JP6161542B2 - 方法、アレイ及びその使用 - Google Patents
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Description
a)個体由来の試験すべきサンプルを備える工程;
b)表IIIに定義される群より選択される1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を測定することによって試験サンプルのバイオマーカー・シグネチャーを判定する工程;
ここで、表IIIに定義される群より選択される1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現は、膵臓癌を有する個体を示す方法を提供する。
c)膵臓癌に罹患していない個体由来の対照サンプル(即ち、陰性対照)を提供する工程;
d)工程(b)において測定された1つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現を測定することによって対照サンプルのバイオマーカー・シグネチャーを判定する工程;
ここで、工程(b)において測定された1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現が、工程(d)において測定された1つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現とは異なる場合、膵臓癌の存在が確認される。
e)膵臓癌に罹患している個体由来の対照サンプル(即ち、陽性対照)を提供する工程;
f)工程(b)において測定された1つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現を測定することによって対照サンプルのバイオマーカー・シグネチャーを判定する工程;
ここで、工程(b)において測定された1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現が、工程(f)において測定された1つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現に相当する場合、膵臓癌の存在が確認される。
(i)プロリンは、その側鎖がα炭素並びに窒素の双方へ結合するので、ペプチド構造を安定化させることができる;
(ii)フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンは、芳香族側鎖を有し高度に疎水性であり、一方、ロイシン及びイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、同様に疎水性である;
(iii)リジン、アルギニン及びヒスチジンは塩基性側鎖を有し、中性pHでは正に荷電しており、一方、アスパラギン酸及びグルタミン酸は酸性側鎖を有し、中性pHでは負に荷電している;
(iv)アスパラギン及びグルタミンは中性pHでは中性であるが、水素結合に関与することができるアミド基を含む;
(v)セリン、スレオニン及びチロシンの側鎖は水素結合に関与することができるヒドロキシル基を含む。
(i)サンプル中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識する工程;
(ii)ビオチン標識タンパク質と、その表面上の別個の位置に固定化された複数のscFvを含むアレイとを接触させる工程であって、scFvが表III中のタンパク質の1つ又はそれ以上について特異性を有する工程;
(iii)固定化scFvと、蛍光色素を含むストレプトアビジン結合体とを接触させる工程;及び
(iv)アレイ表面上の別個の位置での色素の存在を検出する工程
ここで、アレイ表面上の色素の発現は、サンプル中における表IIIからのバイオマーカーの発現を示す。
A)本発明の第1局面に従う1つ又はそれ以上の第1結合剤又は本発明の第2局面に従うアレイ;及び
B)本発明の第1局面に従う方法を行うための説明書
を含む膵臓癌の存在を決定するためのキットを提供する。
血清サンプル
血清サンプルを診断時に、即ち、いかなる治療をも開始する前に、2つの独立した患者コホートから収集し、−80℃で保存した。第1コホートにおいて、膵臓癌(PaC)(n=34)、慢性膵炎(ChP)(n=16)、自己免疫性膵炎(AIP)(n=23)、又は健康な個体(N)(n=30)(臨床症状無し)と診断された、103人の患者由来の血清サンプルをスクリーニングした。患者デモグラフィックを表1に示す。このコホートを無作為に分割し、トレーニングセット及びテストセットとして使用した。PaC(n=25)、又はN(n=20)と診断された45人の患者から構成された、第2コホート(患者デモグラフィックについては、非特許文献14を参照のこと)を、最近収集された抗体マイクロアレイデータ(非特許文献14)を使用して、独立したテストセットとしてのみ使用した。サンプルコホートのサイズは、診断時に収集された十分にキャラクタライズされた血清サンプルの入手可能性によって限定された。
