ES2556360T3 - Métodos de inmunoanálisis mejorados - Google Patents

Abstract

Un método para construir un perfil de producción de autoanticuerpos en un sujeto mamífero, en donde dicho autoanticuerpo es un marcador biológico de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, cuyo método comprende: (a) preparar dos o más diluciones diferentes de una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de dicho sujeto mamífero y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilución de la muestra de ensayo: (i) poner en contacto la dilución de la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo, (ii) detectar la cantidad de unión específica entre el anticuerpo y el antígeno para cada cantidad de antígeno utilizada en la etapa (i), (b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada dilución de la muestra de ensayo utilizada en la etapa (a), para construir un perfil de producción de autoanticuerpos en dicho sujeto antes del comienzo de la enfermedad, o a lo largo del transcurso de la enfermedad.

Description

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DESCRIPCION

Metodos de inmunoanalisis mejorados Campo de la invencion

La invencion se refiere en general al campo de los analisis de diagnostico o pronostico y, en particular, se refiere a analisis para la contruccion de un perfil de produccion de autoanticuerpos en un sujeto mairnfero, en donde dichos autoanticuerpos se utilizan como marcadores biologicos de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad.

Antecedentes de la invencion

Muchos analisis de diagnostico, pronostico y/o seguimiento dependen de la deteccion de un marcador biologico de una enfermedad concreta o susceptibilidad a la enfermedad. Tales marcadores biologicos son comunmente protemas o polipeptidos que son caractensticos de una enfermedad concreta o estan asociados con la susceptibilidad a la enfermedad.

En los ultimos anos se ha hecho evidente que los anticuerpos, y, en particular, los autoanticuerpos, tambien pueden servir como marcadores biologicos de la enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad. Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antfgeno que el sistema inmunitario de un individuo reconoce como foraneo incluso aunque ese antfgeno se origine realmente en el individuo. Pueden estar presentes en la circulacion como autoanticuerpos circulantes libres o en forma de complejos inmunitarios circulantes que consisten en autoanticuerpos unidos a su antfgeno diana. Las diferencias entre una protema de tipo salvaje expresada por celulas "normales" y una forma alterada de la protema producida por una celula enferma o durante un proceso de enfermedad puede, en algunos casos, conducir a que la protema alterada sea reconocida por el sistema inmunitario de un individuo como "no propia" y provocar de ese modo una respuesta inmunitaria en ese individuo. Esto puede ser una respuesta inmunitaria humoral (es decir, mediada por celulas B) que conduce a la produccion de autoanticuerpos inmunologicamente espedficos para la protema alterada.

El documento WO 99/58978 describe metodos para su uso en la deteccion/diagnostico del cancer que se basan en la evaluacion de la respuesta inmunitaria de un individuo a dos o mas marcadores tumorales diferentes. Estos metodos generalmente implican poner en contacto una muestra de fluido corporal tomada del individuo con un panel de dos o mas antfgenos marcadores de tumores distintos, cada uno derivado de una protema marcadora de tumores separada, y detectar la formacion de complejos de los antfgenos marcadores de tumores unidos a autoanticuerpos circulantes inmunologicamente espedficos de las protemas marcadoras de tumores. La presencia de dichos autoanticuerpos circulantes se considera una indicacion de la presencia de cancer.

