MX2013004202A

MX2013004202A - Glicoformas de anticuerpos anti-receptores de folato alfa.

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Publication number: MX2013004202A
Application number: MX2013004202A
Authority: MX
Inventors: Philip M Sass; Nicholas Nicolaides; Luigi Grasso; Eric Routhier; Wei Gu; Jason Young; Yaojun
Original assignee: Morphotek Inc
Priority date: 2010-10-20
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2013-10-17
Also published as: IL225579A0; BR112013009275A2; EP2629798A4; WO2012054654A3; CN103347537A; AU2016202082A1; JP2014505012A; AU2011317088B2; KR20140032944A; AU2011317088A1; CA2815080A1; EP2629798A2; RU2013122843A; WO2012054654A2; US20120164137A1

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-FRA con perfiles novedosos de glicanos neutros unidos a N debido a que las cantidades relativas de uno o más glicanos neutros se incrementan o disminuyen en comparación con los anticuerpos anti-FRA producidos bajo condiciones de cultivo de células de referencia. La invención proporciona además anticuerpos anti-FRA con enlace alterado al FRA, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) alterada y/o tasa de interiorización y/o eficiencia de interiorización alterada en una célula que expresa el FRA. En aspectos relacionados, la invención proporciona cultivos de células que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención, una célula aislada de este cultivo, kits y composiciones que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención, métodos para producir un anticuerpo anti-FRA de la invención y usos de diagnóstico y terapéuticos de un anticuerpo anti-FRA de la invención.

Description

GLICOFORMAS DE ANTICUERPOS ANTI -RECEPTORES DE FOLATO ALFA Antecedentes de la Invención Los receptores de folato enlazados a la membrana se enlazan y transportan la vitamina folato dentro de las células. Existen tres isoformas principales del receptor de folato enlazado a la membrana: a, ß y ?. El "receptor de folato alfa", "FRA" o "FR-a" se refiere a la isoforma alfa del receptor de folato enlazado a la membrana. El FRA es una proteína de la membrana anclada a GPI de cadena individual (Kelemen (2006) Int. J. Cáncer 119:243-250). Las isoformas oc y ß tienen aproximadamente 70% de homología de secuencias de aminoácidos y difieren dramáticamente en su estereoespecificidad hacia algunos folatos . Ambas isoformas son expresadas en el tejido tanto fetal como adulto, aunque el tejido normal expresa generalmente cantidades de bajas a moderadas de FR-ß (o FRB) . Sin embargo, el FRA es expresado en un subconjunto de células epiteliales normales y con frecuencia está sorprendentemente elevado en una variedad de carcinomas (Ross y colaboradores (1994) Cáncer 73(9):2432-2443; Rettig y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:3110-3114; Campbell y colaboradores (1991) Cáncer Res. 51:5329-5338; Coney y colaboradores (1991) . Cáncer Res. 51:6125-6132; Weitman y colaboradores (1992) Cáncer Res. 52:3396-3401; Garin-Chesa y colaboradores (1993) Am. J.

REF: 240278 Pathol. 142:557-567; Holm y colaboradores (1994) APMIS 102:413-419; Franklin y colaboradores (1994) Int. J. Cáncer 8 (Suppl .): 89-95 ; Miotti y colaboradores (1987) Int. J. Cáncer 39:297-303; y Vegglan y colaboradores (1989) Tumori 75:510-513) . El FRA es sobreexpresado en más de 90% de carcinomas ováricos (Sudimack y Lee (2000) Adv. Drug Deliv. Rev. 41(2) : 147-62) .

Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos anti-FRA de humano, particularmente para el uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por FRA, tal como un cáncer médiado por FRA. En particular, existe la necesidad de anticuerpos anti-FRA con diferentes propiedades y métodos para hacer estos anticuerpos y métodos para adaptar las características funcionales de los anticuerpos para varios usos terapéuticos y de diagnóstico. Por ejemplo, la afinidad de enlace, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, la eficiencia de interiorización y/o la tasa de interiorización de un anticuerpo anti-FRA se pueden alterar para un uso deseado.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-FRA de humano, particularmente el anticuerpo monoclonal MORAb-003, con diferentes perfiles de glicanos neutros unidos a N y/o diferentes propiedades y a métodos para hacer y utilizar estos anticuerpos al reemplazar la glucosa por galactosa como fuente de azúcar, reducir la temperatura, reducir el nivel de oxígeno disuelto (DO, por sus siglas en inglés) , incrementar el nivel de C02, agregar CuCl o butirato de sodio al medio de cultivo o incrementar la osmolaridad o recolectar el anticuerpo anti-FRA después del cultivo durante diferentes cantidades de tiempo. La invención también se refiere a un anticuerpo anti-FRA de humano, particularmente el anticuerpo MORAb-003, con afinidad de enlace, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, eficiencia de interiorización y/o tasa de interiorización alteradas y a métodos para producir estos anticuerpos al reemplazar la glucosa por galactosa como una fuente de azúcar, reducir la temperatura, reducir el nivel de oxígeno disuelto (DO, por sus siglas en inglés) , incrementar el nivel de C02/ agregar CuCl o butirato de sodio al medio de cultivo o incrementar la osmolaridad o recolectar el anticuerpo anti-FRA después del cultivo durante diferentes cantidades de tiempo. En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos anti-FRA de humano producidos por medio de cualquiera de los métodos descritos en este documento y composiciones que comprenden los anticuerpos. En otro aspecto, la invención se refiere a cultivos de células diseñados para expresar las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-FRA de humano, particularmente el anticuerpo MORAb-003, en donde las condiciones de cultivo de células comprenden un parámetro seleccionado del suplemento de galactosa, DO reducido, temperatura reducida, suplemento de butirato de sodio o cloruro de cobre, osmolaridad alta y alta cantidad de C0¿ . La invención también se refiere a células hospederas que son aisladas de estos cultivos de células.

