MXPA06013709A - Ligandos fijadores del complejo activador de plasminogeno de tipo uroquinasa (upa) y su receptor (upar), que inhiben las interacciones de upar corriente abajo: identificacion y uso en diagnostico o en terapia. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos u otros Iigandos especificos para los complejos binarios uPA-uPAR, para los complejos ternarios uPA-uPAR y para los complejos de uPAR y otras proteinas distintas de uPA, tales como integrinas que inhiben la interaccion de uPA y uPAR con moleculas adicionales con las cuales interactua el complejo formado. Estos anticuerpos u otros ligandos se usan para metodos de diagnostico y terapeuticos, particularmente contra el cancer.

Description

LIGANDOS FIJADORES DEL COMPLEJO ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO DE TIPO UROQUINASA (uPA) Y SU RECEPTOR íuPAR), QUE INHIBEN LAS INTERACCIONES DE uPAR CORRIENTE ABAJO: IDENTIFICACIÓN Y USO EN DIAGNOSTICO O EN TERAPIA Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención en el campo de la bioquímica, inmunología y medicina, se refiere a anticuerpos ("Ab") o a otros ligandos específicos para (a) los complejos binarios uPA-uPAR, (b) complejos ternarios que contienen uPA-uPAR y (c) complejos de uPAR y proteínas distintas de uPA tales como integrinas. Estos Ab o ligandos que no son Ab inhiben la interacción de uPA y de uPAR con moléculas adicionales con las cuales interactúan los complejos anteriormente mencionados. Estos Ab u otros ligandos que no son Ab se usan en diagnóstico y métodos terapéuticos, particularmente contra el cáncer. Descripción de la técnica anterior. Un cuerpo de evidencia significativo a partir de estudios in vitro e in vivo ha establecido que el sistema activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) es central para el proceso de metástasis, haciendo de él un objetivo promisorio para el desarrollo de fármacos contra el cáncer (Mazar, AP et al. (1999) Angiogenesis 3: 15-32). Además del uPA, su receptor de membrana (uPAR) es un objetivo apropiado para el diseño y desarrollo de agentes terapéuticos y para el diagnóstico de cáncer (Mazar, AP (2001 ) Anti-Cancer Drugs 12: 397-400) porque: (a) el uPAR se expresa selectivamente en células endoteliales ("EC") tumorales angiógenas metastásicas, pero no en otras células; (b) el uPAR es un participante importante en varias rutas extracelulares e ¡ntracelulares requeridas para la metástasis, que actualmente son objeto de intensos esfuerzos de desarrollo de fármacos; y (c) es posible interferir en varios puntos diferentes a lo largo de la ruta del uPA. Así, uPA y uPAR son objetivos promisorios para el desarrollo de diagnósticos y terapéuticos útiles contra muchos tipos diferentes de tumores/cánceres. El sistema uPA uPAR y el cáncer La metástasis y la angiogénesis comparten muchas características funcionales comunes que caracterizan los procesos invasivos y migratorios de las células tumorales y de EC. Estas características incluyen (1 ) la regulación hacia arriba de la expresión de proteasa e integrina, (2) la pérdida de contactos célula-célula y célula-matriz, (3) responsividad aumentada a factores de crecimiento y diferenciación , y (4) remodelación de la matriz extracelular (ECM) y de la membrana basal (BasM ). Todas ellas contribuyen al desarrollo del tumor.

El "sistema" uPA, que comprende la proteasa serina uPA, su receptor uPAR, y su inhibidor específico de serpina, inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1 ), juega un papel central en muchas de estas actividades. La actividad de este sistema es responsable de: ( 1 ) iniciación de cascadas que dan como resultado la activación de plasminógeno, activando varias pro-metaloproteasas (proMMP), (2) liberación y procesamiento de factores de crecimiento latentes, tales como factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FG F- 2), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HG F), y factor de crecimiento transformador ß (TG F ?), (3) (a) interacciones con componentes de la ECM tales como vitronectina (Vn) y fibronectina (Fn), (b) interacciones directas con varias integrinas, incluyendo s5/?1 y sv ?3, y (c) remodelación de la BasM y de la ECM para promover la motilidad celular. Además, el sistema uPA también puede iniciar la rotación de fibrina localizada, la cual puede jugar un papel en la angiogénesis.

La expresión de uPA y de uPAR ha sido demostrada en numerosos tipos de tumores, incluyendo glioblastoma, próstata, mama, colon , hepatocelular y carcinoma de células renales.

(Mizukami I F eí al. (1994) Clin Immunol and Immunopathol 77:96-104; Hsu DW ef al, (1995) Am J Pathol 147: 1 14-23; de Witte JH ef al (1999) Br J Cáncer 79: 1 190-8). La expresión de uPA y de uPAR típicamente es mayor en las formas más agresivas de la enfermedad. En las células tumorales, esta expresión con frecuencia es más alta en el frente invasivo el tumor. (Buo, L ef al, (1995) Human Pathol 26: 1 133-1 138; Yamamoto M ef al (1994) Cáncer Res 54:5016-5020). Se ha informado de fuerte tinción inmunohistoquímica para uPAR en vasos sanguíneos asociados con el frente invasivo de carcinomas de mama, colon y de células renales (Bastholm L ef al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 7: 39-47; Nakata S et al. (1998) Int. J. Cáncer 79: 1 79-186). En el estudio de carcinoma de colon , el uPAR se co-localizó con el VEG F. La expresión de uPA y de uPAR también se ha observado en macrófagos asociados con el tumor en varios tipos de tumor (Ohtani H ef al (1995) Int J Cáncer 62:691 -6; Xu Y ef al (1997) Hum Pathol 28:206-13). El uPA es quimiotáctico para los monocitos y media tanto la adhesión como la migración de estas células. La adhesión y la migración requieren solamente ocupación del uPAR, pero no actividad catal ítica del uPA. Así, se cree que el sistema uPA contribuye al progreso del tumor actuando sobre múltiples tipos de células asociadas al tumor. Varios estudios recientes han evaluado el potencial terapéutico de la inhibición de la unión de uPA con el receptor uPAR en sistemas singénicos. El suministro de un fragmento con terminal amino murino de uPA codificado en adenovirus (abreviado "ATF" — es decir, el dominio de uPA que contiene la región de unión a uPAR) directamente en los tumores, dio como resultado (a) supresión de neovascularización y (b) detención del crecimiento del tumor (Li H ef al ( 1998) Gene Ther 5: 1 105-1 1 13). Debido a la "especificidad" de las especies, se podría esperar que el ATF murino se uniera solamente a las células EC y leucocitos anfitriones, no a las células tumorales humanas. Esto indica que la inhibición del tumor fue mediada a través de la supresión de la respuesta angiogénica del anfitrión . Finalmente, un estudio en colaboración entre algunos de los inventores de la presente y S. Rabbani y J . Gladu demostraron recientemente que un Ab policlonal cultivado contra un fragmento del residuo 100 de uPAR de rata colocado selectivamente en un tumor de mama de rata creció a partir de células de la l ínea celular Mat B i l l (Rabbani SA et al (2002) Cáncer Res 62:2390-97). Este anticuerpo policlonal inhibió completamente el crecimiento del tumor y condujo a la regresión del tumor. Desafortunadamente, a pesar de la promesa de apuntar al sistema uPA para fines de diagnóstico y terapéuticos, los esfuerzos de investigación no han tenido como resultado el desarrollo de agentes apropiados para uso clínico. Los enfoques de moléculas pequeñas han sido obstaculizados por (1 ) la dificultad de inhibir de manera potente una interacción proteína-proteína (por ejemplo, uPA-uPAR o uPAR-integrina), y (2) la carencia de guías o de información estructural apropiadas susceptibles a los esfuerzos en química medicinal. Varios inhibidores potentes de péptidos de la interacción uPA-u PAR han sido identificados, pero estos podrían sufrir de las propiedades farmacológicas típicamente deficientes de los péptidos, y no han demostrado los niveles requeridos de actividad aún en ensayos basados en células (Ploug M ef al (2001 ) Biochemistry 40 : 1 21 57-68). Breve descri pción de la i nvención Los inventores de la presente produjeron un conjunto de anticuerpos monoclonales (mAb) que se unen a complejos u PA-u PAR y que inhiben su interacción de mAb pueden tener utilidad como anticuerpos "desn udos" , así como también para apuntar agentes terapéuticos y agentes para formación de imágenes hacia tumores. Varios anticuerpos que apuntan los uPAR son efectivos en modelos animales de crecimiento de cáncer (el modelo de cáncer ovárico A2780 y el modelo de cáncer de pulmón A549). Los epítopos reconocidos por estos mAb son regiones péptidas dentro de u PAR. Por lo tanto, los péptidos u PAR correspondientes a estas regiones o derivados de ellas son útiles como antagonistas de interacciones de u PAR con proteínas corriente abajo. Es común que las células tumorales malignas y las EC obtenga n una ventaja selectiva en el proceso de mig ración celular e invasividad . Esta ventaja da como resultado al menos en parte de las células, la expresión de moléculas de uPAR en su superficie, y estas moléculas de uPAR son saturadas mediante la unión al ligando u PA producido de manera endógena . As í , los mAb, péptidos u otras entidades qu ímicas que apuntan , y que preferiblemente inhiben a las interacciones uPA-uPAR con los objetivos corriente abajo, son útiles en el tratamiento y/o en el diagnóstico del cáncer. Los ligandos corriente abajo preferidos de uPA-uPAR, o de uPAR solo, incluyen integrinas, proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP), así como también otros compañeros de unión . Algunos de estos ligandos corriente abajo pueden mediar la señalización , la migración y/o la invasión celular. Los inventores de la presente han producido y estudiado dos mAb, ATN-615 y ATN-658, que se unen específicamente al uPAR ocupado por ligando y de esta forma sirven como ejemplos de moléculas que pueden unirse a uPAR sin considerar la presencia del ligando. Los mAb pueden detectar el uPAR ocupado y el no ocupado en un tumor o en otro tejido enfermo en donde el sistema uPA juega un papel en la patobiolog ía . Los Ab u otros ligandos que no son Ab son aquellos que no se unen al sitio de unión a uPA de uPAR.

Los inventores de la presente han identificado los epítopos a los cuales se unen estos Ab. Estos péptidos o péptidos naturales o sintéticos o derivados de péptidos que mantienen la estructura tridimensional de estos epítopos, son útiles como agentes terapéuticos y/o para el diagnóstico. Varias secuencias de péptidos que fueron identificadas basándose en estos epítopos se describen aquí.

Además, los inventores de la presente han desarrollado un método para identificar Ab que imitan las características de ATN-615 y de ATN-658. Este método se puede usar para desarrollar mAb humanizados o totalmente humanos que reconozcan y que se unan a los mismos epítopos a los que se unen ATN-615 y ATN-658. Estos imitadores de ATN-615 y ATN-658, el último de los cuales tiene actividad antitumoral particularmente robusta, están incluidos aquí como agentes terapéuticos y/o para el diagnóstico. La presente invención está dirigida además a macromoléculas, incluyendo Ab, fragmentos de unión de antígenos, tales como Ab de cadena simple (scFv), polipéptidos y péptidos que no son Ab, aptámeros, etc. , así como también moléculas orgánicas pequeñas, que tienen la propiedad de unirse a uPAR sin inhibir la unión de uPA. Algunas de estas moléculas interfieren con interacciones corriente abajo ya sea de uPA-uPAR o del uPAR solo.

Además de las composiciones específicas que apuntan a las interacciones de uPA-uPAR, esta invención también está dirigida a métodos para detectar Ab que se unen exclusivamente a uPA-uPAR o que inhiben las interacciones corriente abajo del uPAR. Así, la invención incluye un método para identificar estas moléculas que se unen al complejo uPA-uPAR. Este método puede ser variado para detectar moléculas que unen otros componentes o complejos del sistema uPA/uPAR. Por ejemplo, la unión de uPA a su inhibidor natural PAI-1 también une a uPAR, formando un complejo ternario uPA:PAI-1 /uPAR. Un método de la presente invención comprende usar estos complejos ternarios para detecta r liga ndos que interactúan solamente con este complejo pero no con el complejo binario u PA: PAI o uPA-u PAR. Otro método está dirigido a inh ibidores que interfieren con la interacción de los complejos ternarios con objetivos corriente abajo tales como LRP . Este ti po de enfoq ue es apropiado para identificar molécu las de ligando que se han internalizado con la unión al complejo. Adicional mente , esta invención incluye métodos para detectar una molécula que se une al complejo u PA-u PAR (pero no al uPA o al u PAR que no están formando complejo) o para detectar inhibidores de u PA-u PAR o uPAR hacia objetivos corriente abajo, así como también la unión de ligandos por sí solos. Estos enlazantes pueden ser Ab, otras proteínas, péptidos, aptámeros , moléculas pequeñas, etc. Una modalidad específica de este tipo podría ser un ligando uPA-uPAR o u PAR que interferido con uPAR mediara el acoplamiento de Fn o que perturbara la unión de Fn o de fragmentos de Fn a la integrina a5ß^ . Las alteraciones del conjunto de otros componentes de la matriz (por ejemplo , la vitronectina ) también están cubiertas por esta invención . Esta invención también está dirig ida a métodos para identificar inhibidores de activación de plasminógeno que no inh iben la actividad catal ítica de uPA y a composiciones novedosas que tienen esta actividad . Más específicamente, la presente invención está dirigida a un ligando que se u ne a un complejo binario u PA-uPAR dicho ligando no se une sustancialmente a (a) uPA libre o a (b) la región de uPAR que reconoce y se une a uPA, de tal forma que el ligando no inhibe la unión de uPA-uPAR. Otra modalidad comprende un ligando que se une a un complejo ternario de uPA-uPAR y una molécula adicional (X), tal como PAI-1, dicho ligando: (a) se une a un complejo uPA-uPAR-X, (b) no se une sustancialmente a cualquiera de los siguientes: (i) un complejo uPA-uPAR, (ii) un complejo uPA-X, (iii), la región de reconocimiento de uPA y de unión a uPA y la región de unión a uPA de uPAR o de X, (iv) uPA libre, o (v) X libre; y (c) no inhibe sustancialmente la unión a uPA-uPAR o la unión a uPA-X. Preferiblemente, el ligando mencionado anteriormente no se une sustancialmente al uPAR libre. El ligando anteriormente mencionado puede ser un polipéptido, preferiblemente un Ab, tal como un mAb, o un fragmento de él que se une a un antígeno. Los mAb preferidos son mAb quiméricos humanizados o mAb humanos. En una modalidad, un mAb preferido o fragmento de unión al antígeno comprende: (a) una cadena VL que contiene tres CDR que tienen las respectivas secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; y (b) una cadena VH que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 6, SEQ I D NO: 7 y SEQ ID NO: 8. Un mAb o fragmento de unión a antígeno más preferido, como anteriormente, comprende (a) una cadena VL con la secuencia SEQ ID NO: 1 ; y (b) una cadena VH con la secuencia SEQ I D NO:2. En otra modalidad preferida, el mAb o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una cadena VL que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ I D NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12 y SEQ I D NO: 13; y (b) una cadena VH que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. Un mAb o fragmento de unión a antígeno más preferido, como anteriormente, comprende: (a) una cadena VL que tiene la secuencia SEQ I D NO: 9; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10. Un Ab preferido de la presente invención es el que se selecciona de: (a) mAb denominado ATN-615 producido mediante un hibridoma que tiene un número de acceso a ATCC # ); (b) un mAb denominado ATN-658 producido mediante un hibridoma que tiene un número de acceso a ATCC # ); (c) un mAb que tiene esencialmente las mismas características de unión al antígeno que ATN-615; y (d) un mAb que tiene esencialmente las mismas características que el ATN-658. En una modalidad, el ligando anterior es uno que inhibe la unión de los complejos uPA-uPAR con otro ligando biológico para estos complejos. Los ejemplos de "otros ligandos biológicos" incluyen integrinas, preferiblemente s5/?1, avß3, avßd, aZß , s6?1, o s4/?1. El ligando anterior puede ser uno que interfiera con, y que inhiba (a) el acoplamiento de Fn mediado por uPAR, (b) la unión de Fn o un fragmento de él a la integrina s5?1; o (c) el acoplamiento de los componentes de Vn. En una modalidad preferida, el ligando anterior es (a) marcado de manera diagnóstica (con una etiqueta detectable); o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado a (en el caso de un polipéptido), una porción activa terapéuticamente, haciendo que el ligando sea activo terapéuticamente. Aquí se proporciona una composición para diagnóstico que comprende (a) el ligando marcado de manera diagnóstica como anteriormente; y (b) un portador aceptable para uso diagnóstico. En la composición para diagnóstico el ligando preferiblemente está marcado con un radionúclido, un agente PET que puede formar imágenes, un agente MRI que puede formar imágenes, un fluorescedor, un fluorógeno, una cromófora, un cromógeno, un fosforecedor, un quimioiluminador o un bioiluminador. Los radionúclidos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en 3H , 14C, 35S, 67Ga, 68Ga , 72As, 89Zr, 97Ru, 99Tc, 1 1 1 ln , 1 23l , 125l , 131 l , 169Yb y 201TI. Los fluorescedores o fluorógenos preferidos son fluoresceína, rodamina , dansilo, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeh ído, fluorescamina, un derivado de fluoresceína, Verde Oregon , Verde Rodamina, Verde Rodol y Rojo Texas. La presente invención proporciona una composición farmacéutica anti-angiogénica o anti-tumoral que inhibe la angiogénesis no deseada, el crecimiento tumoral y/o la metástasis tumoral, que contiene (a) una cantidad efectiva del ligando anterior activo terapéuticamente, y (b) un portador aceptable para uso farmacéutico. Esta composición preferiblemente está en una forma apropiada para inyección . La porción activa terapéuticamente puede ser conjugada directamente con el ligando, o unida indirectamente a él . Una porción terapéutica preferida es un fármaco quimioterapéutico, una toxina o un radionúclido terapéutico (preferiblemente 47Sc, 67Cu , 90Y, 109Pd , 125l , 131 l , 186Re, 188Re, 199Au , 21 1At, 212Pb o 217Bi). En la composición terapéutica anterior, la porción activa terapéuticamente puede ser un péptido o polipéptido, por ejemplo, una toxina, la cual está fusionada al ligando. Esta invención está dirigida a un método para inhibir la migración celular, la invasión celular, la proliferación celular o angiogénesis, o para inducir apoptosis, el cual comprende poner en contacto células asociadas con migración celular, proliferación o angiogénesis no deseadas, con una cantidad efectiva del ligando anterior activo tera péuticamente. También está incl u ido un método para tratar un sujeto q ue tiene una enfermedad , trastorno o cond ición caracterizada por angiogénesis no deseada , crecimiento tumoral y/o metástasis tumoral , que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición farmacéutica terapéutica anterior. También se proporciona un método de análisis para detectar en una muestra una sustancia que se sospecha q ue tiene las propiedades enlazantes del ligando anterior, que comprende : (a) poner en contacto la muestra con complejos u PA-u PAR y determinar la unión de un componente de la muestra a los complejos; (b) poner en contacto la muestra con u PAR libre y determinar la un ión de un componente de la muestra al u PAR. (c) comparar la unión de (a) y (b), en donde la presencia de la unión en (a ) y una ausencia sustancial de unión significativamente menor en (b) ind ica la presencia de la sustancia en la muestra . El análisis puede ser un análisis de u n ión competitiva usando u n compañero de unión marcado que se une a complejos uPA-u PAR, en donde la sustancia en la muestra compete a la unión con el compañero de unión . Una modalidad es u n método de análisis para detectar en una muestra una sustancia que se sospecha q ue tiene las propiedades de unión del ligando anterior, el cual comprende: (a) poner en contacto la muestra con complejos uPA-uPAR-X (con X definido como anteriormente), y determinar la unión de un componente de la muestra a los complejos; (b) poner en contacto la muestra con uno o más de (i) complejos uPA:X, (ii) complejos uPA-uPAR; o (iii) X que no está formando complejo, y determinar la unión de un componente de la muestra a uPA-X, uPA-uPAR o X; (c) comparar la unión de (a) y (b), en donde la presencia de unión en (a) y una ausencia sustancial o significativamente menor de unión en (b) es indicativa de la presencia de la sustancia en la muestra . En el método anterior, los complejos pueden estar sobre la superficie de una célula . Esta invención incluye un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, cuyo péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga, está presente en un epítopo lineal unido mediante un mAb que tiene (a) una cadena V que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ I D NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ I D NO: 5; y (b) una cadena VH que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7 y SEQ I D NO: 8. Un péptido aislado preferido como el anterior está presente en un epítopo lineal único mediante un mAb con (a) una cadena V que tiene la secuencia SEQ I D NO: 1 ; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el péptido aislado contiene al menos tres aminoácidos, y péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga, está presente en un epítopo lineal unido mediante un mAb que tiene (a) una cadena VL que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13; y (b) una cadena VH que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. Un péptido aislado preferido como el anterior está presente en un epítopo lineal unido mediante un mAb que tiene (a) una cadena VL que tiene la secuencia SEQ ID NO: 9; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10. La invención también está dirigida a un péptido aislado, o a una variante de sustitución de él, que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga, está presente en un epítopo lineal reconocido por el mAb denominado ATN-615 o por el mAb denominado ATN-658. La invención incluye un método de análisis para identificar un Ab u otro ligando que se une al mismo epítopo al cual se une el mAb ATN-615 o el mAb ATN-658, dicho método comprende medir la capacidad de una muestra que se sospecha que contiene el Ab u otro ligando para inhibir competitivamente la unión de ATN-615 o de ATN-658 marcado de manera detectable a (i) suPAR inmovilizado, (ii) suPAR D2D3 inmovilizado (en ) un fragmento inmovilizado de suPAR o de D2D3 de suPAR, en donde la inhibición competitiva de al menos aproximadamente 20%, preferiblemente 50%, más preferiblemente 70% y mucho más preferiblemente 90%, indica que un anticuerpo o ligando se une al mismo epítopo. Una modalidad es un método para identificar un péptido que es reconocido por (a) ATN-615, (b) ATN-658, o (c) un Ab u otro ligando, con la misma especificidad de unión que ATN-615 o ATN-658, dicho método comprende medir la capacidad de una muestra que se sospecha que contiene el péptido, o un péptido candidato, para inhibir competitivamente la unión de ATN-615 o de ATN-658 o el Ab u otro ligando con la misma especificidad de unión , a (i) suPAR inmovilizado, (ii) suPAR D2D3 inmovilizado o (iii) un fragmento inmovilizado de suPAR o D2D3 de suPAR, en donde la inhibición competitiva de al menos aproximadamente 20%, preferiblemente 50%, más preferiblemente 70% y mucho más preferiblemente 90%, indica que el péptido tiene la especificidad de unión . Aquí se incluye un ensayo para detectar un compuesto, o para determinar si un compuesto candidato tiene esencialmente las mismas características de unión a una estructura de uPAR que las que tiene ATN-615 o ATN-658, que comprende medir la capacidad de una muestra que está siendo explorada o el compuesto candidato para inhibir competitivamente la unión de ATN-615 o de ATN-658 marcado de manera detectable a (i) suPAR inmovilizado , (n) suPAR D2D3 inmovilizado o (en) un fragmento de suPAR o de D2D3 de suPAR inmovilizado, en donde la inhibición competitiva de al menos aproximadamente 20%, preferiblemente 50%, más preferiblemente 70% y mucho más preferiblemente 90%, indica que el péptido tiene las características de unión . En una modalidad del análisis precedente, el compuesto que está siendo detectado o el compuesto candidato, es una molécula orgánica pequeña que tiene una masa molecular de entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 2500 Da . En otra modalidad, el compuesto que está siendo detectado o el compuesto candidato, es una molécula de ácido nucleico, preferiblemente un oligonucleótido tal como una molécula de ¡ARN o un aptámero. Breve descripción de los dibujos Figura 1 . Análisis SDS-PAG E de fragmentos de ATF y suPAR expresados en células S2. Se clonó y se expresó ATF (aa 1 -143) y suPAR (aa 1 -279) en células S2 de Drosophila Schneider S2. Se indujo a las células a expresar proteínas recombinantes con cobre (0.5 nM ) durante 7 días. Se recolectaron los supernadantes del cultivo y se clarificaron mediante centrifugación y filtración . Después de la adición de inhibidores de proteasa, se purificaron las proteínas mediante cromatografía con intercambio de iones ya sea en DEAE-Sefarosa , pH 7.5, (ATF) o en SP-Sefarosa, pH 8.8, (suPAR). Se purificó adicionalmente el ATF y el suPAR usando RP-HPLC. Se digirió suPAR recombinante purificado, con quimiotripsina para generar el fragmento de dominio2/dominio3 soluble (D2D3).