組み換え抗体マイクロアレイ解析を、以前にインハウスで最適化されたプロトコル(非特許文献12〜15)(下記参照)を使用して行った。簡潔には、57個の主に免疫調節性の被分析物を標的とする、121個のヒト組み換え一本鎖Fv(scFv)抗体をプローブとして使用した。ファージディスプレイ由来のscFv(非特許文献16)の特異性、親和性(nM範囲)、及びオンチップ機能性を、i)ストリンジェント選択プロトコル(非特許文献16)、ii)1標的被分析物当たり複数のクローン(≦4)、及びiii)分子設計によって適合されたscFvライブラリーマイクロアレイ(REF)を使用することによって保証した。平面抗体マイクロアレイ(アレイサイズ;160x8,<0.5 cm2)を、非接触型ディスペンサーを使用して抗体及び対照を一つずつ(330pL/液滴)分配することによって作製した。ビオチン化血清サンプルを別々にスクリーニングし、特異的に結合された被分析物を、共焦点蛍光スキャナーを使用して蛍光標識ストレプトアビジンを添加することによって視覚化した。各個々のアレイデータポイントは、4つのレプリケートの平均値を示す。セミグローバル正規化アプローチ(semi−global normalization approach)を使用して、チップ間(chip−to−chip)正規化を行った。以前の研究によれば(非特許文献12、15、17)、スポット間(spot−to−spot)再現性及びアレイ間(array−to−array)再現性についての相関係数は、それぞれ0.99及び0.94であった。選択された抗体特異性及びマイクロアレイデータを、それぞれ、234ヒトタンパク質アレイ及び10−plexサイトカインサンドイッチ抗体マイクロアレイを使用して、検証した(表II)。さらに、ELISA、タンパク質アレイ、ブロッキング/スパイキング実験、及び/又は質量分析を使用して、いくつかの抗体特異性を前もって検証した(表II)。
データ解析をR(下記参照)において行った。簡潔には、サポート・ベクター・マシン(SVM)を用い、1に設定されたコンストレイント(constraint)のコストで線形カーネルを使用して、2つの規定の群(例えば、癌対健康)の一方に属するとしてサンプルを分類した。オーバーフィッティングのリスクを回避するために、それを調整する試みはしなかった。リーブ・ワン・アウト(LOO)交差検証手順(leave−one−out(LOO) cross validation procedure)を使用して、SVMをトレーニング及びテストした。比較の2つにおいて、このトレーニング部分は、トレーニングセットにおいて最大識別力を示した抗体を選択することによる、抗体サブパネルの作製を含んだ。直接又は交差検証変数減少(backward elimination)戦略のいずれかを使用して、この抗体選択を行った。このアプローチを使用して、縮小候補バイオマーカー・シグネチャーを同定し、続いて独立したテストセットについて評価した。
インフォームド・コンセント後、血清サンプルを診断時に、即ち、治療の開始前に、2つの独立した患者コホートから収集し、−80℃で保存した。PCを組織学によって確認した。患者コホート1は、膵管腺癌(PaC)(n=34)、慢性膵炎(hCP)(n=16)、自己免疫性膵炎(AIP)(n=23)、又は健康な個体(対照;N)(n=30)(臨床症状無し)と診断された、103人の患者(Mannheim University Hospital,Germany)由来の血清サンプルから構成された。患者デモグラフィックを表1に示す。このコホートを無作為にさらに分割し、トレーニングセット(サンプルの3分の2)及びテストセット(3分の1)として使用した。患者コホート2は、PaC(n=25)、又はN(n=20)と診断された45人の患者(Stockholm South General Hospital and Lund University Hospital,Sweden)(患者デモグラフィックについては、非特許文献39を参照のこと)から構成され、最近記載された抗体マイクロアレイデータ(非特許文献39)を使用して採用した。サンプルコホートのサイズが>80%の統計的検出力を提供するために十分であることを確認するために、検出力分析(下記参照)を行った。主要な実験を患者コホート1において行い、一方、コホート2は一実験における検証のための独立したデータセットとして使用した(図5を参照のこと)。
血清プロテオームについての以前に最適化された標識プロトコル(非特許文献39〜43)を使用して、血清サンプルを標識した。簡潔には、粗製血清サンプルを氷上で解凍し、30μLアリコートを遠心分離した(4℃で20分間16000 x g)。上澄み5μLをPBSにおいて45倍に希釈し、およそ2mg/mLのタンパク質濃度が得られた。20分毎に穏やかに撹拌しながら氷上で2時間、0.6 mMの最終濃度にて、サンプルをEZ−link(登録商標)Sulfo−NHS−LC−Biotin(Pierce,Rockford,IL,USA)で標識した。3.5 kDa MWカットオフ 透析ユニット(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)を使用して4℃で72時間PBSに対して透析することによって、遊離ビオチンを除去した。サンプルを等分し、−20℃で保存した。
