MX2015002605A

MX2015002605A - Kits y ensayos de diagnostico para la deteccion del receptor 1 de folato.

Info

Publication number: MX2015002605A
Application number: MX2015002605A
Authority: MX
Inventors: Christina N Carrigan; Nathan E Testa; Olga Ab; Daniel Tavares; Beni B Wolf
Original assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-06-10
Also published as: CN104755498B; CN110294805B; JP2022022420A; CY1122907T1; SI2890717T1; KR20210145850A; BR112015004229A2; WO2014036495A4; KR20150046316A; US20180003715A1; WO2014036495A3; ZA201707245B; JP2015533788A; US9200073B2; PT2890717T; AU2023210668A1; BR112015004229B1; CA2883222C; IL237087A0; EP2890717A2

Abstract

La invención generalmente se refiere a anticuerpos que se unen al receptor 1 de folato humano y ensayos de diagnóstico para terapias basadas en el receptor 1 de folato. Se para monitorear la terapia. La presente invención proporciona métodos para la detección de FOLR1 en una muestra y puede usarse, por ejemplo, para estratificar pacientes. Por lo tanto, en una modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad mediada por el receptor 1 de folato que comprende: (a) medir el nivel de expresión del receptor 1 de folato (FOLR1) diseminado o FOLR1 en una célula tumoral circulante (CTC) en una muestra tomada de un paciente.

Description

KITS Y ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO PARA LA DETECCIÓN DEL RECEPTOR 1 DE FOLATO CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de esta invención se refiere generalmente a anticuerpos que se unen al receptor 1 de folato (FOLR1) humano, métodos de detección del FOLR1, métodos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer, y kits y ensayos de diagnóstico para terapias basadas en F0LR1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado con más de un millón de personas diagnosticadas con cáncer y 500.000 muertes por año solamente en Estados Unidos de América. En general, se calcula que más de 1 de 3 personas desarrollará alguna forma de cáncer durante su vida. Existen más de 200 tipos diferentes de cáncer, cuatro de los cuales—de mama, de pulmón, colorrectal y de próstata-conforman más de la mitad de todos los casos nuevos (Jemal et ál., 2003, C ncer J. Clin. 53:5-26).

El receptor 1 de folato (F0LR1), también conocido como receptor de folato alfa o proteína de unión a folato, es una proteína N-glicosilada expresada en la membrana plasmática de las células. El FOLR1 tiene una alta afinidad por el ácido fólico y por varios derivados reducidos de ácido fólico. El F0LR1 media la administración del folato fisiológico, 5- REF.:254397 metiltetrahidrofolato, al interior de las células.

El FOLR1 se sobreexpresa en la amplia mayoría de cánceres de ovario, así como también en varios cánceres uterinos, de endometrio, pancreáticos, renales, de pulmón y de mama, mientras la expresión del F0LR1 en tejidos normales se restringe a la membrana apical de las células epiteliales en los túbulos proximales del riñón, los neumocitos alveolares del pulmón, la ve iga, los testículos, los plexos coroideos y la tiroides (Weitman SD, et ál, Cáncer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr 16; 501-521 (1996); Kalli KR, et ál . Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). Este patrón de expresión del FOLR1 lo convierte en una diana deseable para la terapia contra el cáncer dirigida con FOLR1.

Debido a que el cáncer de ovario es típicamente asintomático hasta la etapa avanzada, a menudo se diagnostica en una etapa tardía y tiene pronósticos desfavorables cuando se trata con procedimientos disponibles actualmente, típicamente fármacos quimioterapéuticos después de cirugía citorreductora (von Gruenigen V et ál., Cáncer 112: 2221-2227 (2008);Ayhan A et ál., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007); Harry VN et ál., Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). Por lo tanto, existe una clara necesidad médica no cubierta de terapéuticos más eficaces para los cánceres de ovario.

Algunos ensayos previos usados para detectar F0LR1 diseminado no son suficientemente específicos para F0LR1. Por ejemplo, algunos ensayos no distinguen entre F0LR1 y otros miembros de la familia de los receptores de folato (F0LR2, 3 y 4) o informan valores para la FBP (proteína de unión a folato) total. Adicionalmente, algunos ensayos requieren que las muestras humanas (por ejemplo, plasma) sean tratadas previamente con una etapa de lavado con ácido suave para disociar el ácido fólico del receptor. Algunos resultados de los ensayos pueden también tener inconsistencias debido a los efectos competitivos entre la terapia de anticuerpo y el anticuerpo de diagnóstico. Adicionalmente, muchos kits disponibles comercialmente no son tradicionalmente confiables tanto en sus reactivos como en su estabilidad entre lotes. Las evaluaciones de estos kits han dado resultados muy mezclados y se prevén únicamente para uso de investigación. Muchos requieren que la muestra humana esté prediluida antes del análisis para reducir la probabilidad de falsos positivos debido al "efecto de la matriz". Por lo tanto, hay una clara necesidad de ensayos de diagnóstico precisos y altamente sensibles como complementos para terapias basadas en FOLR-1.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para la detección de FOLR1 en una muestra y puede usarse, por ejemplo, para estratificar pacientes. Por lo tanto, en una modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad mediada por el receptor 1 de folato que comprende: (a) medir el nivel de expresión del receptor 1 de folato (FOLR1) diseminado o FOLR1 en una célula tumoral circulante (CTC, por sus siglas en inglés) en una muestra tomada de un paciente, relativo a un nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en una muestra de referencia usando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo huMovl9 a F0LR1; y (b) administrar al paciente una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que module la actividad de F0LR1 si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC del paciente es elevado; donde la dosis fija del anticuerpo o fragmento de este trata de manera eficaz la enfermedad o el trastorno.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1 que comprende: (a) administrar a un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por FOLR1 una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que module la actividad de F0LR1; (b) medir el nivel de expresión de FOLR1 diseminado o en CTC del paciente relativo al nivel F0LR1 en una muestra de referencia usando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo huMovl9 a F0LR1; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 diseminado o en CTC del paciente es elevado; donde un aumento (por ejemplo, debido a que el aumento de la muerte celular causa un aumento en la liberación de F0LR1 diseminado) o la disminución en los niveles de F0LR1 en el paciente indica la eficacia del tratamiento. En otra modalidad, la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores aumenta si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en el paciente disminuye.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para disminuir la expresión de F0LR1 en un paciente que comprende: (a) medir el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en una muestra tomada de un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por F0LR1, en comparación con el nivel de F0LR1 en una muestra de referencia usando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo huMovl9 a F0LR1; y (b) administrar al paciente una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que module la actividad de F0LR1 si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en el paciente es elevado; donde la administración del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este aumenta (por ejemplo, debido a que el aumento de la muerte celular causa un aumento en la liberación de F0LR1 diseminado) o disminuye el F0LR1 en el paciente.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para disminuir la expresión de F0LR1 en un paciente que comprende: (a) administrar a un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por F0LR1 una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que module la actividad de FOLR1; (b) medir el nivel de FOLR1 diseminado o en CTC del paciente con relación al nivel de F0LR1 en una muestra de referencia; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 diseminado o en CTC en el paciente es elevado; donde la administración del fragmento de unión al antígeno o anticuerpo aumenta (por ejemplo, debido a que el aumento de la muerte celular causa un aumento en la liberación de FOLR1 diseminado) o disminuye los niveles de F0LR1 en el paciente.

En una modalidad, la enfermedad es cáncer. En otra modalidad, el cáncer es un cáncer con FOLR1 elevado que se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón no microcítico, de ovarios, cáncer de útero, de endometrio, de páncreas, de riñón, de pulmón, y de mamas. En otra modalidad, el cáncer es cáncer de ovarios que es resistente al platino o refractario al platino.

Además, la invención proporciona un método para monitorear la eficacia terapéutica de una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 en un paciente que comprende: (a) medir un primer nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en una muestra tomada de un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1 usando un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo huMovl9 a F0LR1; (b) administrar al paciente una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1; (c) medir un segundo nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en una muestra tomada de un paciente a continuación de la administración del anticuerpo, usando un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo huMovl9 a F0LR1; y (d) comparar el segundo nivel de F0LR1 con respecto al primer nivel de F0LR1; donde un aumento (por ejemplo, debido a que el aumento de la muerte celular causa un aumento en la liberación de F0LR1 diseminado) o la disminución entre el primer y el segundo valor de F0LR1 indica la eficacia del tratamiento.

En una modalidad, el nivel de expresión de F0LR1 se mide en un fluido corporal. En otra modalidad, el fluido corporal es fluido de ascitis. En otra modalidad, el fluido corporal es suero, sangre o plasma. En otra modalidad, el nivel de expresión de F0LR1 se mide en una muestra de sangre periférica.

En una modalidad, el paciente padece de cáncer. En otra modalidad, el cáncer es un cáncer con FOLR1 elevado que se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón no microcítico, de ovarios, cáncer de útero, de endometrio, de páncreas, de riñón, de pulmón y de mamas. En otra modalidad, el cáncer es cáncer de ovarios que es resistente al platino o refractario al platino.

En una modalidad, la expresión de F0LR1 se mide usando al menos un anticuerpo anti-FOLRl o un fragmento de unión al antígeno adicional de este. En otra modalidad, la expresión de FOLR1 se mide usando dos anticuerpos anti-FOLRl o fragmentos de unión al antígeno de estos. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo murino, quimérico, humanizado o humano. En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de alrededor de 1,0 a alrededor de 10 nM. En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de alrededor de 0,5 nM a alrededor de 5 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión se mide por citometría, Biacore, ELISA o radioinmunoensayo. En otra modalidad, la citometría es citometría de flujo.

En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este no se une al receptor 2 de folato o al receptor 3 de folato.

En una modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a un soporte sólido. En otra modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a una placa de microtitulación. En otra modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende un agente de detección. En otra modalidad, el agente de detección es un agente de detección cromogénico, un agente de detección fluorogénico, un agente de detección enzimático o un agente de detección electroquimioluminiscente. En otra modalidad, el agente de detección es peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés).

En una modalidad, los niveles de F0LR1 se determinan usando un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o citometría (por ejemplo, citometría de flujo). En otra modalidad, el análisis ELISA es un ELISA sándwich.

En una modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente al mismo epítopo de F0LR1 como un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:25 y el polipéptido de la SEQ ID NO:29; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:26 y el polipéptido de la SEQ ID NO:30; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID NO:31; y (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:28 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32.

En una modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente a FOLR1, donde el anticuerpo o fragmento de este inhibe de manera competitiva la unión a F0LR1 de un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:25 y el polipéptido de la SEQ ID NO:29; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:26 y el polipéptido de la SEQ ID NO:30; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID NO:31; y (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:28 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32.

En una modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente a F0LR1, donde el anticuerpo comprende secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y (e) variantes de (a) a (d) que comprenden 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En una modalidad, el al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este está etiquetado de manera detectable.

En una modalidad, el anticuerpo administrado comprende el anticuerpo huMovl9 de FOLR1.

En una modalidad, el huMovl9 se administra como un conjugado de anticuerpo y maitansinoide. En una modalidad, el conjugado de anticuerpo y maitansinoide comprende el maitansinoide DM4 y el enlazador sulfo-SPDB escindible (IMGN853).

Además, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por FOLR-1 que comprende: (a) administrar a un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por F0LR1 una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que module la actividad de F0LR1; (b) entregar una muestra tomada del paciente para medir un nivel de expresión de F0LR1; (c) determinar a partir de los resultados de medición si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC es elevado en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia; y, (d) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC es elevado.

Además, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por FOLR-1 que comprende: (a) administrar a un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por F0LR1 una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que module la actividad de F0LR1; (b) entregar una muestra tomada del paciente para medir un nivel de FOLR1 diseminado o en CTC y compararlo con un nivel de F0LR1 en una muestra de referencia; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC en el paciente es elevado; donde un aumento (por ejemplo, debido a que el aumento de la muerte celular causa un aumento en la liberación de F0LR1 diseminado) o la disminución de los niveles de FOLR1 en el paciente indica la eficacia del tratamiento.

En una modalidad, el anticuerpo administrado comprende el anticuerpo huMovl9 de F0LR1. En otra modalidad, el huMovl9 se administra como un conjugado de anticuerpo y maitansinoide. En una modalidad, el conjugado de anticuerpo y maitansinoide comprende un maitansinoide DM4 y el enlazador sulfo SPDB escindible (IMGN853).

Además, la invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por FOLR-1 que comprende: (a) obtener una muestra de un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, donde el paciente ha recibido una dosis fija de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1; (b) medir un nivel de F0LR1 diseminado o en CTC a partir de una muestra usando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo huMovl9 a FOLR1; (c) determinar si el nivel de F0LR1 diseminado o en CTC del paciente es elevado en relación con el nivel de FOLR1 en una muestra de referencia; (d) instruir a un proveedor de servicios de salud para que aumente la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de FOLR1 diseminado o en CTC del paciente es elevado; donde un aumento (por ejemplo, debido a que el aumento de la muerte celular causa un aumento en la liberación de F0LR1 diseminado) o disminución de F0LR1 en el paciente indica la eficacia del tratamiento.

La invención también proporciona un kit de inmunoensayo para detectar F0LR1 diseminado o en CTC en una muestra, el kit comprende: (a) un anticuerpo de captura contra el F0LR1 humano, donde el anticuerpo de captura o el fragmento de unión al antígeno de este no inhibe de manera competitiva la unión de huMovl9 a F0LR1, y (b) un reactivo de detección. En otra modalidad, el kit comprende además un soporte sólido para el reactivo de captura. En otra modalidad, el reactivo de captura se inmoviliza sobre el soporte sólido.En otra modalidad, el reactivo de captura está recubierto en una placa de microtitulación.En otra modalidad, el reactivo de detección es un segundo anticuerpo de F0LR1. En otra modalidad, el primer y/o segundo anticuerpo de FOLR1 comprende secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y (e) variantes de (a) a (d) que comprenden 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En una modalidad, el reactivo de detección se detecta usando un anticuerpo específico de la especie. En otra modalidad, el kit comprende además un medio de detección para los anticuerpos detectables. En otra modalidad, el medio de detección es colorimétrico. En otra modalidad, el kit comprende además un polipéptido F0LR1 como un estándar de antígeno. En otra modalidad, el polipéptido FOLR1 es FOLRl-Fc.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al mismo epítopo de F0LR1 como un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:25 y el polipéptido de la SEQ ID NO:29; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:26 y el polipéptido de la SEQ ID NO:30; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID NO:31; y (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:28 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une específicamente a F0LR1, donde el anticuerpo o fragmento de este inhibe de manera competitiva la unión a FOLR1 de un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:25 y el polipéptido de la SEQ ID NO:29; (b) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:26 y el polipéptido de la SEQ ID NO:30; (c) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID NO:31; y (d) un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:28 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a FOLR1, donde el anticuerpo comprende secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y (e) variantes de (a) a (d) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

En una modalidad, el anticuerpo comprende secuencias de polipéptidos que son al menos 90 % idénticas a las secuencias de polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b) SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d) SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32. En otra modalidad, las secuencias de polipéptidos son al menos 95 % idénticas a las secuencias de polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b) SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d) SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32. En otra modalidad, las secuencias de polipéptidos son al menos 99 % idénticas a las secuencias de polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b) SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d) SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32.

En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este es murino, no humano, humanizado, quimérico, revestido o humano. En otra modalidad, el anticuerpo se une al FOLR1 humano pero no al F0LR2 o F0LR3. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de longitud completa. En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este comprende un Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv de cadena simple o scFv, Fv unido por disulfuro, dominio V-NAR, IgNar, intracuerpo, IgGACH2, minicuerpo, F(ab')3, tetracuerpo, triacuerpo, diacuerpo, anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 o scFv-Fc.

La invención también proporciona un polipéptido que se une específicamente a F0LR1, donde el polipéptido comprende secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y (e) variantes de (a) a (d) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra modalidad, el polipéptido comprende secuencias que son al menos 90 % idénticas a las secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b) SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d) SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32. En otra modalidad, las secuencias son al menos 95 % idénticas a las secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b) SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d) SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32. En otra modalidad, las secuencias son al menos 99 % idénticas a las secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b) SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d) SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32.

En una modalidad, el anticuerpo o polipéptido se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de alrededor de 1,0 a alrededor de 10 nM. En otra modalidad, el anticuerpo o polipéptido se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de alrededor de 1,0 nM o mayor. En otra modalidad, la afinidad de unión se mide por citometría, Biacore, ELISA o radioinmunoensayo. En otra modalidad, la citometría es citometría de flujo.

La invención también proporciona un método para detectar la expresión de F0LR1 en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido de la invención. En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este está etiquetado de manera detectable. En otra modalidad, la etiqueta se selecciona del grupo que consiste en etiqueta inmunofluorescente, etiqueta quimioluminiscente, etiqueta fosforescente, etiqueta enzimática, radioetiqueta, avidina/biotina, partículas de oro coloidal, partículas de color y partículas magnéticas. En otra modalidad, la expresión de FOLR1 se determina por radioinmunoensayo, ensayo de Western blot, ensayo de inmunofluorescencia, inmunoensayo de enzimas, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de quimioluminiscencia o ensayo de inmunohistoquímica. En otra modalidad, la expresión de F0LR1 se determina usando un ensayo de células tumorales circulantes (CTC), donde las CTC se enriquecen a partir de una muestra de sangre, plasma o suero y se tiñen para la expresión de FOLR1 usando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la invención. Los ejemplos no taxativos de anticuerpos útiles para el ensayo de CTC incluyen FR1-9 y FR1-13. Los ensayos de CTC que usan anticuerpos de la presente invención pueden ser útiles para identificar un sujeto como probable de responder a una terapia basada en FOLR1.