Antes de la inmunización, se conjugó proteína D2D3 con la proteína portadora hemocianina de lapa californiana (KLH). Figura 2. Se une ATN-658 a un muíante no glicosilado de suPAR, lo que indica que el ATN-658 está dirigido contra un epítopo péptido (no carbohidrato), como la mayoría de los otros mAb anti-uPAR. Figura 3. Detecciones Western con dos mAb anti-D2D3, ATN-615 y ATN-658. Las proteínas recombinantes fueron resueltas mediante SDS-PAGE y transferidas a membranas PVDF. Las membranas fueron sondeadas con anticuerpos purificados (5 /g/mL). ATN-615 y ATN-658 reconocen específicamente a suPAR y a D2D3. Figura 4. Los anticuerpos anti-D2D3 inhiben la migración inducida por uPA. La migración de células CHO que expresan uPAR hacia uPA (500 nM) se determinó usando una cámara de prueba Boyden modificada. Los anticuerpos anti-integrina s5, anti-PAR, y anti-D2D3 inhiben la migración, lo que sugiere que la integrina adßl y uPAR son críticos para la migración inducida por uPA. Figura 5. ATN-658 marcada con 125l se une a células HeLa con alta afinidad. Se incubaron monocapas confluentes de células HeLa en placas de 24 receptáculos con concentraciones en aumento de [125l]-ATN-658 a temperatura ambiente durante una hora. Se lavaron las células extensivamente con PBS/Tween-20 y el material unido fue solubilizado con NaOH 1M. Se determinó la unión no específica en la presencia de un exceso de 100 veces de Ab no marcado. Figura 6. Muestra que el mAb ATN-658 no compite con la unión de uPA a células HeLa. La unión de ATN-658 a células HeLa no inhibió la unión de 125l-scuPA. Se incubaron células HeLa con 5 nM de 125l-SCuPA en la presencia o en la ausencia ya sea de 300 nM de scuPA no marcada o de 300 nM de ATN-658. El ATN-617, un mAb anti-uPAR que bloquea la unión de uPA a uPAR se muestra compitiendo por la unión con scuPA. Figura 7. Muestra que el ATN-658 inhibe el crecimiento tumoral en el modelo de cáncer ovárico A2780 tan efectivamente como la cisplatina. Las células A2780 expresan solamente uPAR y no uPA. Figura 8. Muestra que el ATN-658 inhibe el crecimiento tumoral en el modelo de cáncer de pulmón A549 (que no es de células pequeñas), en el cual se inocularon 106 células tumorales. Las células A549 expresan tanto uPA como uPAR. Figura 9. Muestra que el ATN-658 biotinilado se une de manera saturable a suPAR. Figura 10A y 10B. Ambas muestran los resultados de un ensayo de competencia usando ATN-658 marcado con biotina para identificar mAb que reconocen el mismo epítopo en suPAR. El ATN-616 y el ATN-617 son anticuerpos anti-uPAR que bloquean la unión de uPA con uPAR. El ATN-616 se une específicamente a uPAR ocupado por ligando.

