" da invenção incluem todos os vertebrados não- humanos, por exemplo, mamíferos não-humanos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, camundongo, rato, coelho ou cabra, etc, a menos que indicado de outra forma. Em uma modalidade, o “assunto” exclui um ou mais ou todos dentre camundongo, rato, coelho ou cabra.

[0057] Conforme usado neste documento, uma quantidade de uma molécula de anticorpo anti-GCC "eficaz" ou "suficiente" para tratar um distúrbio, ou uma quantidade "terapeuticamente eficaz" ou "quantidade terapeuticamente suficiente" referem-se a uma quantidade da molécula do anticorpo que é eficaz, mediante única ou múltipla administração de dose a um assunto, em tratar uma célula, por exemplo, célula de câncer (por exemplo, uma célula de tumor expressando GCC), ou em prolongar curar, aliviar, ou melhorar um assunto com um distúrbio conforme descrito neste documento além daquele esperado na ausência de tal tratamento. Conforme usado neste documento, "inibir o crescimento" do tumor ou do câncer refere- se a retardar, interromper, prender ou parar seu crescimento e/ou metástases e não indica necessariamente uma eliminaçao total do crescimento do tumor.

[0058] Conforme usado neste documento, "GCC", também conhecido como "STASR", "GUC2C", "GUCY2C" ou proteína "ST receptora" refere-se ao GCC mamífero, de preferência proteína GCC humana. GCC humana refere-se à proteína mostrada na SEQ. ID NO: 3 de ocorrência natural e variantes alélicas de proteína. O alelo em SEQ. ID NO: 3 pode ser codificado pela sequência de ácido nucleico de GCC mostrada na SEQ. ID NO: 2. Outras variantes são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, o número de acesso Ensp0000261170, Ensembl Database, European Bioinformatics Institute e Wellcome Trust Sanger Institute, que tem uma leucina no resíduo 281; SEQ ID NO: 14. do número de pedido de patente publicado U.S. 20060035852; ou número de acesso GenBank AAB 19934. Tipicamente, uma variante alélica que ocorre naturalmente, tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 95%, 97% ou 99% idêntica à sequência de GCC de SEQ. ID NO: 3. O transcrito codifica um produto de proteína de 1073 aminoácidos, e é descrito no acesso do GenBank. :: NM_004963. A proteína GCC é caracterizada como uma proteína receptora superficial de célula de transmembrana, e acreditada-se que tem um papel crítico na manutenção do fluido intestinal, da homeostase do eletrólito e da proliferação celular. Anticorpos Anti-GCC

[0059] Descritas neste documento estão moléculas de anticorpo anti-GCC úteis, inter alia para detectar expressão de GCC. As moléculas de anticorpo anti-GCC, por exemplo, úteis para a deteção de GCC, podem incluir moléculas de anticorpo anti-GCC não-humanas (por exemplo, moléculas de anticorpo não-humanas e não-murinas) que ligam-se especificamente ao GCC, por exemplo, com uma afinidade de ligação de pelo menos 103, 104, 105, 106, 107,108, 109, 1010 and 1011 M-1 ao o GCC. A molécula de anticorpo anti-GCC pode ser uma molécula de anticorpo não-humana, não-murina e não-rato, por exemplo, uma molécula de anticorpo de anti-GCC do coelho, por exemplo, conforme descrito neste documento.

[0060] Em certos aspectos, a invenção relaciona-se às moléculas de anticorpo anti-GCC que incluem características tais como aquelas resumidas nas tabelas 1 e 2. Em otros aspectos, a invenção relaciona-se às moléculas de anticorpo anti-GCC que incluem características tais como aquelas resumidas nas tabelas 3, 4, 5 e/ou 6.

[0061] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC é um anticorpo de hibridoma de coelho e é um dentre anticorpo MIL-44-148-2 ou MIL-44-67-4. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC é derivada do anticorpo MIL-44-148-2 ou MIL-44-67-4.

[0062] Em uma modalidade uma molécula de anticorpo anti-GCC tem uma afinidade para GCC, por exemplo, conforme medido por testes de ligação direta ou de ligação de competição. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC tem um Kd de menos que 1x10-6 M, menos que 1x10-7 M, menos que 1x10-8 M, menos que 1x10-9 M, menos que 1x10-10 M, menos que 1x 10-11 M, menos que 1x10-12 M, ou menos que 1x10-13 M. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo é um IgG, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, e tem um Kd de menos que 1x10-6 M, menos que 1x10-7 M, menos que 1x10-8 M, ou menos que 1x10-9 M. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo anti-GCC, por exemplo, um anticorpo MIL-44-148-2 ou anticorpo derivado deste tem um Kd de cerca de 80 a cerca de 200 pM, preferivelmente cerca de 100 a cerca de 150 pM ou cerca de 120 pM. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo anti-GCC, por exemplo, um anticorpo MIL-44-148-2 ou anticorpo derivado deste tem um ka de cerca de 0.9 a cerca de 1.25x105 M-1 s-1, preferivelmente cerca de 1.1x105 M-1 s-1. Em uma modalidade a molécula do anticorpo é um ScFv e tem um Kd de menos que 1x10-6 M, menos que 1x10-7 M, menos que 1x10-8 M, menos que 1x10-9 M, menos que 1x10-10 M, 1x 10-11 M, menos que 1x10-12 M, ou menos que 1x10-13 M.

[0063] Em modalidades, as moléculas de anticorpo não são imunoconjugados, isto é, são "não-atreladas" e nas modalidades, causam uma reação celular mediante a ligação ao GCC. Em modalidades relacionadas, a reação celular é executada pela célula expressando GCC a que o anticorpo liga. Tal reação celular pode ser mediada de transdução de sinal por GCC, por exemplo, se a molécula de anticorpo for um agonista de GCC (ver, por exemplo, publicação de pedido de patente U.S. num. US20040258687). Em outras modalidades, a reação celular é executada por uma segunda célula, por exemplo, uma célula de efeito imune(por exemplo, uma célula matadora natural) que reconheça a molécula de anticorpo ligada ao GCC na primeira célula. Em algumas modalidades, as moléculas do de vigilância, por exemplo, moléculas de complemento, contatam as moléculas de anticorpo ligadas a GCC antes da reação celular. As reações celulares nestas modalidades podem causar a morte da célula expressando GCC.

[0064] Em modalidades adicionais, as moléculas de anticorpo que são imunoconjugadas podem causar uma reação celular mediante o ligamento ao GCC e internalizar para fornecer um agente à celula expressando-GCC a que ele está ligado.

[0065] Em algumas modalidades, uma molécula de anticorpo anti- GCC da invenção pode bloquear um ligante ligando ao GCC.

[0066] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo não é GCC: B10, GCC: 4D7 ou GCC: C8. Em uma outra modalidade, uma molécula de anticorpo anti-GCC não liga um domínio intracelular de GCC, cerca de resíduo amino-ácido de 455 a 1073 SEQ. ID NO: 3. Por exemplo, nesta modalidade, uma molécula de anticorpo anti-GCC não liga o domínio de homologia de quinase ou o domínio de ciclase de guanilil do GCC.

[0067] A unidade estrutural de anticorpo mamífero ocorrendo na natureza é tipificada por um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A parte amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis por reconhecimento de antígeno. A parte carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora. Cadeias leves humanas podem ser classificadas como cadeias leves kappa e lambda. Cadeias pesadas podem ser classificadas como mu, delta, gama, alfa ou epsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos mais. Ver, em geral, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam olocal de ligação de anticorpo. Os isotipos preferidos para as moléculas de anticorpo anti-GCC são as imunoglobulinas IgG, que podem ser classificados em quatro subclasses, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, tendo cadeias pesadas de gama diferentes. A maioria de anticorpos terapêuticos são anticorpos humanos, quiméricos, ou humanizados do isotipo IgG1. Em uma modalidade particular, a molécula de anticorpo anti-GCC é um anticorpo IgG de coelho.

[0068] As regiões variáveis de cada par de cadeia leve e pesada formam o local de ligação de anticorpo. Assim, um anticorpo intacto de IgG tem dois locais de ligação que são os mesmos. Entretanto, os anticorpos bifuncionais ou biespecíficos são construções híbridas artificiais que têm dois pares de cadeia pesada/leve diferentes, tendo por resultado dois locais de ligação diferentes.

[0069] Todas as cadeias apresentam a mesma estrutura geral das regiões framework relativamente conservadas (FR) juntas às três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões de framework, permitindo ligação a um epítopo específico. Do N-terminal ao C-terminal, ambas as cadeias leves e pesadas compõem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). Conforme usado neste documento, CDRs referem-se para a cada uma das cadeias pesadas (LCDR1, LCDR2, LCDR3) e leves (HCDR1, HCDR2, HCDR3).

[0070] Uma molécula de anticorpo anti-GCC pode compreender todo, ou um subconjunto de ligação de antígeno do CDRs, de uma ou de ambas, a cadeia pesada e leve, de um dos anticorpos de coelho referidos acima. As sequências de amino-ácido de anticorpos de hibridoma de coelho, incluindo regiões variáveis e CDRs, podem ser encontradas na tabela 3 e na tabela 5.

[0071] Assim, em uma modalidade, a molécula de anticorpo inclui um ou ambos de: (a) um, dois, três, ou um número de ligação de antígeno de, CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e/ou LCDR3) de um dos anticorpos de hibridoma de coelho referidos acima . Em modalidades, os CDR(s) podem compreender uma seqüência de amino-ácido de uma ou mais ou o todo de LCDR1-3 conforme segue: LCDR1, ou LCDR1 modificado em que de um a sete aminoácidos são substituídos conservadoramente), LCDR2 ou LCDR2 modificado em que um ou dois aminoácidos são substituídos conservadoramente); ou LCDR3, ou LCDR3 modificado em que um ou dois aminoácidos são substituídos conservadoramente; e (b) um, dois, três, ou um número de ligação de antígeno de, CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e/ou HCDR3) de um dos anticorpos de hibridoma de coelho referidos acima . Em modalidades, os CDR(s) podem compreender uma seqüência de amino-ácido de uma ou mais ou o todo de HCDR1-3 conforme segue: HCDR1, ou HCDR1 modificado em que um ou dois aminoácidos são substituídos conservadoramente, HCDR2 ou HCDR2 modificado em que de um a quatro dos aminoácidos são substituídos conservadoramente; ou HCDR3, ou HCDR3 modificado em que um ou dois aminoácidos são substituídos conservadoramente.

[0072] Os imunogenesúteis para a produção de moléculas de anticorpo anti-GCC incluem GCC por exemplo, células expressando GCC de origem humana por exemplo, (uma linha de células de tumor, por exemplo, células T84, ou células de tumor do cólon frescas ou congeladas, células recombinantes que expressam GCC); As frações de membrana das células que expressam GCC (por exemplo, uma linha de células de tumor do cólon, por exemplo, células T84), ou células de tumor do cólon frescas ou congeladas; células recombinantes expressando GCC; GCC isolado ou purificado, por exemplo, proteína de GCC humano (por exemplo, GCC isolado bioquimicamente, por exemplo, isolado a partir de células de tumor gastrointestinal ou células recombinantes que expressam GCC ou uma variante dessas), ou uma porção dessas (por exemplo, o domínio extracelular de GCC, o domínio de homologia de quinase de GCC ou o domínio catalítico de ciclase de guanilil de GCC ou peptídeo que corresponde a uma porção sua, por exemplo, compreendendo, pelo menos, cerca de 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28 ou 32 resíduos de aminoácidos de SEQ. ID NO : 3); ou um imunogene que compreende o SEQ. ID NO: 46 ou compreendendo uma porção madura deste sem a seqüência de sinal (isto é, sem resíduos 1 de amino-ácido a cerca de 21 ou 23 do NO. SEQ do ID: 46), por exemplo, a proteína hGCC (ECD)-mIgG2a FcR r-mutII madura (também conhecida como “pLKTOK108”), NO. SEQ do ID: 48.

[0073] Imunogenes podem ser fundidas às sequências heterólogas para ajudar na manipulação, purificação, imunização bioquímica ou na medida de titulação de anticorpo. Tais imunogenes podem compreender uma porção de GCC, por exemplo, o domínio extracelular, e uma porção que compreende um polipeptídeo não-GCC. Muitas opções existem para construir uma proteína de fusão para a facilidade de purificação ou a imobilização em uma sustentação contínua, por exemplo, uma coluna de afinidade ou uma placa de microtitulação ou outro substrato/chip de teste adequados. Por exemplo, uma fração de fusão pode adicionar um domínio, por exemplo, glutationa-S-transferase/quinase (GST), que pode ligar a glutationa; uma região Fc de uma imunoglobulina, que pode ligar à proteína A ou à proteína G; resíduos de amino-ácido, por exemplo, dois, três, quatro, cinco, preferivelmente seis resíduos do histidina que podem ligar níquel ou cobalto em uma coluna de afinidade; um marcador de epitopo, por exemplo, uma porção de oncogene de c-myc (myc-Tag), um marcador FLAG (Pat. U.S. Num. 4.703.004), um marcador de (HA) hemaglutinina, um marcador 10 gene T7, um marcador V5, um marcador HSV, ou um marcador VSV-G que pode ligar um anticorpo de marcador específico; ou um cofator, por exemplo, biotina, que pode ligar a streptoavidina.

[0074] Imunogenes que compreendem a porção Fc de uma imunoglobulina podem conter o GCC, na solução ou anexado a uma célula, em uma configuração que permita o acesso estrutural aos epitopos do GCC pelos componentes de vigilância imunes ao hospedeiro para a geração eficiente de anticorpo. Como as cadeias pesadas de imunoglobulina que compreendem as regiões de Fc associam-se em dímeros através das ligações de bissulfeto intra-cadeias, os imunogenes que resultam da fusão com regiões de Fc são dímeros. A valência de proteínas de fusão pode refletir o tipo de imunoglobulina que contribui uma região Fc. Por exemplo, fusões com proteínas de IgG podem ser dímeros, fusões de IgA podem fazer imunogenes tetraméricos, e as fusões de IgM podem fazer imunogenes decaméricos, os últimos dois são facilitados com a co-transfecção da cadeia J. Uma imunoglobulina exemplar para uma proteína de fusão de Fc é IgG1. A porção usada tipicamente tem a dobradiça IgG1, os domínios CH2 e CH3 codificados por um único éxon. Como este éxon tem também uma porção da região CH1, que tem uma cisteína orientada à ligação de dissulfeto com uma cisteína da cadeia leve, uma modificação útil é mutar a cisteína CH1, por exemplo, a uma serina, para assegurar-se que não há nenhuma cisteína não- combinada na proteína de fusão. Tal mutação aumenta também a flexibilidade da dobradiça.

[0075] Uma porção de Fc derivada de uma espécie não- hospedeira, por exemplo, região de Fc lg humano, para fundir a um imunogene para a imunização em uma espécie hospedeira, por exemplo, camundongo, rato, coelho, cabra, age como um adjuvante. Esta função adjuvante pode desencadear anticorpos específicos contra os epitopos Fc e GCC. Os anticorpos reativos a Fc podem ser identificados e rejeitados durante a triagem. A porção de Fc pode ter uma sequência do tipo selvagem ou uma sequência que seja mutada para modificar a função efetora. Por exemplo, uma região constante mutada (variante) pode ser incorporada em uma proteína de fusão para minimizar a ligação aos receptors Fc e/ou a habilidade de reparar o complemento (ver, por exemplo. Winter et al, GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351). Em um exemplo preferido, a lisina 235 e a glicina 237, numerados de acordo com padrões da região Fc, são mutatadas, por exemplo, em alanina. Uma proteína de imunogene/fusão com IgG mutado em Fc pode ter interação reduzida com os receptores de Fc no hospedeiro. Uma proteína de fusão de imunogene solúvel preferida (depois da maturação para clivar o sinal de peptídeo e secreção) é o hGCC(ECD)-mIgG2a FcR r-mutII ( pLKTOK108), que consiste nos resíduos 24 a 430 de amino-ácido do SEQ. ID NO: 3 fundido a imunoglobulina Fc mutada IgG2a de camundongo (coletivamente SEQ. ID NO: 48).

[0076] Para preparar o imunogene expressado por célula, a porção de imunoglobulina pode ser estruturada para imitar uma porção de imunoglobulina do receptor de célula B. Por exemplo, a região de imunoglobulina Fc pode adicionalmente ser fundida a um polipeptídeo que compreende uma região de transmembrana de um receptor imune, tal como os receptores FCY, os receptores Fcα, o receptor Fcα/μ ou os receptores Fcε. A orientação apropriada de tal imunogene receptor Fc ligado a uma célula com exposição adequada na superfície de célula pode ser melhorada se a célula que expressa a proteína de fusão de imunogene compreender adicionalmente componentes adicionais do complexo de receptor de antígeno, por exemplo, receptor de IgM de célula B ou receptor de IgD. Os componentes apropriados do complexo incluem proteínas de bainha de imunoglobulina (Ig), tais como MB-1 e B29 (CD79A e CD79B; Hombach et al. Eur. J. Immunol. 20:2795 - 2799 (1990) para o receptor IgM), que dão forma a um heterodímero. As proteínas de bainha de Ig podem ser providas de forma endógena pela célula transfectada, por exemplo, ao transfectar uma linha de célula de linfoma de célula B; ou pela co-transfecção do imunogene com proteínas de bainha, por exemplo, em um vetor separado ou no mesmo vetor.

[0077] Epitopos úteis, por exemplo, epitopos de referência, da molécula de GCC, aos quais as moléculas de anticorpo anti-GCC, por exemplo, anticorpos monoclonais de coelho, ou suas versões humanizadas, conforme descritos neste documento, podem ligar, podem ser encontrados na porção extracelular do GCC. Tais epitopos de GCC podem ligar moléculas de antibody na superfície das células, por exemplo, no exterior da célula. Por exemplo, um epitopo para uma molécula de anticorpo anti-GCC pode residir dentro, ou incluir um(ns) resíduo(s) a partir de, resíduos 1-50 do SEQ. ID NO: 3, ou seu fragmento que ligue uma molécula de antibocorpo anti-GCC da invenção, por exemplo, seu fragmento de ligação MIL-44-148-2. Tais fragmentos podem compreender resíduos 1-25, 5-30, 10-35, 15-40, 20-45, 25-50, 5-45, 10-40, 15-35, 20-30 ou 33-50 do SEQ. ID NO: 3. Em algumas modalidades, um epitopo para uma molécula de anticorpo anti-GCC, por exemplo, um anticorpo MIL-44-148-2, é um epitopo conformacional adicionalmente compreendendo um ou mais resíduos de amino-ácido adicionais na seqüência de amino-ácido GCC além do resíduo 50, isto é, selecionado a partir de cerca do resíduo 50 ao 1073 do SEQ. ID NO: 3.

[0078] Os Anticorpos criados contra tais epitopos ou ao domínio extracelular, por exemplo, os epitopos que residem dentro, ou incluem um(ns) resíduo(s) dos resíduos de amino-ácido de 24 a 420 SEQ. ID NO: 3, ou uma porção de sua referência, por exemplo, os resíduos 24 a 75, 75 a 150, 150 a 225, 225 a 300, 300 a 375 ou 375 a 420 do GCC, ou as moléculas de anticorpo derivadas destes, podem ser úteis como anticorpos terapêuticos ou diagnósticos, conforme descrito neste documento.

[0079] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC tem uma ou mais das seguintes propriedades: a) compete pela ligação, por exemplo, ligação de superfície celular GCC ou GCC purificado, com uma das moléculas de anticorpo anti-GCC acima referidas resumidas nas tabelas 1 e 2, por exemplo, anticorpos de hibridoma de coelho (por exemplo, MIL-44-148-2); b) liga-se ao mesmo, ou substancialmente o mesmo epítopo no GCC como uma das moléculas de anticorpo anti-GCC acima referidas resumidas nas tabelas 1 e 2, por exemplo, por exemplo, anticorpos de hibridoma de coelhos (por exemplo, MIL-44-148-2). Em uma modalidade, o anticorpo liga o mesmo epitopo, conforme determinado por um ou mais de um ensaio da disposição de peptídeo ou pela ligação aos mutantes de truncamento, químeras ou mutantes de ponto expressados nas preparações de superfície ou de membrana de célula, por exemplo, como aqueles ensaios são descritos neste documento; c) liga-se a um epitopo que tenha pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15 ou 20 resíduos de amino-ácido contíguos em comum com o epitopo de uma das moléculas de anticorpo anti-GCC referidas acima resumidas nas tabelas 1 e 2, por exemplo, anticorpos de hibridoma de coelho (por exemplo, MIL-44-1482); d) liga uma região do GCC humano que é ligado por um anticorpo anti-GCC da invenção, em que a região, por exemplo, uma região extracelular ou citoplásmica, é 10-15, 10-20, 20-30, ou 20-40 resíduos em comprimento, e a ligação é determinada, por exemplo, ligando aos mutantes de truncamento; Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC liga a região extracelular do GCC humano. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo anti-GCC pode ligar a porção humana de GCC do domínio extracelular definida pelos resíduos de amino-ácido de 24 a 420 de SEQ. ID NO: 3. Em uma modalidade uma molécula de anticorpo anti-GCC pode ligar o local de assinatura do ciclase guanilato nos resíduos de amino-ácido 931 a 954 do SEQ. ID NO: 3; ou e) liga a um epitopo de referência descrito neste documento.

[0080] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC liga a sequência de GCC ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS (SEQ. ID NO: 8).

[0081] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC liga a sequência de GCC FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDV (SEQ. ID NO: 9). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo liga um epitopo conformacional. Em outras modalidades uma molécula de anticorpo liga um epitopo linear.

[0082] As moléculas de anticorpo anti-GCC podem ser anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos monospecíficos, anticorpos quiméricos (ver U.S. Pat. Num. 6.020.153) ou anticorpos humanizados ou fragmentos de anticorpo ou derivados destes. Variantes sintéticas e geneticamente modificadas (Ver US Pat. Num. 6.331.415) de qualquer um dos anteriores, também são contempladas pela presente invenção. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal de murino (por exemplo, a técnica de hibridação de células somáticas padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975); ver em geral, Harlow, E. e Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), e a tecnologia de anticorpo monoclonal de coelho e serviços fornecidos por Epitomics (Burlingame, CA), que produz os anticorpos monoclonais de coelho personalizados (RabMAbs®) usando hibridomas coelho-coelho gerados pela funsão das células B isoladas a partir de um coelho imunizado com linha celular de parceiro de fusão proprietária (proprietary fusion partner cell line) Epitomics ', tal como descrito nas Patentes US 7,402,409, 7,429,487, 7,462,697, 7,575,896, 7,732,168,e 8,062,867, cada uma das quais está aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0083] A imunização com a proteína, por exemplo, uma porção solúvel ou GCC, ou proteína de fusão que compreende uma porção de GCC (por exemplo, hGCC(ECD)-mIgG2a FcRbr-mutII (pLKTOK108), ou células ou suas frações de membrana, por exemplo, as células que expressam a superfície exposta GCC ou sua porção (por exemplo, o produto pLKTOK4), pode ser realizada com o imunogene preparado para injeção de um modo a induzir uma resposta, por exemplo, com o adjuvante, por exemplo, adjuvante de Freund completo. Outros adjuvantes apropriados incluem, adjuvante Titermax Gold® (CYTRX Corporation, Los Angeles, Calif.) e alum. Imunogenes peptídeo pequenos podem ser ligados a uma molécula maior, como a hemocianina de lapa californiana (KLH). Camundongos ou coelhos podem ser injetados em um número de maneiras, por exemplo, subcutânea, intravenosa ou intramuscular em vários locais, por exemplo, no peritônio (i.p.), base da cauda, ou almofada de pé ou uma combinação de locais, por exemplo, iP e base da cauda (BIP). As injeções de reforço podem incluir o mesmo imunogene ou diferente e podem incluir, adicionalmente, o adjuvante, por exemplo, adjuvante de Freund incompleto. A imunização com DNA, por exemplo, o DNA que codifica GCC ou sua porção ou proteína de fusão que compreende GCC ou sua porção (por exemplo, hGCC(ECD)-mIgG2aFcRbr- mutII de codificação) pode ser injetado utilizando a tecnologia de biolística. Por exemplo, o DNA é carregado em partículas de ouro microscópicas e injetado em camundongos ou em coelhos com intervalos frequentes ao longo de um período breve.

[0084] Geralmente, onde um anticorpo monoclonal é desejado, um hibridoma é produzido por fusão de uma célula adequada de uma linha de células imortal (por exemplo, uma linha de células de mieloma, tal como SP2 / 0, ou um heteromieloma P3X63Ag8.653) com células produtoras de anticorpos. As células produtoras de anticorpos podem ser obtidas a partir do sangue periférico ou, de preferência, os nódulos linfáticos ou do baço, de seres humanos, animais transgênicos com anticorpo humano ou de outros animais apropriados (por exemplo, coelhos) imunizados com o antigene de interesse. As células que produzem anticorpos de origem humana (por exemplo, um anticorpo humano) podem ser produzidas usando métodos adequados, por exemplo, a fusão de uma célula produtora de anticorpo humano e de heteromieloma ou trioma, ou a imortalização de uma célula B humana ativada através de infecção com vírus de Epstein Barr. (Ver, por exemplo, Pat. U.S. No. 6,197,582 (Trakht); Niedbala et al., Hybridoma, 17:299-304 (1998); Zanella et al., J Immunol Methods, 156:205-215 (1992); Gustafsson et al., Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32 (1991).) As células fundidas ou imortalizadas produtoras de anticorpo (hibridomas) podem ser isoladas utilizando condições de cultura seletivas e clonadas por diluição limitada. Células que produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser identificadas usando um ensaio adequado (por exemplo, ELISA (por exemplo, com o imunogene, por exemplo, hGCC(ECD)-mIgG2aFcRbr- mutII, imobilizado no poço de microtítulo) ou por FACS em uma célula que expressa GCC ou sua porção, por exemplo, uma célula que expressa o produto pLKTOK4) .. Por exemplo, se o imunogene-GCC compreende uma fração de fusão, que é um reagente de afinidade, esta fração pode permitir a proteína de fusão compreendendo GCC ou uma porção desta a ser ligada a uma matriz, por exemplo, revestida de proteína-G, revestida de estreptavidina, placas de microtitulação ou chips de ensaio derivados de glutationa ou revestidos por anticorpo , os quais são, então, combinados com o soro imune ou meio condicionado de um hibridoma ou uma célula recombinante que expressa o anticorpo, e a mistura é incubada sob condições que conduzam à formação de complexo (por exemplo, a condições fisiológicas para sal e pH) .. Após a incubação, os poços da placa de titulação ou células de chip são lavados para remover quaisquer componentes não acoplados e ligação por anticorpo anti-GCC é medida.

[0085] Em modalidades, para aplicações terapêuticas, os anticorpos da invenção presente são anticorpos humanizados. A vantagem de anticorpos humanizados é que eles potencialmente diminuem ou eliminam a imunogenicidade do anticorpo em um recipiente hospedeiro, permitindo desse modo um aumento na biodisponibilidade e uma redução na possibilidade de reação imune adversa, permitindo assim potenciais administrações múltiplas de anticorpo.

