CN1097252A - 多元同步标记分析法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种生物试样(如血、尿及其它)中的物 质测量方法，它建立在固相标记分析的基础上，原理 是将多种抗原抗体或其它特异性结合物，分别包被在 固相载体上，在同一体系里与相应的抗体、抗原或其 他特异性结合物反应，达到同时测定几种物质成分含 量的目的。这个方法具有节省标本，操作简单，降低 成本，减少误差等优点。

Description

本发明属于生物标样（血、尿及其它）标记分析方法，特别适用于免疫测定：即血、尿液或其他生物样品中抗原、抗体及机体成分的测定方法，临床工作中，为了诊断一种疾病，经常需要测定多种成分，常规的标记分析，只能一种一种地测定，即取一份标本血清或其他样品经过一系列的技术操作处理，获得一种成分的含量值，分析的项目越多，耗费的时间就越多，需要的样品也就越多，取大量的样品，对病人是一种痛苦，以乙肝表面抗原，E抗原，表面抗体，E抗体、核心抗体，通常称之为两对半的测定为例，要取得这五种数据，需要作五次操作处理，需要取五份总计0.8毫升血清标本，对儿童来说取够所需的血量并非容易的事，特殊标本的取材更困难，甚至无法测定多种必要的项目，影响论断，另外，检测多种项目要进行多次技术操作，工作量大，消耗多，误差因素也多。

本发明的目的就是针对上述现有标记分析法的不足，建立了一种只用一份标本（血清或其他）进行一次操作处理，就可以完成多种项目检测的方法，从而提高了标记分析的效率，简化了操作，减少了标本用量，减少了误差的机会。

本发明称作多元同步标记分析法，它是在常规固相标记分析的基础上开发出来的，多元同步标记分析的理论基础是免疫学的特异性-即抗体只与相应的抗原结合，Cutt和Treager的抗体包被塑料载体的新技术，为多元同步标记分析的发明奠定了技术条件。

长时以来，人们始终沿用常规的标记分析法，是因为客观上存在着若干尚未解决的实际问题，如免疫学的特异性虽然在理论上被承认，但多种抗原抗体在同一体系同时进行反应时，不同抗原抗体之间有无交叉反应，可否造成干扰;常规的固相载体，无论包被上什么特异物，在外观上均无差别，难于分辨;常规固相标记分析用的试剂，是否适合多元同步标记分析使用，有无干扰物存在，如何将干扰物分离;常规的标记分析，需要一系列的标准管，如果多元同步标记分析沿用常规方法，每一种被测物都带一系列标准管，操作复杂，浪费试剂，多元同步标记分析的优越性也就体现不出来;多元同步标记分析的反应体系必然要增大，被测物和试剂的浓度势必降低，反应机率减少，灵敏度降低。只有解决上述几个问题，多元同步标记分析法才能建立。

本发明通过大量的试验观察，确认了如下的原则和方法。

1、常用的抗体特导性很高，在同一体系内多对抗原抗体可以互不干涉地进行特导性反应。

2、常规固相标记分析的试剂，因为存在干扰物，不能简单地混合使用，需要根据分析项目作认真地分析，必要地检测，查出干扰因素，用物理或化学方法将干扰除去。

3、常用的固相载体为聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺，聚丙烯醛、尼龙等或涂有上述材料的固相支持物，都可用于多元同步标记分析法，为了区分不同的包被物，本发明采用热灼，钻孔等方法制造区分标态，也可用形志，大小作为区分标志，也可以加彩色。实验证明，这些标志方法是行之有效的。如果包被珠在试管内不能上下易位，顺序可以成为区分的标志。利用空吸法，使分珠操作既简单，又迅速、准确。

4、本发明配制了共用标准，减少了标准管数目，节省了试剂，简化了操作。常规标记分析的标准品，只要含量准确，含有杂质并没有影响，例如，常规分析法表面抗原阳性对照中含有E抗原或其他并不影响表面抗原的测定。若用这种试剂配制多元同步测定的阳性对照，就会产生干扰。配制多元同步测定标准的试剂，需根据测定的项目，认真分析所用试剂是否存在干扰因素。若存在干扰因素，则采用化学、物理方法除去干扰，进行必要的纯化处理。