Descri pción de las modal idades preferidas. Los inventores de la presente han encontrado que los mAB , péptidos u otras entidades q u ímicas que apu ntan al complejo uPA/u PAR o al complejo u PAR-integrina son útiles para el tratamiento y/o diagnóstico de cáncer. Hasta la fecha , los i nventores de la presente creen que no han sido descritos anticuerpos que reconozcan el com plejo u PA-u PAR, pero no (a) u PAR o uPA individualmente o (b) u PAR en la presencia de u PA (es decir, u PAR ocupado por ligando). Además, el complejo uPA-u PAR o el uPAR solo tienen otros ligandos "corriente abajo", tales como integrinas, proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) y otros compañeros de unión . Se cree que estas interacciones corriente abajo son importantes para los procesos de migración , invasión y proliferación celular. Por lo tanto son deseables procesos que apu nten estos procesos terapéuticamente o q ue detecten el proceso o sus componentes interactuantes para uso diagnóstico . Además de los anticuerpos específicos que apuntan a estas interacciones, tal como se describe en más detalle más adelante , esta invención también está dirigida a métodos para detectar anticuerpos que se unen exclusivamente al complejo u PA-u PAR o que inhiban las interacciones corriente abajo de uPAR. El enfoq ue de anticuerpo Los inventores de la presente han generado un panel de mAB que apuntan a uPAR. El uPAR es un objetivo ideal para los anticuerpos debido a que se expresa en la superficie celular. La expresión de uPAR en la interfaz de la vasculatura del tumor (en células de tumor invasivo, células endoteliales angiogénicas, o macrófagos asociados a tumor) sugiere que los anticuerpos que apuntan a esta proteína no sufrirán de las mismas barreras para a difusión que deberían reducir al mínimo el potencial de toxicidad cuando se emplea un Ab terapéutico, y reducir al mínimo las señales no específicas (o falsos positivos) cuando se emplea un Ab para diagnóstico. Los inventores de la presente han obtenido mAb contra un fragmento de la forma soluble de uPAR (conocido como "suPAR") expresado en células S2 de Drosophila . en este tipo de células, se expresa un isotipo de suPAR. Se espera que el uso de este suPAR como un inmunógeno supere la unión heterogénea a uPAR observada con otros mAB examinados hasta la fecha . Los estudios realizados como parte de un taller de antígenos leucocitarios compararon anticuerpos anti-uPAR disponibles en 1995-1996 y encontraron que todos ellos son específicos para epítopos de carbohidratos, no de proteína (Manupello, J ef al. , (1996) Tiss Antigens 48:368). Sin duda, el uPAR expresado en tumores es alta y heterogéneamente glicosilado, y el patrón de glicosilación y la representación de diferentes ¡soformas cambia en respuesta a diversas señales (Stoppelli MP ef al (1985) Proc Nati Acad. Sci USA 824939-4943). Así, es poco probable que los anticuerpos anti-uPAR obtenidos contra epítopos carbohidrato reconozcan todas las isoformas de uPAR y pueda reaccionar de manera cruzada indeseablemente con otras proteínas que expresan estructuras de glicosilación similares a las presentes en uPAR. El uso de S2 ha conducido a la identificación de mAb que reconocen los epítopos de proteína dentro de suPAR (Fig . 2). Los inventores de la presente han producido clones estables que expresan altas cantidades de suPAR, así como también fragmentos de dominio de suPAR. Los rendimientos típicos usando estos sistemas de expresión están en el orden de 25-50 mg/L después de la purificación (>95% de pureza). Así, los inventores de la presente han demostrado que es posible expresar todos los componentes requeridos para la generación de los anticuerpos de la presente invención y diseñar análisis para evaluarlos y caracterizarlos. Una forma mutante de suPAR ha sido expresada, en la cual los sitios de glicosilación han sido mutados. Los clones de mAb murino pueden ser humanizados o primatizados. La habilidad de los inventores de la presente para generar fragmentos de dominio conformacionalmente intactos de suPAR les ha permitido producir mAb contra DI aislados y contra D2D3 aislados (de suPAR). Un epítopo expuesto en el fragmento D2D3 de uPAR también se expone en su longitud total , uPAR intacto solamente después de la unión de uPA. Este epítopo ha demostrado ser crítico para la actividad pro-migratoria de uPA (Andolfo A eí al (2002) Thromb Haemost 55:298-306). Así, se espera que los anticuerpos generados contra el fragmento D2D3 en donde este epítopo ya está expuesto, tengan actividad anti-migratoria. Esto ha sido demostrado por el mAb ATN-658. Esta invención está dirigida por lo tanto en parte a un mAb que se une a un complejo binario uPA-uPAR, pero no sustancialmente a (a) uPA libre o (b) la región de uPAR que reconoce y se une a uPA, de tal forma que el mAb no inhibe la unión a uPA-uPAR, cuyo mAb es producido mediante un proceso que comprende el paso inicial de inmunizar un mamífero, preferiblemente un ratón, con (a) un isotipo de suPAR mínimamente glicosilado expresado en células de Drosophila, o (b) un mutante desglicosilado de suPAR en el cual han sido mutados 4 o 5 sitios de glicosilación. Después de la inmunización usando procedimientos estándar, se emplean técnicas convencionales para generar líneas celulares de hibridoma de los animales inmunizados y para generar mAb que tienen las propiedades deseadas. Los mAb específicos para complejos uPA-uPAR que tienen propiedades adicionales o un tanto diferentes a las que se describen aquí, se elaboran de la misma forma usando los mismos antígenos de suPAR novedosos. Los mAb elaborados mediante este proceso pueden unirse o no al uPAR libre en solución. Hay cinco sitios de glicosilación N-ligados en el uPAR de tipo natural : Asn52 (en D 1 ) Asn162 y Asn1 72 (en D2) y Asn200 y Asn233 (en D3). Los últimos cuatro sitios en D2 y D3 preferiblemente son mutados a Gln para generar un inmunógeno suPAR desglicosilado preferido para obtener el mAb de la invención. También se ha generado mAb anti-D2D3 que reconoce uPAR en las superficies celulares sin considerar si el uPAR está ocupado por uPA. Dado que un porcentaje grande de uPAR en tumores sin duda está unido a uPA, los anticuerpos de esta especificidad son útiles como agentes apuntadores para porciones terapéuticas y diagnósticas. Además, en pacientes con cáncer, se observa frecuentemente que los tumores que expresan uPAR que es dividido por proteasas expresadas por estos mismos tumores, dejan un fragmento residual de D2D3 todavía unido al tumor (Sier CF et al. , Thromb Haemost 2004, 91 :403-1 1 ). Así, el apuntamiento exitoso de estos tumores requiere anticuerpos anti D2D3. Estos anticuerpos también son útiles para aplicaciones en formación de imágenes in vivo. Los anticuerpos anti D2D3 (y otros anticuerpos de la presente invención) se someten a prueba preferiblemente en modelos de tumor xenogénos, de los cuales dos ejemplos preferidos son los modelos A2780 y A549 (que se describen en mayor detalle más adelante). Secuencias de am inoácidos de región variable (V) de dos mAb preferidos mAb ATN-658: Secuencias de región variable La secuencia de aminoácidos de consenso (código de una sola letra) de los polipéptidos de la región variable de cadena ligera (VL) y de la región variable de cadena pesada (VH) de mAb ATN-658 se muestran más adelante. Se preparó ADNc a partir de ARN total extraído del hibridoma que expresa ATN-658, y se clonaron las regiones variables, se amplificaron y se secuenciaron usando técnicas estándar. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) para cada región variable están resaltadas (cursiva, negrita, subrayada) Proteína de consenso de ATN-658 V. (SEQ ID NO: 1) 1 DIXLTQSPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQS L DSDGKTYLNW LLQRPGQSPK 51 RLIY VSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP 101 LTFGAGTKLE LKL Proteína de consenso de ATN-658 VH (SEQ ID NO: 2) 1 VQLQESGPEL VKTGASVKIS CKAS GYSFTSYYMH^J VKQSH GKSLEWIGE/ 51 NPYNGGASYN QKIKGRATFT VDTSSRTAYM QFNSLTSEDS AVYYCARS/Y 101 GA/SW.PVWGQ GTTVTVS Tabla 1: Características de CDR de las cadenas ATN-658 L y H *CDR-L1: primer CDR de cadena L, CDR-H2: 2o CDR de cadena H, etc. mAb ATN-615: Secuencias de región variable Se preparó secuencia de aminoácidos (código de una sola letra) de las regiones variables de cadena ligera (VL) y de cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal ATN-615. Se preparó ADNc a partir de ARN total extraído del hibridoma que expresa ATN-615 y las regiones variables se clonaron, se amplificaron y se secuenciaron usando técnicas estándar. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) para cada variable están resaltadas en rojo. Secuencia de proteína de consenso de ATN-615 VL (SEQ ID NO: ü 1 DIVLTQSPDI TAASLGQKVT ITCSASSSVS Y?WWYQQKSG TSPKPWIFE/ 51 SK SGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAAI YYCQQW ?YPF7FGGGT 101 KLEIKR Secuencia de proteína de consenso de ATN-615 VH (SEQ ID NO: 10) 1 VKLQQSGPEV VKPGASVKIS CKAS GYSFTN FYfíWVKQRP GQGLEWIG W/ 51 FHGSDNTEYN EKFKDKATLT ADTSSSTAYM QLSSLTSEDS AVYFCARWGP 101 HWYFDWJGQG TTVTVSS Tabla 2. Características de los CDR de ATN-615 *CDR-L1: primer CDR de cadena L, CDR-H2: 2o CDR de cadena H, etc. De acuerdo con la presente invención, un Ab o un mAb, tiene "esencialmente las mismas características de unión a antígeno" que un mAb de referencia, si éste demuestra un perfil de especificidad similar (por ejemplo, mediante comparación del orden en el rango), y tiene afinidad por el antígeno relevante (por ejemplo, complejo uPA-uPAR) dentro de 1.5 órdenes de magnitud, más preferiblemente dentro de un orden de magnitud, del Ab de referencia. Los anticuerpos se evalúan con respecto a la actividad anti-angiogénica directa en un modelo con inserto de Matrigel in vivo. Se usan anticuerpos radio yodados para someter a prueba la internalización del Ab usado en células MDA MB231, las cuales expresan tanto receptor como ligando. La internalización del anticuerpo también se mide en la presencia de complejos PAI- 1 :uPA. Anticuerpos específicos para u PA, uPAR y complejos binarios v ternarios de ellos En la siguiente descripción , se hará referencia a diversas metodolog ías que son familiares para los conocedores de la materia de inmunolog ía , biología celular, y biolog ía molecular. Las publicaciones y otros materiales que exponen estas metodolog ías conocidas a las cuales se hace referencia están incorporadas aqu í mediante referencia en su totalidad , tal como si estuvieran expuestas completamente. Los trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de la inmunolog ía incluyen Abbas, AK ef al. , Cellular and Molecular Immunology (Cuarta Ed.), W.B. Saunders Co. , Philadelphia , 2000; Janeway, CA ef al. , Immunobiology The Immune System in Health and Disease, 4a . ed . , Garland Publishing Co. , New York, 1999; Roitt, I ef al., Immunology, (ed . actual) CV. Mosby Co. , St. Louis, MO (1999); Klein , J , Immunology, Blackwell Scientific Publications, Inc. , Cambridge, MA, (1990). Los anticuerpos monoclonales (mAb) y los métodos para su producción y uso están descritos en Kohier y Milstem, Nature 256:495-497 (1975); patente estadounidense número 4,376, 1 10; Hartlow, E. ef al. , Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988); Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimensión in Biológica! Analyses, Plenum Press, New York, NY (1980); H . Zola ef al., en Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982)). Los métodos de inmunoanálisis además están descritos en Coligan, JE ef al., eds., Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New York 1991 (o edición actual); Butt, WR (ed.) Practical Immunoassay: The State of the Art, Dekker, New York, 1984; Bizollon, CA, ed., Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays, Elsevier, New York, 1984; Butler, JE, ELISA (Capítulo 29), en: van Oss, CJ ef al, (eds), IMMUNOCHEMISTRY, Marcel Dekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803; Butler, JE (ed.), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, 1991; Weintraub, B, Principies of Radioimmunoassays, The Endocrine Society, March, 1986; Work, TS ef al., Laboratory Techniques and Biochemistry Jn Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, 1978; Dabbs, DJ, Diagnostic Immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 2001. Los anticuerpos anti-idiotípicos se describen, por ejemplo, en Idiotypy in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1984; Immunological Reviews Vol. 79, 1984 y Vol. 90, 1986; Curr. Top Microbiol. Immunol. Vol. 119, 1985; Bona, C. ef al, CRC Crit Rev. Immunol , pp. 33-81 (1981); Jeme, NK, Ann. Immunol. 125C:373-389 (1974); Urbam, J ef al., Ann. Immunol. 133DA79- (1982); Rajewsky, K. ef al, Ann. Rev. Immunol.7:569-607 (1983). La presente invención proporciona anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, reactivos con complejos uPA/uPAR que inhiben las interacciones de uPAR con integrinas u otros objetivos corriente abajo. Los anticuerpos pueden ser xenogénicos, alogénicos, singénicos, o formas modificadas de ellos, tales como anticuerpos humanizados o quiméricos. Los anticuerpos anti idiotípicos específicos para el idiotipo de, por ejemplo, un Ab anti uPA/uPAR también están incluidos. El término "anticuerpo" también quiere decir que incluye tanto moléculas intactas como también fragmentos de ellas que incluyen el sitio de unión a antígeno y son capaces de unirse a un epítopo objetivo, por ejemplo, de complejo uPA/uPAR o uPAR-integrina. Estos incluyen fragmentos Fab y F(ab')2 que carecen del fragmento Fe de un Ab intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión a tejido no específico que un Ab intacto (Wahl ef al., J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983)). También están incluidos fragmentos de Fv (Hochman, J. ef al. (1973) Biochemistry 12: 1130-1135; Sharon, J. et s/.(1976) Biochemistry 15: 1591-1594).). Estos fragmentos diversos se producen usando técnicas convencionales tales como división de proteasa o división química (véase, por ejemplo, Rousseaux ef al., Meth. Enzymol, 727:663-69 (1986)). Los anticuerpos policlonales se obtienen como suero de animales inmunizados tales como conejos, cabras, roedores, etc., y se pueden usar directamente sin tratamiento adicional o pueden ser sometidos a métodos de enriquecimiento o purificación adicional tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio de iones, y cromatografía de afinidad (véase Zola ef al.. supra). Un inmunógeno para la generación de los anticuerpos de esta invención puede comprender uPAR, suPAR, complejos uPA/uPAR o uPAR-integrina, o un fragmento portador de epítopo o un derivado de ellos. Los inmunógenos útiles se producen en una variedad de formas conocidas en la materia, por ejemplo, expresión de genes clonados usando métodos recombinantes convencionales, aislamento de las células de origen, poblaciones de células que expresan altos niveles de, por ejemplo, uPA o uPAR, etc. En el caso de fragmentos más cortos, éstos pueden ser sintetizados químicamente. Un inmunógeno preferido es el fragmento D2D3 de suPAR. Los mAB pueden producirse usando tecnología de hibridoma convencional, tal como los procedimientos introducidos por Kohier y Milstein (Nature, 256:495-97 (1975)), y modificaciones de ellos (véase las referencias anteriores). Un animal, preferiblemente un ratón, es sensibilizado mediante inmunización con un inmunógeno como se explica anteriormente para desencadenar la respuesta de Ab deseada en el animal sensibilizado. Los linfocitos B de los nodos linfáticos, bazos o sangre periférica de un animal sensibilizado, son fusionados con células de mieloma, generalmente en la presencia de un agente promotor de fusión tal como polietilenglicol (PEG). Cualquiera de una cantidad de líneas celulares de mieloma murinas están disponibles para tal uso: las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1 , P3-x63-k0Ag8.653, Sp2/0-Ag 14, o HL1 -653 (disponibles en ATCC, Rockville, M D). Los pasos subsiguientes incluyen crecimiento en medio selectivo de tal forma que las células de mieloma parental no fusionadas y las células de linfocitos donantes eventualmente mueren , mientras que solamente las células de hibridoma sobreviven. Estas se clonan y se cultivan , y sus supernadantes se exploran para detectar la presencia de Ab de la especificidad deseada, por ejemplo, mediante técnicas de inmunoanálisis. Los clones positivos se subclonan , por ejemplo, limitando la dilución, y los mAb se aislan. Los hibridomas producidos de acuerdo con estos métodos se pueden propagar in vitro o in vivo (en fluido de ascitis) (véase en general Fink ef al. , Prog. Clin. Pathol, 9: 121 -33 (1984)). Generalmente, la l ínea celular individual se propaga en cultivo, y el medio de cultivo que contiene altas concentraciones de un solo mAb puede ser recolectado por decantación, filtración , o centrifugación. Producción de Ab Un enfoque preferido para producir un mAb de acuerdo con la presente invención es el que sigue. Se prepara D2D3 de suPAr usando digestión quimiotríptica y purificación (Shliom , O. ef al, (2000) J. Biol. Chem 275:24304-12). Luego se conjuga D2D3 con cualquier proteína portadora útil , tal como albúmina , hemocianina de lapa californiana (KLH) u ovalbúmina . Las inmunizaciones se llevan a cabo típicamente en adyuvante de Freund completo seguidas por refuerzos periódicos en adyuvante de Freund incompleto. También se extrae sangre a los animales periódicamente y el título del suero se mide usando un ELISA en el cual el suPAR es inmovilizado en la superficie de receptáculos de microplacas. Si se usa un péptido, éste preferiblemente está conjugado con una proteína portadora, por ejemplo, KLH , y se inyecta en ratones BALB/c intraperitonealmente (i .p. ) en adyuvante de Freund incompleto (por ejemplo, 50 µg de conjugado), seguido por dos inyecciones adicionales de la misma dosis en adyuvante de Freund incompleto en intervalos de dos semanas. Después de un mes, se proporciona una inyección final (por ejemplo, 50 µg en 0.5 mL de PBS) y preferiblemente también por vía intravenosa (i .v.) (por ejemplo, 50 µg en 0.2 mL) sin adyuvante. Se recolectan las células de bazo tres días después de la inyección final y se fusionan con P3X63AF8/653 u otras células de mieloma usando técnicas estándar. Células de prueba para detectar y caracterizar anticuerpos Se prefiere suPAR puro inmovilizado sobre plástico para la detección primaria . También se puede usar células tales como la línea HeLa que sobreexpresan uPAR para demostrar la unión de células de un mAb anti-suPAR. Muchas l íneas de células tumorales que sobreexpresan uPAR son bien conocidas y están disponibles públicamente; estas pueden usarse para la detección . Las células generalmente se colocan en placas en microplacas de 96 receptáculos. Las células pueden ser fijadas, por ejemplo, con metanol/acetona (50/50), y la unión se detecta mediante la medición de la radioactividad . En una modalidad, un supernadante de hibridoma (por ejemplo, 50 µL) se añade a receptáculos que contienen células 293 fijadas durante aproximadamente 1 .5 h a 37°C. Se lavan las placas dos veces en regulador para lavado (tal como PBS/0.05% de Tween- 20), y se le añade IgG anti-ratón de cabra conjugado con Rojo Rodamina (por ejemplo, 30 µL/receptáculo) en una dilución apropiada, tal como 1 .100, durante 1 .5 h a 37 °C. Después de lavar en un regulador para lavado, se examinan las células para determinar la presencia de inmunofluorescencia; en la modalidad descrita aqu í , se usa un microscopio de fluorescencia . En esta modalidad , la ¡nmunofluorescencia es la base para determinar si un supernadante de hibridoma contiene un Ab específico para el complejo uPA/uPAR (a pesar de que también se puede usar tinción inmunohistoquímica). Si los supernadantes muestran tinción positivamente, se seleccionan los clones del hibridoma, se expanden , y los supernadantes se someten a prueba para determinar la reactividad al complejo mediante ELIAS. En un ELISA preferido, el péptido se acopla a la ovalbúmina (OVA) como una proteína portadora y el conjugado de péptido/OVA cubre los receptáculos de placas EIA de 96 receptáculos, la cual recibe, por ejemplo, 2µg/mL de conjugado en 50 µL de regulador de recubrimiento (0.2 M de Na2CO3/Na HCO3, pH 9.6). Las placas se incuban durante la noche a 4 °C, se bloquean con un regulador para bloqueo apropiado, por ejemplo, PBS que contiene BSA al 1 % (200 µL/receptáculo) durante la noche a 4°C. Los supernadantes del hibridoma (por ejemplo, 50 µL) se añaden a los receptáculos durante 1 .5 horas a temperatura ambiente. Se lavan las placas dos veces en un regulador de lavado (por ejemplo, PBS/ Tween-20 al 0.05 %), y se le añade un Ab secundario acoplado con enzima, tal como una IgG anti-ratón de cabra acoplada con fosfatasa alcalina (50 //L/receptáculo) en una dilución apropiada , por ejemplo, 1 :2000. Se incuban las placas durante 1 .5 horas a temperatura ambiente. Después de lavarse 4 veces en regulador para lavado, se le añade un sustrato cromogénico apropiado para la enzima, por ejemplo, CP-nitrofenilfosfato en esta modalidad (disponible en Kirkegaard y Perry Co. , Gaithersburg , MD), durante aproximadamente 30 min y se mide la absorbancia a una longitud de onda apropiada para el producto coloreado (aquí 405 nm). Los supernadantes del hibridoma que reaccionan fuertemente con el péptido portador del epítopo (por ejemplo, A405 > 1 .0 cuando los controles negativos son <0.02) se re-clonan (preferiblemente dos veces), y la reactividad al mAb se confirma de nuevo mediante ELISA como anteriormente. El término "anticuerpo" quiere decir que incluye tanto moléculas de inmunoglobulina (Ig) intactas como fragmentos y derivados de ellas, que pueden ser producidas mediante división proteol ítica de moléculas de Ig o diseñadas genética o qu ímicamente. Los fragmentos incluyen , por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, cada uno de los cuales es capaz de unirse al antígeno. Estos fragmentos carecen del fragmento Fe del Ab intacto y tienen una ventaja adicional , si se usan terapéuticamente, de eliminarse más rápidamente de la circulación y de sufrir menos unión no específica a tejidos que los anticuerpos intactos. El tratamiento de IgG con papaína produce fragmentos de Fab; el tratamiento con pepsina produce fragmentos de estos fragmentos también pueden producirse mediante ingeniería genética o de proteínas usando métodos bien conocidos en la materia. Un fragmento de Fab es una proteína multimérica que consiste en la porción de una molécula de Ig que contiene las porciones activas inmunológicamente de una cadena pesada (H ) de Ig y una cadena ligera (L) de Ig acopladas juntas covalentemente, y capaces de combinarse específicamente con antígeno. Los fragmentos de Fab típicamente se preparan mediante digestión proteolítica de moléculas de Ig sustancialmente intactas con papaína , usando métodos que son bien conocidos en la materia. Sin embargo, un fragmento de Fab también puede ser preparado expresando en una célula anfitriona apropiada las partes deseadas de la cadena H de Ig y de la cadena L de Ig usando métodos bien conocidos en la materia . Un fragmento de (Fab')2 es un tetrámero que incluye un fragmento de dos cadenas H y dos cadenas L. El fragmento de Fv es una proteína multimérica que consiste en las porciones inmunológicamente activas de una región variable (V) de cadena H de Ig y una región V de cadena L de Ig (VL) acopladas covalentemente juntas y capaces de combinarse específicamente con antígeno. Los fragmentos de Fv están preparados típicamente expresando el célula anfitriona apropiada las porciones deseadas de la región VH y de la región V de Ig , usando métodos bien conocidos en la materia. la proteína de unión a antígeno de cadena simple o el Ab de cadena simple, también denominado "scFv," es un polipéptido compuesto de una secuencia de aminoácidos VL de Ig atada a una secuencia de aminoácidos VH de Ig mediante un péptido que enlaza el término C de la secuencia VL al término N de la secuencia VH. En una modalidad preferida, el Ab es un mAb denominado ATN-615 o ATN-658, ambos de los cuales son anticuerpos lgG 1 . En otra modalidad preferida , el Ab es un Ab quimérico que reconoce un epítopo reconocido por ATN-615 o ATN-658. Anticuerpos gu iméricos los anticuerpos quiméricos de la invención contienen cadenas individuales quiméricas H y L de Ig . La cadena quimérica H contiene una región de unión al antígeno derivada de la cadena H de un Ab no humano específico, por ejemplo, para uPA/uPAR o para complejo uPAR-integrina , por ejemplo mAb ATN-615 o ATN-658, el cual está ligado a al menos una parte de una región CH humana. Una cadena L quimérica contiene una región de unión al antígeno derivada de la cadena L de un Ab no humano específico para el antígeno objetivo, tal como el hibridoma ATN-615 o ATN-658, ligado al menos a una parte de la región CL humana. Como se usa aqu í, el término "región de unión al antígeno" se refiere a aquella parte de una molécula de Ab que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y le confieren al Ab su especificidad y afinidad para el antígeno. La región de Ab incluye los residuos de aminoácidos de "marco" necesarios para mantener la conformación apropiada de los residuos de unión (o "contacto") con el antígeno. Como se usa aquí, el término "anticuerpo quimérico" incluye Ig monovalentes, divalentes o polivalentes. Un Ab quimérico monovalentes es un dímero HL formado por una cadena H quimérica asociada a través de puentes disulfuro con una cadena L quimérica. Un Ab quimérico divalente es el tetrámero H2L2 formado por dos d ímeros HL asociados mediante al menos un puente disulfuro. También se puede producir un Ab quimérico polivalente, por ejemplo, empleando una región CH que agregue (por ejemplo, de una cadena H de Ig M , denominada cadena µ). La invención también proporciona "derivados" de los mAb de ratón o de los Ab quiméricos, dicho término incluye aquellas proteínas codificadas por genes truncados o modificados para producir especies moleculares que se asemejan funcionalmente a los fragmentos de Ig. Las modificaciones incluyen, sin limitación a ellas, adición de codificación de secuencias genéticas para proteínas citotóxicas tales como toxinas de plantas y bacteriales. Los fragmentos y derivados se pueden producir a partir de cualquiera de los anfitriones de esta invención. Los anticuerpo, fragmentos o derivados que tienen cadenas H y cadenas L quiméricas de las mismas o de diferentes especificidades de unión en la región V, pueden ser preparados mediante asociación apropiada de las cadenas de polipéptido individuales, como lo describen por ejemplo, Sears ef al. , Proc Nati Acad Sci USA 72-353-357 ( 1975). Con este enfoque, los anfitriones que expresan cadenas H quiméricas (o sus derivados) se cultivan por separado a partir de anfitriones que expresan cadenas L quiméricas (o sus derivados), y las cadenas de Ig se recuperan separadamente y luego se asocian . Alternativamente, los anfitriones pueden ser co-cultivados y se deja que las cadenas se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguidas por recuperación de Ig , fragmento o derivado ensamblado. La región de unión a antígeno del Ab quimérico (o de un mAb humano) de la presente invención preferiblemente proviene de un Ab no humano específico, por ejemplo, para complejo uPA/uPAR o uPAR-integrina. Las fuentes preferidas para el ADN que codifica este Ab no humano incluyen líneas celulares que producen Ab, preferiblemente hibridomas. Los hibridomas preferidos son la l ínea celular de hibridoma ATN-615 (número de acceso a ATCC ) y ATN-658 (Número de acceso a ATCC ) los cuales fueron producidos como se describió anteriormente y cuyas regiones V tienen las secuencias que se muestran anteriormente. Así, un Ab quimérico preferido (o Ab humano) tiene una secuencia de VL SEQ ID NO: 1 y una secuencia de VH SEQ ID NO: 2 las cuales son las secuencias de consenso de mAb ATN-658. Los residuos de estas regiones CDR pueden ser variados, preferiblemente como sustituciones conservadoras, siempre que la región V de como resultado un Ab con la misma especificidad para el antígeno, y sustancialmente la misma afinidad de unión al antígeno o avidez, preferiblemente al menos 20 % de la afinidad o avidez de un Ab en donde la secuencia de VL es SEQ I D NO: 1 y la secuencia de VH es SEQ ID NO:2. Se prefiere que en este Ab quimérico (o humano), las tres regiones de CDR de la cadena VL sean SEQ I D NO: 3, 4 y 5 y las tres regiones de CDR de la cadena VH sean SEQ I D NO: 6, 7 y 8. Otro Ab quimérico preferido (o Ab humano) tiene una secuencia de VL SEQ I D NO: 9 y una secuencia de VH SEQ ID NO: 10, las cuales son las secuencias de consenso del mAb ATN-615. Los residuos de estas regiones V que no son las regiones de CDR pueden ser variadas, preferiblemente como sustituciones conservadoras, siempre que la región V de como resultado un Ab con la misma especificidad para el antígeno y sustancialmente la misma afinidad o avidez de unión para el antígeno, preferiblemente al menos 20% de la afinidad o avidez de un Ab en donde la secuencia de V es SEQ ID NO:9 y la secuencia de VH es SEQ ID NO: 10. Se prefiere que en este Ab quimérico, las tres regiones de la cadena VL sean SEQ I D NO.1 1 , 12 y 13 y las tres regiones de la cadena VH sean SEQ ID NO: 14, 15 y 16. Las moléculas de ácido nucleico preferidas para su uso en la construcción de un Ab quimérico (o Ab humano) de esta invención son (a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia codificadora que codifica una región VL con la secuencia SEQ ID NO: 1 y (b) una molécula de ácido nucleico con una secuencia codificadora que codifica una cadena VH con la secuencia SEQ ID NO:2. También se prefiere una molécula de ácido nucleico que codifica una región VL que contiene las tres CDR con SEQ I D NO:3, 4 y 5 y una molécula de ácido nucleico que codifica una región VH que contiene las tres CDR con SEQ I D NO; 6, 7 y 8. Otro conjunto de moléculas de ácido nucleico preferidas para su uso en la construcción de un Ab quimérico (o Ab humano) de esta invención son (a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia codificadora que codifica una región VL con la secuencia SEQ I D NO: 9 y (b) una molécula de ácido nucleico con una secuencia codificadora que codifica una cadena VH con la secuencia SEQ I D NO: 10. También se prefiere una molécula de ácido nucleico que codifica una región VL que contiene las tres CDR con SEQ I D NO: 1 1 , 12 y 13 y una molécula de ácido nucleico que codifica una región VH que contiene las tres CDR con SEQ ID NO: 14, 15 y 16. Alternativamente, el Ab no humano que produce células a partir de las cuales se origina la región V del Ab de la invención , puede ser un linfocito B obtenido de la sangre, bazo, nodos linfáticos u otro tejido de un animal inmunizado con D2D3 de suPAR. La célula productora del Ab contribuye con las secuencias de nucleótidos que codifican la región de unión al antígeno del Ab quimérico de la presente invención , también pueden ser producidas mediante transformación de una célula no humana, tal como de primate, o una célu la humana . Por ejemplo, un linfocito B que produce un Ab específico, por ejemplo, complejo u PA/u PAR o u PAR-integrina , puede ser infectado, y transformado con u n virus tal como el virus de Epstein-Barr para prod ucir una cél ula prod uctora de Ab inmortal (Kozbor ef al Immunol Today 4:72-79 ( 1 983 )). Alternativamente , el linfocito B puede ser transformado proporcionando un gen transformador o un producto genético transformador, tal como es bien conocido en la materia . Preferiblemente, la región de unión al antígeno será de origen muri no. En otras modalidades, la región de unión al antígeno puede provenir de otras especies animales , en particu lar roedores tales como ratas o hámsteres . El mAb murino o q uimérico de la presente invención se puede prod ucir en grandes cantidades inyectando célu las de h ibridoma o de transfectoma que secretan el Ab en la cavidad peritoneal de los ratones, y después del tiempo apropiado, recolectar el fluido de ascitis que contiene un título alto del mAb, y aislando el mAb de éste. Para esta producción in vivo del mAb con un hibridoma no murino (por ejemplo, de rata o humano), las células de hibridoma preferiblemente se cultivan en ratones desnudos irradiados o atímicos. Alternativamente, los anticuerpos se pueden producir cultivando células de hibridoma (o de transfectoma ) in vitro y aislando el mAb secretado del medio de cultivo celular. Los genes humanos que codifican las reg iones C constantes de los anticuerpos quiméricos de la presente invención pueden provenir de una biblioteca de hígado fetal humano o de cualquier célula humana, incluyendo aquellas que expresan y producen Ig humanas. La región de CH humana puede provenir de cualquiera de las clases o isotipos conocidas de cadenas H humanas, incluyendo y, µ, a, d o e, y subtipos de ellas, tales como G 1 , G2, G3 y G4. Dado que el isotipo de cadena H es responsable por las diversas funciones efectoras de un Ab, la elección de la región CH será guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación al complemento, o actividad en citotoxicidad celular dependiente de Ab (ADCC). Preferiblemente, la región CH proviene de yl (lgG 1 ), 3 (lgG3), ?4 (lgG4), o µ (IgM ). La región CL humana puede provenir de cualquier isotipo de cadena L humana, K O ? . Los genes que codifican las regiones C de Ig humana se obtienen de células humanas mediante técnicas de clonación estándar (Sambrook, J . ef al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a. Edición , Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Los genes de la región C humana están disponibles fácilmente de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y las subclases de ellas. Los fragmentos de Ab quiméricos, tales como F(ab')2 y Fab, se pueden preparar diseñando una cadena H quimérica que es truncada de manera apropiada. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una parte de cadena H de un fragmento de F(ab')2 podría incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH 1 y la región bisagra de la cadena H , seguida por un codón de parada traduccional para producir la molécula truncada. Generalmente, los anticuerpos quiméricos de la presente invención se producen mediante clonación de segmentos de ADN que codifican las regiones de unión al antígeno de cadena H y L de un Ab específico de la invención , preferiblemente no humano, y unen estos segmentos de ADN a segmentos de ADN que codifican regiones CH y CL humanas, respectivamente, para producir genes que codifican Ig quimérico. Así, en una modalidad preferida , se crea un gen fusionado que contiene un primer segmento de ADN que codifica al menos la región de unión al antígeno de origen no humano, tal como una región V reacomodada funcionalmente con segmento de unión (J ), ligado a un segundo segmento de ADN que codifica al menos una parte de una región C humana. El ADN que codifica la región de unión al Ab puede ser ADN genómico o ADNc. Una alternativa conveniente para el uso de fragmentos genéticos cromosómicos como fuente de ADN que codifica el segmento de unión al antígeno de la región V murina es el uso de ADNc para la construcción de genes Ig quiméricos, tal como informaron Liu ef al. (Proc Nati Acad. Sci. , USA 84:3,439 ( 1987); J. Imm?no. 139:3521 (1987), cuyas referencias están incorporadas aqu í mediante referencia. El uso de ADNc requiere que los elementos de expresión genética apropiados para la célula anfitriona sean combinados con el gen , con el fin de log rar la síntesis de la proteína deseada . El uso de secuencias de ADNc es ventajoso sobre las secuencias genómicas (las cuales contienen intrones), porque esas secuencias de ADNc pueden ser expresadas en bacterias o en otros anfitriones que carecen de sistemas de empalme de ARN apropiados. Por lo tanto, en una modalidad q ue utiliza ADNc que cod ifica la región V de Ab, el método par producir el Ab quimérico implica varios pasos , q ue se indican a continuación : 1 . Aislamiento de ARN mensajero (ARNm) de la l ínea celular productora del mAb, clonación y prod ucción de ADNc de ella . 2. Preparación de u na biblioteca de AD Nc de longitud total a parti r de ARN m pu rificado del cual los segmentos genéticos de la región V apropiada de los genes de la cadena L y H pueden ser: (i ) identificados con sondas apropiadas, (ii ) secuenciados , y (iii ) hechos compatibles con un segmento genético C; 3. Preparación de segmentos genéticos de la región C mediante preparación de AD Nc y clonación ; 4. Construcción de secuencias cod ificadoras completas de cadena H o L mediante enlace de los segmentos genéticos de la región V específicos clonados con el gen de la región C h umana clonado, tal como se describió anteriormente; 5. Expresión y producción de cadenas L y H quiméricas en anfitriones seleccionados, incluyendo células procarióticas y eucarióticas. Una característica común de todos los genes de cadena H y L de Ig y sus ARNm codificados es la región J . Las regiones J de cadena H y L tienen diferentes secuencias, pero existe un alto grado de homolog ía de secuencia (más de 80%) entre cada grupo, especialmente cerca de la región C. Esta homología se explota en este método y las secuencias de consenso de las regiones J de cadena H y L pueden usarse para diseñar oligonucleótidos para su uso como sensibilizadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para el enlace subsiguiente de segmentos de la región V a segmentos de la región C humana. Los vectores de ADNc de la región C preparados a partir de células humanas, pueden ser modificados mediante mutagénesis dirigida al sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana. Por ejemplo, se puede clonar la región C de la cadena K (CK) y la región C de y-? humana completa (C -1 )- En este caso, el método alternativo basado en los clones de la región C genómica como la fuente de vectores de la región C que no permitirían que estos genes se expresaran en sistemas bacterianos en donde sean necesarias enzimas para eliminar secuencias interventoras, estaría ausente. Los segmentos de la región V clonada son eliminados y ligados a vectores de la región C de cadena L o H . Alternativamente, la región C - 1 humana puede ser modificada introduciendo un codon de terminación , generando así una secuencia genética que codifica la porción de la cadena H de una molécula Fab. Las secuencias codificadores con regiones V y C ligadas se transfieren luego a veh ículos de expresión apropiados para su expresión en anfitriones apropiados, procarióticos o eucarióticos. Se dice que dos secuencias que codifican ADN están "ligadas operativamente" si el enlace da como resultado una secuencia continuamente traducible sin alteración o interrupción del marco de lectura del triplete. Una secuencia codificadora está ligada operativamente a un elemento de expresión genética si el enlace da como resultado la función apropiada de ese elemento de expresión genética para dar como resultado la expresión de la secuencia codificadora. Los vehículos de expresión incluyen plásmidos u otros vectores. Entre estos vehículos, los preferidos son los que portan una secuencia de cadena CH o CL humana funcionalmente completa que tiene sitios de restricción apropiados diseñados de tal forma que cualquier secuencia de cadena VH o VL con extremos cohesivos apropiados puede ser insertada fácilmente en ellos. Los veh ículos que contienen la secuencia de cadena CH o CL humana sirven así como intermediarios para la expresión de cualquier cadena H o L completa deseada en cualquier anfitrión apropiado. Un AB quimérico de ratón-humano será sintetizado típicamente a partir de genes dirigidos por los promotores genéticos cromosómicos originarios para las regiones V de cadena H y L de ratón usadas en las construcciones. El empalme ocurre usualmente entre el sitio donante del empalme en la región J del ratón y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C humana y también en las regiones de empalme que aparecen dentro de la región CH humana; la poliadenilación y la terminación de la transcripción ocurren en sitios cromosómicos originarios corriente abajo de las regiones codificadoras humanas. Los elementos de expresión genética útiles para la expresión de genes de ADNc incluye: (a) promotores de transcripción viral y sus elementos potenciadores, tales como el promotor temprano SV40 (Okayama , H . ef al. , Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)), LTR del virus de sarcoma de Rous (Gorman, C . ef al, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 79:61 1 1 ( 1 982)), y LTR de virus de leucemia murina de Moloney (Grosschedl, R ef al. , Cell 47:885 ( 1985)); (b) regiones de empalme y sitios de poliadenilación tales como los provenientes de la región tardía SV40 (Okayama et al. , supra); y (c) sitios de poliadenilación , tales como en SV40 (Okayama et al. , supra). Los genes de ADNc de Ig pueden ser expresados como lo describen Liu ef al. , supra, y Weidle, UH ef al. , Gene 57:21 -29 (1987), usando como elementos de expresión el promotor temprano SV40 y su potenciador, los potenciadores del promotor de cadena H de Ig , empalme de ARNm en la región tard ía SV40, secuencia interventora de ?-globina de conejo, sitios de poliadenilación de Ig y de ?-globina de conejo, y elementos de poliadenilación de SV40. Para los genes de Ig constituidos por ADNc parcial , ADN genómico parcial (Whittle, N ef al. , Protein Eng. 7:499-505 (1987)), el promotor transcripcional es citomegalovirus humano, los potenciadores del promotor son citomegalovirus e Ig de ratón/humana, y las regiones de empalme y poliadenilación de ARNm son de las secuencias de Ig cromosómicas originarias. En una modalidad , para la expresión de genes de ADNc en células de roedores, el promotor transcripcional es una secuencia de LTR viral , los potenciadores del promotor transcripcional son cualquiera del potenciador de cadena H de Ig de ratón y el potenciador de LTR viral , la región de empalme contiene un intrón de más de 31 bp, y las regiones de terminación de poliadenilación y transcripción provienen de la secuencia cromosómica originaria correspondiente a la cadena de Ig que está siendo sintetizada. En otras modalidades, las secuencias de ADNc que codifican otras proteínas se combinan con los elementos de expresión citados anteriormente, para lograr la expresión de las proteínas en células de mamíferos. Cada gen fusionado es ensamblado o insertado en un vector de expresión . Las células receptoras capaces de expresar el producto genético quimérico de la cadena de Ig son transfectadas luego de manera simple con un gen que codifica la cadena H quimérica o la cadena L quimérica, o son co-transfectadas con un gen de cadena H quimérica y un gen de cadena L quimérica. Las células receptores transfectadas se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de los genes incorporados y las cadenas de Ig expresadas o los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos intactos se recuperan del cultivo. En una modalidad , los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quiméricas, o partes de ellos, son acoplados en vectores de expresión separados que luego se usan para co-transfectar una célula receptora . Cada vector puede contener dos genes seleccionables, un primer gen seleccionable diseñado para la selección en un sistema bacteriano y un segundo gen seleccionable diseñado para la selección en un sistema eucariótico, en donde cada vector tiene un par de genes diferentes. Esta estrategia da como resultado vectores que primero dirigen la producción, y permiten la amplificación , de los genes fusionados en un sistema bacteriano. Los genes así producidos y amplificados en un anfitrión bacteriano se usan subsiguientemente para co-transfectar una célula eucariótica , y permiten la selección de una célula co-transfectada portadora de los genes transfectados deseados. Los ejemplos de genes seleccionables para su uso en un sistema bacteriano son el gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que confiere resistencia al cloramfenicol. Los genes seleccionables preferidos para su uso en transfectantes eucarióticos incluyen el gen fosforibosil transferasa xantina guanina (denominado gpt), y el gen fosfotransferasa de Tn5 (denominado neo). La selección de células que expresan gpt se basa en el hecho de que la enzima codificada por este gen utiliza xantina como un substrato para la síntesis de nucleótidos murina , mientras que la enzima endógena análoga no puede. En un medio que contiene ( 1 ) ácido micofenólico, el cual bloquea la conversión de monofosfato de inosina en monofosfato de xantina (S M P), y (2) xantina , solamente las célu las que expresan el gen gpt pueden sobrevivir. El producto del gen neo bloquea la in hibición de la s íntesis de proteína mediante el antibiótico G41 8 y otros antibióticos de la clase de la neomicina . Los dos procedimientos de selección pueden usarse si mu ltánea o secuencial mente para seleccionar la expresión de genes de la cadena Ig introducidos en dos vectores de ADN diferentes en una célula eucariótica . No es necesario incluir diferentes marcadores seleccionables para las célu las eucarióticas; un vector de cadena H y un vector de cadena L, cada u no con el mismo marcador seleccionable , puede ser co-transfectado. Después de la selección de las células resistentes de manera apropiada , la mayoría de los clones contendrán copias integradas de ambos vectores de cadena H y L. Alternativamente, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L qu iméricas pueden ser ensamblados en el mismo vector de expresión . Para la transfección de los vectores de expresión y la prod ucción del Ab quimérico, la l ínea celular receptora preferida es una célula de mieloma . Las células de mieloma pueden sintetizar, acoplar y secretar Ig codificadas mediante genes de Ig transfectados , y poseen el mecanismo para la glicosilación de la Ig . Una célula receptora particularmente preferida es la célula de mieloma no productora de Ig SP2/0 (ATCC #CRL 8287). Las células SP2/0 producen solamente Ig codificada por los genes transfectados. Las células de mieloma pueden ser cultivadas en cultivo o en la cavidad peritoneal de un ratón, en donde la Ig secretada pueda ser obtenida del fluido de ascitis. Otras células receptoras apropiadas incluyen células linfoides tales como linfocitos B de origen humano o no humano, células de hibridoma de origen humano o no humano, o células de heterohibridoma interespecies. El vector de expresión portador de una construcción de Ab quimérico de la presente invención puede ser introducido en una célula anfitriona apropiada mediante cualquiera de una variedad de medios apropiados, incluyendo medios bioqu ímicos tales como transformación , transfección , conjugación, fusión con protoplasto, precipitación de fosfato calcico, y aplicación con policationes tales como dietilaminoetil (DEAE) dextran, y medios mecánicos tales como electorforación , microinyección directa, y bombardeo con microproyectiles. Las secuencias codificadoras de Ig quimérica o genes de la presente invención también se pueden expresar en células de mamífero no linfoides o en otras células eucarióticas, tales como levadura , o en células procarióticas, en particular bacterias. La levadura proporciona ventajas sustanciales sobre las bacterias para la producción de cadenas H y L de Ig . Las levaduras llevan a cabo modificaciones de péptidos post-traslacionales, incluyendo glicosilación. Ahora existe una cantidad de estrategias con ADN recombinante, las cuales se pueden usar para la producción de las proteínas deseadas en levadura . La levadura reconoce secuencias l íderes de productos genéticos de mamíferos clonados, y secreta secuencias l íderes portadoras de péptidos (es decir, pre-péptidos). Los sistemas de expresión genética de levadura pueden ser evaluados rutinariamente en cuanto a los niveles de producción , secreción y la estabilidad de proteínas de cadena H y L quiméricas y Ab quiméricos ensamblados. Se puede utilizar cualquiera de una serie de sistemas de expresión genética que incorporan elementos promotor y de terminación de los genes expresados activamente, codifican enzimas glicol íticas producidas en grandes cantidades cuando se cultivan en medio rico en glucosa. Los genes glicolíticos conocidos también pueden proporcionar señales de control de transcripción muy eficientes. Por ejemplo, se puede utilizar las señales de promotor y terminador del gen de fosfoglicerato quinasa (PGK). Se puede tomar una cantidad de enfoques para evaluar los plásmidos con expresión óptima para la expresión de ADNc de Ig clonado en levadura (véase Glover, D.M . , ed , DNA Cloning, I RL Press, 1985). También se puede utilizar cepas bacterianas como anfitriones para la producción de moléculas de Ab o fragmentos de Ab descritos por esta invención , cepas K12 de E. coli, tales como W31 10 de E. coli (ATCC# 27325), y otras enterobacterias, tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y se puede usar diversas especies de Pseudomonas. Los vectores plásmidos que contienen replicón y secuencias de control que provienen de especies compatibles con una célula anfitriona se usan en cone3xión con estos anfitriones bacterianos. El vector porta un sitio de replicación , así como también genes específicos que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Se puede adoptar una cantidad de enfoques para evaluar los plásmidos de expresión para la producción de Ab o cadenas de Ab codificadas por los ADNc de Ig clonados en bacterias (véase Glover, supra). Los anfitriones preferidos son células de mamíferos, cultivadas in vitro o in vivo. Las células de mamíferos proporcionan modificaciones post-traslacionales a las moléculas de proteína Ig incluyendo eliminación del péptido l íder, doblado y ensamblaje de cadenas H y L, glicosilación de las moléculas de Ab, y secreción de proteína de Ab funcional . Las células de mam ífero que pueden ser útiles como anfitriones para la producción de proteínas de Ab, además de las células de origen linfoide descritas anteriormente, incluyen células de origen fibroblasto, tales como Vero (ATCC CRL 81 ) o CHO-K1 (ATCC CRL 61 ). Muchos sistemas de vector están disponibles para la expresión de genes de cadena H y de cadena L clonados en células de mamífero (véase Glover, supra). Se puede seguir diferentes enfoques para obtener Ab H2L2 completos. Para uso in vivo, particularmente para inyección en seres humanos, es deseable disminuir la inmunogenicidad del mAb haciendo Ab quiméricos de ratón-humano (o de roedor-humano) tal como se explicó anteriormente, o humanizando los Ab usando métodos conocidos en la materia . El Ab humanizado puede ser el producto de un animal que tiene genes de la región constante de Ig humana transgénica (véase por ejemplo WO90/1077 y WO90/04036). Alternativamente, el Ab de interés puede ser diseñado genéticamente para sustituir los dominios bisagra, y/o el dominio marco con la secuencia humana correspondiente (véase WO92/02190). Anticuerpos de cadena simple El Ab de la presente invención puede ser producido como un Ab o scFv de cadena simple en lugar de la estructura multimérica normal. Los Ab de cadena simple incluyen las regiones hipervariables de una Ig de interés y recrean el sitio de unión al antígeno de la Ig originaria mientras que son una fracción del tamaño de la Ig intacta (Skerra, A. ef al. (1988) Science, 240: 1038-1041 ; Pluckthun , A. ef al. (1989) Methods Enzymol. 178- 497-515; Winter, G . ef al. (1991 ) Nature, 349: 293-299); Bird et al. , (1988) Science 242:423, Huston ef al (1988) Proc. Nati. Acad Sci USA 85:5879; Jost CR ef al, J Biol Chem. 1994 269:26267-26273; petentes estadounidenses números 4,704,692, 4,853,871 , 4,94,6778, 5,260,203, 5,455,030). Las secuencias de ADN que codifican las regiones V de la cadena H y de la cadena L están ligadas a un enlazante que codifica al menos aproximadamente 4 aminoácidos (típicamente aminoácidos neutros pequeños). La proteína codificada por esta fusión permite el ensamblaje de una región funcional variable que mantiene la especificidad y afinidad del Ab original. un método para producir los Ab de la presente invención es enlazar dos o más péptidos o polipéptidos juntos mediante técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos pueden ser sintetizados químicamente usando equipo de laboratorio disponible actualmente usando cualquier qu ímica con Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) o fBoc (ferf-butiloxicarbonilo). (Applied Biosystems, Inc. , Foster City, CA). Un conocedor de la materia puede darse cuenta fácilmente de que un péptido o polipéptido correspondiente a una cadena de Ab o a un fragmento de unión con el antígeno de ella, puede ser sintetizado mediante reacciones químicas estándar. Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido o polipéptido, pero no escindirse de su resina de síntesis, mientras que el otro fragmento de un Ab puede ser sintetizado y subsiguientemente escindido de la resina , exponiendo así un grupo terminal que está bloqueado funcionalmente en el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptido, estos dos fragmentos pueden ser unidos covalentemente por medio de una unión peptídica en sus términos C y N, respectivamente, para formar un Ab, o un fragmento de él. (Grunt, GA, Synthetic Peptides A User Guide, W. H . Freeman and Co. , N . Y. (1992); Bodansky, M ef al. , eds, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag Inc. , N .Y. (1993)).

