KR101658164B1 - 브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석 - Google Patents

브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석 Download PDF

Info

Publication number
KR101658164B1
KR101658164B1 KR1020140051045A KR20140051045A KR101658164B1 KR 101658164 B1 KR101658164 B1 KR 101658164B1 KR 1020140051045 A KR1020140051045 A KR 1020140051045A KR 20140051045 A KR20140051045 A KR 20140051045A KR 101658164 B1 KR101658164 B1 KR 101658164B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
free radical
tempo
present
radical initiator
Prior art date
Application number
KR1020140051045A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150124562A (ko
Inventor
오한빈
문봉진
남정주
Original Assignee
서강대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서강대학교산학협력단 filed Critical 서강대학교산학협력단
Priority to KR1020140051045A priority Critical patent/KR101658164B1/ko
Publication of KR20150124562A publication Critical patent/KR20150124562A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101658164B1 publication Critical patent/KR101658164B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/622—Ion mobility spectrometry
    • G01N27/623—Ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8868—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample elemental analysis, e.g. isotope dilution analysis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

본 발명은 펩타이드 서열 동정을 위한 신규한 자유 라디칼 개시제 및 이를 이용한 펩타이드 서열의 동정방법에 관한 것이다.
본 발명의 자유 라디칼 개시제는 벤젠 고리 내 브롬이 치환됨으로써 이온화 과정에서 생성되는 이온 절편들 중 C-말단 절편으로부터 N-말단 절편을 보다 용이하게 구분할 수 있도록 한다.
본 발명은 절편화 스펙트럼의 해석에서의 변수 및 복잡성을 크게 낮추어, 다른 분광학적 데이터 없이 질량 분광분석 결과만으로도 복잡한 구조의 분석대상 펩타이드의 드 노보 시퀀싱을 매우 용이하게 수행할 수 있도록 한다.

Description

브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석{Free Radical-Initiated Peptide Sequencing Mass Spectrometry Using Bromine Isotopic Signature}
본 발명은 자유 라디칼-개시제 화합물에 브롬을 치환하여 얻어지는 고유의 신호를 이용함으로써 보다 구체적인 서열정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
질량 분광분석법(mass spectrometry, MS)의 발전은 나노플로우(nanoflow) 크로마토그래피, 강화 테크닉(enrichment techniques), 동위원소 표지 등의 기술과 결합하여 복잡한 프로테옴의 종합적인 분석을 가능하게 한다[1-4]. 프로테옴 연구에 있어서의 가장 일반적인 접근은 단백질의 복합적인 혼합물을 단백질 분해효소, 일반적으로는 트립신을 이용하여 분해 펩타이드로 만든 후, 나노플로우 역상 크로마토그래피를 통해 펩타이드를 분리하고, 탠덤 질량 분석법(tandem mass spectrometry)에 적용하는 것이다. 수득한 탠덤 질량 분석 데이터의 분석은 대개 다양한 검색엔진(예를 들어 SEQUEST[6], MASCOT[7], X!TANDEM[8] 또는 OMSSA[9])을 이용한 데이터베이스-기반 해석을 통해 이루어진다.
단백질의 동정 및 특성 분석은 단백질 서열 데이터베이스의 존재 하에서 이루어질 수 있다. 그러나, 데이터베이스를 이용할 수 없거나 자료가 부정확할 경우, 분석 대상 단백질에 예상치 못한 변형이 일어나며, 또는 스플라이싱 단백질 이성질체가 존재할 경우, 단백질의 동정은 제한된다.
이러한 경우, 실험적 절편 스펙트럼에 기반한 드 노보 시퀀싱이 이런 제한을 회피하는 데 도움이 될 수 있다[5,10,11]. 드 노보 시퀀싱에 있어, 탠덤 질량 스펙트럼 상의 연속된 피크 사이의 질량의 차이를 취합하여 펩타이드를 동정한다. 따라서, 펩타이드 백본 절편의 피크가 길고 연속되는지 및 절편 피크의 질량이 정확한지 여부가 성공적인 드 노보 시퀀싱을 위한 관건이 된다[10-15]. 전자포획/전달 분해(electron capture/transfe dissociation, ECD/ETD)[16,17]와 같은 최근 개발된 탠덤 질량 분석 기술은 연속적인 서열 정보를 제공함에 있어서 펩타이드의 충돌활성/유도 분해(collisionally activated/induced dissociation, CAD/CID) 방법을 보완한다[18-21]. 그러나, 절편화 신호가 보다 복잡해지는 것이 펩타이드 동정에 항상 유용한 것은 아니다. 절편 피크의 래더링(laddering)은 N- 또는 C-말단 절편 피크가 동시에 존재할 때 모호해진다[5]. 절편 스펙트럼의 복잡성은 안정적인 동위원소 표지를 포함하는 화학적 표지 방법에 의해 완화될 수 있다. 예를 들어, C-말단에 18O를 삽입하는 경우 CAD/CID 스펙트럼에서 y-형 이온을 선택적으로 동정할 수 있게 되어 절편 피크의 특이적인 래더링에 유용하다. 또 다른 주목할 만한 예는 C-말단에 특징적으로 왜곡된 동위원소 표지 패턴을 포함시키는 것이다[5]. H2 16O 및 H2 18O 혼합용액에서 단백질을 분해할 경우 독특하게 왜곡된 동위원소 패턴(동위원소 패턴에서 +2Da 신호가 증가된다)을 가지는 y-형 이온이 생성된다[5,23-27].
H4/D4-니코티닐-N-하이드록시숙시니미드[28], D4-라이신[29], H2/D2-포름알데히드[30] 및 N-말단 H3/D3-아세틸레이션[31]을 이용한 N- 또는 C-말단에의 중수소 표지는 드 노보 시퀀싱을 용이하게 한다[5]. 아울러, 메탈로엔도펩티다아제 Lys-N[32]를 사용하면서 차별적인 13C 동위원소 디메틸 표지를 할 경우 C-말단 절편 또는 내부 절편으로부터 N-말단 절편을 확실하게 구분할 수 있다[33].
펩타이드 절현 스펙트럼을 단순화하기 위해 펩타이드 N-말단의 황산화(sulfonation)가 도입되었으며, 이를 통해 C-말단 절편, 예를 들어 y -(CAD/CID)형 또는 z -(ETD)형 이온 만이 특징적으로 검출된다. 나아가, 드 노보 시퀀싱을 위해 N-[38-41] 또는 C-말단[42,43] 분해 펩타이드의 선택적인 복구가 연구된 바 있다.
최근, 상술한 ECD 및 ETD 등의 전자-기반 탠덤 질량분석 방법은 양성자화된 부위 및 전자의 조합을 통해 형성된 라디칼 부위가 광범위한 펩타이드/단백질 백본 분해를 유도할 수 있음을 보여주었다[16-19,44,45].
펩타이드 시퀀싱에 있어서의 라디칼 사이트의 중요성을 인식함으로 인해 다양한 라디칼 기반 질량 분광분석 방법이 개발될 수 있었다[46-65]. 금속-펩타이드-리간드 삼중 복합체의 충돌 활성화를 통해 펩타이드 라디칼 양이온이 수득된다는 사실이 밝혀졌다[46-50]. 또한 자유 라디칼 개시제가 펩타이드와 공유결합을 통해 접합될 경우 충돌 활성화에 의해 라디칼 사이트가 생성된다는 사실도 밝혀졌다. 연속적인 활성화를 통해, a / x - 또는 c / z -형 펩타이드 백본 분해가 주요 절편화 기작으로 일어나며, 이것이 이른바 자유 라디칼 개시 펩타이드 시퀀싱(free radical initiated peptide 시퀀싱, FRIPS)이다. 대표적인 자유 라디칼 개시제는 퍼옥시카바메이트[51], 아조 모이어티[52], 트립토판 및 시스테인 포함 펩타이드의 N- 또는 S-니트로조-유도체이다[53-57], 및 [(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실)메틸]벤조익 애시드(TEMPO-Bz)기이다[58-62]. 특히, 본 발명에서는 N-말단 위치에서의 라디칼 개시 모티프로서 o-TEMPO-Bz-기가 사용되었다.