以HBsAg HBeAg HBcAb同步放射性标记分析的试剂要求列表如下：

+表示必须达到一定量，-表示不能存在，0表示无关。

试剂成分

试剂  HBsAg  HBsAb  HBeAg  HBeAg  HBcAg  HBcAb

HBsAg

HBeAg阳性对照  +  -  +  -  -  +

HBcHb

HBsAg

HBeAg阴性对照  -  -  -  -  -  -

HBcAb

标记HBcAb  -  -  -  -  -  -

HBsAb

HBeAb标记试剂  -  +  -  +  0  0

HBcAg包被珠  -  -  -  -  +  -

HBsAb包被珠  -  +  -  -  -  -

HBeAb包被珠  -  -  -  +  -  -

5、由于多元同步标记分析的反应体系要比常规法增大，反应试剂和被测物的浓度降低，本发明采用延长反应时间，如实例延长1倍，增加反应机率予以解决。

本发明的技术方案就是在上述实验观察的基础上提出的。

利用抗原抗体或他特异性结合物，包被在固相材料上，在同一反应体系里，在固相载体上与被测的抗原或其他结合物，分别进行特异反应，进行定性、定量测定，其特征在于：

a、多种被测物在同体系，同一试料里，同时进行反应。

b、被测物种类根据固相的标志或顺序区分。

c、多种被测物标准，融汇在同一样品里。

具体操作步骤如下：

1、标本制备：因多元同步标记分析法，建立在常规的固相分析基础上，因此对标本无特殊要求，与常规方法处理保存标本的原则相同。

2、试剂：常规法是单一成分测定，只要试剂适用于某成分的测定即可，即使存在无关成分，只要不干扰该项测定即可，多元同步标记分析要求不含干扰同一体系其他成分测定的物质，这需要对试剂进行加工处理提纯。

可以采用任一种提纯法，最方便的是亲和层析法。

3、反应方法：这个方法的核心技术是利用不同的抗体（抗原或其他特异性结合物）包被在各不相同的可以区分的在固相载体上，在同一体系分别摄取相应的抗原（抗体或其他特异性结合物）将被测物分离，在去除无关因素或干扰因素后，再加标记抗体（抗原或其他特异性结合物），通过标记物定量，计算被测物含量。操作方法与常规的固相标记分析法类同即夹心法，竞争法，中和法。常规方法是单一成分测定，多元同步法则可以结合使用多种方法即在同一体系既有夹心过程，又存在竞争过程、中和过程。

4、数据处理

a、标准曲线法：用于定量测定。

b、定性分析：计数与含量成负相关的定性测定法-中和法、竞争法：以样品计数低于阴性对照的50%为阳性;计数与含量成正相关的定性测定-夹心法，以样品计数高于阴性对照的2.1倍为阳性。