Se puede seleccionar anticuerpos que tengan propiedades particulares deseadas. En el caso de un Ab que se va a usar in vivo, los procedimientos de detección del Ab pueden incluir cualquiera de los bioanálisis in vitro o in vivo que miden la unión a , por ejemplo, uPA/uPAR o complejo uPAR-integrina , con células que expresan el polipéptido o el epítopo de péptido relevante. Más aún , los Ab pueden ser detectados en diversos modelos tumorales tales como un modelo xenogénico de ratón en el cual suna l ínea celular de tumor humano que expresa el antígeno se cultiva por ejemplo en ratones desnudos inmunocomprometidos. Anticuerpo marcado diagnósticamente El término "marcado diagnósticamente" significa que el Ab presente tiene una etiqueta detectable mediante diagnóstico acoplada a él. Hay muchas etiquetas y métodos diferentes para el mareaje, que son familiares para los conocedores de la materia , descritos más adelante. Las clases de etiquetas generales que se pueden usar en la presente invención incluyen isótopos radiactivos, isótopos paramagnéticos, y compuestos que pueden ser vistos en formación de imágenes mediante tomografía con emisión de positrones (PET), compuestos fluorescentes o coloreados, etc. Las etiquetas detectables apropiadas incluyen etiquetas radiactivas, fluorescentes, fluorógenas, cromógenas u otras etiquetas qu ímicas. Las radio etiquetas útiles (radionúclidos), que se detectan simplemente mediante contador gamma, contador de destello o auto radiografía , incluyen 3H , 125l , 31 l , 35S y 14C. El 131 l también es un isótopo terapéutico útil (véase más adelante). Una cantidad de patentes estadounidenses, incorporadas aqu í mediante referencia, describen métodos y composiciones para formar complejos metálicos con moléculas más grandes, incluyendo la descripción de agente quelantes útiles. Los metales preferiblemente son átomos de metal detectables, incluyendo radionúclidos, y forman complejos con proteínas y otras moléculas. Estos documentos incluyen las patentes estadounidenses números 5,627,286; 5,618,513; 5,567,408; 5,443,816; y 5,561 ,220. Las etiquetas fluorescentes comunes incluyen fluoresceína, rodamina , dansilo, ficoeritrina , ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeh ído y fluorescamina. El fluoróforo, tal como el grupo dansilo, tiene que ser excitado por luz de una longitud de onda particular para fluorescer. Véase por ejemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sexta Ed. , Molecular Probes, Eugene, OR. , 1996). La fluoresceína , los derivados de fluoresceína y las moléculas similares a fluoresceína tales como Oregon Green ™ y sus derivados, Rhodamme Green ™ y Rhodol Green ™ , se acoplan con grupos amina usando los grupos isotiocianato, éster succinimid ílico o reactivos a diclorotriazinilo. De manera similar, los fluoróforos también pueden ser acoplados con tioles usando grupos maleimida, yodoacetamida y reactivos a aziridina. Las rodaminas con longitudes de onda largas, que básicamente son los derivados de Rhodamme Green ™ con sustituyentes en los nitrógenos, están entre los reactivos marcadores fluorescentes más fotoestables conocidos. Sus espectros no son afectados por cambios en pH entre 4 y 10, una ventaja importante sobre las fluoresceínas para muchas aplicaciones biológicas. Otros fluoróforos preferidos para derivar el péptido de acuerdo con esta invención son aquellos que se excitan mediante luz ultravioleta. Los ejemplos incluyen azul cascada , derivados de cumarina, naftalenos (de los cuales el cloruro de dansilo es miembro), pirenos y derivados de piridiloxazol. También están incluidos como etiquetas dos materiales inorgánicos relacionados que recientemente han sido descritos: nanocristales semiconductores, que comprenden, por ejemplo, sulfato de cadmio. (Bruchez, M ef al , Science 281 :2013-2016 ( 1998), y puntos de cuantos, por ejemplo, selénido Cd taponado con sulfuro de zinc (Chan , WC ef al , Science 281 :2016- 2018 ( 1998)). En todavía otro enfoque, el grupo amino del Ab se hace reaccionar con reactivos que forman productos fluorescentes, por ejemplo fluorescamina, dialdehídos tales como derivados de o-ftaldialdeh ído, naftaleno-2,3-dicarboxilato y antraceno-2,3-dicarboxilato, 7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol (NBD), tanto cloruro como fluoruro, son útiles para modificar aminas para producir productos fluorescentes. El Ab de la invención también puede ser marcado para la detección usando metales emisores de fluorescencia tales como 152Eu, u otros de la serie lantánidos. Estos metales pueden ser acoplados al péptido usando grupos quelantes metálicos tales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA, véase ejemplo X, infra) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). El DTPA, por ejemplo, está disponible como el anh ídrido, el cual puede modificar fácilmente los péptidos que contienen NH2 de esta invención. Para el diagnóstico o terapia in vivo, los radionúclidos pueden ser unidos al Ab ya sea directamente o indirectamente usando un agente quelante tal como DTPA y DOTA. Los ejemplos de estos radionúclidos son 99Tc, 23l , 125l , 131 l , 1 1 1 ln , 97Ru , 67Cu , 67Ga , 68Ga , 72As, 89Zr, 90Y y 201TI. Generalmente, la cantidad de Ab marcado necesaria para la detectabilidad en uso diagnóstico variará dependiendo de consideraciones tales como edad, condición , sexo y extensión de la enfermedad en el paciente, contraindicaciones, si las hay, y otras variables, y va a ser ajustada por el médico o diagnosticador del individuo. La dosis puede variar desde 0.001 mg/kg hasta 100 mg/kg . El Ab también puede hacerse detectable acoplándolo a un compuesto fosforescente o quimioluminiscente. La presencia del péptido marcado de manera quimioluminiscente se determina entonces detectando la presencia de luminiscencia que aparece durante el curso de una reacción qu ímica. Los ejemplos de quimioiluminadores particularmente útiles son luminol, ¡soluminol , éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. De manera similar, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar los péptidos. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica aumente la eficiencia de la reacción quimiloluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia . Los compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcado son luciferina , luciferasa y aequorina . En todavía otra modalidad, se usa detección colorimétrica, basada en compuestos cromógenos que tienen, o que dan como resultado, cromóforos con altos coeficientes de extinción . La detección in situ del péptido marcado puede lograrse sacando una muestra histológica de un sujeto y examinándola mediante microscopio bajo condiciones apropiadas para detectar la etiqueta. Los conocedores de la materia percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) se puede modificar con el fin de lograr esta detección in situ. Para la formación de imágenes radiactivas in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor principal para seleccionar un radionúclido. El radionúclido elegido tiene que tener un tipo de decaimiento que sea detectable por un instrumento particular. En general, cualquier método convencional para visualizar la formación de imágenes diagnóstica puede utilizarse, de acuerdo con esta invención. Otro factor para seleccionar un radionúclido para diagnóstico in vivo es que la vida media sea suficientemente larga , de manera que la etiqueta sea detectable aún en el momento de máxima absorción por el tejido objetivo, pero suficientemente corta como para que la irradiación perjudicial al anfitrión sea reducida al mínimo. En una modalidad preferida, un radionúclido usado para formación de imágenes in vivo no emite partículas, sino que produce una gran cantidad de fotones en un rango de 140-200 keV, el cual puede ser detectado fácilmente mediante cámaras gamma convencionales. La formación de imágenes in vivo puede usarse para detectar metástasis ocultas que no son observables por otros métodos. La formación de imágenes, por ejemplo, se puede usar para clasificar tumores de manera no invasiva. Uso de anticuerpos para detectar complejos uPA o uPAR mediante inmunoanálisis Los anticuerpos de esta invención son útiles en inmunoanálisis para detectar moléculas que contienen estos epítopos en muestras de tejidos o en un fluido corporal, tal como suero o plasma. Estos Ab podrían detectar el antígeno o un fragmento portador de epítopo de él. De esta forma, si hay proteólisis en el entorno tumoral ocurre la liberación de los fragmentos o en el tejido. Cualquier inmunoanálisis convencional conocido en la materia puede emplearse para este propósito, a pesar de que se prefieren los inmunoanálisis con enzimas, tales como ELISA. Los métodos para inmunoanálisis se describen también en las referencias citadas anteriormente. Los inmunoensayos competitivos típicamente se usan para detectar moléculas en una muestra de prueba que son ligandos para el complejo que pueden imitar los mAb en su especificidad de unión , afinidad, capacidad, etc. En una modalidad de análisis de unión competitiva, se mide la cantidad de Ab unido al complejo (directa o indirectamente usando un anti-lg marcado). La competencia (es decir, menos unión de Ab al complejo) en la presencia de la muestra de prueba , es evidencia de que uno o más componentes de la muestra se unen al complejo. Se espera que la mayoría de los complejos sometidos a prueba se unan con afinidades moderadas (aproximadamente de 1 a 10 µM). En otra modalidad, un soporte sólido, por ejemplo una microplaca , se recubre con el mAb de interés. Se añade la muestra de prueba y se incuba, por ejemplo, durante aproximadamente 30 minutos para permitir la unión de moléculas relevantes al Ab. Se lavan las placas y el complejo, el forma marcada detectablemente (por ejemplo, biotinilado), se añade como ligando competitivo, y se deja competir con la muestra de prueba por la unión al Ab. Un resultado "positivo" para la muestra de prueba será expresado como menos unión del complejo marcado unido a la fase sólida. ESte enfoque, en el cual la solución de complejo y la solución de muestra no se añaden simultáneamente, evita que se confundan los efectos de la unión de la muestra de prueba directamente al complejo, debido a que cualquier muestra de prueba presente tiene que ser capturada primero por el mAb inmovilizado. Preferiblemente, para asegurar que la unión es específica, se corre una serie de diluciones para obtener una curva de dilución. Esto se mostrará si por ejemplo, hay una proporción de unión/señal de 50% menos con la mitad de la muestra, en la ausencia de estos efectos de dilución , puede concluirse que múltiples entidades de unión están entrando en el análisis. Los resultados son más rigurosos si las moléculas que se unen en el sitio de unión del mAb tienen afinidades similares. Análisis inmunohistoguímico Un análisis preferido para detectar los antígenos en un tejido es inmunohistoquímica, usando cualquier método convencional de análisis, los cuales son abundantes en la materia . Un análisis preferido es el que se describe en los ejemplos más adelante. Para una descripción de estos métodos, véase por ejemplo, Dabbs, DJ , Diagnostic Immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 2001 , el cual está incorporado mediante referencia en su totalidad . Inmunoanálisis no histológicos Los inmunoanálisis preferidos son inmunoensayos con enzimas (EIA), tales como ELISA, los cuales emplean antígenos o Ab inmovilizados con soportes sólidos. Para las presentes composiciones y métodos, el soporte sólido preferiblemente es cualquiera de poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrán , nylon , poliacrilamida, difluoruro de polivinilideno, celulosa natural , celulosa modificada, nitrocelulosa, agarosa y perlas magnéticas, en una modalidad preferida, la superficie de poliestireno u otras placas con múltiples receptáculos de plástico, sirve como soporte sólido. en otra modalidad , se usa un soporte sólido al cual se fija el Ab o antígeno en el fondo o se coloca sin fijar en los receptáculos de placas con receptáculos múltiples. Se puede usar también placas con receptáculos múltiples en los cuales los fondos de los receptáculos que contienen nitrocelulosa o un material de membrana similar y a través de las cuales se puede mover el líquido bajo presión o vacío. Los inmunoensayos típicos, y preferidos, incluyen análisis "hacia adelante" en los cuales el Ab inmovilizados en un soporte sólido se pone en contacto primero con la muestra que va a ser sometida a prueba para unirse o "extraer" el antígeno de la muestra mediante formación de un complejo binario inmovilizado Ab-antígeno. Después de incubación apropiada, el soporte sólido se lava para eliminar el residuo de la muestra de fluido incluyendo antígeno no unido, si lo hay, y luego se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de Ab marcado (el cual funciona como una "molécula informadora"). Después de una segunda incubación, que permite que el Ab marcado forme complejo con el antígeno inmovilizado mediante el Ab no marcado, el soporte sólido se lava una segunda vez para eliminar el Ab marcado que no reaccionó y se mide la etiqueta inmovilizada. Este tipo de análisis sandwich hacia adelante puede ser un análisis simple "si/no" para determinar si el antígeno está presente, o puede hacerse cuantitativo comparando la cantidad de Ab marcado inmovilizado con la cantidad inmovilizada cuando se usa una muestra estándar q ue contiene una cantidad conocida de antígeno. También se puede usar análisis sandwich denominados "simultáneo" e "inverso" . Un análisis simultáneo implica un solo paso de incubación , dado que el Ab in movilizado y el Ab marcado se añaden simu ltáneamente a la muestra . Después de la incubación apropiada , el soporte sólido se lava para eliminar el residuo de la muestra y el Ab marcado que no formó complejo. La presencia o cantidad de Ab marcado asociado con el soporte sólido se determina entonces como en el análisis sandwich convencional "hacia adelante" . En un ensayo "inverso", se añade u na solución de Ab marcado a la muestra después de u n periodo de incu bación apropiado seguido por adición de Ab inmovilizado no marcado. Después de u na segunda incubación , se lava el material de fase sólida en forma convencional para liberarlo del residuo de la muestra y el Ab marcado que no reaccionó. La determinación del Ab in movilizado asociado con el soporte sólido, se determina entonces como en los análisis "simultáneo" y "hacia adelante". Anál isis de u n ión del anticuerpo a u PAR en cél u las com pletas El Ab y/o el conjugado de él que apu nta a u PAR se somete a prueba fácilmente para determinar la unión a uPAR, preferiblemente midiendo la inhibición de la unión de [1 25l]DFP-u PA a u PAR en un análisis competitivo de unión al liga ndo, o marcando directamente el Ab con [1 25l] . El análisis puede emplear célu las completas que expresen uPAR, por ejemplo l íneas celulares tales 7mo A2780 o HeLa. Un análisis preferido se realiza como sigue. Se coloca las células en placas (aproximadamente 5 x 104/receptáculo) en medio (por ejemplo, M EM con sales de Earle /10% FBS + antibióticos) en placas de 24 receptáculos, luego se incuban en una atmósfera húmeda con 5% de C02 hasta que las células alcanzan un 70% de confluencia. Se radioyoda uPA con alto peso molecular inactivado catal íticamente (DFP-uPA) usando lodo-gen® (Pierce) para una actividad específica de aproximadamente 250,000 cpm/µg . Las placas que contienen las células se enfrían en hielo y las células se lavan dos veces (5 minutos cada una) con PBS/ 0.05% Tween-80 frío. Los Ab y/o conjugados de ellos sometidos a prueba se diluyen en serie en PBS/ 0.1 % BSA/ 0.01 % Tween-80 frío, y se añaden a cada receptáculo hasta obtener un volumen final de 0.3 mL 10 minutos antes de la adición de [125l]DFP-uPA con una concentración final de 0.2 nM . Luego se incuban las placas a 4°C durante 2 horas, después de este tiempo se lavan las células 3 veces (5 minutos cada una) con PBS/ 0.05% Tween-80 frío. Se añade NaOH (1 N ) a cada receptáculo en 0.5 mL para Usar las células, y se incuba la placa durante 5 minutos a temperatura ambiente o hasta que todas las células en cada receptáculo estén Usadas, según se determina mediante examen microscópico. Luego se aspira el contenido de cada receptáculo y entonces se determinan los conteos totales en cada receptáculo usando un contador gamma. Cada compuesto se somete a prueba por triplicado y los resultados se expresan como un porcentaje de la radiactividad total medida en receptáculos que contienen [125l]DFP-uPA solo, lo cual se toma como representación del máximo de unión (100 %). La inhibición de la unión de [125l]DFP-uPA a uPAR está relacionada usualmente con la dosis, de tal forma que la concentración del compuesto de prueba necesaria para producir una inhibición de la unión de 50% (el valor IC50), el cual se espera que caiga en la parte lineal de la curva, se determina fácilmente. En general, los Ab y/o sus conjugados tienen valores IC50 de menos de aproximadamente 10"5 M. Preferiblemente, los Ab y/o sus conjugados tienen valores IC50 de menos de aproximadamente 10~6 M, más preferiblemente, menos de aproximadamente 10'7 M. Análisis de actividad biológica de anticuerpos anti-uPAR u otros liqandos Los conocedores de la materia se darán cuenta de que los análisis in vitro e in vivo útiles para medir la actividad de los Ab o de otros ligandos de unión a uPAR de la invención, o de conjugados de ellos, tal como se describen aquí, pretenden ser ilustrativos, y no comprehensivos ni limitantes. Análisis de migración de EC Para los estudios de migración de EC, se cubren los transreceptáculos con colágeno de tipo I (50 /vg/mL) añadiendo 200 µL de la solución de colágeno por transreceptáculo, luego incubando durante la noche a 37°C. Los transreceptáculos se ensamblan en placas de 24 receptáculos y se les añade un quimioatrayente (por ejemplo, FGF-2) a la cámara inferior en un volumen total de medio de 0.8 mL. Las EC, tales como las células endoteliales de vena umbilical humana (H UVEC), que han sido desprendidas de cultivo monocapa usando tripsina, se diluyen hasta una concentración final de aproximadamente 106 células/mL con medio libre de suero y se añade 0.2 mL de esta suspensión de células a la cámara superior de cada transreceptáculo. Los inhibidores sometidos a prueba pueden añadirse a ambas cámaras superior e inferior, y se deja proseguir la migración durante 5 horas en una atmósfera humidificada a 37°C. Se sacan los transreceptáculos de la placa teñida usando DiffQuik®. las células que no migraron se sacan de la cámara superior raspándola con un hisopo de algodón y se desprenden las membranas, se montan en portaobjetos, y se cuentan bajo un campo de alto poder (400x) para determinar la cantidad de células migradas. Análisis biológico de la actividad anti-invasiva . La capacidad de las células tales como EC o células tumorales (por ejemplo, células de carcinoma protático humanas PC-3) para invadir a través de una membrana de base reconstituida (Matrigel®) en un ensayo conocido como sistema de análisis de invasión con Matrigel® es bien conocido (Kleinman ef al, Biochemistry 1986, 25: 312-318; Parish ef al, 1992, Int. J. Cáncer 52:378-383). El Matrigel® es una membrana de base reconstituida que contiene colágeno de tipo IV, laminina , proteoglicanos de sulfato de heparán tales como perlecan (el cual se une a bFGF y lo localiza), vitronectina , así como también factor ß de crecimiento transformador (TGF ?), activador del plasminógeno uroquinasa (uPA), activador del plasminógeno de tejido (tPA) y la serpina conocida como inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 1 (PAI-1 ) (Chambers ef al, Canc. Res. 1995, 55: 1 578-1585). Está aceptado en la materia que los resultados obtenidos en este tipo de análisis para los Ab y/o conjugados de ellos u otros ligandos que apuntan a los receptores extracelulares o enzimas, son predictivos de la eficacia de estos Ab y/o conjugados de ellos in vivo (Rabbani ef al. , Int. J. Cáncer 1995, 63: 840-845). Estos ensayos emplean insertos de cultivo tisular transreceptáculos. Las células invasivas se definen como células que atraviesan a través del Matrigel® y la cara superior de una membrana de policarbonato, y se adhieren al fondo de la membrana. Los transreceptáculos (por ejemplo, de Costar), contienen membranas de policarbonato (tamaño de poro de 8.0 µm) están recubiertos con Matrigel® (por ejemplo, de Collaborative Research), el cual ha sido diluido en PBS estéril hasta una concentración final de aproximadamente 75 µg/mL (por ejemplo, 60 µL de Matrigel® diluido por inserto), y colocadas en los receptáculos de una placa de 24 receptáculos. Las membranas se secan durante la noche en una cabina de seguridad biológica, luego se rehidratan añadiéndoles 100 µL de medio, por ejemplo, DM EM , complementado con antibióticos durante 1 hora en una mesa agitadora. El DM EM se elimina de cada inserto mediante aspiración , y se le añade 0.8 mL de DM EM completo (+/10 % FBS y antibióticos) a cada receptáculo de la placa de 24 receptáculos, de tal forma que éste rodee el lado exterior del transreceptáculo ("cámara inferior"). Se añade encima DMEM fresco con antibióticos (100 µL), Glu-plasminógeno humano (5 µg/mL), y cualesquiera inhibidores que vayan a ser sometidos a prueba , dentro del transreceptáculo ("cámara superior"). Las células que van a ser sometidas a prueba son tripsinizadas y resuspendidas en DM EM + antibióticos y se añaden a la cámara superior del transreceptáculo en una concentración final de aproximadamente 8x105 células/mL. Se ajusta el volumen final de la cámara superior a 200 µL. Luego se incuba la placa montada en una atmósfera con C02 húmeda 5% durante aproximadamente 72 horas. Después de la incubación , las células se fijan y se tiñen usando DiffQuik® (Giemsa Stain) y se raspa la cámara superior usando un hisopo de algodón para quitar el Matrigel® y cualesquiera células que no invadieron a través de la membrana. Se desprenden las membranas del transreceptáculo usando una cuchilla X-acto®, se montan sobre portaobjetos usando Permount® y se les coloca cubreobjetos, luego se cuentan bajo un microscopio usando alto poder (por ejemplo, 400x). Se calcula la cantidad media de células invasoras a partir de 5 a 10 campos contados, y se gráfica como una función de la concentración del inhibidor. Análisis de formación de tubo de la actividad antí angiogénica Las EC, por ejemplo células endoteliales de vena umbilical humana (H UVEC) o células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) que se pueden preparar u obtener comercialmente, se mezclan en una concentración de 2 x 105 células/mL con fibrinógeno (5 mg/mL en salina fosfatada regulada (PBS) en una proporción 1:1 (v/v). Se le añade trombina (concentración final de 5 unidades/mL) y se transfiere la mezcla inmediatamente a una placa de 24 receptáculos (0.5 mL por receptáculo). Se deja formar el gel de fibrina y luego se añade VEGF y bFGF a los receptáculos (cada uno con una concentración final de 5 ng/mL) junto con el compuesto de prueba. Se incuban las células a 37°C en 5% C02 durante 4 días, al final de los cuales se cuentan las células en cada receptáculo y se clasifican como redondas, alargadas sin ramificaciones, alargadas con una ramificación, o alargadas con 2 o más ramificaciones. Los resultados se expresan como el promedio de 5 receptáculos diferentes para cada concentración de compuesto. Típicamente, en la presencia de inhibidores angiogénicos, las células permanecen redondas, o forman tubos no diferenciados (por ejemplo, de 0 a 1 ramificación). Este análisis es reconocido en la materia como predictivo de la eficacia angiogénica in vivo (Min ef al., Cáncer Res. 1996, 56: 2428-2433) En un análisis alternativo, se observa formación de tubos de EC cuando se cultivan las EC en Matrigel® (Schnaper HW ef al., J Cell Physiol 1995, 165:107-118). 104 EC/receptáculo se transfieren a placas de 24 receptáculos cubiertas con Matrigel® y se cuantifica la formación de tubos después de 48 horas. Los inhibidores se someten a prueba añadiéndolos ya sea en el momento de añadir las EC o en diversos momentos después de ello. La formación de tubos también puede ser estimulada añadiendo (a) un factor de crecimiento angiogénico tal como bFGF o VEGF, (b) un agente estimulante de diferenciación (por ejemplo, PMA) o (c) una combinación de estos. Si bien no se desea estar atado por la teoría, se esperaría encontrar primero estos modelos para análisis de angiogénesis presentando a las EC un tipo particular de membrana de base, esto es, la capa de matriz que migran y diferencia las EC. Además de unirse a factores de crecimiento, los componentes de la matriz que se encuentran en el Matrigel® (y en las membranas de base in situ), o sus productos proteolíticos, también pueden ser estimuladores de la formación de tubos de EC, lo cual hace a este modelo complementario para el modelo de angiogénesis con gel de fibrina descrito previamente. (Blood, CH et al. , Biochim Biophys Acta 1990, 7032:89-1 18; Odedra, R ef al, Pharmac. Ther 1991 , 49: 1 1 1 -124). Análisis para la inhibición de proliferación celular La capacidad de los Ab y/o conjugados de esta invención para inhibir la proliferación de EC puede determinarse en un formato con 96 receptáculos. Se usa colágeno de tipo I (gelatina) para cubrir los receptáculos de la placa (0.1 -1 mg/mL en PBS, 0.1 mL por receptáculo durante 30 minutos a temperatura ambiente). Después de lavar la placa (3x usando PBS), se coloca en placas 3-6 x 103 células por receptáculo, y se dejan acoplar durante 4 horas (37 °C / 5% C02) en Medio de Crecimiento Endotelial (EGM ; Clonetics) o en medio M 199 complementado con 0.1 -2% FBS. Se elimina el medio y cualesquiera células no acopladas al término de las 4 horas, y se le añade medio fresco suplementado con bFGF (1 -10 ng/mL) o VEGF (1 -10 ng/mL) a cada receptáculo. Se añaden por último los anticuerpos y/o conjugados que van a someterse a prueba, y se deja incubar la placa (37°C/5% CO2) durante 24-48 h . Se le añade el compuesto cromogénico MTS (Promega) a cada receptáculo, y se deja incubar de 1 a 4 horas. El desarrollo de color en cada receptáculo es directamente proporcional a la cantidad de células, sirviendo así como un sucedáneo para el conteo de células. Se usa la lectura de la absorbancia en 490 nm para determinar las diferencias en las cantidades de células, es decir, proliferación , entre los receptáculos de control y los que contienen los Ab y/o conjugados sometidos a prueba. También se puede usar un análisis similar que emplea células tumorales adherentes cultivadas. Sin embargo, se puede omitir el colágeno en este formato. Se colocan células tumorales (por ejemplo, 3-10 x 103/receptáculo) y se dejan adherir durante la noche. Luego se añade medio libre de suero, y las células son forzadas a sincronizarse durante 24 horas. Luego se añade medio + 10% FBS a cada receptáculo para estimular la proliferación . Los anticuerpos y/o conjugados que van a ser sometidos a prueba se incluyen en algunos de los receptáculos. Después de 24 horas, se añade MTS a la placa, y se desarrolla el análisis y se lee tal como se explicó anteriormente.