불안정한 NO-C 결합의 열 활성화(Thermal activation)는 균일분해(homolytic cleavage)를 야기하여 다양한 펩타이드 상의 벤질릭 라디칼 및 니트록실 라디칼을 생성한다. 이러한 균일분해는 펩타이드 백본 분해에 유리한데, 이는 이탈된 TEMPO 기의 니트록실 라디칼의 놀라운 열화학적 안정성 때문이다[58,63].
본 발명자들은 o-TEMPO-Bz-접합기를 이용한 FRIPS 방법과 특유의 더블릿 브롬 동위원소 신호를 통합하여 드 노보 펩타이드 시퀀싱을 용이하게 수행하고자 하였다. o-TEMPO-Bz-접합기의 벤젠 고리에 삽입한 브롬은 C-말단 절편 또는 가능한 내부 절편으로부터 N-말단 절편을 쉽게 구분할 수 있도록 해준다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 펩타이드 서열의 동정에 있어서, 종래의 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱(free radical-initiated peptide sequencing, FRIPS) 방법을 보다 효율적으로 개선하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, TEMPO-이용 FRIPS(o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-NHS)에서 o-TEMPO-Bz-C(O)-NHS 의 벤젠 고리 내에 브롬을 치환시킬 경우 브롬에 의해 발생하는 더블릿 동위원소 신호를 바탕으로 C-말단 절편으로부터 N-말단 절편이 보다 용이하게 구분할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 펩타이드 서열 동정을 위한 자유 라디칼 개시제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드 서열의 동정방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 펩타이드 서열 동정을 위한 자유 라디칼 개시제를 제공한다:
화학식 1
Figure 112014040681817-pat00001
상기 화학식에서 R1은 C1-C4 알킬렌이고, R2는 브로모 C6-C10 아릴이며, R3는 2,5-디옥소-1-피롤리디닐옥시, 2,5-디옥소-3-설포닐-1-피롤리디닐옥시, 2,3,4,5,6-펜타플루오로페녹시, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페녹시, 할라이드 또는 아자이드이다.
본 발명자들은 펩타이드 서열의 동정에 있어서, 종래의 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱(free radical-initiated peptide sequencing, FRIPS) 방법을 보다 효율적으로 개선하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, TEMPO-이용 FRIPS(o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-NHS)에서 o-TEMPO-Bz-C(O)-NHS 의 벤젠 고리 내에 브롬을 치환시킬 경우 브롬에 의해 발생하는 더블릿 동위원소 신호를 바탕으로 C-말단 절편으로부터 N-말단 절편이 보다 용이하게 구분할 수 있다는 사실을 발견하였다.
펩타이드 시퀀싱에 있어서, 이온 절편들의 질량 측정(mass spectrometry)은 분석대상 분자의 구조를 파악하는 데에 유용한 정보를 제공하기는 하나, 단순히 분리된 절편들의 분자량을 알려주는 데에 그쳐 복잡한 구조의 분자일수록 정확한 결합 순서, 특징적 작용기의 존재 및 구체적인 입체화학 등을 파악하기 위해서는 핵자기공명(NMR) 및 자외선(IR) 스펙트럼 등의 분석결과가 추가로 필요한 경우가 많았다.
할로겐 원소인 브롬은 평균 분자량이 79.90이나, 79Br(50.7%) 및 81Br(49.3%)의 두 가지 동위원소가 자연계에 비슷한 빈도로 존재하여 분석 대상 분자에 Br이 포함되어 있을 경우 분광광도 분석에서 특유의 더블릿 피크가 나타난다. 본 발명자들은 이러한 브롬의 특성을 이용, 자유 라디칼 개시제로 사용되는 화합물의 벤젠 고리에 브롬을 치환함으로써 상기 자유 라디칼 개시제가 접합되는 분석대상 펩타이드의 N-말단에 특징적인 신호를 포착, C-말단 절편과 N-말단 절편을 보다 용이하게 구별함으로써 절편화 스펙트럼의 해석에서의 변수 및 복잡성을 크게 낮추고, 궁극적으로 펩타이드의 드 노보 시퀀싱을 매우 용이하게 수행할 수 있도록 하였다.
본 명세서에서 용어“자유 라디칼 개시제(free radical initiator)”는 분석하고자 하는 유기 중합체 분자(예를 들어 폴리펩타이드)의 서열을 동정하기 위하여 상기 분자의 균일 분해(homolytic cleavage)를 유도, 자유 라디칼 생성을 촉매하는 물질을 의미한다. 본 발명의 화합물은 충돌 활성화에 의하여 펩타이드와 균일 분해를 일으키면서 TEMPO(2,2,6,6-tetramethy lpiperidine-1-oxyl)기가 이탈되어 홑전자를 가진 펩타이드 라디칼을 생성하며, 생성된 펩타이드 라디칼은 분자 구조에 따라 특유의 절편화가 이루어지고, 상기 절편들의 분자량을 일반적인 질량분석 기술을 통해 분석함으로써 펩타이드의 서열을 동정할 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물을 정의함에 있어서, 용어“알킬렌”은 직쇄 또는 분쇄의 탄화수소기에서 유래한 2가의 포화 지방족 라디칼을 의미하며, 예를 들어, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 이소부틸렌 등을 포함한다. C1-C4 알킬렌은 탄소수 1 내지 4의 알킬렌 유니트를 의미하며, C1-C4 알킬렌이 치환된 경우 알킬기 이외의 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명에서 용어“알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 펜틸 또는 헥실 등을 포함한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물을 정의함에 있어서, 용어“아릴”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화되고 방향성(aromaticity)를 가지는 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미한다. C6-C10 아릴은 탄소수 6 내지 10의 방향성 고리를 의미하며, C6-C10 아릴이 치환된 클릭 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물을 정의함에 있어서, 용어“브로모 아릴”은 브롬(Br)으로 치환된 아릴기를 의미한다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 화합물과 분석하고자 하는 펩타이드 간의 컨쥬게이션 반응은 친핵성 치환반응이므로, 본 발명의 화학식 1의 R3는 친핵체가 카르보닐기와 반응할 시 다시 카르보닐기의 탄소-산소 간 이중결합이 잘 회복되도록 이탈될 수 있는 작용기여야 한다. 따라서, R3는 친핵성 치환반응의 좋은 이탈기(good leaving group)라면 제한없이 사용될 수 있으며, 구체적으로는 2,5-디옥소-1-피롤리디닐옥시, 2,5-디옥소-3-설포닐-1-피롤리디닐옥시, 2,3,4,5,6-펜타플루오로페녹시, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페녹시, 할라이드 또는 아자이드이고, 가장 구체적으로는 2,5-디옥소-1-피롤리디닐옥시이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1은 메틸렌, 메틸 메틸렌, 디메틸 메틸렌, 에틸메틸렌 또는 메틸 에틸 메틸렌이다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 자유 라디칼 개지제는 균일분해로 인한 TEMPO기의 이탈을 통해 홑전자(자유 라디칼)가 형성됨으로서 펩타이드가 절편화되도록 한다. 따라서, 형성되는 자유라디칼은 공명(resonance)을 통해 안정해지는 것이 바람직하므로, 벤젠 고리와 컨쥬게이션을 통해 공명을 형성할 수 있는 벤질릭 라디칼(benzylic radical)이 형성되어야 한다. 따라서, 본 발명의 화학식 1의 R1은 TEMPO기의 이탈을 통해 벤질릭 라디칼을 형성할 수 있는 메틸렌, 메틸 메틸렌, 디메틸 메틸렌, 에틸메틸렌 또는 메틸 에틸 메틸렌이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R2는 브로모 페닐이다. 보다 구체적으로는, 상기 화학식 1의 R2는
Figure 112014040681817-pat00002
또는
Figure 112014040681817-pat00003
이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물이다:
화학식 2 화학식 3
Figure 112014040681817-pat00004
Figure 112014040681817-pat00005

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 펩타이드 서열의 동정방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 자유 라디칼 개시제를 분석 대상 펩타이드와 컨쥬게이션하는 단계;
(b) 상기 컨쥬게이션된 펩타이드를 충돌 활성화(collisional activation)시켜 라디칼 종을 포함하는 분자 이온 단편을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 이온 단편의 질량을 분석하는 단계.