[0086] Os anticorpos modificadosincluem anticorpos humanizados, quiméricos ou enxertados de CDR. As respostas do anticorpo anti-camundongo humano (HAMA) levaram a indústria a desenvolver anticorpos quiméricos ou humanizados de outra forma. Enquanto os anticorpos quiméricos têm uma região constante humana e uma região variável não-humana, espera-se que certas respostas do anticorpo anti- quimérico humano (HACA) sejam observadas, particularmente em utilizações crônicas ou de múltiplas doses do anticorpo. A presença de tais proteínas derivadas não-humanas (por exemplo, murina, de rato, de coelho, de ovelha ou cabra) pode levar à rápida depuração dos anticorpos ou pode levar à geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um paciente. A fim de evitar a utilização de anticorpos derivados não humanos, anticorpos humanizados em que as sequências são introduzidas a uma sequência de anticorpo a fim de aproximar à sequência de anticorpo humano, ou anticorpos totalmente humanos gerado pela introdução da função de anticorpo humano em espécies não humanas, tal como um rato, camundongo, coelho, ovelha ou cabra, foram desenvolvidos de modo que as espécies não-humanas possam produzir anticorpos com sequências totalmente humanas. Os anticorpos humanos evitam certo dos problemas associados com os anticorpos que possuem regiões de coelho, de roedor, de ovelha ou de cabra variáveis e/ou constantes.

Humanização e Tecnologias de Exposição e Modificações aos Anticorpos

[0087] Moléculas de anticorpos humanizadas minimizam as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas a mAbs de não humanos ou derivadas de não-humanos e, portanto, aumentam a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. O uso de moléculas de anticorpo humanizadas pode fornecer uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crônicas e recadeias, tais como inflamação, auto-imunidade e câncer, que exigem repetidas administrações de anticorpo. A produção de anticorpos humanizados com imunogenicidade reduzida pode ser realizada em relação às técnicas de humanização e técnicas de exposição usando bibliotecas apropriadas. Será apreciado que os anticorpos a partir de espécies não humanas, tais como camundongos, ratos, coelhos, ovelhas, cabras, etc, podem ser humanizados ou primatizados usando técnicas conhecidas na arte. Ver por exemplo, Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) e Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). O anticorpo de interesse pode ser manipulado por técnicas de DNA recombinante para substituir o CH1, CH2, CH3, domínios de dobradiça, ou o domínio de framework com a seqüência humana correspondente (ver WO 92/02190 e U.S. Pat. Nums. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, e 5,777,085). Também, o uso do cDNA Ig para a construção de genes de imunoglobulina quiméricos é conhecido na arte (Liu et al. Proc Natl Acad Sci USA. 84:3439 (1987) e J. Immunol. 139:3521 (1987)). o mRNA é isolado de um hibridoma ou de outra célula produzindo o anticorpo e usado para produzir o cDNA: O cDNA de interesse pode ser amplificado pela reação em cadeia de polimerase usando inciadores específicos (U.S. Pat. Nums. 4.683.195 e 4.683.202).

[0088] Alternativamente, a tecnologia de exposição de fagos (ver, por exemplo, McCafferty et al, Nature, 348:552-553 (1990)) pode ser utilizado para produzir anticorpos humanos ou anticorpos a partir de outras espécies, bem como fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de variáveis de imunoglobulina (V) genes de domínio, por exemplo, a partir de repertórios de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpo são clonados em-estrutura em um gene de proteína de revestimento principal ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibido como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Porque a partícula filamentosa contem uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo resultam também na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exposição de fago pode ser executada em uma variedade de formatos; para suas revisões ver, por exemplo, Johnson e Chiswell,Current Opinion in Structural Biology, 3:564- 571(1993).. Diversas fontes de segmentos V-gene podem ser usadas para a exposição de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram uma disposição diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes V derivados dos baços de camungondos imunizados. Um repertorio de genes V dos doadores humanos não-imunizados pode ser construído e anticorpos a uma disposição diversa de antígenos (incluindo antígenos próprios) podem ser isolados essencialmente depois das técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J., 12:725-734 (1993). Ver, também, U.S. Pat. Num. 5.565.332 e 5.573.905. As bibliotecas de exposição podem conter anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos anticorpos que contêm sequências artificiais de amino-ácido. Por exemplo, a biblioteca pode conter os fragmentos de Fab que contêm CDRs artificiais (por exemplo, sequências de amino-ácido aleatórias) e regiões humanas de framework. Ver, por exemplo, U.S. Pat. Num. 6,300,064 (Knappik, et al.).)

[0089] As sequências de genes de região constantes humanos podem ser encontradas em Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. num de publicação. 91-3242. Os genes de região humanos C estão prontamente disponíveis a partir dos clones conhecidos. A escolha do isotipo será guiada pelas funções de efetor desejadas, tais como o fixação de complemento, ou atividade em citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Isotipos podem ser IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em modalidades particulares, as moléculas de anticorpo da invenção são IgG1 e IgG2. Qualquer uma das regiões constantes de cadeia leve humanas, kappa ou lambda, podem ser usadas. O anticorpo quimérico, humanizado é expressado então por métodos convencionais.

[0090] Em algumas modalidades, uma molécula de anticorpo anti- GCC da invenção pode levar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) a uma célula que expressa GCC, por exemplo, uma célula de tumor. Anticorpos com os isotipos IgG1 e IgG3 são úteis para eliciar a função efetora em uma capacidade citotóxica dependente de anticorpos, devido à sua habilidade de ligar o receptor Fc. Os Anticorpos com os isotipos IgG2 e IgG4 são úteis para minimizar uma resposta ADCC por causa de sua habilidade baixa de ligar o receptor Fc. Em substituições relacionadas das modalidades na região Fc ou alterações na composição de glicosilação de um anticorpo, por exemplo, através do crescimento numa linha de células eucariotas modificada, podem ser feitas para melhorar a capacidade dos receptores Fc para reconhecer, ligar e / ou mediar a citotoxicidade de células às quais os anticorpos anti-GCC ligam (ver, por exemplo, US Pat. Num. 7.317.091, 5.624.821 e publicações incluindo WO 00/42072, Shields, et al. J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001), Lazar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:4005-4010 (2006), Satoh et al. Expert Opin Biol. Ther. 6:1161-1173 (2006)). Em determinadas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo de origem humana, anticorpo humano) podem incluir as substituições ou recolocações de amino-ácido que alteram ou costuram a função (por exemplo, função efetora). Por exemplo, uma região constante de origem humana (por exemplo, região constante y1, região constante Y2) pode ser projetada para reduzir a ativação de complemento e/ou ligação ao receptor Fc. Ver, por exemplo, U.S. Pat. Num. 5,648,260 (Winter et al.), 5,624,821 (Winter et al.) e 5.834.597 (Tso et al.), dos quai os ensinos inteiros são incorporados neste documento por referência.) Preferivelmente, a sequência de amino-ácido de uma região constante da origem humana que contem tais substituições de amino-ácido ou recolocações é pelo menos cerca de 95% idêntica sobre o total comprimento à sequência de amino-ácido da região constante inalterada de origem humana, mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% idêntica sobre o total comprimento à sequência de amino-ácido da região constante inalterada de origem humana.

[0091] Em ainda uma outra modalidade, funções efetoras podem também ser alteradas pela modulação do padrão de glicosilação do anticorpo. Por alteração designa-se dizer deletar uma ou mais frações do hidrato de carbono encontrado no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. Por exemplo, anticorpos com atividades realçadas de ADCC com uma estrutura de carboidrato madura que não tem fucose unida a uma região de Fc do anticorpo são descritos em U.S. Publicação de Pedido de Patente Num. 2003/0157108 (Presta). Ver também U.S. Publicação de Pedido de Patente Num. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Glycofi desenvolveu também as linhas de célula de levedura capazes de produzir glicoformes específicos dos anticorpos.

[0092] Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito que tenha um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo reduzida quantidade de resíduos de fucosil ou um anticorpo tendo estruturas bissectoras aumentadas de GlcNac. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados para aumentar a capacidade do ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria alterada de glicosilação. Células com maquinaria alterada de glicosilação foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras que são projetadas para expressar desse modo anticorpos recombinantes da invenção para deste modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1.176.195 por Hang et al. descreve uma linha de célula com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma transferase de fucosil, tal que os anticorpos expressados em tal linha de célula exibem a hipofucosilação. A publicação WO 03/035835 PCT por Presta descreve uma linha de célula CHO variante, células Lec13, com habilidade reduzida de anexar fucose aos carboidratos ligados a Asn (297), também tendo por resultado a hipofucosilação dos anticorpos expressados que a célula hospedeira (ver também Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Publicação WO 99/54342 PCT por Umana et al. descreve as linhas de célula projetadas para expressar transferases glicosil modificadoras de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)- Nacetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tais que os anticorpos expressos nas linhas de célula projetadas exibiram um aumento de estrutura bissectoras de GlcNac que resulta na atividade aumentada de ADCC dos anticorpos (ver também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

[0093] Anticorpos humanizados também podem ser feitos usando uma abordagem de CDR-enxertados. Técnicas de geração de tais anticorpos humanizados são conhecidas na técnica. Geralmente, anticorpos humanizados são produzidos pela obtenção de sequências de ácidos nucleicos que codificam as sequências variáveis pesadas e variáveis leves de um anticorpo que se liga ao GCC, identificando a região determinante complementar ou "CDR" nas sequências variáveis pesadas e variáveis leves no enxerto das sequências de ácidos nucleicos de CDR para sequências de ácidos nucleicos de framework humano. Ver, por exemplo, U.S. Pat. Nos 4.816.567 e 5.225.539). A localização dos resíduos de CDRs e de framework pode ser determinada (veja, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, e Chothia, C. et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Moléculas de anticorpo anti-GCC aqui descritas têm as sequências de aminoácidos CDR e sequências de ácidos nucleicos codificando CDRs listados nas tabelas 5 e 6. Em algumas modalidades, sequências de tabelas 5 e 6 podem ser incorporadas em moléculas que reconhecem o GCC para uso nos métodos terapêuticos ou de diagnósticos descritos neste documento. O framework humano que é selecionada é aquele que é adequado para administração in vivo, significando que ele não apresenta imunogenicidade. Por exemplo, tal determinação pode ser feita por experiência prévia com uso in vivo de tais anticorpos e estudos de similaridades de amino-acidos. Uma região de framework apropriada pode ser Selecionada de um anticorpo de origem humana tendo pelo menos 65% de identidade de sequências de aminoácidos, e de preferência pelo menos cerca de 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência de aminoácidos ao longo do comprimento da região de framework dentro da sequência de aminoácidos da porção equivalente (por exemplo, região de framework) do anticorpo doador, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-GCC (por exemplo,3G1). A identidade de seqüência de amino-ácido pode ser determinada usando um algoritmo do alinhamento de sequência de amino- ácido apropriado, tal como CLUSTAL W, usando os parâmetros padrões. (Thompson J. D. et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994).)

[0094] Uma vez identificados os CDRs e FRs do anticorpo clonado a serem humanizados, as sequências de amino-ácido que codificam os CDRs são identificadas e as sequências de ácidos nucleicos correspondente enxertadas então em FRS humanos selecionados. Isso pode ser feito utilizando iniciadores conhecidos e vinculadores, a seleção desses é conhecida na técnica. Todas as CDRs de um anticorpo humano específico podem ser substituídas por pelo menos uma porção de uma CDR não- humana ou apenas algumas das CDRs podem ser substituídas por CDRs não-humanas. É apenas necessário substituir o número de CDRs necessárias para a ligação do anticorpo humanizado a um antígeno predeterminado. Depois que os CDRs são enxertados em FRs humanos selecionados, as sequências variáveis leve e variáveis pesadas resultantes são expressadas para produzir um Fv humanizado ou um anticorpo humanizado que liga-se ao GCC. De preferência, os anticorpos enxertados com CDR (por exemplo, humanizados) ligam-se a uma proteína GCC com afinidade semelhante, substancialmente a mesma, ou melhor do que aquela dos anticorpos do doador. Tipicamente, as sequências variáveis pesadas e leves humanizadas são expressas como uma proteína de fusão com sequências de domínio constante humanas para que um anticorpo intacto que liga-se ao GCC seja obtido. No entanto, pode ser produzido um anticorpo Fv humanizado que não contém as sequências constantes.

[0095] Também no escopo da invenção estão anticorpos humanizados em que aminoácidos específicos foram substituídos, excluídos ou adicionados. Em particular, anticorpos humanizados podem ter substituições de aminoácidos na região de framework, para, por exemplo, melhorar a ligação com o antígeno. Por exemplo, um número selecionado, pequeno de resíduos de framework receptores da cadeia de imunoglobulina humanizada pode ser substituído pelos aminoácidos de doadores correspondentes. As posições das substituições incluem resíduos de amino- ácido adjacentes ao CDR, ou que são capazes de interação com um CDR (ver por exemplo, U.S. Pat. Num. 5.585.089 ou 5.859.205). O framework receptor pode ser uma sequência de framework de anticorpo humano ou uma sequência consensual. Conforme usado neste documento, o termo "sequência consensual" refere-se à seqüência encontrada mais frequentemente, ou concebida a partir do resíduos mais comuns em cada posição em uma sequência em uma região entre membros de família relacionados. Um número de sequências consensuais de anticorpo humanas estão disponíveis, incluindo sequências consensuais para os diferentes subgrupos de regiões variáveis humanas (ver, Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office(1991)).). A base de dados de Kabat e suas aplicações estão disponíveis de graça online, por exemplo. através de IgBLAST em National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Md. (ver também, Johnson, G. and Wu, T. T., Nucleic Acids Research 29:205-206 (2001)).

[0096] Outras técnicas para humanização de anticorpos são descritas em Padlan et al. EP 519596 A1, publicado em 23 de Dezembro, 1992. A molécula de anticorpo anti-GCC inclui outros anticorpos humanizados que podem também ser modificados pelo apagamento específico de epitopos de células T humanas ou pela "desimunização" pelos métodos divulgados na publicação PCT num. WO 98/52976 e WO 00/34317, os conteúdos das quais são incorporados nneste documento pela referência. Momentaneamente, o coelho, ou outras espécies não-humanas, regiões variáveis de cadeias leves ou pesadas de um anticorpo anti-GCC podem ser analisados para os peptídeos que ligam à classe MHC II; estes peptídeos representam epitopos de células T potenciais . Para a detecção de potenciais epítopos de célula T, pode ser aplicada uma abordagem de modelagem de computador denominada "peptídeo threading", e além disso, um banco de dados de péptidos de ligação humanos MHC classe II pode ser pesquisado para motivos presentes no VH de coelho sequências VL, conforme descrito nas publicações PCT nums. WO98/52976 e WO00/34317. Estes motivos se ligam a qualquer um dos 18 alotipos DR principais do MHC de classe II e, desse modo, constituem potenciais epítopos de célula T. Os epítopos potenciais de célula T detectados podem ser eliminados, substituindo pequenos números de resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis ou, preferencialmente, por substituições de um aminoácido único. Na medida do possível, substituições conservadoras são feitas, frequentemente mas não exclusivamente, um aminoácido comum nesta posição nas sequências de anticorpo da linha genética humana podem ser usadas. Sequências de linha germinais humanas são divulgadas em Tomlinson, I. A. et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992); Cook, G. P. et al., Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242 (1995); Chothia, D. et al., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992). O diretório BASE V fornece um diretório compreensível de sequências de região variável de imunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, L.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK).. Depois que VH e VL desimunizados de um anticorpo anti-GCC são construídos pelo mutagênese dos genes de coelho VH e VL, a a seqüência variável mutagenizada pode, opcionalmente, ser fundida a uma região constante humana, por exemplo, regiões constantes humanas IgG1 ou K (kappa).

[0097] Em outras modalidades, redução de uma resposta imunogênica por um anticorpo enxertado de CDR pode ser conseguido por mudanças, por exemplo, deleções, substituições, de resíduos de amino-ácido em CDRs (Kashmiri et al. Methods 36:25-34 (2005), U.S. Pat. Num. 6.818.749, Tan et al. J. Immunol. 169:1119-1125 (2006)). Por exemplo, resíduos nas posições envolvidas no contato com o antígeno preferivelmente não seriam mudados. Tipicamente, tais resíduos, a especificidade que determina resíduos (SDRs), estão em posições que indicam níveis elevados de variabilidade entre anticorpos. Sequências consensuais derivadas, por exemplo, pelo método de Clustal (Higgins D. G. et al., Meth. Enzymol. 266:383-402 (1996)), das moléculas de anticorpo anti-GCC, por exemplo, dos anticorpos descritos neste documento, ajudam em identificar SDRs. Nas moléculas de anticorpo anti-GCC descritas neste documento, os SDRs são os seguintes, pelo menos o primeiro resíduo ou em algumas modalidades, os primeiros quatro resíduos da cadeia pesada CDR1; pelo menos a porção N- terminal, por exemplo, os primeiros sete, dez ou 13 resíduos de cadeia pesada CDR2; quase toda a cadeia pesada CDR3; a porção C-terminal, por exemplo, após o resíduo seis, oito, ou nove da cadeia leve CDR1; cerca de o primeiro, médio e/ou último resíduo da cadeia leve CDR2; e a maioria da cadeia leve CDR3, ou pelo menos após o resíduo dois ou três. Em Conformidade, para manter a ligação à proteína GCC após a humanização ou a modificação de uma molécula de anticorpo anti-GCC, tais resíduos SDR em CDRs das moléculas de anticorpo anti-GCC são menos passíveis às mudanças, por exemplo, dos resíduos de coelho aos resíduos consensuais humanos do que os resíduos em outros resíduos do CDRs ou das regiões de framework. Inversamente, pode ser benéfico mudar resíduos em não- humanos, por exemplo, CDRs de coelhos aos resíduos identificados como o consenso em CDRs humanos, por exemplo, CDRs das moléculas de anticorpo anti-GCC descritas no Pedido de Patente Publicado U.S. Num. 20110110936, o conteúdo dos quais são incorporados por referência nneste documento em sua totalidade.

[0098] Os anticorpos Anti-GCC que não são anticorpos intactos são também úteis nesta invenção. Tais anticorpos podem ser derivados de alguns dos anticorpos descritos acima. As moléculas úteis de anticorpo deste tipo incluem (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste de VL, VH, CL e domínios CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste dos domínios de VL e de VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), que consiste em um domínio de VH; (vii) um anticorpo de cadeia pesada funcional de domínio único, que consista em um domínio de VHH (conhecido como um nanocorpo) ver, por exemplo, Cortez-Retamozo, et al., Câncer Res. 64: 2853-2857 (2004), e referências citadas nele; e (vii) um CDR isolado, por exemplo, um ou mais CDRs isolados juntos, com framework suficiente para prover um fragmento de ligação ao antígeno. Além disso, embora os dois domínios de fragmento Fv, VL e VH sejam codificados para por genes separados, eles podem ser juntados, usando métodos recombinantes, por um vinculador sintético que os permita serem feitos como uma única cadeia de proteína em que as regiões VL e VH se combinam para dar forma às moléculas monovalentes (conhecidas como Fv (scFv) de cadeia única; ver por exemplo, Bird et al. Science 242:423-426 (1988); e Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988). Tais anticorpos de cadeia única são destinados também a serem abrangidos dentro do termo "fragmento ligador de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos usando as técnicas convencionais conhecidas àqueles versados na técnica, e os fragmentos são selecionados para utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. Fragmentos de anticorpos, tais como Fv, F(ab')2 e Fab podem ser preparados pela clivagem da proteína intacta, por exemplo. por protease ou clivagem química.

[0099] Nas modalidades, algumas ou todas as sequências CDRs, de uma das ou ambas a cadeia pesada e leve, podem ser usadas em uma outra molécula de anticorpo, por exemplo, em uma molécula de anticorpo enxertada por CDR, humanizada, ou quimérica.

[00100] As modalidades incluem uma molécula de anticorpo que compreenda CDRs suficiente, por exemplo, todos os seis CDRs de um dos anticorpos de hibridoma de coelho descritos neste documento para permitir a ligação ao GCC de superfície de célula.

[00101] Em uma modalidade os CDRs, por exemplo, todos os HCDRs, ou todos os LCDRs, ou todos os seis, são encaixados em regiões de framework derivadas humanas ou humanas. Exemplos de regiões de framework humanas incluem as sequências de framework de linha germinal humanas, as sequências de linha germinal humanas que foram maturadas por afinidade (in-vivo ou in vitro), ou sequências humanas sintéticas, por exemplo, sequências consensuais. Em uma modalidade o framework de cadeia pesada é um framework IgG1 ou IgG2. Em uma modalidade o framework de cadeia leve é um framework kappa. Em uma modalidade a molécula de anticorpo anti-GCC, por exemplo, uma molécula de anticorpo humanizada ou enxertada por CDR, compreende CDRs suficientes, por exemplo, todos os seis CDRs de um dos anticorpos descritos neste documento, por exemplo, as sequências listadas na tabela 5, para permitir ligação ao GCC. (Sequências de ácido nucleico exemplares que podem codificar as sequências de amino-ácido dos CDR alistadas na tabela 5, são providas, na tabela 6 neste documento). Em modalidades particulares, uma molécula de anticorpo anti-GCC pode compreender CDRs de MIL-44-148-2 ou MIL-44-67-4. Fragmentos de anticorpo para uso diagnóstico ou terapêutico in-vivo pode beneficiar-se das modificações que melhoram suas meias vidas de soro. As frações orgânicas adequadas destinadas a aumentar a meia-vida de soro in vivo do anticorpo podem incluir um, dois ou mais frações lineares ou ramificadas, selecionadas a partir de um grupo polimérico hidrofílico (por exemplo, um polímero linear ou ramificado, (por exemplo, um polialcano glicol tal como polietileno-glicol, monometoxi-polietileno-glicol e similares), um carboidrato (por exemplo, um dextrano, uma celulose, um polissacárido e similares), um polímero de um aminoácido hidrofílico (por exemplo, polilisina, poliaspartato e similares), um óxido de polialcano e polivinil pirrolidona), um grupo de ácido graxo (por exemplo, um ácido mono-carboxílico ou um ácido di-carboxílico), um grupo de éster de ácido graxo, um grupo de lípidos (por exemplo, grupo diacilglicerol, grupo esfingolípido (por exemplo, ceramidil)) ou um grupo de fosfolípido (por exemplo, o grupo fosfatidil-etanolamina) .. Preferivelmente, a fração orgânica é ligada a um local predeterminado onde a fração orgânica não danifica a função (por exemplo, diminui a afinidade de ligação do antígeno) do imunoconjugado resultante comparado à fração não- conjugada do anticorpo. A fração orgânica pode ter um peso molecular de cerca de 500Da a cerca de 50.000 Da, preferivelmente cerca de 2000, 5000, 10,000 ou 20,000Da. Os exemplos e os métodos para modificar polipeptídeos, por exemplo, anticorpos, com frações orgânicas podem ser encontrados, por exemplo, em U.S. Pat. Nos. 4,179,337 e 5,612,460, Publicação PCT Num. WO 95/06058 e WO 00/26256, e Publicação de Pedido de Patente U.S. Num. 20030026805.

[00102] Uma molécula de anticorpo anti-GCC pode compreender todo, ou um fragmento de ligação ao antígeno da região variável, de uma ou de ambas, a cadeia pesada e leve, de um dos anticorpos de hibridoma de coelho referidos acima.

[00103] Em uma modalidade a sequência de cadeia leve do amino- ácido de (a) pode diferir de uma das sequências de amino-ácido de referência às quais se fez referência em (a) (i-ii) por 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou 15 resíduos. Em determinadas modalidades, as diferenças são substituições conservativas. Em modalidades, as diferenças estão nas regiões de framework. Em uma modalidade a sequência de cadeia pesada do amino-ácido de (b) pode diferir de uma das sequências de amino-ácido de referência às quais se fez referência em (b) (i-ii) por 1, 2, 3, 4, 5, 10, ou 15 resíduos. Em determinadas modalidades, as diferenças são substituições conservativas. Em modalidades, as diferenças estão nas regiões de framework.

[00104] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC compreende um ou ambos de: (a) uma sequência de amino ácido de cadeia leve de um antígeno de ligação ou fragmento de antígeno de ligação, de (i) uma sequência de amino-ácido de região variável de cadeia leve da tabela 3, por exemplo, SEQ. ID NO: 13, ou (ii) um amino-ácido de região variável de cadeia leve codificado por uma sequência de nucleotídeo da tabela 4, por exemplo, SEQ. ID NO: 12; e (b) uma sequência de amino ácido de cadeia pesada de um antígeno de ligação ou fragmento de antígeno de ligação, de (i) uma sequência de amino- ácido de região variável de cadeia pesada da tabela 3, por exemplo, SEQ. ID NO: 11, ou (ii) uma sequência de amino-ácido codificada por uma seqüência de nucleotídeo da tabela 4, por exemplo, SEQ. ID NO: 10.

[00105] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC compreende um ou ambos de: (a) uma região variável de cadeia leve, ou seu fragmento de antígeno de ligação, tendo pelo menos a homologia de 85, 90, 95, 97 ou 99% com a região variável de cadeia leve de uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção; e (b) uma região variável da cadeia pesada, ou um fragmento de ligação do antígeno, tendo pelo menos 85, 90, 95, 97 ou 99% de homologia com região variável da cadeia pesada de uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção.

[00106] As sequências de amino-ácido das regiões variáveis dos anticorpos anti-GCC da invenção podem ser encontradas na tabela 3. Em uma abordagem, sequências consensuais que codificam as regiões de cadeias pesadas e leves J podem ser usadas para projetar oligonucleotídeos para o uso como inciadores para introduzir locais úteis de limitação na região J para o vínculo subsequente de segmentos da região de V aos segmentos da região humana C. O cDNA da região C pode ser modificado por mutagênese direcionados a um local para colocar um local de restrição na posição análoga na sequência humana.

[00107] Vetores da expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmídeos, YACs, EBV, episomas derivados, e outros semelhantes. Um vetor conveniente é aquele que codifica uma seqüência imunoglobulina CH ou CL humana funcionalmente completa, com locais de restrições apropriados projetados para que qualquer sequência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa. Em tais vetores, a prática de splicing geralmente ocorre entre o local de doador de splice na região J inserida e no local do receptor de splice antecedendo a região C humana e também nas regiões de splice que ocorrem dentro do éxons CH humanos. Vetores de expressão adequados podem conter um número de componentes, por exemplo, uma origem de replicação, um gene marcador selecionável, um ou mais elementos de controle de expressão, tal como um elemento de controle de transcrição (por exemplo, promotor, intensificador, terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, uma sequência de sinal ou sequência líder e afins. Poliadenilação e terminação de transcrição ocorrem em locais cromossomais nativos a jusante das regiões de codificação. O anticorpo quimérico resultante pode ser juntado a qualquer promotor forte. Exemplos de vetores adequados que podem ser utilizados incluem aqueles que são adequados para hospedeiros mamíferos, e com base em sistemas de replicação viral, tal como o vírus símio 40 (SV40), vírus de sarcoma de Rous (RSV), adenovírus 2, vírus do papiloma bovino (BPV), papovavírus BK mutante (BKV), ou o citomegalovírus humano ou de camundongo (CMV), e o vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV), promotores Ig nativos, etc Uma variedade de vetores apropriados é conhecida na arte, incluindo os vetores que são mantidos em única cópia ou cópias múltiplas, ou que se tornam integrados no cromossomo da célula hospedeira, por exemplo, através de LTRs, ou através dos cromossomos artificiais projetados com múltiplos locais de integração (Lindenbaum et al. Nucleic Acids Res. 32:e172 (2004), Kennard et al. Biotechnol. Bioeng. Online May 20, 2009). Exemplos adicionais de vetores apropriados são listados em uma seção mais adiante.

[00108] Assim, a invenção provê um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo humanizado, quimérico ou um fragmento de ligação ao antígeno ou qualquer um dos antecedentes), a cadeia de anticorpo (por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve) ou a porção de ligação de antígeno de uma cadeia do anticorpo que liga uma proteína GCC. Expressão em células hospedeiras eucarióticas é útil porque tais células são mais prováveis que células procarióticas a montar e secretar um anticorpo devidamente dobrado e imunologicamente ativo. No entanto, qualquer anticorpo produzido que estiver inativo devido a dobradura imprópria pode ser renaturável, de acordo com métodos conhecidos (Kim e Baldwin, "Specific Intermediatesin the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding", Ann. Rev. Biochem. 51, pp. 459-89 (1982)). É possível que as células hospedeiras produzam porções de anticorpos intactas, como dímeros de cadeia leve ou dímeros de cadeia pesada, que também são homólogos do anticorpo de acordo com a presente invenção.