Las modalidades particulares no limitantes de la invención se exponen en los siguientes párrafos nume ados. 1. Un método para producir un anticuerpo anti-receptor de Folato Alfa de humano (FRA, por sus siglas en inglés) con un perfil deseado de glicanos neutros unidos a N en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en: (1) cultivar la célula hospedera durante un primer periodo de tiempo utilizando glucosa como fuente de azúcar; y (2) cultivar la célula hospedera durante un segundo periodo de tiempo utilizando galactosa como fuente de azúcar. 2. El método de la modalidad 1, en donde la célula hospedera se cultiva utilizando galactosa como fuente de azúcar del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 3. El método de la modalidad 1, en donde el segundo periodo de tiempo comienza en un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 4. El método de la modalidad 1, en donde el segundo periodo de tiempo comienza en un día seleccionado del día 5 al día 7 desde el inicio del cultivo. 5. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con afinidad de enlace reducida, que comprende los pasos que -consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, durante un primer periodo de tiempo utilizando glucosa como fuente de azúcar; y luego cultivar la célula hospedera durante un segundo periodo de tiempo utilizando galactosa como fuente de azúcar, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene afinidad de enlace reducida en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano producido mediante el cultivo de la célula hospedera sin galactosa. 6. El método de la modalidad 5, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 10%. 7. El método de la modalidad 5, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 15%. 8. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, durante un primer periodo de tiempo utilizando glucosa como fuente de azúcar; y luego durante un segundo periodo de tiempo utilizando galactosa como fuente de azúcar, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene ADCC reducida en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera sin galactosa. 9. El método de la modalidad 8, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 5%. 10. El método de la modalidad 8, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 65%. 11. El método de cualquiera de las modalidades 1, 5 u 8, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero hospedera. 12. El método de la modalidad 11, en donde la célula de mamífero hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO (ovario de hámster chino) GS. 13. El método de cualquiera de las modalidades 1, 5 u 8, en donde la concentración de glucosa es entre 1 g/L a 4 g/L. 14. El método de cualquiera de las modalidades 1, 5 u 8, en donde la concentración de galactosa es de 0.01 g/L a 20 g/L. 15. El método de la modalidad 14, en donde la concentración de galactosa es de 1 g/L a 10 g/L. 16. El método de la modalidad 14, en donde la concentración de galactosa es de 2 g/L a 4 g/L. 17. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula, hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza utilizando galactosa como fuente de azúcar. 18. El método de la modalidad 17, en donde la porción del cultivo realizado . utilizando galactosa como fuente de azúcar es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 19. El método de la modalidad 17, en donde la porción del cultivo realizado utilizando galactosa como fuente de azúcar comienza en un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 20. El método de la modalidad 17, en donde la porción del cultivo realizado utilizando galactosa como fuente de azúcar comienza en un día seleccionado del día 3 al día 7 desde el inicio del cultivo. 21. El método de la modalidad 17, en donde la concentración de galactosa es de 0.01 g/L a 20 g/L. 22. El método de la modalidad 17, en donde la concentración de galactosa es de 1 g/L a 10 g/L. 23. El método de la modalidad 17, en donde la concentración de galactosa es de 2 g/L a 4 g/L. 24. El método de la modalidad l, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 0-6.3% de G0, 21-68% de GOF, 24-63% de GIF, 0-0.8% de G2, 3-11% de G2F, 0-0.39% de M3N2 , 0-0.35% de M3N2F y 0-5% de MAN5. 25. El método de la modalidad 1, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : AN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F en una relación de aproximadamente 1 : 1 : 1.7 : 60 : 20 : 16 : 365 : 370. 26. El método de cualquiera de las modalidades 1, 5, 8 o 17, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 27. El método de la modalidad 1, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N es el perfil obtenido utilizando un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica á la SEC ID NO: 2 en una célula de CHO. 28. El método de la modalidad 5, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 81.3-88.3% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera sin galactosa. 29. El método de la modalidad 8, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano induce la ADCC én el intervalo de 39.0-97.4% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera sin galactosa . 30. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con un perfil deseado de glicanos neutros unidos a N en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica' el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en : (1) cultivar la célula hospedera a una primera temperatura; y luego (2) cultivar la célula hospedera a una segunda temperatura más baja que la primera temperatura. 31. El método de la modalidad 30, en donde la célula hospedera se cultiva a la temperatura más baja iniciando en el día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 32. El método de la modalidad 30, en donde la célula hospedera se cultiva a la temperatura más baja iniciando en el día seleccionado del día 3 al día 5 desde el inicio del cultivo. 33. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con una tasa de interiorización incrementada, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera temperatura; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda temperatura más baja que la primera temperatura, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una tasa de interiorización incrementada en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera temperatura. 34. El método de la modalidad 33, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 15%. 35. El método de la modalidad 33, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 25%. 36. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con una eficiencia de interiorización incrementada, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera temperatura; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda temperatura más baja que la primera temperatura, en donde el anticuerpo tiene una eficiencia de interiorización reducida en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera temperatura. 37. El método de la modalidad 3.6, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 15%. 38. El método de la modalidad 36, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25%. 39. El método de cualquiera de las modalidades 30, 33, 36 o 230, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero . 40. El método de la modalidad 39, en donde la célula de mamífero hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO (ovario de hámster chino) GS. 41. El método de cualquiera de las modalidades 30, 33, 36 o 230, en donde la primera temperatura a la cual se desarrolla la célula hospedera es aproximadamente de 36 a 38°C. 42. El método de cualquiera de las modalidades 30, 33, 36 o 230, en donde la segunda temperatura es de 28 a 35°C. 43. El método de la modalidad 42, en donde la segunda temperatura es de 30 a 33°C. 44. El método de la modalidad 42, en donde la segunda temperatura es de 30 a 31°C. 45. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza a baja temperatura. 46. El método de la modalidad 45, en donde la porción del cultivo realizado a baja temperatura es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 47. El método de la modalidad 45, en donde la porción del cultivo realizado a baja temperatura inicia en un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 48. El método de la modalidad 45, en donde la porción del cultivo realizado a baja temperatura inicia en un día seleccionado del día 3 al día 5 desde el inicio del cultivo. 49. El método de la modalidad 45, en donde la baja temperatura es de 28 a 35°C. 50. El método de la modalidad 45, en donde la baja temperatura es de 30 a 33°C. 51. El método de la modalidad 45, en donde la baja temperatura es de 30 a 31°C. 52. El método de la modalidad 30, en donde the perfil de glicanos unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 0-6.3% de G0 , 21-68% de GOF, 24-63% de GIF, 0-0.8% de G2, 3-11% de G2F, 0-0.39% de M3N2, 0-0.35% de M3N2F y 0-5% de MA 5. 53. El método de la modalidad 33, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo en una tasa de 117-143% en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo producido a la primera temperatura sola. 54. El método de cualquiera, de las modalidades 30, ¦33, 36., 45 o 230, en dónde el anticuerpo anti-FRA de humanó' comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 55. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con un perfil deseado de glicanos neutros unidos a N en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en : (1) cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal; y luego (2) cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células con osmolaridad alta. 56. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con afinidad de enlace reducida, qué comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal; y luego cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células con osmolaridad alta. 57. El método de la modalidad 56, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo con una osmolaridad normal . 58. El método de la modalidad 56, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 40% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo con una osmolaridad normal . 59. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal; y luego cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo ) de células con osmolaridad alta. 60. El método de la modalidad 59, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la afinidad de enlace del, anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo con una osmolaridad normal . 61. El método de la modalidad 59, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 65% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo con una osmolaridad normal . 62. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con una tasa de interiorización incrementada, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal; y luego cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo dé células con osmolaridad alta. 63. El método de la modalidad 62, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al" menos 5% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo con una osmolaridad normal. 64. El método de la modalidad 62, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 10% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo con una osmolaridad normal . 65. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con eficiencia de interiorización reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal; y luego cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células con osmolaridad alta. 66. El método de la modalidad 65, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 98.6%. 67. El método de cualquiera de las modalidades 55, 56, 59, 62 o 65, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero. 68. El método de la modalidad 67, en donde la célula hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO, por sus siglas en inglés (ovario de hámster chino) GS. 69. El método de cualquiera de las modalidades 55, 56, 59, 62 o 65, en donde la osmolaridad normal del medio de cultivo de células está en el intervalo de 250 a 350 mOsm/L. 70. El método de cualquiera de las modalidades 55, 56, 59, 62 o 65, en donde la osmolaridad del medio de osmolaridad alta es de 360 a 800 mOsm/L. 71. El método de la modalidad 70, en donde la osmolaridad del medio de osmolaridad alta es de 400 a 650 mOsm/L. 72. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano, que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza con osmolaridad alta. 73. El método de la modalidad 72, en donde la porción del cultivo realizado con osmolaridad alta es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 74. El método de la modalidad 72, en donde la porción del cultivo realizado con osmolaridad alta inicia en un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 75. El método de la modalidad 72, en donde la porción del cultivo realizado con osmolaridad alta inicia en un día seleccionado del día 3 al día 5 desde el inicio del cultivo . 76. El método de la modalidad 72, en donde la osmolaridad alta es de 360 a 800 mOsm/L. 77. El método de la modalidad 72, en donde la osmolaridad alta es de 400 a 650 mOsm/L. 78. El método de la modalidad 55, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 0-7% de G0, 49-95% de G0F, 0-39% de GIF, 0-0.7% de G2, 0-6% de G2F, 0-0.35% de M3N2 , 0.04-0.46% de M3N2F y 1.2-5.6% de MA 5. 79. El método de la modalidad 56, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 66.8-78.9% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal . 80. El método de la modalidad 62, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano induce la ADCC en el intervalo de 101% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal. 81. El método de la modalidad 62, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo en una tasa de 107% en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal. 82. El método de la modalidad 65, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo con una eficiencia de 1.40-1.42% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células con una osmolaridad normal. 83. El método de cualquiera de las modalidades 55, 56, 59, 62, 65 o 72, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 84. Un método para producir un perfil deseado de glicanos neutros unidos a N de un anticuerpo anti-FRA de humano en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en: (1) cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal; y luego (2) agregar butirato de sodio al medio de cultivo de células normal. 85. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con afinidad de enlace reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti- FRA de humano, en un medio de cultivo de células normal; y luego agregar butirato de sodio al medio de cultivo de células normal . 86. El método de la modalidad 85, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 40% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 87. El método de la modalidad 85, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 88. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células normal; y; luego agregar butirato de sodio al medio de cultivo de células normal. 89. El método de la modalidad 88, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal . 90. El método de la modalidad 88, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 91. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con eficiencia de interiorización reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal; y luego agregar butirato de sodio al medio de cultivo de células normal. 92. El método de la modalidad 91, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 20% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células no mal. 93. El método de la modalidad 91, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 94. El método de cualquiera de las modalidades 84, 85, 88 o 91, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero. 95. El método de la modalidad 94, en donde la célula hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO (ovario de hámster chino) GS . 96. El método de cualquiera de las modalidades 84, 85, 88 o 91, en donde el medio de cultivo de células normal no contiene butirato de sodio. 97. El método de cualquiera de las modalidades 84, 85, 88 o 91, en donde la concentración de butirato de sodio es 0.5 mM. 98. El método de cualquiera de las modalidades 84, 85, 88 o 91, en donde la concentración de butirato de sodio es 10 mM. 99. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza en un medio de cultivo que comprende butirato de sodio . 100. El método de la modalidad 99, en donde la porción del cultivo realizado en un medio .de cultivo que comprende butirato de. sodio es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 101. El método de la modalidad 99, en donde la porción del cultivo realizado en un medio de cultivo que comprende butirato de sodio comienza en un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 102. El método de la modalidad 99, en donde la porción del cultivo realizado en un medio de cultivo que comprende butirato de sodio comienza en un día seleccionado del día 3 al día 7 desde el inicio del cultivo. 103. El método de la modalidad 99, en donde la concentración de butirato de sodio es de 0.01 mM a 90 mM. 104. El método de la modalidad 99, en donde la concentración de butirato de sodio es de 0.01 mM a 16 mM. 105. El método de la modalidad 99, en donde la concentración de butirato de sodio es de 0.5 mM a 10 mM. 106. El método de la modalidad 84, en donde el perfil, de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 0-8% de G0, 39-86% de G0F, 9-48% de GIF, 0-1.0% de G2, 0-7% de G2F, 0-0.41% de M3N2 , 0.03-0.45% de M3N2F y 0-4.4% de MAN5. 107. El método de la modalidad 85, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 59-64% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 108. El método de la modalidad 85, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 44-55% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 109. El método de la modalidad 88 en donde el anticuerpo anti-FRA de humano induce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en el intervalo de 26-91% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 110. El método de la modalidad 91 en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en células objetivo con una eficiencia de 45-84% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de .células normal. 111. El método de cualquiera de las modalidades 84,. 85, 88, 91 o 99, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 112. Un método para producir un perfil deseado de glicanos neutros unidos a N de un anticuerpo anti-FRA de humano en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en: (1) cultivar la célula hospedera a una primera concentración de oxígeno disuelto (DO); y luego (2) cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de DO que es menor que la primera concentración de DO. 113. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con afinidad de enlace reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti- FRA de humano, a una primera concentración de DO; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de DO que es menor que la primera concentración de DO. 114. El método de la modalidad 113, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 30% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 115. El método de la modalidad 113, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la , célula hospedera a la primera concentración de DO. 116. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC incrementada, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera concentración de DO; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de DO que es menor que la primera concentración de DO. 117. El método de la modalidad 116, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 25% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 118. El método de la modalidad 116, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 50% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera . a la primera concentración de DO. 119. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con eficiencia de interiorización reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera concentración de DO; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de DO que es menor que la primera concentración de DO. 120. El método de la modalidad 119, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 30% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 121. El método de la modalidad 119, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano luego se reduce por al menos 60% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 122. El método de cualquiera de las modalidades 112, 113, 116 o 119, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero. 123. El método de la modalidad 122, en donde la célula hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO (ovario de hámster chino) GS . 124. El método de cualquiera de las modalidades 112, 113, 116 o 119, en donde la primera concentración de oxígeno disuelto a la cual puede crecer la célula hospedera es entre 30% y 100%. 125. El método de cualquiera de las modalidades 112, 113, 116 o 119, en donde la segunda concentración de DO es de 0% a 25%. 126. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza a una baja concentración de DO. 127. El método de la modalidad 126, en donde la porción del cultivo realizado a una baja concentración de DO es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 128. El método de la modalidad 126, en donde la porción del cultivo realizado a una baja concentración de DO inicia desde un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 129. El método de la modalidad 126, en donde la porción del cultivo realizado a una baja concentración de DO inicia desde un día seleccionado del día 3 al día 7 desde el inicio del cultivo. 130. El método de la modalidad 126, en donde la baja concentración de DO es de 0% a 30%. 131. El método de la modalidad 130, en donde la baja concentración de DO es de 5% a 25%. 132. El método de la modalidad 130, en donde la baja concentración de DO es de 5% a 10%. 133. El método de la modalidad 112, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 2-11% de G0 , 32-79% de G0F, 12-52% de GIF, 0-1.0% de G2, 0-7% de G2F, 0-0.28% de M3N2 , 0.01-0.43% de M3N2F y 0.1-4.4% de MAN5. 134. El método de la modalidad 113, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 50-63.% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 135. El método de la modalidad 116, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano induce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en el intervalo de más de 100% a más de o igual a 200% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 136. El método de la modalidad 119, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo con una eficiencia de 39-64% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de DO. 137. El método de cualquiera de las modalidades 112, 113, 116, 119 o 126, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 138. Un método para producir un perfil deseado de glicanos neutros unidos a N de un anticuerpo anti-FRA de humano en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en: (1) cultivar la célula hospedera a una primera concentración de C02; y luego (2) cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de C02 que es más alta que la primera concentración de C02. 139. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con afinidad de enlace reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera concentración de C02; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de C02 que es más alta que la primera concentración de C02. 140. El método de la modalidad 139, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 141. El método de la modalidad 139, en donde, la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 142. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera concentración de C02; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de C02 que es más alta que la primera concentración de C02. 143. El método de la modalidad 142, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 144. El método de la modalidad 142, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 65% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 145. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con una tasa de interiorización incrementada, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera concentración de C02 ; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de C02 que es más alta que la primera concentración de C02. 146. El método de la modalidad 145, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 5% en comparación con la tasa de interiórizacion del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 147. El método de la modalidad 145, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 25% en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 148. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con eficiencia de interiorización reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera concentración de C02; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda concentración de C02 que es más alta que la primera concentración de C02. 149. El método de la modalidad 148, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 150. El método de la modalidad 148, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 151. El método de cualquiera de las modalidades 138, 139, 142, 145 o 148, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero. 152. El método de la modalidad 151, en donde la célula hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO (ovario de hámster chino) GS . 153. El método de cualquiera de las modalidades 138, 139, 142, 145 o 148, en donde la primera concentración de C02 es aproximadamente 5% o menos. 154. El método de cualquiera de las modalidades 138, 139, 142, 145 o 148, en donde la concentración de C02 más alta es de 10% a 30%. 155. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza a una concentración de C02 alta. 156. El método de la modalidad 155, en donde la porción del cultivo realizado a una concentración de C02 alta es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 157. El método de la modalidad 155, en donde la porción del cultivo realizado a una concentración de C02 alta inicia desde un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 158. El método de la modalidad 155, en donde la porción del cultivo realizado a una concentración de C02 alta inicia desde un día seleccionado del día 3 al día 7 desde el inicio del cultivo. 159. El método de la modalidad 155, en donde la concentración de C02 alta es de 10% a 30%. 160. El método de la modalidad 155, en donde la concentración de C02 alta es 20%. 161. El método de la modalidad 138, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 0-7% de G0, 50-97% de G0F, 0-39% de GIF, 0-0.7% de G2 , 0-6% de G2F, 0-0.46% de M3N2, 0.06-0.48% de M3N2F y 0-3.8% de MA 5. 162. El método de la modalidad 139, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 45-56% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 163. El método de la modalidad 142, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano induce la ADCC en el intervalo de 23-89% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 164. El método de la modalidad 145, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo en una tasa de 105^125% en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 165. El método de la modalidad 148, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo con una eficiencia de 40-68% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera a la primera concentración de C02. 166. El método de cualquiera de las modalidades 138, 139, 142, 145, 148 o 155, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 167. Un método para producir una estructura deseada de glicanos neutros unidos a N de un anticuerpo anti-FRA de humano en una célula hospedera, en donde la célula hospedera comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, el método comprende los pasos que consisten en: (1) cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal; y luego (2) agregar cloruro de cobre al medio de cultivo de células normal . 168. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con afinidad de enlace reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, cultivar la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal en el cual puede crecer la célula hospedera; y luego agregar cloruro de cobre al medio de cultivo de células normal. 169. El método de la modalidad 168, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 40% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal . 170. El método de la modalidad 168, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 171. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células normal; y luego agregar cloruro de cobre al medio de cultivo de células normal. 172. El método de la modalidad 171, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 20% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 173. El método de la modalidad 171, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 80% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante- el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 174. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con eficiencia de interiorización reducida, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, en un medio de cultivo de células normal; y luego agregar cloruro de cobre al, medio de cultivo de células normal. 175. El método de la modalidad 174, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 30% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 176. El método de la modalidad 174, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 60% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 177. El método de cualquiera de las modalidades 167, 168, 171 o 174, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero. 178. El método de la modalidad 177, en donde la célula hospedera es una célula recombinante derivada de una línea de células de CHO (ovario de hámster chino) GS . 179. El método de cualquiera de las modalidades 167, 168, 171 o 174, en donde el medio de cultivo de células normal no contiene cloruro de cobre. 180. El método de cualquiera de las modalidades 167, 168, 171 o 174, en donde la concentración de cloruro de cobre es de 0.01 µ? a 0.5 mM. 181. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprendé un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde por lo menos una porción del cultivo se realiza en un medio de cultivo que comprende cloruro de cobre . 182. El método de la modalidad 181, en donde la porción del cultivo realizado en un medio de cultivo que comprende cloruro de cobre es del día 0 al día 14 desde el inicio del cultivo. 183. El método de la modalidad 181, en donde la porción del cultivo realizado en un medio de cultivo que comprende cloruro de cobre comienza en un día seleccionado del día 2 al día 10 desde el inicio del cultivo. 184. El método de la modalidad 181, en donde la porción del cultivo realizado en un medio de cultivo que comprende cloruro de cobre comienza en un día seleccionado del día 3 al día 6 desde el inicio del cultivo. 185. El método de la modalidad 181, en donde la concentración de cloruro de cobre es de 0.01 µ? a 0.5 mM. 186. El método de la modalidad 181, en donde la concentración de cloruro de cobre es de 0.01 mM a 0.5 mM. 187. El método de la modalidad 181, en donde la concentración de cloruro de cobre es 0.5 mM. 188. El método de la modalidad 167, en donde el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA de humano comprende 0-8% de G0 , 34-81% de G0F, 13-53% de GIF, 0-0.7% de G2, 0-7% de G2F, 0.07-0.61% de M3N2 , 0.16-0.58% de M3N2F, y 0-4.3% de MAN5. 189. El método de la modalidad, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano tiene una afinidad relativa de enlace de 41-56% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal. 190. El método de la modalidad 171, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano induce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en el intervalo de 21-87% en comparación con la ADCC del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en un medio de cultivo de células normal . 191. El método de la modalidad 174, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano se interioriza en una célula objetivo con una eficiencia de 41-71% en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo producido mediante el cultivo de la célula hospedera en ún medio de cultivo de células normal. 192. El método de cualquiera de las modalidades 167, 168, 171, 174 -o 181, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 193. Un método para alterar una o más propiedades de un anticuerpo anti-FRA de humano seleccionado del grupo que consiste de: a) el perfil de glicanos-N neutros del anticuerpo anti-FRA de humano; b) la afinidad de enlace; c) la ADCC; d) la tasa de interiorización; y e) la eficiencia de interiorización; que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, y recolectar una célula hospedera que produce el anticuerpo anti-FRA de humano en un tiempo que es menor que 13 días o más de 15 días después del inicio del cultivo. 194. El método de la modalidad 193, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido por células recolectadas 13-15 días después del inicio del cultivo. 195. El método de la modalidad 193, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido por células recolectadas 13-15 días después del inicio del cultivo. 196. El método de la. modalidad 193, en donde la afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA de .humano se reduce por al menos 50% en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo producido por células recolectadas 13-15 días después del inicio del cultivo. 197. El método de la modalidad 193, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 198. El método de la modalidad 194, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 199. El método de la modalidad 195, en donde la ADCC del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos S5% en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 200. El método de la modalidad 193, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 201. El método de la modalidad 193, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 5% en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 202. El método de la modalidad 193, en donde la tasa de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se incrementa por al menos 25% en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 203. El método de la modalidad 193, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 204. El método de la modalidad 193, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 25% en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 205. El método de la modalidad 193, en donde la eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA de humano se reduce por al menos 50% en comparación con el anticuerpo recolectado en 13-15 días después del inicio del cultivo. 206. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano que comprende el paso que consiste en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, en donde la célula hospedera se recolecta en un tiempo antes de 13 días o un tiempo después de 15 días del inicio del cultivo. 207.. El método de la modalidad 193 o 206, en donde la célula hospedera es una célula de mamífero. 208. El método de la modalidad 207, en donde la célula hospedera es una célula recombinante derivada de una líne de células de CHO (ovario de hámster chino) GS . 209. El método de la modalidad 193 o 206, en donde el tiempo de recolección se selecciona del grupo que consiste de: un tiempo de 240 horas - 312 horas después del inicio del cultivo y un tiempo de 360 horas - 480 horas después del inicio del cultivo. 210. El método de la modalidad 209, en donde el tiempo de recolección es de 240 horas después del inicio del cultivo. 211. El método de la modalidad 209, en donde el tiempo de recolección es de 408 horas después del inicio del cultivo . 212. El método de la modalidad 209, en donde el tiempo de recolección es de 480 horas después del inicio del cultivo. 213. El método de la modalidad 193 o 206, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC- ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 214. Un cultivo de células que comprende una célula hospedera eucariótica diseñada para expresar, las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-FRA de humano, en donde las condiciones del cultivo de células comprenden un parámetro seleccionado del grupo que consiste de: suplemento de galactosa, oxígeno disuelto reducido (DO) , temperatura reducida, butirato de sodio, cloruro de cobre, osmolaridad alta y C02 alto. 215. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde el nivel de DO es de 0% a aproximadamente 25%. 216. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde la concentración de C02 es de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%. 217. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde la temperatura es de: 28°C a aproximadamente 35°C. 218. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde la concentración de galactosa es de 0.01 g/L a 20 g/L. 219. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde la concentración de butirato de sodio es de 0.5 mM a 10 mM. 220. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde la concentración de cloruro de cobre es de 0.01 M a 0.5 mM. 221. El cultivo de células de la modalidad 2114, en donde la osmolaridad del cultivo de células es de 360-800 mOsm/L . 222. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde la célula hospedera eucariótica es una célula de CHO. 223. El cultivo de células de la modalidad 222, en donde la célula de CHO es una célula CHO-K1. 224. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende lina región constante de cadena pesada de humano del isotipo IgGl. 225. El cultivo de células de la modalidad 214, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 226. Una célula hospedera aislada del cultivo de células de la modalidad 214. 227. Un anticuerpo anti-FRA alfa de humano producido por medio del método de cualquiera de las modalidades 1, 5, 8, 17, 30, 33, 36, 45, 55, 56, 59, 62, 65, 72, 85, 88, 91, 99, 113, 116, 119, 126, 139, 142, 145, 148, 155, 168, 171, 174, 181, 206 o 230, o. una porción de enlace a antígenos del anticuerpo . 228. Una composición que comprende el anticuerpo anti-FRA de humano de la modalidad 227 y un portador farmacéuticamente aceptable. 229. La composición de la modalidad 228, que comprende además un agente terapéutico adicional . 230. Un método para producir un anticuerpo anti-FRA de humano con ADCC incrementada, que comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedera que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FRA de humano, a una primera temperatura; y luego cultivar la célula hospedera a una segunda temperatura más baja que la primera temperatura. 231. Una célula hospedera aislada del cultivo de células de la modalidad 225. 232. El anticuerpo anti-FRA alfa de humano de la modalidad 227, en donde el anticuerpo anti-FRA de humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEC ID NO: 1 y comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEC ID NO: 2 o una secuencia 99% idéntica a la SEC ID NO: 2. 233. Una composición que comprende el anticuerpo anti-FRA de humano de la modalidad 232 y un portador farmacéuticamente aceptable.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1H muestran diagramas de estructuras de glicanos de anticuerpo unidos a N neutros que se recuperaron de anticuerpos anti-FRA. La figura representa las estructuras de glicanos procesadas parcialmente M3N2 (Figura 1A) , M3N2F (Figura IB) , MA 5 (Figura 1C) y las estructuras de glicanos completamente procesadas NGA2(G0) (Figura ID), NGA2F (GOF) (Figura 1E) , NA2G1F (GIF) (Figura 1F) , NA2 (G2) (Figura 1G) y NA2F (G2F) (Figura 1H) .

La Figura 2 es una gráfica que muestra la distribución de estructuras- de glicanos de anticuerpo unidos a N neutros que se recuperaron de anticuerpos anti-FRA producidos por células hospederas cultivadas bajo varias condiciones (cuyo título es "Distribución de Glicanos Unidos a N, Neutros, Principales en Muestras de MORAb-003"). "Pos.

Ctl." representa anticuerpos anti-FRA producidos por células hospederas cultivadas en las condiciones listadas como "Control Positivo" en la Tabla 3. El "estándar de referencia MORAb-003" representa un anticuerpo anti-FRA que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 7 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo. Las condiciones de cultivo de células hospederas que corresponden a "supl. de galactosa", "temp. baja", "osmo. alta", "butirato de Na 0.5 mM" , "DO bajo", "alto contenido de C02" , "butirato de Na 10 mM" , "supl. de CuCl", "recolección en el Día 10", "recolección en el Día 14", "recolección en el Día 17" y "recolección en el Día 20" se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 3 muestra la distribución de estructuras de glicanos de anticuerpo unidos a N neutros que se recuperaron de anticuerpos anti-FRA producidos por células hospederas cultivadas bajo varias condiciones. El "estándar de referencia MORAb-003" es el anticuerpo descrito en relación con la Figura 2.

La Figura 4 muestra la afinidad de enlace a FRA de anticuerpos anti-FRA producidos por células hospederas cultivadas bajo varias condiciones.

La Figura 5 muestra la ADCC de anticuerpos anti-FRA producidos por células hospederas . cultivadas bajo varias condiciones .

La Figura 6 es una gráfica de apalancamiento que muestra las correlaciones entre ADCC (eje y) y la concentración relativa (%) del glicano NGA2 (GO) en un anticuerpo anti-FRA (eje x) (cuyo título es "Gráfica de Apalancamiento" ) .

La Figura 7 es una gráfica de apalancamiento que muestra las correlaciones entre la ADCC (eje y) y la concentración relativa (%) de glicanos no fucosilados en un anticuerpo. anti-FRA (eje x) (cuyo título es "Gráfica de Apalancamiento" ) .

La Figura 8 es una gráfica de apalancamiento que muestra las correlaciones entre la ADCC (eje y) y la concentración relativa (%) del glicano M3N2F en un anticuerpo anti-FRA (eje x) (cuyo título es "Gráfica de Apalancamiento") .