c、根据数据统计原理，作正规的七检验判断阴性或阳性更好。

下面结合多元同步标记分析举例，作进一步的说明：

（一）HBsAg HBeAg HBcAB同步放射性标记分析。

1、设备：放射性标记分析实验室常规仪器，计数器，洗珠设备，分珠器等。

2、试剂：

（1）、HBsAg、HBeAg、HBcAb阴性对照下称三阴对照血清。

（2）、HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性对照下称三阳对照血清。

（3）、HBsAb包被珠。

（4）、HBeAb包被珠。

（5）、HBcAg包被珠。

（6）、HBcAb、HBeAb复合标记试剂。

三、方法：

三阴管  三阳管  被测样品管

三阴性对照:  0.2

三阳性对照  0.2

样品  0.2

HBcAb标记试剂  0.5  0.5  0.5

HBsAb包被珠  一粒  一粒  一粒

HBEAb包被珠  一粒  一粒  一粒

HBcAb包被珠  一粒  一粒  一粒

45度C3h后蒸溜水洗三次每次3ML

取出上层HBcAg包被珠作HBcAb测定。

HBsAb

HBeAb标记试剂  0.4  0.4  0.4

45度2h后，室温过夜蒸溜水洗三次每次3ML取出上层作HBeAg测定，底层留作HBsAg测定。

4、结果计算，按常规方法进行。

（二）HBsHb HBeHb同步放射性标记分析实例。

1、仪器：同上

2、试剂：

（1）、HBsAb HBeAb阴性对照

（2）、HBsAb HBeAb阳性对照

（3）、竞争HBeAg

（4）、HBsAg包被珠

（5）、HBeAb包被珠

（6）、HBsAg HBeAb复合标记液

五、方法

             HBsAb              HBsAb

             HBeAb              HBeAb

HBsAb

HBeAb阴性对照  0.2            -               -

HBsAb

HBeAb阳性对照  -             0.2              -

样品           -              -               0.2

竞争HBeAg      0.3           0.3              0.3

HBsAg包被珠    一粒          一粒              一粒

HBeAb包被珠    一粒          一粒              一粒

45度  3h  蒸溜水洗3次，每次4ml

HBsAg

HBeAb 复合标记液  0.4         0.4            0.4

45度  2h  室温过液  蒸溜水洗3次每次4ml

4、计算：按常规方法进行

为了证明本发明的可靠性，对把本发明的分析法与常规法作了比较结果如下：

1、灵敏度比较，将HBsAg、HBeAg阳性对照作一系列稀释后用两种方法测定、结果见表

表1  HBsAg阴阳对照各种稀释度的P/N值

1:2  1:4  1:8  1:16  1:32  1:64  1:128  1:256  1:512

多元同步  33  33  27  16  14  8  6  4.5  1.9

常规法  88  85  64  53  27  18  10  6  1.9

表2  HBeAg阳性对照各种稀释度的P/N值

多元同步  1:2  1:4  1:8  1:16  1:32 1:64 1:128 1:256 1:512

11.5  10.8  6.3  3.6  2.6  2.3  1.6  1.2  1.1

常规法  41  20  18  11  5.1  3.3  2.3  1.4  0.5

2、特异性比较：从理论上讲，只要常规方法HBsAg测定与HBeAg测定无干扰，多元同步也不会存在干扰，实例也证明了这点。

HBeAg阳性对照P/N＝30  HBeAg测定为阴性P/N＝1.1

HBsAg阳性对照P/N＝15.3  HBeAg测定为阴性P/N＝0.9

3、临床应用比较、临床标本58份，用两种方法测定HBsAg和HBeAg、检出HBeAg阳性11例，两种方法一致。常规方法检出HBsAg30例，多元同步法检出25例，对结果不一致的样品进行复查，常规4例阴性，1例阳性，多元同步5例阴性，最终检出结果，常规法26例，多元同步法25例，结果不同的那例，采用吴清福的数据处理法则两种方法均在可疑范围。用北方免疫试剂研究所提供的HBsAg国家标准品作检测结果如下：

国家标准  常规法  多元同步法

灵敏度  ≤1ng/ml  ≤1ng/ml  ≤1ng/ml

特异性20管  0/20  0/20  0/20

线性5点  0.95  0.97  0.966

精密度(10管CV)

<15%  8.9%  7.6%

HBcHb、HBeAb的多元同步测定结果也很好。本发明的多元同步标记分析法，具有如下优点：

1、多元同步分析法简化了操作，大大提高了工作效率，以乙肝两对半的常规放射性标记分析与多元同步放射性标记分析为例，比较如下：

乙肝两对半常规标记分析法与多元同步标记分析法比较

标本用量  加样次数  洗珠次数  消耗吸头  阴阳性对照

常规标记法  0.8ml  11次  11次  11次  10并

多元同步法  0.3ml  6次  4次  5  4

多元同步标记分析法与常规标记法提高工作效率2.5倍。

2、多元同步法可以在同一体系中分析多种成分，标本需要量少，减少病人痛苦对医学研究和临床都有很大意义。

3、多元同步分析法操作简单，减少了误差来源，减少了错号及样品、试剂漏加、重加的几率。

4、多元同步分析法可以在同一体系进行多种成分测定增加了多种检测项目的可比性。

5、多元同步分析法的核心是固相吸附剂的一致性，文献报道通过共价健结合包被珠变异在2.2%完全达到了液相法的水平，可以用于定量，多元同步分析法将使标记分析系列化，在医学分析测定方面有很大的实用价值。

Claims (3)

1、一种生物试样(血、尿或其它物质)的多元同步标记分析法，利用抗原、抗体或其他特异性结合物包被在固相材料上，在同一体系里，在固相载体上与被测的抗体，抗原或其他特异性结合物分别进行特异性反应，进行定性定量测定，其特征在于：

a、多种被测物在同一体系，同一试样、同时进行反应。

b、被测物种类的区分，根据固相的标志或区位，顺序。

c、多种被测物标准融汇在同一标样里。

2、按照权利要求1，所述的多元同步标记分析法，其特征在于固相材料可以是聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺，聚丙烯醛或尼龙，固相的区分方法包括形状，大小、标志、颜色或顺序，标记分析法可以是放射性标记，酶标记，荧光标记或稀土元素标记。

3、按照权利要求1和2所述的多元同步标记分析法，其特征在于标样和试剂原料中的干扰物需要清除。