[00109] Ainda mais, conforme descrito em outro lugar neste documento, os anticorpos ou anticorpos de humanos ou espécies não- humanas podem ser gerados através de tecnologias do tipo de exibição, incluindo, sem limitação, exibição de fago, exibição retroviral, exibição ribossomal, e outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas na técnica e as moléculas resultantes podem ser submetidas a maturação adicional, tais como a maturação de afinidade, como tais técnicas são conhecidas na técnica. Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) and Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomal display), Parmley and Smith Gene 73:305318 (1988) (phage display), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), and U.S. Pat. No. 5,733,743. Se tecnologias de exibição são utilizadas para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados conforme descrito acima.

[00110] Será apreciado que os anticorpos que são gerados, não necessitam possuir inicialmente um isotipo particular desejado, mas, em vez disso, o anticorpo como gerado pode possuir qualquer isotipo. Por exemplo, o anticorpo produzido pelo hibridoma de coelho MIL-44-148-2 tem um isotipo IgG. O isotipo do anticorpo pode ser comutado depois disso, por exemplo, IgG2, ou IgG3 para elicitar uma resposta de ADCC quando o anticorpo liga o GCC em uma célula, usando as técnicas convencionais que são conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem o uso de técnicas recombinantes diretas (ver por exemplo, U.S. Pat. Num 4.816.397) Técnicas de fusão célula-célula, (ver, por exemplo, U.S. Pat Num 5.916.771), entre outros. Na técnica de fusão célula-célula, um mieloma ou outra linhagem celular é preparada tal que possua uma cadeia pesada com qualquer isotipo desejado e outro mieloma ou outra linhagem celular é preparada tal que possua a cadeia leve. Essas células podem, posteriormente, ser fundidas e uma linhagem celular, expressando um anticorpo intacto, pode ser isolada.

[00111] Em modalidades particulares, a molécula de anticorpo GCC é um anticorpo IgG anti-GCC de coelho. Já que tais anticorpos possuem ligação desejada para a molécula GCC, qualquer um de tais anticorpos pode ser prontamente comutado para isotipo para gerar outro isotipo enquanto ainda possuindo a mesma região variável (que define a especificidade e afinidade de anticorpo, em certa medida). Nesse sentido, conforme candidatos de anticorpos são gerados, que atendem aos atributos "estruturais" desejados conforme discutido acima, eles podem geralmente ser fornecidos com pelo menos certos atributos "funcionais" adicionais que são desejados através da troca do isotipo. Em uma modalidade, a região variável ou fragmento de ligação ao antígeno desta pode ser acoplado a uma região constante (ou seu fragmento) diferente da região constante com a qual foi gerado com, por exemplo, uma região constante (ou seu fragmento) de outro anticorpo ou de uma região constante sintética (ou seu fragmento). Em modalidades, a região constante é uma região constante IgG1 ou IgG2 (ou seus fragmentos). Alterações de sequências podem ser feitas nas regiões variáveis ou constantes para modificar a atividade efetora da molécula de anticorpo.

Projeto e Geração de Outros Terapêuticos

[00112] Os anticorpos que são produzidos e caracterizados neste documento em relação ao GCC provém para o design de outras modalidades terapêuticas, incluindo outros anticorpos, outros antagonistas ou frações químicas diferente de anticorpos são facilitadas. Essas modalidades incluem, sem limitação, anticorpos tendo funcionalidade ou atividade de ligação similares, terapêuticos de anticorpo avançados, tais como anticorpos biespecíficos, imunoconjugados, e terapêuticos marcados por rádio, geração da terapêuticos, particularmente intracorpos, e pequenas moléculas. Além disso, como discutido acima, a função efetora dos anticorpos da invenção pode ser alterada pela alternância de isotipo para um IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgA2, IgE ou IgM para diversos usos terapêuticos.

[00113] Por exemplo, em conexão com anticorpos biespecíficos, os anticorpos biespecíficos podem ser gerados tal que compreendam (i) dois anticorpos, um com uma especifidade para GCC e outro para uma segunda molécula, que são conjugados juntos, (ii) um único anticorpo que tem uma cadeia específica para GCC e uma segunda cadeia específica para uma segunda molécula, ou (iii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade para GCC e para outra molécula. Tais anticorpos bispecíficos podem ser gerados usando técnicas que são conhecidas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes). Retiuladores apropriados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos reativos distintamente separados por um espaçador adequado (por exemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncionalis (por exemplo, dissuccinimidil suberato). Tais vinculadores estão disponíveis por Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Ver também, por exemplo, o vampiro et al. Immunomethods 4:72-81 (1994) and Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) and Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992) e em relação a (iii) ver, por exemplo, Traunecker et al. Int. J. Câncer (Suppl.) 7:51-52 (1992). Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Além disso, "Kappabodies" (Ill. et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al. EMBO J. 13:5303-9 (1994), U.S. Pat. No. 5,837,821), "Diabodies" (Holliger et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448 (1993)), or "Janusins" (Traunecker et al. EMBO J. 10:3655-3659 (1991) and Traunecker et al. Int J câncer Suppl 07:51-52 (1992)) também pode ser preparado.

Ácidos Nucleicos e Polipeptídeos

[00114] Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo que codificam para ou representam as moléculas de anticorpo descritas neste documento. Tais polinucleotídeos codificam para ambas as regiões variáveis e constantes de cada uma das cadeias pesadas e leves, embora outras combinações também são contempladas pela presente invenção em conformidade com as composições descritas neste documento. A presente invenção também contempla fragmentos de oligonucleotídeo derivados dos polinucleotídeos divulgados e sequências de ácido nucleico complementares a estes polinucleotídeos.

[00115] Os polinucleotídeos podem ser na forma de RNA ou DNA. Polinucleotídeos na forma de DNA, cDNA, DNA genômico, análogos de ácido nucleico e DNA sintético estão dentro do escopo da presente invenção. O DNA pode ser de fita dupla ou fita simples, e se de fita simples, pode ser a fita de codificação (sentido) ou fita de não-codificação (anti-sentido). A sequência de codificação que codifica o polipeptídeo pode ser idêntica à seqüência de codificação aqui provida ou pode ser uma sequência de codificação diferente em que a sequência de código, em resultado da redundância ou degeneração do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo como o DNA neste documento apresentado.

[00116] Em modalidades providas, polinucleotídeos codificam pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve da presente invenção, por exemplo, como resumido na tabela 4. A presente invenção também inclui polinucleotídeos variantes contendo modificações como substituições, aditamentos ou exclusões polinucleotídicas e qualquer modificação de polipeptídeos resultantes da sequência polinucleotídica variante. Um polinucleotídeo da presente invenção também pode ter uma sequência de código que é uma variante da sequência de codificação apresentada neste documento. Por exemplo, uma variante polinucleotídica pode ter pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 97% de identidade com um polinucleotídeo listado na tabela 4. Em modalidades, a variante polinucleotídicas codifica para uma molécula de anticorpo anti-GCC.

[00117] Ainda mais a presente invenção se relaciona com polipeptídeos que representam os anticorpos da presente invenção, bem como fragmentos, análogos e derivados de tais polipeptídeos. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser polipeptídeos recombinantes, polipeptídeos produzidos naturalmente ou polipeptídeos sintéticos. Os fragmentos, derivados ou análogos dos polipeptídeos da presente invenção podem ser um em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não pode ser codificado pelo código genético; ou pode ser tal em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte; ou pode ser tal em que o polipeptídeo é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol); ou pode ser tal em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo, tal como uma sequência líder ou secretora ou uma sequência que é empregada para a purificação do polipeptídeo ou uma sequência pró-proteína. Tais fragmentos, derivados e análogos estão no escopo da presente invenção. Em vários aspectos, os polipeptídeos da invenção podem ser produtos parcialmente purificados, ou purificados.

[00118] Um polipeptídeo da presente invenção pode ter uma sequência de aminoácidos idêntica àquela dos anticorpos descritos neste documento, por exemplo, resumidos nas tabelas de 2 ou 3 ou que é diferente por pequenas variações devido a uma ou mais substituições de aminoácidos. A variação pode ser uma mudança "conservadora" tipicamente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos, na qual o aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas semelhantes, por exemplo, substituição de leucina com isoleucina ou treonina com serina; substituição de lisina com arginina ou histidina. Em contraste, as variações podem incluir alterações não-conservadoras, por exemplo, a substituição de uma glicina com um triptofano. Variações menores semelhantes também podem incluir deleções ou inserções de aminoácido ou ambos. Orientação na determinação de quais e quantos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou excluídos sem alterar a atividade biológica ou imunológica pode ser encontrada usando programas de computador conhecidos na técnica, por exemplo um software DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wis).

[00119] Em outro aspecto, a invenção inclui, ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes codificando as moléculas de anticorpo anti-GCC. Em modalidades, os ácidos nucleicos codificam uma ou mais de uma molécula de anticorpo, uma cadeia pesada, uma cadeia leve, uma região variável de cadeia leve, uma região variável da cadeia pesada, porções das cadeias pesadas e cadeias leves das moléculas de anticorpo aqui descritas (por exemplo, um fragmento de região variável de cadeia leve que quando combinado com uma região variável de cadeia pesada de comprimento total é a ligação de antígeno ou uma região variável da cadeia pesada que fragmenta quando combinado com uma região variável de cadeia leve de comprimento total é ligação de antigénio) e CDRs. Modalidades incluem tais ácidos nucleicos dispostos em vetores, por exemplo, vetores de expressão. Ainda mais, a invenção compreende moléculas de anticorpo produzidas pelas células hospedeiras, por exemplo, expressando as moléculas de anticorpo codificadas por tais plasmídeos

[00120] Em uma modalidade, é provido um vetor, por exemplo, um vetor de expressão, que compreende uma ou ambas:

[00121] Seqüências que codificam uma região variável da cadeia leve, por exemplo, uma região variável da cadeia leve descrita na tabela 3, por exemplo, uma sequência listada na tabela 4, seu fragmento de ligação do antígeno ou um, dois ou três CDRs de uma cadeia leve (e, opcionalmente, uma região de framework), aqui descritos, por exemplo, CDRs descrito na tabela 5,e.g., um CDR de codificação de seqüência na tabela 6; e

[00122] Sequências que codificam uma região variável da cadeia pesada, por exemplo, uma região variável da cadeia pesada descrita na tabela 3, por exemplo, uma sequência listada na tabela 4, seu fragmento de ligação do antígeno ou um, dois ou três CDRs de uma cadeia pesada (e, opcionalmente, uma região de framework), aqui descritos, por exemplo, CDRs descritos na tabela 5, por exemplo, um CDR de codificação de seqüência na tabela 6.

[00123] Em modalidades providas, polinucleotídeos codificam pelo menos uma região variável de cadeia pesada ou pelo menos uma região variável de cadeia leve dos anticorpos da presente invenção. Em modalidades providas, polinucleotídeos podem codificar pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpos da presente invenção.

[00124] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC compreende um ou ambos de: (a) uma região variável de cadeia leve, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, codificado por um ácido nucleico que se hibridiza sob condições de rigor selecionadas com, (i) o complemento de uma sequência de molécula de codificação de ácido nucleíco de ancitorpo anti-GCC descrita neste documento, por exemplo, na tabela 4, ou (ii) qualquer sequência de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de uma molécula de anticorpo anti- GCC da invenção, por exemplo, um dos anticorpos de coelho referidos acima resumidos nas tabelas 1 e 2; e (b) uma região variável de cadeia pesada, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, codificado por um ácido nucleico que se hibridiza sob condições de rigor selecionadas com, (i) o complemento de uma sequência de molécula de codificação de ácido nucleíco de ancitorpo anti-GCC descrita neste documento, por exemplo, na tabela 4, ou (ii) qualquer sequência de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada de uma molécula de anticorpo anti- GCC da invenção, por exemplo, um dos anticorpos de coelho referidos acima resumidos nas tabelas 1 e 2; e

[00125] Em uma modalidade, condições de rigor selecionadas são condições de rigor altas ou muito alta, por exemplo, como as condições são aqui descritas.

[00126] A presente invenção provê também vetores que incluem os polinucleotídeos da presente invenção, células hospedeiras que são geneticamente manipuladas com vetores da presente invenção e a produção dos anticorpos da presente invenção por técnicas de recombinação.

[00127] A seqüência apropriada de DNA pode ser inserida no vector por uma variedade de procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA é inserida em locais de endonuclease de restrição apropriados de procedimentos conhecidos na técnica. A seqüência de polinucleotídeos do vetor de expressão está operativamente vinculada a uma sequência de controle de expressão adequada (ou seja, promotora) para direcionar a síntese de mRNA. Exemplos de tais promotores incluem, mas não estão limitados a, o vírus sarcoma de Rous LTR ou o promotor SV40 precoce ou tradio, o lac ou trp de e. coli, o promotor PL de fago lambda e outros promotores conhecidos para controlar a expressão de genes em células procariotas (e.g., promotores tac, T3, T7 para e. coli) ou eucarióticas (por exemplo,promotor de citomegalovírus, promotor tardio adenovírus, promotor EF-1a) ou seus vírus. O vetor de expressão também contém um local de ligação de ribossomo para a iniciação da tradução e um terminador de transcrição. O vetor também pode incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. Por exemplo, o vetor pode conter intensificadores, que são sequências de DNA estimulando a transcrição de origem viral, tais como os derivados de vírus símio tais como formulário como SV40, vírus de polioma, citomegalovírus, vírus de papiloma bovino ou vírus do sarcoma de Moloney, ou de origem genômica. O vetor de preferência também contém uma origem de replicação. O vetor pode ser construído para conter uma origem exógena de replicação ou, tal origem de replicação pode ser derivada de SV40 ou outra fonte viral, ou pelo mecanismo de replicação cromossômica da célula hospedeira.

[00128] Em adição, os vetores, opcionalmente, contém um gene marcador para a seleção de células hospedeiras transfectadas tais como genes de marcador dihidrofolato redutase para permitir seleção com metotrexato em uma variedade de hospedeiros, ou antibióticos, tais como o gene .beta.-lactamase (resistência à ampicilina), gene Tet (resistente à tetraciclina) usado em células procarióticas ou neomicina, GA418 (geneticina, um derivado de neomicina) gpt (ácido micofenólico), ampicilina, ou genes de resistência higromicina, ou genes que complementam uma lesão genética das células hospedeiras, tais como a ausência de quinase timidina, transferase fosforribosil de hipoxantina, dihidrofolato redutase, etc. Genes que codificam o produto do gene de marcadores auxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) são frequentemente utilizados como marcadores selecionáveis em levedura.

[00129] A fim de obter os anticorpos da presente invenção, uma ou mais sequências polinucleotídicas que codificam para as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada e regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada dos anticorpos da presente invenção devem ser incorporados a um vetor. As seqüências polinucleotídicas que codificam as cadeias leves e pesadas dos anticorpos da presente invenção podem ser incorporadas em um ou vários vetores e então incorporadas nas células hospedeiras. vetores de expressão adequados para expressão em células de mamíferos incluem, por exemplo, pCDM8, pcDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Califórnia), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, Califórnia), pCDEF3 (Goldman, L. A., et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GIBCO division of Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322(1990)), Bicistronic GPEX® Retrovector (Gala Biotech, Middleton, Wis.) e similares. Vetores de expressão, que são apropriados para uso em vários hosts de expressão, tais como células procarióticas (e. coli), células de insetos ( células Drosophila Schnieder S2, Sf9) e levedura (P. methanolica, p. pastoris, S. cerevisiae) também estão disponíveis. Vetores exemplares são pLKTOK58 (seqüência de tipo selvagem IgG1 Fc) e pLKTOK59 (seqüência mutada IgG1 Fc) (ver Publicação do Pedido de Patente U.S. no. 20060147445).

[00130] Conforme será apreciado, anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser expressos em linhagens celulares diferentes das linhagens de células de hibridoma. Sequências que codificam os cDNAs ou clones genômicos para os anticorpos específicos podem ser usadas para células hospedeiras de mamífero ou não-mamífero adequadas. Transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, embalar o polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e transduzir uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos, por exemplo, transfecção mediada por dextran, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibrene, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas e microinjeção direta da molécula de DNA. O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a transfecção mediada por dextrano, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, bombardeamento de partículas, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas, conjugados de peptídeo, dendrímeros e microinjeção direta do DNA no núcleo.

[00131] Em outro aspecto, a invenção compreende, uma célula hospedeira composta por um ácido nucleico aqui descrito. Em modalidades a célula expressa uma molécula de anticorpo ou seu componente, aqui descritos. Ainda mais uma modalidade provê um método de produzir uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula do anticorpo anti-GCC descrita neste documento, por exemplo, uma molécula de anticorpo de coelho, ou uma versão humanizada da mesma, compreendendo a manutenção da célula hospedeira em condições adequadas para a expressão, no qual cadeia(s) imunoglobulina é(são) expressa(s) e uma molécula de anticorpo é produzida. Uma modalidade adicional provê uma célula hospedeira, composta por qualquer um dos vetores de expressão antecedentes codificando sequências de anticorpos de cadeia leve e pesada. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariota, por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de levedura ou uma célula procariótica, por exemplo, e. coli. Por exemplo, as células de mamíferos podem ser uma célula cultivada ou uma linha celular. Células de mamíferos exemplares incluem linhas de célula linfocíticas (por exemplo, NS0), células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS. Em uma determinada modalidade, a célula hospedeira cultivada é uma célula CHO que inclui sequências de ácidos nucleicos, codificação de uma molécula de anticorpo MIL-44-148-2. Em outra modalidade, a célula hospedeira é hibridoma MIL-44148-2 (PTA-8132). Além disso, células incluem células oócito e células de um animal transgênico, por exemplo, a célula epitelial mamária. Por exemplo, ácidos nucleicos codificando uma molécula de anticorpo aqui descrita podem ser expressos em um animal transgênico não-humano.

[00132] Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiras para a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis pela American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas não limitado a células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e um número de outras linhagens celulares. Células não-mamíferas que incluem mas não estão limitadas a bacterianas, leveduras, insetos e plantas também podem ser usadas para expressar anticorpos recombinantes. Mutagênese direcionada a localização de domínio de anticorpo CH2 para eliminar glicosilação pode ser preferida para evitar alterações em imunogenicidade, farmacocinética, e/ou funções efetoras resultantes da Glicosilação de não-humanos. Os métodos de expressão são selecionados pela determinação de qual o sistema gera os mais altos níveis de expressão e produz anticorpos com propriedades de ligação GCC constitutivas.

[00133] A modalidade adicionalmente provê um método de produzir uma molécula de anticorpo anti-GCC, por exemplo, uma molécula de anticorpo de coelho ou sua versão humanizada, compreendendo a manutenção da célula hospedeira composta por ácidos nucleicos descritos neste documento, por exemplo, uma ou mais seqüências de ácido nucleico listadas na tabela 4 ou 6, sob condições adequadas para a expressão de uma imunoglobulina, segundo o qual as cadeias de imunoglobulina, são expressas e uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de anticorpo de coelho, ou sua versão humanizada, que liga o GCC, ou um fragmento ou sua variante, é produzida. Por exemplo, métodos de expressão de moléculas de anticorpo incluem o uso de células hospedeiras, onde uma primeira molécula de ácidos nucleicos recombinantes de codificação de uma molécula d anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve de anticorpos de coelho ou sua versão humanizada e uma segunda molécula de ácidos nucleicos recombinantes de codificação de uma molécula do anticorpo, por exemplo, uma cadeia pesada de anticorpos de coelho ou sua versão humanizada, são compreendidos em um vetor de expressão única. Em outras modalidades, eles estão em vetores separados. O método ainda pode compreender a etapa de isolamento ou recuperação do anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno de anticorpo, cadeia de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de uma cadeia de anticorpo, se desejado.

[00134] Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico (ou seja, uma ou mais moléculas de ácido nucleico) codificando as cadeias pesadas e leves de um anticorpo de coelho (ou humanizado) que liga uma proteína GCC, ou uma construção de expressão (ou seja, uma ou mais construções) compreendendo tal(is) molecula(s) de ácido nucleico, pode ser introduzida em uma célula hospedeira adequado para criar uma célula hospedeira recombinante usando qualquer método apropriado para a célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, eletroporação, transfecção, infecção), de tal forma que a(s) molecula(s) de ácido nucleico está operadamente vinculada a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em uma construção criada por processos na célula, integrado no genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante resultante pode ser mantida em condições adequadas para a expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal não- humano adequado, em meios de cultura apropriados, suplementado com sais apropriados, fatores de crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.), pelo qual o(s) polipeptídeo(s) codificado é (são) produzido(s). Se desejado, a proteína codificada pode ser isolada ou recuperada (por exemplo, do animal, da célula hospedeira, do meio, do leite). Este processo engloba a expressão em uma célula hospedeira de um animal não-humano transgênico (ver, por exemplo, WO 92/03918, GenPharm International) ou planta.

[00135] Ainda mais, expressão de anticorpos da invenção (ou outras frações deles) de produção linhas de células podem ser intensificadas com um número de técnicas conhecidas. Por exemplo, a sintetase de glutamina e sistemas de expressão de genes DHFR são abordagens comuns para melhorar a expressão sob certas condições. Clones de célula de alta expressão podem ser identificadas usando técnicas convencionais, tais como a clonagem de diluição limitada, tecnologia Microdrop ou quaisquer outros métodos conhecidos na técnica. O sistema GS é discutido no todo ou em parte em conexão com Patente Européia N° 0 216 846, 0 256 055 e 0 323 997 e Pedido de Patente Europeu n ° 89303964.4.

[00136] Em um sistema exemplar para a expressão recombinante de um anticorpo modificado, ou sua porção ligadora de antígeno, da invenção, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo quanto a cadeia leve do anticorpo é introduzido em células CHO de dhfr por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes de cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo estão, cada um, operativamente ligados a elementos reguladores potencializadores/promotores (por exemplo, derivados de SV40, CMV, adenovírus e similares, tais como um potenciador de CMV/elemento regulatório promotor de AdMLP ou um potencializador de SV40/elemento regulador promotor de AdMLP) para conduzir altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carreia um gene de DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor, usando a seleção/amplificação do metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. As técnicas padrões de biologia molecular são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultura de células hospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura.

[00137] Anticorpos da invenção também podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que são transgênicos para a produção das sequências de cadeia leve e pesada de imunoglobulinas de interesse e produção do anticorpo em sua forma recuperável. Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, anticorpos podem ser produzidos em, e recuperados de, o leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Vide, por exemplo, Pat. U.S. Nums. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, e 5,741,957.

[00138] Os anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno, cadeias de anticorpo e porções de ligação de antígeno respectivos descritos neste documento também podem ser produzidos em um apropriado sistema de expressão in vitro, por síntese química ou por qualquer outro método adequado.

Proteínas de fusão e Immunoconjugados

[00139] Os anticorpos anti-GCC aqui descritos podem ser funcionalmente vinculados por qualquer método adequado (por exemplo, acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou similares) para uma ou mais entidades moleculares não-anticorpo.

[00140] Proteínas de fusão podem ser produzidas em que uma molécula de anticorpo anti-GCC, conforme descrito neste documento e uma fração não-anticorpo são componentes de uma cadeia de polipeptídeo contínua única. A fração não-anticorpo pode ser localizada N-terminalmente, C-terminalmente ou internamente, no que diz respeito à fração de anticorpo. Por exemplo, algumas encarnações podem ser produzidas através da inserção de um ácido nucleico de codificação de sequências de imunoglobulina em um vetor de expressão adequado, tal como um vetor pET (por exemplo, pET-15b, Novagen), um vetor de fago (por exemplo, pCNATAB 5 E, Pharmacia), ou outro vetor, por exemplo, vetor de fusão de proteína A pRIT2T, Pharmacia). A construção resultante pode ser expressa para produzir cadeias de anticorpo que compõem uma fração não-anticorpo (por exemplo, marcador de histidina, marcador E ou domínio de ligação da proteína A IgG). Proteínas de fusão podem ser isoladas ou recuperadas usando qualquer técnica adequada, tal como a cromatografia utilizando uma matriz de afinidade apropriada (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.116.7.8 (1991)).

[00141] A invenção fornece moléculas de anticorpo anti-GCC que são direcionadas para e, em modalidades, são internalizadas nas células. Elas são capazes de entregar agentes terapêuticos ou agentes detectáveis para ou em células expressando GCC, mas não para ou em células onde o alvo não é expresso. Assim, a invenção também provê imunoconjugados anti- GCC constituídos por uma molécula de anticorpo anti-GCC, conforme descrito neste documento, que é conjugada com um agente terapêutico ou um agente detectável. Em modalidades, a afinidade para GCC de um imunoconjugado anti-GCC é pelo menos 10, 25, 50, 75, 80, 90 ou 95% do que para o anticorpo não-conjugado. Isto pode ser determinado usando superfície de célula GCC ou GCC isolado. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC, por exemplo, um imunoconjugado, tem um LD50, conforme determinado por um ensaio descrito neste documento, de menos de 1.000, 500, 250, 100 ou 50 pM.

[00142] A molécula de anticorpo anti-GCC pode ser modificada para atuar como um imunoconjugado utilizando técnicas que são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver, também, U.S. Pat. No. 5,194,594. A preparação de anticorpos radiomarcados, pode também ser facilmente preparada utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Junghans et al. em Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edição, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Ver, também, U.S. Pat. Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (U.S. Re. Pat. Num. ° 35.500), 5.648.471 e 5.697.902.

[00143] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo e fração de não-anticorpo são conectados por meio de um vinculador. Em tais modalidades, o imunoconjugado é representado pela fórmula (I): em que, Ab é uma molécula de anticorpo anti-GCC aqui descrita; X é uma fração que conecta Ab e Z, por exemplo, o resíduo de um vinculador aqui descrito após a ligação covalente de um ou ambos Ab e Z; Z é um agente terapêutico ou marcador; e m varia de cerca de 1 a cerca de 15.

[00144] A variável m representa o número de frações --X--Z por molécula de anticorpo em um imunoconjugado de fórmula (I). Em várias modalidades, m varia de 1 a 15, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 a 2. Em algumas modalidades, m varia de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 ou 2 a 3. Em outras modalidades, m é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em composições compreendendo uma pluralidade de imunoconjugados da fórmula (I), m é o número médio de frações --X---Z por Ab, também conhecido como sendo a carga média de droga. Carga média de droga pode variar de 1 a cerca de 15-X-Z frações por Ab. Em algumas modalidades, quando m representa a carga média de droga, m é cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7 ou cerca de 8. Em modalidades exemplares, m é de cerca de 2 a cerca de 8. Em uma modalidade, m é cerca de 8. Em outra modalidade, m é cerca de 4. Em outra modalidade, m é cerca de 2.

[00145] O número médio de frações --X--Z por Ab pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa, ensaio de ELISA e HPLC. Também pode ser determinada a distribuição quantitativa de imunoconjugados em termos de m. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de imunoconjugados homogêneos, onde m é um determinado valor, conforme distinguindo de imunoconjugados com outras cargas de droga, podem ser alcançadas através de meios tais como inverter fase HPLC ou eletroforese.

[00146] Os imunoconjugados da fórmula (I) podem existir como misturas, em que cada componente de mistura tem um valor diferente de m. Por exemplo, um imunoconjugado de fórmula (I) pode existir como uma mistura de dois componentes de imunoconjugado separados: um componente de imunoconjugado em que m é 7 e o outro componente de imunoconjugado em que m é 8.