La Figura 9 es una gráfica que muestra los resultados de un experimento que mide la interiorización de anticuerpos anti-FRA. La interiorización de los anticuerpos anti-FRA se midió como una función de la inhibición de la proliferación de células que expresan FRA mediante el uso de una inmunotoxina secundaria anti-humano (cuyo título es "Curva Estándar") . La OD540 se muestra en el eje y. La concentración de los anticuerpos anti-FRA se muestra en el eje x. El "estándar de referencia" se refiere al anticuerpo MORAb-003 descrito en relación con la Figura 2.

La Figura 10 es una tabla que muestra el cálculo de las concentraciones de anticuerpo anti-FRA que dan por resultado 50% de inhibición de la proliferación de células que expresan FRA (IC50) . "estd. de ref." se refiere al anticuerpo MORAb-003 descrito en relación con la Figura 2.

La Figura 11 es un histograma que muestra los resultados de un experimento de enlace de FACS que mide la actividad de interiorización de un anticuerpo anti-FRA (cuyo título es "Histograma de Enlace del MORAb-003 (estándar de referencia) a IGROV, teñido por FITC" ) . "estd. de ref." refiere al anticuerpo MORAb-003 descrito en relación con la Figura 2. El área sombreada (población Pl) corresponde a células incubadas con el anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC. La población P2 (control de 0%) corresponde a células incubadas con una IgG de humano irrelevante como control y un anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC. La población P3 corresponde a células incubadas con el anticuerpo anti-FRA y el anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC y lavadas con amortiguador de glicina acida. La población P4 (control de 100%) corresponde a células incubadas con el anticuerpo anti-FRA y un anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC con un lavado de amortiguador de PBS .

La Figura 12 es una gráfica que muestra los resultados de un experimento de enlace de FACS que mide la actividad de interiorización de un anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo (cuyo título es "Porcentaje de Interiorización"). El porcentaje de intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) medida por medio de la citometría de flujo de una población de células que expresan FRA (eje y) se representa como una función del tiempo (eje x) en relación con el enlace total en cada punto de tiempo.

La Figura 13 es una gráfica que muestra los resultados de un experimento de enlace de FACS que mide la actividad de interiorización de los anticuerpos anti-FRA descritos en la Tabla 4, así como también anticuerpos anti-FRA de control (cuyo título es "Comparación de % de Interiorización"). El porcentaje de MFI medida por medio de la citometría de flujo de una población de células que expresan FRA (eje y) se representa como una función del tiempo (eje x) en relación con el enlace total en cada punto de tiempo, "estd. de ref . MORAb-003" se refiere al anticuerpo MORAb-003 descrito en relación con la Figura 2.

La Figura 14 representa un modelo de ajuste del porcentaje de interiorización del anticuerpo anti-FRA como una función del tiempo, en donde Log (agonista) vs. Respuesta Pendiente Variable. "estd. de ref." se refiere al anticuerpo MORAb-003 descrito en relación con Figura 2 (cuyo titulo es "Datos 1") .

La Figura .15 es una tabla que resume los resultados de los estudios de interiorización de FACS descritos en el Ejemplo 5.

La Figura 16 es una tabla que resume los datos relacionados con la afinidad de enlace, ADCC, tasa de interiorización y eficiencia de interiorización de los anticuerpos anti-FRA. El "Estándar de Referencia MORAb-003" se refiere al anticuerpo MORAb-003 descrito en relación con la Figura 2.

Descripción Detallada de la Invención La invención se basa en parte en el descubrimiento sorprendente que al variar ciertas condiciones del cultivo de células para la producción recombinante de un anticuerpo anti-FRA, en particular el anticuerpo monoclonal anti-FRA MORAb-003, uno puede cambiar el perfil - de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo y en algunos casos, puede cambiar una o más propiedades del anticuerpo anti-FRA. En particular, los inventores han descubierto que uno puede cambiar el perfil de glicanos neutros unidos a N de un anticuerpo anti-FRA al reemplazar la glucosa -por galactosa como fuente de azúcar, reducir la temperatura, reducir el nivel de oxígeno disuelto (DO) , incrementar el nivel de C02, agregar CuCl o butirato de sodio al medio de cultivo, incrementar la osmolaridad o recolectar el anticuerpo anti-FRA después del cultivo durante diferentes cantidades de tiempo y que cada una de las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente altera el perfil de glicanos neutros unidos a N. Es decir, uno o más glicanos neutros que constituyen el perfil están presentes en cantidades incrementadas o disminuidas en relación con la cantidad de los glicanos en el perfil de un anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de referencia definidas en este documento. Un anticuerpo monoclonal anti-FRA, tal como el anticuerpo MORAb-003, con glicanos neutros unidos a N alterados es útil como una molécula terapéutica alternativa debido a que estas moléculas pueden tener una o más propiedades deseables que incluyen pero no están limitadas a pK o pD alterado, vida media alterada, solubilidad mejorada, inmunogenicidad reducida o efectos colaterales reducidos. Los inventores descubrieron además que la producción del anticuerpo anti-FRA bajo cualquiera de estas condiciones altera la afinidad de enlace, ADCC,. tasa de interiorización y/o eficiencia de interiorización del anticuerpo anti-FRA.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-FRA con perfiles novedosos de glicanos neutros unidos a N en que las cantidades relativas de uno o más glicanos neutros se incrementan o disminuyen en comparación con anticuerpos anti-FRA producidos bajo las condiciones de referencia de cultivo de células definidas en este documento. La invención proporciona además anticuerpos anti-FRA con enlace alterado (reducido típicamente) al FRA, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos alterada (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o tasa de interiorización y/o eficiencia de interiorización alterada en una célula que expresa FRA. En varias modalidades, el anticuerpo anti-FRA comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 o una secuencia que es por lo menos 95% idéntica, y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 6 o la SEC ID NO: 7 o una secuencia que es por lo menos 95% idéntica. En modalidades particulares, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7, o las secuencias que son por lo menos 95% idénticas a las secuencias mencionadas anteriormente (Ebel y colaboradores, (2007) Cáncer Immunity, 7:6). En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99% idéntica a la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es por lo menos 96%, por lo menos 97%,' por lo menos 98%, o por lo menos 99% idéntica a la SEG ID NO: 2, SEC ID NO: 6 o SEC ID NO : 7. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA comprende una cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 8 (con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder) y una cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 9 (con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder) . En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada carece de la lisina C-terminal. En varias modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención tiene las secuencias de aminoácidos del anticuerpo producido por una línea de células depositada bajo términos de acuerdo con el Tratado de Budapest con the American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 el 24 de Abril de 2006 bajo el número de acceso PTA-7552 o secuencias de ese tipo que carecen de la lisina C-terminál de cadena pesada.

En aspectos relacionados, la invención proporciona cultivos de células que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención, una célula aislada de este cultivo y kits y composiciones que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención .

En otro aspecto, la invención proporciona métodos paira producir un anticuerpo anti-FRA al alterar una condición de cultivo de células, la alteración se selecciona de: el uso de galactosa como fuente de azúcar, la reducción de la temperatura, la reducción del nivel de oxígeno disuelto (DO) , el incremento del nivel de C02, la adición de CuCl o butirato de sodio al medio de cultivo, el incremento de la osmolaridad o la recolección del anticuerpo anti-FRA después del cultivo durante diferentes cantidades de tiempo y un anticuerpo anti-FRA producido por medio del método. La invención proporciona además métodos ' para alterar el perfil neutro unido a N y/o una o más propiedades de un anticuerpo anti-FRA o para producir un anticuerpo anti-FRA con el perfil deseado de glicoformas neutras unidas a N o una propiedad mediante el cultivo de las células hospederas que expresan un anticuerpo anti-FRA bajo una condición de cultivo alterada descrita en este documento.

En todavía un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para utilizar un anticuerpo anti-FRA de la invención. En algunas modalidades, los anticuerpos se utilizan para detectar la presencia o para cuantificar el FRA o células que expresan FRA in vitro o in vivo. En otras modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención se utiliza para la terapia ya sea solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Los anticuerpos de la invención se enlazan específicamente al receptor de folato alfa dé humano (FRA) . Como se utiliza en este documento, un anticuerpo que se enlaza específicamente al FRA (también referido en este documento como un anticuerpo anti-FRA) no se enlaza significativamente a proteínas que no son FRA. Se dice que un anticuerpo se enlaza específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación (KD) es < 1 mM, < 100 nM o < 10 nM, En ciertas .modalidades, la KD es de 1 pM a 500 pM. En otras modalidades, la KD está entre 500 pM a 1 µ , de 1 µ? a 100 nM o de 100 mM a 10 nM. En una modalidad preferida, el FRA es FRA de humano tal como el FRA de humano que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos en la SEC ID NO: 4.

En algunas modalidades de la invención, un anticuerpo anti-FRA es un anticuerpo de cuatro cadenas (también referido como una inmunoglobulina) que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La cadena, pesada de. un anticuerpo anti-FRA de la invención está compuesta de un dominio variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH) . La cadena ligera está compuesta de un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL) . Para' los fines de esta solicitud, los dominios variables maduros de cadena pesada y cadena ligera comprenden cada uno tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) dentro de cuatro regiones de marco (FR1, FR2 , FR3 y FR4) ordenadas de la terminación N a la terminación C: FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio en este documento es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 o Chothia y colaboradores, Nature (1989) 342:878-883.

Un anticuerpo de la invención es un subtipo 1 de inmunoglobulina G de humano (IgGl) con una cadena ligera kappa de humano.

El término "anticuerpo" puede referirse a una molécula de anticuerpo individual o una pluralidad de moléculas de anticuerpo, como sea apropiado para el contexto. Aquellas personas de experiencia en el campo apreciarán, por ejemplo, que un perfil de glicanos neutros se refiere a una pluralidad de moléculas de anticuerpo.

La invención proporciona, en varias modalidades, un anticuerpo anti-FRA que tiene cualquiera de los .perfiles de glicanos neutros unidos a N mostrados en la Figura' 3 o descritos en la siguiente sección de "Condiciones de Cultivo". En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2, NA2, NA2F, MAN5 y NA2G1F y una cantidad disminuida de NGA2F en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo anti-FRA tiene una cantidad incrementada de NGA2 , por ejemplo por lo menos un incremento al doble o un incremento al triple en el NGA2 en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA comprende aproximadamente 9% de glicoformas no fucosiladas. La invención también proporciona un. anticuerpo anti-FRA que tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NA2 , NGA2F y MA 5 y una cantidad disminuida de NA2G1F en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y NA2 en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NA2 y NGA2 en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y NA2 y una cantidad disminuida de NA2F en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2F, NA2 y MA 5 en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2, M3N2F y NA2 en comparación con el perfil del anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia.

En estos perfiles, la cantidad de M3N2, M3N2F y MAN5 puede ser incrementada por al menos' aproximadamente 2 veces o más . La cantidad de NA2 puede ser incrementada por al menos aproximadamente 10 veces o más. La cantidad de NA2F puede ser incrementada por al menos aproximadamente 2 veces o más. La cantidad de NA2F puede ser disminuida por al menos aproximadamente 40% o más o puede ser incrementada por al menos aproximadamente 2 veces o más. La cantidad de NA2G1F puede ser disminuida por al menos aproximadamente 25% o 30% o más, y la cantidad de NGA2F puede ser incrementada por al menos aproximadamente 10% o 15% o más.

En modalidades particulares, el anticuerpo monoclonal anti-FRA es el anticuerpo monoclona.1 MORAb-003. El "MORAb-003" se refiere a un anticuerpo anti-FRA que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7 y se produce bajo las condiciones de cultivo de referencia y es suministrado por un fabricante externo. Las constantes de enlace cinéticas y de régimen permanente entre el estándar de referencia del anticuerpo MORAb-003 y el FR-a purificado se han determinado mediante la espectroscopia de resonancia de plasmón superficial. La constante de asociación (ka) se determinó que era (2.25. +- .0.02 ) M^s"1 y la constante de separación (kD) se determinó que era ( 5.02. +- .0.08 ) s"1. Se ha determinado que una constante de disociación de régimen permanente (KD) es 2.23 nM (Publicación de Patente de los Estados Unidos 20050232919) .

En varias modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-FRA que tiene una afinidad de enlace disminuida, ADCC incrementada o disminuida, eficiencia de interiorización reducida o tasa de interiorización incrementada en comparación con un anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de referencia.

Como se utiliza en este documento, los glicanos neutros unidos a N se adhieren al sitio de glicosilación conservado o una posición correspondiente (Asn299 en la SEC ID NO: 5) . Como se utiliza en este documento, un "perfil de glicanos neutros unidos a N" de un anticuerpo anti-FRA comprende las estructuras de glicanos neutros mostradas en la Figura l. Estas estructuras incluyen los glicanos procesados parcialmente M3N2, M3N2F y MAN5 y los glicanos procesados completamente NGA2 (GO) , NGA2F (GOF) , NA2G1F (GIF), NA2 (G2) y NA2F (G2F) . Para los fines de esta solicitud, "GO" se refiere a glicanos agalactosilados , "Gl" se refiere a glicanos monogalactosilados y "G2" . se refiere a glicanos digalactosilados .

El perfil de glicanos del anticuerpo de la invención se puede determinar como se describe en el Ejemplo 2. En resumen, los glicanos unidos a N que se adhieren a la cadena pesada de anticuerpo son retirados enzimáticamente utilizando peptidil-N-glicosidasa F (PNGasa F) y se purifican por medio de la cromatografía de filtración en gel. La mezcla de glicanos resultante es etiquetada de manera fluorescente utilizando, por ejemplo, 2 -aminobenzamida (2-AB) y se resuelve por medio de la HPLC de fase normal. Los glicanos etiquetados de manera fluorescente se cuantifican mediante la fluorescencia. La identificación de glicanos a partir de los picos que surgen durante la separación se realiza mediante la detección espectrométrica de masas en línea. Los glicanos unidos a N complejos se pueden etiquetar después de la remoción enzimática utilizando cualquier fluoróforo adecuado (por ejemplo, ácido 2 -aminobenzoico (2-AA) , 2 -aminobenzamida (2-AB) , 2-aminopiridina (2-AP) , ácido 8 -Aminonaftalen-1 , 3 , 6-trisulfónico (ANTS) , 2 -Aminoacridona (AMAC) o ácido 9-Aminopiren-1 , 3 , 6 -trisulfónico (APTS) ) , o utilizando radioisótopos, o utilizando pequeñas etiquetas químicas que pueden ser detectadas por sí mismas utilizando otros medios (por ejemplo, biotina) . Los glicanos complejos, ya sea etiquetados o no etiquetados, luego se pueden separar por medio de una variedad de métodos, que incluyen HPLC (fase inversa, fase normal, intercambio aniónico) y métodos electroforéticos basados en gel o capilares y se pueden enumerar por medio de técnicas de fluorescencia, amperométricas pulsadas, de índice refractivo, dispersión de luz evaporativa y espectrométricas de masas.

De acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células que expresan el anticuerpo. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica una cadena pesada, una cadena ligera o ambas se insertan en un vector de expresión y se pueden unir de manera operable a secuencias de control de expresión tal como secuencias de control de transcripción y traducción.

Las secuencias "unidas de manera operable" incluyen tanto las secuencias de control de expresión que están contiguas con el gen de interés como las secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" utilizado en este documento significa secuencias de polinucleótidos que afectan la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de expresión pueden incluir, secuencias apropiadas de inicio de transcripción, terminación, promotoras e intensificadoras ; señales de procesamiento de ARN tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que incrementan la eficacia de traducción (es decir, secuencia consensual Kozak) ; secuencias que incrementan la estabilidad de proteínas; y cuando se desea, secuencias que incrementan la secreción de proteínas. El carácter de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedera; en los eucariotes, generalmente, estas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias de líder y secuencias de socio de fusión.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV) , episomas derivados de EBV y similares. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, una cadena de anticuerpo o un fragmento de enlace a antígenos de la invención se liga en un vector de tal manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para su función proyectada que consiste en regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. Como es bien sabido para un trabajador experto, el vector de expresión y secuencias de control de expresión se seleccionan para que sean compatibles con el nivel de expresión deseado, la célula hospedera de expresión que se utiliza y similares. Los ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera o fragmento de anticuerpo y la cadena pesada o fragmento de anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o en el mismo vector de expresión. Los ácidos nucleicos se insertan en el vector de expresión por medio de métodos estándar (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el (los) ácido (s) nucleico (s) y el vector que codifica (n) el anticuerpo o ligadura de extremos romos si no están presentes sitios de restricción) .

Las líneas de células de mamíferos que son útiles como hospederas para la expresión son bien conocidas¦ en el campo e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de the American Type Culture Collection (ATCC) . Estas incluyen, ínter alia, las células de ovario de hámster chino (CHO) (tales como la célula CHO-K1) , células NSO, células SP2 , células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés) , células de riñon de mono verde africano (COS) , células de carcinoma hepatocelular de humano (por ejemplo Hep G2) , células A549 y una variedad de otras líneas de células. Las líneas de células que se prefieren particularmente se seleccionan a través de la determinación de cuales líneas de células tienen niveles de expresión altos. En una modalidad, las células no son líneas de células mutantes sensibles a la temperatura. En otra modalidad, las células son líneas de células mutantes sensibles a la temperatura. En algunas modalidades, las células hospederas son células de CHO, células CHO-K1 o células GS CHO-K1.

En algunas modalidades, un vector de expresión recombinante que codifica un anticuerpo se introduce en células hospederas de mamífero y los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células hospederas durante un periodo de tiempo que es suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se desarrollan las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteínas.