La invención también proporciona una célula aislada que produce un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido de la invención.

La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, o polipéptido de la invención que comprenda (a) cultivar una célula que exprese el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, o polipéptido de la invención.

La invención también proporciona un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento del cáncer, donde la expresión aumentada de proteína FOLR1 ha sido medida en una muestra de cáncer del sujeto usando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido proporcionado en la presente previo a la administración del agente activo.

La invención también proporciona un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, que comprende: (a) medir el nivel de proteína F0LR1 en una muestra del paciente usando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este, o un polipéptido proporcionado en la presente; y (b) administrar al paciente una dosis fija del agente activo si el nivel de proteína F0LR1 en el paciente es elevado en relación con el nivel de proteína F0LR1 de referencia.

La invención también proporciona una agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1, que comprende: (a) administrar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1 una dosis fija del agente activo; (b) medir el nivel de proteína FOLR1 en el paciente usando el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este, o polipéptido proporcionado en la presente; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de proteína F0LR1 en el paciente es elevada en relación con el nivel de proteína F0LR1 de referencia.

La invención también proporciona una agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, donde (a) el nivel de proteína FOLR1 medida en una muestra tomada de un paciente se compara con el nivel de proteína F0LR1 de referencia usando un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno de este, o un polipéptido proporcionado en la presente; y (b) una dosis fija del agente activo se administra si el nivel de proteína FOLR1 en el paciente es elevado en relación con el nivel de proteína F0LR1 de referencia, donde la administración del agente activo disminuye el nivel de proteína F0LR1.

La invención también proporciona una agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, donde las células que expresan F0LR1 en un paciente disminuyen, donde (a) se administra al paciente una dosis fija del agente activo; (b) el nivel de proteína F0LR1 medida en una muestra obtenida de un paciente se compara con el nivel de proteína F0LR1 de referencia usando un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno de este, o un polipéptido proporcionado en la presente; y (c) la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores aumenta si el nivel de proteína FOLR1 en el paciente es elevado en relación con el nivel de proteína F0LR1 de referencia; donde la administración del agente activo disminuye el nivel de proteína F0LR1.

La invención también proporciona una agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para utilizar en un método para monitorear la eficacia terapéutica de una dosis fija del agente activo en un paciente, que comprende: (a) medir un primer nivel de proteína F0LR1 en una muestra tomada de un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1 usando un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno de este, o un polipéptido proporcionado en la presente; (b) administrar al paciente una dosis fija del agente activo; (c) medir un segundo nivel de proteína FOLR1 en una muestra tomada del paciente a continuación de la administración del agente activo, usando un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno de este o un polipéptido proporcionado en la presente; y (d) comparar el segundo nivel de proteína F0LR1 con respecto al primer nivel de proteína FOLR1; donde una disminución entre el primer y segundo nivel de proteína F0LR1 indica la eficacia del tratamiento.

La invención también proporciona un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de FOLR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1 en un paciente, que comprende: (a) administrar una dosis fija del agente activo a un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por F0LR1; (b) entregar una muestra tomada del paciente para medir un nivel de proteína F0LR1 usando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o un polipéptido proporcionado en la presente; (c) determinar a partir de los resultados de la medición si el nivel de proteína FOLR1 en el paciente es elevado en relación con un nivel de proteína F0LR1 de referencia; y, (d) aumentar la cantidad y/o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de proteína FOLR1 en el paciente es elevado en relación con el nivel de proteína FOLR1 de referencia.

La invención también proporciona una agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1, que comprende: (a) administrar una dosis fija del agente activo a un paciente que padece una enfermedad o un trastorno mediado por FOLR1; (b) entregar una muestra tomada del paciente para medir un nivel de proteína FOLR1 usando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o un polipéptido proporcionado en la presente y comparar el nivel de proteína F0LR1 medido con respecto al nivel de proteína FOLR1 de referencia; y (c) aumentar la cantidad o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de proteína F0LR1 en el paciente es elevado en relación con el nivel de proteína FOLR1 de referencia; donde una disminución en los niveles de F0LR1 en el paciente indica la eficacia del tratamiento.

La invención también proporciona una agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, que comprende: a) obtener una muestra de un paciente que padece una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, donde el paciente ha recibido una dosis fija del agente activo; (b) medir un nivel de proteína F0LR1 a partir de una muestra usando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, o un polipéptido proporcionado en la presente; (c) determinar si el nivel de proteína F0LR1 es elevado en relación con un nivel de proteína F0LR1 de referencia; (d) aumentar o instruir a un proveedor de servicios de salud para que aumente la cantidad y/o frecuencia de las dosis fijas posteriores si el nivel de proteína F0LR1 en el paciente es elevado en relación con el nivel de proteína F0LR1 de referencia; donde una disminución de F0LR1 en el paciente indica la eficacia del tratamiento.

La invención también proporciona un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1, donde la expresión aumentada de F0LR1 ha sido medida en una muestra del sujeto usando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido proporcionado en la presente previo a la administración del agente activo.

En algunas modalidades, la proteína F0LR1 medida es F0LR1 diseminado. En algunas modalidades, la proteína FOLR1 medida está en una célula tumoral circulante.

En una modalidad, el nivel de proteína FOLR1 se mide en un fluido corporal. En algunas modalidades, el fluido corporal es fluido de ascitis. En algunas modalidades, el fluido corporal es suero, sangre o plasma. En algunas modalidades, el nivel de proteína F0LR1 se mide en una muestra de sangre periférica.

En algunas modalidades, el paciente padece de cáncer. En algunas modalidades, la enfermedad o el trastorno mediado por F0LR1 es cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer con F0LR1 elevado que se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón no microcítico, de ovarios, cáncer de útero, de endometrio, de páncreas, de riñón, de pulmón, y de mamas. En algunas modalidades, el cáncer de ovarios es resistente al platino o refractario al platino. En algunas modalidades, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés). En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de endometrio.

En algunas modalidades, el nivel de proteína F0LR1 se mide usando dos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de estos o polipéptidos diferentes que se unen específicamente a F0LR1 . En algunas modalidades, el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido usado para detectar la proteína F0LR1 está unido a un soporte sólido. En algunas modalidades, el soporte sólido es una placa de microtitulación.

En algunas modalidades, el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido usado para detectar la proteína F0LR1 comprende un agente de detección. En algunas modalidades, el agente de detección es un agente de detección cromogénico, un agente de detección fluorogénico, un agente de detección enzimático o un agente de detección electroquimioluminiscente. En algunas modalidades, el agente de detección es peroxidasa de rábano picante (HRP).

En algunas modalidades, los niveles de proteína F0LR1 se determinan usando un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En algunas modalidades, el análisis ELISA es un análisis ELISA sándwich.

En algunas modalidades, el agente activo comprende el anticuerpo huMovÍ9 de F0LR1. En algunas modalidades, el huMovl9 se conjuga a un agente citotóxico. En algunas modalidades, el huMovl9 se administra como un conjugado de anticuerpo y maitansinoide que comprende adicionalmente el maitansinoide DM4 y el enlazador sulfo-SPDB escindible (IMGN853).

La invención también proporciona un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno de este o un polipéptido proporcionado en la presente para su uso como un diagnóstico.

La invención también proporciona un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno o un polipéptido proporcionado en, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que no inhibe de manera competitiva la unión a F0LR1 de un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1 con un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 y/o para monitorear la eficacia terapéutica de una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de FOLR1.

La invención también proporciona un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno de este o un polipéptido proporcionado en la presente para su uso en un método para diagnosticar (i) una enfermedad o trastorno mediado por F0LR1 y/o (ii) la respuesta al tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FOLR1 con una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1 y/o (iii) la eficacia terapéutica de un tratamiento con una dosis fija de un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad de F0LR1. En algunas modalidades, el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido se usa en un método para diagnosticar cáncer en un paciente que sufre de este. En algunas modalidades, el cáncer se asocia con niveles de F0LR1 elevados. En algunas modalidades, el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido comprende un agente de detección. En algunas modalidades, el agente de detección es un agente de detección cromogénico, un agente de detección fluorogénico, un agente de detección enzimático o un agente de detección electroquimioluminiscente.

La invención también proporciona métodos donde la enfermedad mediada por FOLR-1 es cáncer, donde el agente activo comprende IMGN853, y donde el nivel de proteína F0LR1 diseminada se mide utilizando un ensayo ELISA utilizando al menos dos anticuerpos anti-FOLRl que no inhiben de forma competitiva la unión del agente activo a F0LR1, donde cada uno de al menos dos anti-FOLRl comprende secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; y (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24.

La invención también proporciona métodos donde la enfermedad mediada por FOLR1 es cáncer, donde el agente activo comprende IMGN853, donde el anticuerpo anti FOLR1 que no inhibe de manera competitiva la unión del agente activo a F0LR1 comprende la secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20, y 21; o (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y donde la proteína FOLR1 se detecta por citometría.

En algunas modalidades de los métodos, el cáncer es cáncer de ovarios. En algunas modalidades, el cáncer de ovarios es resistente al platino o refractario al platino. En algunas modalidades, el cáncer es NSCLC. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de endometrio.

La invención también proporciona agentes activos donde la enfermedad mediada por FOLR-1 es cáncer, donde el agente activo comprende IMGN853, y donde el nivel de proteína F0LR1 diseminada se mide utilizando un ensayo ELISA utilizando al menos dos anticuerpos anti-FOLRl que no inhiben de forma competitiva la unión del agente activo a F0LR1, donde cada uno de al menos dos anti-FOLRl comprenden secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; y (d) SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24.

La invención también proporciona agentes activos donde la enfermedad mediada por FOLR-1 es cáncer, donde el agente activo comprende IMGN853, y donde el nivel de proteína F0LR1 diseminada se mide utilizando un ensayo ELISA utilizando al menos dos anticuerpos anti-FOLRl que no inhiben de forma competitiva la unión del agente activo a FOLR1, donde cada uno de al menos dos anti-FOLRl comprende secuencias de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y las SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b) las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y las SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c) las SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y las SEQ ID NO: 19, 20 y 21; y (d) las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y las SEQ ID NO: 22, 23 y 24.

En algunas modalidades de los agentes activos, el cáncer es cáncer de ovarios. En algunas modalidades, el cáncer de ovarios es resistente al platino o refractario al platino. En algunas modalidades, el cáncer es NSCLC. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de endometrio.

La invención también proporciona un método para tratar cáncer que comprende administrar un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígenos de este que modula la actividad FOLR1 a un paciente con niveles elevados de proteína F0LR1 diseminada con relación a un nivel de proteína FOLR1 de referencia, donde los niveles de proteína FOLR1 del paciente se midieron utilizando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno, o polipéptido proporcionado en la presente.

La invención también proporciona un método para tratar cáncer que comprende administrar un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que modula la actividad F0LR1 a un paciente con niveles elevados de proteína F0LR1 sobre células tumorales circulantes con relación a un nivel de proteína F0LR1 de referencia, donde los niveles de proteína F0LR1 del paciente se midieron utilizando un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno, o polipéptido proporcionado en la presente. En algunas modalidades, el agente activo comprende IMGN853. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de ovarios. En algunas modalidades, el cáncer de ovarios es resistente al platino o refractario al platino. En algunas modalidades, el cáncer es NSCLC. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de endometrio.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este, o polipéptido proporcionado en la presente para medir el nivel de proteína F0LR1 en una muestra in vitro.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Representación esquemática del ensayo de antígeno F0LR1 diseminado.

Figura 2A. Representación esquemática del ensayo ELISA de competición Movl9. Figura 2B Determinación de afinidad de unión de muFRl-13 mediante análisis ELISA sándwich utilizando Movl9.

Figura 3A Representación esquemática de análisis ELISA de competición de unión directa para determinar los epítopos de unión no competitiva a F0LR1. Figura 3B Gráfica de transformación logarítmica de los resultados de ELISA de competición para analizar la interferencia de unión de los anticuerpos anti-FOLRl con Movl9.

Figura 4. Gráfica de transformación logarítmica de los resultados de ELISA de competición para analizar la interferencia de unión de los anticuerpos anti-FOLRl con muFRl-13.

Figura 5. Afinidad de unión de los anticuerpos anti-FOLRl mediante análisis de ELISA sándwich.

Figuras 6A y 6B. Afinidad de unión de FR1-13 mediante (fig.6A) citometría de flujo y (fig.6B) análisis de ELISA sándwich.

Figuras 7A y 7B. Gráfica de transformación logarítmica de resultados para (fig.7A) unión de anticuerpo para FOLR2 y (fig.7B) FOLR3 mediante análisis de ELISA sándwich.

Figura 8. Efecto del ácido fólico unido previamente a F0LR1 en la detección del antígeno de FOLR1 diseminado utilizando FR1-9 y FR1-13.

Figura 9. Análisis de muestras de ascitis humana en busca de la presencia de FOLR1 y la presencia de proteínas de ensayo de interferencia.

Figura 10. Análisis de muestras de plasma humano normal agrupado en busca de la presencia de FOLR1 y la presencia de proteínas de ensayo de interferencia.

Figura 11. Determinación de concentración de FOLR1 en muestras de plasma de ovarios de pacientes humanos utilizando el análisis de ELISA sándwich de F0LR1.

Figura 12. Representación esquemática para interpolar la cantidad de F0LR1 en una muestra de paciente basándose en una curva de dosis-respuesta sigmoidea 4PL del estándar de proteína de fusión FOLRl-Fc purificada diluida de forma serial.

Figura 13. Titulación de anticuerpos anti-FOLRl utilizando líneas celulares con un intervalo de niveles de expresión de F0LR1. Para cada línea celular y dilución, se realizó una tinción en triplicado. Se midió y promedió la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) para la expresión de FRA y se muestran en la tabla (error representa el SEM).

Figura 14. Histogramas que muestran la expresión de F0LR1 en las líneas celulares utilizando diluciones óptimas de anticuerpos anti-FOLRl.

Figura 15. Gráfica que muestra la competición entre anticuerpos anti-FOLRl e IMGN853.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método novedoso para detectar el receptor 1 de folato humano (FOLR1) diseminado o FOLR1 en células tumorales circulantes en una muestra de un paciente. El F0LR1 se puede detectar utilizando anticuerpos que no inhiben de forma competitiva la unión de un agente activo anti-FOLRl (por ejemplo, un agente activo que comprende el anticuerpo huMovl9) al FOLR1. Los anticuerpos que no inhiben de forma competitiva la unión de un agente activo anti-FOLRl son especialmente útiles para detectar F0LR1 (por ejemplo, FOLR1 diseminado o FOLR1 en celulas tumorales circulantes) en muestras de pacientes que han sido tratados con el agente activo anti-FOLRl. Se puede utilizar F0LR1 diseminado o F0LR1 en células tumorales circulantes para monitorear o determinar la eficacia terapéutica, o la probabilidad de respuesta al tratamiento de cánceres caracterizados por la sobreexpresión de FOLR1. También se describen los polipéptidos de unión a F0LR1 novedoso, tales como anticuerpos, que son útiles en los métodos de detección de F0LR1 diseminado así como los métodos de detección de F0LR1 adicional (por ejemplo, IHC para ensayos de CTC y FOLR1 asociados a células y unidos a membranas). También se proporcionan polipéptidos y polinucleótidos relacionados, composiciones que comprenden los agentes de unión a FOLR1 y métodos para elaborar los agentes de unión a FOLR1. Además, los métodos proporcionados en la presente se pueden utilizar para la estratificación de los pacientes.

I. Definiciones Para facilitar el entendimiento de la presente invención, se definen a continuación una cantidad de términos y frases.

Los términos "receptor 1 de folato humano", "FOLR1 " o "receptor de folato alfa (FR-a), " tal como se usa en la presente, se refieren a cualquier F0LR1 humano natural, a menos que se indique lo contrario. Por lo tanto, todos estos términos se pueden referir ya sea a una secuencia de ácido nucleico o proteína tal como se indica en la presente. El término "F0LR1 " comprende FOLR1 "de longitud completa" no procesado, así como también cualquier forma de F0LR1 que resulte del procesamiento dentro de la célula. El término también abarca las variantes de FOLR1 que ocurren naturalmente, por ejemplo, variantes de corte y empalme (excepto aquellas variantes que abarcan F0LR2, FOLR3, o FOLR4), variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos F0LR1 descritos en la presente pueden estar aislados de una variedad de fuentes, tal como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o preparados mediante métodos recombinantes o de síntesis. Los ejemplos de secuencias F0LR1 incluyen, de modo no taxativo, los números de referencia NCBI, P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1 y NP_057936.1 La secuencia FOLR1 humana es la siguiente: MAQRMTTQLLLLLVWVAW GEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQ CRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWI QQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPF HFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPW AAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO:49).