Análisis de citotoxicidad Los efectos anti proliferativos y citotóxicos de los Ab y/o conjugados de ellos pueden ser determinados para diversos tipos de células, incluyendo células tumorales, EC, fibroblastos y macrófagos. Esto es especialmente útil cuando se somete a prueba un Ab que ha sido conjugado con una porción terapéutica tal como un radioterapéutico o una toxina. Por ejemplo, se podría esperar que un conjugado de uno de los Ab de la invención con reactivo de Bolton-Hunter que ha sido yodado con 31 l inhiba la proliferación de células que expresan uPAR (muy probablemente induciendo la apoptosis). Se podría esperar efectos anti proliferativos contra células tumorales, y células endoteliales estimuladas, pero bajo algunas circunstancias no en células endoteliales o fibroblastos dérmicos humanos normales inactivas. Cualquier efecto anti proliferativo o citotóxico observado en las células normales puede representar toxicidad no específica del conjugado. Un análisis típico podría involucrar colocar en placas células con una densidad de 5-10,000 células por receptáculo en una placa de 96 receptáculos. El compuesto que va a ser sometido a prueba se añade en una concentración de 10 veces la IC50 medida en un ensayo de unión (esto variará dependiendo del conjugado) y se deja incubar con las células durante 30 minutos. Se lavan las células 3 veces con medio, luego se les añade medio fresco que contiene [3H]timidina (1 µCi/mL) y se dejan incubar a37°C en 5% CO2 durante 24 y 48 horas. Se Usan las células en los diversos puntos de tiempo usando NaOH 1 M y se determinan los conteos por receptáculo usando un contador ß. Se puede medir la proliferación de manera no radiactiva usando reactivo MTS o CyQuant® para medir la cantidad de células total. Para los análisis de citotoxicidad (medición de lisis celular), se usa un equipo para citotoxicidad Promega de 96 receptáculos. Si hay evidencia de actividad anti proliferativa , se puede medir la inducción de apoptosis usando TumorTACS (Genzyme). Análisis de actividad de Caspasa-3 Se puede determinar la capacidad de los Ab y/o de sus conjugados para promover la apoptosis de EC, midiendo la activación de caspasa-3. Se usa colágeno de tipo I (gelatina) para cubrir una placa P100 y se inoculan 5x105 EC en EGM + 10% FBS Después de 24 horas (a 37°C/5% CO2) se reemplaza el medio por EGM + 2% FBS, 10 ng/mL bFG F y el compuesto de prueba deseado. Se recolectan las células después de 6 horas, se preparan Usados en 1 % Tritón X-100 detergente, y se analizan los Usados usando el equipo para análisis EnzChek®Caspase-3 #1 (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Modelo de angiogénesis corneana El procedimiento usado es esencialmente idéntico al descrito por Volpert, OV et al, J. Clin Invest. 1996, 98:671 -679. De manera resumida, se anestesia a ratas Fischer hembras (120-140 g) y se les implantan bolitas (5 µL) comprimidas de Hydron®, bFGF (1 50 nM ), y los Ab y/o conjugados de ellos que van a ser sometidos a prueba en incisiones diminutas practicadas en la córnea a 1.0-1.5 mm del limbo. Se evalúa la neovascularización 5 y 7 días después de la implantación. El día 7, se anestesia a los animales y se les infunde un tinte tal como carbón coloidal para teñir los vasos. Luego se sacrifican los animales, se fijan las córneas con formalina y se aplanan las córneas y se fotografían para evaluar el grado de neovascularización. Se puede cuantificar los vasos nuevos formando imágenes del área de vasos total o de la longitud, o simplemente contando los vasos. Análisis de angiogénesis de membrana corioalantoica de pollo Este análisis se realiza esencialmente tal como lo describe Nguyen ef al., Microvascular Res. 1994, 47:31-40. Un tamiz que contiene factores angiogénicos (bFGF) o células tumorales mas un compuesto de prueba, aquí los Ab anti-uPAR o conjugados, se coloca sobre la CAM de un embrión de pollo de 8 días de edad y se observa la CAM durante 3 a 9 días después de la implantación de la muestra. Se cuantifica la angiogénesis determinando el porcentaje de cuadrados en el tamiz que contienen vasos sanguíneos visibles. Análisis con inserto de Matrigel® Este análisis se realiza esencialmente como lo describe Passaniti, A ef al., 1992, Lab Invest. 67:519-528. Se mezcla Matrigel® {por ejemplo, 500 µL) (Collaborative Biomedical Products, Inc., Bedford, MA) enfriado en hielo con heparina {por ejemplo, 50 µg/mL), FGF-2 {por ejemplo, 400 ng/mL) y el compuesto que va a ser sometido a prueba. En algunos análisis se puede sustituir el bFGF con células tumorales como estímulo angiogénico. La mezcla de Matrigel® se inyecta subcutáneamente (s.c.) en ratones desnudos atímicos de 4 a 8 semanas de edad en sitios cercanos a la l ínea media abdominal, preferiblemente 3 inyecciones por ratón . El Matrigel® inyectado forma un gel sólido palpable. Los sitios de inyección se escogen de tal forma que cada animal recibe un inserto de control positivo (tal como FGF2 + heparina), un inserto de control negativo, (por ejemplo, regulador + heparina) y un inserto que incluye el compuesto que está siendo sometido a prueba para determinar su efecto sobre la angiogénesis, por ejemplo (FG F-2 + heparina + compuesto). Todos los grupos de tratamiento preferiblemente se corren por triplicado. Los animales se sacrifican por dislocación cervical aproximadamente a los 7 d ías después de la inyección o en otro momento que sea óptimo para observar la angiogénesis. Se desprende la piel del ratón a lo largo de la línea media abdominal, y se recuperan los insertos de Matrigel® y se exploran con microscopio inmediatamente con alta resolución. Luego se dispersan los insertos en agua y se incuban a 37 °C curarte la noche. Se determinan los niveles de hemoglobina (Hb) en los insertos usando solución de Drabkin (por ejemplo, de Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de Hb en el inserto es una medida indirecta de la angiogénesis, dado que refleja la cantidad de sangre en la muestra. Además, o alternativamente, se puede inyectar a los animales antes de sacrificarlos con un 0.1 mL de regulador (preferiblemente PBS) que contiene un dextrán al cual se le conjuga un fluoróforo. La cantidad de fluorescencia en el inserto disperso, determinada fluorimétricamente, también sirve como una medida de angiogénesis en el inserto. También se puede usar tinción con mAb anti-CD31 (CD31 es "molécula de adhesión de plaqueta-célula endotelial" , "PECAM") para confirmar la formación de neovasos y la densidad de microvasos en los insertos. Evaluación in vivo de la inhibición de angiogénesis y de los efectos anti-tumorales usando el análisis con inserto de Matrigel® con células tumorales En este análisis, se mezclan células tumorales, por ejemplo 1 -5 x 106 células del carcinoma de pulmón Lewis 3LL o de la línea celular de próstata de rata MatLyLu , con Matrigel® y luego se inyecta en el flanco de un ratón siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Una masa de células tumorales y una respuesta angiogénica poderosa puede observarse en los insertos después de aproximadamente 5 a 7 d ías. La acción anti tumoral y anti angiogénica de un compuesto en un entorno tumoral real puede ser evaluada incluyéndolo en el inserto. Luego se realiza la medición del peso tumoral , niveles de Hb o niveles de fluorescencia 8de un conjugado de dextrán-fluoróforo inyectado antes del sacrificio), para medir la Hb o la fluorescencia, primero se homogenizan los insertos con un homogenizador de tejido. Modelos de Xenoinjerto de crecimiento tumoral subcutáneo Carcinoma ovárico h umano Se estableció una línea de cáncer ovárico humano A2780 de tejido tumoral de un paciente no tratado. Las células A2780 se mantienen como una monocapa en medio RPM I 1640 complementado con 2 mM de glutamina , 0.01 mg/mL de insulina bovina y 10% de FBS. (Hamilton , TC ef al, Sent. Oncol. 1984; 77:285- 293; Behrens, BC ef al, Cáncer Res. 1987; 47:414-41 8). Se inocula dos millones de células A2780 en el flanco derecho de ratones Balb/c hembras. El tumor A2780 se deja desarrollar hasta 50 a 200 mm3 antes del tratamiento. El Ab de control de IgG así como también los mAb del uPAR anti-D2D3 se administran por vía intraperitoneal en 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes. El grupo de tratamiento con cisplatina se dejó desarrollar hasta 1000 mm3; los animales recibieron 6 mg/kg una vez por semana. En el momento del sacrificio, se obtiene plasma y se extrae el tumor de cada animal . La mitad del tumor se congela rápidamente para su evaluación bioquímica, y el resto se coloca en fijador de zinc para evaluación histológica. Carcinoma de pulmón h umano La A549, línea celular de carcinoma de pulmón humano, (No. de catálogo ATCC CCL-185) fue establecida a través de cultivo de explantación de tejido carcinomatoso de pulmón de un paciente masculino caucásico de 58 años de edad (Giard, DJ ef al , J. Nati Cáncer Inst. 57: 1417-23 (1973)). Se mantienen células A549 en medio F12K de Ham complementado con 2 mM de L-glutamina, 0.15% de NaHCO3, y 10 % de FBS.