Además, la expresión a partir de líneas de células de producción se puede incrementar utilizando una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de genes de glutamina sintetasa (el sistema GS) es un planteamiento común para incrementar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se plantea por completo o parcialmente en relación con las Patentes Europeas Nos. 216 846, 256 055, 323 997 y 338 841, incorporadas en este documento a manera de referencia en su totalidad.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para la producción de un anticuerpo anti-FRA utilizando una variedad de condiciones de cultivo de células. Como se utiliza en este documento, las "condiciones de cultivo de referencia" se refieren a las células cultivadas en biorreactores de producción de tanque agitado de 2L en el medio CD-CHO (Invitrogen) a 180 rpm. El pH del cultivo de células de referencia está en el intervalo de 6.9 - 7.1. Por ejemplo, el pH puede ser de 7.0. La concentración de glucosa del cultivo de células de referencia es de 1 g/L a 4 g/L o de 1 g/L a 3 g/L. La temperatura del cultivo de células de referencia es de aproximadamente 36 a 38°C. Por ejemplo, la temperatura puede ser de 36.5°C. La concentración de C02 es de aproximadamente 5%. La osmolaridad de referencia del medio de cultivo de células se encuentra en el intervalo de 250 a 350 mOsm/L. El medio de cultivo de células de referencia no contiene butirato de sodio o cloruro de cobre. La tensión de oxígeno disuelto (DO) del medio de cultivo de células de referencia se encuentra en el intervalo de 30 a 100%. Por ejemplo, el DO del medio de cultivo de células de referencia está entre 30% y 40%. El tiempo de recolección para los anticuerpos cultivados bajo las condiciones de cultivo de células de referencia puede ser de 13 a 15 días, por ejemplo, 14 días (es decir, 336 horas) después del inicio del cultivo de células, lo cual se espera que sea el tiempo en que la viabilidad del cultivo sea 50%. Las muestras "estándar de referencia MORAb-003", "estd. de ref. MORAb-003" y el "estándar de referencia" descritas en las Figuras comprenden la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera en la SEC ID NO: 7 y fueron producidas por células cultivadas bajo las condiciones de cultivo de referencia descritas previamente y fueron suministradas por un fabricante externo.

En algunas modalidades, las condiciones de cultivo se varían durante la fase de crecimiento y/o la fase de estado latente. Un cultivo discontinuo es una población de células desarrolladas en un sistema cerrado. La curva, de crecimiento típica para una población de células en un cultivo discontinuo comprende una fase de estado latente, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. La fase de estado latente se refiere a la primera etapa del ciclo de crecimiento cuando una población se toma de un ambiente de crecimiento antiguo a un ambiente nuevo, donde las células se adaptan a la nueva fuente de nutrientes; sintetizando ARN, proteínas y otras moléculas pero aún sin dividirse. La longitud de este periodo puede ser breve o prolongada, dependiendo de la historia del cultivo y las condiciones de crecimiento .

Por ejemplo, la invención proporciona métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción del tiempo de cultivo utilizando galactosa como fuente de azúcar. En algunas modalidades, la galactosa se utiliza como la fuente de azúcar desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. En otras modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo utilizando glucosa como fuente de azúcar y durante un segundo periodo de tiempo utilizando galactosa como fuente de azúcar. Por ejemplo, de acuerdo cori los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por el cultivo de células utilizando glucosa como fuente de azúcar en la fase de estado latente y utilizando galactosa como fuente de azúcar en la fase de crecimiento. En algunas modalidades, las células se cultivan utilizando galactosa como fuente de azúcar desde el día 0 al día 14, o iniciando cualquier día desde 2 al día 10, o preferiblemente iniciando desde el día 3, día 4, día 5, día 6 o día 7. Para cualquiera de los métodos anteriores, la concentración de galactosa puede ser de 0.01 g/L a 20 g/L, preferiblemente de 1 g/L a 10 g/L o más preferiblemente de 2 g/L a 4 g/L. En algunas modalidades, la concentración de galactosa puede ser 2 g/L.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2, NA2 , NA2F, MAN5 y NA2G1F y una cantidad disminuida de NGA2F, en comparación con un estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar tiene' un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de M3N2F y/o una cantidad incrementada de NA2F y/o una cantidad incrementada de NA2G1F y/o una cantidad disminuida de NGA2F, en comparación con un anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de. la glicoforma M3N2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar puede ser por lo menos 30% reducida en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar puede ser incrementada por lo menos dos veces en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2G1F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar puede ser incrementada por lo menos 40% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10).. En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NGA2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar puede ser disminuida por lo menos 25% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 1 : 1.7 : 60 : 20 : 16 : 365 : 370. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.12% de M3N2, 0.14% de M3N2F, 0.2% de NA2, 7.06% de NA2F, 2.42% de MAN5 , 1.9% de NGA2 , 43.73% de NA2G1F y 44.43% de NGA2F. En algunas modalidades, por lo menos 6% o 7% de los glicanos neutros en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar puede ser de la glicoforma NA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas utilizando galactosa como fuente de azúcar tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 4.64% de glicoformas no fucosil.adas y 95.36% de glicoformas fucosiladas .

La invención proporciona además métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción del tiempo de cultivo a una temperatura baja. En algunas modalidades, las células se cultivan a una temperatura baja desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. En otras modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo a una primera temperatura y durante un segundo periodo de tiempo a una temperatura más baja. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células utilizando una primera temperatura en la fase de estado latente y utilizando una temperatura más baja en la fase de crecimiento. La primera temperatura puede ser de aproximadamente 36 a 38°C. La temperatura más baja puede ser de aproximadamente 28 a 35°C, o de aproximadamente 30 a 33 °C, o de aproximadamente 30 a 31°C y puede ser de aproximadamente 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C o 35°C. En algunas modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo a una temperatura de 36.5°C y durante un segundo periodo de tiempo a 30°C. Las células se pueden cultivar a una temperatura más baja desde el día 0 hasta el día 14 o iniciando en cualquier día desde el día 2 hasta el día 10, o preferiblemente iniciando desde el día 3, el día 4 o el día 5.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a una temperatura más baja tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NGA2 en comparación con los estándares de referencia de anticuerpo anti-FRA. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a una temperatura más baja tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NGA2 y/o una cantidad disminuida de NA2G1F, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a una temperatura más baja tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de glicoformas no fucosiladas, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NGA2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a temperatura baja puede ser incrementada por lo menos dos veces en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2G1F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a temperatura baja puede ser disminuida por lo menos 30% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado a una temperatura más baja tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 13 : 2.5 : 70 : 100 : 350 : 1050 : 3500. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a una temperatura más baja tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.02% de M3N2 , 0.25% de M3N2F, 0.05% de NA2, 1.36% de NA2F, 2.04% de MAN5 , 6.98% de NGA2 , 68.52% de NA2G1F y 90.92% de NGA2F. En algunas modalidades, por lo menos 6% o 7% de los glicanos neutros en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a temperatura baja puede ser de la glicoforma NGA2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a una temperatura más baja puede comprender aproximadamente 9% de glicoformas no fucosiladas. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a temperatura baja tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 9.09% de glicoformas no fucosiladas y 90.92% de glicoformas fucosiladss.

La invención también proporciona métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción del tiempo de cultivo con una osmolaridad alta. En algunas modalidades, las células se cultivan con una osmolaridad alta desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. En otras modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo con una osmolaridad de referencia y durante un segundo periodo de tiempo con una osmolaridad más alta. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células utilizando una osmolaridad de referencia en la fase de estado latente y utilizando una osmolaridad más alta en la fase de crecimiento. La osmolaridad de referencia puede estar en los intervalos de 250 a 350 raOsm/L. La osmolaridad alta puede ser de 360 a 800 mOsm/L o de 400 a 650 mOsm/L. En algunas modalidades, las células se cultivan a aproximadamente 450 mOsm/L, 475 mOsm/L, 500 mOsm/L, 525 mOsm/L, 550 mOsm/L, 575 mOsm/L, 600 mOsm/L, 625 mOsm/L o 650 mOsm/L. En algunas modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo a 250-350 mÓsm/L y un segundo periodo de tiempo a 600 mOsm/L. Las células se pueden cultivar con una osmolaridad alta desde el día 0 al día 14, o iniciando cualquier día desde el día 2 al día 10, preferiblemente iniciando cualquier día desde el día 3 al día 5, es decir, cultivando las células con una osmolaridad más alta, como se describe en este documento, iniciando en el día 2, día 3, día 4 o día 5.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NA2, MA 5 y NGA2F y una cantidad disminuida de NA2G1F en comparación con el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de MAN5 y/o una cantidad disminuida de NA2G1F y/o una cantidad incrementada de NGA2F, en comparación con el anticuerpo anti- FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma MAN5 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta puede ser incrementada por lo menos 40% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2G1F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta puede ser disminuida por lo menos 30% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NGA2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta puede ser incrementada por lo menos 15% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB810-10) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado con osmolaridad alta tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 3 ; 3 : 15 : 43 : 33 : 250 : 900. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.08% de M3N2 , 0.25% de M3N2F, 0.23% de NA2, 1.23% de NA2F, 3.4% de MA 5 , 2.63% de NGA2 , 19.57% de NA2G1F y 72.6% de NGA2F. En algunas modalidades, por lo menos 3% o 4% de los glicanos neutros en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta puede ser de la glicoforma MAN5. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas con osmolaridad alta tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 6.34% de glicoformas no fucosiladas y 93.65% de glicoformas fucosiladas.

La invención proporciona además métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción¦ del tiempo de cultivo en presencia de butirato de sodio. En algunas modalidades, las células se cultivan en presencia de butirato de sodio desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. En otras modalidades, las células se cultivan durante un o primer periodo de tiempo en ausencia de butirato de sodio y durante un segundo periodo de tiempo en presencia de butirato de sodio. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células en ausencia de butirato de sodio en la fase de estado latente y en presencia de butirato de sodio en la fase de crecimiento. En algunas modalidades, el butirato de sodio se puede utilizar a una concentración de 0.01 mM - 90 mM o 0.01 mM - 16 mM. En algunas modalidades, el butirato de sodio se puede utilizar a una concentración de 0.5 mM o 10 mM. En algunas modalidades, el butirato de sodio se agrega en el día 6 después del inicio del cultivo. Las células se pueden cultivar en presencia de butirato de sodio desde el día 0 hasta el día 14, o iniciando en cualquier día desde el día 2 hasta el día 10, preferiblemente iniciando en el día 3, día 4, día 5, día 6 o día 7.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y NA2 en comparación con el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA. producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de MA 5 , en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En otras modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de M3N2 y/o una cantidad incrementada de M3N2F y/o una cantidad disminuida de NA2 y/o una cantidad incrementada de MAN5, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma MAN5 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio puede ser disminuida por lo menos 25% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma MA 5 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio puede ser incrementada por lo menos 30% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato dé sodio puede ser disminuida por lo menos 75% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio puede ser incrementada por lo menos 70% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforraa NA2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio puede ser disminuida por lo menos 75% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de 3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 1.7 : 3 : 18 : 16 : 23 : 200 : 450. En otras modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 8 : 3 : 40 : 80 : 55 : 500 : 1500. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.14% de M3N2 , 0.24% de M3N2F, 0.47% de NA2, 2.49% de NA2F, 2.19% de MA 5 , 3.26% de NGA2 , 28.66% de NA2G1F y 62.55% de NGA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.05% de M3N2 , 0.4% de M3N2F, 0.13% de NA2, 1.83% de NA2F, 4.11% de MA 5 , 2.77% de NGA2 , 25.33% de NA2G1F y 65.38% de NGA2F. En algunas modalidades, por lo menos 4% o 5% de los glicanos neutros en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio puede ser de la glicoforma MA 5. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 6.06% de glicoformas no fucosiladas y 93.94% de glicoformas fucosiladas . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de butirato de sodio tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 7.06% de glicoformas no fucosiladas y 92.94% de glicoformas fucosiladas.

La invención proporciona además métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción del tiempo de cultivo en una tensión baja de oxígeno disuelto (DO) . En algunas modalidades, las células se cultivan en una tensión baja de DO desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. En otras modalidades, las células- se cultivan durante un primer periodo de tiempo en un DO de referencia y durante un segundo periodo de tiempo en un DO más bajo. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células utilizando un DO de referencia en la fase de estado latente y utilizando un DO más bajo en la fase de crecimiento. El DO de referencia puede estar en el intervalo de 30-100%. Por ejemplo, el DO del medio de cultivo de células de referencia puede estar entre 30% y 40%. El DO más bajo puede ser un DO de 0%-25%, o 5%-25%, preferiblemente 5%-20%, 5%-15%, 5%-10%, tal como aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15%. En algunas modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo en una tensión de DO de 30% y en un segundó periodo de tiempo en una tensión de DO de 5%. Las células se pueden cultivar en un DO bajo iniciando cualquier día desde el día 2 hasta el día 10, preferiblemente desde el día 3 hasta. el día 7, tal como iniciando en el día 3, día 4, día 5, día 6 o día 7.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en un DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NA2 y NGA2 en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NA2 y M3N2 en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de M3N2 y/o una cantidad disminuida de A 5 y/o una cantidad incrementada de NGA2 y/o una cantidad incrementada de NA2G1F y/o una cantidad disminuida de NGA2F, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de glicoformas no fucosiladas, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de 3N2, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo puede ser disminuida por lo menos 95% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No.. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicofbrma MAN5 en el anticuerpo anti'-FRA producido por células cultivadas a DO bajo puede ser disminuida por lo menos 25% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NGA2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a DO bajo puede ser incrementada por lo menos 2 veces en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de las glicoformas no fucosiladas en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a DO bajo puede ser incrementada por ló menos 40% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2G1F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a DO bajo puede ser incrementada por lo menos 20% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NGA2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas a DO bajo puede ser disminuida por lo menos 15% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia ' (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2 en el anticuerpo anti-F A producido por células cultivadas en DO bajo puede ser disminuida por lo menos 80% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 20 : 50 : 280 : 220 : 650 : 3200 : 5500. En otras modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende, una relación de 3N2 : 3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 8 : 30 : 40 : 55 : 80 : 550 : 1800. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.01% de M3N2, 0.22% de M3N2F, 0.48% de NA2 , 2.8% de NA2F, 2.22% de MA 5 , 6.53% de NGA2, 31.98% de NA2G1.F y 55.75% de NGA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.04% de M3N2, 0.31% de M3N2F, 0.3% de NA2, 1.59% de NA2F, 2.23% de MAN5 , 3.17% de NGA2 , 21.9% de NA2G1F y 70.46% de NGA2F. En algunas modalidades, por lo menos 6% o 7% de los glicanos neutros en el anticuerpo anti-FRA producidos por células cultivadas en DO bajo puede ser de. la glicoforma NGA2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo puede comprender aproximadamente 9% o 10% de glicoformas no fucosiladas. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 9.24% de glicoformas no fucosiladas y 90.75% de glicoformas fucosiladas. En algunas . modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en DO bajo tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 5.74% de glicoformas no fucosiladas y 94.26% de glicoformas fucosiladas.

La invención también proporciona métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción del tiempo de cultivo en una concentración alta de C02. En algunas modalidades, las células se cultivan en una concentración alta de C02 desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. Preferiblemente, la concentración de C02 se incrementa después de la fase de estado latente. En otras modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo en una concentración de referencia de C02 y durante un segundo periodo de tiempo en una concentración alta de C02. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células que utiliza una concentración de referencia de C02 en la fase de estado latente y que utiliza una concentración alta de C02 en la fase de crecimiento. La concentración de referencia de C02 puede ser de aproximadamente 5%. La concentración alta de C02 puede ser 10%-30% o 10%-20%, es decir, aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, aproximadamente 12%, aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, aproximadamente 22%, aproximadamente 23%, aproximadamente 24%, aproximadamente 25%, aproximadamente 26%, aproximadamente 27%, aproximadamente 28%, aproximadamente 29% o aproximadamente 30%. En algunas modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo en una concentración de C02 de aproximadamente 5% y un segundó periodo de tiempo en una concentración de C02 de hasta 20%. Las células se pueden cultivar en una concentración alta de C02 iniciando cualquier día desde el día 2 al día 10, es decir, iniciando el día 2, día 3, día 4, día 5, día 6, día 7, día 8, día 9 o día 10.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en una concentración alta de C02 tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y NA2 y una cantidad disminuida de NA2F en comparación con el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en una concentración alta de C02 tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de NA2 y/o una cantidad disminuida de MA 5 , en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en una concentración alta de C02 puede ser disminuida por lo menos 60% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de. cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma MAN5 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en una concentración alta de C02 puede ser disminuida por lo menos 40% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado en una concentración alta de C02 tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 1.5 : 1 : 7 : 8 : 16 : 100 : 400. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en una concentración alta de C02 tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.19% de M3N2 , 0.27% de M3N2F, 0.23% de NA2, 1.34% de NA2F, 1.61% de MAN5 , 3.04% de NGA2, 19.51% de NA2G1F y 73.81% de NGA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en una concentración alta de C02 tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 5.07% de glicoformas no fucosiladas y 94.93% de glicoformas fucosiladas.