Los analisis que miden la respuesta inmunitaria del individuo a la presencia de protema marcadora de tumores en terminos de produccion de autoanticuerpos proporcionan una alternativa a la medicion directa o deteccion de protemas marcadoras de tumores en fluidos corporales. Tales analisis constituyen esencialmente una deteccion indirecta de la presencia de protema marcadora de tumores. Debido a la naturaleza de la respuesta inmunitaria, es probable que los autoanticuerpos puedan ser producidos por una cantidad muy pequena de protema marcadora de tumores circulante y los metodos indirectos que se basan en la deteccion de la respuesta inmunitaria a marcadores tumorales por consiguiente seran mas sensibles que los metodos para la medicion directa de marcadores tumorales en fluidos corporales. Los metodos de analisis basados en la deteccion de autoanticuerpos por lo tanto pueden ser particularmente valiosos en el proceso temprano de la enfermedad y posiblemente tambien en relacion con el escrutinio de pacientes asintomaticos, por ejemplo en el escrutinio para identificar individuos "en riesgo" de desarrollar enfermedad entre una poblacion de individuos asintomaticos o para identificar a los individuos que han desarrollado una enfermedad en una poblacion de individuos asintomaticos. Ademas, los metodos de analisis basados en la deteccion de autoanticuerpos pueden tener un valor particular en el proceso temprano de la enfermedad y posiblemente tambien se pueden usar para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad en una poblacion de individuos sintomaticos. Ademas, pueden ser utiles para la deteccion temprana de enfermedades recurrentes. Los metodos de analisis tambien pueden ser valiosos en la seleccion o seguimiento de terapias para una enfermedad.

Los anticuerpos y autoanticuerpos tambien pueden servir como marcadores biologicos de otros estados de enfermedad o susceptibilidades a enfermedades, de las cuales la artritis reumatoide, el lupus eritematoso generalizado (LEG), la cirrosis biliar primaria (CBP), la tiroiditis autoinmune (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto), la gastritis autoinmune (por ejemplo, anemia perniciosa), la adrenalitis autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Addison), el hipoparatiroidismo autoinmune, la diabetes autoinmune (p. ej., diabetes de Tipo l), la miastenia grave no son mas que ejemplos.

Los autores de la presente invencion han reconocido que cuando los analisis basados en la deteccion de anticuerpos se utilizan para evaluar diagnosticamente o prognosticamente el estado de la enfermedad, la progresion

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de la enfermedad o la susceptibilidad a la enfermedad de un individuo en una poblacion, pueden surgir dificultades en la elaboracion de una metodologfa de analisis normalizada apropiada para toda la poblacion de sujetos que va a ser sometida a escrutinio debido a que las cantidades absolutas de autoanticuerpo presente vanan considerablemente de un individuo a otro. Esto puede producir una alta incidencia de resultados falsos negativos, por ejemplo, entre individuos que tienen una baja cantidad de autoanticuerpo. Del mismo modo, existe una dificultad en la puntuacion de resultados positivos verdaderos debido a que la variacion de las cantidades absolutas de autoanticuerpo de un individuo a otro significa que es diffcil fijar un umbral para un resultado de analisis positivo que sea apropiado para todos los individuos dentro de la poblacion escrutada.

Los autores de la presente invencion han determinado que el rendimiento y mas espedficamente la utilidad clmica y la fiabilidad de los analisis basados en la deteccion de autoanticuerpos, como marcadores biologicos de la enfermedad se pueden mejorar drasticamente mediante la inclusion de una etapa de titulacion del antigeno. Al someter a ensayo la muestra que se sospecha que contiene autoanticuerpos contra una serie de cantidades diferentes de antigeno y construir una curva de titulacion es posible identificar fiablemente resultados de escrutinio positivos verdaderos independientemente de la cantidad absoluta de autoanticuerpo presente en la muestra. Este enfoque es contrario a los metodos de la tecnica anterior que titulan meramente el antigeno para construir una curva de calibracion para permitir la identificacion de la concentracion de antigeno mas apropiada para ser utilizada para la deteccion de anticuerpos en muestras de pacientes reales. En estos metodos solo se propone una medicion de punto unico para el diagnostico real. Por lo tanto, estos metodos no permitiran la variacion de cantidades del autoanticuerpo que se va a detectar de individuo a individuo que dan como resultado la incidencia de falsos positivos y falsos negativos. Los autores de la presente invencion han encontrado que los metodos de analisis basados en la titulacion del antigeno exhiben una mayor especificidad y sensibilidad que la medicion de la reactividad de autoanticuerpos a una unica concentracion de antigeno.