본 발명에서 이용되는 자유 라디칼 개시제에 대해서는 상기에서 상세히 기술하였으므로, 명세서의 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 방법에 따라 펩타이드 서열을 동정하기 위해서는 상기 단계 (a)와 같이 본 발명의 화합물을 펩타이드와 컨쥬게이션 해야 한다. 본 발명의 화합물은 이후 충돌 활성화에 의하여 펩타이드와 균일 분해를 일으키면서 이탈되어, 홑전자를 가진 펩타이드 라디칼을 생성한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 본 발명의 화합물을 상기 분석 대상 펩타이드 N-말단의 아미노기 또는 라이신 잔기의 아민기에 컨쥬게이션함으로써 이루어진다.
컨쥬게이션 단계는 펩타이드의 아미노 또는 아민기 중 비공유 전자쌍을 가지는 질소원자가 친핵체가 되어 화학식 1의 카르보닐기와 반응함으로써 아마이드를 생성하는 가아민 반응(aminolysis)를 통해 이루어진다. 따라서, 펩타이드와 상기 화합물의 컨쥬게이션은 친핵성 치환반응을 잘 일어나도록 하는 어떠한 극성 유기 용매 하에서도 실시할 수 있으며, 예를 들어디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디클로로메탄, 디메틸설폭시드, 디메틸아세트아미드, 테트라하이드로퓨란 하에서 실시될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, 디메틸아세트아미드 하에서 실시할 수 있으며, 가장 구체적으로는 디메틸설폭시드 용매 하에서 실시할 수 있다. 반응 온도는 상온에서 실시하며, 30분 내지 1시간 동안 반응시키는 것이 가장 바람직하다.
이후, 상기 컨쥬게이션된 펩타이드로부터 충돌 활성화를 통해 자유 라디칼 종을 형성하고, 이들로부터 이온 절편들이 형성된다. TEMPO기의 균일분해를 통한 자유 라디칼 종의 형성과, 이로부터 이온 절편의 형성은 각각 별개의 충돌 활성화(1차 충돌 및 2차 충돌)로 이루어질 수도 있고 1회의 충돌 활성화를 통해 이루어질 수도 있다.
이온화 과정은 분석 물질을 질량 분석기 내부로 주입하는데 필수적인 과정으로, 내부 에너지의 전달 조건이 이온화 과정에서 가장 중요한 요소이다. 중성 분자의 이온화는 전자의 방출, 전자의 포획, 수소이온의 흡착, 수소이온의 탈착 또는 이온의 탈착을 통해 이루어진다. 이온화 방법의 종류로는 전자 이온화법(electron ionization, EI), 화학 이온화법(chemical ionization, CI), 고속 원자 충격법(fast atom bombardment, FAB), 열분무법(thermospray), 전기분무법(electrospray, ESI), 대기압 화학 이온화법(atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화법(matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI)이 있으며, 펩타이드의 서열 동정에 사용하는 분석법은 전자빔, 충돌활성분해법, 적외선 다광자 분해법, 및 자외선 레이저 조사법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)를 통해 형성되는 분자 이온 단편은 a-, c-, x-, z- 및 y-형 이온으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 기체 상(gas phase)에서 수행한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)-(c)는 질량분석기(mass spectrometer)에서 실시된다. 질량 분석기는 프로테오믹스에 많이 사용되는 화학적, 생물학적 실험기기로, 펩타이드와 같은 고분자 물질을 강한 전자빔, 충돌활성분해법, 적외선 다광자 분해법, 전자포획분해법, 전자전달분해법, 및 자외선 레이저 등으로 단편화시켜 각 이온 단편의 질량을 계산하여 고분자 물질을 동정한다. 질량분석기는 물질을 질량대 전하의 비(m/z)로 측정한다. 질량분석기의 중요한 특징은 질량 분석 상한선(upper mass limit), 투과 효율(transmission) 및 분해능(resolution)으로, 질량분석 상한선은 결정될 수 있는 질량 대 전하의 비(m/z ratio)에서 가장 높은 값을 의미하고, 투과 효율은 이온원으로부터 검출기에 도달하는 이온의 비율을 의미하며, 분해능은 작은 분자량의 차이로도 두 이온을 서로 다른 신호로 구분할 수 있는 능력을 의미한다.
이온원이 다양한 것처럼 질량분석기의 종류 또한 다양한데, 그 종류로는 사중극자 분석기(quadrupole analyzer), 이온 트랩 질량분석기(quadrupole ion trap), 이중 초점 자기 섹터 질량분석기(double-focusing magnetic sector), 비행시간차 질량분석기(time-of-flight mass spectrometer, TOFMS) 및 푸리에 변환 이온 싸이클로트론 공명 질량분석기(Fourier transform-ion cyclotron resonance)가 있다.
이온이 질량분석기에 의해 분리되어 신호를 만들면 이온검출기에서 이를 확인할 수 있다. 이온 검출기의 종류로는 전자 증배관(electron multiplier), 페러데이 컵(Faraday cup), 어레이 검출기(array detector) 및 포톤 증배관(photon multiplier)이 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 펩타이드 서열 동정을 위한 신규한 자유 라디칼 개시제 및 이를 이용한 펩타이드 서열의 동정방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 자유 라디칼 개시제는 벤젠 고리 내 브롬이 치환됨으로써 이온화 과정에서 생성되는 이온 절편들 중 C-말단 절편으로부터 N-말단 절편을 보다 용이하게 구분할 수 있도록 한다
(c) 본 발명은 절편화 스펙트럼의 해석에서의 변수 및 복잡성을 크게 낮추어, 다른 분광학적 데이터 없이 질량 분광분석 결과만으로도 복잡한 구조의 분석대상 펩타이드의 드 노보 시퀀싱을 매우 용이하게 수행할 수 있도록 한다.
도 1은 단일 양성자화된 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-키네텐신의 MS/MS(도 1a) 및 MS3 질량 스펙트럼(도 1b)를 각각 나타낸 그림이다. 줌-아웃 인셋은 Br 특이적인 더블릿 동위원소 패턴을 보여준다블릿 isotopic pattern. *: 미지정 피크.
도 2는 단일 양성자화된 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-안지오텐신 Ⅱ의 MS3 질량 스펙트럼을 나타낸 그림이다. 줌-아웃 인셋은 Br 특이적인 더블릿 동위원소 패턴을 보여준다. *: 미지정 피크.