La invención proporciona además métodos para producir un anticuerpo anti-FRA mediante el cultivo de células capaces de expresar el anticuerpo durante por lo menos una porción del tiempo de cultivo en presencia de cloruro de cobre (CuCl) . En algunas modalidades, las células se cultivan en presencia de CuCl desde el día 0 hacia adelante, donde el día 0 es el día de la inoculación. En otras modalidades, las células se cultivan durante un primer periodo de tiempo en ausencia de CuCl y durante un segundo periodo de tiempo en presencia de CuCl. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención es producido por un cultivo de células en ausencia de CuCl en la fase de estado latente y en presencia de CuCl en la fase de crecimiento. El CuCl puede utilizarse en cualquier concentración de 0.01 µ? - 0.5 mM o de 0.01 mM -0.5 mM. En algunas modalidades, el CuCl se utiliza en una concentración de 0.5 mM. En algunas - modalidades, el CuCl puede agregarse iniciando cualquier día desde el día 0 hasta el día 14 después del inicio del cultivo. En algunas modalidades, el CuCl se agrega en el día 6 después del inicio del cultivo.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2, M3N2F y NA2 en comparación con el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y/o una cantidad incrementada de M3N2F y/o una cantidad disminuida de NA2 y/o una cantidad disminuida de MA 5 y/o una cantidad incrementada de NA2G1F y/o una cantidad disminuida de NGA2F, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia dé CuCl puede ser incrementada por lo menos 50% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl puede ser incrementada por lo menos 60% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65). En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl puede ser disminuida por lo menos 75% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma MAN5 en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia ' de CuCl puede ser disminuida por lo menos 25% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo dé células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2G1F en el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl puede ser incrementada por lo menos 30% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NGA2F en el anticuerpo anti-FRA . producido por células cultivadas en presencia de CuCl puede ser disminuida por lo menos 10% en comparación con el anticuerpo anti-F A producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB809-65) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA cultivado en presencia de CuCl tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 2 : 2 : 1 : 17 : 14 : 25 : 220 : 400. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.34% de M3N2, 0.37% de M3N2F, 0.15% de NA2 , 2.6% de NA2F, 2.16% de MAN5 , 3.88% de NGA2, 33.03% de NA2G1F y 57.46% de NGA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA producido por células cultivadas en presencia de CuCl tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 6.53% de glicoformas no fucosiladas y 93.46% de glicoformas fucosiladas.

De acuerdo con la invención, el anticuerpo anti-FRA se puede recolectar aproximadamente 10 días (240 horas) , 13 días, 14 días (336 horas) , 15 días, 17 días (408 horas) o 20 días (480 horas) después del inicio del cultivo de células.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y NA2 en comparación con el estándar de .referencia de anticuerpo anti-FRA. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 17 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2, NA2 y MAN5 en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 20 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de M3N2 y NA2 en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento .

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de M3N2 y/o una cantidad disminuida de M3N2F y/o una cantidad disminuida de MA 5, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad disminuida de glicoformas no fucosiladas, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días puede ser disminuida por lo menos 80% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma M3N2F en el anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días puede ser disminuida por lo menos 25% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma MAN5 en el anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días puede ser disminuida por lo menos 50% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, la cantidad de las glicoformas no fucosiladas en el anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 10 días puede ser disminuida por lo menos 25% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 10 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 6 : 8 : 40 : 30 : 70 : 550 : 1800. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 10 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.04% de M3N2, 0.24% de M3N2F, 0.31% de NA2, 1.48% de NA2F, 1.28% de MAN5 , 2.64% de NGA2 , 22.33% de NA2G1F y 71.68% de NGA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 10 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 4.27% de glicoformas no fucosiladas y 95.73% de glicoformas fucosiladas .

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 17 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una cantidad incrementada de NA2, en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, la cantidad de la glicoforma NA2 en el anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 17 días puede ser incrementada por lo menos 50% en comparación con el anticuerpo anti-FRA producido bajo las condiciones de cultivo de células de referencia (Lote No. NB859-25) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 17 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 2 : 3 : 13 : 20 : 18 : 170 : 440. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 17 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.15% de M3N2, 0.34% de M3N2F, 0.51% de NA2 , 1.9% de NA2F, 3.16% de MAN5 , 2.77% de NGA2, 24.87% de NA2G1F y 66.3% de NGA2F. En algunas modalidades, por lo menos 3% o 4% de glicanos neutros en el anticuerpo anti-FRA producido por células recolectadas en 17 días puede ser de la glicoforma MAN5. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 17 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 6.59% de glicoformas no fucosiladas y 93.41% de glicoformas fucosiladas.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 20 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende una relación de M3N2 : M3N2F : NA2 : NA2F : MAN5 : NGA2 : NA2G1F : NGA2F de aproximadamente 1 : 1.8 : 2.5 : 10 : 19 : 17 : 140 : 430. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 20 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 0.16% de M3N2, 0.29% de M3N2F, 0.4% de NA2 , 1.66% de NA2F, 2.96% de MA 5, 2.64% de NGA2 , 22.43% de NA2G1F y 69.45% de NGA2F. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA recolectado en 20 días tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N de aproximadamente 6.16% de glicoformas no fucosiladas y 93.83% de glicoformas fucosiladas.

La invención comprende un método para producir un anticuerpo anti-FRA utilizando una o más de las condiciones descritas anteriormente.

En una modalidad, el anticuerpo anti-FRA de la invención tiene afinidad de enlace alterada para el FRA humano en relación con el estándar de referencia anti-FRA. La afinidad de enlace en algunas modalidades puede ser reducida en comparación con un estándar de referencia MORAb-003 y reducidas en comparación con el anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia definidas en este documento (control positivo) . Estos anticuerpos se pueden producir mediante el cultivo de células hospederas que expresan el anticuerpo anti-FRA: utilizando galactosa como fuente de azúcar, a baja temperatura, con osmolaridad alta, en presencia de butirato de sodio, en DO bajo, en una concentración alta de C02, en presencia de cloruro de cobre, o mediante la recolección de células que expresan el anticuerpo anti-FRA 10, 17 o 20 días después del inicio del cultivo, .como se describe en este documento. En modalidades que utilizan galactosa como fuente de azúcar, se puede agregar 2 g/L de galactosa en 5 días después del inicio del cultivo. En modalidades que utilizan una temperatura baja, la temperatura de cultivo puede ser cambiada de 36.5°C a 30°C en 5 días después del inicio del cultivo. En modalidades que utilizan una osmolaridad incrementada, la osmolaridad del cultivo se puede incrementar a 600 mOsm/L al agregar NaCl en 7 días después del inicio del cultivo. En modalidades que utilizan una tensión reducida de oxígeno disuelto (DO) , el DO se puede cambiar de 30% a 5% en 6 días después del inicio del cultivo. En modalidades que utilizan butirato de sodio, se puede agregar butirato de sodio 0.5 mM o 10 mM en 6 días después del inicio del cultivo. En modalidades que utilizan cloruro de cobre, se puede agregar cloruro de cobre 0.5 mM en 6 días después del inicio del cultivo. En otras modalidades, la concentración de C02 en el medio se incrementó a 20% en 5 días después del inicio del cultivo.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el cultivo puede consistir de células de CHO, por ejemplo células CHO-Kl que comprenden ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: .5 o que codifican una secuencia que es por lo. menos 95% idéntica, y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 6 o la SEC ID NO: 7 o que codifican una secuencia que es por lo menos 95% idéntica. En particular, la célula puede comprender ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7, o que codifican secuencias que son por lo menos 95% idénticas a las secuencias mencionadas anteriormente. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica la cadena pesada comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 8 con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 9 con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder. En varias modalidades, el anticuerpo anti-FRA comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 o una secuencia que es por lo menos 95% idéntica, y la secuencia de aminoácidos de cadena de ligera de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 6 o la SEC ID NO: 7 o una secuencia que es por lo menos 95% idéntica. En modalidades particulares, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7 o secuencias que son por lo ménós 95% idénticas a las secuencias mencionadas anteriormente.

La afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA se puede medir por medio de ensayos ELISA, RIAs, citometría de flujo o resonancia de plasmón superficial, tal como BIACOREMR. El término "resonancia de plasmón superficial" , utilizado en este documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo - utilizando el sistema BIACOREMR (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.) . Para descripciones adicionales, véase Jonsson U. y colaboradores, Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. y colaboradores, Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. y colaboradores, J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995); y Johnsson B. y colaboradores, Anal. Biochem. 198:268-277 (1991).

La afinidad de enlace del anticuerpo anti-FRA se puede reducir por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% en relación con un anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. En varias modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención con enlace reducido al FRA humano comprende la secuencia de . aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 o una secuencia que es por lo menos 95% idéntica y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 6 O la SEC ID NO : 7 o una secuencia que es por lo menos 95% idéntica. En particular, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SE ID NO: 7, o secuencias que son por lo menos 95% idénticas a las secuencias mencionadas anteriormente.

Un anticuerpo monoclonal anti-FRA con afinidad de enlace reducida para el FRA humano es útil para el tratamiento del cáncer. Sin ser limitado por una teoría, la afinidad de enlace reducida puede permitir una penetración más profunda en los tumores, para permitir la fijación como objetivo de la masa tumoral interior. Véase, Adams y colaboradores, "High Affinity Restricts the Localization and Tumor Penetration of Single-Chain Fv Antibody Molecules" , Cáncer Res. 61:4750-4755 (15 de Junio de 2001) .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede tener citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) alterada en relación con un anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. En algunas modalidades, la ADCC se incrementa en comparación con el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA. En algunas modalidades, un anticuerpo, producido mediante el cultivo bajo una condición de cultivo alterada también tiene una ADCC incrementada en comparación con el anticuerpo producido bajo condiciones de referencia (control positivo) . En otras modalidades, la ADCC se incrementa en comparación con un control positivo pero se reduce en comparación con el estándar de referencia de anticuerpo. En aún otras modalidades, la ADCC se reduce en comparación con un control positivo y con el estándar de referencia de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales anti-FRA con ADCC incrementada son útiles para terapias donde el modo de acción es producir, funciones efectoras inmunes contra células objetivo que expresan el FRA, por ejemplo, para tratar enfermedades y condiciones donde se desea eliminar células que expresan el FRA. Los anticuerpos monoclonales anti-FRA con ADCC reducida son útiles en terapias donde el modo de acción es utilizar el anticuerpo como un agente de fijación como objetivo para suministrar una carga útil citotóxica a una célula objetivo. Sin ser limitado por una teoría, puede ser deseable reducir la actividad de ADCC para maximizar la concentración local del conjugado de anticuerpo, así como también la eficiencia de interiorización del anticuerpo. La interacción del anticuerpo con las células efectoras inmunes, como sería necesario para la ADCC, se predeciría que reduce la disponibilidad del conjugado de anticuerpo en la superficie celular y disminuye la eficiencia del conjugado de anticuerpo.

Como se utiliza en este documento, la ADCC es una actividad efectora inmune del anticuerpo. La ADCC puede ser mediada por receptores Fe en las células efectoras, las cuales incluyen pero no están limitadas a células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) o macrófagos, que conduce a la lisis de células y/o muerte dé las células objetivo que expresan el FRA. La ADCC de un anticuerpo anti-FRA de la invención se puede medir utilizando ensayos estándar conocidos en el campo (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0239911, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad) . Por ejemplo, una célula que expresa el FRA puede ser expuesta a varias concentraciones de un anticuerpo anti-FRA (o controles negativos tal como sin anticuerpo o Ig 10.5 de control) y células efectoras activadas, tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés) . La ADCC puede ser supervisada mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH, por sus siglas en inglés) que ocurre con la lisis de células de las células que expresan el FRA. La actividad de la LDH se puede medir por medio de un ensayo espectrofotométrico . La ADCC también se puede medir al etiquetar células que expresan el FRA con diacetato de carboxifluoreceína-éster-succinimidílico (CFDA SE) . Las células etiquetadas luego se mezclan con diluciones del anticuerpo anti-FRA y células efectoras no etiquetadas derivadas de PBMCs. Después de la incubación, las poblaciones de células se registran mediante la citometría de flujo por las células que expresan el FRA etiquetadas, viables, restantes.

En varias modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención puede producir una ADCC que es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo ' menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% más alta que aquella que ocurre en relación con un anticuerpo anti-FRA producido bajo "condiciones de cultivo de referencia" (es decir, estándar de referencia de anticuerpo y/o control positivo) como se define en este documento. En otras modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención puede producir una ADCC que es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% más baja que aquella que ocurre en relación con un anticuerpo anti-FRA producido bajo "condiciones de cultivo de referencia" como se define en este documento .

De acuerdo con los métodos de la invención, la ADCC de un anticuerpo anti-FRA se puede incrementar al cultivar células hospederas que expresan el anticuerpo a temperatura baja o en DO bajo como se describe en este documento. En algunas modalidades, la temperatura baja puede ser un cambio de 36.5°C a 30°C en 5 días después del inicio del cultivo. En algunas modalidades, el DO se puede cambiar de 30% a 5% en 6 días después del inicio del cultivo. De acuerdo con otros métodos, la ADCC se puede disminuir al recolectar el anticuerpo del cultivo antes de 13 días o después de 15 días del inicio del cultivo.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el cultivo puede consistir de células de CHO, por ejemplo células CHO-Kl que comprenden ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 o que codifican una secuencia que es por lo menos 95% idéntica, y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 6 o la SEC ID NO: 7 o que codifican una secuencia que es por lo menos 95% idéntica. En particular, la célula puede comprender ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID N : 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7, o que codifican secuencias que son por lo menos 95% idénticas a las secuencias mencionadas anteriormente. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica la cadena pesada comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 8 con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 9 con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder.

De acuerdo con la invención, la ADCC incrementada se correlaciona con una cantidad incrementada de glicanos NGA2 (GO) o glicanos no fucosilados en el anticuerpo anti-FRA y está correlacionada inversamente con la cantidad de glicanos M3N2F en el anticuerpo anti-FRA.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención se interioriza en una célula con el enlace al FRA en la superficie de la célula. Estos anticuerpos que se interiorizan se pueden conjugar con agentes quimioterapéuticos , tales como inmunotoxinas , radionúclidos o agentes citotóxicos y citostáticos . En una modalidad, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede tener una eficiencia de interiorización o tasa de interiorización alterada en relación con un anticuerpo producido bajo las condiciones de cultivo de referencia. Es este contexto, la eficiencia de interiorización se refiere a la capacidad con la cual el anticuerpo anti-FRA puede ser retenido dentro de una célula objetivo, mientras que la tasa de interiorización se refiere a la tasa en la cual un anticuerpo anti-FRA puede atravesar la membrana celular de una célula objetivo. Los ensayos estándar conocidos en el campo se pueden utilizar para supervisar la interiorización de un anticuerpo anti-FRA de la invención en células que expresan el FRA (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2006/0239911, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad) . Por ejemplo, las segundas inmunotoxinas , tal como el ensayo Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, EUA) , se pueden utilizar para supervisar la interiorización de un anticuerpo anti-FRA de la invención. Las segundas inmunotoxinas son conjugados de un anticuerpo secundario, tal como una IgG anti-humano de cabra, y la proteína inactivadora de ribosoma, saporina. Estas segundas inmunotoxinas se pueden seleccionar de modo que se enlacen a un anticuerpo anti-FRA de la invención. Si el anticuerpo anti-FRA se interioriza, la saporina inhibirá la síntesis de proteínas y causará la muerte de células. La viabilidad celular de las células que expresan el FRA expuestas al anticuerpo anti-FRA de la invención y una segunda inmunotoxina (o controles negativos) se pueden medir con ensayos estándar de viabilidad celular, tales como aquellos que leen el número de células viables mediante la espectrofotometría .

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención puede exhibir una tasa de interiorización que es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 99%, o por lo menos 99.9% más alta que un anticuerpo anti-FRA producido bajo "condiciones de cultivo de referencia" como se define en este documento. Un anticuerpo monoclonal anti-FRA con una tasa de interiorización incrementada es útil por ejemplo para conjugados de anticuerpos, donde la interiorización más rápida puede ser equivalente a los mejores agentes farmacodinámicos, y potencialmente una dosificación menos frecuente o más baja. Adicionalmente, para terapias en las cuales se desea retirar el antígeno de la superficie celular mediante la interiorización del complejo de anticuerpo-antígeno, una tasa de interiorización más rápida se esperaría que condujera a una eficiencia incrementada en la remoción del antígeno de la superficie celular. Por ejemplo, en terapias que fijan como objetivo las vías de señalización mediadas por FRA involucradas en el crecimiento de células cancerosas, el anticuerpo anti-FRA reduce la señalización de receptores mediante la remoción del receptor de la superficie celular mediante la interiorización.

En otras modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención exhibe una tasa de interiorización que es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%. o por lo menos 95% más baja que un anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento.

Un anticuerpo monoclonal anti-FRA con una tasa de interiorización reducida puede ser útil cuando el modo de acción terapéutico involucra tanto mecanismos intracelulares como una función efectora. Sin ser limitado por una teoría, un anticuerpo anti-FRA que se interioriza más lentamente permanece en la superficie celular y tiene oportunidad incrementada para una actividad efectora, que incluye ADCC y CDC: En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención puede tener una constante de interiorización semi-máxima de aproximadamente 57 minutos o 58 minutos. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención tiene una constante de interiorización semi-máxima de aproximadamente 36 minutos, 37 minutos, 41 minutos, 42 minutos, 45 minutos o 46 minutos. La constante de interiorización semi-máxima se puede determinar por medio de los ensayos de interiorización descritos en este documento, que incluyen el análisis de FACS .

En una modalidad, un anticuerpo anti-FRA de . la invención puede exhibir una eficiencia de interiorización reducida en comparación con la eficiencia de interiorización de un anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. Un anticuerpo anti-FRA con una eficiencia de interiorización reducida es útil para incrementar la disponibilidad del anticuerpo para el sistema inmune y para potenciar adicionalmente la ADCC o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención puede exhibir una eficiencia de interiorización que es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% más baja que un anticuerpo anti-FRA producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención puede tener un valor IC50 de interiorización de 1632 ng/mL o 990 ng/mL. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención tiene un valor IC50 de interiorización de 1632 ng/mL o 990 ng/mL. El valor IC50 y el valor EC50 se pueden determinar por medio de los ensayos de interiorización descritos en este documento.