Los autores de la presente invencion han determinado adicionalmente que los metodos de analisis que combinan la titulacion del antigeno con la titulacion simultanea de la muestra de ensayo ofrecen aun mas ventajas que los metodos basados solo en la titulacion del antfgeno. Estos denominados metodos de "titulacion cruzada" constituyen el objeto de la presente invencion.

Compendio de la invencion

De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos para dos o mas autoanticuerpos en un sujeto mairnfero, en donde al menos uno de dichos autoanticuerpos es un marcador biologico de un estado de enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, cuyo metodo comprende:

(a) preparar dos o mas diluciones diferentes de una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de dicho sujeto mamffero y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

(i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con dos o mas conjuntos de antfgenos, en donde cada uno de dichos conjuntos de antfgenos es especifico para uno de dichos anticuerpos que se van a detectar en la muestra de ensayo y en donde cada uno de dichos conjuntos de antfgenos comprende una pluralidad de cantidades diferentes del mismo antigeno,

(ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada cantidad de antfgeno en cada conjunto de antfgenos usado en la etapa (i),

(b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo con cada conjunto de antfgenos utilizado en la etapa (a), para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos en dicho sujeto o bien antes del comienzo de la enfermedad o bien a lo largo del transcurso de la enfermedad.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos para dos o mas autoanticuerpos en un sujeto mamffero, en donde al menos uno de dichos autoanticuerpos es un marcador biologico de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, cuyo metodo comprende:

(a) preparar dos o mas diluciones diferentes de una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de dicho sujeto mamffero y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

(i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con dos o mas conjuntos de antfgenos, en donde cada uno de dichos conjuntos de antfgenos es espedfico para uno de dichos anticuerpos que se van a detectar en la muestra de ensayo y en donde cada conjunto de antfgenos comprende una pluralidad de cantidades diferentes del mismo antfgeno,

(ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada cantidad de antfgeno en cada conjunto de antfgenos usado en la etapa (i),

(b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo con cada conjunto de antfgenos utilizado en la etapa (a), para

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construir un perfil de produccion de autoanticuerpo en dicho sujeto o bien antes del comienzo de la enfermedad o bien a lo largo del transcurso de la enfermedad.

Se describe un metodo de deteccion de un estado de enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad en un sujeto mairnfero, comprendiendo dicho metodo detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo, en donde la muestra de ensayo comprende un fluido corporal de dicho sujeto mai^ero y en donde dicho anticuerpo es un marcador biologico de un estado de enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, cuyo metodo comprende:

(a) preparar dos o mas diluciones diferentes de dicha muestra de ensayo y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

(i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antigeno espedfico para dicho anticuerpo,

(ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antigeno para cada cantidad de antigeno usado en la etapa (i),

(b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antigeno para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en la etapa (a), y

(c) determinar la presencia o ausencia de dicho estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad basandose en la cantidad de union espedfica entre dicho anticuerpo y dicho antigeno para cada dilucion de la muestra de ensayo y la cantidad de antigeno sometidos a ensayo

Se describe un metodo de deteccion de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamffero en donde dicho anticuerpo es un marcador biologico de un estado de enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, cuyo metodo comprende:

(a) preparar dos o mas diluciones diferentes de dicha muestra de ensayo y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

(i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antfgeno espedfico para dicho anticuerpo,

(ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada cantidad de antfgeno usado en la etapa (i),

(b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en la etapa (a), en donde la presencia en la muestra de ensayo de anticuerpo reactivo con el antfgeno utilizado en el analisis se indica por una curva generalmente en forma de S o sigmoidea para al menos dos diluciones diferentes de la muestra de ensayo.

Se describe un metodo de deteccion de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamffero en donde dicho anticuerpo esta dirigido a una sustancia foranea introducida en dicho sujeto mamffero, comprendiendo el metodo:

(a) preparar dos o mas diluciones diferentes de dicha muestra de ensayo y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

(i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antfgeno espedfico para dicho anticuerpo,

(ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada cantidad de antfgeno usado en la etapa (i),

(b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en la etapa (a), y en donde la presencia en la muestra de ensayo de anticuerpo reactivo con el antfgeno utilizado en el analisis se indica por una curva generalmente en forma de S o sigmoidea para al menos dos diluciones diferentes de la muestra de ensayo.