도 3은 단일 양성자화된 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-뉴로텐신의 MS3 질량 스펙트럼을 나타낸 그림이다. 줌-아웃 인셋은 Br 특이적인 더블릿 동위원소 패턴을 보여준다. *: 미지정 피크.
도 4는 단일 양성자화된 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-브라디키닌의 MS3 질량 스펙트럼을 나타낸 그림이다. 줌-아웃 인셋은 Br 특이적인 더블릿 동위원소 패턴을 보여준다. *: 미지정 피크.
도 5는 단일 양성자화된 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-H-7405_펩타이드의 MS3 질량 스펙트럼을 나타낸 그림이다. 줌-아웃 인셋은 Br 특이적인 더블릿 동위원소 패턴을 보여준다. *: 미지정 피크.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-NHS의 합성
o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-NHS(2,5-디옥소피롤리딘-1-일-5-브로모-2-(((2, 2,6,6-테트라메틸피페리디-1-일)옥시)메틸)벤조에이트 또는 p-TEMPO-Bz(Br) -C(O)-NHS(2,5-디옥소피롤리딘-1-일-5-브로모-4-(((2,2,6,6-테트라메틸피페리디-1-일)옥시)메틸)벤조에이트의 구체적인 합성과정은 이하에서 기재하였다. 하기의 합성 모식도 및 제법은 예시적으로 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O) -NHS의 합성과정을 나타낸 것이며, p-TEMPO-Bz(Br)은 출발물질(하기 모식도의 2번 화합물, 5-브로모-2-메틸벤조익 애시드)을 5-브로모-4-메틸벤조익 애시드로 바꾸어 동일한 방법에 의해 합성될 수 있다.
Figure 112014040681817-pat00006

5-브로모-2-메틸벤조익 애시드 메틸 에스터 (3):
5-브로모-2-메틸벤조익 애시드(2)(500mg, 2.30 mmol), 디메틸 설페이트(440 mg, 3.49 mmol), 및 포타슘 카보네이트(1.29 g, 9.33 mmol)를 둥근바닥 플라스크에 넣고 아세톤으로 희석하였다. 수득한 현탄액을 아르곤과 함께 5분 간 정화한 뒤 혼합물을 2시간 동안 가열하여 환류시켰다. 반응 혼합물을 냉각하고 감압 하에서 농축시켜 아세톤을 제거하였다. 혼합물에 물을 추가한 뒤 용액을 CH2Cl2(30 mL X 3)로 추출하였다. 혼합 추출물을 브린(brine)으로 세척한 뒤, 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과한 뒤 진공에서 농축하였다. 수득물을 실리카 겔(Hex:EtOAc = 4:1)에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고형의 5-브로모-2-메틸-벤조익 애시드 메틸 에스터(496 mg, 94%)를 수득하였다.
Rf=0.7(Hex:EtOAc=4:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.04(d, J=2.0Hz, 1H), 7.51(dd, J=8.4 및2.4Hz, 1H), 7.12(d, J=2.4Hz, 1H), 3.90(s, 3H), 2.55(s, 3H).
2-브로모메틸-5-브로모벤조익애시드 메틸에스터(4):
5-브로모-2-메틸벤조익애시드 메틸에스터(3)(560 mg, 1.82 mmol), N-브로모숙신이미드(NBS)(358 mg, 2.01 mmol) 및 벤젠에 용해된 벤조일 퍼옥사이드(5 mg, 0.02 mmol)를 환류하에 밤새 교반하였다. 상온으로 냉각 후, 반응 혼합물을 물을 첨가하여 퀀칭하고 CH2Cl2(30 mL X 3)로 추출하였다. 혼합 추출물을 브린(brine)으로 세척한 뒤, 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과한 뒤 진공에서 농축하였다. 수득물을 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고형의 4번 화합물(476mg, 85%)을 수득하였다.
Rf=0.5(Hex:EtOAc= 1:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.11(s, 1H), 7.62(d, J=8.0Hz, 1H), 7.34(d, J=8.4Hz, 1H), 4.90(s, 2H), 3.95(s, 3H).
5-브로모-2-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-일옥시메틸)-벤조익애시드 메틸에스터(5):
쉬링크 플라스크에 2-브로모메틸-5-브로모벤조익애시드 메틸에스터(4)(550mg, 1.79mmol), TEMPO(306mg, 1.96mmol), Cu(OTf)2(6.9 mg, 0.019 mmol), 구리 분말(114 mg, 1.79 mmol), 4,4’-디노닐-2,2’-비피리딜(Nbpy, 29 mg, 0.071 mmol) 및 벤젠(15 mL)을 넣어주었다. 반응 혼합물을 끓는 아르곤으로 10분 간 탈기시키고 70℃에서 16시간 동안 가열하였다. 다시 상온으로 냉각시킨 뒤 EtOAc를 이용하여 짧은 실리카겔을 통해 여과하였다. 여과물은 진공에서 농축 후 잔기를 헥산:EtOAC를 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고형의 5번 화합물(468 mg, 68%)을 수득하였다.
Rf=0.6(Hex:EtOAc= 3:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.06(d, J=1.6Hz, 1H), 7.67(d, J=8.4Hz, 1H), 7.64(dd, J=8.4 및 2.0Hz, 1H), 5.15(s ,2H), 3.89(s, 3H), 1.48-1.47(brm, 4H), 1.36(brs, 1H), 1.33(brs, 1H), 1.16(s, 12H).
5-브로모-2-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일옥시메틸)벤조익애시드(6):
5-브로모-2-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일옥시메틸)벤조익애시드 메틸에스터(5)(1.19 g, 3.1 mmol)를 THF/메탄올(1:1, 10 mL)에 용해시켰다. 상온에서 상기 용액에 25% 액상 5 mL를 첨가하였다. 24시간 동안 교반 후, 반응 혼합물을 10% HCl 용액으로 산성화시키고 CH2Cl2(30mL X 3)으로 추출하였다. 혼합 추출물을 브린(brine)으로 세척한 뒤, 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과한 뒤 진공에서 농축하였다. 수득물을 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피(Hex:EtOAc=1:1, 10% MeOH)로 정제하여 흰색 고형의 5-브로모-2-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일옥시메틸)-벤조익애시드(6)(1.10 g, 96%)를 수득하였다.
Rf=0.6(Hex:EtOAc=1:1, 10% MeOH); 1H NMR (400MHz, CDCl3):δ8.05 (brs, 1H), 7.43(brs, 2H), 5.21(brs, 2H), 1.50-1.30(brm, 6H), 1.13(brs, 6H), 1.04(brs, 6H).
5- 브로모 -2-(2,2,6,6- 테트라메틸 -피페리딘-1- 일옥시메틸 )- 벤조익애시드 2,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스터(1, o - TEMPO - Bz ( Br )- NHS ) :
5-브로모-2-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-1-일옥시메틸)벤조익애시드(6)(1.06g, 2.87 mmol), N-하이드록시숙신이미드(330 mg, 2.87 mmol) 및 DMAP-TsOH(41 mg, 0.14 mmol)를 질소환경 하에서 건조된 CH2Cl2(10 mL)에 용해시켰다. CH2Cl2(2mL에 용해된 N,N’-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(710 mg, 3.44 mmol)를 0℃에서 천천히 첨가하였다. 12시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 농축하였다. 수득물을 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 흰색 고형의 목적 화합물(993 mg, 74%)를 수득하였다.