La tasa de interiorización se puede incrementar al cultivar células hospederas que expresan el anticuerpo anti-FRA en DO bajo o al recolectar el anticuerpo anti-FRA 17 o 20 después del inicio del cultivo como se describe, en este documento. En algunas modalidades, el DO puede ser cambiado de 30% a 5% en 6 días después del inicio del cultivo.

En cualquiera de las modalidades anteriores, el cultivo puede consistir de células de CHO, por ejemplo células CHO-K1 que comprenden ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 o que codifican una secuencia que es por lo menos 95% idéntica, y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 6 o la SEC ID NO: 7 o que codifican una secuencia que es por lo menos 95% idéntica. En particular, la célula puede comprender ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7, o que codifican secuencias que son por lo menos 95% idénticas a las secuencias mencionadas anteriormente. En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica la cadena pesada comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 8 con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 9 con o sin los nucleótidos que codifican la secuencia líder.

Composiciones farmacéuticas En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-FRA de la invención, particularmente el anticuerpo MORAb-003, con una o más de las características alteradas que se describen en este documento y un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un "portador farmacéuticamente aceptable" puede ser un solvente, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables, solamente a manera de ilustración, son el agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes de humedecimiento o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humedecimiento o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, los cuales incrementan la vida útil en almacenamiento o la efectividad del anticuerpo.

Una composición que comprende el anticuerpo anti- FRA de esta invención puede estar en cualquier forma adecuada para la administración a un sujeto, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles) , dispersiones o suspensiones, aerosoles, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. Como apreciaría un trabajador experto, la forma depende del modo de administración y la aplicación terapéutica pretendidos. En algunas modalidades, una composición anti-FRA de la invención está en la forma de soluciones inyectables o infusibles, por ejemplo, las composiciones pueden ser similares a aquellas utilizadas para la inmunización pasiva de humanos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal , intramuscular) tal como mediante la infusión intravenosa o la inyección pero también se contempla la administración mediante una inyección intramuscular o subcutánea, rutas oral y nasal. Otros modos de administración contemplados por la invención incluyen intrabronquial , intramucosa, intraespinal , intrasinovial , intra-aórtica, ocular, ótica, tópica y bucal, e intratumoral .

En algunas modalidades, las composiciones de anticuerpo anti-FRA para uso terapéutico son estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La invención incluye composiciones formuladas como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada que es adecuada para una alta concentración de fármaco: Las soluciones inyectables estériles de la invención se pueden preparar al incorporar el anticuerpo anti-FRA en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por la esterilización por filtración. Las dispersiones que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención se pueden preparar al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado por congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo. La fluidez apropiada de la solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión o mediante el uso de surfactantes . Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que para prolongar la absorción de composiciones inyectables de la invención, uno puede incluir en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención se puede preparar con un portador que protegerá al anticuerpo contra la liberación rápida, es decir, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas . de suministro microencapsulados . Se pueden utilizar polímeros biocompatibles , biodegradables , tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones son conocidos generalmente para aquellas personas expertas en el campo. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems (J.R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978) .

En algunas modalidades, las composiciones que comprenden un anticuerpo anti-FRA de la invención comprenden además compuestos activos adicionales . En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-FRA de la invención es co-formulado con y/o co-administrado con uno o más agentes terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos adicionales. Los agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, un anticuerpo anti-FRA con una diferente especificidad fina, anticuerpos que se enlazan a otros objetivos, agentes anti-inflamatorios no esteroidales , agentes analgésicos, agentes anticáncer, esteroides, agentes anti-alergia, agentes quimioterapéuticos, agentes antineoplásicos y agentes citotóxicos.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención se puede co-formular con un anticuerpo u otro agente que se sabe que inhibe la proliferación de tumores o células cancerosas, por ejemplo, un anticuerpo o agente que inhibe el receptor de erbB2, E-selectina, EGF-R, CD20, VEGF (por ejemplo, AVASTINMR (bevacizumab) , LUCENTISR (ranibizumab) y MACUGENMR (pegaptanib) ) , receptor de VEGF 1 (VEGFR1) , receptor de VEGF 2 (VEGFR2) o receptor de VEGF 3 (VEGFR3) .

Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitación, GLEEVECMR (imatinib), ERBITUXMR (cetuximab) , L-asparaginasa, IRESSAMR (gefitinib) , TARCEVAMR (erlotinib) y VELCADEMR (bortezomib) y similares.

Más específicamente, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con agentes alquilantes. Los ejemplos de agentes alquilantes útiles incluyen, sin limitación, altretamina (hexametilmelamina) , busulfano, carboplatina, carmustina (BCNU) , clorambucilo , cisplatina, CYTOXA MR (ciclofosfamida) , dacarbazina (DTIC) , ifosfamida, lomustina, mecloretamina (mostaza nitrogenada) , melfaláno, oxalaplatina, estreptozocina, TEMODARMR (temozolomida) y tiotepa y similares.

El anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con antimetabolitos . Los ejemplos de antimetabolitos útiles incluyen, sin limitación, 5-fluorouracilo (5-FU) , 6 -mercaptopurina (6-MP) , XELODAMR (capecitabina) , ARA-CM (citarabina) , fludarabina, GEMZARMR (gemcitabina) , metotrexato y ALIMTAMR (pemetrexed) y similares .

El anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co- formulado con inhibidores de topoisomerasa I y II que incluyen, sin limitación, CAMPTOSARMR (HCl de irinotecan) , SN-38, camptotecina, HYCAMTINMR (topotecan) , etoposida, teniposida, ELLENCEMR (epirrubicina) , ADRIAMYCINMR (doxorrubicina) , idarrubicina, mitoxantrona, lamelarina D y HU-331 (Kogan y colaboradores (2007) Molecular Cáncer Therapeutics 6:173-183, incorporada en este documento a manera de referencia) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA 'de la invención puede ser co- formulado con antibióticos añtitumorales , tales como actinomicina-D, bleomicina y mitomicina-C y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con inhibidores mitóticos. Los ejemplos no limitantes de inhibidores mitóticos útiles incluyen EMCYTMR (estramustina) , IXEMPRAMR (ixabepilona) , TAX0TEREMR (docetaxel) , TATOLMR (paclitaxel) , VELBAN (vinblastina) , 0NC0VINMR (vincristina) y NAVELBINEMR (vinorelbina) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con agentes de diferenciación. Los ejemplos no limitantes de agentes de diferenciación útiles incluyen trióxido de arsénico, retinoides, tretinoína y TARGRETINM (bexaroteno) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con compuestos esteroides, tales como, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona y dexametasona y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con compuestos relacionados con hormonas. Los ejemplos no limitantes de compuestos relacionados con hormonas útiles incluyen estrógenos, progestinas (tal como MEGACEMR (acetato de megestrol) ) , FASLODEXMR (fulvestrant) , tamoxifeno, toremifeno, LUPRONMR (leuprolida) , ZOLADEXR (goserelina) , ARIMIDEXMR (anastrozol) , FE ARAMR (letrozol) , AROMASINMR (exemestano) , CAS0DEXMR (bicalutamida) , EULEXINMR (flutamida) y NILANDRONMR (nilutamida) .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II) . Los ejemplos no limitantes . de inhibidores de COX-II útiles incluyen CELEBREXMR (celecoxib) , valdecoxib y rofecoxib y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co- formulado con agentes inmunoterapéuticos . Los ejemplos no limitantes de agentes inmunoterapéuticos útiles incluyen los interferones (tal como el interferón-alfa) , BCG, interleucina-2 (IL-2) , talidomida, lenalidomida, CAMPATHMR (alemtuzumab) y RITUXANMR (rituximab) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-formulado con un inhibidor de MMP. Por ejemplo, el anticuerpo anti-FRA puede ser co-formulado con agentes anti-angiogénicos , tales como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2) o inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) . Los inhibidores de MMP preferidos son aquellos que no demuestran artralgia. Son más preferidos aquellos que inhiben selectivamente la MMP-2 y/o la MMP- 9 en relación con las otras metaloproteinasas de matriz (es decir MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP- 10, MMP-11, MMP-12 y' MMP-13) . Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP que son útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 y los compuestos expuestos en la siguiente lista: ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] - (1-hidroxicarbamoil-ciclopentil) -araino] -propiónico,- hidroxiamida del ácido 3-exo-3- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -8-oxa- biciclo [3.2.1] octan-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R, 3R) 1- [4- (2-cloro-4-fluoro-benciloxi) -bencensulfonil-] -3-hidroxi-3 -metil-piperidin-2 -carboxílico; hidroxiamida del ácido 4- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -tetrahidro-piran-4-carboxílico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] - (1-hidroxi-carbamoil-ciclobutil) -amino] -propiónico; hidroxiamida del ácido 4 - [4 - (4 -cloro- fenoxi ) -bencensulfonilamino] -tetrahidro-piran-4 -carboxílico; hidroxiamida del ácido (R) 3- [4- (4-cloro-fenoxi) -bencensulfonilamino] - tetrahidro-piran-3 -carboxílico ; hidroxiamida del ácido (2R,3R) 1- [4- (4-fluoro-2-metil-benciloxi) -bencensulfonil] -3 -hidroxi-3 -metil-piperidin-2-carbóxílico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] -(1-hidroxicarbamoil-l-metil-etil) -amino] -propiónico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] - (4-hidroxicarbamoil-tetrahidro-piran-4-il) -amino] -propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3- [4- (4 -cloro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -8-oxa-iciclo [3.2.1] octan-3 -carboxílico; hidroxiamida del ácido 3-endo-3- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -8-oxa-iciclo [3.2.1] octan-3 -carboxílico; e hidroxiamida del ácido (R) 3- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -tetrahidro-furan-3 -carboxílico y similares; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de los compuestos .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA puede ser co- formulado con un inhibidor de int.egrina. Los ¦ inhibidores de integrina incluyen, sin limitación, obtustatina, rodocetina, Vitaxina (Medlmmune) , cilengitida (EMD 121974, Merck), S137 (Pfizer),. S247 (Pfizer) y JSM6427 (Jerini) (véase, por ejemplo, Brown y colaboradores (2008) Tnternational Journal of Cáncer 123: 2195-2203; Stupp y colaboradores (2007) Journal of Clinical Oncology 25: 1637- 1638; Eble y colaboradores (2003) Biochem J. 376: 77-85, todos incorporados en este documento a manera dé referencia) .

Las composiciones de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo anti-FRA de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o una porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo es superado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa inicial de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva puede ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva .

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada, óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, varias dosis divididas se pueden administrar a través del tiempo o la -dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y la uniformidad de la dosificación. Una forma unitaria de dosificación utilizada en este documento se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que son tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico, deseado en asociación con el portador farmacéutico, requerido. La descripción para las formas unitarias de dosificación de la invención es dictada por o es dependiente directamente de (a) las características únicas del anticuerpo anti-FRA y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se logra y (b) las limitaciones inherentes en el campo de la combinación tal como un anticuerpo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos .

Un intervalo ejemplar no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo anti-FRA de la. invención es de 0.025 a 50 mg/'kg, de 0.1 a 50 mg/kg, de 0.1-25 mg/kg, de 0.1 a .10 mg/kg o de 0.1 a 3 mg/kg. En una modalidad, el anticuerpo anti-FRA se administra en una formulación como, una solución acuosa, estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5 y que comprende de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo, de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de TweenMR, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80 o polisorbato 20, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de un azúcar no reductor seleccionado de pero no limitado a trehalosa o sacarosa, de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de dihidrato de EDTA disódico y comprende opcionalmente un antioxidante farmacéuticamente aceptable además de un agente quelatante. Los antioxidantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, metionina, tiosulfato de sodio, catalasa y platino. Por ejemplo, la composición puede contener metionina en una concentración que varía de 1 mM a aproximadamente 100 mM y en particular, es aproximadamente 27 mM. En algunas modalidades, una formulación contiene 5 mg/ml de anticuerpo en un amortiguador de citrato de sodio 20 mM, pH 5.5, NaCl 140 mM y 0.2 mg/ml de polisorbato 80. Se debe observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la condición que es aliviada. Se debe entender además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a través del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en este documento son ejemplares únicamente y no tienen por objeto limitar el alcance o la práctica de la composición reclamada.

Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden el anticuerpo anti-FRA de la invención o una composición farmacéutica que comprende este anticuerpo anti-FRA. Un kit puede incluir, además del anticuerpo o composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para el uso en un método de diagnóstico o terapéutico, así como también un material de empaquetado tal como, pero no limitado a, hielo, hielo seco, poliestireno , espuma, plástico, celofán, envoltura de encogimiento térmico, envoltura de burbujas, cartón y bolitas a base de almidón. En una modalidad, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un agente de diagnóstico que se puede utilizar en un método descrito en este documento. En aún otra modalidad, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos que se pueden utilizar en el método descrito en este documento.

La invención también se refiere a composiciones y kits para inhibir el cáncer en un mamífero que comprenden una cantidad de un anticuerpo de la invención en combinación con una cantidad de un agente quimioterapéutico, en donde las cantidades del compuesto, sal, solvato o profármaco, y del agente quimioterapéutico son efectivas conjuntamente en la inhibición del crecimiento anormal de células. Muchos agentes quimioterapéuticos son conocidos actualmente en el campo. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabolitos , antibióticos de intercalación, inhibidores de quimiocina, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de respuestas biológicas, anti -hormonas , por ejemplo anti-andrógenos , y agentes anti-angiogénesis .

Métodos de diagnóstico Los anticuerpos anti-FRA de la invención se pueden utilizar para la detección in vitro o in vivo de FRA o células que expresan FRA en una muestra biológica. El anticuerpo anti-FRA se puede utilizar en un inmunoensayo convencional que incluye, sin limitación, un ensayo ELISA, RIA, citometría de flujo, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica de tejidos, inmunotransferencia Western o inmunoprecipitación . El anticuerpo anti-FRA de la invención se puede utilizar para detectar FRA de humanos.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar FRA en una muestra biológica. El método comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-FRA de la invención y detectar los anticuerpos enlazados. El anticuerpo anti-FRA se puede etiquetar directamente con una etiqueta detectable o puede no ser etiquetado. Si se utiliza un anticuerpo no etiquetado, un segundo anticuerpo u otra molécula que pueda enlazarse al anticuerpo anti-FRA que es etiquetado se utiliza para detectar un anticuerpo enlazado al FRA. Como es bien sabido para una persona experta en el campo, se selecciona un segundo anticuerpo que es capaz de enlazarse específicamente a la especie y clase concretas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo anti-FRA comprende una IgG de humano, entonces el segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-IgG de humano etiquetado. Otras moléculas que se pueden enlazar a anticuerpos incluyen, sin limitación, Proteína A y Proteína G, las cuales están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Pierce Chemical Co.

Las etiquetas adecuadas para el anticuerpo o molécula secundaria han sido dadas a conocer e incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, 0-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos adecuados de grupos protésicos incluyen estreptavidinibiotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina ; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye gadolinio; y los ejemplos de un material radiactivo adecuado incluyen 125I ; ¾31I f 35S 0 3H_ Los anticuerpos anti-FRA de la invención se pueden utilizar para determinar la presencia y/o nivel de FRA. en un tejido o en células, tales como células displásicas, derivadas del tejido. El tejido puede ser un tejido enfermo tal como un tumor o una biopsia del mismo. Las células pueden ser, por ejemplo, células de cáncer ovárico, pancreático, prostático o pulmonar. La detección puede ser en una muestra de tejido o in vivo. Un anticuerpo anti-FRA de la invención se puede utilizar de acuerdo con la invención para detectar y/o cuantificar el FRA en un tejido, los niveles de FRA en la superficie celular o la localización de FRA por medio de los métodos planteados anteriormente.

Los anticuerpos de la presente invención, especialmente los anticuerpos humanizados también se pueden utilizar in vivo para detectar el FRA en tejidos y órganos, por ejemplo en tumores que expresan el FRA. Para la detección in vivo del FRA,. un anticuerpo anti-FRA etiquetado se administra a un paciente necesitado de esta prueba de diagnóstico y el paciente se sujeta al análisis de imagenlogía con el propósito de determinar la ubicación de los tejidos que expresan el FRA. El análisis de imagenologia es bien conocido en el campo médico e incluye, sin limitación, el análisis de rayos x, la imagenologia de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) o la tomografía computarizada (CE, por sus siglas en inglés) . En otra modalidad del método, una biopsia de tumor o tejido se obtiene del paciente para determinar si expresa el FRA. Para la imagenologia, el anticuerpo anti-FRA se puede etiquetar con un agente detectable que puede ser transformado en imagen en un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-FRA puede ser etiquetado con un agente de contraste, tal como bario, el cual se puede utilizar para el análisis de rayos x, o un agente de contraste magnético, tal como un quelato de gadolinio, el cual se puede utilizar para MRI o CE. Otros agentes . de etiquetado incluyen, sin limitación, radioisótopos, tal como 99Tc . De acuerdo con la invención, el anticuerpo anti-FRA también podría estar no etiquetado y la imagenología es mediante la administración de un segundo anticuerpo u otra molécula que es detectable y que se puede enlazar al anticuerpo anti-FRA.