En todos los aspectos de la invencion, el sujeto mamffero es preferiblemente un ser humano.

En todos los aspectos de la invencion, el anticuerpo es un autoanticuerpo.

En todos los aspectos de la invencion, el metodo se lleva a cabo preferiblemente in vitro en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal obtenido o preparado a partir del sujeto mai^ero.

En todos los aspectos de la invencion, la etapa (a) del analisis implicara poner en contacto preferiblemente todas y cada una de las diluciones de la muestra de ensayo con todas y cada una de las cantidades de antfgeno utilizado en el analisis, de tal manera que se sometan a ensayo todas las posibles combinaciones de diluciones de la muestra de ensayo y las cantidades de antfgeno.

Una caractenstica concreta de la invencion en todos sus aspectos es que el criterio para determinar si el autoanticuerpo relevante esta o no esta presente en la muestra de ensayo se basa en la cantidad de union

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espedfica observada en todas y cada una de las diferentes combinaciones de diluciones de la muestra de ensayo y concentraciones de antigeno sometidas a ensayo, en otras palabras los valores colectivos, en lugar de solo una lectura a una unica concentracion de antigeno o para una unica dilucion de la muestra de ensayo. Asf, la determinacion de la presencia o ausencia de estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad o autoanticuerpos para una sustancia extrana en una muestra de paciente puede seguir estando basada directamente en estos valores colectivos. En una realizacion, se realiza la valoracion sobre la base de la presencia de una curva generalmente en forma de S o sigmoidea cuando la cantidad de union espedfica se representa frente a la cantidad de antigeno durante al menos dos diluciones diferentes de la muestra de ensayo. Como resultara evidente a partir de los Ejemplos de la presente memoria, los autores de la presente invencion han observado que los metodos de la invencion tienen una sensibilidad mas alta con una especificidad equivalente al menos a los metodos de diagnostico o deteccion basados en la titulacion del antfgeno solo y reducen la incidencia de determinaciones falsas positivas y falsas negativas.

La presente invencion se describira ahora adicionalmente. En los pasajes siguientes se definen caractensticas diferentes de los diversos aspectos de la invencion con mayor detalle. Cada caractenstica definida de ese modo en relacion con un aspecto de la invencion se puede combinar con las caractensticas descritas en relacion con cualquier otro aspecto de la invencion a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier caractenstica indicada como preferida o ventajosa se puede combinar con cualquier otra caractenstica o caractensticas indicadas como preferidas o ventajosas a menos que se indique claramente lo contrario.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra una serie de curvas de titulacion cruzada para la deteccion de autoanticuerpos contra p53 (Fig. 1 a a d) y c-myc (Fig.1 e a h) en las muestras de suero tomadas de pacientes con cancer de mama. En cada experimento, se sometieron a ensayo por separado seis diluciones diferentes del suero del paciente para la union espedfica contra una serie de titulacion de cantidades variables de antfgeno p53 o c-myc recombinantes (la dilucion de suero 1/10.000 es efectivamente un control "sin suero"). Para cada antigeno, se trazaron curvas separadas de la union espedfica (expresada como absorbancia a 650 nm) frente a la concentracion de antfgeno para cada dilucion del suero del paciente.

La Figura 2 ilustra un ejemplo de un diseno de placa de titulacion utilizado para realizar analisis de Suero y Concentracion de Antfgeno Optimos (OSAAC) segun el ejemplo 3. Nota - las diluciones de suero y antfgeno se muestran en placas separadas, mientras que en la practica las diluciones de suero y antfgeno se anaden a los pocillos correspondientes de la misma placa unica.