Aproximadamente 106 células de carcinoma A549 se inoculan en el flanco derecho de ratones hembras C.B-17/Sys (scid/scid) con inmunodeficiencia grave combinada (SCI D). El tratamiento se inicia preferiblemente el d ía después de la inoculación del tumor. El Ab de control de IgG (y el control de PBS), así como también el mAb de uPAR anti-D2D3 ATN-658 se administra intraperitonealmente, 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes. Inicialmente, se miden los volúmenes tumorales una vez por semana . Cuando el volumen en cualquier grupo de tratamiento excede los 300 mm3, se obtienen las mediciones dos veces por semana . En el momento del sacrificio, se obtiene el plasma y se extrae el tumor de cada animal . La mitad del tumor se congela rápidamente para su evaluación bioqu ímica y el resto se coloca en fijador de zinc para su evaluación histológica. Modelo de metástasis con xenoi njerto .Se somete a prueba los Ab y/o sus conjugados para determinar la inhibición de la metástasis tardía usando un modelo de metástasis experimental tal como el de Crowley et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90 5021 -5025). La metástasis tard ía involucra los pasos en donde las células tumorales se acoplan y extravasan , invaden localmente, se inoculan, proliferan e inducen angiogénesis. Se inocula a ratones desnudos con células de carcinoma prostático humano (PC-3) transfectadas con un gen informador, preferiblemente el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) pero como una alternativa con un gen que codifica las enzimas cloranfenicol acetil-transferasa (CAT), luciferasa o LacZ. Este enfoque permite el uso de cualquiera de estos marcadores (detección de fluorescencia o GFP o detección colorimétrica histoquímica de las diversas enzimas) para seguir el comportamiento de estas células. Las células se inyectan, preferiblemente por vía i.v.,y se identifica la metástasis después de aproximadamente 14 días, particularmente en los pulmones, pero también en los nodos linfáticos regionales, fémures y cerebro. Esto imita el tropismo en el organismo de la metástasis de origen natural en el cáncer de próstata humano. Por ejemplo, se inyectan células PC-3 que expresan GFP (106 células por ratón) por vía intravenosa a en la vena de la cola de ratones desnudos (nu/nu). Los animales se tratan con una composición de prueba a 100 µg/animal/día dada q.d. IP. Se visualizan las células y focos metastásicos y se cuantifican mediante microscopio de fluorescencia o con histoquímica microscópica de luz o triturando el tejido y realizando análisis colorimétrico de la etiqueta detectable. Composiciones farmacéuticas y terapéuticas y su administración Los compuestos que se puede emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen todos los de las moléculas de polipéptidos, preferiblemente Ab, descritos anteriormente, así como también las sales aceptables para uso farmacéutico de estos compuestos. Las sales de adición de ácido aceptables para uso farmacéutico de los compuestos de la invención, que contienen un grupo básico se forman en donde sea apropiado con ácidos orgánicos o inorgánicos fuertes o moderadamente fuertes, no tóxicos, mediante métodos conocidos en la técnica . Los ejemplos de sales de adición de ácido que están incluidas en esta invención, son sales maleato, fumarato, lactato, oxalato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, tartrato, citrato, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato y nitrato. Las sales de adición de base aceptables farmacéuticamente de los compuestos de la invención que contienen un grupo ácido, se preparan por métodos conocidos a partir de ases orgánicas e inorgánicas, e incluyen , por ejemplo, bases no tóxicas de metales alcalinos y alcalino-térreos, tales como calcio, sodio, potasio e hidróxido de amonio, y bases orgánicas no tóxicas tales como trietilamina, butilamina, piperazina , y tri(hidroximetil)metilamina . Tal como se estableció anteriormente, los compuestos de la invención poseen la capacidad de inhibir la proliferación, motilidad o invasividad y angiogénesis de EC, propiedades que son aprovechadas en el tratamiento del cáncer, en particular del cáncer metastásico. Una composición de esta invención puede ser activa per se, o puede actuar como un "profármaco" que se convierte in vivo en la forma activa. Composiciones marcadas terapéuticamente. En una modalidad preferida, los mAb descritos aquí están "conjugados terapéuticamente" o "marcados terapéuticamente" (términos que son intercambiables) y se usan para suministrar un agente terapéutico al sitio en el cual los compuestos se alojan y se unen, tales como sitios de metástasis tumoral o focos de infección/inflamación, restenosis o fibrosis. El término "conjugado terapéuticamente" significa que el mAb modificado está conjugado con otro agente terapéutico que está dirigido ya sea a la causa subyacente o a un "componente" de la invasión tumoral , angiogénesis, inflamación u otra patología. Un polipéptido marcado terapéuticamente porta una "etiqueta" terapéutica apropiada también denominada "porción terapéutica". Una porción terapéutica es un átomo, una molécula, un compuesto o cualquier componente qu ímico añadido al péptido que la hace activa para tratar una enfermedad o condición objetivo, primordialmente una que está asociada con angiogénesis no deseada . La porción terapéutica puede estar unida directa o indirectamente al mAb. El mAb marcado terapéuticamente se administra como composición farmacéutica, la cual contiene un portador o excipiente aceptable para uso farmacéutico, y preferiblemente tiene una forma apropiada para inyección . Los ejemplos de radioisótopos terapéuticos útiles (ordenados por número atómico) incluyen 47Sc, 67Cu , 90Y, 109Pd, 125l , 131 l , 186Re, 188Re, 199Au , 21 1At, 212Pb y 217Bi . Estos átomos pueden ser conjugados con el péptido directamente, indirectamente como parte de un quelato, o en el caso del yodo, indirectamente como parte de un grupo Bolton-Hunter yodado. El radio yodo puede introducirse ya sea antes o después de que este grupo está acoplado con el compuesto péptido. Las dosis preferidas de conjugados radionúclidos son una función de la radiactividad específica que va a ser originada en el sitio objetivo, las cuales varían con el tipo de tumor, la ubicación del tumor y la vascularización , la cinética y la biodistribución del portador péptido, energ ía de emisión radiactiva por el núclido, etc. Los conocedores de la materia de radioterapia pueden ajustar la dosis del péptido fácilmente en conjunto con la dosis del núclido particular para efectuar el beneficio terapéutico deseado sin experimentación indebida. Otro enfoque terapéutico incluido aquí es el uso de terapia de captura de neutrón de boro, en donde se suministra un péptido borado a un sitio objetivo deseado, tal como un tumor, más preferiblemente un tumor intracraneal (Barth , RF, Cáncer Invest 74:534-550 (1 996); Mishima, Y (ed), Cáncer Neutrón Capture Therapy, New York: Plenum Publishing Corp. , 1996, Soloway, AH ef al , (eds), J Neuro-Oncol 33 1 - 188 (1997). El isótopo 10B estable se irradia con neutrones térmicos de baja energía (<0.025 eV), y la captura nuclear resultante produce partículas a y núcleos de 7Li que tienen alta transferencia de energ ía lineal y longitudes de ruta respectivas de aproximadamente 9 y 5 µm. Este método se basa en la acumulación de 10B en el tumor con niveles más bajos en la sangre, células endoteliales y tejido normal (por ejemplo, de cerebro). Dicho suministro se ha logrado usando factor de crecimiento epidérmico (Yang . W ef al. , Cáncer Res 57:4333-4339 (1997). Otros agentes terapéuticos que pueden ser acoplados con los mAb de acuerdo con el método de la invención , son fármacos, profármacos, enzimas para activación de profármacos, agentes fotosensibilizadores, terapéuticos de ácido nucleico, vectores inversos, vectores virales, lectinas y otras toxinas. Las lectinas son proteínas, originadas comúnmente de plantas, que se unen a los carbohidratos. Entre otras actividades, algunas lectinas son tóxicas. Algunas de las sustancias más citotóxicas conocidas son toxinas de proteína de origen bacteriano y vegetal (Frankel, AE ef al, Ann Rev Med 37: 125-142 (1 986)). Estas moléculas se unen a la superficie celular e inhiben la síntesis de proteína celular. Las toxinas vegetales más comúnmente usadas son ricino y abrina; las funciones enlazantes y tóxicas están contenidas en dos subunidades de proteína separadas, las cadenas A y B. La cadena B de ricino se une a los carbohidratos de la superficie celular y promueve la absorción de la cadena A en la célula . Una vez dentro de la célula , la cadena A de ricino inhibe la síntesis de proteínas inactivando la subunidad 60S del ribosoma eucariótico. Endo, Y. et al , J Biol. Chem. 262: 5908-5912 (1987)). Otras toxinas derivadas de plantas, que son proteínas inhibidoras ribosómicas de cadena simple, incluyen proteína antiviral de Pokeweed (Strip, F. ef al. , FEBS Lett 795: 1 -8 (1986)). La toxina de difteria y la exotoxina A de Pseudomonas también son proteínas de cadena simple, y sus funciones de enlace y toxicidad residen en dominios separados de la misma proteína. La exotoxina A de Pseudomonas tiene la misma actividad catalítica que la toxina de la difteria . Se ha usado el ricino terapéuticamente uniendo su cadenaa tóxica, a moléculas objetivo tales como Ab para permitir el suministro específico en el sitio del efecto tóxico. También se ha usado toxinas bacterianas como conjugados anti tumorales. Tal como se pretende aquí, una cadena o dominio péptido tóxico, se conjuga con un compuesto de esta invención y se suministra de una forma específica para el sitio a un sitio objetivo en donde se desea la actividad tóxica, tal como un foco metastásico. La conjugación de las toxinas con la proteína , tal como Ab u otros ligandos, es conocida en la materia (Olsnes, S. ef al , Immunol Today 70:291 - 295 (1 989); Vitetta, ES ef al , Ann. Rev Immunol 3: 197-212 ( 1985)).

Los fármacos citotóxicos que interfieren con los procesos celulares críticos incluyendo ADN , ARN y síntesis de proteínas, han sido conjugados con Ab y usados subsiguientemente para terapia in vivo. Estos fármacos, incluyendo, sin limitación a ellos, daunorubicina, doxirubicina , metortrexato y mitomicina C, también son acoplados a los compuestos de esta invención y se usan terapéuticamente de esta forma. Los compuestos de la invención, así como también las sales de ellos aceptables para uso farmacéutico, pueden ser incorporados en formas de dosis convenientes, tales como cápsulas, obleas impregnadas, tabletas o preparaciones inyectables. Se puede emplear portadores sólidos o l íquidos aceptables para uso farmacéutico. Los portadores sólidos incluyen almidón , sulfato de calcio dihidratado, térra alba , sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina , acacia , estearato de magnesio y ácido esteárico. Los portadores l íquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuate, aceite de oliva , salina , agua, dextrosa, glicerol y similares. De manera semejante, el portador o diluyente puede incluir cualquier material de liberación prolongada, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera. Cuando se usa un portador líquido, la preparación puede estar en la forma de un jarabe, elíxir, emulsión , cápsula de gelatina suave, l íquido estéril inyectable (por ejemplo, una solución), tal como una ampolla , o una suspensión líquida acuosa o no acuosa . Se puede encontrar un resumen de estas composiciones farmacéuticas, por ejemplo, en Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (Gennaro 18a . ed . 1990). Las preparaciones farmacéuticas se elaboran siguiendo técnicas convencionales de qu ímica farmacéutica que involucran pasos tales como mezcla, granulación y compresión, cuando es necesario para formas de tabletas, o mezcla, relleno y disolución de los ingredientes, según sea apropiado, para dar los productos deseados para administración oral, parenteral , tópica, transdérmica, intravaginal , intrapenil , intranasal , intrabronquial, intracraneal , intraocular, intraaural y rectal. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores de pH y otros. La presente invención puede usarse en el diagnóstico o tratamiento de cualquiera de una cantidad de géneros y especies animales, y es aplicable igualmente en la práctica de medicina humana o veterinaria. Así, las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar animales domésticos y comerciales, incluyendo aves y más preferiblemente mamíferos, así como también seres humanos. El término "administración sistémica" se refiere a la administración de una composición o agente tal como el polipéptido, descrito aqu í, de una forma que de como resultado la introducción de la composición en el sistema circulatorio del sujeto o que permita su dispersión en todo el cuerpo, tal como inyección o infusión intravenosa (i.v.). La administración "regional" se refiere a administración en un espacio anatómico específico, y un poco más limitado, tal como intraperitoneal , intratecal, subdural , o en un órgano específico. Los ejemplos incluyen intravaginal , intrapenil, intranasal, intrabronquial (o instilación pulmonar), intracraneal, intra-aural o intraocular. El término "administración local" se refiere a la administración de una composición o fármaco en un espacio anatómico limitado, o circunscrito, tal como inyección intratumoral en una masa tumoral, inyecciones subcutáneas (s.c.), inyecciones intramusculares (i. m.). Un conocedor de la materia entenderá que la administración local o la administración regional con frecuencia dará como resultado la entrada de una composición en el sistema circulatorio, es decir, de tal forma que las rutas s.c. o i.m . también son vías de administración sistémica. Las preparaciones inyectables o infundibles pueden ser preparadas en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones, formas sólidas apropiadas para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección o infusión , o como emulsiones. Si bien las vías de administración preferidas son sistémicas, tales como i .v. , la composición farmacéutica se puede administrar tópicamente o transdérmicamente, por ejemplo, como ungüento, crema o gel ; oralmente, rectalmente, por ejemplo, como supositorio. Para su aplicación tópica, el compuesto puede ser incorporado en vehículos aplicados tópicamente, tales como una pomada o ungüento. El portador del ingrediente activo puede ser cualquiera en forma que se pueda rociar o no. Las formas no rociables pueden ser formas semi sólidas o sólidas que contiene un portador autóctono para aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del agua. Las formulaciones apropiadas incluyen , sin limitación a ellas, solución , suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas y similares. Si se desea, estas pueden ser esterilizadas o mezcladas con agentes auxiliares, por ejemplo conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, reguladores, o sales para influenciar la presión osmótica y similares. Los veh ículos preferidos para preparaciones tópicas no rociables incluyen bases para ungüento, por ejemplo polietilenglicol 1000 (PEG-1000); cremas convencionales tales como crema HEB; geles; así como también jalea de petróleo y similares. También son apropiados para aplicación tópica, así como también para instilación pulmonar, las preparaciones en aerosol en donde el compuesto, preferiblemente en combinación con un material portador inerte sólido o líquido, está empacado en una botella exprimible o en mezcla con un propelente volátil presurizado, normalmente gaseoso. Las preparaciones en aerosol pueden contener solventes, reguladores, agentes tensoactivos, perfumes y/u antioxidantes además de los compuestos de la invención. Para las aplicaciones tópicas preferidas, especialmente para seres humanos, se prefiere administrar una cantidad efectiva del compuesto a un área afectada, por ejemplo, la superficie de la piel, membrana mucosa, ojos, etc. Esta cantidad abarcará generalmente desde aproximadamente 0.001 mg hasta aproximadamente 1 g por aplicación, dependiendo del área que va a ser tratada, la gravedad de los síntomas, y la naturaleza del vehículo tópico empleado. Otros portadores aceptables para uso farmacéutico para composiciones de polipéptidos de la presente invención son liposomas, composiciones farmacéuticas en las cuales la proteína activa está contenida ya sea dispersa o presente de manera variable en corpúsculos constituidos por capas acuosas concéntricas adherentes a capas lípidas. El polipéptido activo preferiblemente está presente en la capa acuosa y en la capa l ípida, dentro o fuera , o en cualquier caso, en el sistema no homogéneo conocido generalmente como suspensión liposómica. La capa hidrofóbica, o capa lípida , generalmente, pero no de manera exclusiva, contiene fosfolípidos tales como lecitina y esfingomielina, esferoides tales como colesterol , más o menos sustancias iónicas activas en superficie tales como dicetilfosfato, estearilamina o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de naturaleza hidrofóbica. Los conocedores de la materia se darán cuenta de otras modalidades apropiadas de las presentes formulaciones liposómicas. Las composiciones terapéuticas para el tratamiento de tumores y cáncer pueden contener, además del péptido, uno o más agentes anti-tumorales adicionales, tales como inhibidores mitóticos, por ejemplo, vinblastina ; agentes alquilantes, por ejemplo, ciclofosfamida, inhibidores de folato, por ejemplo, metotrexato, piritrexim o trimetrexato; antimetabolitos, por ejemplo, 5-fluorouracilo y citosina arabinósida; antibióticos intercaladores, por ejemplo adriamicina y bleomicina; enzimas o inhibidores de enzimas, por ejemplo, asparaginasa , inhibidores de topoisomerasa tales como etoposida, o modificadores de respuesta biológica , por ejemplo interferones o interleucinas. De hecho, las composiciones farmacéuticas que contienen cualquier terapéutico para cáncer conocido en combinación con los péptidos descritos aquí, están dentro del alcance de esta invención. La composición farmacéutica también puede contener uno o más de otros medicamentos para tratar síntomas adicionales para los cuales el paciente objetivo está en riesgo, por ejemplo anti-infecciosos, incluyendo agentes antibacterianos, anti-fúngicos, anti-parasitarios, anti-virales y anti-coccidiales. La dosis terapéutica administrada es una cantidad que es efectiva terapéuticamente, tal como se conoce o como la puede determinar fácilmente un conocedor de la materia . La dosis también depende de la edad , salud y peso del receptor, del tipo de tratamiento o tratamientos concurrentes, si los hay, la frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado, tal como por ejemplo, efectos anti-inflamatorios o efecto antibacteriano. Métodos terapéuticos Los métodos de esta invención se pueden usar para inhibir el crecimiento tumoral y la invasión en un sujeto o para suprimir la angiogénesis inducida por tumores inhibiendo el crecimiento celular endotelial y la migración . Al inhibir el crecimiento o la invasión de un tumor o angiogénesis, los métodos dan como resultado la inhibición de la metástasis tumoral. A un sujeto vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, se le administra una cantidad del compuesto efectiva para inhibir el crecimiento tumoral, la invasión o angiogénesis. El compuesto o sal de él aceptable para uso farmacéutico preferiblemente se administra en la forma de una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente.