Rf=0.69(Hex:EtOAc = 1:1); 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.28(s, 1H), 7.79(s, 2H), 5.14(s, 2H), 2.91(s, 4H), 1.58-1.32(brm, 6H), 1.17(s, 6H), 1.15(s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ169.18, 160.31, 142.42, 137.46, 133.75, 129.15, 123.42, 120.38, 75.62, 60.13, 39.78, 32.99, 25.79, 20.59, 17.20.
o- TEMPO - Bz ( Br )-C(O)- NHS 와 펩타이드의 접합
o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-펩타이드를 제작하기 위하여, 아세토니트릴(20 μL)에 용해시킨 o-TEMPO-Bz (Br)-C(O)-NHS 용액(~0.2 mg)을 분석하고자 하는 펩타이드가 포함된 TEAB(트리에틸암모늄 비카보네이트) 완충액(1M, 20μL)에 첨가하였다. 합쳐진 용액을 볼텍싱 믹서로 1분 간 섞어주었다. 상온에서 6시간 뒤에, 용액을 질소기체와 함께 제거하고 잔기는 MS 분석에 사용되었다.
실험재료
안지오텐신 Ⅱ(DRVYIHPF) 및 브라디키닌 (RPPGFSPFR)는 Sigma(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 키네텐신(IARRHPYFL), 뉴로텐신(RRPYIL) 및 H-7405(GRGLSLSA, Bachem product code)는 Bachem(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 메탄올 및 HPLC 증류수는 Burdick & Jackson(Ulsan, Korea)에서 구입하였다.
질량 분광분석
모든 질량 분광분석 실험은 ESI(electrospray ionization) 양이온 모드에서 선형 이온포집질량분석기(LTQ-XL, Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. o-TEMPO-Bz(Br)-C(O) 펩타이드를 메탄올/물/아세트산(49:49:2, v/v/v)에 ~20μM농도로 용해시켜 시료용액을 제작하였으며, 3μL/min의 유속으로 질량 분광분석기에 직접 주입하였다. 질량 분광분석기의 파리미터는 다음과 같다: 피복기체 유속(sheath gas flow), 10(arb); 스프레이 전압, +5 kV; 캐필러리(capillary) 온도, 275℃; 캐필러리 전압, +35 V; 튜브 렌즈, +150 V. MS2 및 MS3 실험을 위해, 전구 이온(precursor ions)을 10m/z 분리 윈도우로 분리하고 표준화 충돌 에너지를 10-12(임의 단위)로 세팅하였다. 각각의 총 질량 및 텐덤 질량 분광 스펙트럼을 100 스캔 이상을 이용하여 기록하였다.
실험결과
Br -치환: FRIPS 질량 분광분석기 상에서의 용이한 드 노보 시퀀싱
본 발명자들은 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)기가 접합된 모델 펩타이드(키네텐신, IARRHPYFL)에 대해 MS2 및 MS3 텐덤 질량 분광분석을 수행하였다. 먼저, o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-키네텐신 시료 용액의 전기분무(electro- spraying)로 전체 질량 스펙트럼을 수득하였다. 전체 질량 스펙트럼에서 가장 풍부한 피크는 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-키네텐신이 단일 양성자화된 피크[(RM+H)+]에 해당하는 m/z 1522.7인 것으로 밝혀졌다. (RM+H)+에서 아래첨자“R”은 키네텐신 펩타이드 N-말단에 o-TEMPO-Bz-C(O) 기가 접합되어 있음을 의미한다. 컨쥬게이션된 이온을 분리하여 MS2 및 MS3에 적용하였으며, 수득된 텐덤 질량 스펙트럼은 도 1a 및 1b에 각각 나타냈다.
도 1a는 15.0의 표준화 충돌 에너지(NCE)를 단일 양성자화된 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-키네텐신[(RM+H)+]에 가하여 얻어진 결과를 보여준다. 이전의 FRIPSMS 실험과 마찬가지로, o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-키네텐신 이온은 주로 TEMPO기의 산소 및 벤질릭 탄소 사이의 결합에서 균일 분해가 일어나 Bz(Br)-C(O)-키네텐신[(rM+H)+, atm/z=1366.6] 라디칼 절편을 생성하였다[58-62]. TEMPO와 벤질 라디칼을 생성하는 C-O 결합 분해의 기체상 자유에너지는 이론적으로 낮으면 G3(MP2)-RAD//B3LYP/6-31G(d)의 수준(예를 들어 108.7 kJ/mol)일 것으로 예측되었다. (rM+H)+에서 아래첨자“r”은 펩타이드 N-말단에 Bz-C(O)-모이어티가 존재함을 의미하며, 이 첨자는 이하 N-말단 펩타이드 백본 절편을 나타내는 데 사용하였다. MS2 스펙트럼에서 Bz(Br)-C(O)-키네텐신이 주로 생성된다는 것은 전기음성도가 높은 Br이 벤젠 고리에 포함되어도 벤질릭 탄소의 라디칼 생성 특성에 큰 영향을 미치지 않음을 말해준다.
도 1b는 Bz(Br)-C(O)-키네텐신 이온을 추가적으로 충돌 활성화한 결과를 보여준다. 이전의 FRIPSMS 실험과 마찬가지로, MS3 스펙트럼에서 많은 절편 피크가 관찰되었다[58-62]. 절편 피크의 분석을 통해 a -형 펩타이드 백본 절편이 주요 절편 형태임을 알 수 있었으며, 몇몇 b -, y - 및 z -형 절편도 관찰되었다. 일반적으로, a -, c -, x - 및 z -형 절편은 라디칼-매개 펩타이드 절편화 과정에서 만들어지는 전형적인 펩타이드 백본 절편으로 알려져 있다[44-50]. 관찰된 b - 및 y -형 절편은 소위 “mobile proton model”메카니즘을 통해 일어나는 양성자-보조 펩타이드 백본 절편화에 의해 만들어진다[67]. 본 발명자들은 이전의 연구에서 염기성 아르기닌 잔기가 펩타이드 내에 존재하여 단백질이 펩타이드 백본을 따라 충분히 이동 가능할 때 TEMPO-이용 FRIPS 방법에 의해 b - 및 y -형 이온도 생성될 수 있음을 밝혔다[61].
보다 중요하게, 도 1b에서 보여지는 스펙트럼의 줌-아웃 인셋(zoomed-out inset)에서 나타나듯이 많은 수의 절편이 Br 더블릿 동위원소 패턴을 보였다. 이러한 특징적인 Br 동위원소 패턴은 a -, b -, c -, 및 이들과 함께 나타나는 측쇄 이탈 피크와 같은 N-말단 절편을 C-말단 절편( x -, y -, z -, 및 이들과 함께 나타나는 측쇄 이탈 피크)과 쉽게 구분할 수 있도록 해준다. 절편들의 모양분석을 통해 13개의 N-말단 및 13개의 C-말단이 동정된 절편이 동정되었다.
몇몇의 a -형 절편[예를 들어 r a n +(n=3-8)]가 나타났으며, a -형 절편들은 IAR-R-H-PY-F-L 서열에 해당하는 m/z 간격을 보여주었다; 아미노산 잔기사이의 대시(-)는 텐덤 질량 스펙트럼(특히 FRIPS MS)에 의해 절단된 잔기 간의 결합을 나타낸다. 다른 N-말단 절편(예를 들어 r b -, r c -, 및 이들과 함께 나타나는 측쇄 이탈 피크)도 나타났는데, 이들 피크로 IAR-R-H-PY-F-L 서열을 확인할 수 있었다. 유사하게, Br 더블릿 패턴을 보이지 않는 많은 C-말단 절편들로 인하여 IARRHPYFL 서열의 존재를 확인할 수 있다. 나아가, x 8 + 및 x 7 +과 같은 C-말단 절편은 I-A-RRHPYFL와 같은 부가적인 서열정보를 제공하는데, 이는 N-말단 절편으로는 얻을 수 없는 정보이다.