57個の主に免疫調節性の生体分子を標的とする、合計で121個のヒト組み換え一本鎖Fv(scFv)抗体フラグメントを、n−CoDeRライブラリー(非特許文献43)から選択し、これらは、親切にもBioInvent International AB,Lund,Swedenによって提供されたか、又はMats Ohlin教授(Lund University,Sweden)(ムチン−1に対する5つのクローン)によって提供された。ファージディスプレイ由来のscFvの特異性、親和性(nM範囲)及びオンチップ機能性を、i)ストリンジェント選択プロトコル(非特許文献43)、ii)1標的分子当たり複数のクローン(≦4)、及びiii)分子設計によって適合されたscFvライブラリーマイクロアレイ(非特許文献44、45)を使用することによって保証した。抗体フラグメントを大腸菌培養物100mL中で産生し、Ni−NTAアガロース(Qiagen,Hilden,Germany)においてアフィニティー・クロマトグラフィーを使用して、発現上澄み又は細胞ペリプラズムのいずれかから精製した。結合された分子を250mMイミダゾールで溶出し、PBSに対して広範囲に透析し、マイクロアレイ作製のために使用するまで4℃で保存した。280nmでの吸光度を測定することによって、抗体濃度を測定した(平均500μg/mL、範囲50〜1840μg/mL)。
平面抗体マイクロアレイの作製のために、本発明者らは、以前に最適化され検証されたセットアップ(非特許文献39〜43、46)を使用した。簡潔には、圧電技術を使用して、液滴およそ330 pLを堆積させることにより、非接触型プリンター(BioChip Arrayer,PerkinElmer Life & Analytical Sciences,Wellesley,MA,USA)を使用して、scFvを黒色ポリマーMaxisorbマイクロアレイスライド(NUNC,Roskilde,Denmark)上へ配列した。第2液滴を分配する前に第1液滴を乾燥させて、2つの液滴を各位置にスポットした。1位置当たり平均して5 fmol抗体(範囲1.5〜25)を堆積した。適切な統計を保証し、いかなる局所的欠損をもなくすために、各プローブを8個のレプリケートでプリントした。8個の20 x 8サブアレイが配置されたスライドごとに、位置マーカー及び対照scFvを含む合計で160個のプローブをプリントした。定量化の間のグリッドアラインメントを助けるために、一列のAlexa647結合ストレプトアビジン(Invitrogen,Carlsband,CA,USA)(10μg/mL)を選択位置にスポットした。アレイを、一晩、PBS中の5%(w/v) 無脂肪粉ミルク(Semper AB,Sundbyberg,Sweden)においてブロックした。
2つの選択したscFv(抗IL−6(2)及び抗IL−10(1))の特異性を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って、RayBio(登録商標)278 Human Protein Array Gシリーズ(Norcross,GA,USA)を使用してテストした。scFvをビオチン3.5倍モル過剰で氷上にて2時間EZ−link(登録商標)Sulfo−NHS−LC−Biotin(Pierce)で標識した。未結合ビオチンをPBSに対する72時間の透析によって除去した。合計で5μgの抗体を各アレイへ添加した。1μg/mL Alexa647結合ストレプトアビジン(Invitrogen)を使用して、結合を検出した。PBSを陰性対照として1つのアレイへ添加し、ストレプトアビジンの非特異的結合を調べた。アレイをスキャンし、陰性対照アレイからのシグナルを差し引いた。さらに、十分にキャラクタライズされた標準化血清サンプル、及び独立した方法、例えば、質量分析、ELISA、MSD、及びCBAを使用して、並びにスパイキング及びブロッキング実験(表II)を使用して、いくつかの抗体特異性を前もって検証した。
ヒトTh1/Th2 10−plex MSD(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD,USA)アッセイを、抗体マイクロアレイ結果を検証しようとして行った。MSD 96−プレートの各ウェルを、空間的に別箇の電極スポットにおいて、IFN−γ、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−8、IL−10、IL−12p70、IL−13及びTNF−αに対する抗体でプレ官能化した。11個のPaC、11個の健康、9個のChP及び3個のAIPサンプル(AIPサンプルの数が少ないことは、そのサブグループにおけるサンプル量が限られていたためであった)を含む、合計34個の血清サンプル(未希釈)を分析した。アッセイを製造業者によって提供されたプロトコルに従って実行し、電気化学発光に基づく読み出しをMSD SECTOR(登録商標)機器において行った。