Métodos Terapéuticos En otro aspecto, la invención proporciona métodos para utilizar un anticuerpo anti-FRA de la invención para la terapia. Los métodos de la invención incluyen la reducción del crecimiento, proliferación o supervivencia de células que expresan FRA in vitro o in vivo. La invención proporciona además un método para tratar el cáncer en un sujeto necesitado del mismo, que comprende el paso que consiste en administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal anti-FRA de la invención. En varias modalidades, el cáncer es 'cáncer de ovario, mama, renal, colorrectal, pulmonar, endometrial, cerebral, de trompas de falopio o uterino o leucemia. La invención también proporciona un método para reducir el crecimiento de células displásicas que están asociadas con la expresión incrementada de FRA en un sujeto necesitado del mismo, que comprende el paso que consiste en administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal anti-FRA de la invención. En varias modalidades, las células displásicas son células de cáncer de ovario, mama, renal, colorrectal, pulmonar, endometrial, cerebral, de trompas de falopio, uterino o células de leucemia. En modalidades preferidas, el sujeto es un humano.

En una modalidad, la invención proporciona métodos para inhibir la actividad de FRA que comprenden poner en contacto o exponer una célula que expresa FRA con o a un anticuerpo anti-FRA. En algunos métodos, el anticuerpo anti-FRA se administra a un sujeto necesitado del mismo. El sujeto puede estar sufriendo de una enfermedad o condición caracterizada por la displasia o la expresión incrementada de FRA. Los ejemplos no limitantes incluyen cáncer, crecimiento de tumores y trastornos hiperproliferativos . El sujeto puede ser un sujeto humano o un sujeto veterinario, que incluye un modelo animal no humano de una enfermedad humana. El anticuerpo anti-FRA se puede utilizar en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una condición caracterizada por la displasia o la expresión incrementada de FRA.

De acuerdo con los métodos de la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención se puede administrar puro o se puede incorporar en una composición farmacéutica que es adecuada para la administración a un sujeto. La composición farmacéutica puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable tal como un solvente, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen pero no están limitados a uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como cantidades de humedecimiento o menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humedecimiento o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, los cuales incrementan la vida útil en almacenamiento o la efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.

El anticuerpo anti-FRA se puede administrar una o múltiples veces. Donde se utilizan múltiples administraciones, éstas pueden ser diarias, semanales, mensuales o si fuera apropiado periódicamente incluyendo múltiples dosis diarias. La administración puede ser en un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo anti-FRA también se puede administrar continuamente, por ejemplo, por vía de una minibomba. El anticuerpo anti-FRA se puede administrar, por ejemplo, por vía de una ruta mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral o intratumoral . El anticuerpo anti-FRA se puede administrar una vez, por lo menos dos veces o durante por lo menos el periodo de tiempo hasta que la condición sea tratada, mitigada a curada. El anticuerpo anti-FRA se administrará generalmente siempre que la condición esté presente o durante más tiempo para impedir la recurrencia de la condición. El anticuerpo anti-FRA se administrará generalmente como parte de una composición farmacéutica como se describiera supra. La dosificación del anticuerpo anti-FRA estará generalmente en el intervalo de 0.1 a 100 mg/kg, más preferiblemente de 0.5 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 1 a 20 mg/kg y aún más preferiblemente de 1 a 10 mg/kg. La concentración en suero del anticuerpo anti-FRA se puede medir por medio de cualquier método conocido en el campo.

En otra modalidad, el anticuerpo anti-FRA se puede coadministrar con otro agente terapéutico que incluye otro anticuerpo anti-FRA. El agente terapéutico adicional también puede ser un oligonucleótido que reduce la expresión de FRA mediante la interferencia de ARN, que incluye 'moléculas de ácido nucleico de cadena individual o de doble cadena. En el caso de un sujeto que sufre de un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer o un tumor, el agente terapéutico adicional puede ser un agente antineoplásico . En un aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un sujeto necesitado del mismo que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-FRA de la invención en combinación con un agente anti-tumoral seleccionado del grupo que consiste de, pero que no está limitado a, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabolitos, agentes de intercalación, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de respuestas biológicas, anti-hormonas , inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteasa de matriz, agentes terapéuticos genéticos, anti-andrógenos , agentes antineoplásicos y agentes citotóxicos . En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-FRA o una terapia de combinación se administra junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia.

De acuerdo con la invención, un anticuerpo anti-FRA de la invención se puede administrar con un anticuerpo u otro agente que se sabe que inhibe la proliferación de células tumorales o cancerosas, por ejemplo, un anticuerpo o agente que inhibe el receptor de erbB2 , E-selectina, EGF-R, CD20, VEGF (por ejemplo, AVASTINMR (bevacizumab) , LUCENTISMR (ranibizuraab) y MACUGENMR (pegaptanib) ) , receptor de VEGF 1 (VEGFRl) , receptor de VEGF 2 (VEGFR2) o receptor de VEGF 3 (VEGFR3) y similares.

El anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con agentes quimioterapéuticos que incluyen, sin limitación, GLEEVECMR (imatinib) , ERBITUXMR (cetuximab) , L-asparaginasa, IRESSAM (gefitinib) , TARCEVAR (erlotinib) y VELCADEMR (bortezomib) y similares.

Más específicamente, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con agentes alquilantes. Los ejemplos de agentes alquilantes útiles incluyen, sin limitación, altretamina (hexametilmelamina) , busulfano, carboplatina, carmustina (BCNU) , clorambucilo, cisplatina, CYTOXA MR (ciclofosfamida) , dacarbazina (DTIC) , ifosfamida, lomustina, mecloretamina (mostaza nitrogenada) , melfalano, oxalaplatina, estreptozocina, TEMODAR ( temozolomida) y tiotepa y similares.

El anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con antimetabolitos . Los ejemplos de antimetabolitos útiles incluyen, sin limitación, 5-fluorouracilo (5-FU) , 6 -mercaptopurina (6-MP) , XEL0DAR (capecitabina) , ARA-CMR (citarabina) , fludarabina, GEMZARMR (gemcitabina) , metotrexato y ALIMTAMR (pemetrexed) y similares .

El anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con inhibidores de topoisomerasa I y II que incluyen, sin limitación, CAMPTOSARMR (HCl de irinotecan) , SN-38, camptotecina, HYCAMTINMR (topotecan) , etopósida, tenipósida, ELLENCEMR (epirrubicina) , ADRIAMYCINMR (doxorru icina) , idarrubicina, mitoxantrona, lamelarina D y HU-331 (Kogan y colaboradores (2007) " Molecular Cáncer Therapeutics 6: 173-183) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con antibióticos antitumorales , tales como actinomicina-D, bleomicina, mitomicina-C y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con inhibidores mitóticos . Los ejemplos no limitantes de inhibidores mitóticos útiles incluyen EMCYTMR (estramustina) , IXEMPRAMR (ixabepilona) , TAXOTEREMR (docetaxel) , TATOLMR (paclitaxel) , VELBANR (vinblastina) , ONCOVINR (vincristina) y NAVELBINEMR (vinorelbina) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con agentes de diferenciación. Los ejemplos no limitantes de agentes de diferenciación útiles incluyen trióxido de arsénico, retinoides, tretinoína y TARGRETINMR (bexaroteno) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con compuestos esteroides, tales como, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona y dexametasona y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con compuestos relacionados con hormonas. Los ejemplos no limitantes de compuestos relacionados con hormonas útiles incluyen estrógenos, progestinas (tal como MEGACER (acetato de megestrol) ) , FASLODEXMR (fulvestrant) , tamoxifeno, toremifeno, LUPRONMR (leuprolida) , ZOLADEXMR (goserelina) , ARIMIDEXMR (anastrozol) , FEMARAMR (letrozol) , AROMASI MR (exemestano) , CASODEXMR (bicalutamida) , EULEXINR ( flutamida) , ILANDRONR (nilutamida) y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con un inhibidor de COX-II (ciclooxigenasa II) . Los ejemplos no limitantes de inhibidores de COX-II útiles incluyen CELEBREXMR (celecoxib) , valdecoxib y rofecoxib y similares.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con agentes inmunoterapéuticos . Los ejemplos no limitantes de agentes inmunoterapéuticos útiles incluyen los interferones (tal como el interferón-alfa) , BCG, interleucina- 2 (IL-2) , talidomida, lenalidomida, CAMPATHMR (alemtuzumab) y RITUXA MR (rituximab) .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser co-administrado con un inhibidor de MMP. Por ejemplo, el anticuerpo anti-FRA puede ser coadministrado con agentes anti-angiogénicos , tales como inhibidores de MMP- 2 (metaloproteinasa de matriz 2) o inhibidores de MMP- 9 (metaloproteinasa de matriz 9) . Los inhibidores de MMP preferidos son aquellos que no demuestran artralgia. Son más preferidos aquellos que inhiben selectivamente la MMP-2 y/o la MMP- 9 en relación con las otras metaloproteinasas de matriz (es decir MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP que son útiles en la presente invención son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 y los compuestos expuestos en la siguiente lista: ácido 3 - [ [4 - (4 - fluoro- fenoxi) -bencensulfonil] - ( 1-hidroxicarbamoil-ciclopentil) -amino] -propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -8-oxa-biciclo [3.2.1] octan-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R,3R) 1- [4- (2-cloro-4-fluoro-benciloxi) -bencensulfonil- ] -3 -hidroxi- 3 -metil-piperidin-2 -carboxílico; hidroxiamida del ácido 4- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] - tetrahidro-piran-4 -cárboxílico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro- fenoxi) -bencensulfonil] -(1-hidroxi-carbamoil-ciclobutil) -amino] -propiónico; hidroxiamida del ácido 4- [4- (4 -cloro- fenoxi) -bencensulfonilamino] - tetrahidro-piran-4 -cárboxílico ; hidroxiamida del ácido (R) 3- [4- (4-cloro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -tetrahidro-piran-3 -carboxílico ; hidroxiamida del ácido (2R,3R) 1 - [4 - (4 - fluoro- 2 -metil-benciloxi) -bencensulfonil] -3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] - ( 1-hidroxicarbamoil-l-metil-etil) -amino] -propiónico; ácido 3- [ [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonil] - (4-hidroxicarbamoil-tetrahidro-piran-4 -il) -amino] -propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3- [4- (4-cloro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -8-oxa-iciclo [3.2.1] octan-3 -carboxílico; hidroxiamida del ácido 3-endo-3- [4- (4-fluoro- fenoxi ) -bencensulfonilamino] -8-oxa-iciclo [3.2.1] octan-3 -carboxílico; e hidroxiamida del ácido (R) 3- [4- (4-fluoro-fenoxi) -bencensulfonilamino] -tetra idro-furan- 3 -carboxílico; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de los compuestos.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FRA puede ser co-administrado con un inhibidor de integrina. Los inhibidores de integrina incluyen, sin limitación, obtustatina, rhodocetina, Vitaxina (Medlmmune) , cilengitida (EMD 121974, Merck), S137 (Pfizer), S247 (Pfizer) y JSM6427 (Jerini) (véase, por ejemplo, Brown y colaboradores (2008) International Journal of Cáncer 123: 2195-2203; Stupp y colaboradores (2007) Journal of Clinical Oncology 25: 1637-1638; Eble y colaboradores (2003) Biochem J. 376: 77-85, todos incorporados en este documento a manera de referencia) .

La co-administración de un anticuerpo anti-FRA de la invención con un agente terapéutico adicional (terapia de combinación) comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-FRA y el agente terapéutico adicional así como también la administración de dos o más composiciones farmacéuticas separadas: una que comprende el anticuerpo anti-FRA y la(s) otra(s) que comprende (n) el (los) agente (s) terapéutico ( s) adicional (es) . Además, la co-administración o la terapia de combinación incluye el anticuerpo anti-FRA y agentes terapéuticos adicionales que se administran de manera simultánea o secuencial, o ambas. Por ejemplo, el anticuerpo anti-FRA se puede administrar una vez cada tres días, mientras que el agente terapéutico adicional se administra una vez al día al mismo tiempo que el anticuerpo anti-FRA .o en un tiempo diferente. Un anticuerpo anti-FRA se puede administrar antes de o subsecuentemente al tratamiento con el agente terapéutico adicional. Similarmente , la administración de un anticuerpo anti-FRA de la invención puede ser parte de un régimen de tratamiento que incluye otras modalidades de tratamiento que incluyen radiación, cirugía, ejercicio, fototerapia, que incluye terapia con rayo láser y suplementos dietéticos. La terapia de combinación se puede administrar para prevenir la recurrencia de la condición. Preferiblemente, la terapia de combinación se administra múltiples veces. La terapia de combinación se puede administrar desde tres veces al día ¦ hasta una vez cada seis meses. La administración puede ser en un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses o se puede administrar continuamente, por ejemplo por vía de una minibomba. La. terapia de combinación se puede administrar, por ejemplo, por vía de una ruta oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular o parenteral .

En una modalidad, el anticuerpo anti-FRA se administra en una formulación como una solución acuosa estéril que tiene un pH que varía de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, preferiblemente de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5 y más preferiblemente de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.2. La formulación puede comprender de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml o de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de anticuerpo. La formulación puede comprender de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar de Tween , de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa y de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de dihidrato de EDTA disódico. En . una modalidad preferida, el anticuerpo se, administra en una formulación de 5.0 ± 0.5 mg/mL de anticuerpo en fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7.2, Tween 80 USP al 0.01% .

En una modalidad aún adicional, al anticuerpo anti-FRA sé coloca una radioetiqueta, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido citotóxico. El anticuerpo anti-FRA o la proteína de fusión de anticuerpo anti-FRA dirige la radioetiqueta, inmunotoxina, toxina o péptido tóxico a la célula tumoral o cancerosa que expresa FRA. En una modalidad preferida, la radioetiqueta, inmotoxina, toxina o péptido tóxico se interioriza después de que el anticuerpo anti-FRA se une al FRA sobre la superficie de la célula tumoral o cancerosa.

Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en este documento son para fines ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán aparentes para aquellas personas expertas en el campo y se deberán incluir dentro, y se pueden hacer sin aparatarse de, el alcance verdadero de la invención.

Ej emplos EJEMPLO 1: CULTIVO Y PURIFICACION DE UN ANTICUERPO ANTI-FRA CULTIVADO BAJO CONDICIONES VARIADAS Las células CHO-K1 que producen un anticuerpo anti-FRA que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEC ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEC ID NO: 7 se recuperaron de la crioconservación y se subcultivaron bajo las condiciones mostradas en la Tabla 1. La expansión y subcultivo del inoculo se realizaron en matraces de agitación de 125 mL y 500 mL.

Tabla 1 : Recuperación de reservas de células crioconservadas y condiciones de subcultivo Después de la recuperación y el subcultivo, las células se desarrollaron en un cultivo de lotes alimentados en biorreactores de producción de tanque agitado de 2 L (B-DCU, Sartorius) con varios cambios de condiciones experimentales de cultivo de células y con los controles positivos (Tablas 2 y 3) .

Tabla 2: Condiciones de operación de los cultivos de lotes alimentados en biorreactores de producción de tanque agitado de 2 L Tabla 3 : Tabla de cambios de condición del biorreactor Los cultivos de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 se purificaron de la siguiente manera. Los medios de cultivo acondicionados (1.5 L para cada condición) de células que secretaban el MORAb-003 se aclararon mediante. la centrifugación (10,000 g, 20 min) . Los sobrenadantes resultantes se filtraron a través de una membrana; de 0.22 mm. Los anticuerpos MORAb-003 en los medios acondicionados se purificaron por medio de la cromatografía de afinidad de proteína A, con la ayuda de un dispositivo AktaExplorer 100AMR (GE Healthcare) . En resumen, una columna de volumen de lecho de 20 mL empacada con ProSep VAMR (# de Catálogo 113115830, Millipore) se equilibró con PBS (fosfato de potasio 0.02 M, cloruro de sodio 0.15 M, pH 7.2). Después del aclaramiento, los medios acondicionados que contenían MORAb-003 se cargaron en la columna en un caudal de 5.0 mL/minuto. La resina se lavó con PBS para 12 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés) , seguido por la elución de los anticuerpos MORAb-003 enlazados, utilizando 3.5 CV de amortiguador de elución (ácido acético 10 mM, glicina 100 mM, pH 3.8). La resina se limpió con 2 CV de clorhidrato de guanidina 6 M. Los caudales en todos los pasos excepto la carga fueron 7.0 mL/minuto. Las fracciones de elución acumuladas se dializaron contra 2 L de PBS durante aproximadamente 15 horas a 4°C, utilizando una tubería SnakeSkin Pleated Dialysis TubingMR de 10 kDa de corte (# de Producto 68100, Thermo Scientific) .

EJEMPLO 2: PERFILADO DE GLICANOS DE UN ANTICUERPO A TI-FRA CULTIVADO BAJO CONDICIONES VARIADAS Después de que los anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se cultivaron y se purificaron como se describiera en el Ejemplo 1, las estructuras de- carbohidratos complejos unidos a N neutros que se encontraban en los anticuerpos se retiraron, se separaron, se identificaron y se cuantificaron de la siguiente manera. Los números de lote asignados a las muestras de anticuerpos anti-FRA cultivados bajo condiciones variadas se muestran en la Tabla 4. Los glicanos unidos a N en la cadena pesada de los anticuerpos MORAb-003 se retiraron enzimáticamente utilizando peptidil-N-glicosidasa F (PNGasa F) y se purificaron mediante la cromatografía de filtración en gel. La mezcla de glicanos resultante se etiquetó de manera fluorescente utilizando 2-aminobenzamida (2-AB) y se resolvió mediante la HPLC de fase normal, utilizando una columna Tosoh TSK-Gel 80 -Amida. Los glicanos etiquetados de manera fluorescente se cuantificaron mediante la fluorescencia (Ex 330 nm / Em 420 nm) . La identificación de glicanos a partir de picos que surgieron durante la separación se realizó mediante la detección espectrométrica de masas en línea, utilizando un espectrómetro de masas Agilent ESI-T0FMR en ya sea un modo de cromatograma iónico total o cromatograma iónico extraído. Los diagramas de las estructuras de glicanos recuperadas se muestran en la Figura 1.