[00147] Em uma modalidade, o imunoconjugado da fórmula (I) existe como uma mistura de três imunoconjugados separados em que m para os três imunoconjugados separados é 1, 2 e 3, respectivamente; 3, 4 e 5, respectivamente; 5, 6 e 7, respectivamente; 7, 8 e 9, respectivamente; 9, 10 e 11, respectivamente; 11, 12 e 13, respectivamente; ou 13, 14 e 15, respectivamente.

[00148] A variedade de vinculadores apropriados (por exemplo, os reagentes heterobifuncionais para conectar uma molécula de anticorpo a um agente terapêutico ou marcador) e métodos para a preparação de imunoconjugados são conhecidos na técnica. (Ver, por exemplo, Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992).) O vinculador pode ser clivável, por exemplo, sob condições fisiológicas, por exemplo, sob condições intracelulares, tais que a clivagem do vinculador libera a droga (ou seja, o agente terapêutico ou marcador) no ambiente intracelular. Em outras modalidades, o vinculador não é clivável, e a droga é liberada, por exemplo, pela degradação de anticorpo.

[00149] O vinculador pode ser ligado a um grupo quimicamente reativo sobre a fração do anticorpo, por exemplo, para um grupo amino, imino, hidroxil, tiol ou carboxil livre (por exemplo, para términos N- ou C-, para o grupo de amino epsilon de um ou mais resíduos de lisina, o grupo ácido carboxílico livre de um ou mais resíduos de ácido glutâmico ou ácido aspártico ou ao grupo sulfidrila de um ou mais resíduos de cisteinil). O local ao qual está ligado o vinculador pode ser um resíduo natural na sequência de aminoácidos da fração do anticorpo ou pode ser introduzido na fração do anticorpo, por exemplo, pela tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, através da introdução de um local de clivagem de cisteína ou protease na seqüência de aminoácidos) ou pela bioquímica de proteínas (por exemplo, redução, ajuste do pH ou proteólise). Um dos mais comumente usados métodos de ligação covalente não- específica é a reação de carbodiimida para vincular um grupo de carboxi (ou amino) de um composto para um grupo de amino (ou carboxi) da molécula do anticorpo. Além disso, agentes bifuncionais como dialdeídos ou imidoésteres têm sido utilizados para vincular o grupo de amino de um composto de grupos de amino de uma molécula de anticorpo. Também disponível para anexo de droga (ou seja, agente terapêutico ou marcador) a moléculas de anticorpo é a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxidação de periodato de uma droga que contém grupos glicol ou hidroxi, formando assim um aldeído que é então reagido com a molécula de anticorpo. Anexo ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos aminoácidos da molécula de anticorpo. Isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para anexar covalentemente drogas à molécula de anticorpo. Outras técnicas são conhecidas para o artesão versado na técnica e no escopo da presente invenção.

[00150] Em determinadas modalidades, um intermediário, que é o precursor do vinculador (X), é reagido com a droga (Z), em condições adequadas. Em determinadas modalidades, grupos reativos são usados na droga e/ou no intermediário. O produto da reação entre a droga (ou seja, o agente terapêutico ou marcador) e o intermediário, ou a droga derivada, é posteriormente reagido com a molécula de anticorpo em condições adequadas. O imunoconjugado pode ser purificado a partir de reagentes ao se empregar metodologias bem conhecidas para aqueles versados na técnica, por exemplo, cromatografia de coluna (por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, filtração por gel, cromatografia de interação hidrofóbica), diálise, diafiltração ou precipitação. O imunoconjugado pode ser avaliado ao se empregar metodologias bem conhecidas para aqueles versados na técnica, por exemplo, SDS-PAGE, espectroscopia de massa ou eletroforese capilar.

[00151] Em algumas modalidades, o vinculador é clivável por um agente de clivo que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossomo ou cavéolas). O vinculador pode ser, por exemplo, um vinculador peptidil que é clivado por uma enzima protease ou peptidase intracelular, incluindo, mas não limitado a, uma protease lisossômica ou endossômica. Em algumas modalidades, o vinculador peptidil tem comprimento de pelo menos dois aminoácidos ou pelo menos três aminoácidos. Agentes de clivagem podem icluir as catepsinas B e D e plasmina, todas as quais são conhecidas por hidrolisar derivados de drogas dipeptídeo resultando na liberação de droga ativa (ou seja, o agente terapêutico ou marcador) no interior das células alvo (ver, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm Therapeutics 83:67-123). Mais típicos são os vinculadores peptidil que são clivagens por enzimas que estão presentes nas células expressando GCC. Por exemplo, um vinculador peptidil é clivável pela protease dependente de tiol catepsina-B, que é altamente expressa em tecido cânceroso, pode ser usado (por exemplo, um Phe-Leu ou um vinculador Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ. ID NO: 319)). Outros exemplos de tais vinculadores são descritos, por exemplo, em U.S. Pat. N. ° 6.214.345, incorporados neste documento por referência na sua totalidade e para todos os efeitos. Em uma modalidade específica, o vinculador peptidil clivável por uma protease intracelular é um vinculador Val-Cit ou um vinculador Phe-Lys (ver, por exemplo, U.S. Pat. N. ° 6.214.345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o vinculador val-cit). Uma vantagem de usar liberação proteolítica intracelular da droga (ou seja, o agente terapêutico ou marcador) é que a droga normalmente é atenuada quando conjugada e as estabilidades de soro dos conjugados é normalmente elevada.

[00152] Em outras modalidades, o vinculador clivável é sensível ao pH, ou seja, sensível à hidrólise em determinados valores de pH. Normalmente, o vinculador sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, pode ser usado um ácido-lábil vinculador que é hidrolisável na lisossoma (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou semelhante). (Ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Tais vinculadores são relativamente estáveis em condições de pH neutro, tais como aquelas no sangue, mas são instáveis abaixo de pH 5,5 ou 5,0, o pH aproximado de lisossoma. Em determinadas modalidades, o vinculador hidrolisável é um vinculador tioéter (como, por exemplo, um tioéter anexado ao agente terapêutico através de uma ligação de acilhidrazona (ver, por exemplo, U.S. Pat. No. 5,622,929).

[00153] Em ainda outras modalidades, o vinculador é clivável sob condições redutoras (por exemplo, um vinculador de bissulfeto). Uma variedade de vinculadores de dissulfureto são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados utilizando SATA (N- succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3 (2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3 (2-piridilditio) butirato) e SMPT (N- succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio) tolueno) -, SPDB e SMPT (Ver, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Câncer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Câncer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver, também, U.S. Pat. No. 4,880,935.)

[00154] Em ainda outras modalidades específicas, o vinculador é um vinculador malonato (Johnson et al., 1995, Anticâncer Res. 15:1387-93), um vinculador de maleimidobenzoil (Lau et al., 1995, Bioorg Med. Chem. 3(10):1299-1304), ou um análogo de 3'-N-Amida (Lau et al., 1995, Bioorg- Med Chem. 3(10):1305-12).

[00155] Em ainda outras modalidades, a unidade de vinculador não é clivável e a droga (ou seja, o agente terapêutico ou marcador) é liberada pela degradação de anticorpo. (Ver, por exemplo Publicação U.S. n° 20050238649 incorporados por referência neste documento em sua totalidade e para todos os efeitos).

[00156] Normalmente, o vinculador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como usado neste documento, "não substancialmente sensível ao meio extracelular," no contexto de um vinculador, significa que não mais do que cerca de 20%, normalmente não mais do que cerca de 15%, mais tipicamente não mais do que cerca de 10% e ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 5%, não mais de cerca de 3%, ou não mais de cerca de 1% dos vinculadores, em uma amostra de imunoconjugado, são clivados quando o imunoconjugado apresenta-se em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Whether a linker is not substantially sensitive to the extracellular environment can be determined, for example, by incubating with plasma the immunoconjugate for a predetermined time period (e.g., 2, 4, 8, 16, or 24 hours) and then quantifying the amount of free drug present in the plasma.

[00157] Em outras, não mutuamente exclusivas modalidades, o vinculador promove a internalização celular. Em determinadas modalidades, o vinculador promove interiorização celular quando conjugada com o agente terapêutico ou marcador (Z). Ainda outras modalidades, o vinculador promove interiorização celular quando conjugado para ambos a fração Z e a molécula de anticorpo anti-GCC.

[00158] Uma variedade de vinculadores exemplares que podem ser usados com as composições e métodos presentes são descritos em WO 2004-010957, Publicação U.S. n ° 20060074008, Publicação U.S. n ° 20050238649 e Publicação U.S. n ° 20060024317 (cada uma das quais é incorporada por referência neste documento em sua totalidade e para todos os efeitos).

[00159] Exemplos de vinculadores capazes de serem usados para acoplar uma molécula de anticorpo a um agente terapêutico ou marcador incluem, por exemplo, maleimidocaproil (mc);vinculadores maleimidocaproil- p-aminobenzilcarbamato; maleimidocaproil-peptídeo-aminobenzilcarbamato, e.g., maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p-aminobenzilcarbamato e maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p-aminobenzilcarbamato (vc); N- succinimidil 3-(2-piridilditio)proprionato (também conhecido como N- succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato ou SPP); 4-succinimidil-oxicarbonil-2- metil-2-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT); N-succinimidil 3-(2- piridilditio)propionato(SPDP); N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butirato (SPDB); 2- iminotiolano; S-acetilsuccínico anidrido; disulfídeo benzil carbamato; carbonato; vinculadores hidrazone; N-(α-Maleimidoacetoxi) éster succinimido; N-[4-(p-Azidosalicilamido) butil]-3'-(2'-piridilditio)propionamido (AMAS); N- [.beta.-Maleimidopropiloxi] éster succinimido (BMPS); [N-ε- Maleimidocaproiloxi] éster succinimido (EMCS); N-[y-Maleimidobutiriloxi] éster succinimido (GMBS); Succinimidil-4-[N-Maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi- [6-amidocaproato] (LC-SMCC); Succinimidil 6-(3-[2-piridilditio]- propionamido)hexanoato (LC-SPDP); éster m-Maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimide (MBS); N-Succinimidil[4-iodoacetil]aminobenzoato (SIAB); Succinimidil 4-[N-maleimidomethil]ciclohexano-1-carboxilato (SMCC); N- Succinimidil 3-[2-piridilditio]-propionamido(SPDP); [N- ε-Maleimidocaproiloxi] éster sulfosuccinimido (Sulfo-EMCS); N-[ y-Maleimidobutiriloxi]éster sulfosuccinimido (Sulfo-GMBS); 4-Sulfosuccinimidil-6-metil-α-(2- pyridilditio)toluamido]hexanoato) (Sulfo-LC-SMPT); Sulfosuccinimidil 6-(3'-[2- piridilditio]-propionamido)hexanoato (Sulfo-LC-SPDP); éster m- Maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimido (Sulfo-MBS); N- Sulfosuccinimidil[4-iodoacetil]aminobenzoato (Sulfo-SIAB); Sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC); Sulfosuccinimidil 4-[p-maleimidofenil]butirato (Sulfo-SMPB); etilene glicol- bis(éster de ácido succínico N-hydroxisuccinimido) (EGS);disuccinimidil tartrato (DST); 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7, ácido 10-tetraacético (DOTA); ácido dietilenetriamina-pentaacético (DTPA); e vinculadores tioureia.

[00160] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um agente citostático ou citotóxico. Exemplos incluem, sem limitação, anti- metabólitos (por exemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, pentostatina, cladribina, 5-fluorouracil (5FU), floxuridina (FUDR), citosina-arabinósido (citarabina), metotrexato, trimetoprima, pirimetamina, pemetrexede); agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalan, clorambucil, tiotepa/clorambucil, ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina, bussulfano, dibromomanitol, cisplatina, carboplatina, nedaplatina, oxaliplatina, satraplatina, triplatina tetranitrato, procarbazina, altretamina, dacarbazina, mitozolomida, temozolomida); antraciclinas (por exemplo., daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, valrubicina); antibióticos (por exemplo, dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina, estreptozotocina, gramicidina D, mitomicinas (por exemplo, a mitomicina C), duocarmicinas (por exemplo, CC-1065), calicheamicinas); agentes antimitóticos (incluindo, por exemplo, maitansinóides, auristatinas, dolastatinas, criptoficinas, alcalóides de vinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina), taxanos (por exemplo, o paclitaxel, o docetaxel ou um novo taxano (ver, por exemplo, Publicação de Patente Internacional n . WO 01/38318, publicada em 31 de Maio de 2001)), e colchicina, inibidores de topoisomerase (por exemplo, irinotecano, topotecano, amsacrina, etoposideo, teniposideo, mitoxantrona), e inibidores de proteassoma (por exemplo, ácidos borônicos de peptidil).

[00161] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um maitansinóide. Compostos de maitansinóide e métodos para sua conjugação de anticorpos são descritos, por exemplo, em Chari et al., Câncer res, 52: 127-131 (1992); Widdison et al., J. Med. Chem. 49: 4392-4408 (2006); e Pat. U.S. Num Nos. 5,208,020 and 6,333,410. Exemplos de maitansinóides incluem análogos maitansina tendo um anel aromático modificado (por exemplo, C-19-decloro, C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi) e aqueles que têm modificações noutras posições (por exemplo, C-9-CH, C-14-alcoximetilo, C- 14-hidroximetilo ou aciloximetilo, C-15-hidroxi / aciloxi, C-15-metoxi, C-18-N- demetil, 4,5-desoxi) .. Em determinadas modalidades, o maitansinóide é N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(4-mercapto-1-oxopentil)maitansina (DM3), N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1) ou N.sup.2'-deacetil-N.sup.2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)maitansina (DM4).

[00162] Compostos de maitansinóide que compõem um grupo sulfidrila podem ser acoplados aos anticorpos usando um vinculador heterobifuncional que está conectado ao maitansinóide composto por meio de uma vinculação tioéter ou dissulfeto. Em algumas dessas modalidades, o vinculador é acoplado a um grupo amino no anticorpo (por exemplo, um grupo amino terminal ou o grupo de amino de epsilon de um resíduo de lisina. Em algumas modalidades, o vinculador heterobifuncional que é usado para acoplar compostos de maitansinóide a um anticorpo é N-succinimidil-3 (2- piridilditio) propionato (também conhecido como N-succinimidil-4 (2-piridilditio) pentanoato, ou SPP), 4-succinimidil-oxicarbonil-2-metil-2 (2-piridilditio)- tolueno (SMPT), N-succinimidil-4 [N-maleimidometil] ciclohexano-1- carboxilato (SMCC), N-succinimidil 3 (2-piridilditio) propionato (SPDP); N- succinimidil-4 (2-piridilditio) butirato (SPDB), 2-iminotiolano ou anidrido S- acetilsuccinico.

[00163] Em algumas outras modalidades, o agente terapêutico é uma dolastatina. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é uma auristatina, como auristatina E (também conhecido na técnica como um derivado do dolastatina-10) ou seu derivado. Compostos de auristatina e métodos para sua conjugação de anticorpos são descritos, por exemplo, em Doronina et al., Nature Biotech.,, 21: 778-784 (2003); Hamblett et al, Clin. Câncer Res., 10: 7063-7070 (2004); Carter and Senter, Câncer J., 14 154-169 (2008); U.S. Pat. Nums. 7,498,298, 7,091,186, 6,884,869; 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; e 4,486,414; Publicação de Patente U.S. Nums. 20090010945, 20060074008, 20080300192, 20050009751, 20050238649, e 20030083236; e Publicação de Patentes Internacional Nums. WO 04/010957 e WO 02/088172, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua totalidade e para todos os efeitos.

[00164] A auristatina pode ser, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um cetoácido. Por exemplo, auristatina E pode ser reagida com ácido benzóico paraacetil ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outras auristatinas típicos incluem auristatina fenilalanina fenilenodiamina (AFP), mono-metil auristatina E (MMAE) e mono- metil auristatina F (MMAF).

[00165] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um radionuclídeo. Exemplos de radionuclídeos úteis como toxinas em radioterapia incluem: 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb e 212 B. Outros radionuclídeos utilizados por aqueles que são ordinariamente versados na técnica incluem: 32P e 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 191Os, 193MPt, 197Hg, todos os emissores beta negativos e/ou auger. Alguns radionuclídeos preferenciais incluem: 90Y, 131I, 211At e 212Pb/212 Bi.

[00166] Uma pessoa versada na técnica pode conjugar uma molécula de anticorpo anti-GCC para um radionuclídeo usando técnicas conhecidas. Por exemplo, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla.,; e Barchel, S. W. e Rhodes, B. H., (1983)Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., cada um dos quais é incorporado neste documento por referência, ensinam a conjugação de vários radionuclídeos terapêuticos e diagnósticos em aminoácidos de anticorpos. Tais reações podem ser aplicadas para conjugar radionuclídeos de moléculas de anticorpo anti-GCC da invenção com um agente quelante apropriado e/ou o vinculador.

Sequências de anticorpo anti-GCC

[00167] Os anticorpos monoclonais anti-GCC de coelho foram gerados por vários métodos, conforme é discutido em mais detalhes nos exemplos. Brevemente, os anticorpos monoclonais de coelho MIL-44-148-2 e MIL-44-67-4 foram gerados pela tecnologia tradicional de imunização em coelhos. Hibridomas coelho-coelho verdadeiros foram gerados em Epitomics (Burlingame, CA) pela fusão de B-células isoladas de um coelho imunizado com a linha celular de parceiro de fusão proprietária Epitomics (proprietary fusion partner cell line) (ver Patentes U.S. 7,402,409; 7,429,487; 7,462,697; 7,575,896; 7,732,168; e 8,062,867).. A especificidade dos anticorpos contra GCC foi testada por citometria de fluxo (FCM) e ELISA.

[00168] A tabela 1 abaixo resume os anticorpos anti-GCC monoclonais de coelho da invenção gerados usando o imunogene hGCC (ECD) / mIgG2a FcR-mutII.

[00169] As sequências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada foram determinadas. Tabela 2 abaixo é um resumo dos Nums. SEQ. de ID, para as regiões variáveis de vários anticorpos. As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos para as regiões variáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves para anticorpos anti-GCC de coelho são mostradas nas tabelas 3 e 4, respectivamente.

[00170] As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos para cada um dos CDRs das cadeias pesadas e leves para detecção de anticorpos anti-GCC são mostradas nas tabelas 5 e 6, respectivamente.

[00171] O sequenciamento dos CDRs permitiu a determinação da abundância de resíduos que podem servir como locais de conjugação de toxina. Por exemplo, uma cisteína livre não-combinada na região de ligação de antígeno pode ser um local de conjugação de auristatina e uma lisina pode ser um local de conjugação de maitansina. Conjugação de toxina a um aminoácido do CDR aumentaria a preocupação de alterar a afinidade de ligação do anticorpo ao GCC. Assim, em modalidades, os CDRs carecem de um aminoácido que pode ser conjugado com um agente terapêutico. Tabela 1: Resumo de Nums. de SEQ de ID para cadeias pesadas e leves de mAbs de coelho anti-GCC Ácido Nucleico MIL-44-148-2 H2 (Num de SEQ de ID: 4) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTG TCCAGTGTCAGTCAGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAAC GGATACCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTC ATAGAATGAACTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGA TCGCAATCATTACTCATAATAGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAA AGCCGATCCACCATCACCAGAAACACCAGCGAGAACACGGTGACTCTGA AAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAG AGAGGATAGTATGGGGTATTATTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTG GTCACCATCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGG GACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTAC CTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAAT GGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCG CTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGC AACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCG CCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGA TGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGC ACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGC GTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAG GAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACAC CATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGAC CTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAG AAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTG GACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGA GTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGG CCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAA ATGA Aminoácido MIL-44-148-2 H2 (Num de SEQ de ID: 42) METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVKESGGGLFKPTDTLTLTCTVSGFSLSSHR MNWVRQTPGKGLEWIAIITHNSITYYASWAKSRSTITRNTSENTVTLKMTSLT AADTATYFCAREDSMGYYFDLWGPGTLVTISSGQPKAPSVFPLAPCCGDTP SSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVS VTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFN STIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYT MGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSD GSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK Ácido Nucleico MIL-44-148-2 L5 (Num de SEQ de ID: 5) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGG CTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTG TGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTC AGAGCATTAGTAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGTC TCCCAAGCCCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCA TCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCA GTGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGCAGACTTA TACTAATAATCATCTTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCAAA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCA GGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTT CCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTG GCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAAC CTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAG AGTACACCTGCAGGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTT CAATAGGGGTGACTGTTAG Aminoácido MIL-44-148-2 L5 (Num de SEQ de ID: 43) MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIS NWLAWYQQKPGQSPKPLIYRASTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVECA DAATYYCQQTYTNNHLDNGFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGT VTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLT STQYNSHKEYTCRVTQGTTSVVQSFNRGDC Ácido Nucleico MIL-44-67-4 H2 (Num de SEQ de ID: 6) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTG TCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATCCGACATCAGTAA CTATGCAATATCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATTC ATCGGATATATTAGTTATGGTAAAAGTATATACTACGCGAGCTGGGCGAA AGGCCGGTTCGCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGGAA ATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGAG AGGATAGTGCTACTTATAGTCCTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGT CACCGTCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGG GACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTAC CTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAAT GGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCG CTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGC AACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCG CCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGA TGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGC ACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGC GTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAG GAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACAC CATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGAC CTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAG AAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTG GACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGA GTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGG CCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAA ATGA Aminoácido MIL-44-67-4 H2 (Num de SEQ de ID: 44) METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDISNYAI SWVRQAPGKGLEFIGYISYGKSIYYASWAKGRFAISKTSSTTVDLEITSPTTE DTATYFCAREDSATYSPNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSS TVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVT SSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTI RVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMG PPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSY FLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK Ácido Nucleico MIL-44-67-4 L4 (Num de SEQ de ID: 7) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGG CTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTG TGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTC AGAGTATTAACACCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCG TCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCA TCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCA GCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTA TAGTTATAATAATCTTGATCGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTG GTCACA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCA GGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTT CCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTG GCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAAC CTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAG AGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTT CAATAGGGGTGACTGTTAG Aminoácido MIL-44-67-4 L4 (Num de SEQ de ID: 45) MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIN TYLAWYQQKPGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISGVECAD AATYYCQQGYSYNNLDRAFGGGTEVVVTGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTV TIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTST QYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC Tabela 2: Resumo de Num de SEQ de ID para regiões variáveis de mAbs de coelho anti-GCC Tabela 3: Sequências de aminoácidos das regiões variáveis mAb de mAbs de coelho anti-GCC Tabela 4: Sequências de ácido nucleíco das regiões variáveis mAb de mAbs de coelho anti-GCC Tabela 5. Sequências de aminoácidos de CDRs de mAbs de coelho anti-GCC Tabela 6: Sequências de ácido nucleico de CDRs de mAbs de coelho anti- GCC

Usos terapêuticos

[00172] As moléculas de anticorpo anti-GCC monoclonais de coelho aqui descritas têm utilidades in vitro e in vivo . Por exemplo, estas moléculas de anticorpo podem ser administradas a células em cultura, por exemplo, im vitro ou ex vivo, ou administradas em um sujeito, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir, uma variedade de distúrbios. Em certas modalidades de aplicações terapêuticas da invenção, as moléculas de anticorpo anti-GCC monoclonais de coelho da invenção são humanizadas, usando uma ou mais técnicas descritas neste documento.

[00173] As moléculas de anticorpo, imunoconjugadas e proteínas de fusão descritas neste documento podem ser usadas para modular uma atividade ou função de uma proteína GCC, tais como a ligação de ligante (por exemplo, a ligação de ST ou guanilina), transdução de sinal mediada por GCC, manutenção de fluidos intestinais, homeostase eletrolítica, liberação de cálcio intracelular (fluxo de cálcio), diferenciação celular, proliferação celular ou ativação de células.

[00174] Em um aspecto, a invenção apresenta um método de matar, inibir ou modular o crescimento de ou interferir com o metabolismo de uma célula expressando GCC. Em uma modalidade, a invenção provê um método de inibir a sinalização celular mediada por GCC ou um método de matar uma célula. O método pode ser usado com qualquer célula ou tecido que expressa GCC, tal como uma célula câncerosa. Exemplos de células câncerosas, que expressam o GCC incluem, mas não estão limitados a, uma célula de um câncer de origem gastrointestinal (por exemplo, câncer colorretal, câncer de estômago, câncer de intestino ou câncer de esôfago), câncer pancreático, câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma), sarcomas de tecidos moles como leiosarcoma ou rabdomiossarcoma, tumores gastrointestinal ou neuroendócrino broncopulmonar, tumores neuroectodérmicos ou qualquer lesão metastática destes. Exemplos não- limitantes de células expressando GCC incluem T84 células de adenocarcinoma de cólon humano, células frescas ou congeladas de tumor do cólon e células que compreendem um ácido nucleico recombinante codificando GCC ou uma porção do mesmo.

[00175] Métodos da invenção incluem as etapas de contato da célula com uma molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado, conforme descrito neste documento, em uma quantidade eficaz, ou seja, quantidade suficiente para inibir a sinalização celular mediada por GCC ou uma quantidade suficiente para matar a célula. O método pode ser usado em células em cultura, por exemplo, in vitro, invivo, ex vivo, ou in situ. Por exemplo, células que expressam GCC (por exemplo, células recolhidas por biópsia de um tumor ou lesão metastática; células de uma linhagem de células de câncer estabelecida; ou células recombinantes), podem ser cultivadas in vitro em meio de cultura e o passo de contato pode ser efetuado adicionando-se a molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado ao meio de cultura. Em métodos de matar uma célula, o método compreende usar uma molécula de anticorpo anti-GCC não-atrelada, ou um imunoconjugado constituído por uma molécula de anticorpo anti-GCC e um agente citotóxico. O método irá resultar na morte de células expressando GCC, incluindo, nomeadamente, as células de tumor expressando GCC (por exemplo, células de tumor do cólon).

[00176] Os anticorpos monoclonais de coelho da invenção, ou versões humanizadas dos mesmos, podem ser testados para internalização celular após a ligação ao GCC usando técnicas de microscopia de imunofluorescência bem conhecidas para aqueles versados na técnica. Tais anticorpos que tiveram a internalização confirmada seriam úteis quando ligados a uma fração citotóxica para fins terapêuticos, ou a uma fração para um imageamento de célula. Anticorpos que não internalizam ainda podem ser usados para fins de diagnóstico ou para métodos terapêuticos usando anticorpo nu projetado para elicitar uma resposta citotóxica mediada por células dependentes de anticorpo ou talvez para métodos de entrega de lipossomas.

[00177] Moléculas de anticorpo anti-GCC da presente invenção ligam-se a domínios extracelulares de GCC ou porções de células expressando o antígeno. Como resultado, quando se pratica os métodos da presente invenção para matar, suprimir ou detectar células câncerígenas, os fragmentos de ligação de anticorpos ou antígenos, ligam-se a todas essas células, não apenas para as células que são fixas ou células cujos domínios antigênicos intracelulares podem ser expostos ao ambiente extracelular. Consequentemente, a ligação dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, está concentrada em áreas onde existem células expressando GCC, independentemente se essas células são fixas ou não fixas, viáveis ou necrótico. Além disso ou, alternativamente, as moléculas de anticorpo anti- GCC, ligam-se e são internalizadas com GCC mediante células de ligação expressando o antígeno.