Los términos "antígeno diseminado" y "FOLR1 diseminado" se usan de manera intercambiable en la presente. Estos términos se refieren a una proteína F0LR1 que es soluble y que no está asociada a la célula. En algunas modalidades, incluye el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) y el enlazador de glicosilfosfatidilinositol (GPI, por sus siglas en inglés). En una modalidad, el F0LR1 diseminado incluye solo el ECD. El FOLR1 incluye un péptido señal (aminoácidos 1-24), la cadena de proteínas F0LR1 (aminoácidos 25-233 o 234) y un propéptido que se puede escindir (aminoácidos 235 a 257). El FOLR diseminado puede incluir los aminoácidos 1 a 257, 1 a 233, 1 a 234, 25 a 233, 25 a 234 o cualesquiera otros fragmentos de estos. En algunas modalidades, la secuencia señal está escindida. En otras modalidades, la parte de GPI y de ECD puede estar incrustado en una membrana (por ejemplo, una balsa lipídica soluble). En una modalidad, el FOLR1 diseminado puede incluir los aminoácidos 1-233 o un fragmento de estos.

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores, a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en la presente, el término "anticuerpo" comprende anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes de Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos multiespecífíeos tales como anticuerpos biespecífíeos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una parte de determinación del antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede pertenecer a cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de estas (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) de acuerdo a la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada a los que se hace referencia como alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y conocidas. Los anticuerpos pueden estar no conjugados o conjugados con otras moléculas, tales como toxinas, radioisótopos, etc.

En algunas modalidades, un anticuerpo es un anticuerpo de origen no natural. En algunas modalidades, se purifica un anticuerpo a partir de componentes naturales. En algunas modalidades, un anticuerpo es producido de forma recombinante. En algunas modalidades, se produce un anticuerpo mediante un hibridoma.

Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une, tal como F0LR1. En una modalidad determinada, los anticuerpos bloqueantes o antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. De manera ideal, la actividad biológica se reduce en un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso un 100 %.

Los términos "anticuerpo anti-FOLRl" y "un anticuerpo que se une a F0LR1" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unir F0LR1 con suficiente afinidad, de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a FOLR1. El alcance de la unión de un anticuerpo anti-FOLRl a una proteína no F0LR1 no relacionada es menor que alrededor de 10 % de la unión del anticuerpo a FOLR1 tal como se midió, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas modalidades, el anticuerpo que se une a F0LR1 tiene una constante de disociación (Kd) de £1 mM, £100 nM, £10 nM, £1 nM o £0,1 nM. En una modalidad, el anticuerpo anti-FOLRl no se une a FOLR2, F0LR3, FOLR4, o al ácido fólico.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecífíeos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de un población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica la naturaleza del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos discretos. En determinadas modalidades, el anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que une un objetivo, donde la secuencia de polipéptidos de unión al objetivo se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una sola secuencia de polipéptidos de unión al objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tales como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que una secuencia de unión al objetivo seleccionado se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo, para humanizar la secuencia de unión objetivo, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc. y para que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión al objetivo alterado también sea un anticuerpo monoclonal de esta invención. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas ya que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo a través de ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante una variedad de téenicas, que incluyen, por ejemplo, el método hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et ál., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et ál., Antibodies: A Laboratory Manual, (Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed.1988); Hammerling et ál., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4,816,567), tecnología de visualización de fagos (ver, por ejemplo, Clackson et ál., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et ál., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Sidhu et ál., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et ál., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et ál., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), y teenologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen parte o la totalidad de los lugares de inmunoglobulina humana o genes que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et ál., Proc.Nati.Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et ál., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et ál., Year in Immunol.7:33 (1993); patente estadounidense N.° 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et ál., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et ál., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et ál., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son cadenas específicas de inmunoglobulina, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de estas, que contienen secuencias no humanas mínimas (por ejemplo, murinas). Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas donde los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) se reemplazan por residuos de la CDR de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et ál., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et ál., 1988, Nature, 332:323-327; Verhocyen et ál., 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente con la sustitución de residuos adicionales ya sea en la región marco Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para perfeccionar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos o tres, dominios variables que contienen todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas, o sustancialmente todas, las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana de consenso. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de un dominio o región constante de inmunoglobulina (Fe), comúnmente la de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados se describen en la patente estadounidense 5,225,539 o 5,639,641. Los anticuerpos "de revestimiento" generalmente implican la identificación de los residuos de la superficie del marco de la región variable en las cadenas ligeras y en las pesadas, y su reemplazo con equivalentes humanos. Los métodos de los anticuerpos de revestimiento se han proporcionado, por ejemplo, en Roguska et ál., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 91(3):969-973 (1994) y Roguska et ál., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), que se incorporan en su totalidad a la presente mediante referencia.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera consisten cada una en cuatro regiones marco (FR, por sus siglas en inglés) conectadas mediante tres regiones determinantes de co plementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR de cada cadena se mantienen a gran proximidad mediante las FR y, junto a las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de anticuerpos. Existen al menos dos téenicas para determinar CDR: (1) un enfoque basado en variabilidad de secuencia a través de especies (es decir, Kabat et ál. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et ál (1997) J. Molec. Biol . 273:927-948)). Asimismo, algunas veces se usan combinaciones de estos dos enfoques en la técnica para determinar las CDR.

El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et ál., Sequences of Immunological Interest. 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

La numeración de las posiciones de aminoácidos en Kabat se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Al usar este sistema de numeración, la secuencia de aminoácido lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento, o inserción en, una FR o una CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir la inserción de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) luego del residuo 52 de H2 y los residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) luego del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo determinado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia de numeración de Kabat "estándar". Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol . Biol . 196 : 901-917 (1987) ) . El final del bucle CDR-H1 de Chothia, cuando se enumera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 según la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat ubica las inserciones en H35A y H35B; si 35A y 35B no están presentes, el bucle finaliza en 32; si solo 35A está presente, el bucle termina en 33 ; si tanto 35A como 35B están presente, el bucle termina en 34 ) . Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.

. El termino "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a un anticuerpo producido por un humano realizado empleando cualquier téenica conocida en la técnica . Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de estos, y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o cadena ligera humano tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera de murino y polipéptidos de cadena pesada de humano.

El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada corresponde a la región variable de anticuerpos que derivan de una especie de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, a la vez que las regiones constantes son homologas a las secuencias en anticuerpos que derivan de otras (generalmente humanas) para evitar provocar una respuesta inmunitaria en la especie.

Los términos "epítopo" o "determinante antigénico" se usan de manera intercambiable en la presente y se refieren a esa parte de un antígeno capaz de ser reconocida y de unirse específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante plegamiento terciario de una proteína. Generalmente, los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen durante el proceso de desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopos formados a partir de plegamiento terciario generalmente se pierden durante la desnaturalización de la proteína.Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la tensión de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X respecto a su compañera Y puede estar representada generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede calcularse usando métodos comunes conocidos en la téenica, que incluyen los descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad por lo general se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad por lo general se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de unión y cualquiera de ellos puede utilizarse a efectos de la presente invención. En la presente se describen modalidades ilustrativas específicas.

"O mejor", cuando se usa en la presente para referirse a la afinidad de unión, se refiere a una unión más fuerte entre una molécula y su compañero de unión. "0 mejor", cuando se usa en la presente, se refiere a una unión más fuerte representada por un valor Kd numérico menor. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad respecto a un antígeno de "0,6 nM o mejor", la afinidad del anticuerpo para el antígeno es <0,6 nM, es decir, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM etc. o cualquier otro valor menor que 0,6 nM. En una modalidad, la afinidad del anticuerpo tal como lo determina una Kd será entre alrededor de 103 a alrededor de 10~12 M, entre alrededor de 106 a alrededor de 10~ 11 M, entre alrededor de 10~s a alrededor de 10~10M, entre alrededor de 106 a alrededor de 10-9M, entre alrededor de 10~6a alrededor de 108 M, o entre alrededor de 10-6 a alrededor de 10-7 M.

La frase "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", tal como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación) de modo que un experto en la téenica consideraría que la diferencia entre los dos valores es de poca importancia biológica y/o estadística o ninguna dentro del contexto de las características biológicas medidas por los valores (por ejemplo, los valores Kd). La diferencia entre los dos valores es menor que alrededor de 50 %, menor que alrededor de 40 %, menor que alrededor de 30 %, menor que alrededor de 20 o menor que alrededor de 10 % en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparación.

Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se encuentra en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que fueron purificados al grado que ya no se encuentran en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está aislada es sustancialmente pura.

Tal como se usa en la presente, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos 50 % puro (es decir, libre de contaminantes), al menos 90 % puro, al menos 95 % puro, al menos 98 % o al menos 99 % puro.

El término "expresión aumentada" de FOLR1 se refiere a una muestra que contiene niveles elevados de expresión de F0LR1 según se comparó con una muestra de referencia, un nivel de F0LR1 de referencia o un nivel de F0LR1 previo detectado del mismo sujeto. Por lo tanto, por ejemplo, los "niveles de proteína F0LR1 aumentados" en una muestra de paciente pueden tener niveles de proteína F0LR1 que son mayores que los niveles de proteína F0LR1 en una muestra de referencia no cancerosa.

Los "niveles de proteína F0LR1 aumentados" en una muestra de paciente también pueden, por ejemplo, tener niveles de proteína F0LR1 que son iguales a los niveles de proteína F0LR1 en una muestra de cáncer. En algunas modalidades, se detectan "niveles de proteína F0LR1 aumentados" cuando el nivel de proteína F0LR1 de un paciente es al menos alrededor de 5 %, al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 15 %, al menos alrededor de 20 %, o al menos alrededor de 25 %, al menos alrededor de 30 %, o al menos alrededor de 50 % más que, por ejemplo, un nivel F0LR1 previo detectado del mismo sujeto. En ensayos de células tumorales circulantes, los "niveles de proteína F0LR1 aumentados" se pueden referir a muestras en las que se detecta F0LR1 en un porcentaje mayor de células o muestras en las que se detecta FOLR1 en niveles mayores en las células. Por lo tanto, en algunas modalidades, se detectan "niveles de proteína FOLR1 aumentados" en ensayos de CTC donde al menos alrededor de 5 %, al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 15 %, al menos alrededor de 20 %, o al menos alrededor de 25 %, al menos alrededor de 30 %, o al menos alrededor de 50 % más células muestran expresión F0LR1. Además, en algunas modalidades, se detectan "niveles de proteína F0LR1 aumentados" en ensayos de CTC donde al menos alrededor de 5 %, al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 15 %, al menos alrededor de 20 %, o al menos alrededor de 25 %, al menos alrededor de 30 %, o al menos alrededor de 50 % más F0LR1 fue detectado en las células.

Se puede utilizar una "muestra de referencia" para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la invención a partir de una muestra de prueba. Las muestras de referencia pueden ser células (por ejemplo, líneas celulares, sedimentos celulares), fluidos corporales o tejido. Los niveles del F0LR1 en la "muestra de referencia" pueden ser una cantidad absoluta o relativa, un intervalo de cantidad, una cantidad mínima y/o máxima, una cantidad promedio y/o una cantidad mediana de F0LR1. Una "muestra de referencia" también puede servir como punto de referencia de la expresión de F0LR1 con el cual se compara la muestra de prueba. La "muestra de referencia" puede incluir una muestra anterior o muestra de referencia del mismo paciente, una referencia normal, o una referencia de una población de pacientes pertinentes. Generalmente, los niveles FOLR1 se expresan como valores en una curva estándar. Una curva estándar es un método cuantitativo de graficar datos de ensayo para determinar la concentración de F0LR1 en una muestra. En una modalidad, la muestra de referencia es un estándar de antígeno que comprende F0LR1 purificado FOLRl-Fc. Los métodos de diagnóstico de la invención involucran una comparación entre niveles de expresión del F0LR1 en una muestra de prueba y un "valor de referencia" o "nivel de referencia". En algunas modalidades, el valor de referencia es el nivel de expresión del FOLR1 en una muestra de referencia. Un valor de referencia puede ser un valor predeterminado y también se puede determinar a partir de muestras de referencia (por ejemplo, muestras biológicas de control) sometidas a prueba en paralelo con las muestras de prueba. Un valor de referencia puede ser un valor de corte individual,tal coo un valormediano,promedio o un intervalo devalores, tal como un intervalo de confianza. Los valores de referencia se pueden establecer para varios subgrupos de individuos, tales como individuos predispuestos al cáncer, individuos con cáncer en etapa temprana o tardía, individuos masculinos y/o femeninos o individuos sometidos a terapia contra el cáncer. Los ejemplos de muestras o valores de referencia normales o muestras o valores de referencia positivos se describen en la presente.

El término "anticuerpo primario" en la presente se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de la proteína diana en una muestra. Un anticuerpo primario es generalmente el primer anticuerpo utilizado en un ensayo ELISA. En una modalidad, el anticuerpo primario es el único anticuerpo utilizado en un procedimiento IHC. El término "anticuerpo secundario" en la presente se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un anticuerpo primario, formando así un puente entre el anticuerpo primario y un reactivo posterior, si hubiera. El anticuerpo secundario es generalmente el segundo anticuerpo usado en un procedimiento inmunohistoquímico.

Tal como se usa en la presente, la "inmunohistoquímica" se refiere a métodos histoquímicos e inmunológicos utilizados para analizar, por ejemplo, células o tejidos. Por lo tanto, los términos "inmunohistoquímica", "inmunocitoquímica" e "inmunoquímica" se utilizan de manera intercambiable.

Una "muestra" o "muestra biológica" de la presente invención es de origen biológico, en modalidades específicas, tal como de organismos eucariotas. En modalidades preferidas, la muestra es una muestra humana, pero también se pueden usar muestras animales en la práctica de la invención. Las fuentes no taxativas de una muestra para usar en la presente invención incluyen tejido sólido, aspirados de biopsia, ascitis, extractos fluidos, sangre, plasma, suero, líquido raquídeo, linfa, las secciones externas de la piel, de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, tumores, órganos, cultivos celulares y/o constituyentes de cultivos celulares,por ejemplo.Lapresente invención esparticularmente útil para muestras de cáncer que generalmente comprenden fluidos corporales, tal como ascitis, donde la cantidad de material disponible es pequeña. El método se puede utilizar para examinar un aspecto de la expresión del F0LR1 o un estado de una muestra incluyendo, de modo no taxativo, la comparación de diferentes tipos de células o tejidos, la comparación de diferentes etapas de desarrollo y la detección o determinación de la presencia y/o tipo de enfermedad o anormalidad.

Tal como se usa en la presente, el término "reactivo de captura" se refiere a un reactivo capaz de unir y capturar una molécula objetivo en una muestra de modo que en condiciones adecuadas, el complejo reactivo de captura-molécula objetivo se pueda separar del resto de la muestra. En una modalidad, el reactivo de captura está inmobilizado. En una modalidad, el reactivo de captura en un inmunoensayo sándwich es un anticuerpo o una mezcla de diferentes anticuerpos contra un antígeno objetivo.

Tal como se usa en la presente, el término "anticuerpo detectable" se refiere a un anticuerpo que es capaz de ser detectado ya sea directamente a través de una etiqueta amplificada por un medio de detección o indirectamente mediante,por ejemplo, otro anticuerpo que se encuentre etiquetado. Para el etiquetado directo, el anticuerpo normalmente se conjuga con un resto que es detectable mediante algunos medios. En una modalidad, el anticuerpo detectable es un anticuerpo biotinilado.

El término "etiqueta" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo, como para generar un anticuerpo "etiquetado". La etiqueta puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Tal como se usa en la presente, el término "medio de detección" se refiere a un resto o téenica utilizada para detectar la presencia del anticuerpo detectable en el análisis ELISA en la presente e incluye agentes de detección que amplifican la etiqueta inmobilizada como una etiqueta capturada en una placa de microtitulación. En una modalidad, el medio de detección es un agente de detección fluorimétrico tal como avidina o estreptavidina.

Comúnmente, un análisis "ELISA sándwich" emplea las siguientes etapas: (1) la placa de microtitulación se recubre con un anticuerpo de captura; (2) se agrega la muestra y cualquier antígeno presente se une al anticuerpo de captura; (3) se agrega el anticuerpo de detección y se une al antígeno; (4) se agrega el anticuerpo secundario unido a la enzima y se une al anticuerpo de detección; y (5) se agrega el sustrato y es convertido por la enzima hasta obtener una forma detectable.

Por "correlacionar" o "que correlaciona" significa comparar, de cualquier modo, el rendimiento y/o los resultados de un primer análisis con el rendimiento y/o los resultados de un segundo análisis. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis al realizar el segundo análisis y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis para determinar si se debería realizar un segundo análisis y/o se pueden comparar los resultados de un primer análisis con los resultados de un segundo análisis.En una modalidad, la expresión del F0LR1 aumentada se correlaciona con la probabilidad aumentada de la eficacia de una terapia anticáncer dirigida a F0LR1.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen las condiciones fisiológicas en mamíferos donde una población de células se caracteriza por tener un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, de modo taxativo, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más ejemplos particulares de los cánceres incluyen cánceres de origen endotelial, mesenquimal o epitelial, tal como cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de células escamosas, cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, mesotelioma y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo (por ejemplo, peritoneal primario), cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, endometrial (por ejemplo, adenocarcinoma endometrial) o carcinoma uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de la vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, cáncer de cerebro (por ejemplo, glioblastoma, tumores del plexo coroideo) y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, y también tumores de vasos sanguíneos y trompas de falopio. Los cánceres también abarcan cánceres que contienen células que tienen niveles de expresión F0LR1 elevado. Tales cánceres de FOLR1 elevado incluyen, de modo no taxativo, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón microcítico, cáncer uterino, del endometrio, pancreático, renal, pulmonar y de mama.