Las Figuras 3 a 7 muestran una serie de curvas de titulacion cruzada para la deteccion de autoanticuerpos contra p53, ECD6 (tambien conocido como dominio extracelular de hER2) y un fragmento 3' de ECD6 en muestras de suero tomadas de pacientes con cancer de mama primario y sujetos de control normales. En cada experimento, se sometieron a ensayo por separado seis diluciones diferentes del suero del paciente para la union espedfica contra una serie de titulacion de cantidades variables de antfgenos p53, ECD6 o fragmento 3' de ECD6 recombinantes. Para cada antfgeno, se trazaron curvas separadas de la union espedfica (expresada como absorbancia a 650 nm) frente a la concentracion de antfgeno para cada dilucion del suero del paciente. La Figura 3 muestra las curvas de titulacion representativas para la deteccion de autoanticuerpos anti-p53 en el suero de un paciente de cancer de mama primario (panel a) o un sujeto de control normal (panel b). La Figura 4 muestra las curvas de titulacion representativas para la deteccion de autoanticuerpos anti-ECD6 (utilizando antfgeno ECD6) en el suero de un paciente de cancer de mama primario (panel a) o de un sujeto normal de control (panel b). La Figura 5 muestra las curvas de titulacion representativas para la deteccion de autoanticuerpos anti-ECD6 (utilizando antfgeno 3' ECD6) en el suero de un paciente de cancer de mama primario (panel a) o un sujeto de control normal (panel b). La Figura 6 muestra las curvas de titulacion representativas para la deteccion de autoanticuerpos anti-p53 o autoanticuerpos anti-ECD6 en el suero del mismo paciente de cancer de mama primario usando el antfgeno p53 (panel A), antfgeno ECD6 (panel B) o antfgeno 3' ECD6 (panel C). La Figura 7 (paneles a a d) muestra las curvas de titulacion adicionales mencionadas en el ejemplo 3.

Descripcion detallada de la invencion

En terminos generales, la invencion proporciona un metodo de inmunoanalisis para la deteccion de un autoanticuerpo que sirve como un marcador biologico de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, que se caracteriza porque dos o mas diluciones diferentes de una muestra que se va a someter a ensayo para determinar la presencia del autoanticuerpo (muestra de ensayo) son analizadas cada una para determinar union espedfica frente diferentes cantidades de antfgeno espedfico para el autoanticuerpo, y se producen las curvas de titulacion separadas de la cantidad de union de autoanticuerpo/antfgeno frente a la cantidad de antfgeno sometido a ensayo para cada dilucion diferente de la muestra de ensayo. En pocas palabras, el analisis se basa en la titulacion cruzada tanto de la muestra de ensayo como del antfgeno utilizados como reactivos en el inmunoanalisis.

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Las caractensticas generales de los inmunoanalisis, por ejemplo ELISA, radioinmunoanalisis y similares, son bien conocidas por los expertos en la tecnica (vease Immunoassay, E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Los inmunoanalisis para la deteccion de anticuerpos que tienen una especificidad inmunologica concreta requieren generalmente el uso de un reactivo (antfgeno) que exhibe reactividad inmunologica espedfica con el anticuerpo sometido a ensayo. Dependiendo del formato del analisis este antigeno puede ser inmovilizado sobre un soporte solido. Una muestra que se va someter a ensayo para determinar la presencia del anticuerpo se pone en contacto con el antigeno y si los anticuerpos de la especificidad inmunologica requerida estan presentes en la muestra estos reaccionaran inmunologicamente con el antigeno para formar complejos anticuerpo- antigeno que a continuacion se pueden detectar o medir cuantitativamente.

El metodo de la invencion se caracteriza porque dos o mas diluciones diferentes de la muestra que se va a someter a ensayo para determinar la presencia del autoanticuerpo son sometidos a ensayo cada una frente a una pluralidad de cantidades diferentes de antfgeno (tambien denominado en la presente memoria como una serie de titulacion de antigeno). El analisis debe implicar someter a ensayo al menos dos diluciones diferentes de la muestra de ensayo, pero puede implicar someter a ensayo tres, cuatro, cinco, o de seis a diez o incluso mas diluciones diferentes de la muestra de ensayo. Cada dilucion separada de la muestra de ensayo se somete a ensayo contra al menos dos, y preferiblemente al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas cantidades diferentes del antfgeno. Los analisis tfpicos tambien pueden incluir un control negativo que no contiene ningun antigeno y/o un control de muestra de ensayo negativo, tal como por ejemplo una dilucion 1/10.000 de la muestra de ensayo.