全ての統計及びデータ解析をR(http://www.r−project.org)において行った。簡潔には、サポート・ベクター・マシン(SVM)を用い、1に設定されたコンストレイントのコストで線形カーネルを使用して、2つの規定の群(例えば、癌対健康)の一方に属するとしてサンプルを分類した。オーバーフィッティングのリスクを回避するために、それを調整する試みはしなかった。リーブ・ワン・アウト(LOO)交差検証手順(非特許文献42)を使用して、SVMをトレーニング及びテストした。比較の2つにおいて、このトレーニング部分は、トレーニングセットにおいて最大識別力を示した抗体を選択することによる、抗体サブパネルの作製を含んだ。直接又は交差検証変数減少戦略のいずれかを使用して、この抗体選択を行った。このアプローチを使用して、縮小候補バイオマーカー・シグネチャーを同定し、続いて独立したテストセットについて評価した。
PaC個体と健康な個体とを識別するためのバイオマーカー・シグネチャーを同定するために、変数減少手順(backward elimination procedure)を使用した。このアプローチにおいて、その時点で1つのサンプルをデータセットから除外した。その時点で1つの抗体を除外し、残りの抗体を使用して分類を行うことによって、残りのサンプルをSVMのトレーニングのために使用した。全ての抗体をいったん除外した場合に、最も少ない情報を与える抗体を、最小のKullback−Leibler(KL)誤差が分類について得られた場合に除外されたものと定義し、データセットから除いた。たった1つの抗体が残されるまでLOO手順を反復し、抗体が除かれた順序を記録した。新しいサンプルを除外することによって手順を繰り返し、全サンプルがいったん除外されるまで、反復を継続した。抗体が除かれた順序のリストを、サンプルが除外された各時点について作製した。最後に、全サンプルをいったん除外し、コンセンサスリストを作製し、ここで、各抗体には、行われた全ての反復にわたって平均化された、それがどれぐらい長く変数減少プロセスを耐えたかに基づくスコアが割り当てられた。プロセスの全体にわたって、各々の除外サンプルを使用し、各々の新しい長さの抗体サブパネルについて構築されたSVMモデルをテストし、性能に対応する決定値が返された。従って、任意の所定のサブパネル長さについての全サンプルのための決定値を収集した。対応のROC面積を、データセットの能力及び変数減少戦略を評価するための手段として、抗体の数に対してプロットした。18個の被分析物の縮小シグネチャーをコンセンサスリストから選択し、25個のPaC及び20個のN血清サンプルの抗体マイクロアレイ解析からの独立したデータセット(非特許文献39)を、候補シグネチャーのプレ検証のためのテストセットとして使用した。シグネチャー被分析物をテストセットにおけるSVM LOO交差検証手順において使用し、PaCとNとを識別するシグネチャーの能力をROC曲線で示した。
PaC対健康な対照の分類
PaCと関連する血清バイオマーカー・シグネチャーを同定するために、本発明者らは、第1患者コホートを使用して、PaC(n=34)対N(n=30)の示差的血清タンパク質発現プロファイリングを行った。抗体マイクロアレイの代表的な画像を図1Aに示し、これは、動的なシグナル強度、適切なスポット形態及び低い非特異的バックグラウンド結合が得られたことを示している。結果は、例えばTh1及びTh2サイトカインの両方を含む、33個の非重複タンパク質被分析物が、示差的に発現された(p<0.05)ことが分かり、補体タンパク質C1q及びプロペルジンを除いて、これらの全てがPaCにおいてアップレギュレートされたことを示した(図1B)。
第1患者コホート(n=64)に由来する分類の能力をテストするために、本発明者らは、本発明者らのLOO手順と反復変数減少戦略とを組み合わせることによって、大部分が分類に寄与する18非重複バイオマーカーへ被分析物の総数を先ず縮小した。このプロセスにおいて、Kullback−Leiblerダイバージェンス誤差を最小化し、一つずつの抗体の段階的削除のためのガイドとして使用した。各回の後に、SVM決定値を収集し、対応のROC曲線及びAUC値を計算した。図2Aにおいて、AUC値が残っている抗体の数に対してプロットされており、これは、ごく僅かな抗体が含まれた場合でさえ、高度でかつ安定した分類を示している。様々な被分析物、例えば、サイトカイン、補体タンパク質及び酵素から構成される、18−被分析物縮小候補血清バイオマーカー・シグネチャーを図2Bに示す。次に、本発明者らは、新たな独立したテスト群である第2患者コホート(n=45)に対してこの18−被分析物クラシファイヤーを適用した(図2C)。結果は、クラシファイヤーが、感度88%及び特異性85%に対応する、0.95のROC AUC値(図2D)でPaC対Nへの患者の階層化を可能にしたことを示した。従って、データは、PaC診断についての第1プレ検証血清バイオマーカー・シグネチャーをアウトラインした。