Tabla 4 : Números de lote que corresponden a las condiciones de cultivo de anticuerpos anti-FRA El lote NB859-25 sé derivó de un cultivo desarrollado bajo las condiciones empleadas para los lotes de controles positivos NB810-10 y NB809-65. El lote NB859-25 se designó como un control positivo para fines de comparación de los resultados . experimentales con los otros lotes producidos en el ciclo 3.

Los resultados preliminares de la distribución de los glicanos unidos a N, neutros, principales en las muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se muestran en la Figura 2. Los resultados adicionales de la distribución de los glicanos neutros en las muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se muestran en la Figura 3. El "estándar de referencia MORAb-003" es un anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo.

EJEMPLO 3 : CORRELACION DE LA AFINIDAD DE ENLACE DE UN ANTICUERPO ANTI-FRA CON CONDICIONES DE CULTIVO DE ANTICUERPOS Y ESTRUCTURA DE GLICANOS La afinidad de enlace relativa de las muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se determinó mediante la espectroscopia de resonancia de plasmón superficial. El receptor de folato alfa (FRA) de humano recombinante (SEC ID NO: 3) se inmovilizó sobre la superficie de un chip CM5. de calidad apta para investigación por vía del acoplamiento de amina. Las diluciones del estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo o preparaciones de muestras variantes que abarcaban 0.02-44 mg/mL se inyectaron en serie sobre la superficie y los niveles de enlace se midieron después de permitir que la asociación procediera durante 40 s. La superficie se regeneró entre ciclos mediante el llenado con glicina 10 mM pH 2.0. El nivel de enlace como una función de la concentración de MORAb-003 se representó gráficamente para el estándar de referencia y todas las muestras, utilizando BiaEvaluation 4.1MR (GE Healthcare). Los datos se adaptaron a un ajuste de curva logística de cinco parámetros y la potencia de enlace relativa de cada muestra en comparación con el estándar de referencia se determinó mediante el análisis de líneas paralelas utilizando STATLIAMR versión 3.2 (Brendan Technologies). Los resultados se muestran en la Figura 4. Para calcular los resultados en la columna "Potencia Medida", la potencia de enlace del estándar de . referencia se estableció como 100%. Todas las condiciones de cultivo, inclusive los controles positivos, tuvieron una afinidad de enlace más baja en -comparación con el anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo.

EJEMPLO 4: CORRELACION DE ADCC DE UN ANTICUERPO ANTI-FRA CON LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE ANTICUERPOS Y LA ESTRUCTURA DE GLICANOS La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) in vitro medida por las muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se midió de la siguiente manera. Las células de adenocarcinoma ovárico de humano IGROV-1 que expresaban FRA (Bernard, y colaboradores (1985) Cáncer Res. 4: 4970-4979) se etiquetaron con diacetato de carboxifluóresceína-éster succinimidílico (CFDA SE) . Las células etiquetadas se mezclaron con diluciones de muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 y células efectoras no etiquetadas que se derivaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, por sus siglas en inglés) de humano. Después de la incubación durante 4 horas, las poblaciones de células se registraron mediante la citometría de flujo para las células IGROV-1 etiquetadas, viables, restantes. La fracción de células restantes después del tratamiento con un lote de muestra variante de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 se comparó con aquella de células tratadas con concentraciones idénticas de una preparación de estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producida bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrada por un fabricante externo. Los resultados se muestran en la Figura 5. Para calcular los resultados en la columna "Potencia Medida", la ADCC del estándar de referencia se estableció como 100%. Para calcular los resultados en la columna "Potencia Relativa" , la media de la ADCC medida de los dos controles positivos se estableció como 100%.

Las condiciones de cultivo de células a temperatura baja y en DO bajo produjeron isoformas de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 con altos porcentajes de glicanos NGA2 (G0) . La presencia de glicanos NGA2 (G0) se correlacionó con una ADCC incrementada (Figura 6) . Esta correlación fue estadísticamente significativa.

La presencia de glicanos no fucosilados se correlacionó con una ADCC incrementada (Figura 7) . Esta correlación fue estadísticamente significativa.

La presencia de glicanos M3N2F se correlacionó inversamente con una ADCC incrementada (Figura 8) .

EJEMPLO 5: CORRELACION DE LA ACTIVIDAD DE INTERIORIZACION DE UN ANTICUERPO ANTI-FRA CON LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE ANTICUERPOS Y LA ESTRUCTURA DE GLICANOS La actividad de interiorización de muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se registró por el grado de aniquilación de células que expresan el FRA, utilizando una inmunotoxina secundaria antihumano. Las diluciones de muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 y una cantidad fija de un anticuerpo secundario anti-IgG humana de cabra conjugado con la proteína vegetal citotóxica saporina (Hum- ZAP, Advanced Targeting Systems, Inc.) se agregaron a pocilios de placas de microtítulo de 96 pocilios tratadas con cultivo de tejido que contenían 2,000 células/pocilio de células IGROV-1 que expresaban el FRA humano. La interiorización del complejo de MORAb- 003 -Hum- AP con el enlace a antígenos da por resultado la liberación de la citotoxina en las células IGROV-1 de una manera dependiente de MORAb- 003. La fracción del anticuerpo anti-FRA MORAb- 003 interiorizado se puede registrar de esta manera con base en el grado de aniquilación de células IGROV-1. La proliferación de células IGROV-1 se midió por medio de la tinción con Azul de Sulforodamina de las células vivas, restantes utilizando un lector de microplacas SpectraMax 190MR (Molecular Devices Corp.) . Los datos (valor OD540 contra la concentración del anticuerpo anti-FRA MORAb-003) se ajustaron a un algoritmo de ajuste de curva logística de 5 parámetros. La concentración del anticuerpo anti-FRA MORAb-003 que daba por resultado 50% de aniquilación de las células IGROV-1 (IC50) se calculó a partir de los parámetros de ajuste de curva medidos para cada curva (véase la Figura 9 y la Figura 10) .

La actividad de interiorización de las muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 se midió también por medio de FACS . Las células IGROV-1 que expresaban el FRA humano se incubaron durante 30 minutos a 4°C con 1 µg/mL de muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 y se lavaron con PBS . Las células luego se incubaron durante 30 minutos a 4°C con 40 µg/mL de anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC y se lavaron con PBS . Las células luego se incubaron durante un periodo de tiempo predeterminado a 37 °C para iniciar la interiorización. Las células se lavaron con amortiguador de glicina ácida a 4°C para retirar todos los anticuerpos enlazados a la membrana. Después del lavado con amortiguador de glicina ácida, la citometría de flujo se realizó en las células a 4°C. En todos los experimentos, la interiorización se definió como el incremento dependiente del tiempo en la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) , ya que únicamente un anticuerpo que se interiorizó dentro de la membrana plasmática sería retenido y produciría una señal fluorescente después del lavado ácido.

La Figura 11 muestra un histograma de los resultados del experimento de enlace de FACS realizado con el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo. El área sombreada (población Pl) corresponde a células incubadas con un anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC. La población P2 (0% de control) corresponde a células incubadas con una IgG de humano irrelevante como control y un anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC. La población P3 corresponde a células incubadas con el anticuerpo anti-FRA y un anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC y lavadas con amortiguador de glicina ácida. La población P4 (100% de control) corresponde a las células incubadas con el anticuerpo anti-FRA y un anticuerpo anti-IgG de humano conjugado con FITC con lavado de amortiguador de PBS .

El porcentaje de interiorización del anticuerpo anti-FRA MORAb-003 se calculó a partir de la intensidad de fluorescencia relativa de la siguiente manera: ( (MFI [muestra] - MFI [0% de control] )/ (MFI [100% de control] - MFI[0% de control])) x 100 La Figura 12 representa la relación entre el tiempo y la interiorización por células IGROV-1 del estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo. El eje y representa el porcentaje de MFI medido por medio de la citometría de flujo de una población de células IGROV-1 a través del tiempo (eje x) en relación con el enlace total en cada punto de tiempo. La Figura 13 representa la relación entre el tiempo y la interiorización por células IGROV-1 de las muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 descritas en la Tabla 4, asi como también el estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo, en donde las tres muestras etiquetadas como "estd. de réf . MORAb-003" representan el mismo lote de anticuerpo utilizado en diferentes corridas del experimento de FACS . La Figura 14 representa el ajuste de los datos en la Figura 13 mediante una regresión no lineal a una curva logística de cuatro parámetros. Los parámetros de ajuste de curva EC50 resultantes se utilizaron para alimentar la información de la Figura 15.

La Figura 15 resume los resultados de los estudios de interiorización de muestras de anticuerpos anti-FRA MORAb-003 de FACS y proporciona los valores EC50. Los valores EC50 más bajos indican una interiorización más rápida. El estándar de referencia de anticuerpo anti-FRA MORAb-003 producido bajo las "condiciones de cultivo de referencia" definidas en este documento y suministrado por un fabricante externo alcanzó un pico de interiorización en aproximadamente 2 horas (120 minutos) . Las muestras NB859-26 y NB859-27 (producto de cultivo de 17 y 20 días) tienen un valor EC50 más bajo, lo que indica un proceso de interiorización más rápido que el control positivo. La muestra NB859-28 (cultivo tratado con oxígeno disuelto bajo) también demostró un proceso de interiorización más rápido que el control positivo.

La Figura 16 resume los datos de actividad descritos en los Ejemplos 3, 4 y 5.- A menos que se definan de otra manera en este documento, los términos científicos y técnicos que se utilizan en relación con la presente invención deberán tener los significados que son entendidos comúnmente por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares deberán incluir pluralidades y los términos en plural deberán incluir la forma singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en este documento son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en el campo .

Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales que son bien conocidos en el campo y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y planteadas por toda la presente descripción a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook J. & ussell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000) ; Ausubel y colaboradores, Short Protocole in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lañe Using Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan y colaboradores, Short Protocole in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003) , incorporados en este documento a manera de referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en el campo o como se describe en este documento. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, la química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en el campo.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente u otros documentos citados en este documento se incorporan por este acto a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada solicitud, patente, solicitud de patente u otro documento individual se indicara individualmente que se incorpora a manera de referencia para todos los fines.

Por toda esta descripción y modalidades, se entenderá que la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprende" "que comprende" implican la . inclusión de un número entero establecido o un grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros .

Tabla 5: Tabla de Secuencia Las secuencias líderes están en cursiva. Los CDRs están subrayados SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE CADENA PESADA DEL ANTICUERPO ANTI-FRA MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAP GKGLEWVA ISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHGD DPA FAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN YV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGK (SEC ID NO: 1) EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAPG GLEWVAMISSGGSYTYYADSV KGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHGDDPAWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG E YKC VSNKALPAPIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K (SEC ID NO: 5) SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE CADENA LIGERA DEL ANTICUERPO ANTI-FRA MGFSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSDNLHWYQQKP GKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQ SSYPYMYTF GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC ID NO: 2) MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAP KPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYTFGQGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC ID NO: 6) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISS NLH YQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFS GSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASWCLLNNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC ID NO: 7) SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE CADENA PESADA DEL ANTICUERPO ANTI-FRA atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgaggtcc aactggtggagagcggtggaggtgttgtgcaacctggccggtccctgcgcctgtcctgctccgc atctggcttcaccttcagcggctatgggttgtcttgggtgagacaggcacctggaaaaggtctt gagtgggttgcaatgattagtagtggtggtagttatacctactatgcagacagtgtgaagggta gatttgcaatatcgcgagacaacgccaagaacacattgttcctgcaaatggacagcctgagacc cgaagacaccggggtctatttttgtgcaagacatggggacgatcccgcctggttcgcttattgg ggccaagggaccccggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctgg caceetcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactactt ccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccg gctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagct tgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaa agttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaccc ctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt 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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7, y en donde el anticuerpo monoclonal tiene citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) alterada en comparación con la ADCC del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia.

2. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ADCC se incrementa.

3. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ADCC se disminuye.

4. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque tiene una tasa de interiorización incrementada en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo monoclonal preparado bajo condiciones de cultivo de referencia.

5. A anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: l o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina C-terminal, y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 ; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7, y en donde el anticuerpo monoclonal tiene una tasa de interiorización alterada en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia.

6. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la tasa de interiorización se incrementa.

7. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la tasa de interiorización se disminuye.

8. A anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO : 7 y en donde el anticuerpo monoclonal tiene un perfil alterado de glicanos neutros unidos a N en comparación con el perfil de glicanos neutros unidos a N del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia.

9. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el perfil alterado de glicanos neutros unidos a N comprende uno o más de: a) M3N2 incrementado o disminuido; b) M3N2F incrementado o disminuido; c) NA2 incrementado; d) NA2F incrementado o disminuido; e) MAN5 incrementado o disminuido; f) NGA2 incrementado; g) NGA2F incrementado o disminuido; o h) NA2G1F incrementado o disminuido.

10. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c- terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7 y en donde el anticuerpo monoclonal tiene una ADCC incrementada y tiene un perfil de glicanos neutros unidos a N que comprende NGA2 incrementado y glicoformas no fucosiladas, totales, incrementadas en comparación con el anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia.

11. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo tiene además una tasa de interiorización incrementada.

12. A anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7 y en donde el anticuerpo monoclonal tiene eficiencia de interiorización disminuida en comparación con la eficiencia de interiorización del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia.

13. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la eficiencia de interiorización es 28 ng/ml o menor.

14. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la eficiencia de interiorización es 990 ng/ml o menor.

15. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la eficiencia de interiorización es 1632 ng/ml o menor.

16. A anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7 y en donde el anticuerpo monoclonal tiene afinidad de enlace alterada en comparación con la afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia.

17. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la afinidad de enlace se incrementa.

18. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la afinidad de enlace se disminuye.

19. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la afinidad de enlace se incrementa 10% o más.

20. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la afinidad de enlace se disminuye 10% o más.

21. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque comprende además un agente activo adicional.

23. Un cultivo de células, caracterizado porque comprende una célula hospedera eucariótica, la célula hospedera comprende ácidos nucleicos que codifican el aminoácido en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5 y que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7, en donde las condiciones de cultivo de células comprenden un parámetro seleccionado del grupo que consiste de: galactosa, tensión reducida de oxígeno disuelto, temperatura reducida, butirato de sodio, cloruro de cobre, osmolaridad alta y C02 alto.

24. El cultivo de células de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende además un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

25. El cultivo de células de. conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la célula hospedera eucariótica es una célula de CHO.

26. Una célula hospedera, caracterizada porque se aisla del cultivo de células de conformidad con la reivindicación 24.

27. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque se aisla del cultivo de células de conformidad con la reivindicación 24.

28. Un método para producir a anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al FRA, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7 y donde el anticuerpo monoclonal tiene una ADCC alterada en comparación con la ADCC del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia que comprende el paso que consiste en cultivar una célula de CHO que comprende ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera en condiciones •de cultivo de células que comprenden un parámetro seleccionado del grupo que consiste de: galactosa, tensión reducida de oxígeno disuelto, temperatura reducida, butirato de sodio, cloruro de cobre, osmolaridad alta y Co2 alto.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la ADCC se incrementa y la condición de cultivo se selecciona de la tensión reducida de oxígeno disuelto y la temperatura reducida.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anticuerpo tiene además una tasa de interiorización incrementada.

31. Un método para producir un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al FRA, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 7 y en donde el anticuerpo monoclonal tiene una tasa de interiorización alterada en comparación con la tasa de interiorización del anticuerpo monoclonal cuando se prepara bajo condiciones de cultivo de referencia que comprende el paso que consiste en cultivar una célula de CHO que comprende ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera en condiciones de cultivo de células que comprende un parámetro seleccionado del grupo que consiste de: galactosa, tensión reducida de oxígeno disuelto, reducido, temperatura reducida, butirato de sodio, cloruro de cobre, osmolaridad alta, C02 alto, recolección en menos de 13 o más de 15 días.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la tasa de interiorización se incrementa y la condición de cultivo se selecciona de la tensión reducida de oxígeno disuelto o recolección en menos de 13 o más de 15 días .

33. Un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente al receptor de folato alfa (FRA) , caracterizado porque el anticuerpo monoclonal comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada en la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 5, con o sin la lisina c-terminal y comprende además una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada de: una secuencia de aminoácidos que es 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6; o la secuencia de aminoácidos . de la SEC ID NO: 7, hecho por medio de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-32.

34. Un método para reducir el crecimiento de células displásicas asociadas con la expresión incrementada de FRA en un sujeto necesitado del mismo, caracterizado porque comprende el paso que consiste en administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, 27 o 33.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque las células displásicas son células de cáncer de ovario, mama, renal, colorrectal, pulmonar, endometrial, cerebral, de trompas de falopio, uterino o células de leucemia.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el sujeto es un humano.

37. Un método para el tratamiento del cáncer en un sujeto necesitado del mismo, caracterizado porque comprende el paso que consiste en administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, 27 o 33.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el cáncer se selecciona de cáncer de ovario, mama, renal, colorrectal, pulmonar, endometrial o cerebral .

39. Un método para detectar una célula que expresa el FRA, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en poner en contacto la célula con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, 27 o 33 y detectar el enlace

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula es una célula displásica.

41. Un método para detectar el FRA en una muestra biológica, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, 27 o 33, y detectar el enlace.