Las dosis de las proteínas (incluyendo los Ab), péptidos, multímeros péptidos, etc. , preferiblemente incluyen unidades de dosis farmacéuticas que contiene una cantidad efectiva del péptido. La forma de unidad de dosis se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosis unitarias para un sujeto mamífero; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas de unidad de dosis de la invención es dictada por, y depende directamente de (a) las características únicas del material activo y del efecto terapéutico en particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de un compuesto activo para el tratamiento de, y la sensibilidad de, sujetos individuales. Por cantidad efectiva se quiere decir una cantidad suficiente para lograr una concentración en estado estable in vivo, la cual da como resultado una reducción mensurable en cualquier parámetro relevante de la enfermedad , y puede incluir crecimiento de tumor primario o metastásico, cualquier índice aceptado de reactividad inflamatoria, o una prolongación mensurable de intervalo libre de enfermedad o de supervivencia. Por ejemplo, una reducción en el crecimiento tumoral en 20% de los pacientes se considera eficaz (Frei H l , E. , The Cáncer Journal 3: 127-136 (1997)). Sin embargo, un efecto de esta magnitud no se considera como un requerimiento mínimo para que la dosis sea efectiva de acuerdo con esta invención . En una modalidad , una dosis efectiva preferiblemente es de 10 veces, y más preferiblemente 100 veces mayor que la dosis efectiva en 50% del compuesto (ED50) en un análisis in vivo como el que se describe aqu í. La cantidad del compuesto activo que va a ser administrado depende del péptido o derivado de péptido preciso seleccionado, de la enfermedad o condición , de la vía de administración, de la salud y peso del receptor, de la existencia de otro tratamiento concurrente, si lo hay, de la frecuencia de tratamiento, de la naturaleza del efecto deseado, por ejemplo, la inhibición de metástasis tumoral, y del criterio del practicante entrenado. Una dosis preferida para tratar a un sujeto, preferiblemente mamífero, más preferiblemente humano, con un tumor, es una cantidad de hasta aproximadamente 100 miligramos de compuesto activo basado en polipéptido por kilogramo de peso corporal . Una dosis simple típica del péptido o péptido mimético está entre aproximadamente 0.01 y 20% de concentración (por peso) del compuesto, preferiblemente se sugiere entre 1 y 5%. Una dosis diaria total en el rango desde aproximadamente 0.1 miligramos hasta aproximadamente 7 gramos se prefiere para la administración intravenosa. Los rangos precedentes son sugeridos sin embargo, dado que la cantidad de variables en un régimen de tratamiento individual es grande, y se esperan excursiones considerables de estos valores preferidos.

Una cantidad efectiva o dosis del péptido para inhibir la proliferación de células endoteliales o migración in vitro está en el rango desde aproximadamente 1 picogramo hasta aproximadamente 5 nanogramos por célula. Las dosis efectivas y los rangos de dosis óptimos pueden determinarse in vitro usando los métodos descritos aqu í. Los compuestos de la invención pueden ser caracterizados como productores de un efecto inhibidor de la proliferación , migración , invasión de células tumorales o de células endoteliales, o de antiogénesis, de metástasis tumoral o de reacciones inflamatorias. Los compuestos son especialmente útiles para producir un efecto anti-tumoral en un anfitrión mamífero, preferiblemente humano, que aloja un tumor en donde la inhibición de angiogénesis da como resultado la reducción del tamaño o de la tasa de crecimiento del tumor o de la destrucción del tumor. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. Un ejemplo más largo de una enfermedad o condición contra la cual el método anterior es efectivo, incluye el crecimiento primario de un tumor sólido, leucemia o linfoma ; invasión tumoral , metástasis o crecimiento de metástasis tumorales; hiperplasia benigna, ateroesclerosis, angiogénesis miocárdica, restenosis vascular posterior a angioplastia con balón , formación neoíntima después de trauma vascular; restenosis de injerto vascular, formación colateral coronaria, trombosis venosa profunda, angiogénesis isquémica de extremidades, telangiectasia, granuloma piogénico, enfermedad corneana , rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética u otra, fibroplastia retrolental , neovascularización diabética, degeneración macular, endometriosis, artritis, fibrosis asociada con una condición inflamatoria crónica, daño traumático en la médula espinal, incluyendo isquemia, escaras o fibrosis, fibrosis pulmonar, fibrosis inducida por quimioterapia , curación de heridas con escaras y fibrosis, úlceras pépticas, una fractura de hueso, queloides, o un trastorno de vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación , menstruación, preñez o placentación asociada con invasión de células patógenas o con angiogénesis. Una enfermedad o condición que se prefiere tratar con el método anterior es crecimiento tumoral, invasión o metástasis. Esto incluye tumores cerebrales. Los ejemplos de estos tumores cerebrales son astrocitoma, astrocitoma anaplástico, glioblastoma, glioblastoma multiforma, astrocitoma pilocítico, xantoastrocitoma pleiomórfico, astrocitoma subpendimal de célula gigante, astrocitoma fibrilar, astrocitoma gemistócico, astrocitoma protoplásmico, oligodendroglioma , oligodendroglioma anaplástico, ependimoma , ependimoma anaplástico, ependimoma mixopapilar, subependimoma , oligoastrocitoma mixto y oligoastrocitoma maligno. El método también se usa para tratar une enfermedad uterina tal como endometriosis y neovascularización ocular patógena, tal como la que está asociada con , o que es causa de, retinopatía diabética proliferativa, degeneración macular neovascular relacionada con la edad, retinopatía de premadurez, retinopatía de células en forma de hoz, u oclusión de la vena retiniana . Los inhibidores de angiogénesis pueden jugar un papel en la prevención de angiogénesis y gliosis inflamatoria después de daño traumático en la médula espinal , promoviendo así el reestablecimiento de la conectividad neuronal (Wamil, AW et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 95: 13188-13193 (1998)). Por lo tanto, las composiciones de la presente invención se administran tan pronto como sea posible después del daño traumático espinal y durante varios d ías hasta aproximadamente dos semanas después de él para inhibir la angiogénesis y la gliosis que podrían prevenir estéricamente el reestablecimiento de la conectividad neuronal . El tratamiento reduce el área de daño en el sitio del daño a la médula espinal y facilita la regeneración de la función neuronal y con ello previene la parálisis. Se espera que los compuestos de la invención también protejan los axones de la degeneración Walleriana , despolarizacion mediada por aminobutirato (que ocurre en las neuronas traumatizadas) y mejora de la recuperación de la conductividad neuronal de células del sistema nervioso central aisladas y tejido en cultivo. Métodos generales con ADN recombinante Los métodos generales de biología molecular han sido descritos ampliamente en la materia (Sambrook, ef al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (o posterior), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel , F ef al, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Wiley-l nterscience, New York, (edición actual); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual ( 1990); Glover, DM , ed. , DNA Cloning : A Practical Approach , vol. I & I I , I RL Press, 1985; Alberts, B. et al. , Molecular Biology of the Cell, 4a. edición (o posterior), Garland Publishing , Inc. , New York, NY (2002); Watson , JD ef al, Recombinant DNA, 2a . edición (o posterior) Ed. , WH Freeman & Co. ; 2nd edition (1993); y Oíd , RW ef al. , Principies of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 5a. edición (o posterior) Univ. of Calif. Press, Berkeley (1994). A menos que se indique otra cosa , una secuencia de ácido nucleico en particular comprende sus variantes de sustitución conservadora (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y una secuencia complementaria. El término "ácido nucleico" es un sinónimo con "polinucleótido", e incluye un gen , una molécula de ADN , una molécula de ARNm, así como también un fragmento de cualquiera de estos, tal como un oligonucleótido, y además, equivalentes de ellos (loso cuales se explican más completamente más adelante). Los tamaños de ácidos nucleicos se expresan como kilobases (kb) o como pares de bases (bp). Estos son estimados derivados de electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida (PAG E), a partir de secuencias de ácido nucleico que están determinadas por el usuario o publicadas. El tamaño de proteína se expresa como masa molecular en kilodaltons (kDA) o como longitud (cantidad de residuos de aminoácidos). El tamaño de proteína se estima a partir de PAGE, a partir de secuenciación , a partir de secuencias de aminoácidos presumibles basadas en la secuencia codificadora de ácido nucleico o de secuencias de aminoácidos publicadas. Específicamente, las moléculas de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos correspondientes a los polipéptidos de la presente invención , o a sus variantes activas, pueden ser sintetizados mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 4,683,202), usando sensibilizadores derivados de la secuencia de la proteína descrita aquí. Estas secuencias de ADNc pueden ser ensambladas luego en un vector de expresión eucariótico o procariótico y el vector resultante se puede usar para dirigir la síntesis del polipéptido de fusión o su fragmento o derivado mediante células anfitrionas apropiadas, por ejemplo células COS o CHO. Como se usa aquí, el término "ácido nucleico" incluye estos fragmentos o equivalentes. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención pueden ser de ADN o de ARN . Las células anfitrionas procarióticas o eucarióticas transformadas o transfectadas para expresar los polipéptidos de la presente invención están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, el polipéptido puede ser expresado en células bacterianas, tales como E. coli , células de insectos (baculovirus), levadura, o células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células humanas (las cuales son preferidas para uso terapéutico humano de las células transfectadas). Otros anfitriones apropiados son familiares para los conocedores de la materia . La expresión en las células eucarióticas conduce a glicosilación parcial o completa y/o a formación de uniones disulfuro relevantes inter- o intra-cadena del polipéptido recombinante. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSed (Baldari ef al, 1987, EMBO J. 6:229-234), pM Fa (Kurjan ef al. 1982 Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz ef al, 1987, Gene 54: 1 13-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation , San Diego, Calif.). Los vectores baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (células SF 9) incluyen la serie pAc (Smith et al, 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow et al, (1989) Virology 170:31 -39). En general , se usan células COS (Gluzman 1981 Cell 23: 1 75-182) en conjunto con vectores tales como pCDM 8 (Aruffo ef al, supra, para la amkplificación/expresión transitoria en células de mamífero, mientras que se usan células CHO (CHO negativas a dhfr) con vectores tales como pMT2PC (Kaufman ef al, 1987, EMBO J. 6: 1 87-195) para la amplificación/expresión estable en células de mam ífero. La línea celular de mieloma NSO (un sistema de expresión de sintetasa glutamina) está disponible en Celltech Ltd. La construcción de vectores apropiados que contienen las secuencias de codificación y control deseadas emplea técnicas de ligación y restricción estándar, las cuales son bien conocidas en la materia. Los plásmidos aislados, secuencias de ADN , u oligonucleótidos sintetizados, son divididos, ajustados y re-ligados en la forma deseada. Las secuencias de ADN que forman los vectores están disponibles en una cantidad de fuentes. La estructura principal de vectores y los sistemas de control general mente se encuentran en vectores "anfitriones" disponibles que se usan para la construcción de las secuencias. Para la secuencia codificadora pertinente, la construcción inicial puede ser, y usualmente es, asunto de recuperar las secuencias apropiadas de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico. Sin embargo, una vez que está descrita la secuencia, es posible sintetizar la secuencia genética completa in vitro comenzando por los derivados nucleótidos individuales. La secuencia genética completa para genes de longitud en el rango de 500 a 100 bp puede ser preparada sintetizando oligonucleótidos complementarios individuales que se solapan y colocándolos en porciones monocatenarias que no se solapan usando ADN polimerasa en la presencia de trifosfatos desoxiribonucleótidos. Este enfoque se ha usado exitosamente en la construcción de varios genes de secuencia conocida. Véase, por ejemplo, Edge, Nature 1981 , 292:756; Nambair ef al, Science 1984, 223: 1299; and Jay, J. Biol. Chem. 1984, 259:631 1 . Los oligonucleótidos sintéticos se preparan con métodos descritos en las referencias citadas anteriormente o por Beaucage et al, Tetrahedron Lett. 1981 , 22: 1859; y Matteucci ef al, J. Am. Chem Soc. 1981 , 103:3185. Los componentes de los vectores deseados se pueden extraer y ligar usando procedimientos de restricción y ligación estándar. La escisión de AD N específica para el sitio se realiza tratándolo con la enzima (o enzimas) de restricción apropiada , bajo condiciones que generalmente son comprendidas en la materia , y los particulares de los cueles se especifican por el fabricante de estas enzimas de restricción disponibles comercialmente . Véase por ejemplo, el catálogo de productos de New England Biolabs. Si se desea , la separación por tamaño de los fragmentos divididos puede realizarse mediante técnicas de electroforesis estándar en gel de pol iacrilamida o en gel de aga rosa (por ejemplo, Meth Enzymol. ( 1 980) 65 :499-560). Cualquiera de una cantidad de métodos se usa para introducir mutaciones en la secuencia codificadora para generar variantes si estas se van a producir de manera recombi na nte. Estas mutaciones incluyen deleciones o inserciones simples , deleciones, inserciones o sustituciones sistemáticas de grupos de bases o sustituciones de bases simples. La modificación de la secuencia de ADN mediante mutagénesis dirig ida al sitio es una técnica bien conocida para la cual están disponi bles comercialmente procedimientos y reactivos (Zol ler et al, Nucleic Acids Res. 1 982 , 1 0:6487-6500 ; Adelman ef al , DNA 1 983, 2: 1 83-1 93)). El AD N aislado se analiza mediante restricción y/o se secuencia med iante el método de didesoxi nucleótido (Sanger, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1 977, 74:5463; Messing , ef al, Nucleic Acids Res. 1 981 , 9:3091 o Maxam ef al, Meth. Enzymol., supra). El ADN vector puede introducirse en célu las de mam ífero por medio de técnicas convencionales tales como co-precipitación con fosfato de calcio o con cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrán, lipofección o electroforación. Los métodos apropiados para transformar células anfitrionas pueden encontrarse en Sambrook ef al. supra y en otros textos estándar. En los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del grupo informador y la proteína objetivo para hacer posible la separación del a proteína objetivo del grupo informador luego de la purificación de la proteína de fusión. Las enzimas proteolíticas para esta escisión y sus secuencias de reconocimiento incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Habiendo descrito ahora en general la invención, la misma será comprendida más fácilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a manera de ilustración, y no pretenden limitar la presente invención, a menos que se especifique. Ejemplo I Materiales v Métodos Líneas celulares gue expresan proteínas El sistema de expresión con Drosophila (DES™; Invitrogen, Inc.) utiliza la línea celular Schneider 2 (S2) derivada de Drosophila melanogaster, y vectores plásmidos para la expresión de proteína heterólogas. Los vectores plásmidos para la expresión en células S2 son muy versátiles, permitiendo la expresión ¡nducible de una proteína dirigida por el promotor de metalotienina (MT). El mismo plásmido también permite que la proteína sea secretada por la célula en el medio circundante, simplificando grandemente la purificación de la proteína . Se puede insertar múltiples copias del vector de manera estable en el ADN genómico de células S2, lo cual es importante para la generación de Ab dirigidos contra el componente proteína de uPAR. Las producciones típicas de proteína después de la purificación son 25-50 mg/L con una pureza de aproximadamente 95 por ciento (Figura 1 ). Han sido generadas l íneas celulares que expresan las siguientes proteínas: suPAR, D1 , D2D3, scuPA, ATF1 -143, ATFI-135, Kringle47-143, y Kringle47-1 35. Además, se han generado clones para suPAR en los cuales se han eliminado sitios de glicosilación N-ligados. Reactivos Se adquirió 125l como Na125l (480-630 MBq [13-1 7 mCi] por µg de yodo) en Amersham Corp. Líneas de célu las tumorales Se usaron las siguientes l íneas de células tumorales: A549, HeLa, y A2780. La línea celular de cáncer ovárico humano A2780 fue establecida a partir de tejido tumoral de un paciente no tratado. Las células A2780 se mantienen como una monocapa en medio RPM I 1640 complementado con 2 mM de glutamina, 0.01 mg/mL de insulina bovina, y 10% de FBS (supra). A549, carcinoma pulmonar humano, número de catálogo de ATCC CCL-185, descritas anteriormente, se mantienen en medio F12K de Ham complementado con 2 MM de L-glutamina, NaHCO3 al 0.15% y FBS al 10 %. Se inocularon células A2780 (2xl06) en el flanco derecho de ratones Balb/c hembras. Se dejó desarrollar el tumor hasta un rango de 50 a 200 mm3 antes de que se iniciara el tratamiento. El Ab de IgG control , así como también el mAb de uPAR anti-D2D3 fueron administrados intraperitonealmente a 10 mg/kg dos veces por semana los lunes y los viernes. El grupo con tratamiento con cisplatina se desarrolló hasta 1000 mm3; los animales recibieron 6 mg/kg una vez por semana. Se inocularon células de carcinoma A549 (106) en el flanco derecho de ratones hembras C.B-17/Sys (scid/scid) f (scid: con inmunodeficiencia combinada grave). Se comenzó el tratamiento el día después de la inoculación del tumor. El Ab de control de IgG (y el PBS control) así como también el mAb de uPAR anti-D2D3 ATN-658 fueron administrados intraperitonealmente 10 mg/kg dos veces por semana, lunes y viernes. Se midieron los volúmenes tumorales inicialmente una vez por semana. Cuando el volumen en cualquier grupo de tratamiento excedió los 300 mm3, se hicieron mediciones dos veces por semana. Al momento del sacrificio, se obtiene plasma y se extrae el tumor de cada animal. La mitad del tumor se congela rápidamente para evaluación bioquímica y el resto se coloca en fijador de zinc para evaluación histológica. Ejemplo 2 mAb anti-D2D3 La inmunización de ratones Balb/c con el dominio D2D3 de suPAR recombinante conjugado con KLH generó una respuesta inmunológica robusta. Los experimentos de fusión subsiguientes generaron clones parentales con reactividad cruzada específica con el dominio D2D3 de uPAR según se determinó mediante detección Western y análisis ELISA usando proteínas recombinantes. Estos clones parentales fueron sometidos a dilución limitante y se obtuvo un panel de mAb específico para D2D3. Las propiedades de cuatro de estos Ab están resumidas en la tabla 3. El isotipeaje identificó todos los clones como IgG 1 , K. La especificidad para uPAR fue confirmada mediante detección Western. La afinidad de los Ab fue determinada usando ensayos de unión directos. La mayoría de los clones tiene afinidades de 1 a 5 nM. Tabla 3: anticuerpos anti-D2D3 (uPAR) ATN-615 lgG1, K 2 ATN-658 igGi, K 1 ATN-616 igGi, K 5 ATN-617 igd, K 3 Los resultados de los experimentos de detección Western usando dos de estos Ab, ATN-615 y ATN-658, Ambos Ab reconocen específicamente a suPAR y específicamente, al dominio D2D3 de uPAR.