"Tumor" y "neoplasia" se refieren a cualquier masa de tejido que resulta del crecimiento celular o proliferación excesivos, ya sea benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) que incluye lesiones precancerosas.

Los términos "célula cancerosa", "célula tumoral" y equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células que surgen de un tumor o lesión precancerosa, que incluyen células no tumorigénicas, que comprenden la mayor parte de la población de células tumorales y células madre tumorigénicas (células madre cancerosas). Tal como se usa en la presente, el término "célula tumoral" se modificará por el término "no tumorigénico" cuando se refiere solamente a aquellas células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir aquellas células tumorales de las células madre cancerosas.

El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), que incluye de modo no taxativo, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que será el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable en la presente para hacer referencia a un sujeto humano.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es de forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se le administraría la formulación. La formulación puede ser estéril.

Una "cantidad eficaz" de un anticuerpo tal como se describe en la presente es una cantidad suficiente para realizar un objeto específicamente establecido. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y en una manera rutinaria, en relación al propósito establecido.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis fija" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir la cantidad de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y en una modalidad determinada, detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y en una modalidad determinada, detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento del tumor; aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer; y/o tener como resultado una respuesta favorable tal como la supervivencia libre de evolución aumentada (PFS, por sus siglas en inglés), supervivencia libre de enfermedad (DFS, por sus siglas en inglés), o supervivencia general (OS, por sus siglas en inglés), respuesta completa (CR, por sus siglas en inglés), respuesta parcial (PR, por sus siglas en inglés), o en algunos casos, enfermedad estable (SD, por sus siglas en inglés), una disminución en enfermedad progresiva (PD, por sus siglas en inglés), un tiempo reducido para la evolución (TTP, por sus siglas en inglés), una disminución en CA125 en el caso de cáncer de ovarios, o cualquier combinación de estos. Véase la definición en la presente de "tratar". En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, éste puede ser citoestático y/o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, con dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Comúnmente, aunque no necesariamente, dado que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

PFS, DFS, y OS se pueden medir con normas establecidas por el Instituto Nacional del Cáncer y por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos para la aprobación de nuevos fármacos. Véase Johnson et ál, (2003) J. Clin. Oncol.21(7):1404-1411.

La "supervivencia libre de evolución" (PFS, por sus siglas en inglés) se refiere al tiempo desde la inscripción al estudio hasta la evolución de la enfermedad o la muerte. La PFS generalmente se mide utilizando el método Kaplan-Meier y los estándares 1.1 del criterio de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST, por sus siglas en inglés). Generalmente, la supervivencia libre de evolución se refiere a la situación donde un paciente permanece vivo, sin que el cáncer empeore.

El "tiempo para la evolución del tumor" (TTP, por sus siglas en inglés) se define como el tiempo desde la inscripción al estudio hasta la evolución de la enfermedad. El TTP se mide generalmente utilizando el criterio RECIST 1.1.

Una "respuesta completa" o "remisión completa" o "CR" indica la desaparición de todos los signos de tumor o cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer se curó.

Una "respuesta parcial" o "PR" se refiere a una disminución en el tamaño o el volumen de uno o más tumores o lesiones, o en la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento.

"Enfermedad estable" se refiere a la enfermedad sin evolución o recaída. En la enfermedad estable no hay suficiente encogimiento del tumor para que califique para la respuesta parcial ni un suficiente aumento del tumor para que califique como enfermedad progresiva.

"Enfermedad progresiva" se refiere a la apariencia de una o más lesiones o tumores y/o la evolución inequívoca de lesiones no objetivo existente. La enfermedad progresiva también se puede referir a un crecimiento tumoral de más de 20 por ciento desde que comenzó el tratamiento, ya sea debido a aumentos en la masa o al esparcimiento del tumor.

"Supervivencia sin enfermedad" (DFS, por sus siglas en inglés) se refiere al tiempo durante y posterior al tratamiento por el que el paciente permanece sin enfermedad.

"Supervivencia general" (OS, por sus siglas en inglés) se refiere al tiempo desde la inscripción al estudio del paciente hasta su muerte o se censura en la fecha que se le vio vivo por última vez. La OS incluye una prolongación de la expectativa de vida en comparación con individuos o pacientes sin tratamiento previo. La supervivencia global se refiere a la situación donde un paciente permanece vivo durante un período de tiempo definido, tal como un año, cinco años, etc., por ejemplo, a partir del diagnóstico o tratamiento.

Una "disminución en los niveles CA125" se puede evaluar de acuerdo con las pautas de Gynecologic Cáncer Intergroup (GCIG) [Intergrupo de Cáncer Ginecológico]. Por ejemplo, los niveles CA125 se pueden medir antes del tratamiento para establecer un nivel CA125 de referencia. Los niveles CA125 se pueden medir una o más veces durante o luego del tratamiento, y una reducción en los niveles CA125 en el tiempo en comparación con el nivel de referencia se considera una disminución en los niveles CA125.

Los términos tales como "que trata" o "tratamiento" o "para tratar" o "que alivia" o "para aliviar" se refieren tanto a 1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas y/o detienen la evolución de una afección o trastorno patológico diagnosticado, como a 2) medidas profilácticas o preventivas que evitan y/o desaceleran el desarrollo de una afección o trastorno patológico dirigido. Por lo tanto, las personas que necesitan tratamiento incluyen aquellas que ya padecen el trastorno; las propensas a padecer el trastorno; y aquellas en las cuales se desea evitar el trastorno. En determinadas modalidades, un sujeto es "tratado" exitosamente contra el cáncer de acuerdo con los métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de los siguientes: reducción de caquexia, aumento en tiempo de supervivencia, extensión del tiempo hasta el avance del tumor, reducción de la masa tumoral, reducción de la carga tumoral y/o una prolongación del tiempo de la metástasis tumoral, tiempo de la recidiva tumoral, respuesta tumoral, respuesta completa, respuesta parcial, enfermedad estable, enfermedad progresiva, supervivencia libre de evolución (PFS), supervivencia general (OS), cada una según se midieron por los estándares establecidos por el Instituto Nacional del Cáncer y la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos para la aprobación de nuevos fármacos. Véase Johnson et ál, (2003) J. Clin. Oncol.21(7):1404-1411.

Los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico", tal como se utilizan de manera intercambiable en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante polimerasa de ADN o ARN. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede transmitir antes o después del montaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente luego de la polimerización, por ejemplo, mediante conjugación con un componente de marcado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "casquetes", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones de internucleótidos, tal como, por ejemplo, los que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.); los que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.); los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralén, etc.); los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, borón, metales oxidativos, etc.); los que contienen alquiladores; los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.); así como formas no modificadas de uno o más polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes comúnmente en los azúcares se puede reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o conjugar con soportes sólidos. El OH del extremo 5' o 3' se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos orgánicos del grupo casquete de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en la téenica, que incluyen, por ejemplo, 2'-O-metilo-, 2'-0-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como, arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos, tales como, ribósido de metilo. Se puede reemplazar uno o más enlaces de fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, de modo no taxativo,modalidades donde el fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ( "amidato"), P (0)R, P(0)0R', C0 o CH2 ( "formacetal"), donde cada R o R' es independientemente H o un alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace de éter (--O--), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No necesariamente todos los enlaces en un polinucleótido son idénticos. La descripción que antecede aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en la presente, incluyendo ARN y ADN.

El término "vector" se refiere a una construcción que es capaz de entregar y expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, de modo no taxativo, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN no conjugado, vectores plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y determinadas células eucariotas, tal como células productoras.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente y se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede ser interrumpido por no aminoácidos. Asimismo los términos comprenden un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la téenica. Se entiende que debido a que los polipéptidos de la presente invención se basan en anticuerpos, en determinadas modalidades, los polipéptidos pueden ocurrir como cadenas simples o cadenas asociadas. En algunas modalidades, un polipéptido, péptido o proteína es de origen no natural. En algunas modalidades, un polipéptido, péptido o proteína es purificado a partir de otros componentes de origen natural. En algunas modalidades, un polipéptido, péptido o proteína se produce de forma recombinante.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de nucleótidos o de residuos aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo brechas, si fuera necesario) para máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservativa de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En la téenica se conocen varios algoritmos y software que se pueden usar para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Uno de estos ejemplos no taxativos de un algoritmo de alineamiento de secuencia es el algoritmo descrito en Karlin et ál, 1990, Proc . Nati . Acad. Sci . , 87:2264-2268, según modificación en Karlin et ál., 1993, Proc. Nati . Acad. Sci . , 90:5873-5877e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et ál., 1991, Nucleic Acids Res . , 25:3389-3402). En determinadas modalidades, Gapped BLAST se puede usar tal como se describe en Altschul et ál., 1997, Nucleic Acids Res . 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et ál., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son otros programas de software públicamente disponibles que se pueden usar para alinear secuencias. En determinadas modalidades, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en software GCG (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70 o 90 y un peso de longitud del, 2, 3, 4, 5o6). En determinadas modalidades alternativas, el programa GAP en el paquete de software GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol . Biol . (48):444-453 (1970)) se puede usar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, usando o bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). De manera alternativa, en determinadas modalidades, el porcentaje de identidad entre el nucleótido o las secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede determinar usando el programa ALIGN (versión 2.0) y usar un PAM120 con tabla de residuo, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4. Un experto en la téenica puede determinar los parámetros apropiados para una máxima alineamiento por software de alineamiento particular. En determinadas modalidades, se usan los parámetros por defecto de software de alineamiento. En determinadas modalidades, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos con respecto a un aminoácido de segunda secuencia se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es la cantidad de residuos de aminoácidos clasificados como coincidencias idénticas en la alineamiento de la primera y la segunda secuencia (tal como se alinean por inspección visual o un programa de alineamiento de secuencia particular) y Z es la cantidad total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia respecto a la segunda secuencia será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia respecto a la primera secuencia.

A modo de ejemplo no taxativo, si algún polinucleótido particular tiene determinado porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es de al menos 80 % idéntica, al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica y en algunas modalidades, al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica) con respecto a una secuencia de referencia puede determinarse, en determinadas modalidades, usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan de forma tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótido de referencia y se permiten brechas en la homología de hasta 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.

En algunas modalidades, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90% y en algunas modalidades al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de nucleótidos o de residuos de aminoácidos al compararlos y alinearlos para obtener una máxima correspondencia, tal como se miden utilizando un algoritmo de comparación de secuencia o mediante inspección visual. En determinadas modalidades, existe identidad en una región de las secuencias que es de al menos 10, alrededor de 20, alrededor de 40-60 residuos de longitud o cualquier valor entero intermedio, o puede ser en una región más larga que 60-80 residuos, al menos alrededor de 90-100 residuos o las secuencias son sustancialmente idénticas en la longitud completa de las secuencias que se comparan, tal como la región codificante de una secuencia de nucleótidos por ejemplo.

Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una en la que un residuo de aminoácido se remplaza por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la téenica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, U sina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservativa. En determinadas modalidades, las sustituciones conservadoras en las secuencias de polipéptidos y anticuerpos de la invención no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos a uno o más antígenos, es decir, el FOLR1 al que se une el polipéptido o anticuerpo. Se conocen en la téenica métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno (véase, por ejemplo, Brummell et ál., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et ál. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999) y Burks et ál. Proc . Nati . Acad. Sci . USA 94:.412-417 (1997)).

Tal como se usa en la presente descripción y reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Se entiende que donde sea que se describan las modalidades en la presente con la expresión "comprende", también se proporcionan las modalidades análogas descritas en términos de "consiste en" y/o "consiste esencialmente en".

El término "y/o" tal como se usa en una frase tal como "A y/o B" en la presente pretende incluir: tanto "A y B", "a o B", "A" y "B". Asimismo, el término "y/o" como se usa en la frase tal como "A, B y/o C" pretende comprender cada una de las siguientes modalidades: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo) y C (solo).

II. Ensayo de antígeno diseminado El conjugado de anticuerpo y maitansinoide (AMC, por sus siglas en inglés), IMGN853, comprende el anticuerpo monoclonal de unión a F0LR1, huMovl9 (M9346A), conjugado al maitansinoide, DM4 (N(2')-deacetil-N2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)- aitansina), unido a través del enlazador sulfo-SPDB (N-succinimidil 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato) escindible. IMGN853 y huMovl9 se describen en la publicación de solicitud estadounidense pendiente n.° 2012/0009181, que se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia. El antígeno F0LR1 contiene un solo epítopo reconocido por Movl9. En una modalidad, el anticuerpo huMovl9 comprende las cadenas pesada y ligera con las siguientes secuencias: SEQ ID NO:46: huMovl9 vHC QVQLVQSGAEW KPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGR1HPYDGDTFYN QKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:47 - huMovl9 vLCvl.00 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR SEQ ID NO : 48 huMovl9 vLCvl.60 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR.

En algunas modalidades, un agente activo anti-FOLRl tal como IMGN853 modula la actividad de F0LR1, por ejemplo, disminuye la actividad de la proteína FOLR1.

IMGN853 se encuentra actualmente en desarrollo clínico para varias indicaciones terapéuticas que incluyen cáncer de ovarios con FOLR1 positivo, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer endometrial, cáncer renal y otras neoplasias malignas epiteliales. El cáncer de ovario exhibe la mayor penetración de FOLR1 y se considera la mayor indicación para el tratamiento con IMGN853 (Antony AC. Ann Rev Nutr 16:501-21 (1996); Yuan Y et ál. Hum Pathol 40(10):1453-1460 (2009)).

Medir los niveles de antígeno en circulación en muestras de plasma de pacientes (antígeno diseminado) puede ayudar a identificar las poblaciones de pacientes con mayor probabilidad de responder al tratamiento con AMC. Se ha informado que los niveles altos de antígeno diseminado afectan de forma marcada la farmacocinética de los anticuerpos terapéuticos (Tolcher A. et ál. 20th Symposium on Molecular Targets and Cáncer Therapeutics; octubre 21-24, 2008; Génova, Suiza: EORTC-NCI-AACR, pl63, #514; Baselga J, et ál. J Clin Oncol 14:737-744 (1996)). Es probable que los niveles de antígeno diseminado de las muestras de plasma de pacientes sea variable dependiendo de factores tales como objetivo del antígeno, indicaciones de la enfermedad y curso de la enfermedad. Los niveles de antígeno diseminado actualmente en indicaciones de enfermedad para IMGN853 han sido examinados de forma insuficiente mientras que la correlación con la expresión del tumor sólido es limitada. Mientras que se ha informado la elevación de FOLR1 en adenocarcinomas de ovarios, los datos sugieren que no está elevado en otras indicaciones de tumor F0LR1+, tal como carcinoma de pulmón de células pequeñas (Mantovani LT, et ál. Eur J Cáncer 30A(3):363-9 (1994); Basal E, et ál. PLoS ONE 4(7): e6292 (2009)). El presente método permite la detección del receptor F0LR1 en la presencia de ácido fólico alto. Ensayos anteriores han utilizado Movl9 en el diseño del ensayo. Dado que IMGN853 contiene Movl9 y en una modalidad es la terapia objetivo de la invención, es vital que el método detecte F0LR1 en presencia o ausencia de Movl9 en modalidades donde IMGN853 se administra antes de la detección de F0LR1. Ensayos anteriores que utilizan Movl9 tienen efectos competitivos y detectarán considerablemente menos F0LR1 o nada en pacientes que reciben el tratamiento IMGN853 En una modalidad, el presente método para detectar F0LR1 en muestras de fluido de fuente humana utiliza un formato de análisis de ELISA sándwich tradicional (Figura 1). En una modalidad, el método utiliza un agente de captura (es decir, anticuerpo, otra proteína) para FOLR1 junto a un soporte sólido. En una modalidad, el soporte sólido es una placa de microtitulación. A esto se agrega la muestra (fluidos de ascitis, sangre, suero, plasma, etc.) sin dilución, y se detecta por un agente de detección diferente (un anticuerpo o proteína diferente) que no interfiere con la unión del primer agente de captura. El agente de detección luego se detecta a través del uso de un agente de detección secundario (biotina / estreptavidina, anticuerpos mono o policlonales anti-humanos, etc.) que pueden unirse más de una vez al primer agente de detección, por lo tanto amplificando la señal de detección. Luego se cuantifica el agente de detección secundario mediante el uso de algunos otros medios (por ejemplo, TMB/peroxidasa, conteo de escintilación, sondas fluorescentes, etc.). De manera adicional, el ensayo detecta F0LR1 y no es impactado de forma negativa por la presencia de Movl9, IMGN853, otros miembros de la familia F0LR1 o ácido fólico.