종합적으로, 키네텐신의 완전한 서열 정보는 N- 및 C-말단 절편을 모두 고려하였을 때 수득할 수 있다. 종래의 TEMPO-이용 FRIPS MS 스펙트럼에서와 같이, 중성 작용기의 이탈에 따른 많은 수의 피크가 발생하였다[58-62]. m/ z1366.6 바로 아래의 소위 (M-X)+ 부위와 CO2(44 Da) 및 H2O(18 Da) 뿐아니라A rg(100 Da), His(83 Da) 및 Ile(또는 Leu)(57 Da)에서의 중성 작용기 이탈에 따른 Bz(Br)-C(O)-키네텐신( r M+H)+도 발견되었다[68, 69]. 이러한 측쇄 이탈은 서열 내 Arg, His 및 Ile(or Leu)가 존재함을 말해준다.
다른 펩타이드에의 적용
벤젠 고리에서의 브롬 치환이 펩타이드의 드 노보 시퀀싱을 용이하게 하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 안지오텐신II(DRVYIHPF), 뉴로텐신(RRPYIL), 브라디키닌(RPPGFSPFR) 및 H-7405(GRGLSLSR)를 대상으로 추가실험을 진행하였다. 도 2 내지 5는 각각 안지오텐신 II, 뉴로텐신, 브라디키닌 및 H-7405로부터 수득한 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-펩타이드의 MS3 스펙트럼을 나타낸다. 안지오텐신 Ⅱ에서, 관찰된 절편은 대부분 N-말단 절편이었으며, 단지 두 개의 낮은 피크만이 C-말단 절단에 의한 것이었는데(도 2), 이는 키네텐신의 경우와 다소 달랐다. 특히 N-말단 절편에서, a -형 이온인 r a 2 +, r a 3 +, r a 4 +, r a 5 +, r a 6 + 및 r a 7 +가 관찰되었다. 이러한 Br 신호를 나타내는 이러한 a -형 절편들로 인하여 펩타이드의 부분적 서열들을 추론할 수 있다: DR-V-Y-I(또는 L)-H-P-H. 키네텐신의 분석에서와 마찬가지로, 안지오텐신 Ⅱ 스펙트럼도 (M-X)+ 부위에서 측쇄 이탈에 의한 피크가 나타났다. 도 3에서 보는 바와 같이, 뉴로텐신의 MS3 스펙트럼에서는 a -, b - 및 y -형 절편이 주로 관찰되었다. 역시 N-말단 Br 신호를 보이는 a -형이 쉽게 식별되어 짧은 뉴로텐신의 부분적 서열을 알 수 있었다: RR-P-Y-I-L. x 5 + 또는 y 5 +와 같은 C-말단 절편은 뉴로텐신에 대한 추가적인 서열정보를 제공한다. 상기 펩타이드들(키네텐신, 안지오텐신 Ⅱ 및 뉴로텐신)은 C-말단에 염기성의 Arg 또는 Lys를 포함하지 않으므로, 키네텐신을 제외하고는 C-말단 절편이 N-말단 절편보다 낮은 빈도로 관찰된다. 이하에서, 본 발명자들은 C-말단에 Arg를 포함하는 브라디키닌 및 H-7405 펩타이드에 대해 추가 실험을 진행하였다(도 4 및 도 5). 도 4는 o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-브라디키닌(RPPGFSPFR)의 MS3 스펙트럼을 보여준다. 여기서, 관찰된 C-말단 절편의 수는 C-말단의 Arg에 의해 증가하였으며, a -/ x -, b -/ y - 및 c -/ z - 형 이온을 생성시키는 절편화가 보다 고르게 일어났다. 몇몇 측쇄 이탈도 관찰되었으나, 백본 절단에 수반되는 중성기의 이탈은 이전의 펩타이드들에 비해 빈도가 낮았다.
브라디키닌에 있어서, a -형 절편으로부터 보다 짧은 서열정보만이 얻어졌다:RPPGF-S-P-F-R. 그러나, C-말단 절편의 증가[특히, x 8 +, x 7 +( y 7 +), x 6 +, x 4 + ( z 4 +) 및 y 3 +(R-P-P-GF-S-PFR)]로 인하여 N-말단 부위의 시퀀싱이 용이해졌다. C-말단 절편의 증가는 H-7405(GRGLSLSR)에서도 관찰되었다(도 5). C-말단 부위의 염기성 Arg 잔기의 존재로 인해 많은 C-말단 절편이 관찰되었다. 따라서, C-말단 절편으로 G-RG-L-S-LSR 서열이 확인된 반면, N-말단 절편으로는 매우 짧은 서열(GRGL-SL-SR)만을 확인할 수 있었다.
결론
본 발명자들은 TEMPO-이용 FRIPS(o-TEMPO-Bz(Br)-C(O)-NHS)에서 o-TEMPO-Bz-C(O)-NHS 접합시약에 브롬이 포함될 경우 Br 더블릿 동위원소 신호를 통해 C-말단 절편으로부터 N-말단 FRIPSMS 절편이 보다 용이하게 구분됨을 확인하였다. N-말단과 C-말단 절편의 간편한 구별은 절편화 스펙트럼의 해석에서 복잡성을 크게 낮추어, 조사하고자 하는 펩타이드의 드 노보 시퀀싱을 매우 용이하게 한다. 아울러, 벤젠 고리에의 Br 치환이 라디칼-유도 분해 기작을 변화시키지 않는다는 점도 주목할 만하다. 다른 안정적인 동위원소 표지-기반 드 노보 시퀀싱 전략과 비교할 때, 브롬 치환방법은 자연계에 풍부한 브롬의 특유 더블릿 동위원소 패턴(예를 들어 79Br 및 81Br)을 이용한다는 점에서 비용 면에서 효율적이다. 가장 중요한 점은, 브롬-치환된 TEMPO-이용 FRIPSMS 방법은 통상적인 TEMPO-이용 FRIPSMS에 비해 추가적인 실험단계를 요구하지 않는다는 점이다. 합성단계에서 단지 출발물질을 2-메틸벤조익 애시드에서 5-브로모-2-에틸벤조익 애시드로 바꾸어 보롬화된 TEMPO-FRIPS 시약인 o-TEMPO-Bz(Br)-NHS를 동일한 방법으로 제조할 수 있으며, 이는 TEMPO-이용 FRIPSMS에서 특유의 브롬 동위원소 신호를 제공함으로써 드 노보 펩타이드 시퀀싱에 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
1. Hunt, D. F.; Yates, J. R.; Shabanowitz, J.; Winston, S.; Hauer, C. R. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1986, 83,6233-6237.
2. Ong, S-. E.; Blagoev, B.; Kratchmarova, I.; Kristensen, D. B.; Steen, H.; Pandey, A.; Mann, M. Mol . Cell . Proteomics 2002,1,376-386.
3. Aebersold, R.; Mann, M. Nature 2003,422,198-207.
4. Cavatt, B. F.; Simon, G. M.; Yates, J. R. Nature 2007,450,991-1000.
5. Seidler, J.; Zinn, N.; Boehm, M. E.; Lehmann, W. D. Proteomics 2010,10,634-649.
6. Eng, J. K.; Mccormack, A. I.; Yates, J. R. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 1994, 5,976-989.
7. Perkins, D. N.; Pappin, D. J. C.; Creasy, D. M.; Cottrell, J. S. Electrophoresis 1999, 20,3551-3567.
8. Craig, R.; Beavis, R. C. TADEM: Bioinformatics 2004, 20,1466-1467.
9. Geer, L. Y.; Markey, S. P.; Kowalak, J. A.; Wagner, L.; Xu, M.; Maynard, D. M.; Yang, X.; Shi, W.; Bryant, S. H. J. Proteome Res. 2004, 3,958-964.