癌が膵臓における良性症状と識別することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、第1患者コホートを使用して、PaC(n=34)の血清タンパク質発現プロフィールとChP(n=16)又はAIP(n=23)のそれとを比較した。PaC対ChPの場合、15個の非重複の示差的に発現された(p<0.05)血清被分析物が特定され、これらのうち2つ(IL−4及びIL−12)を除いて全てがPaCにおいてアップレギュレートされた(図3A)。生データに基づいて、結果は、PaC及びChPが、97%感度及び69%特異性に対応する、0.86のROC AUC値(図3B)で識別され得たことを示した。合計49個の非重複血清被分析物が、PaC対AIPにおいて示差的に発現されることが分かり、C1q及びプロペルジンを除いて全てがPaCにおいてアップレギュレートされた(図3A)。再び、生データに基づいて、結果は、PaC対AIPが、それぞれ、97%及び91%の感度及び特異性に基づいて、0.99のROC値(図3B)で分類され得たことを示した。
PaC、N、ChP及びAIPを含む全第1患者コホート(n=103)の分類の能力をテストするために、本発明者らは、コホートをトレーニングセット(3分の2)及びテストセット(3分の1)に分割した(図4A)。次に、大部分がトレーニングセットにおける分類に寄与する25個の非重複被分析物から構成された縮小血清バイオマーカー・シグネチャーを、直接的な反復変数減少戦略を使用することによって解読した。例えばサイトカイン及び補体タンパク質から構成される25−被分析物縮小バイオマーカー・シグネチャーを図4Bに示す。次に、本発明者らは、独立したテストセットにおいてこの25−被分析物クラシファイヤーを適用した(図4C)。データは、PaCが、それぞれ、73%及び75%の感度及び特異性をアウトラインする、0.88のROC AUC値(図4C)で特定され得たことを示した。
本研究において、免疫系の診断力を利用してPaCを標的化するために、本発明者らはアフィニティープロテオミクスを適用した。本発明者らは、免疫系は、疾患に由来する個体の健康状態の変化に非常に敏感であるという考えに本発明者らのアプローチの基礎を置き、特に免疫調節性の被分析物の、レベルの変動によるこれらの変化を記録した。この目的のために、本発明者らは、これらの種の重要な調節性の血清被分析物を主に標的化するように本発明者らの抗体マイクロアレイを設計した。データは、高い診断力を示すPaC関連候補バイオマーカー・シグネチャーが解明され(de−convolute)得たことを示した。同様に、このアフィニティープロテオミックアプローチは、他の癌適応症と健康な対照とを識別するいくつかの血清学的バイオマーカー・シグネチャーの同定を最近可能にし(非特許文献14〜15、17、19)、このことはプラットフォームの能力をさらに実証している。
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IL−7+インテグリンα−10+BTK+C1q+IgM+IL−9+プロカテプシンW+プロペルジン+TMペプチド+b−ガラクトシダーゼ。
Claims (20)
- 試験サンプルのバイオマーカー・シグネチャーに基づいて個体内における膵臓癌の存在を決定するための方法であって、以下:
a)個体由来の試験すべきサンプルを備える工程;
b)表IV(A)及び/又は表IV(B)に列挙されるバイオマーカーから選択される2つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を判定することによって試験サンプルのバイオマーカー・シグネチャーを判定する工程;
を含み又はからなり、
ここで、表IV(A)及び/又は表IV(B)に列挙されるバイオマーカーから選択される2つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現は、膵臓癌を有する個体を示す、方法。 - 以下:
c)膵臓癌に罹患していない個体由来の対照サンプルを備える工程;
d)工程(b)において測定された2つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現を測定することによって対照サンプルのバイオマーカー・シグネチャーを判定する工程;
をさらに含み又はからなり、
ここで、工程(b)において測定された2つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現が、工程(d)において測定された2つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現とは異なる場合、膵臓癌の存在が確認される、請求項1に記載の方法。 - 以下:
e)膵臓癌に罹患している個体由来の対照サンプルを備える工程;