Los ensayos de la presente invención incluyen ensayos para seleccionar pacientes susceptibles de recibir terapia a base de F0LR1 y ensayos para monitorear la respuesta del paciente. Los ensayos para la predicción de la respuesta se realizan antes de la selección de la terapia, y los niveles de F0LR1 diseminado pueden impactar las decisiones de la terapia. Para monitorear la respuesta del paciente, el ensayo se realiza al comienzo de la terapia para establecer los niveles del punto de referencia (o predeterminado) de F0LR1 en la muestra. La misma muestra luego se ensaya y los niveles de FOLR1 se comparan al punto de referencia o a los niveles predeterminados. Tal como se usa en la presente, el término "nivel predeterminado" generalmente se refiere a un valor de detención de ensayo que se utiliza para evaluar los resultados diagnósticos al comparar los resultados del ensayo con el nivel predeterminado, y donde el nivel predeterminado ya se ha asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, monitorear si un sujeto que se está tratando con un fármaco ha alcanzado un nivel de sangre eficaz del fármaco, monitoreando la respuesta de un sujeto que recibe tratamiento para el cáncer con un fármaco anticáncer, monitorear la respuesta de un tumor en un sujeto que recibe el tratamiento para el tumor, etc.). El nivel predeterminado puede ser un valor absoluto o un valor normalizado al sustraer el valor obtenido de un paciente antes del comienzo de la terapia. Un ejemplo de un nivel predeterminado que se puede utilizar es un nivel de referencia obtenido de uno o más sujetos que puede opcionalmente estar sufriendo de una o más enfermedades o afecciones. La comparación (o análisis informacional) del nivel del biomarcador ensayado con el nivel predeterminado de referencia se puede realizar por un sistema automatizado, tal como un programa de software o sistema de inteligencia que es parte o es compatible con el equipo (por ejemplo, una plataforma de computadora) sobre la cual se lleva a cabo el ensayo. De manera alternativa, esta comparación o el análisis informacional puede ser realizado por un doctor. En una modalidad, donde los niveles siguen iguales o disminuyen, la terapia puede ser eficaz y se puede continuar. Cuando ocurre un aumento considerable sobre el nivel de referencia (o nivel predeterminado), el paciente puede que no esté respondiendo. En otra modalidad, un aumento en los niveles de F0LR1 diseminados puede ser indicativo de muerte celular aumentada y liberación aumentada del FOLR1 diseminado. En esta modalidad, un aumento en el F0LR1 diseminado indica la eficacia terapéutica. Por consiguiente, en algunas modalidades, se mide el FOLR1 diseminado y se mide la muerte celular. En la téenica se conocen los ensayos para medir la muerte celular e incluyen, por ejemplo, la detección del antígeno M30 (citoqueratina escindida con caspasa), marcadores del daño en el ADN tal como g-H2AC, o características morfológicas de células tales como núcleos teñidos con DAPI fragmentados y/o condensados.

Los ensayos de la presente invención pueden ser realizados por cualesquiera métodos de ensayo de proteínas. Los métodos de ensayo de proteínas útiles en la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos de inmunoensayo que implican la unión de un anticuerpo o proteína específico etiquetado o no etiquetado a la proteína o fragmento de F0LR1 expresada. Métodos de inmunoensayos útiles incluyen ambos ensayos de fase de solución que se llevan a cabo utilizando cualquier formato conocido en la técnica, tal como, de modo no taxativo, Biacore, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET, por sus siglas en inglés), un formato ELISA, (sándwich, inhibición competitiva hacia adelante y hacia atrás) o un formato de polarización de fluorescencia, y ensayos de fase sólida tal como inmunohistoquímica. Los agentes de unión F0LR1 proporcionados más adelante son particularmente útiles para estos métodos de inmunoensayo.

III. Agentes de unión a F0LR1 La presente invención proporciona agentes que se unen específicamente a FOLR1 humano. A estos agentes se los denomina en la presente "agentes de unión a FOLRl".

Los agentes de unión a FOLRl incluyen agentes de unión a FOLRl que comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de muFRl-9, muFRl-13, muFRl-53, muFRl-62, y muFRl-64. Las secuencias de CDR muFRl-9, muFRl-13, muFRl-53 y muFRl-62 se describen en las Tablas 1 y 2 a continuación.

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada variable Tabla 2:Secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera variable Las moléculas de unión a FOLR1 pueden ser anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que se unen específicamente a FOLR1 que comprenden las CDR de muFRl-9, muFRl-13, muFRl-53, muFRl-62, o muFRl-64 con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones conservadoras de aminoácidos por CDR.

Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas ligeras variables o cadenas pesadas variables individuales que se describen en la presente. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender una cadena ligera variable y una cadena pesada variable. Las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable de anticuerpos de muFRl-9, muFRl-13, muFRl-53 y muFRl-62 murinos se proporcionan en las Tablas 3 y 4, a continuación.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de cadena ligera variable También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:25-28; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:29-32. En determinadas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 96 %, al menos alrededor de 97 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:25-32. Por lo tanto, en determinadas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:25-28, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 95 de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:29-32. En determinadas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:25-28; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29-32. En determinadas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente a F0LR1. En determinadas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo urino, quimérico o humanizado que se une específicamente a F0LR1 . En determinadas modalidades, el polipéptido que tiene determinado porcentaje de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:25-32 difiere de las SEQ ID NO:25-32 solo por sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Los polipéptidos pueden comprender una de las cadenas ligeras o cadenas pesadas individuales que se describen en la presente. Los anticuerpos y polipéptidos también pueden comprender una cadena ligera y una cadena pesada. Las secuencias de cadena ligera y cadena variable de anticuerpos de muFRl-9, muFRl-13, muFRl-53 y muFRl-62 murinos se proporcionan en las Tablas 5 y 6, a continuación.

Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de cadena pesada de ongitud completa Tabla 6: Secuencias de aminoácidos de cadena ligera de longitud completa También se proporcionan polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33-36; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:37-40. En determinadas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 96 %, al menos alrededor de 97 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33-40. Por lo tanto, en determinadas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33-36, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos alrededor de 95 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:37-40. En determinadas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:33-36; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37-40. En determinadas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une específicamente a F0LR1. En determinadas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo urino, quimérico o humanizado que se une específicamente a F0LR1. En determinadas modalidades, el polipéptido que tiene determinado porcentaje de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:33-40 difiere de las SEQ ID NO:33-40 solo por sustituciones de aminoácidos conservadoras.

La afinidad o avidez de un anticuerpo para un antígeno se puede determinar de forma experimental utilizando cualquier método adecuado conocido en la téenica, por ejemplo, citometría (que incluye citometría de flujo), ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA), o cinética (por ejemplo, análisis de espectroscopia de resonancia de plasmones de superficie (BIACORE™). Se pueden emplear fácilmente los ensayos de unión directa así como los formatos de ensayo de unión competitiva. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et ál., "Interacciones anticuerpo-antígeno, " In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, N.Y. (1992); y los métodos descritos en la presente. La afinidad medida de una interacción de anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH, temperatura). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (por ejemplo, KD o Kd, Kon, Koff) se realizan con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un amortiguador estandarizado, tal como se conoce en la téenica y tal como el amortiguador se describe en la presente.

En un aspecto, los ensayos de unión se pueden realizar utilizando citometría (por ejemplo, citometría de flujo) sobre las células que expresan el antígeno F0LR1 en la superficie. Por ejemplo, las células F0LR1 positivas tales como SKOV3 fueron incubadas con concentraciones variadas de anticuerpos anti-FOLRl utilizando 1 x 105 células por muestra en 100 mL de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2 %). Luego, las células se sedimentaron, se lavaron e incubaron durante 1 hora con 100 pL de anticuerpo IgG de cabra-antihumano o cabra-antirratón conjugado con FITC (el cual se obtiene de, por ejemplo, Jackson Laboratory, 6 pg/mL en amortiguador FACS). Las células se sedimentaron una vez más, se lavaron con amortiguador FACS y se suspendieron nuevamente en 200 ml de PBS que contenía formaldehído al 1 %. Las muestras se adquirieron, por ejemplo, utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillos de HTS y se analizó utilizando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EUA). Para cada muestra la intensidad media de fluorescencia para FL1 (MFI, por sus siglas en inglés) se exportó y se gráfico con la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica para generar una curva de unión. Se coloca una curva de dosis-respuesta sigmoidal para las curvas de unión y los valores EC50 se calculan utilizando programas tales como GraphPad Prism v4 con parámetros por defecto (GraphPad software, San Diego, CA). Los valores EC50 se pueden utilizar como una medida para la constante de disociación evidente "Kd" o "KD" para cada anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Usando el método de hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal hospedador adecuado, tal como se describe anteriormente para obtener la producción de linfocitos de anticuerpos que se unirá específicamente a un antígeno inmunizante. Los linfocitos también se pueden inmunizar in vitro. Luego de la inmunización, los linfocitos se aíslan y fusionan con una línea celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, polietilenglicol, para formar células de hibridoma que luego se pueden seleccionar de las células de mieloma y linfocitos no fusionados. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno seleccionado según se determina por inmunoprecipitación, inmunotransferencia o por un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)) se pueden propagar en cultivo in vi tro usando métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 1986) o en in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales luego se pueden purificar a partir del medio de cultivo o fluido de ascitis tal como se describe para los anticuerpos policlonales.

De manera alternativa, los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer usando métodos de ADN recombinante tal como se describe en la patente estadounidense 4,816,567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aíslan de linfocitos B o células de hibridoma, tal como por RT-PCR usando cebadores de oligonucleótidos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, y su secuencia se determina usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas ligera y pesada se clonan en vectores de expresión adecuados que cuando se transfectan en células hospedadoras, tales como las células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otra forma no producen proteína de inmunoglobulina, las células hospedadoras producen anticuerpos monoclonales.Además, los anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de estos de las especies deseadas se pueden aislar de las bibliotecas de expresión de fagos que expresan CDR de las especies deseadas, como se describe (McCafferty et ál., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et ál., 1991, Nature, 352:624-628; y Marks et ál., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se pueden modificar aun más de distintas maneras usando teenología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas modalidades, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón se puede sustituir 1) por las regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) por un polipéptido no inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas modalidades, las regiones constantes se truncan o se eliminan para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Se puede usar mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.

En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal contra F0LR1 de humano es un anticuerpo humanizado. En determinadas modalidades, los anticuerpos se utilizan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas del HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administra a un sujeto humano.

Los métodos para diseñar, humanizar o revestir anticuerpos no humanos y humanos también se pueden utilizar y son conocidos en la téenica. Un anticuerpo humanizado, revestido o diseñado similarmente puede tener uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que no es humana, por ejemplo, de modo no taxativo, de ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos no humanos son reemplazados por residuos que usualmente son denominados residuos de "importación", que son típicamente tomados de una constante, variable de "importación" u otro domino de una secuencia humana conocid .

Las secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o para reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, semivida y cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en influenciar la unión al F0LR1. Por consiguiente, parte o la totalidad de las secuencias CDR humanas o no humanas se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones constante y variable se pueden reemplazar con aminoácidos humanos u otros.

Opcionalmente los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados, revestidos, diseñados o humanos diseñados con retención de alta afinidad para el antígeno F0LR1 y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos anti-FOLRl diseñados o humanizados (o humanos) y los anticuerpos revestidos se pueden preparan opcionalmente mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados y diseñados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias originales, diseñadas y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son conocidos para los expertos en la téenica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran estructuras de conformación tridimensional probables de secuencias de inmunoglobulina candidata seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del posible rol de los residuos en la función de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unir su antígeno, tal como F0LR1. De esta forma, los residuos de marco (FR) se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias de consenso e importadas, de forma tal que se logre la característica del anticuerpo deseada, tal como una mejor afinidad por el o los antígenos diana.

La humanización, revestimiento o diseño de de la presente invención se puede realizar utilizando cualquier método conocido, tal como y de modo no taxativo aquellos descritos en Winter (Jones et ál., Nature 321:522 (1986); Riechmann et ál., Nature 332:323 (1988); Verhocyen et ál., Science 239:1534 (1988)), Sims et ál., J. Immunol.151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.196:901 (1987), Cárter et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et ál., J. Immunol. 151:2623 (1993), Roguska et ál., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91 (3):969-973 (1994), Roguska et ál., Protein Eng.9(10):895-904 (1996), patente estadounidense N.° 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; y 7,342,110, cada una de las cuales se incorpora totalmente a la presente mediante referencia, que incluye las referencias citadas allí.

En determinadas modalidades alternativas, el anticuerpo a FOLR1 es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente usando diversas téenicas conocidas en la técnica. Se pueden generar linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (ver por ejemplo, Colé et ál., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et ál., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; y la patente estadounidense 5,750,373). Además, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, cuando la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos, como se describe, por ejemplo, en Vaughan et ál., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et ál., 1998, Proc. Nat'1. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, y Marks et ál., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las téenicas para la generación y uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos también se describen en las patentes estadounidenses Nos. 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484 y 7,264,963; y Rothe et ál., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018 (cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia). Las estrategias de maduración de la afinidad y las estrategias de transposición de cadena (Marks et ál., 1992, Bio/Technology, 10:779-783, que se incorpora en su totalidad mediante esta referencia), son conocidas en la técnica y pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.

Los anticuerpos humanizados también se pueden producir en ratones transgénicos que contienen lugares de inmunoglobulina humana que, tras la inmunización, pueden producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 y 5,661,016.

Esta invención también abarca anticuerpos biespecíficos que reconocen específicamente un receptor 1 de folato humano. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos capaces de reconocer específicamente y unirse a al menos dos epítopos distintos. Los distintos epítopos pueden estar dentro de la misma molécula (por ejemplo, el mismo receptor 1 de folato humano) o en distintas moléculas de modo que, por ejemplo, los anticuerpos puedan reconocer y unirse específicamente a un receptor 1 de folato humano así como, por ejemplo, 1) una molécula efectora en un leucocito, tal como un receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD3) o receptor Fe (por ejemplo, CD64, CD32 o CD16) o 2) un agente citotóxico, como se describe en detalle a continuación.

Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos distintos, de los cuales al menos uno se origina en un polipéptido de la invención. De manera alternativa, un grupo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un grupo que se une a una molécula activadora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores Fe para IgG de modo de enfocar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecífíeos también se pueden utilizar para dirigir los agentes citotóxicos a las células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un grupo de unión al antígeno y un grupo que se une a un agente citotóxico o a un quelante radionucleido, tales como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Las téenicas para crear anticuerpos biespecíficos son comunes en la técnica (Millstein et ál., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et ál., 1985, Science 229:81; Suresh et ál, 1986, Methods in Enzymol.121:120; Traunecker et ál., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et ál., 1992, J. Exp. Med.175:217-225; Kostelny et ál., 1992, J. Immunol.148:1547-1553; Gruber et ál., 1994, J. Immunol. 152:5368; y patente estadounidense 5,731,168). También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos (Tutt et ál., J. Immunol.147:60 (1991)). Por lo tanto, en determinadas modalidades, los anticuerpos a F0LR1 son multiespecíficos.

En determinadas modalidades, se proporciona un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la penetración del tumor. Se conocen varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan por medio de digestión proteolíltica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et ál., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et ál., 1985, Science, 229:81). En determinadas modalidades, los fragmentos de anticuerpo se producen de manera recombinante. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv se pueden expresar en y secretar a partir de E. coli u otras células hospedadoras, permitiendo así la producción de grandes cantidades de estos fragmentos los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo discutidas anteriormente. El fragmento de anticuerpo también puede ser anticuerpos lineales tal como se describe en la patente estadounidense 5,641,870, por ejemplo, y puede ser monoespecífico o biespecífico. Otras téenicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el practicante capacitado.

De acuerdo con la presente invención, se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple específicos para el receptor 1 de folato humano (ver, patente estadounidense N.° 4,946,778). Además, los métodos se pueden adaptar para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse et ál., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir una identificación rápida y eficaz de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para un receptor 1 de folato o los derivados, fragmentos, análogos u homólogos de estos. Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir mediante métodos en la técnica que incluyen, de modo no taxativo: (a) un fragmento F(ab')2 producido por digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado mediante reducción de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2, (c) un fragmento Fab generado mediante el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (d) fragmentos Fv.

Adicionalmente se puede desear, en especial en el caso de los fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo para aumentar su semivida sérica. Esto también puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor de salvamento al fragmento de anticuerpo mediante la mutación de la región adecuada en el fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en una etiqueta peptídica que luego se fusiona con el fragmento de anticuerpo en cualquiera de los extremos o en el medio (por ejemplo, mediante síntesis de ADN o peptídica).

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto que los anticuerpos, por ejemplo, dirijan células inmunes a células no deseadas (patente estadounidense N.° 4,676,980). Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, que incluyen los que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados a estos efectos incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

A los efectos de la presente invención, debe entenderse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que facilita la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de una F0LR1 humana. En este sentido, la región variable puede comprender o derivar de cualquier tipo de mamífero al que se puede inducir para que fije una respuesta humoral y genere inmunoglobulinas contra el antígeno asociado al tumor deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, de primate no humano (por ejemplo, monos cinomolgos, macacos, etc.) o lupino. En algunas modalidades, tanto las regiones variables como las constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras modalidades, las regiones variables de anticuerpos compatibles (en general derivadas de una fuente no humana) se pueden diseñar o adaptarse específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. En lo que a esto respecta, las regiones variables útiles en la presente invención se pueden humanizar o alterar de otro modo a través de la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.