La actividad funcional de los anticuerpos anti-D2D3 fue sometida a prueba en ensayos de migración. Los experimentos previos han demostrado que las células CHO que expresan uPAR migran hacia uPA en un análisis con cámara Boyden modificada (Figura 4), y que esta migración es dependiente del G FD de uPA (no se muestra). Como se muestra en la figura 4, la migración celular es inhibida por un mAb específico para D2D3 así como también un Ab policlonal de conejo dirigido contra uPAR. De manera interesante, la migración celular también es inhibida por Ab con integrina anti-a5, pero no por Ab con integrina anti-a6. Tomados juntos, estos datos sugieren que la integrina a5ß1 y uPAR son críticos para la migración inducida por uPA. La utilidad de los diversos Ab anti-D2D3 para la formación de imágenes de diagnóstico o para apuntar agentes terapéuticos es dependiente de su capacidad para unir uPAR en la superficie celular con alta afinidad . Tal como se muestra en la figura 5, el Ab ATN-658 se une a células HeLa con una KD de aproximadamente 1 .5 nM . Esto es consistente con la K para este Ab determinada en experimentos de unión directa (Tabla 3), lo que indica que la unión no es afectada por el proceso de marcado. Se puede unir uPA al receptor uPAR en la superficie de células tumorales o endoteliales in vivo. Así, los Ab que se unen a uPAR en la presencia de uPA tienen por lo tanto una utilidad adicional como agentes para el diagnóstico o tratamiento. El mAb ATN-658 no inhibe la unión de scuPA a uPAR (figura 6), en la superficie de células HeLa, y es capaz de unirse a células HeLa en la presencia de scuPA. Así, el ATN-658 puede apuntarse tanto a receptores ocupados como no ocupados en la superficie celular. Las secuencias de aminoácidos de consenso de cadenas VL y VH , incluyendo las tres regiones de CDR de ATN-658 y de ATN-615 fueron determinadas mediante métodos estándar y han sido explicados anteriormente, y por lo tanto no se repiten aquí, si bien deben considerarse como incorporados en esta descripción de ejemplo. Ejemplo III Unión de uPA a uPAR Se midió la unión de uPA a uPAR usando uPA marcada con 125l y células HeLa. Las células HeLa expresan cantidades abundantes de uPAR pero no expresan uPA. De manera resumida, se marcaron 100 µg de scuPA con 1 00 µCi de [ 25l]Nal usando el reactivo de yodación Iodo-Gen ™ (Pierce Biotechnology Inc) Se eliminó el Nal marcado no incorporado de la proteína marcada , usando una columna de exclusión por tamaño y la proteína marcada eluida en salina regulada con Tris que contenía 0.1 % de albúmina de suero bovino (BSA). Se incubaron las células HeLa con concentraciones en aumento de [125l]-SCuPA diluido en PBS que conten ía 0.1 % de BSA durante 2 h a 4°C. Se lavaron las células extensivamente con PBS/0.1 % BSA, se Usaron las monocapas de células con NaOH 1 M y se determinó la cantidad total de conteos de unión. La unión específica se determinó incubando células con [125l]-SCuPA en la presencia de un gran exceso de scuPA no marcado. También se realizó la unión con células MDA-MB231 , las cuales expresan tanto uPA como uPAR. Para determinar la unión de scuPA primero se eliminó el uPA endógeno de la superficie de las células MDA-MB231 lavándolas con un regulador que contenía glicina 0.1 M /100 mM de NaCI, con pH 3 durante 5 minutos a 4°C. Este procedimiento se usó también para determinar la unión de [125I]-ATF a células HeLa. La capacidad de los Ab par inhibir la unión ya sea de [125l]-scuPA o de [125I]-ATF a células HeLa se determinó incubando células con cantidades en aumento del Ab no marcado durante 15 minutos a 4°C, antes de la adición de la proteína marcada con [l25l]. Ejemplo IV Inhibición de migración celular La inhibición de la migración celular por los Ab específicos para uPA o uPAR fue sometida a prueba usando un análisis en cámara Boyden modificada, tal como se describió previamente (Tarui, T ef al , (2003) J Biol Chem, 27829863- 29872). De manera resumida, el lado inferior de un filtro de cámara Boyden fue cubierto con 500 nM de uPA y se añadió regulador de migración libre de suero (Medio de Eagle modificado con Dulbecco que contenía 10 mM de Hepes y albúmina de suero bovino al 0.5%) a la cámara inferior. Las células CHO que expresan uPAR fueron resuspendidas en regulador de migración libre de suero (8 x 105 células/mL) y se le añadió 100 µL a la cámara superior. Para someter a prueba la capacidad de los Ab anti-uPA o anti-u PAR para inhibir la migración celular, se preincubaron las células con 10 µg/mL de Ab durante 15 minutos antes de la adición a la cámara superior. Las células fueron incubadas luego a 37°C en 5% CO2 durante 20 h . Las células que migraron hacia la cámara inferior fueron detectadas tiñendo con 0.5% de violeta cristal y microscopio de luz. Ejemplo V Análisis para anticuerpos gue reconocen el mismo epítopo g ue ATN-658 usando ATN-658 biotinilado. El Ab anti-D2D3, ATN-658, fue biotinilado usando EZ-link™ sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce Biotechnology Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Típicamente, se usó un exceso molar de 20 veces del reactivo marcador con biotina para marcar el ATN-658 y se desincorporó la biotina que se extrajo del Ab marcado usando una columna de exclusión por tamaño. Para asegurar que el Ab marcado retuviera su afinidad por uPAr, se sometió a prueba Biotina-ATN-658 en un análisis ELISA para la unión a suPAR. La biotina-ATN-658 unida fue detectada usando estreptavidina conjugada con HRP. La marcación con biotina no redujo la afinidad de ATN-658 por suPAR (Figura 9). Para identificar Ab que reconozcan el mismo epítopo que ATN-658 se estableció un análisis de competencia. De manera resumida, se cubrieron placas de 96 receptáculos con alta unión de proteína EIA/RIA con 100 ng/receptáculo de suPAR durante la noche a 4°C. Después del bloqueo de la unión no específica con caseína al 1 %, se lavaron las placas con PBS y los se añadieron los Ab sometidos a prueba, diluidos en PBS/caseína al 0.1 % con 0.2 nM de biotina-ATN-658, a los receptáculos apropiados. Se incubaron las placas durante 1 h adicional a temperatura ambiente, se lavaron extensivamente con PBS/Tween-20 al 0.05% y se detectó la unión de Biotina-ATN-658 usando estreptavidina conjugada con H RP y el sustrato apropiado (Figura 10A/10B). Ejemplo VI Actividades de mAb In vivo Se sometieron a prueba los anticuerpos para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento tumoral in vivo en dos modelos: el modelo de cáncer de pulmón humano de células no pequeñas y el modelo de cáncer ovárico A2780 usando los procedimientos y condiciones descritos en el Ejemplo I . El tratamiento se inició el d ía después de la inoculación del tumor. El Ab de IgG control (y el PBS control), así como también el mAb de uPAR anti-D2D3 ATN-658 se administraron por vía intraperitoneal 10 mg/kg dos veces por semana lunes y viernes. El ATN-658 inhibió significativamente el crecimiento en ambos modelos (Figura 7 y 8). todas las referencias citadas anteriormente están incorporadas aqu í mediante referencia en su totalidad , ya sea incorporadas específicamente o no. Habiendo descrito ahora totalmente esta invención , los conocedores de la materia se darán cuenta que la misma se puede llevar a cabo dentro de una amplia gama de parámetros, concentraciones, y condiciones equivalentes, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin experimentación indebida . En el caso de cualquier desacuerdo entre las secuencias de aminoácidps descritas anteriormente y las que están en la lista de secuencias electrónica o en papel anexa o presentada posteriormente, las secuencias anteriores tendrán precedencia.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un ligando que se une a un complejo binario de uPA-uPAR, pero que no se une sustancialmente a (i) uPA libre o (¡i) la región de uPAR que reconoce y se une a uPA, de tal forma que el ligando no inhibe la unión a uPA-uPAR. 2. Un ligando que se une a un complejo ternario de uPA-uPAR y una molécula adicional X, dicho ligando: (a) se une a un complejo uPA-uPAR-X; (b) no se une sustancialmente a cualquiera de los siguientes: (i) un complejo uPA-uPAR, (ii) un complejo uPA-X, (iii) la región de reconocimiento de uPA y de unión a uPA de uPAR (¡v) la región de reconocimiento de uPA y de unión a uPA de X, (v) uPA libre; o (vi) X libre; y (c) no inhibe sustancialmente la unión de uPA-uPAR o la unión de uPA-X. 3. El ligando de la reivindicación 2 caracterizado además porque X es la proteína PAI-1 . 4. El ligando de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que sustancialmente no es une a uPAR libre. 5. El ligando de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 que es un polipéptido. 6. El ligando de la reivindicación 4 que es un polipéptido. 7. El ligando de la reivindicación 5 que es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de él. 8. El ligando de la reivindicación 6 que es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de él. 9. El anticuerpo de la reivindicación 7 que es un mAb. 10. El anticuerpo de la reivindicación 8 que es un mAb. 11. El anticuerpo de la reivindicación 9, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno contiene: (a) una cadena VL que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; and (b) una cadena VH que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. 12. El anticuerpo de la reivindicación 9, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno contiene: (a) una cadena VL que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2. 13. Un anticuerpo monoclonal purificado o un fragmento de unión al antígeno de él, que contiene: (a) una cadena VL que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ ID NO:2. 14. El anticuerpo de la reivindicación 9, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno contiene: (a) una cadena VL que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ I D NO: 1 1 , SEQ I D NO: 12 y SEQ I D NO: 13; y (b) una cadena VH que contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 14, SEQ I D NO: 15 y SEQ ID NO: 16. 15. El anticuerpo de la reivindicación 9, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno contiene: (a) una cadena VL que tiene la secuencia SEQ I D NO: 9; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ I D NO: 10. 16. Un anticuerpo monoclonal purificado o un fragmento de unión al antígeno de él , que contiene; (a) una cadena V que tiene la secuencia SEQ ID NO:9; y (b) una cadena VH que tiene la secuencia SEQ I D NO: 10. 1 7. El mAb de la reivindicación 7 que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un mAb denominado ATN-615 producido por hibridoma que tiene el número de acceso de ATCC # ); (b) un mAb denominado ATN-658 producido por hibridoma que tiene el número de acceso de ATCC # ); (c) un mAb que tiene esencialmente las mismas características de unión al antígeno que ATN-615; y (d) un mAb que tiene esencialmente las mismas características de unión al antígeno que ATN-658. 18. El ligando de la reivindicación 1 que inhibe la unión de complejos uPA-uPAR con otro ligando biológico para estos complejos. 19. El ligando de la reivindicación 4 que inhibe la unión de complejos uPA-uPAR con otro ligando biológico para estos complejos. 20. The ligando de la reivindicación 18 que es un polipéptido. 21. El ligando de la reivindicación 15 que es un polipéptido. 22. El ligando de la reivindicación 18, caracterizado además porque el otro ligando biológico es una integrina. 23. El ligando de la reivindicación 22, caracterizado además porque la integrina se selecciona del grupo que consiste en: adßl, avßZ, avßd, aZß , y a§ß\,aAß? . 24. El ligando de la reivindicación 2, 18, 20 o 23, caracterizado además porque dicho ligando interfiere con e inhibe (a) el acoplamiento de fibronectina mediado por uPAR, (b) la unión de fibronectina o de un fragmento de ella a integrina s5 "1, o (c) el acoplamiento de los componentes de la vitronectina. 25. El ligando de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 26. El ligando de la reivindicación 4 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 27. El ligando de la reivindicación 5 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 28. El ligando de la reivindicación 7 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 29. El ligando de la reivindicación 9 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 30. El ligando de la reivindicación 11 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 31. El ligando de la reivindicación 12 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 32. El ligando de la reivindicación 13 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 33. El ligando de la reivindicación 14 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 34. El ligando de la reivindicación 15 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 35. El ligando de la reivindicación 16 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con, o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 36. El ligando de la reivindicación 17 que está (a) marcado de manera detectable por diagnóstico o (b) marcado con, conjugado con , o fusionado con, una porción activa terapéuticamente, que hace a dicho ligando activo terapéuticamente. 37. Una composición para diagnóstico que contiene: (a) el ligando marcado de la reivindicación 25; y (b) un portador aceptable para uso diagnóstico 38. La composición de la reivindicación 37 caracterizada demás porque el ligando está marcado con un radionúclido, un agente PET que puede formar imágenes, un agente MRI que puede formar imágenes, un fluorescedor, un fluorógeno, una cromófora , un cromógeno, un fosforecedor, un quimioiluminador o un bioiluminador. 39. La composición de la reivindicación 38, caracterizada además porque la etiqueta es un radionúclido seleccionado del grupo que consiste en 3H, 14C, 35S, 67Ga , 68Ga, 72As, 89Zr, 97Ru , 99Tc, 1 1 1 l n, 123l , 125l , 131 l , 169Yb y 201TI. 40. La composición de la reivindicación 38 caracterizada además porque la etiqueta es un flourescedor o fluorógeno seleccionado del grupo que consiste en fluoresceína, rodamina, dansilo, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, fluorescamina , un derivado de fluoresceína , Verde Oregon, Verde Rodamina, Verde Rodol y Rojo Texas. 41 . Una composición farmacéutica terapéutica anti-angiogénica o anti-tumoral que inhibe la angiogénesis, crecimiento tumoral y/o metástasis tumoral no deseados, que contiene: (a) una cantidad efectiva del ligando activo terapéuticamente de la reivindicación 25; y (b) un portador aceptable para uso farmacéutico. 42. La composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 41 en una forma apropiada para inyección. 43. La composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 41 caracterizada además porque la porción activa terapéuticamente está conjugada directamente con , o unida indirectamente al ligando. 44. La composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 41 caracterizada además porque la porción activa terapéuticamente es un fármaco quimoterapéutico, una toxina o un radionúclido terapéutico. 45. La composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 44 caracterizada además porque el radionúclido se selecciona del grupo que consiste en 47Sc, 67Cu , 90Y, 109Pd , 125l , 1 31 l , 186Re, 1 88Re, 1 99Au, 21 1At, 212Pb y 217Bi . 46. La composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 41 caracterizada además porque una porción terapéuticamente activa es un péptido o polipéptido fusionado con dicho ligando. 47. La composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 46 caracterizada además porque el péptido o polipéptido fusionado es una toxina . 48. Un método para inhibir la migración celular, invasión celular, proliferación celular o angiogénesis, o para inducir apoptosis, que comprende poner en contacto células asociadas con migración celular, invasión, proliferación o angiogénesis no deseadas, con una cantidad efectiva de un ligando activo terapéuticamente de la reivindicación 25. 49. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad, trastorno o condición caracterizado por angiogénesis, crecimiento tumoral y/o metástasis tumoral no deseados, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición farmacéutica terapéutica de la reivindicación 41. 50. Un método de análisis para detectar en una muestra una sustancia que se sospecha que tiene las propiedades de unión del ligando de la reivindicación 1, que comprende (a) poner en contacto la muestra con complejos uPA-uPAR y determinar la unión de un componente de dicha muestra a los complejos; (b) poner en contacto la muestra con uPAR libre, y determinar la unión de un componente de dicha muestra a la uPAR. (c) comparar la unión de (a) y (b), caracterizado además porque la presencia de unión en (a) y una ausencia sustancial de unión significativamente menor en (b) es indicativa de la presencia de dicha sustancia en la muestra. 51. El método de la reivindicación 50 caracterizado además porque se sospecha que el ligando es uno que sustancialmente no se une a uPAR libre. 52. El método de la reivindicación 50 caracterizado además porque se sospecha que el ligando es un polipéptido. 53. El método de la reivindicación 50 caracterizado además porque se sospecha que el ligando es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de él. 54. El método de la reivindicación 50, caracterizado además porque dicho análisis es un análisis de unión directa. 55. El método de la reivindicación 50, caracterizado además porque dicho análisis es un análisis de unión competitiva usando un compañero de unión marcado que se une a complejos uPA-uPAR, en donde la sustancia en la muestra compite por la unión con el compañero de unión. 56. Un método de análisis para detectar en una muestra una sustancia que se sospecha que tiene las propiedades de unión del ligando de cualquiera de las reivindicaciones 2 - 3, que comprende (a) poner en contacto la muestra con complejos uPA-uPAR-X y determinar la unión de un componente de dicha muestra a los complejos; (b) poner en contacto la muestra con uno o más de (i) complejos uPA:X (ii) complejos uPA-uPAR o (iii) X que no ha formado complejo y determinar la unión de un componente de dicha muestra a uPA-X, uPA-uPAR o X; (c) comparar la unión de (a) y (b), caracterizado además porque la presencia de unión en (a) y una ausencia sustancial o significativamente menor de unión en (b) es indicativa de la presencia de dicha sustancia en la muestra. 57. El método de la reivindicación 56 caracterizado además porque dichos complejos están en la superficie de una célula. 58. El método de la reivindicación 56 caracterizado además porque dichos complejos están en la superficie de una célula. 59. Un método de análisis para identificar un anticuerpo u otro ligando que se une al mismo epítopo que el mAb ATN-615 o el mAb ATN-658, que comprende medir la capacidad de una muestra que se sospecha que contiene dicho anticuerpo u otro ligando para inhibir competitivamente la unión de ATN-615 o ATN-658 marcado de manera detectable a (i) suPAR inmovilizado, (ii) dominio D2D3 de suPAR inmovilizado, o (iii) un fragmento de suPAR o D2D3 de suPAR inmovilizado caracterizado además porque al menos aproximadamente 20% de inhibición competitiva indica que un anticuerpo o ligando se une al mismo epítopo. 60. un método para identificar un péptido que es reconocido por (a) mAb ATN-615, (b) mAb ATN-658, o (c) un anticuerpo u otro ligando que tiene la especificidad de unión de mAb ATN-615 o mAb ATN-658, cuyo método comprende medir la capacidad de una muestra que se sospecha que contiene dicho péptido, o un péptido candidato, para inhibir competitivamente la unión de mAb ATN-615 o de mAb ATN-658 o de dicho anticuerpo u otro ligando marcado de manera detectable, con la misma especificidad de unión, a (i) suPAR inmovilizado , (ii) D2D3 de suPAR inmovilizado, o (iii) un fragmento inmovilizado de suPAR o D2D3, caracterizado además porque al menos aproximadamente 20% de inhibición competitiva indica que el péptido tiene dicha especificidad de unión. 61. Un análisis para detectar un compuesto que tiene, o para determinar si un compuesto candidato tiene, esencialmente las mismas características de unión cuando se une a una estructura uPAR como lo hace ATN-615 o ATN-658, que comprende medir la capacidad de una muestra que está siendo explorada o del compuesto candidato para inhibir competitivamente la unión de ATN-615 o ATN-658 marcado de manera detectable a (i) suPAR inmovilizado , (ii) D2D3 de suPAR inmovilizado, o (iii) un fragmento inmovilizado de suPAR o de D2D3, caracterizado además porque al menos aproximadamente 20% de inhibición competitiva indica que el compuesto tiene dichas características de unión. 62. El análisis de la reivindicación 61 caracterizado además porque el compuesto que está siendo explorado, o el compuesto candidato, es una molécula orgánica que tiene una masa molecular de entre aproximadamente 50 Da y aproximadamente 2500 Da. 63. El método de la reivindicación 61 caracterizado además porque el compuesto que está siendo expolorado, o el compuesto candidato, es una molécula de ácido nucleico. 64. El método de la reivindicación 63, caracterizado además porque la molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido. 65. El método de la reivindicación 64 caracterizado además porque el oligonucleótido es una molécula de iARN o un aptámero. 66. Un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga, está presente en un epítopo lineal unido por un mAb que tiene las siguientes características: (a) una cadena V contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5; y (b) una cadena VH contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. 67. Un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga, está presente en un epítopo lineal unido por un mAb que tiene las siguientes características: (a) una cadena VL tiene la secuencia SEQ ID NO: 1; y (b) una cadena VH tiene la secuencia SEQ ID NO:2. 68. Un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga , está presente en un epítopo lineal unido por un mAb que tiene las siguientes características: (a) una cadena VL contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ I D NO: 1 1 , SEQ I D NO: 12 y SEQ ID NO: 13; y (b) una cadena VH contiene tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos respectivas SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ I D NO: 1 6. 69. Un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga , está presente en un epítopo lineal unido por un mAb que tiene las siguientes características: (a) una cadena VL tiene la secuencia SEQ ID NO:9; and (b) una cadena VH tiene la secuencia SEQ ID NO: 10. 70. Un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga , está presente en un epítopo lineal reconocido por (a) un mAb denominado ATN-658 producido por un hibridoma que tiene el número de acceso a ATCC # , o (b) un mAb que tiene esencialmente las mismas características de unión al antígeno que ATN-658. 71 . Un péptido aislado que contiene al menos 3 aminoácidos, dicho péptido, cuando es parte de una secuencia de aminoácidos más larga, está presente en un epítopo lineal reconocido por (a) un mAb denominado ATN-615 producido por un hibridoma que tiene el número de acceso a ATCC # , o (b) un mAb que tiene esencialmente las mismas características de unión al antígeno que ATN-658.