10. Standing, K. G. Curr . Opin . Struct . Biol. 2003,13,595-601.
11. Beardsley, R. L.; Sharon, L. A.; Reilly, J. P. Anal . Chem. 2005, 77,6300-6309.
12. Marshall, A. G.; Hendrickson, C. L.; Stone, D.; Shi, H. Anal . Chem. 2002, 74,253A-259A.
13. Spengler, B. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2004,15,703-714.
14. Frank, A. M.; Savitski, M. M.; Nielsen, M. L.; Zubarev, R. A.; Penvzner, P. A. J. Proteome Res. 2007,6,114-123.
15. Chi, H.; Sun, R. X.; Yang, B.; Song, C. Q.; Wang, L. H.; Liu, C.; Fu, Y.; Yuan, Z. F.; Wang, H. P.; He, S. M.; Dong, M. Q. p Novo: J. Proteome Res. 2010,9,2713-2724.
16. Zubarev, R. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. J. Am . Chem . Soc. 1998, 120,3265-3266.
17. Syka, J. E. P.; Coon, J. J.; Schroeder, M. J.; Shabanowitz, J.; Hunt, D. F. Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 2004, 101,9528-9533.
18. Zubarev, R. A.; Zubarev, A. R.; Savitske, M. M. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2008,19,753-761.
19. Good, D. M.; Wirtala, M.; McAlister, G. C.; Coon, J. J. Mol . Cell . Proteomics 2007,6,1942-1951.
20. Taouatas, N.; Drugan, M. M.; Heck, A. J. R.; Mohammed, S. Nature Methods 2008, 5,405-407.
21. Bertsch, A.; Leinenbach, A.; Pervukhin, A.; Lubeck, M.; Hartmer, R.; Baessmann, C.; Elnakady, Y. A.; Muller, R.; Bocker, S.; Huber, C. G. Kohlbacher, D. Electrophoresis 2009, 30,3736-3747.
22. Schnolzer, M.; Jedrzejewski, P.; Lehmann, W. D. Electrophoresis 1996, 17, 945-953.
23. Mo, W. J.; Takao, T.; Shimonishi, Y. Rapid Commun . Mass Spectrom. 1997, 11,1829-1834.
24. Uttenweiler-Joseph, S.; Neubauer, G.; Christoforidis, A.; Zerial, M.; Wilm, M. Proteomics 2001, 1,668-682.
25. Krokhin, O.; Li, Y.; Andonov, A.; Feldmann, H.; Flick, R.; Jones, S.; Stroeher, U.; Batien, N.; Dasuri, K. V. N.; Cheng, K.; Simonsen, J. N.; Perreault, H.; Wilkins, J.; Ens, W.; Plummer, F.; Standing, K. G. Mol . Cell . Proteomics 2003,2,346-356.
26. Yao, X.; Afonso, C.; Fenselau, C. Proteome Res. 2003,2,147-152.
27. Bantscheff, M.; Dumpelfeld, B.; Kuster, B.; Rapid Commun . Mass Spectrom . 2004,18,869-876.
28. Munchach, M.; Quadroni, M.; Miotto, G.; James, P. Anal . Chem. 2000, 72, 4047-4057.
29. Gu, S.; Pan, S.; Bradbury, E. M.; Chen, X. Anal . Chem. 2002, 74, 5774-5785.
30. Hsu, J. L.; Huang, S. Y.; Chow, N. H.; Chen, S. H. Anal . Chem. 2003, 75,6843-6852.
31. Noga, M. J.; Asperger, A.; Silberring, J. Rapid Commun . Mass Spectrom. 2006,20,1823-1827.
32. Boersema, P. J.; Taouatas, N.; Altelaar, A. F. M.; Gouw, J. W.; Ross, P. L.; Pappin, D. J.; Heck, A. J. R.; Mohammed, S. Mol . Cell . Proteomics 2009,8,650-660.
33. Hennrich, M. L.; Mohammed, S.; Altelaar, A. F. M.; Heck, A. J. R. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2010,21,1957-1965.
34. Keough, T.; Youngquist, R. S.; Lacey, M. P. A Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1999, 96,7131-7136.
35. Keough, T.; Youngquist, R. S.; Lacey, M. P. Anal . Chem. 2003, 75, 157A-165A.
36. Lee, Y. H.; Kim, M. S.; Choi, W. S.; Min, H. K.; Lee, S. W. Proteomics 2004, 4,1684-1694.
37. Madsen, J. A.; Brodbelt, J. S. Anal . Chem. 2009,81,3645-3653.
38. Gevaert, K.; Goethals, M.; Martens, L.; Van Damme, J.; Staes, A.; Thomas, G. R.; Vandekerckhove, J. Nat . Biotechnol . 2003,21,566-569.
39. McDonald, L.; Robertson, D. H. L.; Hurst, J. L.; Beynon, R. J. Nat . Methods 2005,2,955-957.
40. Yamaguchi, M.; Obama, T.; Kuyama, H.; Nakayama, D.; Ando, E.; Okamura, T.; Ueyama, N.; Nakazawa, T.; Norioka, S.; Nishimura, O.; Tsunasawa, S. Rapid Commun . Mass Spectrom. 2007, 21,3329-3336.
41. Xu, G.; Shin, S. B. Y.; Jaffrey, S. R. Proc . Nat ’l Acad . Sci . U.S.A. 2009, 106,19310-19315.
42. Kasai, K. J. Chromatogr. A 1992,597,3-18.
43. Sechi, S.; Chait, B. T. Anal . Chem . 2000,72,3374-3378.
44. Cooper, H. J.; H, K.; Marshall, A. G. Mass Spectrom . Rev. 2005, 24,201-222.
45. Oh, H. B.; McLafferty, F. W. Bull . Kor . Chem . Soc. 2006, 27, 389-394.
46. Chu, I. K.; Rodriquez, C. F.; Lau, T. C.; Hopkinson, A. C.; Siu, K. W. M. J. Phys . Chem. 2000,104,3393-3397.
47. Wee, S.; O’Hair, R. A. J.; McFadyen, W. D. Int . J. Mass Spectrom. 2004, 234,101-122.
48. Laskin, J.; Yang, Z.; Chu, I. K. J. Am . Chem . Soc. 2008, 130,3218-3230.
49. Hopkinson, A. C. Mass Spectrom . Rev. 2009,28,655-671.
50. Kong, R. P. W.; Quan, Q.; Hao, Q.; Lai, C. K.; Siu, C. K.; Chu, I. K. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2012, 23, 2094-2101.
51. Chacon, A.; Masterson, D. S.; Yin, H. Y.; Liebler, D. C.; Porter, N. A. Biorg . Med . Chem . 2006,14,6213-6222.
52. Hodyss, R.; Cox, H. A.; Beauchamp, J. L. J. Am . Chem . Soc . 2005, 127,12436-12437.
53. Hao, G.; Gross, S. S. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2006, 17, 1725-1730.
54. Ryzhov, V.; Lam, A. K. Y.; O’Hair, R. A. J. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2009, 20,985-995.
55. Osburn, S.; O’Hair, R. A. J.; Ryzhov, V. Int . J. Mass Spectrom. 2012, 316,133-139.
56. Jones, A. W.; Winn, P. J.; Cooper, H. J. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2012, 23, 2063-2074.
57. Knudsen, E. R.; Julian, R. R. Int . J. Mass Spectrom. 2010, 294, 83-87.
58. Lee, M. H.; Kang, M. H.; Moon, B. J.; Oh, H. B. Analyst 2009, 134, 1706-1712.
59. Lee, M. H.; Lee, Y. J.; Kang, M. H.; Park, H. Y.; Seong, Y. M.; Sung, B. J.; Moon, B. J.; Oh, H. B. J. Mass Spectrom. 2011, 46, 830-839.