En determinadas modalidades, los dominios variables tanto en la cadena pesada como en la ligera están alterados por el reemplazo al menos parcial de una o más CDR y, de ser necesario, por el reemplazo parcial de la región marco y modificación de la secuencia. Aunque las CDR pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso de una subclase que el anticuerpo a partir del cual derivan las regiones marco, se prevé que las CDR derivarán de un anticuerpo de una clase diferente y en determinadas modalidades de un anticuerpo de una especie diferente. Puede no ser necesario reemplazar todas las CDR por las CDR completas de la región variable donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. En cambio, solo puede ser necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión al antígeno. Dadas las explicaciones proporcionadas en las patentes estadounidenses No.5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762, será competencia de aquellos expertos en la téenica, ya sea realizando experimentos de rutina o mediante el método de prueba y error, obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.

A pesar de las alteraciones a la región variable, los expertos en la técnica entenderán que los anticuerpos modificados de la presente invención comprenderán los anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos de longitud completa o los fragmentos inmunorreactivos de estos) en los que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante han sido eliminados o de otro modo alterados para proporcionar las características bioquímicas deseadas, tales como el aumento de la ubicación del tumor o la reducción de la semivida sérica cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante natural o inalterada. En algunas modalidades, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con la presente invención comprenden adiciones, supresiones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados descritos en la presente pueden comprender alteraciones o modificaciones a uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o al dominio constante de cadena ligera (CL). En algunas modalidades, se contemplan regiones constantes modificadas donde uno o más dominios se suprimen parcial o totalmente. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados comprenderán construcciones o variantes con el dominio eliminado donde se eliminó todo el dominio de CH2 (construcciones de CH2). En algunas modalidades, el dominio de región constante omitido se reemplazará con un espaciador de aminoácidos corto (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona parte de la flexibilidad molecular típicamente impartida por la región constante ausente.

Se observará que en determinadas modalidades, los anticuerpos modificados se pueden modificar para que fusionen el dominio CH3 directamente con la región bisagra de los anticuerpos modificados respectivos. En otras construcciones, puede ser deseable proporcionar un espaciador de péptido entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, se podrían expresar construcciones compatibles donde se ha suprimido el dominio CH2 y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos, el espaciador se puede agregar, por ejemplo, para asegurar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Sin embargo, cabe destacar que los espaciadores de aminoácidos pueden resultar, en algunos casos, inmunogénicos y pueden desencadenar respuestas inmunitarias no deseadas contra la construcción. Por consiguiente, en determinadas modalidades, cualquier espaciador que se agregue a la construcción será relativamente no inmunogénico, o incluso se omitirá por completo, de manera de que mantenga las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos modificados.

Aparte de la supresión total de los dominios de región constante, se reconocerá que los anticuerpos de la presente invención se pueden proporcionar mediante la supresión o sustitución parcial de unos pocos aminoácidos o incluso un único aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente como para reducir de manera sustancial la unión de Fe y de esa manera aumentar la ubicación del tumor. De modo similar, puede ser deseable eliminar simplemente esa parte de uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, unión de complemento C1Q) que se va a modular. Las supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (semivida sérica) mientras se dejan otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante del sujeto intactas. Asimismo, tal como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos se pueden modificar mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos, que mejoran el perfil de la construcción resultante. En este sentido, puede ser posible la interrupción de la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, la unión de Fe) mientras se mantienen de manera sustancial la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Determinadas modalidades pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables, tales como la disminución o el incremento de la función efectora o para proporcionar más uniones de citotoxinas o carbohidratos. En las modalidades, puede ser deseable la inserción o replicación de secuencias específicas derivadas de los dominios de regiones constantes seleccionados.

La presente invención además abarca variantes y equivalentes que son básicamente homólogos con los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, o fragmentos de anticuerpo de estos, establecidos en la presente. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativa, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por medio de aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Se conoce bien en la téenica lo que se pretende con una sustitución conservativa de un aminoácido.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento de este, contra una F0LR1 humano. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de la invención pueden variarse sin efecto significativo de la estructura o función de la proteína. Por lo tanto, la invención incluye además variaciones de los polipéptidos que muestran actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, o fragmento de este, contra la proteína del receptor de folato humano. los mutantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones de tipo.

Los polipéptidos y análogos se pueden modificar adicionalmente para contener restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la proteína. Estos restos derivados pueden mejorar la solubilidad, la semivida biológica o la absorción de la proteína. Los restos también pueden reducir o eliminar todo efecto secundario deseable de las proteínas y similares. Un resumen de los restos se puede encontrar en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20.a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

Los polipéptidos aislados descritos en la presente se pueden producir mediante cualquier método adecuado conocido en la téenica, los métodos oscilan entre métodos sintéticos de proteína directos hasta construir una secuencia de ADN que codifica secuencias de polipéptido aislado y que expresa las secuencias en un hospedador transformado adecuado. En algunas modalidades, se construye una secuencia de ADN utilizando tecnología recombinante al aislar o sintetizar una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo salvaje de interés. Opcionalmente, la secuencia se puede mutagenizar por medio de mutagénesis específica del sitio para proporcionar análogos funcionales de esta. Ver, por ejemplo, Zoeller et ál., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 81:5662-5066 (1984) y patente estadounidense No.4,588,585.

En algunas modalidades, se podría construir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés mediante síntesis química utilizando un sintetizador de oligonucleótidos. los oligonucleótidos se pueden diseñar de acuerdo con la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y al seleccionar estos codones que son favorecidos en la célula hospedadora en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden emplear métodos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, una secuencia completa de aminoácidos puede ser utilizada para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado en particular. Por ejemplo, se pueden sintetizar y luego ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifican partes del polipéptido deseado. Típicamente, los oligonucleótidos individuales contienen 5' o 3' excedentes para ensamblaje adicional.

Una vez ensamblados (por medio de síntesis, mutagénesis dirigida al sitio u otro método) , las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de expresión adecuada para la expresión de la proteína en un hospedador deseado. Se puede confirmar el ensamblaje adecuado por medio de secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedador adecuado. Tal como se conoce en la téenica, para obtener niveles elevados de expresión de un gen transfectado en un hospedador, el gen debe encontrarse operativamente unido a las secuencias de control de expresión de transcripción y traducción que son funcionales en el hospedador de expresión elegido.

En determinadas modalidades, se utilizan vectores de expresión recombinante para amplificar y expresar los anticuerpos que codifican ADN, o fragmentos de estos, contra F0LR1 humano. Los vectores de expresión recombinante son construcciones reproducibles de ADN que tienen fragmentos de ADN sintético o derivados de ADNc que codifican una cadena de polipéptido de un anticuerpo anti-FOLRl, o fragmento de este, unido operativamente a elementos adecuados de regulación de transcripción o traducción que derivan de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. En general, una unidad de transcripción comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que desempeñan un rol regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores de transcripción, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en una proteína y (3) secuencias adecuadas de iniciación y terminación de transcripción y traducción, tal como se describe detalladamente a continuación los elementos de regulación pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripción. Asimismo se puede incorporar adicionalmente la capacidad de replicarse en un hospedador, normalmente otorgada por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformadores. Las regiones de ADN se encuentran "unidas operativamente" cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido de señal (líder de secreción) se encuentra operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a un ribosoma se encuentra operativamente unido a una secuencia codificante si se encuentra ubicado como para permitir la traducción. Los elementos estructurales destinados a ser utilizados en los sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de proteínas traducidas por una célula hospedadora. De manera alternativa, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Opcionalmente el residuo se puede escindir posteriormente a partir de la proteína de expresión recombinante para proporcionar un producto final.

La elección de secuencia de control de expresión y vector de expresión dependerá de la elección del hospedador. Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de vector/hospedador de expresión. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus de papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, que incluyen pCRl, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de intervalo más amplio de hospedador, tal como M13 y fagos filamentosos de ADN de cadena simple.

Las células hospedadoras adecuadas para expresión de un polipéptido o anticuerpo de unión a FOLR1 (o una proteína FOLR1 para usar como antígeno) incluyen células procariotas, de levadura, de insecto o eucariotas superiores bajo el control de promotores adecuados. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilli. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares de origen mamífero establecidas tal como se describe a continuación. También podrían utilizarse sistemas de traducción libre de células. Los vectores de clonación y de expresión adecuados para el uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero fueron descritos por Pouwels et ál. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), cuya descripción pertinente se incorpora a la presente mediante esta referencia. La información adicional con respecto a los métodos de producción de proteínas, incluyendo la producción de anticuerpos, se puede encontrar, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense N.°.2008/0187954, patente estadounidense Nos. 6,413,746 y 6,660,501, y publicación de patente internacional N.°. WO 04009823, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

También se utilizan varios sistemas de cultivo de células de mamífero o insecto para expresar proteínas recombinantes. Se puede realizar la expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero debido a que las proteínas generalmente se encuentran correctamente plegadas, adecuadamente modificadas y son completamente funcionales. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares que incluyen, por ejemplo, células L, líneas celulares de C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcriptos, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados unidos al gen a ser expresado y otras secuencias flanqueantes 5' o 3' no transcriptas, y secuencias 5' o 3' no traducidas, tales como sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de transcripción. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se examinan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Las proteínas producidas por un hospedador transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado, los métodos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra téenica estándar de purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad, tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de recubrimiento de influenza y glutatión S-tranferasa, se pueden unir a la proteína para permitir una fácil purificación al pasar por una columna de afinidad adecuada. Asimismo, las proteínas aisladas pueden caracterizarse físicamente utilizando técnicas como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.

Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteínas recombinantes en medios de cultivo primero se pueden concentrar utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Luego de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. De manera alternativa, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato con grupos dietilaminoetilo (DEAE) laterales.

Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos utilizados normalmente en la purificación de proteínas. De manera alternativa, se puede emplear un paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Por último, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) utilizando medios hidrofóbicos de RP-HPLC, por ejemplo, gel de sílice con cadenas laterales metilo u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente un agente de unión a F0LR1. Se pueden emplear también algunas o todas las etapas de purificación mencionadas anteriormente, en varias combinaciones, para obtener una proteína recombinante homogénea.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, por extracción inicial de sedimentos celulares, seguido por una o más etapas de concentración, supresión de sales, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño. También se puede usar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en las etapas de purificación finales. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden interrumpirse por cualquier método conveniente, que incluye ciclo congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisado celular.

Los métodos conocidos en la téenica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, los que se describen en la publicación de patente n.° 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

IV. Polinucleótidos En determinadas modalidades, la invención abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido que se une específicamente a un receptor F0LR1 humano o un fragmento de el polipéptido. Por ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo a un FOLR1 humano o codifica un fragmento de el anticuerpo. Los polinucleótidos de la invención pueden encontrarse en forma de ARN o en forma de ADN. ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético, y puede ser de cadena doble o de cadena simple, y, si es de cadena simple puede ser la cadena codificante o la no codificante (antisentido). En algunas modalidades, el polinucleótido es un ADNc o un ADN que carece de uno o más intrones endógenos.

En algunas modalidades, un polinucleótido es un polinucleótido de origen no natural. En algunas modalidades, un polinucleótido se produce de forma recombinante.

En determinadas modalidades, los polinucleótidos están aislados. En determinadas modalidades, los polinucleótidos son sustancialmente puros. En algunas modalidades, un polinucleótido se purifica a partir de componentes naturales.

La invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipeptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-40. También se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos alrededor de 95 %, al menos alrededor de 96 %, al menos alrededor de 97 %, al menos alrededor de 98 % o al menos alrededor de 99 % con SEQ ID NO: 1-40.

En determinadas modalidades, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que asiste, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido de una célula hospedadora (por ejemplo, una secuencia líder que funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido de la célula). El polipéptido con una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula hospedadora para producir la forma madura del polipéptido. Asimismo los polinucleótidos pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la prosecuencia, permanece una proteína madura activa.

En determinadas modalidades, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante del polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a una secuencia de marcador que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia de marcador puede ser una etiqueta hexa-histidina proporcionada por un vector pQE-9 para proporcionar purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en caso de un hospedador bacteriano, o la secuencia de marcador puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de influenza cuando se usa un hospedador mamífero (por ejemplo, células COS-7).

La presente invención se refiere adicionalmente a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente que codifican, por ejemplo, fragmentos, análogos y/o derivados.

Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, no codificantes o ambas. En algunas modalidades, las variantes del polinucleótido contienen alteraciones que producen sustituciones silenciosas, adiciones o supresiones, que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas modalidades, las variantes de nucleótido son producidas por sustituciones silenciosas debido a la degeneración del código genético. Las variantes de polinucleótido se pueden producir por una variedad de motivos, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón de un hospedador particular (cambiar los codones del ARNm humano a aquellos preferidos por un hospedador bacteriano tal como E. coli).

Asimismo, se proporcionan los vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en la presente.

V. Detección Cuando se usa un formato de ELISA sándwich, el anticuerpo de captura estará sin etiquetar. El anticuerpo de detección será directamente etiquetado o indirectamente detectado mediante la adición (luego del lavado del exceso de anticuerpo de detección) de un exceso molar de un segundo anticuerpo etiquetado dirigido contra el primer anticuerpo.

La etiqueta utilizada para el anticuerpo de detección es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de los anticuerpos F0LR1. Ejemplos de etiquetas adecuadas son la gran cantidad de etiquetas conocidas por su uso en inmunoensayos y que incluyen restos que pueden ser detectados en forma directa, como fluorocromo, etiquetas quimioluminiscentes y radiactivas, así como restos, tales como enzimas, que deben reaccionar o derivarse para ser detectados. Ejemplos de tales etiquetas incluyen los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense n.° 4 737 456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, peroxidasa de rábano picante (HRP9, fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/estreptavidina-b-galactosidasa con MUG, etiquetas de rotación, etiquetas bacteriófagas, radicales libres estables y similares. Tal como se mencionó anteriormente, la detección fluorimétrica es un ejemplo.

Se encuentran disponibles métodos convencionales para unir estas etiquetas en forma covalente a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, pueden emplearse agentes de acoplamiento tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, benzidina bis-diazotizada y similares para etiquetar los anticuerpos con las etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticas anteriormente descritas. Véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses n.0 3,940,475 (fluorimetría) y 3,645,090 (enzimas); Hunter et ál. Nature 144:945 (1962); David et ál. Biochemistry 13:1014- 1021 (1974); Pain et ál. J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982). En determinadas modalidades, las etiquetas de la presente son fluorescentes para aumentar la amplificación y sensibilidad a 8 mg/ml, más preferentemente biotina con estreptavidina-b-galactosidasa y MUG para amplificar la señal. En determinadas modalidades, se usa una etiqueta colorométrica, por ejemplo, donde el anticuerpo detectable es biotinilado y el medio de detección es avidina o estreptavidina-peroxidasa y bencidina de 3,3',5,5'-tetrametilo.

La conjugación de la etiqueta, que incluye las enzimas, con el anticuerpo representa un procedimiento de manipulación estándar para alguien con experiencia en las téenicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et ál. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, " en Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone y H. Van Vunakis, Vol.73 (Academic Press, Nueva York, N.Y., 1981), p.147-166.

Luego de la adición del último anticuerpo etiquetado, se determina la cantidad de anticuerpo unido mediante la supresión del exceso de anticuerpo etiquetado sin unir con lavados y la posterior medida de la cantidad de etiqueta adjunta a través de un método de detección adecuado para la etiqueta, y la correlación de la cantidad medida con la cantidad de F0LR1 diseminado o F0LR1 en células tumorales circulantes en la muestra biológica. Por ejemplo, en el caso de las enzimas, la cantidad de color desarrollado y medido representará una medida directa de la cantidad de FOLR1 diseminado presente o F0LR1 presente en células tumorales circulantes. Específicamente, si la etiqueta es HRP, el color puede detectarse usando el sustrato bencidina de 3,3',5,51-tetrametilo a 450 nm de absorbancia.