[00178] O método também pode ser executado em células presentes em um sujeito, como parte de um protocolo in vivo. Em uma modalidade, o sujeito é um sujeito humano. Alternativamente, o sujeito pode ser um mamífero expressando um antígeno GCC com o qual uma molécula de anticorpo anti-GCC divulgada neste documento desempenha uma reação cruzada. Uma molécula de anticorpo anti-GCC ou seu imunoconjugado pode ser administrada para um sujeito humano para fins terapêuticos. Uma molécula do anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado também pode ser administrada a um mamífero não-humano expressando o antígeno semelhante a GCC com o qual o anticorpo reage em cruzamento (por exemplo, um primata, porco ou camundongo) para fins veterinários, ou como um modelo animal de doença humana. Modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (por exemplo, testes de tempo corrido de administração e dosagens). Para modalidades in vivo, a etapa de contato é efetuada em um sujeito e inclui a administração de uma molécula de anticorpo anti-GCC ou seu imunoconjugado ao sujeito sob condições eficazes para permitir ambos a ligação da molécula de anticorpo ao domínio extracelular de GCC expresso na célula e o tratamento da célula.

[00179] Em uma modalidade, a invenção provê um método de tratamento de câncer através da administração de uma molécula de anticorpo anti-GCC ou um imunoconjugado constituído por uma molécula de anticorpo anti-GCC e um agente citotóxico para um paciente que necessita de tal tratamento. O método pode ser usado para o tratamento de qualquer distúrbio câncerígeno que inclui pelo menos algumas células que expressam o antígeno GCC. Como usado neste documento, o termo "câncer" deve incluir todos os tipos de tumores câncerígenos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células malignamente transformadas, tecidos ou órgãos, independentemente do tipo histopatológico ou estágio de invasão. Os termos "câncer" e "tumor" podem ser usados de forma intercambiável (por exemplo, quando usado no contexto dos métodos de tratamento, "tratamento de um câncer" e "tratamento de um tumor" têm o mesmo significado).

[00180] Em modalidades, o tratamento é suficiente para reduzir ou inibir o crescimento do tumor do sujeito, reduzir o número ou o tamanho de lesões metastáticas, reduzir a carga de tumor, reduzir a carga de tumor primário, reduzir invasividade, prolongar o tempo de sobrevivência, ou manter ou melhorar a qualidade de vida.

[00181] Exemplos de distúrbios câncerígenos incluem, mas não estão limitados a, tumores sólidos, tumores de tecidos moles e lesões metastáticas. Exemplos de tumores sólidos incluem malignidades, por exemplo, sarcomas, adenocarcinomas e carcinomas, dos diversos sistemas de órgãos, tais como aqueles que afetam cólon. Adenocarcinomas incluem malignidades, como carcinoma de células não pequenas do pulmão. Lesões metastáticas dos cânceres acima mencionados também podem ser tratadas ou prevenidas com os métodos e composições da invenção.

[00182] Em algumas modalidades, o câncer expressando GCC a ser tratado é um câncer primário ou metastático de origem gastrointestinal, como o câncer colorretal, câncer de estômago, câncer de intestino ou câncer de esôfago. Em algumas modalidades, o câncer expressando GCC a ser tratado é câncer pancreático primário ou metastático. Em algumas modalidades, o câncer expressando GCC a ser tratado é câncer de pulmão primário ou metastático, tal como carcinoma adenoescamoso, carcinoma de células escamosas ou adenocarcinoma. Em algumas modalidades, o câncer expressando GCC a ser tratado é um sarcoma, tal como Leiomiossarcoma ou rabdomiossarcoma. Em algumas modalidades, o câncer expressando GCC a ser tratado é um tumor neuroectodermal primário ou metastático, tal como um feocromocitoma (aphaechromotcytoma) ou um paraganglioma. Em algumas modalidades, o câncer de expressando GCC é um tumor neuroendócrino gastrointestinal ou broncopulmonar primário ou uma metastizado.

[00183] O método pode ser útil no tratamento de um distúrbio relevante em qualquer estágio ou subclassificação. Por exemplo, o método pode ser usado para tratar câncer de cólon de fase precoce ou tardia, ou câncer de cólon, de qualquer das fases 0, I, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC e IV.

[00184] Em algumas modalidades, o método para o tratamento de câncer expressando GCC (por exemplo, câncer colorretal, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de pulmão, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, tumor neuroendócrino, tumor neuroectodérmico etc.) compreende administrar a um paciente que necessite de tal tratamento uma molécula de anticorpo anti-GCC não-atrelada aqui descrita. Em outras modalidades, o método compreende a administração de um imunoconjugado constituído por uma molécula de anticorpo anti-GCC descrita neste documento e um agente citotóxico tal como um maitansanóide ou uma auristatina ou seus derivados. Métodos de administração de imunoconjugados e moléculas de anticorpo são descritos acima. As dosagens adequadas das moléculas usadas irão depender da idade e do peso do sujeito e do composto específico usado.

[00185] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- GCC ou imunoconjugado é administrada em ciclos de tratamento. Um "ciclo de tratamento" consiste em um período de tratamento, durante o qual a molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado é administrada conforme descrito acima, seguido por um período de repouso, durante o qual nenhuma molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado é administrada. O ciclo de tratamento pode ser repetido conforme necessário para atingir o efeito desejado.

[00186] Os anticorpos anti-GCC descritos neste documento (por exemplo, moléculas de anticorpo anti-GCC não-atreladas ou imunoconjugados, compreendendo uma molécula de anticorpo anti-GCC e um agente terapêutico) podem ser usados em combinação com outras terapias. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente invenção co formulada com, e/ou co administrada, com um ou mais adicionais agentes terapêuticos, por exemplo, um ou mais agentes anti- câncer, por exemplo, agentes citotóxicos ou citostáticos, tratamento hormonal, vacinas, e/ou outras imunoterapias. Em outras modalidades, os anticorpos anti-GCC são administrados em combinação com outras modalidades de tratamento terapêutico, incluindo cirurgia, radiação, criocirurgia, ou termoterapia. Tais terapias de combinação vantajosamente podem utilizar doses mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.

[00187] Administração "em combinação", conforme usado aqui, significa que dois (ou mais) diferentes tratamentos são aplicados ao sujeito durante o curso da aflição do sujeito com o distúrbio, por exemplo, os dois ou mais tratamentos são aplicados após o sujeito ter sido diagnosticado com o distúrbio e antes que a doença tenha sido curada ou eliminada. Algumas modalidades, a aplicação de um tratamento está ainda ocorrendo quando começa a aplicação do segundo, para que haja sobreposição. Isto é por vezes referido neste documento como "simultânea" ou "aplicação simultânea." Em outras modalidades, a aplicação de um tratamento termina antes do início da aplicação de outro tratamento. Em algumas modalidades de ambos os casos, o tratamento é mais eficaz por causa de administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, um efeito equivalente é visto com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz os sintomas em maior medida, do que seria visto se o segundo tratamento fosse administrado na ausência do primeiro tratamento, ou a situação análoga é vista com o primeiro tratamento. Em algumas modalidades, a aplicação é tal que a redução de um sintoma, ou outro parâmetro relacionado com o distúrbio é maior do que o que seria observado com um tratamento aplicado na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou maior do que aditivo. A aplicação pode ser tal que o efeito do primeiro tratamento aplicado é ainda detectável quando o segundo é aplicado.

[00188] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- GCC ou seu imunoconjugado é usado em combinação com um agente quimioterapêutico. Exemplos não-limitantes de agentes quimioterápicos prejudiciais ao DNA incluem inibidores de topoisomerase I (por exemplo, irinotecano, topotecano, camptotecina e seus análogos ou metabolitos, e doxorrubicina); inibidores da topoisomerase II (por exemplo, etoposido, teniposido, daunorrubicina e); agentes alquilantes (por exemplo, melfalano, clorambucil, busulfan, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, dacarbazina, metotrexato, mitomicina C, e ciclofosfamida); Intercaladores de DNA (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, e carboplatina); Intercaladores de DNA e geradores de radicais livres, tais como a bleomicina; e miméticos de nucleosídeos (por exemplo, 5-fluorouracil, capecitibina, gemcitabina, fludarabina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina, e hidroxiureia).

[00189] Agentes quimioterápicos que interrompem a replicação celular incluem: paclitaxel, docetaxel e análogos relacionados; vincristina, vinblastin e análogos relacionados; talidomida, lenalidomida e análogos relacionados (por exemplo, CC-5013 e CC-4047); inibidores quinase de proteína tirosina (por exemplo, mesilato de imatinibe e gefitinibe); inibidores de proteassoma (por exemplo, bortezomibe);inibidores de NF-KB, incluindo inibidores da quinase IKB; anticorpos que se ligam às proteínas sobre- expressas em cânceres e desse modo regulam negativamente a replicação de células (por exemplo, trastuzumabe, rituximabe, cetuximabe e bevacizumabe); e outros inibidores de proteínas ou enzimas conhecidas por serem reguladas positivamente, sobre-expressas ou ativadas em cânceres, a inibição das quais regula negativamente a replicação de células.

[00190] A seleção de agente(s) terapêutico(s) ou a modalidade de tratamento a ser combinada com uma molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado da invenção dependerão do distúrbio a ser tratado. A modalidade de tratamento ou agente(s) adicionais pode incluir, por exemplo, terapias padrão aprovadas para a indicação a ser tratada. Por exemplo, quando a molécula de anticorpo anti-GCC ou seu imunoconjugado é usado para tratar o câncer de cólon, pode ser usado em combinação com, por exemplo, cirurgia; terapia de radiação; 5-fluorouricil (5-FU), capecitibina, leucovorina, irinotecano, oxaliplatina, bevacizumabe, cetuximabe, panitumum ou suas combinações (por exemplo, oxaliplatina/capecitibina (XELOX), leucovorina/5-fluorouricil /-oxaliplatina (FOLFOX), 5- fluorouricil/leucovorina/irinotecano (FOLFIRI), FOLFOX mais bevacizumabe, ou FOLFIRI mais bevacizumabe).

[00191] Em outro aspecto, a invenção apresenta o uso de uma molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado, conforme descrito neste documento na fabricação de um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento é para tratamento de câncer, por exemplo, um câncer gastrointestinal. Em algumas modalidades, o medicamento compreende uma molécula de anticorpo anti-GCC tendo características resumidas nas tabelas 1-6. Em algumas modalidades, o medicamento é composto por um MIL-44148-2 ou uma molécula de anticorpo MIL-44-67-4 ou suas versões humanizadas.

Detecção e Marcação de Anticorpo

[00192] Moléculas de anticorpo anti-GCC usadas em métodos descritos neste documento, por exemplo, na detecção in vitro e in vivo, por exemplo, diagnóstico, estadiamento, ou métodos, de imagem podem ser diretamente ou indiretamente marcadas com uma substância detectável para facilitar a detecção do agente de ligação ligado ou não ligado. Substâncias detectáveis apropriadas incluem várias enzimas biologicamente ativas, ligantes, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais quimioluminescentes, materiais bioluminescentes, materiais cromofóricos, materiais densos de eléctron, paramagnéticos (por exemplo, ressonância magnética nuclear ativa) e materiais radioativos. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-GCC é acoplada a um íon radioativo, por exemplo, o índio (111In), iodo (131I ou 125I), ítrio (90Y), lutécio (177Lu), actínio (225Ac), bismuto (212Bi ou 213Bi), enxofre (35S), carbono (14C), trítio (3H), ródio (188Rh), tecnécio (99 mTc), praseodímio, ou fósforo (32P); ou um radionuclídeo emissor de pósitrons, por exemplo, carbono-11 (11 C) potássio-40 (40K), nitrogênio-13 (13 N), oxigênio-15 (15O), flúor-18 (18 F), gálio (68Ga) e iodo-121 (121 I). Agentes radioativos adicionais que podem ser conjugados com os anticorpos da invenção para uso em métodos de diagnóstico/detecção in vitro ou in vivo são descritos abaixo.

[00193] Marcadores exemplares incluem fluoróforos como quelatos de terra raros ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (U.S. Pat. N. ° 4.737.456), luciferina e 2,3- dihidropftalazinedionas. Outros exemplos de marcadores exemplares incluem peroxidase de raiz forte (HRP), fosfatase alcalina, galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose 6-fosfato-desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantina oxidase, juntamente com uma enzima que emprega o peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor tais como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de rotação, marcadores de bacteriófago, radicais livres estáveis, e similares.

[00194] Moléculas de anticorpo marcadas de fluoróforo e cromóforo podem ser preparadas a partir de frações padrão conhecidas na técnica. Devido ao fato de que os anticorpos e outras proteínas absorvem luz com comprimentos de onda de até cerca de 310 nm, as frações fluorescentes devem ser selecionadas para terem absorção substancial em comprimentos de onda acima de 310 nm e, preferencialmente, acima de 400 nm. Uma variedade de compostos fluorescentes e cromóforos adequados são descritos por Stryer Science, 162:526 (1968) and Brand, L. et al. Annual Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972). Os anticorpos podem ser marcados com grupos cromóforos fluorescentes por procedimentos convencionais, tais como aqueles divulgados na Patente U.S. Num. 3.940.475, 4.289.747 e 4.376.110.

[00195] Um grupo de agentes fluorescentes tendo um número de propriedades desejáveis descrito acima é os corantes xanteno, que incluem as fluoresceinas, derivadas de 3,6-diidroxi-9-henilxantidrol, resaminas e rodaminas, derivados de 3,6-diamino-9-fenilxantidrol e lissanima rodamina B. Os derivados de rodamina e fluoresceína de 9-o-carboxifenilxantidrol têm um grupo de 9-o-carboxifenil. Compostos de fluoresceína com grupos de acoplamento reativo tais como grupos de amino e isotiocianato tais como isotiocianato fluoresceína e fluorescamina estão prontamente disponíveis. Outro grupo de compostos fluorescentes são as naftilaminas, tendo um grupo amino na posição α ou β.

[00196] As moléculas de anticorpo marcadas podem ser usadas, por exemplo, diagnosticamente e/ou experimentalmente em vários contextos, incluindo (i) para isolar um antígeno predeterminado por técnicas padrão, tal como a cromatografia de afinidade ou imunoprecipitação; (ii) para detectar um antígeno predeterminado (por exemplo, em um lisado celular ou célula sobrenadante) a fim de avaliar a abundância e o padrão de expressão da proteína; (iii) para monitorar os níveis de proteína no tecido como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um regime de tratamento determinado.

Diagnósticos In Vitro

[00197] Os anticorpos anti-GCC e imunoconjugados descritos neste documento podem ser usados para detectar a presença ou a ausência de GCC, por exemplo, para detectar a presença ou ausência de GCC em uma amostra biológica ex vivo obtida a partir de um sujeito (ou seja, detecção in vitro), ou para detectar a presença ou a distribuição ou a ausência de GCC em um sujeito (ou seja, na detecção in vivo). Tais métodos de detecção são úteis para detectar ou diagnosticar uma variedade de distúrbios, ou para orientar as decisões terapêuticas. O termo "detectar" como usado neste documento abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Detecção de GCC ou proteína GCC, como usado neste documento, significa detectar proteína intacta de GCC ou detectar uma porção da proteína GCC que compõe o epítopo ao qual a molécula de anticorpo anti-GCC se liga.

[00198] Da mesma forma, em outro aspecto, as características da invenção, um método de detecção de expressão de GCC em uma amostra biológica, tal como uma célula ou tecido, por exemplo, uma célula de tumor, ou um tumor tendo uma ou mais células que expressa GCC. O método compreende: entrar em contato com uma amostra biológica, com uma molécula de anticorpo anti-GCC descrita neste documento (por exemplo, MIL- 44-148-2 ou MIL-44-67-4), em condições que permitem a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo anti-GCC e proteína GCC; e detectar a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo anti-GCC e proteína GCC, desse modo, detectar a presença de proteína GCC, por exemplo, para detectar uma célula ou tumor expressando GCC.

[00199] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-GCC é um imunoconjugado que inclui uma marcação detectável. A marcação detectável pode ser um agente radioativo. Alternativamente, a marcação detectável é um agente não-radioativo (por exemplo, um fluoróforo ou um cromóforo, como descrito acima).

[00200] Em determinadas modalidades, a amostra biológica inclui células normais ou câncerosas ou tecidos que expressam GCC. Exemplos de células normais ou de tecidos que expressam GCC incluem mas não estão limitados a células ou tecido de origem gastrointestinal, particularmente células ou tecido normais colorretais. Exemplos de células câncerosas ou tecidos, que expressam o GCC incluem, mas não estão limitados a, um câncer de origem gastrointestinal, tal como câncer colorretal, câncer de estômago, câncer de intestino delgado e câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de pulmão tal como, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso e adenocarcinoma, sarcomas de tecidos moles como leiomiossarcoma e rabdomiossarcoma, tumores gastrointestinal ou neuroendócrino broncopulmonar, e tumores neuroectodérmicos. Em modalidades particulares, os tecidos de células normais ou câncerosas podem expressar GCC em níveis mais elevados em relação a outros tecidos, por exemplo outros tecido tal como células B e/ou tecidos associados a célula B.

[00201] Métodos de detecção descritos neste documento, tanto in vitro quanto in vivo, podem ser usados para avaliar um distúrbio em um sujeito. Em determinadas modalidades, o distúrbio é um distúrbio de células proliferativas, como um câncer ou um tumor, por exemplo, câncer colorretal, câncer de estômago ou câncer pancreático.

[00202] Em um aspecto, a invenção provê, um método para detectar a presença ou ausência de proteína GCC em uma amostra biológica in vitro (por exemplo, em uma biópsia de célula ou tecido obtido de um sujeito). O método compreende: (i) colocar em contato uma amostra biológica obtida de um sujeito com uma molécula de anticorpo anti-GCC ou seu imunoconjugado e (ii) detectar a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo anti-GCC e a proteína GCC. Formação de complexo é indicativo da presença ou nível de proteína GCC na amostra biológica, considerando que se não há formação complexa, é indicativo da ausência de proteína GCC na amostra biológica.

[00203] Amostras biológicas exemplares para métodos descritos neste documento incluem uma célula, células, tecidos ou fluidos corporais, tais como um exsudato inflamatório, sangue, soro, fluido intestinal, amostra de fezes. Em particulares modalidades, a amostra biológica compreende uma(s) célula(s) câncerosa(s) ou tecido. Por exemplo, a amostra pode ser uma biópsia de tumor, por exemplo, a biópsia de um tumor colorretal, um tumor gástrico, um tumor esofágico, um tumor de intestino delgado, um tumor no pulmão, um sarcoma de tecidos moles, tumor neuroendócrino, um tumor neuroectodérmico, ou de uma amostra de tecido de qualquer local metastático respectivo. Em outras modalidades, a amostra biológica pode ser sangue ou outro fluido, onde o fluido é composto por uma célula de câncer. Uma biológica pode ser obtida usando qualquer um dos vários métodos na técnica. Além disso, uma amostra biológica pode ser tratada com um fixador tal como formaldeído e embebida em parafina e seccionada para uso. Alternativamente, podem ser empregados tecidos frescos ou congelados. Em outras modalidades, aspirados por agulha fina podem ser usados.

[00204] Em determinadas modalidades, um teste de célula ou tecido é obtido de um indivíduo suspeito de ter um distúrbio associado com a expressão GCC. Em determinadas modalidades, uma célula ou tecido de teste obtido de um indivíduo suspeito de ter um distúrbio associado à expressão de GCC em um local diferente que a superfície apical de células epiteliais intestinais (por exemplo, expressão de GCC citoplasmática em células epiteliais intestinais), ou um distúrbio associado com expressão GCC em células ou tecidos não intestinais, tais como pâncreas, pulmão, tecido mole, ou tecido de origem neuroendócrina ou neuroectodérmica. Em determinadas modalidades, um teste de célula ou tecido é obtido de um indivíduo suspeito de ter um distúrbio associado com aumentada expressão de GCC.

[00205] Em uma modalidade, o nível de GCC, em uma amostra de sujeito, ou no sujeito, é comparado com um nível de referência, por exemplo, o nível de GCC em um material de controle, por exemplo, uma célula normal da mesma origem de tecido que a célula do sujeito ou uma célula tendo GCC em níveis comparáveis à tal célula normal. O método pode incluir, por exemplo, responsivo ao nível detectado de GCC, prover um diagnóstico, um prognóstico, uma avaliação da eficácia de tratamento, ou a realização de um distúrbio. Um nível mais elevado de GCC na amostra ou sujeito, em comparação com o material de controle, indica a presença de um distúrbio associado com aumento da expressão de GCC. Um nível mais elevado de GCC na amostra ou sujeito, em comparação ao material de controle, também pode indicar a relativa falta de eficácia de um tratamento, um prognóstico relativamente mais pobre ou uma fase posterior da doença. O nível de GCC também pode ser usado para avaliar ou selecionar o tratamento futuro, por exemplo, a necessidade de um tratamento mais ou menos agressivo, ou a necessidade de mudar de um regime de tratamento para outro. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compõem a seleção de uma terapia direcionada a GCC, por exemplo, uma terapia direcionada a GCC descrita neste documento, com base, pelo menos em parte, nos níveis de GCC determinados e, opcionalmente, administração da terapia direcionada a GCC selecionada para o sujeito.

[00206] Formação de complexo entre a molécula de anticorpo anti- GCC e GCC pode ser detectada por medição ou visualização de anticorpo (ou fragmento de anticorpo) ligado ao antígeno de GCC ou molécula de anticorpo não ligada. Uma pessoa ordinariamente versada na técnica pode prontamente apreciar a multiplicidade de maneiras de detectar a ligação de anticorpos anti-GCC com GCC. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de ligação de antígeno que são conhecidos na técnica, tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A e imuno-histoquímica (IHC).

[00207] Em uma determinada modalidade, GCC é detectado ou medido por imuno-histoquímica utilizando um anticorpo anti-GCC da invenção. Técnicas de imuno-histoquímica podem ser usadas para identificar e essencialmente colorir as células que expressam GCC. Essa "coloração" permite a análise de migração metastática. Anticorpos anti-GCC como os descritos neste documento são contatados com células fixas e o GCC presente nas células reage com os anticorpos. Os anticorpos são marcados de maneira detectável usando anticorpo segundo marcado ou proteína A para colorir as células. Em uma determinada modalidade, o anticorpo MIL-44-148- 2 é usado em um ensaio IHC para detectar ou medir a expressão de GCC em uma amostra biológica.

[00208] Outros ensaios de detecção convencionais podem ser usados, por exemplo, western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A e imuno-histoquímica (IHC) ou radioimunoensaio (RIA).

[00209] Alternativo à marcação da molécula de anticorpo anti-GCC, a presença do GCC pode ser ensaiada em uma amostra por um imunoensaio de competição, utilizando padrões marcados com uma substância detectável e uma molécula de anticorpo anti-GCC não marcada. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões marcados e o agente de ligação a GCC são combinados e a quantidade de padrão marcado ligado ao anticorpo não marcado é determinada. A quantidade de GCC na amostra é inversamente proporcional à quantidade de padrão marcado ligado ao agente de ligação de GCC.

[00210] Também é possível diretamente detectar GCC para formação complexa de molécula de anticorpo anti-GCC sem manipulação adicional ou marcação de qualquer componente (GCC ou molécula de anticorpo), por exemplo, utilizando a técnica de transferência de energia de fluorescência (FET, ver, por exemplo, Lakowicz et al, U.S. Pat. No. 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., U.S. Pat. No. 4,868,103). Uma marcação de fluoróforo na primeira molécula de "doador", é selecionada, tal que, após excitação com luz incidente de comprimento de onda adequado, sua energia fluorescente emitida será absorvida por uma marcação fluorescente em uma segunda molécula receptora, que por sua vez, é capaz de fluorescência devido a energia absorvida. Alternadamente, a molécula de proteína 'doadora' pode simplesmente utilizar a energia fluorescente natural de resíduos de triptofano. Marcas são escolhidas para emitir diferentes comprimentos de onda da luz, de forma que a marca de molécula 'receptora' possa ser diferenciada daquela do 'doador'. Uma vez que a eficiência de transferência de energia entre as marcas está relacionada com a distância que separa as moléculas, pode ser avaliada a relação espacial entre as moléculas. Em uma situação em que a ligação ocorre entre as moléculas, a emissão fluorescente da marca de molécula 'receptora' no ensaio deve ser máxima. Um evento de ligação de FET pode ser convenientemente medido através de meios de detecção fluorométrica padrão bem conhecidos na técnica (por exemplo, usando um fluorímetro).

[00211] Em outro exemplo, determinação da capacidade de uma molécula de anticorpo reconhecer GCC pode ser feita sem marcação de qualquer componente de ensaio (molécula de anticorpo ou GCC), utilizando uma tecnologia como a Análise de Interação Biomolecular (BIA) em tempo real (ver, e.g., Sjolander, S, and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:23382345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Conforme usado neste documento, "BIA" ou "ressonância plasmônica de superfície" é uma tecnologia para estudar interações biospecíficas em tempo real, sem marcar quaisquer dos interagentes (por exemplo, BIACORETM). Mudanças na massa na superfície de ligação (indicativo de um evento de ligação) resultam em alterações do índice de refração de luz próximo à superfície (o fenômeno ótico de ressonância plasmônica de superfície (SPR)), resultando em um sinal detectável que pode ser usado como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas.

[00212] Em alguns aspectos, a divulgação apresenta uma mistura de reação que inclui uma molécula de anticorpo descrita neste documento (por exemplo, um imunoconjugado que inclui uma molécula de anticorpo aqui descrita e, por exemplo, uma marcação) e uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra biológica aqui descrita. Em outras modalidades, a mistura de reação pode incluir uma molécula de anticorpo descrita neste documento (por exemplo, um imunoconjugado que inclui uma molécula de anticorpo aqui descrita e, por exemplo, uma marcação) e GCC obtidos de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra biológica aqui descrita.

[00213] Em determinadas modalidades, um método, conforme descrito acima, compreende a detecção de ligação de um anticorpo anti-GCC com GCC expressada na superfície de uma célula ou contida numa preparação de membrana obtida a partir de uma célula expressando GCC em sua superfície. Em determinadas modalidades, o método compreende entrar em contato com uma célula com um anticorpo anti-GCC sob condições permissivas para a ligação do anticorpo anti-GCC com GCC e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-GCC e GCC na superfície das células. Um ensaio exemplar para detectar a ligação de um anticorpo anti- GCC com GCC expressado na superfície de uma célula é um ensaio "FACS".

Diagnóstico In Vivo

[00214] Em ainda outra modalidade, a invenção provê um método para detectar a presença ou ausência de células ou tecidos expressando GCC in vivo. O método inclui (i) administrar a um sujeito (por exemplo, um paciente tendo um câncer), uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção (ou seja, MIL-44-148-2 ou MIL-44-67-4), ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de preferência um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conjugado com uma marcação ou marcador detectável; (ii) expondo o sujeito a um meio de detecção do referida marcador detectável ou marcador para os tecidos ou células expressando GCC. Tais métodos in vivo podem ser usado para avaliação, diagnóstico, realização e/ou prognóstico de um paciente que sofre de um distúrbio tal como o câncer. The method comprises: (i) administrar a um sujeito, uma molécula de anticorpo anti-GCC ou seu imunoconjugado e (ii) detectar a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo anti-GCC e a proteína GCC. Formação de complexo é indicativo da presença ou nível de proteína GCC no sujeito, considerando que se não há formação complexa, é indicativo da ausência de GCC no sujeito.