60. Lee, J. H.; Park, H. Y.; Kwon, H. S.; Kwon, K. M.; Jeon, A. R.; Kim, H. I.; Sung, B. J.; Moon, B. J.; Oh, H. B. Anal . Chem . 2013, 85, 7044-7051.
61. Jeon, A. R.; Lee, J. H.; Kwon, H. S.; Park, H. S.; Moon, B. J.; Oh, H. B. Mass Spectrom . Lett. 2013,4,71-74.
62. Marshall, D. L.; Hansen, C. S.; Trevitt, A. J.; Oh, H. B.; Blanksby, S. J. Phys . Chem . Chem . Phys. 2014,16,4871-4879.
63. Sun, Q.; Nelson, H.; Ly, T.; Stoltz, B. M.; Julian, R. R. J. Proteome Res. 2009,8,958-966.
64. Ly, T.; Julian, R. R. J. Am . Chem . Soc. 2010,132, 8602-8609.
65. Tan, L.; Xia, Y. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2013, 24,534-542.
66. Hodgson, J. L.; Roskop, L. B.; Gordon, M. S.; Lin, C. Y.; Coote, M. L. J. Phys . Chem. A. 2010, 114,10458-10466.
67. Dongre, A. R.; Jones, J. L.; Somogyi, A.; Wysocki, V. H. J. Am . Chem . Soc. 1996, 118,8365-8374.
71. Haselmann, K. F.; Budnik, B. A.; Kjeldsen, F.; Polfer, N. C.; Zubarev, R. A. Eur . J. Mass Spectrom. 2002, 8, 461-469.72. Laskin, J.; Yang, Z.; Ng, C. M. D.; Chu, I. K. J. Am . Soc . Mass Spectrom. 2010, 21, 511-521.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 펩타이드 서열 동정을 위한 자유 라디칼 개시제:
    화학식 1
    Figure 112016015321700-pat00007

    상기 화학식에서 R1은 C1-C4 알킬렌이고, R2는 브로모 페닐이며, R3는 2,5-디옥소-1-피롤리디닐옥시, 2,5-디옥소-3-설포닐-1-피롤리디닐옥시, 2,3,4,5,6-펜타플루오로페녹시, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페녹시, 할라이드 또는 아자이드이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1은 메틸렌, 메틸 메틸렌, 디메틸 메틸렌, 에틸메틸렌 또는 메틸 에틸 메틸렌인 것을 특징으로 하는 자유 라디칼 개시제.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R2는
    Figure 112016015321700-pat00008
    또는
    Figure 112016015321700-pat00009
    인 것을 특징으로 하는 자유 라디칼 개시제.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R3는 2,5-디옥소-1-피롤리디닐옥시인 것을 특징으로 하는 자유 라디칼 개시제.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 자유 라디칼 개시제:
    화학식 2 화학식 3
    Figure 112016015321700-pat00010
    Figure 112016015321700-pat00011

  7. 다음의 단계를 포함하는 펩타이드 서열의 동정방법:
    (a) 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 자유 라디칼 개시제를 분석 대상 펩타이드와 컨쥬게이션하는 단계;
    (b) 상기 컨쥬게이션된 펩타이드를 충돌 활성화(collisional activation)시켜 라디칼 종을 포함하는 분자 이온 단편을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 이온 단편의 질량을 분석하는 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 자유 라디칼 개시제를 상기 분석 대상 펩타이드 N-말단의 아미노기 또는 라이신 잔기의 아민기에 컨쥬게이션함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 분자 이온 단편은 a-, c-, x-, z- 및 y-형 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 기체 상(gas phase)에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140051045A 2014-04-28 2014-04-28 브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석 KR101658164B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140051045A KR101658164B1 (ko) 2014-04-28 2014-04-28 브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140051045A KR101658164B1 (ko) 2014-04-28 2014-04-28 브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150124562A KR20150124562A (ko) 2015-11-06
KR101658164B1 true KR101658164B1 (ko) 2016-09-21

Family

ID=54600875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140051045A KR101658164B1 (ko) 2014-04-28 2014-04-28 브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101658164B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101063981B1 (ko) * 2009-01-12 2011-09-14 서강대학교산학협력단 자유 라디칼 개시제 및 이를 이용한 펩타이드 서열의 동정방법
WO2012120288A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Immunovia Ab Method, array and use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101063981B1 (ko) * 2009-01-12 2011-09-14 서강대학교산학협력단 자유 라디칼 개시제 및 이를 이용한 펩타이드 서열의 동정방법
WO2012120288A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Immunovia Ab Method, array and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150124562A (ko) 2015-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8034623B2 (en) Method for free radical initiated peptide sequencing
Cox et al. Role of the site of protonation in the low-energy decompositions of gas-phase peptide ions
Samgina et al. N-terminal tagging strategy for de novo sequencing of short peptides by ESI-MS/MS and MALDI-MS/MS
Smith et al. Investigation of gas phase ion structure for proline-containing b2 ion
CN108463728B (zh) 同量异位质量标记
Bradley et al. Sequence analysis of underivatized peptides by negative ion chemical ionization and collision induced dissociation
Stutzman et al. Dissociation behavior of tryptic and intramolecular disulfide-linked peptide ions modified in the gas phase via ion/ion reactions
Friess et al. Mass spectrometric noncovalent probing of amino acids in peptides and proteins
US20120276643A1 (en) Method for Specific Cleavage of N-CA Bond in Peptide Main Chain
Logerot et al. Dissociation pattern of sodiated amide peptides as a tool for de novo sequencing
KR101658164B1 (ko) 브롬 동위원소 신호를 이용한 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석
JP6083595B2 (ja) タンパク質とリン酸化ペプチドのペプチド主鎖のＮ−Ｃα結合又はＣα−Ｃ結合の特異的切断方法
He et al. Does a charge tag really provide a fixed charge?
Liu et al. Charge-dependent dissociation of insulin cations via ion/ion electron transfer
EP3155436B1 (en) Isobaric mass labels
Jeon et al. Guanidination of lysine residue improves the sensitivity and facilitates the interpretation of free radical initiated peptide sequencing (FRIPS) mass spectrometry results
Bianco et al. Scrambling of autoinducing precursor peptides investigated by infrared multiphoton dissociation with electrospray ionization and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry
JP2022023059A (ja) アイソバリック質量標識
Lloyd et al. Peptide fragmentation by corona discharge induced electrochemical ionization
Vorontsov et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization post-source decay fragmentation of the cystine-containing amphibian peptides with novel cysteine tags
Wilson et al. Electrospray ionization mass spectrometry of vitamin D derivatives
Tsunematsu et al. Fragmentations of peptide derivatives depending on the positions of proline in negative‐ion fast atom bombardment mass spectrometry
Reddy et al. Positive and negative ion electrospray tandem mass spectrometry (ESI MS/MS) of boc-protected peptides containing repeats of L-Ala-γ 4 Caa/γ 4 Caa-L-Ala: Differentiation of some positional isomeric peptides
KR101500488B1 (ko) 음이온 모드를 이용한 원스텝 자유 라디칼-개시 펩타이드 시퀀싱 질량분석
Happersberger et al. A mass spectrometric approach to the characterization of protein folding reactions

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190701

Year of fee payment: 4