En este contexto, el termino "antigeno" se refiere a una sustancia que comprende al menos un determinante antigenico o epftopo capaz de interactuar espedficamente con el anticuerpo diana que se desea detectar, o cualquier agente de captura que interactua espedficamente con la region variable o las regiones determinantes de la complementariedad de dicho autoanticuerpo. El antfgeno tfpicamente sera una macromolecula biologica de origen natural o sintetico, tal como por ejemplo una protema: o peptido, un polisacarido o un acido nucleico y puede incluir anticuerpos o fragmentos de los mismos tales como anticuerpos anti-idiotipo.

Los lectores expertos apreciaran que, en el metodo de la invencion, la cantidad de determinantes antigenicos o epftopos disponibles para la union al autoanticuerpo diana es importante para establecer una serie de titulacion. En muchos formatos de analisis la cantidad de determinantes antigenicos o epftopos disponibles para la union esta directamente correlacionada con la cantidad de moleculas de antfgeno presentes. Sin embargo, en otras realizaciones, tales como ciertos sistemas de analisis en fase solida, la cantidad de determinantes antigenicos o epftopos expuestos puede no correlacionarse directamente con la cantidad de antfgeno pero puede depender de otros factores, tales como la union a la superficie solida. En estas realizaciones, se puede considerar que las referencias de la presente memoria a "diferentes cantidades de antfgeno" en una serie de titulacion se refieren a diferentes cantidades del determinante antigenico o epftopo.

La cantidad relativa o absoluta de la union espedfica entre el autoanticuerpo (presente en la dilucion de la muestra de ensayo) y el antfgeno se determina para cada combinacion diferente de dilucion de la muestra de ensayo y la cantidad de antfgeno (determinante antigenico o epftopo) sometida a ensayo. Los resultados se utilizan a continuacion para trazar o calcular una serie de curvas de la cantidad (relativa o absoluta) de la union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada cantidad de antfgeno sometido a ensayo, generandose una curva separada para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en el analisis. Los resultados tfpicos se ilustran, a modo de ejemplo solamente, en las Figuras adjuntas para la deteccion de varios autoanticuerpos diferentes. La presencia en la muestra de ensayo de autoanticuerpo reactivo con el antfgeno usado en el analisis se determina basandose en la cantidad de union espedfica observada en cada cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en el analisis y se indica generalmente por la presencia de una curva en forma de S o sigmoidea para al menos dos diluciones de la muestra de ensayo diferentes.

Las cantidades absolutas de union espedfica entre autoanticuerpo y antfgeno no son generalmente importantes, a menos que se desee producir una medicion cuantitativa. Para una simple determinacion afirmativa/negativa de la presencia o ausencia de autoanticuerpos es suficiente que se produzca solo una curva de la forma correcta para al menos dos de las diluciones de la muestra de ensayo diferentes sometidas a ensayo en el analisis. Si no hay variacion en la union detectable respecto a las diferentes cantidades de antfgeno sometidas a ensayo para cualquiera de las diluciones de la muestra de ensayo sometidas a ensayo, esta se puede puntuar como una ausencia de una cantidad detectable del autoanticuerpo. En realizaciones preferidas de la invencion, el metodo no es cuantitativo. Por tanto, puede dar una determinacion afirmativa/negativa de la presencia o ausencia de autoanticuerpos usando una relacion adimensional proporcional, que es independiente de la intensidad de la senal.