VI. Ensayos en células tumorales circulantes Los anticuerpos anti-FOLRl descritos en la presente pueden usarse también para la detección de FOLR1 en un ensayo de células tumorales circulantes. Las células tumorales circulantes (CTC) son células que se han diseminado en la vasculatura desde un tumor y circulan en el torrente sanguíneo. Las CTC están presentes en la circulación en concentraciones extremadamente pequeñas. En general, las CTC se enriquecen a partir de la sangre o plasma del paciente mediante varias téenicas conocidas en la técnica. Las CTC pueden teñirse para obtener marcadores específicos usando métodos conocidos en la técnica incluidos, de modo no taxativo, métodos basados en la citometría (por ejemplo, citometría de flujo) y métodos basados en IHC. Las CTC pueden teñirse para obtener marcadores de proteínas únicos para las células tumorales que permiten la identificación y distinción de las CTC de las células sanguíneas normales. Las CTC también pueden teñirse para obtener F0LR1 usando los anticuerpos de la invención incluidos, de modo no taxativo, FR1-9 y FR1-13. El análisis de las CTC también puede incluir análisis cuantitativo de la cantidad de CTC y/o la cantidad de F0LR1 positivo en CTC. En la presente invención, los anticuerpos F0LR1 descritos en la presente pueden usarse para teñir las CTC aisladas a partir de un sujeto que padece de cáncer para medir el FOLR1 presente en las CTC. Un aumento en las CTC que expresan FOLR1 puede ayudar a identificar el sujeto con cáncer que posiblemente responda a una terapia basada en FOLR1 o permita la optimización de un régimen terapéutico con un anticuerpo FOLR1 o inmunoconjugado. La cuantificación de FOLR1 en CTC puede proporcionar información sobre la etapa del tumor, respuesta a la terapia y/o evolución de la enfermedad. Puede usarse como biomarcador de pronóstico, predictivo o farmacodinámico. Además, puede usarse la tinción de las CTC para obtener marcadores particulares incluido, de modo no taxativo, FOLR1, como una biopsia líquida ya sea solo o en combinación con análisis de muestras de biopsia sólidas de marcadores tumorales adicionales.

VII. Kits Con fines de conveniencia, el método de ensayo de la presente invención puede proporcionarse en forma de un kit. Tal kit es una combinación empaquetada que incluye los elementos básicos de: (a) un primer reactivo, que puede ser un reactivo de captura, compuesto de anticuerpos monoclonales contra el F0LR1 humano; y/o (b) un segundo reactivo que es un reactivo de detección. El reactivo de detección también puede comprender anticuerpos monoclonales F0LR1, pero también pueden comprender anticuerpos detectables (etiquetados o no etiquetados)que se unen a F0LR1. Los elementos básicos se definen en lo expuesto anteriormente y en los Ejemplos a continuación.

En una modalidad donde el primer reactivo y el segundo reactivo son anticuerpos, fragmento de unión al antígeno de estos, o polipéptidos que se unen a F0LR1, el primer y segundo reactivo son anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno o polipéptidos diferentes. En una modalidad, el primer reactivo se une a un epítopo de F0LR1 diferente al segundo reactivo de F0LR1. En una modalidad, ni el primer reactivo ni el segundo reactivo inhiben de manera competitiva la unión de un agente activo (por ejemplo, un agente activo que comprende un anticuerpo huM0vl9 o un fragmento de unión al antígeno de este) de unirse a F0LR1.

En una modalidad, el kit comprende adicionalmente un soporte sólido para el agente de captura, que puede proporcionarse como un elemento independiente o en el que los reactivos de captura ya se encuentran inmovilizados. De esta forma, los anticuerpos de captura en el kit pueden inmovilizarse en un soporte sólido o pueden inmovilizarse en el soporte que está incluido en el kit o proporcionado independientemente del kit.

En una modalidad, el reactivo de captura está recubierto en una placa de microtitulación. Los reactivos de detección pueden ser anticuerpos etiquetados detectados en forma directa o anticuerpos no etiquetados detectados por anticuerpos etiquetados dirigidos contra los anticuerpos no etiquetados cultivados en una especie diferente. Cuando la etiqueta es una enzima, el kit incluirá normalmente sustratos y cofactores requeridos por la enzima, y cuando la etiqueta es un fluoróforo, un precursor de tinte que proporciona el cromóforo detectable. Cuando el reactivo de detección se encuentra sin etiquetar, el kit puede comprender adicionalmente un medio de detección para los anticuerpos detectables, tales como los anticuerpos etiquetados dirigidos a los anticuerpos no etiquetados, por ejemplo, en un formato detectado de manera fluorimétrica. Normalmente, cuando la etiqueta es una enzima, el kit incluye sustratos y cofactores requeridos por la enzima, donde la etiqueta es un fluoróforo, un precursor de tinte que proporciona un cromóforo detectable y donde la etiqueta es biotina, una avidina tal como avidina, estreptavidina o estreptavidina conjugada con HRP o b-galactosidasa con MUG.

En una modalidad, el reactivo de captura es el anticuerpo FR1-9 de F0LR1 y el reactivo de detección es el anticuerpo FR1-13 de F0LR1. En otra modalidad, el FR1-13 es biotinilado.

Además, el kit contiene típicamente instrucciones para llevar a cabo el ensayo, y/o proteína F0LR1, o fragmentos de esta (por ejemplo, el dominio extracelular de F0LR1 o el dominio extracelular de FOLR1 y todo o una parte del dominio de enlace GPI) como un estándar de antígeno, así como otros aditivos tales como estabilizadores, amortiguadores de incubación o lavado, y similares. En una modalidad, el estándar de antígeno de F0LR1 es una inmunoadhesina de F0LR1-Fc. El kit también puede incluir instrucciones para la detección y puntaje de la expresión del F0LR1.

Los componentes del kit se proveerán en relaciones predeterminadas y las cantidades relativas de los diversos reactivos variarán en forma adecuada para proveer concentraciones de los reactivos en solución que maximicen en forma sustancial la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden ser provistos en forma de polvos secos, usualmente liofilizados, que incluyen excipientes que al diluirse proveerán una solución reactiva con la concentración adecuada para combinarse con la muestra a ser evaluada.

Las modalidades de la presente descripción se pueden definir adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos no taxativos, que describen en detalle la preparación de determinados anticuerpos de la presente descripción y métodos para usar anticuerpos de la presente descripción.Será evidente para los expertos en la téenica que se pueden poner en práctica muchas modificaciones, tanto a los materiales como a los métodos, sin alejarse del alcance de la presente descripción.

EJEMPLOS Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presente tienen fines meramente ilustrativos y que a los expertos en la téenica se les podrán ocurrir varias modificaciones o cambios en vista de estos, los que deben incluirse dentro del espíritu y ámbito de la presente solicitud.

Ejemplo 1 Desarrollo de anticuerpos anti-FOLRl murinos Hubo dos series diferentes de inmunización/análisis. En la primera serie, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con aproximadamente 5xl06 células KB que expresaban F0LR1 (American Tissue Culture Collection, ATCC CCL-17). En la segunda serie, se usaron 300-19 células que expresaban el F0LR1 humano en su superficie para inmunizar los ratones. Para producir estas células, se obtuvo a secuencia de aminoácidos de FOLR1 humano del sitio web de NCBI (acceso NP_057937), luego se optimizó con codones y se sintetizó por biotecnologías de Blue Heron, se flanqueó por sitios de restricción EcoRI y Xbal para facilitar la clonación en el vector de expresión pSRa del mamífero. 300-19 células, una línea celular pre-B derivada de un ratón Balb/c (Reth et ál., Nature, 317:353-355 (1985)), se transfectaron con el plásmido de expresión pSRa-FolRl para expresar de manera estable los altos niveles de F0LR1 humano en la superficie de la célula. Los protocolos de inmunización estándar conocidos para los expertos, por ejemplo, tales como aquellos usados en ImmunoGen, Inc. se aplicaron para ambas series. Los ratones inmunizados se estimularon con antígeno tres días antes siendo sacrificados por generación de hibridoma. Los bazos de los ratones se recogieron de conformidad con los protocolos de animales estándares, tales como, por ejemplo, moler tejido entre dos portaobjetos microscópicos esmerilados estériles para obtener una suspensión celular única en un medio RPMI-1640. Las células del bazo se centrifugaron, sedimentaron, lavaron y fusionaron con un mieloma murino, tal como, por ejemplo, P3X63Ag8.653 células (Kearncy et ál., J. Immunol., 123:1548-1550 (1979)) usando polietileno glicol-1500 (Roche 783 641). Las células fusionadas se suspendieron nuevamente en un medio de selección RPMI-1640 que contenía hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma H-0262) y se seleccionaron para el cultivo en placas de cultivo con fondo plano de 96 pocilios (Corning-Costar 3596, 0.2 mi de suspensión celular por pocilio) a 37° C con CO2 al 5 %. Después de 5 días de incubación, se eliminaron 0.1 mi del sobrenadante del cultivo de cada pocilio y se reemplazaron con 0.1 mi del medio RPMI-1640 que contenía el complemento hipoxanthina-thmidina (HT)(Sigma H-0137). Se continuó la incubación a 37 °C con CO2 al 5 % hasta que los clones del hibridomaeestaban listos para el análisis del anticuerpo. También pueden usarse otras téenicas de inmunización y producción de hibridoma, incluidas aquellas descritas en Langone et ál. (Eds., "Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology, Academic Press, volume 121, Florida) y Harlow et ál. ( "Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1988)).

Ejemplo 2 Selección y análisis del hibridoma.

Se utilizaron 300-19 células de F0LR1 transfectadas con células de células KB y F0LR1 humanas en la primera y segunda serie de análisis correspondientes. Los sobrenadantes del cultivo del hibridoma se analizaron mediante citometría de flujo para la secreción de anticuerpos monoclonales de ratón para unirse a células positivas FOLR1, tal como las células 300-19 que expresan FOLR1 o células KB, pero no a las células con F0LR1 negativo, tal como las células 300-19 no transfectadas. Se incubaron 0,1 mi de sobrenadantes de hibridoma durante 3 horas con o bien células con FOLR1 positivo o bien las células 300-19 no transfectadas (1 xlO5 células por muestra) en 0,1 mi de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2 %). Luego, las células se centrifugaron, se sedimentaron, se lavaron e incubaron durante 1 hora con 0,1 mi de anticuerpo IgG antirratón de cabra conjugado con PE (el cual se obtiene de, por ejemplo, Jackson Laboratory, 6 mg/mL en amortiguador FACS). Las células se centrifugaron, se sedimentaron una vez más, se lavaron con amortiguador FACS y se suspendieron nuevamente en 0,2 mi de PBS que contenía formaldehído al 1 %. La fluorescencia asociada a las células se midió utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillos de HTS o un citómetro de flujo de barrido FACS y se analizó utilizando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EUA). Los clones de hibridoma positivos se subclonaron mediante dilución limitada. Se eligió un subclon de cada hibridoma, que mostró la misma reactividad contra F0LR1 como las células originales mediante citometría de flujo para análisis sucesivos. Los subclones estables se cultivaron y el isotipo de cada anticuerpo anti-FOLRl se identificó utilizando reactivos de isotopificación comerciales (Roche 1493027). Los anticuerpos murinos se purificaron con proteína A a partir de medio de hibridoma purificado tal como se describe anteriormente. Estos anticuerpos se denominaron anticuerpos FR-1.

Un clon, muFRl-13, se identificó como un clon anti-FOLRl que (1) no compitió o perjudicó la unión de Movl9 simultáneamente al mismo antígeno, y (2) tuvo una especificidad de unión alta respecto al objetivo tal como se demostró mediante téenicas de citometría de flujo comunes (Figura 2A y 2B). Estas dos características eran necesarias en el desarrollo de este ensayo, y por lo tanto el clon muFRl-13 fue elegido para ser utilizado en el ensayo.

Del panel de 64 clones anti-FOLRl restantes, se requirió un segundo anticuerpo para el ensayo que tuvo el mismo criterio que fue necesario para muFRl-13. De manera adicional, el segundo anticuerpo no pudo competir o perjudicar la unión de muFRl-13 simultáneamente al mismo antígeno (es decir, Movl9, muFRl-13 y el clon final deben tener epítopos separados de forma distinta). Para satisfacer estas condiciones, se llevaron a cabo una serie de experimentos de ELISA de competición en el panel de 65 clones antifolato (Figura 3A). Si un anticuerpo comparte el mismo epítopo o es estéricamente similar al anticuerpo que se detecta, se observa una reducción en la señal (Figura 3B). Utilizando este método, se identificaron 5 anticuerpos de los 64 analizados que poseían epítopos que compiten con Movl9, y por lo tanto se quitaron para ser considerados adicionalmente.

El mismo método se repitió sustituyendo Biotina conjugada con Movl9 con Biotina conjugada con muFRl-13 (Figura 4). Utilizando este método, se identificaron 6 clones adicionales que poseían epítopos que compiten con muFRl-13, y por lo tanto se quitaron para ser considerados adicionalmente. De los 53 clones restantes, 13 clones más mostraron tener poca afinidad y se quitaron para ser considerados adicionalmente.

Los 40 clones restantes se analizaron utilizando un formato ELISA similar tal como se muestra en la Figura 1. Los 40 clones se recubrieron alternativamente sobre la placa de ensayo en lugar de muFRl-9 en el diagrama, y las curvas de unión resultantes se analizaron. Se muestra en la Figura 5. Se consideró que los anticuerpos que contenían la respuesta media máxima más baja (EC50) tenían la especificidad de unión más alta a F0LR1, y fueron por lo tanto elegidos como los candidatos principales para el ensayo. Las afinidades de unión de los 4 clones principales ensayados en este método variaban de ~1-5xl0-9 M luego de que se encontraban disponibles materiales nuevos y de mejor calidad para las pruebas.

Ejemplo 3 Purificación de anticuerpo monoclonal murino Los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes de subclones de hibridoma utilizando métodos estándar, tal como, por ejemplo cromatografía de la Proteína A o G (Proteína A o G HP de HiTrap, 1 mL, Amersham Biosciences). Brevemente, el sobrenadante se preparó para la cromatografía mediante la adición de 1/10 volumen de amortiguador Tris/HCl 1 M, pH 8,0. El sobrenadante con pH ajustado se filtró a través de una membrana de filtro de 0,22 mm y se cargó en una columna equilibrada con el amortiguador de unión (PBS, pH 7,3). La columna se lavó con amortiguador de unión hasta que se obtuvo un punto de referencia estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó con amortiguador de ácido acético 0,1 M que contenía NaCl 0,15 M, pH 2,8, utilizando una tasa de flujo de 0,5 mL/min. Las fracciones de aproximadamente 0,25 mL se recolectaron y neutralizaron mediante la adición de 1/10 volumen de Tris/HCl 1M,pH 8,0.La o las fracciones pico se dializaren durante la noche dos veces contra lx PBS y se esterilizaron al filtrarlas a través de una membrana de filtro de 0,2 mm. El anticuerpo purificado se cuantificó mediante absorbancia a Aseo.

Ejemplo 4 Caracterización de unión mediante citometría de flujo La especificidad de unión se evaluó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos purificados. Cada anticuerpo se incubó durante 3 horas con o bien células 300-19 que expresan P0LR1 o bien las células 300-19 no transfectadas (1 xlO5 células por muestra) en 0, 1 mi de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con suero de cabra normal al 2 %) . Luego, las células se sedimentaron, se lavaron e incubaron durante 1 hora con 0 , 1 mi de anticuerpo IgG antirratón de cabra conjugado con FITC (el cual se obtiene de , por ej emplo, Jackson Laboratory, 6 mg/mL en amortiguador FACS) . Las células se sedimentaron una vez más, se lavaron con amortiguador FACS y se suspendieron nuevamente en 200 m? de PBS que contenía f ormaldehído al 1 % . Las muestras se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur con el mué st reador multipocillos de HTS o un citómetro de flujo de barrido FACS y se analizó utilizando CellQuest Pro (todos de ED Biosciences, San Diego, EUA) . Los histogramas de FACS de los anticuerpos anti-POLRl mostraron un cambio de fluorescencia, mientras que las células 300-19 originales no lo hicieron. Además, no se detectó un cambio de fluorescencia significativo cuando cualquiera de las líneas celulares fueron incubadas solo con anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con FITC.

Ejemplo 5 Clonación y secuenciamiento de las regiones VL y VH de muFRl-9 y FR1-53 El ARN celular total se preparó a partir de celulas de hibr idoma 5 x 10s utilizando un kit Rneasy (QIAgen) de acuerdo al protocolo del fabricante . Posteriormente se sintetizó el ADNc a partir del ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc SuperScript II ( Invitrogen) . El procedimiento para la reacción PCR degenerada de la primera vuelta en el ADNc derivado de las células de hibridoma se basó en métodos descritos en Wang et ál . (2000 ) J Immunol Methods . 13 de enero; 233 ( 1-2 ) : 167-77 ) y Co et ál . ( 1992 ) J Immunol . 15 de febrero; 148 (4 ) : 1149-54 ) ) . Las secuencias VH se amplificaron mediante PCR utilizando los siguientes cebadores degenerados : EcoMHl CiraOGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO: 45) , £ccMH2 CITCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSACTCWGG (SEQ ID NO: 41) , y BamlgGl GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTi!lGGC (SEQ ID NO: 42) . Las secuencias VL se amplificaron mediante PCR utilizando los siguientes cebadores degenerados : SacIMK GGAGCTCX^YAITCTGMTSAQyiCARWCIMCA (SEQ ID NO: 43) y HindKL TATAGAGCrCAAGCITCGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO: 44) . (las bases mezcladas se definen de la siguiente manera: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C , R=A+G, W=A+T) .

Las mezclas de reacción de PCR luego se pasaron por un gel de agarosa de baj a fusión al 1 % , las bandas de 300 a 400 pb se excisaron, se purificaron utilizando mini columnas de ADN Zymo y se enviaron a Agencourt Biosciences para secuenciamiento . Los cebadores de PCR 5 ' y 3 ' respectivos se utilizaron como cebadores de secuenciación para secuenciar los ADNc de región variable de ambas direcciones. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL se obtuvieron al traducir los resultados de la secuenciación de ADN con software de VectorNTI .