[00215] Tais indivíduos podem ser diagnosticados como sofrendo de câncer metastático expressando GCC e as células de câncer metastático expressando GCC podem ser detectadas pela administração ao indivíduo, de preferência pela administração intravenosa, uma composição farmacêutica que compreende uma transportadora farmaceuticamente aceitável ou diluente e um composto conjugado que é composto por uma molécula de anticorpo anti-GCC e uma fração ativa no qual a fração ativa é um agente radioativo, e detectar a presença de uma acumulação localizada ou agregação de radioatividade, indicando a presença de células expressando o GCC. Em algumas modalidades da presente invenção, a composição farmacêutica compreende uma transportadora ou diluente farmaceuticamente aceitável e um composto conjugado que é composto por uma molécula de anticorpo anti- GCC e uma fração ativa na qual a fração ativa é um agente radioativo e a molécula de anticorpo anti-GCC é o anticorpo MIL-44-148-2 descrito neste documento, ou seus fragmentos ou derivados.

[00216] Em uma determinada modalidade, radionuclídeos podem ser conjugados a uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção para uso como um agente de imagens in vivo de procedimentos de imagem. Agentes de imageamento são procedimentos de diagnóstico úteis, bem como os procedimentos usados para identificar a localização das células de metástase. Por exemplo, indivíduos podem ser diagnosticados como sofrendo de câncer metastático colorretal e as células de câncer metastático podem ser detectadas pela administração ao indivíduo, de preferência pela administração intravenosa, preferivelmente de uma composição farmacêutica que compreende um diluente ou transportadora farmaceuticamente aceitável e um composto conjugado que é composto por uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção e uma fração ativa no qual a fração ativa é um radionuclídeo, e detectar a presença de uma acumulação localizada ou agregação de radioatividade, indicando a presença de células expressando o GCC.

[00217] Imageamento pode ser realizado por muitos procedimentos bem conhecidos àqueles ordinariamente versados na técnica e o agente apropriado de imageamento útil em tais procedimentos pode ser conjugado a uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção por meios bem conhecidos. Exemplos de marcadores úteis para diagnóstico por imagem em conformidade com a presente invenção são radiomarcadores, tais como 32P, 3H, 14C, 188Rh, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81MKr, 87MSr, 99Tc, 111In, 113M In, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb and 206Bi, and 213Bi; marcadores fluorescentes como fluoresceína e rodamina; marcadores ativos de ressonância magnética nuclear; pósitrons emissores de isótopos de oxigênio, nitrogênio, ferro, carbono ou gálio (por exemplo, 68Ga, 18F) detectáveis por uma tomografia computadorizada de emissão de fóton única ("SPECT") tomografia por emissão de pósitrons ("PET") ou detector ;quimioluminescentes tais como luciferina; e marcadores enzimáticos, tais como a peroxidase ou fosfatase. Emissores de radiação de curto alcance, como os isótopos detectáveis por sondas de detector de curto alcance, tais como sondas transretais também podem ser empregados. Imageamento também pode ser realizado, por exemplo, por radiocintilografia, imageamento por ressonância magnética nuclear (MRI) ou tomografia computadorizada (CT scan). Imageamento por tomografia computadorizada (CT scan) pode empregar um metal pesado como quelatos de ferro. Escaneamento por MRI pode empregar quelato de gadolínio ou manganês.

[00218] Os anticorpos podem ser marcados com esses reagentes, usando as técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Fla.; and Barchel, S. W. and Rhodes, B. H., (1983)Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., cada um dos quais é incorporado neste documento por referência, ensinam a conjugação de vários radionuclídeos terapêuticos e diagnósticos em aminoácidos de anticorpos. Tais reações podem ser aplicadas para conjugar radionuclídeos de moléculas de anticorpo anti-GCC da invenção com um agente quelante apropriado e/ou o vinculador. Vide Wensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y para técnicas relacionadas à radiomarcação de anticorpos. Ver também, D. Colcher et al. Meth. Enzymol. 121: 802-816 (1986).

[00219] No caso de um anticorpo radiomarcado, o anticorpo é administrado ao paciente, é localizado ao tumor portando o antígeno com o qual o anticorpo reage, e é detectado ou "tem uma imagem gerada" in vivo, usando as técnicas conhecidas, tais como escaneamento radionuclear usando, por exemplo, uma câmera gamma ou tomografia por emissão ou computadorizada. Vide, por exemplo, A. R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp 65-85(Academic Press 1985).. Alternativamente, um leitor de tomografia transaxial de emissão positrônica, conforme denominado Pet VI localizado no Brookhaven National Laboratory, pode ser usado onde a radiomarca emite os pósitrons (por exemplo, 11C, 18F, 15O, and 13N, 68Ga).

[00220] Em outras modalidades, a invenção provê métodos para determinar a dose, por exemplo, a dose de radiação, à qual diferentes tecidos são expostos quando um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, tem administrada uma molécula de anticorpo anti-GCC que é conjugada com um isótopo radioativo. O método inclui: (i) administrar uma molécula de anticorpo anti-GCC conforme descrito neste documento, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-GCC, que é rotulada com um isótopo radioativo a um sujeito; (ii) medir a quantidade de isótopo radioativo localizado em tecidos diferentes, por exemplo, tumor, ou sangue, em vários pontos de tempo até que algum ou todo o isótopo radioativo tenha sido eliminado do corpo do sujeito; e (iii) calcular a dose total de radiação recebida por cada tecido analisado. As medidas podem ser tiradas em pontos de horário agendados, por exemplo, dia 1, 2, 3, 5, 7 e 12, após administração (no dia 0) da molécula de anticorpo anti-GCC radioativamente marcada ao sujeito. A concentração de radioisótopos presentes em um determinado tecido, integrada ao longo do tempo e multiplicada pela atividade específica do radioisótopo pode ser usada para calcular a dose que um determinado tecido recebe. Informações farmacológicas geradas usando moléculas de anticorpo anti-GCC marcadas com um isótopo radioativo, por exemplo, um emissor gama, por exemplo, 111In podem ser usadas para calcular a dose esperada que o mesmo tecido receberia de um isótopo radioativo diferente que não pode ser facilmente medido, por exemplo, um beta-emissor, por exemplo, 90Y. Diagnóstico Acompanhante para a terapia direcionada ao GCC

[00221] Os métodos de diagnósticoin vitro e in vivo aqui descritos são úteis para informar se um paciente que sofre de uma doença proliferativa, tal como câncer, ou um distúrbio gastrointestinal, tal como síndrome inflamatória intestinal, doença de Crohn ou constipação, ou devem ser tratados ou não com uma terapia direcionada ao GCC, com base na presença ou ausência, respectivamente, da expressão de GCC na superfície de ou dentro de células ou tecidos do paciente. Um paciente tendo uma mais células que expressam GCC na superfície celular ou dentro da célula é um candidato para tratamento com uma terapia direcionada ao GCC.

[00222] Em certos aspectos, a invenção fornece um método para determinar a sensibilidade de um paciente suspeito de sofrer de uma doença ou distúrbio expressando-GCC para uma terapia direcionada a GCC, compreendendo as etapas de: (i) entrar em contato com uma amostra biológica obtida de um sujeito com uma molécula de anticorpo anti-GCC da invenção; (ii) detectar a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo anti-GCC e proteína GCC; em que formação complexa é indicativo da presença ou nível de proteína GCC na amostra biológica, e a ausência de formação complexa é indicativo da ausência de proteína GCC na amostra biológica, determinando, assim, a sensibilidade do paciente a uma terapia direcionada a GCC. Em uma modalidade particular, a formação complexa entre a molécula de anticorpo anti-GCC e proteína GCC na amostra biológica é detectada através de imuno-histoquímica utilizando uma molécula de anticorpo descrita neste documento, por exemplo, o anticorpo MIL-44-1482 descrito neste documento.

[00223] Amostras biológicas exemplares podem compreender uma célula, células, tecidos ou fluidos corporais, tais como um exsudato inflamatório, sangue, soro, fluido intestinal, amostra de fezes. Em particulares modalidades, a amostra biológica compreende uma(s) célula(s) câncerosa(s) ou tecido. Por exemplo, a amostra pode ser uma biópsia de tumor, por exemplo, a biópsia de um tumor colorretal, um tumor gástrico, um tumor esofágico, um tumor de intestino delgado, um tumor no pulmão, um sarcoma de tecidos moles, tumor neuroendócrino, um tumor neuroectodérmico, ou de uma amostra de tecido de qualquer local metastático respectivo. Em outras modalidades, a amostra biológica pode ser sangue ou outro fluido, onde o fluido é composto por uma célula de câncer. Uma biológica pode ser obtida usando qualquer um dos vários métodos na técnica. Além disso, uma amostra biológica pode ser tratada com um fixador tal como formaldeído e embebida em parafina e seccionada para uso. Alternativamente, podem ser empregados tecidos frescos ou congelados. Em outras modalidades, aspirados por agulha fina podem ser usados.

[00224] Exemplares doenças/distúrbios que podem ser avaliados (por exemplo, diagnosticados) e tratados usando os métodos de diagnóstico acompanhantes aqui descritos incluem, mas não se limitam a desordens proliferativas incluindo mas não limitadas a câncer colorretal, câncer de estômago, câncer de intestino delgado, câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma), sarcoma de tecidos moles tais como leiomiossarcoma e rabdomiossarcoma, tumores neuroendócrinos broncopulmonares e gastrointestinais, tumores neuroectodérmicos, distúrbios gastrointestinais, tais como síndrome inflamatória intestinal, doença de Crohn e prisão de ventre e distúrbios neurológicos como a doença de Parkinson. Os métodos da invenção guiam as decisões do médico na decisão de tratar um paciente com uma terapia direcionada a GCC. Os métodos providos neste documento também permitem a geração de um relatório de tratamento personalizado, por exemplo, um relatório de tratamento personalizado de câncer, por exemplo, com uma terapia direcionada a GCC descrita neste documento.

[00225] Uma terapia direcionada a GCC é um agente terapêutico que trata ou previne uma doença que expressa GCC ou uma doença mediada por GCC, por exemplo,uma doença que expressa GCC ou uma doença mediada por GCC descrita neste documento. Em certos aspectos da invenção, a terapia direcionada a GCC é um ligante-GCC tal como uma molécula de anticorpo anti-GCC ou um ligante de peptídeo (por exemplo, um peptídeo ST) conjugada a um agente, tal como um agente terapêutico. Ligantes-GCC exemplares conjugados a agentes terapêuticos (ou seja, imunoconjugados) são descritos, por exemplo, em Pedido de Patente Publicado n. ° 20110110936, cujo conteúdo é incorporado por referência neste documento na íntegra. Em uma determinada modalidade, o agente terapêutico direcionado a GCC é anticorpo monoclonal IgG1 humano anti- GCC conjugado com um agente citotóxico, no qual o mAb inclui uma região variável da cadeia leve (VL) tendo as três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (CDR1, CDR2 e CDR3) e uma região variável de cadeia pesada (VH) tendo três regiões determinantes de complementaridade de cadeia presada (CDR1, CDR2 e CDR3) listadas nas tabelas 7 (sequências de aminoácidos) e 8 (sequências de ácidos nucleicos correspondentes) abaixo, e uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve listadas nas tabelas 9 (sequências de aminoácidos) e 10 (sequências de ácido nucleico correspondentes) abaixo. Tabela 7: Sequência de aminoácidos de CDRs VH e CDRs VL Tabela 8: Sequência de ácido nucleíco de CDRs VL e CDRs VH Tabela 9: Sequência de aminoácidos da região variável mAb Tabela 10. Sequência de ácido nucleíco da região variável mAb

[00226] Os aminoácidos e sequências de ácidos nucleicos correspondentes para as sequências de cadeia pesada hIgG1 e de cadeia leve hKappa completas contendo os VL CDRs e VH CDRs mostrados nas tabelas 7 e 8 e regiões variáveis de cadeia leve e pesada mostradas nas tabelas 9 e 10 estão listadas abaixo:

[00227] A seqüência de nucleotídeos de cadeia pesada hIgG1 é: GAATTCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAAC AGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGG ACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTTTGGT GGGTCTTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACGA CAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAG AACCAGTTCGCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCT GTTTATTACTGTGCGAGAGAACGTGGATACACCTATGGTAACTTTGACCA CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGG CCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGG CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGA GGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAATAATAGGGATAACAGGGTAATACTAGAG (SEQ ID NO: 83)

[00228] A seqüência de proteína de cadeia pesada hIgG1 é: MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGY YWSWIRQPPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSS VTAADTAVYYCARERGYTYGNFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 84)

[00229] A sequência de nucleótidos de cadeia leve Kappa é: GCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGC AACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCC ACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCA GTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGAATC CCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCA TCGGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTAT AAAACCTGGCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAACGTGGAAATCAAAC GTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCA GTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTA CAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTCTAGA (SEQ ID NO: 85)

[00230] A seqüência de proteínas de cadeia leve hKappa é: MGWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNL AWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAV YYCQQYKTWPRTFGQGTNVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 86)

[00231] Em um aspecto particular da invenção, a terapia direcionada a GCC é um imunoconjugado tendo uma molécula de anticorpo anti-GCC conjugada com uma molécula de auristatina. Em uma modalidade, o imunoconjugado é composto por uma molécula de anticorpo anti-GCC que inclui três CDRs de cadeia pesada (VH), de acordo com SEQ ID NOs: 67, 68 e 69 e três regiões de CDR de cadeia leve (VL), de acordo com SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, conjugados com uma molécula de auristatina. Em outra modalidade, o imunoconjugado é composto por uma molécula de anticorpo anti-GCC que inclui uma região de cadeia pesada, de acordo com SEQ ID NOs: 79, e uma região variável de cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 80, conjugado com uma molécula de auristatina. Em ainda outra modalidade, o imunoconjugado é composto por uma molécula de anticorpo anti-GCC que inclui as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com SEQ ID NO s 79 e 80, respectivamente, conjugados com uma molécula de auristatina.

[00232] Em algumas modalidades, a molécula de auristatina está ligada a uma fração de cisteína na molécula de anticorpo anti-GCC por meio de um vinculador contendo uma molécula de maleimida, por exemplo, uma fração de maleimidocaproil.

[00233] Em algumas modalidades, a molécula de auristatina é acoplada a uma molécula de anticorpo anti-GCC usando um vinculador heterobifuncional que está ligado a um grupo hidroxila na molécula de auristatina. Em algumas dessas modalidades, o vinculador compreende uma hidrazona. Em algumas modalidades, o vinculador é um composto de hidrazona formado pela reação de um ácido de cetocarboxílico, por exemplo, o ácido 5-benzoilvalérico e maleimidocaproilhidrazido. Em modalidades particulares, o vinculador é ácido fenilhexanóico-(Z)-6-(2-(6-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-yl)hexanoil)hidrazono)-6

[00234] Em algumas outras modalidades, a molécula de auristatina é acoplada a uma molécula de anticorpo anti-GCC usando um vinculador heterobifuncional que está conectado a um grupo monometil amino na molécula de auristatina. Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma fração clivável, por exemplo, uma fração de peptídeo e um espaçador auto-imolador p aminobenzilcarbamato Ligantes exemplares incluem maleimidocaproil (mc), maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p- aminobenzilcarbamato, e maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p- aminobenzilcarbamato (vc).

[00235] Em determinadas modalidades, a terapia direcionada a GCC é um imunoconjugado caracterizado pela fórmula Ab-(vc-MMAF)m(formula (I-4)); Ab-(vc-MMAE)m (formula (I- 5));Ab-(mc-MMAE)m (formula (I-6)); or Ab-(mc-MMAF)m, (formula (I-7)), em que Ab é uma molécula de anticorpo anti-GCC que inclui características tais como as características descritas em qualquer uma das tabelas 7, 8, 9 ou 10, S é um átomo de enxofre do anticorpo, e m varia de cerca de 1 a cerca de 15. Em determinadas modalides, m é um inteiro de 1 a cerca de 5.

[00236] Em algumas modalidades, a variável m na fórmula (I-4), (I 5), (I-6), ou (I-7) varia de cerca de 2 a cerca de 10, de cerca de 6 a cerca de 8, de cerca de 4 a 6, de cerca de 3 a cerca de 5, ou de cerca de 1 a cerca de 3.

[00237] Em determinadas modalidades em particular, a terapia direcionada a GCC é um imunoconjugado de fórmula (I-4), (I-5), (I-6), ou (I-7), em que Ab é uma uma molécula de anticorpo que inclui três CDRs de cadeia pesada (VH), de acordo com SEQ ID NOs: 67, 68 e 69 e três regiões de CDR de cadeia leve (VL), de acordo com SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, e m é cerca de 3 a cerca de 5 (por exemplo, cerca de 4). Em certos aspectos, o Ab que inclui os CDRs de cadeia pesada de acordo com SEQ ID NOs: 67, 68 e 69 e as três regiões de CDR de cadeia leve, de acordo com SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, respectivamente, é um anticorpo monoclonal humano, preferencialmente um anticorpo IgG1 humano.

[00238] Em determinadas modalidades em particular, a terapia direcionada a GCC é um imunoconjugado de fórmula (I-4), (I-5), (I-6), ou (I-7), em que Ab é uma uma molécula de anticorpo monoclonal que inclui uma região variável de de cadeia pesada, de acordo com SEQ ID NOs: 79, e uma região variável de cadeia leve de acordo com SEQ ID NO: 80, e m é cerca de 3 a cerca de 5 (por exemplo, cerca de 4). Em certos aspectos, o Ab que inclui as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com SEQ ID NO s 79 e 80, respectivamente, é um anticorpo monoclonal humano, preferencialmente anticorpo IgG1 humano.

[00239] Em outras determinadas modalidades em particular, a terapia direcionada a GCC é um imunoconjugado de fórmula (I-4), (I-5), (I-6), ou (I-7), em que Ab é uma uma molécula de anticorpo monoclonal IgG humano que inclui uma seguência lgG1 de região variável de de cadeia pesada, de acordo com SEQ ID NOs: 84 e uma seqüência de cadeia leve Kappa, de acordo com SEQ ID NO: 86, e m é cerca de 3 a cerca de 5 (por exemplo, cerca de 4).

[00240] Em ainda outra modalidade, a terapia direcionada a GCC é um conjugado de GCC-ligante capaz de atravessar a barreira hemato- encefálica. Por exemplo, em certos aspectos, a invenção se relaciona com um ligante-GCC conjugado com um agente neuroprotetor tal como l-dopa, que é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica. Exemplos de tais conjugados de GCC-ligante são descritos no pedido PCT publicado WO2013/016662, cujo conteúdo é incorporado por referência neste documento na íntegra. Em modalidades da invenção, pacientes sofrendo de ou com suspeita de um distúrbio neurológico (por exemplo, a doença de Parkinson), cujos neurônios expressam GCC seriam considerados bons candidatos para tratamento com um ligante GCC conjugado a um agente neuroprotetor.

[00241] Em alguns aspectos da invenção, a terapia direcionada a GCC é um antagonista de GCC. Em uma modalidade, a terapia direcionada a GCC é um antagonista de peptídeo (por exemplo, um peptídeo ST) ou um inibidor de pequena molécula de GCC.

[00242] Em alguns aspectos, a terapia direcionada a GCC é um antagonista de GCC. Em uma modalidade, o agonista de GCC é um peptídeo ST. Em uma determinada modalidade, o agonista de GCC é um peptídeo ST que compreende a seqüência de aminoácidos: H-Cys1-Cys2- Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH (SEQ ID NO: 87), em que existem três ligações de bissulfeto: Entre Cys1 e Cys6, entre Cys2 e Cys10, e entre Cys5 e Cys13. Em uma modalidade particular o GCC agonista é um agonista de peptídeo que vincula GCC tal como Linaclotide (Ironwood Pharmaceuticals).

[00243] Em determinadas modalidades da invenção, pacientes cujas células de tumor expressam GCC em suas superfícies seriam considerados bons candidatos para tratamento com moléculas de anticorpo anti-GCC conjugados a toxina, tal como um imunoconjugado, conforme descrito neste documento, ou os anticorpos conjugados a toxina, conforme descritos em Pedido de Patente U.S. n. ° 20110110936, cujo conteúdo é incorporado por referência neste documento na íntegra. Sem a intenção de ser limitado por qualquer teoria, pacientes cujas células de tumor expressam quantidades baixas de GCC em suas superfícies podem não ser tão bons candidatos para isso ou podem ser candidatos para combinar a terapia direcionada a GCC com um método de tratamento adicional ou ser candidatos para terapia de anticorpo não-atrelada. Em outro exemplo, a dose de terapia direcionada a GCC pode ser ajustada para refletir o número de moléculas GCC expressado na superfície de células tumorais. Por exemplo, pacientes com elevado número de moléculas de GCC em suas superfícies de células de tumor podem ser tratados com doses mais baixas de uma terapia direcionada a GCC do que pacientes com baixo número de moléculas GCC expressadas na superfície das células de tumor. Detectar a presença de células de tumor expressando GCC in vivo pode permitir a identificação de tecidos ao tumor expressando GCC primário tendo sofrido metástase. Conhecimento de quais tecidos têm metástases pode levar a aplicação da terapia de tumor direcionada.

[00244] Conforme discutido acima, as moléculas de anticorpo descritas neste documento permitem uma avaliação da presença de uma proteína GCC em tecidos normais versus tecidos tumorais, através da qual pode ser avaliada a presença ou gravidade da doença, o progresso da doença e/ou a eficácia da terapia. Por exemplo, a terapia pode ser monitorizada e eficácia avaliada. Em um exemplo, uma proteína GCC pode ser detectada e/ou medida em uma primeira amostra obtida de um sujeito tendo uma doença proliferativa e terapia pode ser iniciada. Posteriormente, uma segunda amostra pode ser obtida do sujeito e proteína GCC na amostra pode ser detectada e/ou medida. Uma diminuição na quantidade de proteína GCC detectada ou medida na segunda amostra pode ser indicativa de eficácia terapêutica.

[00245] Sem a intenção de ser limitado por qualquer teoria, vascularização pode ser necessária para uma terapêutica direcionada a GCC para acessar um tumor expressando GCC, especialmente em casos onde a terapêutica direcionada a GCC é administrada por via intravenosa. Assim, em determinadas modalidades dos métodos da invenção, pode ser útil avaliar ou caracterizar a vascularização do tumor além de ou em conjunto com a detecção de proteínas GCC. Por exemplo, uma amostra de tecido pode ser colorida com um agente que identifica uma célula endotelial vascular, como um anticorpo anti-CD-31 ou uma molécula de anticorpo anti- von Fator Willebrand e um anticorpo anti-GCC da invenção para simultaneamente ou contemporaneamente caracterizar a expressão de GCC e vascularização de tecido. Em certos aspectos da invenção, tal caracterização da expressão de GCC simultânea ou contemporânea e a vasculatura é útil como uma ferramenta de seleção dos pacientes para uma terapêutica direcionada.

[00246] Em outro aspecto, a expressão de superfície de célula do GCC pode ser necessária para uma terapêutica direcionada a GCC para afetar a morte de uma célula de tumor expressando GCC. Por exemplo, algumas células de tumor podem estar expressando GCC, mas não na superfície da célula. Se uma terapêutica depende da expressão de GCC na superfície celular, tal terapêutica pode não ser capaz de matar uma célula onde GCC é primariamente intracelular. Assim, em algumas modalidades da invenção, a avaliação de diagnóstico ou prognóstico pode adicionalmente incluir análise e/ou quantificação de localização celular de GCC, por exemplo, um método que pode distinguir e/ou quantificar a expressão de superfície de célula da expressão intracelular. Sem a intenção de ser limitado por qualquer teoria, um paciente cujo tumor principalmente tem expressão intracelular de GCC pode não ser um bom candidato para uma molécula de anticorpo anti- GCC que vincula-se ao domínio extracelular de GCC. Alternativamente, um resultado tão analítico pode solicitar tratamento inicial com um agente que induz a expressão de superfície de célula de GCC (ver, por exemplo, publicação PCT NO. WO04/071436). Na sequência, ou em conjunto com indução de superfície de célula de GCC, uma molécula de anticorpo anti-GCC que tem acesso a ou liga-se somente a GCC expresso extracelularmente pode ser administrada.

Kits

[00247] Também dentro do escopo da invenção estão kits compostos por uma molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado, conforme descrito neste documento. Adicionalmente, estão inclusos kits compostos por composições lipossomas, constituídas por uma molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado. O kit pode incluir um ou mais outros elementos incluindo: instruções de uso; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico ou um agente útil para quelação, ou outra forma de acoplamento, um anticorpo para um marcador ou agente terapêutico ou uma composição radioprotetora; dispositivos ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração; transportadoras farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos, ou outros materiais para a administração a um sujeito. Instruções de uso podem incluir instruções para aplicações diagnósticas da molécula de anticorpo anti-GCC ou imunoconjugado para detectar GCC, in vitro, por exemplo, em uma amostra, por exemplo, uma biópsia ou células de um paciente com um câncer, ou in vivo. As instruções podem incluir orientações para a aplicação terapêutica, incluindo dosagens sugeridas e/ou modos de administração, por exemplo, em um paciente com um câncer (por exemplo, um câncer de origem gastrointestinal, tal como, por exemplo, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de esôfago). Outras instruções podem incluir instruções sobre acoplamento do anticorpo a um quelante, um marcador ou um agente terapêutico, ou para a purificação de um anticorpo conjugado, por exemplo, de componentes de conjugação não reagidos. Como discutido acima, o kit pode incluir um marcador, por exemplo, qualquer um dos marcadores aqui descritos. Como discutido acima, o kit pode incluir um agente terapêutico, por exemplo, um agente terapêutico aqui descrito. Em algumas aplicações, o anticorpo será reagido com outros componentes, por exemplo, um marcador ou um quelante ou agente terapêutico, por exemplo, um radioisótopo, por exemplo, ítrio e lutécio. Em tais casos, o kit pode incluir um ou mais de um recipiente de reação para realizar a reação ou um dispositivo de separação, por exemplo, uma coluna cromatográfica, para uso na separação do produto acabado de materiais inciais ou intermediários de reação.

[00248] O kit adicionalmente pode conter pelo menos um reagente adicional, tal como um agente de diagnóstico ou terapêutico, por exemplo, um agente de diagnóstico ou terapêutico, conforme descrito neste documento, e/ou uma ou mais moléculas de anticorpo anti-GCC adicionais ou imunoconjugados, formulados conforme apropriado, em uma ou mais preparações farmacêuticas separadas.

[00249] O kit pode ainda conter um protetor à radiação. A natureza radiolítica de isótopos, por exemplo, 90ítrio (90Y) é conhecida. A fim de superar esta radiólise, podem ser incluídos radioprotetores, por exemplo, no tampão de reação, desde que tais radioprotetores sejam benignos, o que significa que eles não inibem ou de outro modo afetam negativamente a reação de marcação, por exemplo, de um isótopo, tal como 90Y, para o anticorpo. O tampão de formulação da presente invenção pode incluir um radioprotetor como albumina de soro humano (HSA) ou o ascorbato, que minimizam a radiólise devido ao ítrio ou outros radionuclídeos fortes. Outros radioprotetores são conhecidos na técnica e também podem ser usados no tampão de formulação da presente invenção, ou seja, os varredores de radicais livres (fenol, sulfitos, glutationa, cisteína, Ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de Ascorbil, HOP(:O) H2I glicerol, formaldeído Sulfoxilato de sódio, Na2S2O, Na2S2O3, e SO2,etc.).).