Una medida de la cantidad de autoanticuerpo presente en una muestra concreta, si se desea, puede derivar de los resultados del analisis de titulacion cruzada. En realizaciones no limitantes que implican ensayos cftnicos de una poblacion de pacientes, se puede establecer un corte para puntuar un resultado en un paciente en concreto como positivo en comparacion con los resultados obtenidos de un grupo control de sujetos normales, por ejemplo, un corte de media + 2 desviaciones tfpicas del grupo normal. Las muestras de pacientes en las que la union espedfica de

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antigeno a autoanticuerpo diana (p. ej. el valor obtenido despues de la correccion para la union no espedfica) cae por encima de este corte para al menos una concentracion de antigeno pueden ser puntuadas como positivas.

En otras realizaciones no limitantes de la invencion se puede utilizar un sistema de calibracion con el fin de puntuar las muestras de ensayo desconocidas como positivas o negativas. Uno de tales sistemas de calibracion se puede basar en el uso de muestras de control positivas y negativas conocidas. Se pueden analizar muestras de control positivas y negativas/calibradoras en paralelo con la muestra o las muestras de ensayo usando la metodologfa de analisis de la invencion. Las muestras de ensayo desconocidas se consideran positivas o negativas en comparacion con las muestras de control positivas y negativas conocidas utilizadas como calibradores.

El metodo de la invencion es ventajoso para su uso en ensayos clmicos de diagnostico, pronostico, predictivos y/o de seguimiento, en donde las cantidades absolutas de autoanticuerpo diana presente puede variar enormemente de paciente a paciente. Los autores de la presente invencion han observado que si tales analisis se basan en la deteccion de la union de autoanticuerpos utilizando una unica cantidad/concentracion de antfgeno de ensayo, las muestras de pacientes que contienen una cantidad de anticuerpo que se encuentra en un extremo muy bajo o muy alto del intervalo fisiologico normal (de cantidad de autoanticuerpo) a traves de la poblacion se pueden perder debido a las limitaciones de la metodologfa de analisis; las muestras con una baja cantidad de autoanticuerpo pueden considerarse como resultados falsos negativos, mientras que aquellas con niveles muy altos de autoanticuerpo pueden estar fuera de la escala para la deteccion exacta dentro de la metodologfa de analisis elegida.

En todas las realizaciones de la invencion, el anticuerpo detectado utilizando la metodologfa de analisis de titulacion cruzada es un autoanticuerpo.

El metodo de analisis de titulacion cruzada de la invencion se utiliza para la deteccion de autoanticuerpos como marcadores biologicos de estado de enfermedad o susceptibilidad donde existe una considerable variacion de paciente a paciente, tanto en las cantidades absolutas de autoanticuerpo presente en el paciente, como en la especificidad de los autoanticuerpos, en particular, la afinidad del autoanticuerpos para su antfgeno diana. Las respuestas de autoanticuerpos, por su naturaleza pueden variar significativamente de paciente a paciente, ocurriendo la variacion tanto en las cantidades absolutas de autoanticuerpos presentes como en la especificidad/afinidad de los autoanticuerpos. El metodo de la invencion puede tener en cuenta esta variacion de paciente a paciente, permitiendo asf un formato de analisis convencional (adecuado para su uso en el ensayo de todos los individuos dentro de una poblacion) que se va a desarrollar para cualquier autoanticuerpo dado.

Las interacciones entre los autoanticuerpos y sus antfgenos diana son generalmente de baja afinidad pero la fuerza de la union puede variar de paciente a paciente, como se ha esbozado anteriormente. El metodo de la invencion es particularmente adecuado para la deteccion de la union de baja afinidad, ya que se puede deducir un resultado positivo de la forma de las curvas de titulacion generadas para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en el analisis.

El metodo de la invencion difiere de los metodos de analisis basados en la titulacion del antfgeno solo (es decir, analisis que implican someter a ensayo una unica muestra de ensayo frente a una serie de titulacion de antfgeno) ya que permite la deteccion de senales producidas por la union de autoanticuerpos poco abundantes y/o de baja afinidad que de otra manera podna ser enmascarada por la union no espedfica (del antfgeno utilizado en el analisis) con componentes no buscados en la muestra de ensayo.