f)工程(b)において測定された2つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現を測定することによって対照サンプルのバイオマーカー・シグネチャーを判定する工程;
をさらに含み又はからなり、
ここで、工程(b)において測定された2つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サン
プル中における発現が、工程(f)において測定された2つ又はそれ以上のバイオマーカーの対照サンプル中における発現に相当する場合、膵臓癌の存在が確認される、請求項1又は2に記載の方法。 - 工程(b)が、表IV(A)に列挙されるバイオマーカーの1つ又はそれ以上の発現を測定することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、表IV(B)に列挙されるバイオマーカーの1つ又はそれ以上の発現を測定することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、表IV(C)に列挙されるバイオマーカーからの1つ又はそれ以上のバイオマーカーの発現を測定することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 方法が、膵臓癌(PaC)と任意の他の疾患状態とを識別するためのものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、表V(A)に列挙されるバイオマーカーからの1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を測定することをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 工程(b)が、表V(B)に列挙されるバイオマーカーからの1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を測定することをさらに含む、請求項7又は8に記載の方法。
- 工程(b)が、表V(C)に列挙されるバイオマーカーからの1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を測定することをさらに含む、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、表V(D)に列挙されるバイオマーカーからの1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を測定することをさらに含む、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、表V(F)に列挙されるバイオマーカーからの1つ又はそれ以上のバイオマーカーの試験サンプル中における発現を測定することをさらに含む、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)が、表V(A)、表V(B)、表V(C)、表V(D)及び/又は表V(F)に列挙されるバイオマーカーの全ての試験サンプル中における発現を測定することをさらに含む、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 他の疾患状態が、慢性膵炎(ChP)、急性炎症性膵炎(AIP)及び/又は正常である、請求項7〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)、(d)及び/又は工程(f)が、2つ又はそれ以上のバイオマーカーの1つへ結合することができる第1結合剤を使用して行われる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 第1結合剤が、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む又はからなる、請求項15に記載の方法。
- 工程(b)、(d)及び/又は(f)が、2つ又はそれ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定する工程を含み;及び、2つ又はそれ以上の結合性部分が、各々、核酸分子を含む又はからなる、請求項15又は16に記載の方法。
- 請求項15〜17のいずれか1項に定義される2つ又はそれ以上の結合剤を含む、個体内の膵臓癌の存在を決定するためのアレイ。
- 個体内の膵臓癌の存在を決定するための診断マーカーとしての、請求項1〜18のいずれか1項に定義される群より選択される2つ又はそれ以上のバイオマーカーの使用。
- A)請求項15〜17のいずれか1項に定義される2つ若しくはそれ以上の第1結合剤又は請求項18に記載のアレイ;
B)請求項1〜17のいずれか1項に定義される方法を行うための説明書;
を含む、膵臓癌の存在を決定するためのキット。
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