[00250] Um kit provido seria um útil para radio-marcadores de uma proteína conjugada com quelante ou peptídeo com um radioisótopo terapêutico para a administração a um paciente. O kit inclui (i) um frasco contendo um anticorpo conjugado quelante, (ii) um frasco contendo tampão de formulação para estabilizar e administrar o anticorpo radio-marcado a um paciente e (iii) instruções para executar o procedimento radiomarcação. O kit provê a exposição de um anticorpo conjugado quelante para o radioisótopo ou um sal respectivo para uma quantidade suficiente de tempo sob condições amigáveis, por exemplo, conforme recomendado nas instruções. É produzido um anticorpo radiomarcado tendo suficiente pureza, atividade específica e especificidade de ligação. O anticorpo radiomarcado pode ser diluído a uma concentração adequada, por exemplo, tampão de formulação e administrado diretamente ao paciente com ou sem adicional purificação. O anticorpo conjugado quelante pode ser fornecido na forma liofilizada. Os exemplos a seguir são ilustrativos, mas não pretendem ser limitantes da presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de uma proteína de fusão GCC humano de domínio extracelular-Fc de camundongo (hGCC-ECD-mFc)

[00251] A geração de um domínio extracelular (ECD) de guanilil ciclase (GCC) humano (h) (hGCC)/ constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Ig)G2a (Fc) de camundongo (com proteína de fusão da região de mutação de ligação receptora (FcRbr-mutII) (i.e., proteína de fusãoh GCC (ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII, também referida neste documento como pLKTOK108 e MIL-44) para imunização e triagem foi realizada da seguinte forma. Antígeno GCC foi preparado por subclonagem de uma porção de gene GCC codificando um seqüenciado compreendendo a seguinte seqüência GCC (seqüência de sinal e domínio extracelular) para o vetor de expressão pLKTOK4: MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEP LKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTC EGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLS CDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETE DCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCG GPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS PGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPK FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTH VNKTYPVDMSPTFTWKNSKL (SEQ ID NO: 46)

[00252] A sequência de aminoácidos GLy-Arg-Gly-Pro-Gln (SEQ ID NO: 66), em posições 427 para 430, foi selecionada para finalizar o fragmento de GCC extracelular. Em GCC, essa seqüência é imediatamente seguida por uma Pro que se alinha com uma Pro em posição homóloga para a Pro que é historicamente utilizada para iniciar as proteínas de fusão Fc IgG1 humanas. A região IgG2a Fc de camundongo de pLKTOK108 foi projetada para começar com a sequência de aminoácidos que é funcionalmente o fim do domínio CH1 [Pro-Arg-Valina (Val) - Pro - isoleucina (Ile)-treonina (Thr) - Glu - asparagina (Asn)] (SEQ ID NO: 58). Duas regiões foram mutadas na região constante IgG2a de camundongo. Além da leucina (Leu) - Leu - Gly-Gly (SEQ ID NO: 59) para Leu-alanina (Ala) - Gly - Ala (SEQ ID NO: 60) mutações (posições 234 a 237 lisina [Lys] - Lys - Gly-Gly (SEQ ID NO: 61) para Lys-Ala-Gly-Ala (SEQ ID NO: 62), a segunda região receptora Fc em posições 318 a 322 também foi mutada conforme segue: ácido glutâmico (Glu)-Fenilalanina (Phe)-Lys-Cisteína (Cys)-Lys(SEQ ID NO: 63) para Ala- Phe-Lys-Cys-Lys (SEQ ID NO: 64) e, em seguida, pára Phe-Lys-Cys-Lys (SEQ ID NO: 65).

[00253] Uma vez que a seqüência de proteína de fusão completa foi projetada, seqüências de enzima de restrição flanqueadoras para BamHI e XbaI, bem como a sequência Kozak (CTCACC) e um códon de parada terminal foram adicionados para completar o cDNA de proteína de fusão. As seqüências de aminoácidos e nucleotídeos da proteína de fusão pLKTOK108 (hGCC/mIgG2a FcRmutII) é provida abaixo (os locais de restrição BamHI e XbaI são mostrados em letras minúsculas em SEQ ID NO: 47): Sequência de nucleotídeo GCC-ECD Humano/IgG2a Fc de camundongo (SEQ ID NO: 47) cgcggatccctcaccATGAAGACGTTGCTGTTGGACTTGGCTTTGTGGTCACTG CTCTTCCAGCCCGGGTGGCTGTCCTTTAGTTCCCAGGTGAGTCAGAACT GCCACAATGGCAGCTATGAAATCAGCGTCCTGATGATGGGCAACTCAGC CTTTGCAGAGCCCCTGAAAAACTTGGAAGATGCGGTGAATGAGGGGCTG GAAATAGTGAGAGGACGTCTGCAAAATGCTGGCCTAAATGTGACTGTGA ACGCTACTTTCATGTATTCGGATGGTCTGATTCATAACTCAGGCGACTGC CGGAGTAGCACCTGTGAAGGCCTCGACCTACTCAGGAAAATTTCAAATG CACAACGGATGGGCTGTGTCCTCATAGGGCCCTCATGTACATACTCCAC CTTCCAGATGTACCTTGACACAGAATTGAGCTACCCCATGATCTCAGCTG GAAGTTTTGGATTGTCATGTGACTATAAAGAAACCTTAACCAGGCTGATG TCTCCAGCTAGAAAGTTGATGTACTTCTTGGTTAACTTTTGGAAAACCAAC GATCTGCCCTTCAAAACTTATTCCTGGAGCACTTCGTATGTTTACAAGAAT GGTACAGAAACTGAGGACTGTTTCTGGTACCTTAATGCTCTGGAGGCTA GCGTTTCCTATTTCTCCCACGAACTCGGCTTTAAGGTGGTGTTAAGACAA GATAAGGAGTTTCAGGATATCTTAATGGACCACAACAGGAAAAGCAATGT GATTATTATGTGTGGTGGTCCAGAGTTCCTCTACAAGCTGAAGGGTGACC GAGCAGTGGCTGAAGACATTGTCATTATTCTAGTGGATCTTTTCAATGAC CAGTACTTGGAGGACAATGTCACAGCCCCTGACTATATGAAAAATGTCCT TGTTCTGACGCTGTCTCCTGGGAATTCCCTTCTAAATAGCTCTTTCTCCA GGAATCTATCACCAACAAAACGAGACTTTGCTCTTGCCTATTTGAATGGA ATCCTGCTCTTTGGACATATGCTGAAGATATTTCTTGAAAATGGAGAAAAT ATTACCACCCCCAAATTTGCTCATGCTTTCAGGAATCTCACTTTTGAAGG GTATGACGGTCCAGTGACCTTGGATGACTGGGGGGATGTTGACAGTACC ATGGTGCTTCTGTATACCTCTGTGGACACCAAGAAATACAAGGTTCTTTT GACCTATGATACCCACGTAAATAAGACCTATCCTGTGGATATGAGCCCCA CATTCACTTGGAAGAACTCTAAACTTCCTAATGATATTACAGGCCGGGGC CCTCAGCCCAGAGTGCCCATAACACAGAACCCCTGTCCTCCACTCAAAG AGTGTCCCCCATGCGCAGCTCCAGACCTCGCAGGTGCACCATCCGTCTT CATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCA TGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGACGTCCA GATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAA ACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCC CCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGCATTCAAATGCAAGGT CAACAACAGAGCCCTCCCATCCCCCATCGAGAAAACCATCTCAAAACCC AGAGGGCCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGCAG AAGAGATGACTAAGAAAGAGTTCAGTCTGACCTGCATGATCACAGGCTTC TTACCTGCCGAAATTGCTGTGGACTGGACCAGCAATGGGCGTACAGAGC AAAACTACAAGAACACCGCAACAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTC ATGTACAGCAAGCTCAGAGTACAAAAGAGCACTTGGGAAAGAGGAAGTC TTTTCGCCTGCTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCTTACGACT AAGACCATCTCCCGGTCTCTGGGTAAATAAtctagagca

[00254] Sequência de aminoácido GCC-ECD Humano/IgG2a Fc de camundongo (SEQ ID NO: 48): MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPL KNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEG LDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYK ETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWY LNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKL KGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYLEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFS RNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYD GPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTW KNSKLPNDITGRGPQPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLAGAPSVFIFPPKIK DVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNST LRVVSALPIQHQDWMSGKAFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVL PPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGS YFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGK

[00255] Conforme dito acima, a proteína recombinante pLKTOK108 combina a região extracelular de GCC humano fundido a uma região de IgG2a Fc de camundongo no qual as duas regiões de ligação receptoras Fc mutadas (FcRs) foram uma mutadas para impedir a ligação ao receptor Fc (mIgG2a FcRmutII). A inserção de DNA recombinante para pLKTOK108 foi criada por um processo PCR de três etapas, como segue:

[00256] O primeiro passo criou o GCC humano extracelular adaptado e os fragmentos de DNA FcRmutII IgG2a de camundongo adaptados contendo 35 nucleotídeos de sequências de sobreposição. Estas reações de PCR usaram os iniciadores e moldes descritos na tabela 11 e tabela 12 com o protocolo descrito na tabela 13 para criar os dois fragmentos. Esses fragmentos de DNA foram isolados a partir de um gel de agarose 1% usando um kit de purificação Gel Qiagen (Valencia, CA). O molde de GCC humano foi provido por um vetor de expressão de proteínas que contém a seqüência para GCC humano (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA. O molde para o domínio de Fc foi obtido de uma construção de expressão para 1228 humano fundido ao IgG2aFc de camundongo com duas regiões de ligação receptoras de Fc mutado (FcRmutII), referida como pLKTOK84, que foi criada usando o vetor pLKTOK61 (descrito na Patente U.S. 7.053.202, cujo conteúdo é incorporado por referência neste documento na sua totalidade) como um molde. Tabela 11 Moldes usados em reações de montagem PCR do primeiro passo para criar o DNA recombinante para pLKTOK108 Tabela 12: Iniciadores usados em Todas as Reações PCR para criar pLKTOK108 Tabela 13: Protocolo de Reação usado nas reações de montagem PCR de primeiro passo para criar DNA Recombinante para pLKTOK108 A segunda reação de PCR combinou os modelosnas concentrações listadas na Tabela 14 O protocolo de reação listados na Tabela 15 criou um gene de proteína de fusão recombinante único. O produto desta reação foi utilizado diretamente como matriz na terceira reação PCR Tabela 14: Modelos Usados nas reações de montagem PCR de segundo passo para criar DNA Recombinante para pLKTOK108 Tabela 15: Protocolo de Reação usado nas reações de montagem PCR de segundo passo para criar DNA Recombinante para pLKTOK108 A terceira reação PCR utilizou os modelos e os iniciadores descritos na Tabela 16 e na Tabela 12 com o protocolo descrito na Tabela 17 abaixo para criar os fragmentos completos. Estes fragmentos de DNA foram isolados a partir de um gel agarose 0,7% utilizando um kit de purificação de gel da Qiagen (Apêndice F), e um Kit de Clonagem adenosina tiamina de cadeia secundária (overhang) TOPO® TA (Apêndice F). Clones únicos foram isolados e o DNA purificado utilizando o kit de DNA miniprep da Qiagen (Apêndice F). O DNA foi sequenciado com os iniciadores M13f, M13r pSMUCH2 e para identificar aqueles com a sequência desejada. TOPO clone TOK108-15 intermediário continha a sequência de DNA recombinante desejada. Tabela 16: Modelos Usados nas reações de montagem PCR de terceiro passo para criar DNA Recombinante para pLKTOK108 Tabela 17 Protocolo de reações usado no terceiro passo de reações de montagem PCR para criar o DNA recombinante para pLKTOK108

[00257] Para criar a expressão vetorial pLKTOK4, pcDNA3.1TM foi usado como um vetor de estrutura fundamental. Ele contém o gene neomicina (NEO) para resistência à G-418 (Geneticin ®), para permitir a fácil seleção em condições de pesquisa. O local de restrição SpeI foi eliminado do pcDNATM3.1 por mutagênese dirigida ao local. O promotor dea EF-1 do plasmídeo pcDEF3 (originalmente pEF-BOS4) foi inserido no pcDNA TM3.1, eliminando assim o promotor CMV. Um mapa circular para o vetor de expressão pLKTOK4 é representado na Figura 1.

[00258] Clonagem foi realizada sobre os produtos finais PCR usando um Kit de Clonagem TOPO®TA. Após a digestão com enzimas de restrição BamHI e XbaI, o fragmento desejado do clone TOPO foi ligado ao vetor de expressão pLKTOK4, que também foi digerido com BamHI e XbaI. A Reação de ligação foi usada para transformar as células K12 quimicamente competentes e. coli e então selecionada no caldo Luria (LB) / placas de ágar de ampicilina. Plasmídeos de clones individuais e. Coli foram isolados usando o kit de miniprep de DNA QIAGEN e sequenciados com os iniciadores SP6 (SEQ ID NO: 55), EF5S (SEQ ID NO: 54) e pSMUCH2 (SEQ ID NO: 53).

[00259] Um clone determinado para conter o DNA recombinante desejado por sequenciação de DNA e usado para fazer uma grande quantidade de puro plasmídeo de DNA usando um kit Maxiprep QIAGEN. Este DNA maxiprep foi usado para transfecção em células de ovários de hamister chinês (CHO-DG44) deficientes de dihidrofolato redutase. Uma linha de celular livre de soro, adaptada à suspensão CHO-DG44, chamada de S1-CHO-DG44, foi usada para o desenvolvimento de linhas celulares de produção de pLKTOK108. Brevemente, as transfecções foram feitas usando um dispositivo Nucleofector ® de Amaxa Biosystems e kit Nucleofection® V usando um DNA circular não-linearizado, ou plasmídeo DNA linear tratado com enzima de restrição Pvu I. Células transfectadas foram mantidas em meio de crescimento IS-CHO-V-GS por 48 horas antes de serem trocados para meio de seleção G-418. As células transfectadas vivas foram alimentadas com meio de seleção G-418 fresco e mantidas em cultura até confluência (~ 10 a 14 dias). A produtividade de pLKTOK108 de cada piscina de transfecção foi avaliada por meio de um ensaio de ELISA IgG2a de camundongo e as células expandiram-se para fazer os bancos de células congeladas. A piscina de transfecção com maior produtividade por IgG2a ELISA de camundongo foi identificada por clonagem de diluição limitada onde células foram plaqueadas em 5 placas de cultura de tecidos de 96 poços x em meio de seleção G-418 (cerca de 1 célula em cada poço). As placas de 96 poços foram incubadas numa incubadora a 37oC com 5% CO2 por 2 semanas sem alimentação. 50 μL de sobrenadante de cada poço que teve uma única colônia foi transferido diretamente em uma placa de 96 poços de ensaio para realizar o ensaio de ELISA IgG2a de camundongo. Vinte e três clones com alta produtividade foram identificados e expandiram-se sequencialmente através de placas de 24 poços de cultura de células e em seguida, placas de cultura de 6 poços de célula. O título de anticorpos do sobrenadante destes clones foi medido em 3 diferentes diluições no ensaio de IgG2a ELISA de camundongo.

[00260] Os 6 melhores clones com base no título de IgG2a de camundongo foram expandidos no meio de seleção G-418 para fazer os bancos de células congeladas, e foram adaptados ao meio de suspensão livre de soro Sigma #21. A densidade celular e a viabilidade foram determinados utilizando o analisador de Cultura de células Automatizado Cedex, e a concentração de proteína no sobrenadante foi medida utilizando o ensaio de ELISA IgG2a de camundongo. Uma vez que as células atingiram a fase de crescimento logarítmico, foram colhidas e congeladas a-80°C durante a noite e depois transferidas para uma câmara de nitrogênio líquido para armazenamento.

[00261] Para produzir a proteína de fusão, células foram descongeladas chapeadas e posteriormente expandidas em série em frascos T maiores e depois em frascos de agitação com densidades iniciais de 3,0x105 células/mL e incubadas em uma incubadora umidificada definida a 37° C, com 5% CO2 em um agitador orbital, definido a 105 rpm. As culturas finais foram alimentadas com 10% do volume do Meio Alimentador Especial Sigma #21 nos dias 4 e 7 e 5% do volume no dia 10. Meio Alimentador Sigma #21 consiste de Meio Sigma #21 suplementado com 40 g/L de glicose, 10 de g/L L-glutamina, 10 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de peptona de soja. A cultura de agitação foi colhida por centrifugação. O sobrenadante contendo proteína pLKTOK108 secretada foi filtrado através de 0,2 μm unidade de filtro de membrana polietersulfona baixa ligação de proteína (PES), com o filtrado contendo pLKTOK108 bruto pronto para purificação ou armazenado a-80 ° C para a purificação futura.

[00262] Purificação inicial envolveu circular sobrenadantes filtrados contendo pLKTOK108 sobre uma coluna de proteína Sepharose A a cerca de 4°C. A resina foi então lavada com PBS pH7,4, e a proteína eluída com glicina 0,1 M em PBS pH 3,0 e neutralizada com 1M de fosfato de sódio em pH 6,5. O eluato neutralizado foi concentrado usando um concentrador Vivaspin com um peso molecular de corte (MWCO) de 30kDa e carregado em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) Superdex 200 (apêndice G) que foi previamente equilibrada com o tampão PBS pH 7,4 a fim de separar os agregados desta proteína. Proteína purificada pLKTOK108 elui como um único pico, com pureza confirmada em SDS-PAGE e coloração Comassie. Frações que contêm os homodímeros hGCC (ECD) / mIgG2a Fc foram reunidas. Depois que a concentração do material reunido foi determinada por absorção UV em 280 nm no espectrofotómetro NanoDropTM ND1000, a proteína pLKTOK108 purificada foi aliquotadas e armazenada a- 80°C.

Exemplo 2: Geração de mAbs de coelho pela imunização de proteína

[00263] Anticorpos monoclonais de coelho contra a proteína de fusão hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII (pLKTOK108) foram gerados usando o RabMAb® serviço prestado pela Epitomics (Burlingame, CA). Para efeitos da geração de MAb, a proteína de fusão hGCC(ECD)-mIgG2a RcRbr-mutII proteína de fusão (pLKTOK108)é referida neste documento como MIL-44.

[00264] Três coelhos (ML1009, ML1010 e ML1011) foram imunizados com MIL-44 usando técnicas de imunização convencionais. O título do soro contra MIL-44 e um antígêno de contra-filtro não-GCC (hMadCAM-mFc) foi avaliado usando teste sangra. Foram dadas imunizações de reforço após a imunização inicial. O coelho com o mais alto título de soro, coelho ML1010, foi escolhido como candidato para esplenectomia e fusão monoclonal usando os métodos e linha celular de sócio e proprietário de fusão de Epitomics.

[00265] Em dois dias separados (dia 1 e dia 2), 200 milhões de células de linfócitos foram fundidas com 100 milhões de células parceiras de fusão e plaqueadas em placas de 20 X 96 poços, respectivamente. As placas foram mantidas em incubadoras de cultura de tecidos sob condições padrão. Crescimento celular foi examinado 2-3 semanas após a fusão e a eficiência de fusão computada usando o número de poços com crescimento, dividido pelo número total de poços examinados. A eficiência de fusão para a fusão no dia 1 foi medida com 72% de eficiência de fusão, considerando que a eficiência de fusão no dia 2 foi de 79%. Um mínimo de duas placas foram examinadas para cada fusão da seguinte forma:

[00266] Foi efetuada triagem em todas as 40 placas usando métodos ELISA padrão com placas revestidas com 50 ng de MIL-44/poço. Uma purga de ML1010 a diluição de 1:10K foi usada como controle de positivo. 151 clones tendo um O.D. maior que 0,5 foram considerados presumidamente positivos e expandiram-se em uma placa de 24 poços. Uma tela de confirmação posterior foi realizada por ELISA empregando chapas revestidas com 50 ng de MIL-44 ou 50 ng de hMadCAM-mFc/poço. 143 clones foram confirmados positivos contra MIL-44 e entre eles, 72 foram identificados como MIL-44 específicos, ou seja, eram negativos contra a proteína hMadCAM-mFc.

[00267] Após a avaliação sobrenadante de multiclone, vários dos multiclones específicos MIL-44 foram sub-clonados: incluindo multiclone #148 e #67. Subclonagem foi efetuada usando o método de diluição de célula limitado. Vários sobrenadantes subclones foram selecionados por ELISA. As células de hibridoma para subclones 1#48-2 e #67-4 foram Selecionadas para congelamento/banco e para triagem suplementar e análise como um reagente de detecção de GCC em um ensaio imuno-histoquímica (IHC), conforme descrito no exemplo 3.

[00268] Os anticorpos MIL-44-148-2 e MIL-44-67-4 também foram clonados em pcDNA3.1 + neo (Invitrogen) para produção por transfecção transiente em células de mamíferos e sequenciamento. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos para as cadeias pesadas e leves para anticorpos MIL-44-67-4 e MIL-44-148-2 são providas abaixo. A seqüência de sinal em cada cadeia de IgG é mostrada em itálico; a região variável em cada cadeia de IgG é mostrada em negrito; os CDRs aparecem sublinhados. Sequência de Ácido Nucleico MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 4) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTG TCCAGTGT CAGTCAGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAACGGATAC CCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTCATAGA AIGAAÇTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGC AATCATTACTCATAATAGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAAGC CGATCCACCATCACCAGAAACACCAGCGAGAACACGGTGACTCTGAAA ATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAGA GAGGATAGTATGGGGTATTATTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTG GTCACCATCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGG GACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTAC CTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAAT GGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCG CTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGC AACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCG CCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGA TGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGC ACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGC GTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAG GAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACAC CATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGAC CTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAG AAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTG GACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGA GTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGG CCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAA ATGA Sequência de Aminoácido MIL-44-148-2 H2 (SEQ ID NO: 42) METGLRWLLLVAVLKGVQC QSVKESGGGLFKPTDTLTLTCTVSGFSLSSHR MNWVRQTPGKGLEWIAIITHNSITYYASWAKSRSTITRNTSENTVTLKMTSL TAADTATYFCAREDSMGYYFDLWGPGTLVTISS GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVR TFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSK PTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYI NNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPA PIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEK NGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALH NHYTQKSISRSPGK Sequência de Ácido Nucleico MIL-44-148-2 L5 (SEQ ID NO: 5) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGG CTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTG TGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGT CAGAGCATTAGTAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG TCTCCCAAGCCCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCT CATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCA TCAGTGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGCAGA CTTATACTAATAATCATCTTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGT GGTGGTCAAA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCA GGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTT CCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTG GCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAAC CTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAG AGTACACCTGCAGGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTT CAATAGGGGTGACTGTTAG Sequência de Aminoácido MIL-44-148-2 L5 (SEQ ID NO: 43) MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSI SNWLAWYQQKPGQSPKPLIYRASTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVE CADAATYYCQQTYTNNHLDNGFGGGTEVVVK GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIE NSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCRVTQGTTSVVQSFNRGD C Sequência de Ácido Nucleico MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 6) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTG TCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTG GGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATCCGACATCAGTA ACTATGCAATATCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAAT TCATCGGATATATTAGTTATGGTAAAAGTATATACTACGCGAGCTGGGC GAAAGGCCGGTTCGCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCT GGAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGC CAGAGAGGATAGTGCTACTTATAGTCCTAACTTGTGGGGCCCAGGCAC CCTGGTCACCGTCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGG GACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTAC CTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAAT GGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCG CTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGC AACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCG CCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGA TGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGC ACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGC GTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAG GAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACAC CATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGAC CTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAG AAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTG GACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGA GTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGG CCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAA ATGA Sequência de Aminoácido MIL-44-67-4 H2 (SEQ ID NO: 44) METGLRWLLLVAVLKGVQC QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDISNYAI SWVRQAPGKGLEFIGYISYGKSIYYASWAKGRFAISKTSSTTVDLEITSPTTE DTATYFCAREDSATYSPNLWGPGTLVTVSS GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVR TFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSK PTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYI NNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPA PIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEK NGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALH NHYTQKSISRSPGK Sequência de Ácido Nucleico MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 7) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGG CTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTG TGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGT CAGAGTATTAACACCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG CGTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCT CATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCA TCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGG GTTATAGTTATAATAATCTTGATCGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGT GGTGGTCACA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCA GGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTT CCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTG GCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAAC CTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAG AGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTT CAATAGGGGTGACTGTTAG Sequência de Aminoácido MIL-44-67-4 L4 (SEQ ID NO: 45) MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSI NTYLAWYQQKPGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISGVEC ADAATYYCQQGYSYNNLDRAFGGGTEVVVT GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIE NSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGD C

Exemplo 3: Imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-GCC Deteção de expressão de GCC em modelos de tumor humano xenoenxertos de mCRC

[00269] Um ensaio IHC usando o anticorpo MIL-44-148-2 foi desenvolvido para avaliar a expressão de GCC em tumores de xenoenxerto HEK293-GCC e vários xenoenxertos de tumores humanos primários (PHTX) derivados de amostras de pacientes de câncer colorretal metastático (mCRC) em camundongos fêmeas SCID.

[00270] Níveis de proteína GCC em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), foram avaliados em seções de 5 μm de espessura e incubados com anticorpo MIL-44-148-2 (3,5 μg/mL) por 1 hora em Colorador Automatizado Discovery XT® Ventana Medical Systems (Tucson, AZ). Anticorpos foram biotinilados com um anticorpo secundário anti-cabra de coelho (Vector Laboratories) e desenvolvidos com o sistema de mapa substrato3, 3'-diaminobexidina (DAB) (Ventana Medical Systems). As lâminas foram contra-coloridas com hematoxilina e fotografadas usando o sistema de escaneamento de lâmina por inteira Aperio.

[00271] Níveis de GCC diferiram significativamente dentre estes tumores com pontuação H (sistema de Pontuação descrito abaixo) que variam de 4 + em xenoenxertos de tumor HEK293-GCC e de 1+, 1-2+, 2+, 23+, e 4+ em diversos xenoenxertos de tumor PHTX. Em geral, em tumores com células de tumor moderadamente/bastante diferenciadas que mantiveram uma estrutura epitelial polarizada, GCC concentrou-se no lado luminal do tecido do tumor.

Deteção de expressão GCC em amostras de cólon humano e em microaranjos tumorais

[00272] Os anticorpos MIL-44-148-2 e MIL-44-67-4 descritos neste documento foram também submetidos a triagem como um reagente de deteção de GCC em um protocolo IHC descrito acima usando os xenoenxertos de tumor humano primários (PHTX) citados acima, peletes de célula transfectadas HT29 e HEK293 GCC, além de amostras humanas de cólon malignas e benignas (FFPE e microarranjos de tumor (TMAs)).

[00273] Peletes de célula transfectadas HT-29 e HEK293 GCC coloriram conforme esperado. As PHTXs demonstraram uma ampla gama de intensidades de coloração com os clones MIL-44-148-2 e MIL-44-67-4. Tanto MIL-44-148-2 quanto MIL-44-67-4 coloriram positivamente no carcinoma de cólon bem ou moderadamente diferenciado em situ ou metástase. Tumores pouco diferenciados coloriram menos intensamente. Tecido de cólon normal demonstrou coloração apical positiva usando anticorpos produzidos pelos subclones MIL-44-67-4- e MIL-44-148-2.

[00274] Anticorpos dos subclones MIL-44-148-2 e MIL-44-67-4- proveram prontamente aparente, intensa e específica coloração nas células de GCC transfectadas HEK293 e células HT29 sem qualquer coloração não específica nas linhas de célula parentais HEK293 e HT29. Os dois clones também coloriram positivamente no carcinoma de cólon bem ou moderadamente diferenciado em situ ou metástase. Menos coloração foi observada por ambos subclones em carcinomas pouco diferenciados. Cólon normal demonstrou coloração apical positiva para ambos os clones, conforme esperado. MIL-44-148-2 demonstrou uma sensibilidade e especificidade em geral maior do que MIL-44-67-4 em IHC. Enquanto MIL-44-67-4 demonstrou uma faixa dinâmica melhor do que MIL-44-148-2 em peletes de célula, MIL- 44-148-2 demonstrou uma faixa dinâmica superior sobre a de MIL-44-67-4 em TMAs. Em geral, o subclone MIL-44-148-2 mostrou superioridade sobre o MIL-67-4, demonstrando maior sensibilidade e especificidade em IHC e uma faixa dinâmica plena de TMA e uma intensa coloração (+2 na pontuação IHC ) no cólon normal em baixa concentração.