Las secuencias de ADNc de la región variable preliminar incluía secuencias de extremo 5 ' derivadas de los cebadores PCR degenerados en vez del ARNm del anticuerpo murino para que las comparaciones de secuencias con secuencias de la linea germinal del anticuerpo de ratón facilitara la identificación y supresión de estos artefactos de secuenciación . El sitio de IgBlast de NCBI (www. ncbi . nlm . nih .gov/igblast/ ) se utilizó para buscar las secuencias de líneas germinales murinas a partir de las cuales se derivaron las secuencias de ADNc de anticuerpo preliminares y las secuencias de extremo 5 ' derivado de cebadores se reemplazaron con las secuencias de líneas germinales correspondientes . Las secuencias de región variable limpiadas luego se combinaron con las secuencias de referencia de NCBI para las regiones constantes IgGl y la kappa murinas (números de acceso AJ294736. 1 y D78344 . 1 respectivamente) para ensamblar secuencias de anticuerpos murinos de longitud completa esperadas . El peso molecular de las cadenas ligeras y pesadas FR1-9 y FR1-53 murinas esperadas fue calculado y comparado con la masa medida mediante cromatografía líquida/análisis de espectrofotometría de masa (LC/MS).

Los esfuerzos iniciales para secuenciar la cadena ligera FR1-9 murina, siguiendo los métodos descritos anteriormente, no fueron exitosos por lo tanto se emplearon métodos alternativos. Se utilizaron las secuencias de cadena ligera de hibridomas relacionadas a FR1-9 para diseñar el cebador PCR KS77LClead (ttttgagctctggattccagcctccagaggt) para hibridarlo a la secuencia líder presumida del marco de cadena ligera FR1-9. Esta reacción PCR y secuenciamiento del cebador líder se llevó a cabo tal como se describe anteriormente y proporcionó una secuencia de ADNc completa que codifica una cadena ligera que une la masa de cadena ligera FR1-9 medida mediante LC/MS.

Ejemplo 6 Muestra de control de fusión de Fe F0LR1 Se construyó una molécula de fusión FC de receptor 1 de folato humano como una fuente de antígeno soluble alternativa a la proteína de unión al folato humano típicamente derivada de la leche humana. El extremo amino del ADNc del FOLR1 humano, descrito en el ejemplo de inmunización anterior, fue extirpado de la secuencia de longitud completa con una digestión de restricción EcoRI y Pstl. Este fragmento contenía el ADNc codificando los 233 aminoácidos del péptido señal N-terminal a los residuos hacia arriba de la corriente del sitio de unión GPI de huFolRl (acceso NM_016731.2 de NCBI). Un enlazador de los oligonucleótidos Pstl a BamHI facilitó la clonación del fragmento FolRl dentro del marco con las secuencias de región constante de anticuerpo CH3, CH2 e IgG2A murino bisagra (n.° de acceso P01863 de NCBI) en el plásmido de expresión de mamífero pmuFc2ANL-EK. Luego la proteína de fusión FolRl-Fc humana se expresó mediante transfecciones transitorias o estables en líneas celulares hospedadoras de mamífero tales como las células CHO o HEK-293T. Dado que la proteína de fusión de 475 aminoácidos contiene la región constante de IgG2A murina, la molécula se purificó siguiente los procedimientos de purificación de anticuerpos murinos estándares descritos anteriormente.

Ejemplo 7 Ensayo ELISA de antígeno diseminado Para asegurarse que el rendimiento de los materiales era continuo tal como se esperaba, a todos los anticuerpos se les analizó la unión mediante métodos de citometría de flujo y ELISA conocidos en la téenica. La citometría de flujo se realizó utilizando células T47D humanas que expresan F0LR1 cultivadas utilizando técnicas de cultivo celular in vitro conocidos en la técnica. Los anticuerpos se unieron a estas células y se detectaron indirectamente utilizando un anticuerpo de detección anti-murino de cabra con Alexa-fluor 488 en una máquina FACScalibur (Figura 6A-B). Se aplicaron los mismos métodos a los otros anticuerpos y se determinó que los anticuerpos seleccionados finales FR1-13 y FR1-9 mostraron una afinidad de unión de aproximadamente 1-3c109 M y 2-4xl09 respectivamente en ambos métodos.

Es importante que el ensayo solo detecte FOLR1, y no F0LR2 o especialmente F0LR3 (encontrados comúnmente como una proteína diseminada en el plasma humano), ya que el Movl9 es específico para F0LR1 solamente. Para determinar esto, los cuatro clones principales se analizaron mediante kits de ELISA comercialmente disponible (Figuras 7A-B). El anticuerpo de detección de control positivo muestra una señal positiva sobre el fondo que indica la detección de FOLR2 o F0LR3. Los anticuerpos restantes (FR1-9, FR1-53, FR1-62, FR1-64, y Movl9) no producen una señal en el ensayo, y por lo tanto no se unen a F0LR2 o F0LR3.

De manera adicional, la presencia de ácido fólico unido a FOLR1 podría potencialmente oscurecer el epítopo de los anticuerpos elegidos. Para asegurar que el ensayo detectara F0LR1 en cantidades fisiológicas de ácido fólico en sangre humana, el ácido fólico se incubó previamente con la proteína purificada estándar de FOLR1 y se agregó a la placa de ensayo. Tal como se muestra en la Figura 8, la presencia de ácido fólico tuvo un impacto insignificante en la afinidad de detección del ensayo en comparación con los controles positivos que no contenían ácido fólico. Por lo tanto, se concluyó que el ensayo podría detectar FOLR1 incluso en la presencia de ácido fólico unido.

Dado que ninguno de los cuatro clones de anticuerpos principales (FR1-9, 53, 62, o 64) mostraron interferencia con la unión de Movl9 o FR1-13, y dado que no se observaron propiedades de unión adversas en presencia de FOLR2, FOLR3, o ácido fólico, estos cuatro candidatos de los 64 clones originales fueron viables para ser utilizados en el ensayo. De estos cuatro clones, se determinó que los clones FR1-9 y FR1-53 tenían afinidad de unión más alta en comparación con FR1-62 y FR1-64. La producción del anticuerpo FR1-53 de su hibridoma original produjo un rendimiento consistentemente más pobre, y por lo tanto se eligió al clon FR1-9 por su facilidad para producir anticuerpos, pureza de anticuerpos más alta y porcentaje de monómeros.

En esfuerzos para optimizar el ensayo, se utilizó un enfoque sistemático en el que se optimizaron las concentraciones de FR1-9, FR1-13 biotinilado, Strp-HRP y sus respectivos tiempos de incubación utilizando la proteína de fusión FOLRl-Fc como el estándar antígeno. La fusión FOLRl-Fc es un péptidos de fusión de huFOLRl y IgG2A murino bisagra, CH2, CH3. El criterio para establecer condiciones optimizadas fueron las señales reproducibles con una relación de señal-ruido alta, efectos de matriz mínimos en muestras de plasma humana, alta repetitividad y precisión y el límite de detección más bajo.

Más específicamente, el ensayo se realizó al recubrir una placa de ensayo con muFRl-9 a 2 mg/mL y se incubó. Luego de bloquear con una proteína no específica, se agregaron las muestras (incluyendo los estándares de antígeno y muestras de plasma humano) a las placas de ensayo para incubarlas. Las placas luego se lavaron y se agregó anticuerpo de detección muFRl-13b (2 pg/mL) a cada pocilio. Las placas se lavaron nuevamente antes de agregar un exceso molar de peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina (1:5000). La placa se lavó una vez más antes de agregar 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB). La TMB reaccionó con la peroxidasa para formar un color azul, con una intensidad proporcional a la cantidad de FOLR1 presente en la muestra. La reacción se detuvo con una solución que contenía ácido, que se volvió de color amarilla. El ensayo luego se lcyó en un lector de placas Spectramax para determinar la intensidad de la reacción de color en cada muestra (absorbancia). Cuando era necesario, se generaba una curva respuesta-dosis sigmoidea (pendiente variable) con el software v5.04 de Graphpad Prism utilizando la ecuación 4PL: Y = parte inferior + (parte superior -inferior)/I + 10A ((LogEC50-X)* pendiente de Hill para todas las series de diluciones.

Para determinar la adecuación del formato ELISA final, se sometieron a prueba las muestras de ascitis humana provenientes de una fuente que no es un tumor y de plasma de pacientes con cáncer de ovarios humano. En pacientes con fluido de ascitis que no tienen tumores, se analizaron 15 muestras en busca de presencia de F0LR1.No se detectó F0LR1 por el ensayo en ninguna de las 15 muestras, y no se observaron falsos positivos debido a efectos de la matriz (Figura 9). De manera alternativa, a estas muestras de ascitis se les agregó proteína F0LR1 humana purificada y se realizó la detección posterior. La recuperación de la proteína F0LR1 tal como lo determinó el ensayo fue mayor que 85 % de la cantidad agregada conocida (no mostrada). Por lo tanto, se asumió que no hubo proteínas que interfieren en el fluido de ascitis humano no asociado a tumores incluso sin dilución de la muestra.

El mismo análisis se realizó en plasma humano normal agrupado (el grupo fue n=10 pacientes por lote). No se detectó FOLR1 endógeno a través del ensayo, y no se descubrieron proteínas que interfirieran en las muestras no diluidas de plasma humano con proteína huFOLRl-Fc purificada agregada (Figura 10). Las muestras de plasma con cáncer de ovario humano fueron proporcionadas por el Instituto del Cáncer Dana Farber [Dana Farber Cáncer Institute] o el Hospital General de Massachusetts [Mass General Hospital]. De las 72 muestras analizadas a la fecha, se identificaron que 7 muestras poseían niveles detectables de F0LR1 con un intervalo de 0,7 a 30,6 nM. Se muestra un análisis representativo de estos datos en la Figura 11. Aquí, tres de ocho muestras contenían niveles detectables de FOLR1 que exhibían 0,74, 0,91 y 30,6 nM para las muestras PB105, PB106 y PB109 respectivamente. El método para la interpolación de estos datos a partir de una curva estándar relevante generada utilizando huFOLRl-Fc se muestra en la Figura 12.

Ejemplo 8 Ensayo de células tumorales circulantes Se seleccionaron tres líneas celulares con niveles variados de expresión de FOLR1 como representativas de expresión alta (KB), expresión baja (0VCAR3) y sin expresión (A549). FR1-9 y FR1-13 sin etiquetar, así como el anticuerpo anti-FOLRl comercial ("FRA comercial") se titularon y las titulaciones óptimas se determinaron para cada uno de los anticuerpos utilizando detección de citometría de barrido láser (LSC, por sus siglas en inglés) sobre las líneas celulares seleccionadas. La fluorescencia se midió como intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) y se muestra en la Figura 13. Los tres anticuerpos mostraron expresión del receptor de folato en las células KB. Las diluciones óptimas se identificaron para cada anticuerpo de la siguiente manera: 1:5 para el FRA comercial, 1:100 para muFRl-9, y 1:200 para muFRl-13. De los anticuerpos sometidos a prueba, el anticuerpo comercial exhibió la relación óptima entre señal y fondo (8,0 versus 4,07 (muFRl-9) y 4,19 (uFRl-13)), pero solo muFRl-9 mostró una señal en las células 0VCAR3 (aproximadamente 30 % más señal que las células A549). Véase la Figura 14.

Para las aplicaciones que incluyen monitorear el tratamiento o eficacia con IMGN853, el anticuerpo seleccionado para ser utilizado en un ensayo CTC no debería competir con el componente del anticuerpo de IMGN853 (es decir, huMovl9 (M9346A)) para la unión a FOLR1. Los ensayos de competición se llevaron a cabo para determinar si cualquiera de los anticuerpos competía con el anticuerpo IMGN853 para la unión a FOLR1. Para estos ensayos, las células A549 (negativas) y KB (con expresión alta) se trataron con el anticuerpo M9346A o solo el vehículo. Las células luego se lavaron y se tiñeron con cada uno de los tres anticuerpos, y la expresión se analizó utilizando LSC. Los resultados se proporcionan en la Figura 15. Las barras claras (izquierda) representan solo el vehículo, y las barras oscuras (derecha) representan las células tratadas IMGN853. Si existe competición con el IMGN853 terapéutico, entonces la barra oscura (derecha) será más baja que la barra más clara (izquierda) en las células KB. Los resultados en la Figura 15 muestran que el anticuerpo FRA comercial compite para la unión con IMGN853 (disminución de ~66 % en la señal FRA), mientras que los anticuerpos muFRl-9 y muFRl-13 no fueron afectados por el tratamiento de IMGN853.

Juntos, estos resultados demuestran que muFRl-9 y muFRl-13 no compitieron con IMGN853, lo que los convierte en candidatos más deseables para utilizar en un ensayo que monitorea los niveles de F0LR1 en un fluido corporal (por ejemplo, sangre o plasma), célula tumoral circulante o muestra de tejido, luego del tratamiento con IMGN853. Además, muFRl-9 fue más sensible y demostró la capacidad única de detectar la expresión en células 0VCAR3 que tenían bajos niveles de expresión y es el anticuerpo candidato preferido para estos tipos de ensayos.

Ejemplo 9 Detección de F0LR1 en las células tumorales circulantes (CTC) aisladas de pacientes con cáncer de ovario y NSCLC.

Se toman muestras de sangre de paciente con cáncer de ovarios o con cáncer NSCLC en los siguientes momentos:Análisis (hasta 28 días antes del punto de referencia); Punto de referencia; Antes del ciclo 3; y al Finalizar el ciclo 4. Las CTC están enriquecidas de las muestras y teñidas para CK, CD45, núcleos y FOLR1 utilizando los anticuerpos y las diluciones descritos en el Ejemplo 8, anteriormente. La cantidad de CTC (es decir, células nucleadas con CK+/CD45), la cantidad de células nucleadas con CK-/CD45, la expresión de FOLR1 en CTC, la cantidad de células nucleadas con CK/CD45, y el porcentaje de CTC con F0LR1 positivo y células nucleadas con CK/CD45 se determinan por LSC para cada muestra. Los datos se utilizan para determinar los niveles de expresión de FOLR1 en CTC en varios momentos durante el ensayo clínico de Fase I para IMGN853.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, sitios de internet y números de acceso/secuencias de bases de datos (incluyendo tanto secuencias de polinucleótidos como de polipéptidos) citadas en la presente se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad a todos los efectos en la misma medida que si se indicara que cada publicación, patente, solicitud de patente, sitio de internet o número de acceso/secuencia de bases de datos individuales se incorpora de manera específica e individual mediante referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al mismo epítopo de FOLR1, o inhibe de forma competitiva la unión a F0LR1 de un anticuerpo, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en: (a)un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:25 y el polipéptido de la SEQ ID NO:29; (b)un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:26 y el polipéptido de la SEQ ID NO:30; (c)un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:27 y el polipéptido de la SEQ ID NO:31; y (d)un anticuerpo que comprende el polipéptido de la SEQ ID NO:28 y el polipéptido de la SEQ ID NO:32.

2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en: (a)SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b)SEQ ID NO: 4,5 y 6; y las SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c)SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; (d)SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y (e)variantes de (a) a (d) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

3. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en: (a)SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:29; (b)SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:30; (c)SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:31; y (d)SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:32.

4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque es murino, no humano, humanizado, quimérico, revestido o humano.

5. Un polipéptido que se une específicamente a FOLR1, caracterizado porque comprende las secuencias que se seleccionan del grupo que consiste en; (a)SEQ ID NO: 1, 2 y 3 y SEQ ID NO: 13, 14 y 15; (b)SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y SEQ ID NO: 16, 17 y 18; (c)SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y SEQ ID NO: 19, 20 y 21; (d)SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y SEQ ID NO: 22, 23 y 24; y (e) variantes de (a) a (d) que comprenden 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos.

6. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un método para detectar la proteína P0LR1 en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína F0LR1 se detecta por radioinmunoensayo, ensayo de Western blot, ensayo de inmunofluorescencia, inmunoensayo de enzimas, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de quimioluminiscencia, citometría o ensayo de inmunohistoquímica.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la citometría es citometría de flujo.

10. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la proteína F0LR1 es proteína P0LR1 diseminada.

11. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la proteína F0LR1 se detecta en células tumorales circulantes en la muestra.

12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el inmunoensayo de la enzima es una un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína F0LR1 se detecta mediante ensayo inmunohistoquímico.

14. Una célula caracterizada porque produce el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

15. Un metodo para producir el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende (a) cultivar la célula de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 12 y (b) aislar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este o polipéptido a partir de la célula cultivada.

16. Un kit de inmunoensayo para detectar la proteína F0LR1 en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) un primer reactivo, en donde el primer reactivo es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este de conformidad con cualquiera con las reivindicaciones 1-4 o el polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, y (b) un segundo reactivo, donde el segundo reactivo es un reactivo de detección.

17. Un método para tratar el cáncer caracterizado porque comprende administrar un agente activo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a FOLR1 de un paciente con niveles de proteína F0LR1 elevados, donde los niveles de proteína FOLR1 elevados se midieron utilizando el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de conformidad con cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-4 o el polipéptido de conformidad con la reivindicación 5.