[00275] Com base nos resultados dos experimentos de IHC iniciais descritos acima, o subclone MIL-44-148-2 foi selecionado para o desenvolvimento e validação de um protocolo automatizado equivalente ao protocolo de IHC descrito acima usando um colorizador automatizado Tek- Mate. O ensaio IHC automatizado é uma ferramenta útil para triagem de pacientes com câncer para tumores expressando GCC como um critério de julgamento clínico para inscrição à uma terapia de câncer direcionada ao GCC, e geralmente como uma ferramenta de triagem para a seleção de pacientes (por exemplo, pacientes com câncer), que devem receber uma terapia direcionada ao GCC.

[00276] O protocolo IHC indicado na tabela 18 foi desenvolvido para a detecção de GCC em células e tecidos humanos FFPE, e cerca de 53 tumores colorretais e 20 tecidos de cólon normais, bem como 2 cânceres de cólon TMAs (comprados de US Biomax) foram submetidos a triagem para expressão de GCC. Estes tumores cobriram uma faixa de tipos de tumor, bem como os tecidos com metástase de câncer de cólon.

[00277] Seções de quatro-micron foram preparadas a partir das diversas amostras de tecido. Seções de tecido foram desparafinizadas por mudanças de xileno de 4, 5 minutos, seguidas por uma série de álcool classificados para água destilada. Recuperação de epítopo induzida por calor e vapor (SHIER) foi usada com solução de SHIER2 por 20 minutos no intervalo capilar na câmara superior de um vaporizador Black e Decker. Tabela 18A: Procedimento IHC Tabela 18B: Folha de Especificações de Reatividade de Anticorpos

[00278] Uma pessoa versada na técnica reconheceria que o intensificador de anticorpo primário pode ser um anticorpo secundário anticoelho desenvolvido em uma espécie que não coelho (por exemplo, humano, rato, bode, camundongo, etc.) tendo o mesmo isótipo que o MIL-44-148-2 ou MIL-44-67, mAbs de coelho(IgG de coelho) ou um reagente semelhante que é apropriado para amplificar o sinal MIL-44.

[00279] O protocolo acima usa uma incubação de anticorpo durante a noite de MIL-44-148-2 a 1.0μg/ml com uma detecção de peroxidase baseada em não-biotina (Kit Ultravision de Thermo/Lab Vision) e DAB como cromogêneo. Este procedimento foi completamente automatizado usando o TechMate 500 ou TechMate 1000 (Roche Diagnostics). Depois da coloração, lâminas foram desidratadas através de uma série de álcool para etanol absoluto, seguido de lavagens de xileno. lâminas foram permanentemente cobertas com lamínulas de vidro e CytoSeal. Lâminas foram examinadas sob um microscópio para avaliar a coloração. Coloração positiva é indicada pela presença de um produto de reação marrom (DAB-HRP). Contra-corante hematoxilina provê uma coloração azul nuclear para avaliar a morfologia de células e tecidos.

[00280] Mediante avaliação da coloração de GCC, determinou-se que uma abordagem de pontuação H seria a melhor abordagem para quantificar a expressão de GCC. A abordagem de Pontuação-H provê resolução de dados ideal para determinar a variação na porcentagem de tumor e intensidade de coloração dentre e entre os tipos de tumor. Ela também provê uma boa ferramenta para determinar os limiares para a coloração positiva. Neste método, a porcentagem de células (0-100) dentro de um tumor com intensidades de coloração variando de 0-3+ são providas. Com o método instantâneo, partituras com intensidades de 0, 0,5, 1, 2 e 3 foram providas. Dependendo do marcador, coloração 0,5 pode ser marcada como positiva ou negativa e reflete leve mas perceptíveis colorações para o marcador. Para obter uma pontuação H, a porcentagem de células tumorais são multiplicadas por cada intensidade e somadas:

[00281] PontuaçãoH = (% tumor * 1) + (% tumor * 2) + (% tumor * 3). Por exemplo, se um tumor é 20% negativo (0), 30% +1, 10% +2, 40% +3, isto daria uma pontuação H de 170.

[00282] A pontuação H máxima é 300 (100% * + 3), por localização sub celular (ou seja, apical ou citoplasmática), se 100% de células tumorais marcarem intensidade de 3 +. Inicialmente, como um controle, a pontuação H total sozinha não foi usada para comparar amostras, mas avaliada além de uma revisão da avaria da porcentagem de células em cada intensidade. Por exemplo, uma pontuação de 90 poderia representar 90% da colloração de células tumorais com 1 + de intensidade ou 30% de células com intensidade 3 +. Estas amostras têm a mesma pontuação H, mas expressão de GCC muito diferente. A porcentagem de células a ser pontuadas em cada intensidade pode variar, mas normalmente são pontuadas em incrementos de 10%; no entanto, uma pequena porcentagem de pontuação de um único componente pode ser estimada a 1% e 5% também para demonstrar que algum nível de coloração está presente. Para o GCC, coloração apical pode ser considerada para avaliação em incrementos de níveis baixos, tais como 1 e 5%.

[00283] Duas diferentes localizações sub celulares foram pontuadas por GCC usando a abordagem de pontuação H. Estas incluem coloração citoplasmática e apical associada à coloração. O padrão de coloração citoplasmático foi observado geralmente como difuso por todo o citoplasma das células tumorais. No entanto, em alguns casos houve variações de coloração citoplasmática, que incluía intensa coloração globular ou coloração granular puntiforme grosseira. Intensa coloração globular foi pontuada com 3 + coloração citoplasmática. A coloração puntiforme foi associada com coloração apical e não foi dada uma pontuação separada para este tipo de coloração citoplasmática (n = 4 amostras para coloração puntiforme). Coloração apical de GCC foi observada quando o lúmen estava presente. Outros padrões de coloração GCC observados incluíam coloração não-lúmen similar a membrana (um caso) e coloração extra-celular presente no lúmen do tumor. Em tecidos normais de cólon, a coloração era geralmente apical juntamente com coloração citoplasmática difusa.

[00284] Como as pontuações de H foram obtidas para a expressão de GCC citoplasmática e apical e como não se sabe se um tipo de localização é mais crítico que o outro para a eficácia de uma terapia direcionada a GCC, todos os dados foram capturados e um alguns casos, uma pontuação H total foi gerada usando a soma da expressão de GCC citoplasmática e apical. Em tais casos, a pontuação H máxima tornou-se 600 para a pontuação total (300 apical + 300 citoplasmática).

[00285] No geral, a coloração nas amostras de cólon normais ilustraram que GCC é anatomicamente privilegiado, sendo expresso na superfície apical. GCC foi expresso em mais de 95% das amostras de tumor e, em contraste com o tecido normal, demonstrou coloração citoplasmática difusa em alguns casos. Também foi observada coloração forte focal GCC em amostras humanas de metástase hepática de CRC.

[00286] As tabelas 19A mostram resultados de pontuação H de coloração citoplasmática e apical em tecidos normais e de tumor, que foram submetidos a triagem. Dados mostrados na tabela 19A são avariados de acordo com a origem da amostra (interna (denotada como MLNM), TMAs (denotadas como BIOMAX) e CRO (denotado como QualTek)) e grau do tumor. Resumo de dados de positividade é provido ao usar limiares de intensidade de coloração 0,5 e 1,0+ . Um total de 173 amostras de tumor foram pontuadas. Ao usar um corte 0,5 + para a intensidade de coloração positiva para coloração citoplasmática ou apical, 95% dos tumores são considerados positivos. Ao usar um corte 1.0+, 92% das amostras são consideradas positivas.

[00287] A origem dos tecidos mostra a variação da porcentagem de células de tumores positivos, bem como as pontuações H. Para limiar de positividade de coloração 1 +, a faixa é de 84% (amostras MTB de tumor CRO) a 100% (amostras internas ou amostras de tecido único CRO - Observe o menor número de amostras nesses grupos). Os tecidos de tumor internos mostraram uma pontuação H apical muito alta de 253 (n = 9 amostras). Havia também diferenças nos resultados de Pontuação dos 2 TMAs. EUA Biomax TMA C0992 coloriu mais forte do que C0701. Sem a intenção de ser limitado por qualquer teoria, a diferença de TMAs pode ser devida a uma diferença com a fixação com a fonte de tecidos ou um bloco poderia ter sido cortado mais recentemente do que o outro.

[00288] A estabilidade do antígeno em uma seção de corte e o frescor das amostras cortadas foram considerados. Amostras testada o estudo instantâneo incluiu amostras que foram cortadas e armazenadas e amostras que foram cortadas frescas, indicando que é necessário uma pesquisa adicional de estabilidade do tecido de amostras ao longo do tempo.

[00289] Algumas diferenças foram observadas em positividade de GCC e grau de tumor (ver tabela 19B), com maior coloração positiva associada a tumores bem diferenciadas vs tumores mal diferenciados (seis tumores de US Biomax não incluiram um grau). Tumores de grau 1 (n = 20) mostraram 100% de positividade; Tumores de grau 2 (n = 95) marcaram 98% dos casos positivos; e Tumores de grau 3 (n = 44) marcaram uma taxa de positividade de 88%. Tumores mal diferenciados geralmente têm falta de lúmen, o que pode ser responsável por algumas destas diminuições de coloração devido a uma falta de coloração apical. Esta porcentagem de positividade foi baseada em um limiar de intensidade de coloração 0,5 + . Sete dos 7 mets distantes foram positivos (de tecidos internos e CRO). Tumores metastáticos de US Biomax TMA foram listados como mets para linfonodos.

[00290] Em geral, GCC colore uma porcentagem muito elevada de tumores de cólon e tecidos normais de cólon independentemente da origem do tecido ou do grau do tumor. Tabela 19A: Resumo de coloração de câncer de cólon por fonte de amostra Tabela 19B: Resumo de coloração de câncer de cólon por grau do tumor

[00291] A precisão de Intra-ensaio do ensaio GCC IHC foi avaliado dentro de uma execução utilizando 5 réplicas cada de três peletes de células e 14 diferentes tecidos de carcinoma de cólon . Peletes de células foram preparados em lâminas separadas. Amostras de tumor de cólon foram incluídas em dois blocos de multi-tumor diferentes. Estes tecidos foram pontuados por reatividade GCC IHC.

[00292] Coloração de precisão de peletes de célula: Coloração quase idêntica foi observada em todas as 5 repetições intra-executadas dos peletes de 3 células.

[00293] Coloração de precisão das amostras de tumor de cólon: Coloração muito semelhante à quase idêntica foi observada entre as 5 repetições intra-executadas das 14 amostras de tumor de cólon. As amostras foram pontuadas por um patologista certificado usando a abordagem de pontuação H conforme descrito acima anteriormente. O desvio padrão demonstrou que, em todos os casos a variação foi mínima, demonstrando assim boa precisão de coloração dentro da mesma execução. No geral, houve coloração GCC IHC de intra execução muito consistente das amostras de carcinoma de cólon e pelete de célula testados.

[00294] Variabilidade de ensaio entre-execução e variabilidade devido a diferentes operadores foi avaliada em 5 execuções de coloração GCC IHC separadas. Quatro execuções foram realizadas em dias diferentes por um operador e um segundo operador realizou a quinta execução. Coloração incluiu testes dos mesmos tecidos em testes de precisão descritos acima.

[00295] Coloração de reprodutibilidade de peletes de célula: Coloração quase idêntica foi observada em todas as 5 repetições inter- executadas dos peletes de 3 células.

[00296] Coloração de reprodutibilidade das amostras de tumor de cólon: Coloração muito semelhante à quase idêntica foi observada entre as 5 repetições inter-executadas das 14 amostras de tumor de cólon. As amostras foram pontuadas por um patologista certificado usando a abordagem de pontuação H conforme descrito anteriormente. O desvio padrão demonstrou em todos os casos, a variância, como mínimo, demonstrando assim boa reprodutibilidade de coloração do dia-a-dia e com um operador diferente. No geral, houve coloração GCC IHC de inter- execução e inter-operador muito consistentes das amostras de carcinoma de cólon e pelete de célula testados.

[00297] Especificidade do ensaio de GCC IHC foi avaliada através do teste de um painel de tecidos humanos normais. Estes tecidos humanos normais incluíam 30 tipos diferentes de tecido: adrenal, bexiga, medula óssea, mama, córtex cerebral, colo do útero, trompas de Falópio, coração, rim, fígado, pulmão, linfonodo, nervo, ovário, pâncreas, parótida (glândula salivar), pituitária, placenta, próstata, músculo esquelético, pele, medula espinhal, baço, estômago, testículo, timo, tireóide, amigdalas, ureter e útero. Para cada tipo de tecido, pelo menos 3 espécimes únicos foram coloridos e avaliados para imunorreatividade GCC.

[00298] No geral, o ensaio de GCC IHC usando o anticorpo MIL-44148-2 foi mostrado pelo ensaio IHC descrito neste documento ser muito específico para as amostras de tumor de cólon em relação à coloração de tecido normal, particularmente para a coloração apical. Coloração apical foi detectada apenas em 2 das amostras de estômago; no entanto, esta coloração também foi observada no controle negativo. Coloração citoplasmática, geralmente leve, observou-se em vários tipos de tecido, incluindo o folículo ovariano (1 de 3 amostras), pele (folículo e derme, 2 das 3 amostras), células parietais de estômago (2 de 3 amostras), epitélio glandular da próstata (leve em 3 de 3 casos), hipófise (2 de 3 casos), epitélio do útero (3 de 3 casos), epitélio da trompa de Falópio (2 de 3 casos), trofoblasto da placenta (leve em 2 dos 3 casos) e pulmão (endotélio em 3 de 3 casos e epitélio bronquíolo em 1 de 3 casos). A mais forte coloração citoplasmática (2 +) estava presente em um caso de Trompa de Falópio e um caso de hipófise. Em ambos os casos havia mais leve coloração nos mesmo compartimentos no controle negativo. Células plasmáticas foram positivas em vários tecidos, incluindo o baço, amígdalas e linfonodos. Histiócitos foram positivos no baço, pulmão e linfonodos. Coloração de estroma esteve presente no testículo (2 de 3 casos), útero (3 de 3 casos) e ovário (1 de 3 casos). Coloração extracelular dos vasos sanguíneos foi amplamente observada e parece ser de ligação não-específica de soro.

[00299] O ensaio de GCC, utilizando o anticorpo monoclonal de coelho, MIL-44-148-2, sobre a plataforma de coloração TechMate mostra consistentei nter e intra execução de coloração de tumores e peletes de células de controle. O ensaio GCC parece ser altamente sensível no carcinoma de cólon enquanto colore a grande maioria das amostras de tumor de cólon testadas. O ensaio GCC também parece ser muito mais específico para tumores de cólon em comparação com tecidos normais. Expressão de GCC observada em muitos tumores de cólon é muito mais forte que qualquer coloração observada em um painel normal de tecido 30 com pelo menos 3 repetições de cada tipo de tecido. Nenhuma mancha de GCC apical específica foi detectada em qualquer um dos tecidos normais, sendo que coloração apical é comum na maioria das amostras de GCC. Apenas a coloração citoplasmática é observada em alguns tipos de tecido normal e esta coloração é geralmente leve. O anticorpo MIL-44-148-2 parece ser um marcador IHC reprodutível, sensível e relativamente específico para a coloração de tumores de cólon fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE).

Exemplo 4: Imuno-histoquímica adicional em Modelos de PHTX Não-Colo- Retais e Microarranjos de Tumor e Amostras Clínicas Colo-retais e Não- Colorretais Humanas

[00300] O ensaio automatizado de IHC descrito no exemplo 3 foi utilizado para avaliar a expressão de GCC (i.e., expressão de GCC apical, citoplasmática e/ou agregada) em uma variedade de amostras não-colorretal de diferentes fontes, incluindo xenoenxertos de tumor primário humano (PHTX), derivados de câncer gástrico e amostras de pacientes de câncer pâncreático em camundongos fêmeas SCID e vários microarranjos de tumor (TMAs) comprados em BioMax, Pantomics e outras fontes comerciais) específicos para o câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão e leiomiossarcomas/rabdomiossarcomas. Expressão de GCC também foi avaliada através do ensaio de IHC automatizado descrito no exemplo 3 em uma variedade de amostras de clínicas humanas, incluindo amostras de tumor gástrico, pancreático e de esôfago humano, obtidas a partir do banco de tecido de uma especialidade CRO (QualTek) acionado para executar o ensaio de IHC automatizado e câncer colorretal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de esôfago e câncer de intestino derivado de pacientes com câncer testados para expressão de GCC antes da inscrição em um estudo de marcação aberta, multicêntrico, escalonamento de dose, primeiro em humanos de um conjugado de anticorpo-droga direcionado a GCC, designado como MLN0264, em pacientes adultos com malignidades gastrintestinais avançadas expressando Guanilil ciclase C (Study C26001,ClinicalTrials.gov identifier NCT01577758).

[00301] Os resultados da coloração IHC em várias amostras de tecido colorretal normais e câncerosas e de tecidos não-colorretais (gástrico, de pâncreas, intestino, esôfago, pulmão, rabdomiossarcoma, Leiomiossarcoma) de várias fontes (PHTX, amostras clínicas humanas e tumormicroarranjos) são mostrados nas tabelas 20-32 abaixo. Tabelas 20-32 incluem as pontuações IHC (0, + 0,5, 1 +, 2 + e 3 +) e as pontuações H correspondentes calculadas com base nas pontuações de IHC tanto para Apical ("A") e citoplasmática ("C" ou "Cito") coloração GCC nos vários tecidos testados. Além disso, a tabela 32 mostra uma comparação de dados da expressão de GCC IHC em amostras clínicas humanas de câncer primário e metastático, em cada caso obtido do mesmo paciente. Como mostrado na primeira coluna da esquerda, as amostras "A" (ou seja, 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A 10A, etc.), referem-se às amostras do tumor primário, enquanto as amostras "B" (ou seja, 1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B, etc.) Referem-se a amostras de tumor metastático, obtidas a partir do mesmo paciente do qual foi obtida a amostra correspondente de tumor primário (a amostra correspondente "A"). Em outras palavras, as designações "1A" e "1B" referem-se aos tumores primários e metastáticos, respectivamente, obtidos a partir do mesmo paciente; a designação "2A" e "2B" referem-se aos tumores primários e metastáticos, respectivamente, obtidos de outro paciente e assim por diante. Uma maioria das amostras de tumor, mostradas na tabela 32 foram obtidas de pacientes com câncer colorretal primário e metastático, exceto onde indicado de outra forma conforme refletido na coluna rotulada "Comentários", caso em que o tipo específico de câncer não - colorretal é especificado. Como pode ser visto na coluna "Observações" na tabela 32, algumas amostras de tumores neuroendócrinos, carcinomas de células renais, tumores gástricos, GIST gástrico (tumor estromal gástrico), tumores pancreáticos e Leiomiossarcoma uterinas também foram da expressão de GCC pelo ensaio de IHC. Tabela 20: Ensaio IHC em modelo PHTX de câncer gástrico humano Tabela 21: Modelo de PHTX de Câncer Pancreático Humano Tabela 22A: Coloração IHC de GCC em microarranjo de tumor pancreático US Biomax P1921 (TMA) Tabela 22B: : Resumo do Coloração de GCC em Microarranjo de Tumor Pancreático US Biomax P1921 (TMA) Tabela 23A: : Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Pancreático US Biomax PA1002 (TMA) Tabela 23B: Sumário de Coloração de GCC em Microarranjo de Tumor Pancreático US Biomax PA1002 (TMA) Tabela 24A: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Pancreático-Parte 1 Pantomics PAC481 Tabela 24B: Resumo do Coloração de GCC em TMA Pancreático Pantomics PAC481-Parte 1 Tabela 24C: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Pancreático Pantomics PAC481-Parte 2 Tabela 24D: Resumo do Coloração de GCC em TMA Pancreático Pantomics PAC481-Parte 2 Tabela 25: Coloração IHC de GCC no Microarranjo de Tumor Gástrico US Biomax STC1501-Parte 1 Tabela 25B: Resumo do Coloração de GCC em TMA Gástrico US Biomax STC1501-Parte 1 Tabela 25C: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Gástrico US Biomax STC1501-Parte 2 Tabela 25D: Resumo do Coloração de GCC em TMA Gástrico US Biomax STC1501-Parte 2 Tabela 26A: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Esofágico Pantomics ESC1021 Tabela 26B: Resumo do Coloração de GCC em Microarranjo de Tumor Esofágico Pantomics ESC1021 Tabela 27A: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Esofágico US BioMax ES8010-Parte 1 Tabela 27B: Resumo de Coloração de GCC em TMA Esofágico US BioMax ES8010-Parte 1 Tabela 27C: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Esofágico US BioMax ES8010-Parte 2 Tabela 27D: Summary of GCC Staining in US BioMax ES8010 Esofágico TMA -Part 2 Tabela 28A: Coloração IHC de GCC em Micorarranjo de Tumor de Pulmão US BioMax LC20813 Tabela 28B: Resumo do Coloração de GCC em TMA de Pulmão US BioMax LC20813 Tabela 29A: Coloração IHC de GCC em Microarranjo de Tumor Leiomiossarcoma/Rabdomiossarcoma Tabela 29B: Resultados da Pontuação Ab de Controle Negativo em Microarranjo de Tumor de Leiomiossarcoma/Rabdomiossarcoma Tabela 30A: Coloração IHC de GCC nas Amostras Clínicas Humanas de Câncer Não-Colorretal a partir de um Banco de Dados de Tecido de CRO (QualTek) Tabela 30B: Coloração IHC de GCC em Amostras Clínicas Humanas de Cólon Normal e Câncer Colorretal (Grau do tumor 1, 2, 2&3 ou 3) a partir de um Bando de Dados de Tecido de CRO (QualTek) Tabela 31: Amostras Clínicas de Estudo de Escalonamento de Dose de Fase I C260001 de MLN0264 Terapêutico Direcionado ao GCC Tabela 32: Expressão IHC de GCC em Amostras de Tumor Colorretal Primário e Metastático

Resumo dos resultados de coloração GCC IHC

[00302] Resultados de coloração GCC IHC mostrados nos exemplos 3 e 4 demonstram que o GCC é expresso em uma variedade de malignidades Gastrointestinais, incluindo colorretal, estômago, intestino delgado e tumores de esôfago, bem como tumores não-gastrointestinais incluindo tumores pancreáticos e adenocarcinomas de pulmão, carcinomas espinocelulares de pulmão, leiomiossarcomas e rabdomiossarcomas. Um resumo das diversas análises de microarranjo de tumor é mostrado na tabela 33 abaixo. Tabela 33: Análise TMA mostra que GCC é expresso em uma variedade de malignidades * (% positivo é definido pela pontuação H > 10)

[00303] Amostras clínicas humanas de neoplasias gastrointestinais e malignidades GI-relacionadas também tiveram resultado positivo no teste para diferentes níveis de expressão de GCC, conforme resumido na tabela 34 abaixo. Tabela 34. Porcentagem de tumores submetidos a triagem em C26001 positivo (Positivo é definido como uma pontuação H > = 10 em apical ou citoplasmática)

[00304] Os resultados resumidos na tabela 34 são semelhantes aos resultados observados durante as sessões de triagem de TMA, resumidas na tabela 33.

[00305] A distribuição de pontuação H combinado/agregado de expressão GCC através de tipos de tumor da triagem de paciente de inscrição para a experiência C26001 é retratada nas figuras 2A-2D.

[00306] A distribuição de pontuação H combinada/agregada de expressão GCC dos vários microarranjos de tumor no pâncreas, gástrico e colorretal selecionados é retratada nas figuras 3A - 3C.

[00307] Enquanto esta invenção tem sido particularmente mostrada e descrita com referências as modalidades providas de seus exemplos, será compreendido por aqueles versados na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem partirem do escopo da invenção circundado pelas reivindicações acrescentadas.

Claims (17)

1. Molécula de anticorpo anti-GCC caracterizada por compreender três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; e três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 27, 28 e 29, respectivamente.

2. Molécula de anticorpo anti-GCC, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

3. Molécula de anticorpo anti-GCC, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo é: (a) um anticorpo monoclonal; e/ou (b) um anticorpo de coelho ou anticorpo derivado de coelho, opcionalmente um anticorpo monoclonal de coelho ou um anticorpo monoclonal de coelho humanizado.

4. Molécula de anticorpo anti-GCC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo anti-GCC é conjugada com um marcador detectável, em que o marcador detectável é selecionado a partir de uma enzima biologicamente ativa, um ligante, um grupo protético, um material fluorescente, um material luminescente, um material quimioluminescente, um material bioluminescente, um material cromofórico, um material denso de elétrons, um material paramagnético e um material radioativo.

5. Sequências de ácido nucleico isolado caracterizadas por compreenderem SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO 12.

6. Vetor caracterizado por compreender as sequências de ácido nucleico isolado, como definidas na reivindicação 5.

7. Método de produção de uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender cultivar uma célula compreendendo as sequências de ácido nucleico isolado, como definidas na reivindicação 5, ou o vetor, como definido na reivindicação 6, sob condições que permitem a produção de uma molécula de anticorpo, assim produzindo a molécula de anticorpo.

8. Uso de uma molécula de anticorpo anti-GCC, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para a detecção de uma molécula de GCC em uma amostra biológica, o uso compreendendo colocar a amostra biológica em contato com uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e determinar se a referida molécula de anticorpo se liga à referida molécula de GCC.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a detecção de uma molécula de GCC compreende um ensaio de imunohistoquímica.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a referida amostra biológica é uma biópsia do tumor derivada de um paciente com suspeita de ter um câncer que expressa GCC, em que o câncer é opcionalmente selecionado a partir de câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de intestino delgado, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de pulmão, um sarcoma de tecidos moles, um tumor neuroectodérmico e um tumor neuroendócrino.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por compreender ainda a etapa de quantificação da expressão atípica e/ou citoplasmática de GCC na referida amostra biológica.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a quantificação compreende uma abordagem de pontuação H.

13. Kit caracterizado por compreender a molécula de anticorpo anti- GCC, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e instruções de uso.

14. Uso de uma molécula de anticorpo anti-GCC, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para determinar a sensibilidade de células cancerosas a um agente terapêutico direcionado ao GCC e/ou avaliar se um sujeito é um candidato potencial para uma terapia direcionada ao GCC, o uso compreendendo as etapas de: i) colocar uma amostra de células cancerosas obtidas de um paciente que tem câncer em contato com a molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e ii) detectar a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo e a proteína de GCC na amostra, assim, determinando a sensibilidade das células de câncer a uma terapia direcionada ao GCC, e/ou determinar se um sujeito é um candidato para o tratamento com uma terapia direcionada ao GCC.

15. Mistura de reação caracterizada por compreender uma amostra biológica e uma molécula de anticorpo anti-GCC, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

16. Uso de uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para gerar um relatório de tratamento de câncer personalizado, o referido uso compreendendo as etapas de: i) colocar uma amostra biológica compreendendo uma ou mais células cancerosas obtidas de um paciente com câncer suspeito de ter um câncer que expressa GCC em contato com a molécula de anticorpo e proteína de GCC na amostra biológica; ii) detectar a formação de um complexo entre a molécula de anticorpo e a proteína GCC na amostra biológica; iii) quantificar a expressão de GCC na amostra biológica do complexo; iv) comparar o nível de expressão de GCC contra um banco de dados compreendendo terapia direcionada ao GCC; e v) selecionar uma terapia direcionada ao GCC e, opcionalmente, um regime de dosagem, com base no nível de expressão de GCC determinado na amostra.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 14 ou 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de intestino delgado, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de pulmão, um sarcoma de tecidos moles, um tumor neuroectodérmico e um tumor neuroendócrino.