Los autores de la presente invencion han observado una considerable variacion inter-antfgeno y tambien intra- antfgeno en la dilucion de la muestra de ensayo optima requerido para la deteccion optima de los autoanticuerpos diana. Por lo tanto, la misma muestra de ensayo del paciente puede tener una primera dilucion optima para la deteccion de autoanticuerpos para un primer antfgeno y una dilucion optima diferente para la deteccion de autoanticuerpos para un segundo antfgeno derivado de una protema diferente (variabilidad inter-antfgeno). La "diferencia" en la dilucion optima de la muestra de ensayo para dos antfgenos derivados de protemas diferentes puede ser de varios ordenes de magnitud. Por ejemplo, una dilucion optima de una muestra de ensayo dada para la deteccion de autoanticuerpos para un primer antfgeno (protema A) podna ser 1:800, pero la misma muestra de ensayo puede requerir una dilucion optima de 1:50 para la deteccion de autoanticuerpos para un segundo antfgeno (protema B). Un efecto similar se puede observar cuando los antfgenos utilizados son diferentes fragmentos de la misma protema, o una protema de longitud completa y un sub-fragmento de esta protema (variabilidad intra- antfgeno). Por lo tanto, si la muestra de ensayo se va a someter a ensayo para determinar la reactividad frente a un panel de antfgenos diferentes (que se derivan de diferentes protemas o fragmentos de una sola protema o una combinacion de los mismos), la dilucion optima de la muestra de ensayo requerida para cada antfgeno en el panel podna ser diferente. El metodo de la invencion evita este problema sometiendo a ensayo diluciones variables de la muestra de ensayo frente a diluciones variables de cada antfgeno en el panel cada vez que se realiza el metodo en un entorno clmico. Asf, cada antfgeno en el panel se pondra automaticamente a prueba a su dilucion "optima" de la muestra de ensayo.

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Los autores de la presente invencion tambien han observado que se pueden producir diferencias inter-individuo en la dilucion de muestra de ensayo optima para un antigeno concreto. As^ para cualquier antfgeno dado una muestra de ensayo de un primer sujeto puede dar un resultado optimo a una primera dilucion de la muestra de ensayo (p. ej. 1:100), mientras que cuando una muestra de ensayo de un segundo sujeto se somete a ensayo utilizando el mismo antigeno puede ser optima una dilucion diferente de la muestra de ensayo (p. ej. 1:500). El metodo de la invencion es capaz de tener en cuenta tal variacion de paciente a paciente ya que para cada antigeno sometido a ensayo se somete a ensayo una serie de diluciones de la muestra de ensayo, frente a un intervalo de diluciones de antfgeno cada vez que el analisis se realiza en un entorno cttnico. De este modo, el metodo de la invencion siempre utilizara la dilucion de la muestra de ensayo optima para cada antigeno sometido a ensayo contra cada muestra de ensayo.

El metodo de la invencion tambien proporciona una proteccion contra la variacion dfa a dfa en la realizacion de inmunoanalisis utilizados para la deteccion de autoanticuerpos para el diagnostico, pronostico y/o control (estado de enfermedad o terapia). Se observa a menudo que puede haber una variacion considerable dfa a dfa en la intensidad de la senal cuando se llevan a cabo inmunoanalisis para la deteccion de autoanticuerpos en muestras que comprenden los fluidos corporales de pacientes. Tal variacion puede surgir, por ejemplo, debido a diferencias en la forma en que se obtuvieron las muestras y se almacenaron antes de la prueba. Estos factores hacen diffcil puntuar los resultados de los analisis clmicos con certeza, por ejemplo sobre la base de un valor umbral sencillo de la union autoanticuerpo/antfgeno. La presente invencion minimiza los efectos de tal variacion dfa a dfa ya que es claramente evidente un resultado positivo para determinar la presencia de autoanticuerpo a partir de la forma de las curvas de titulacion generadas para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en el analisis, independiente de la intensidad de la senal.

Una ventaja adicional del metodo de la invencion es que permite la dilucion de la muestra del paciente, pero todavfa produce resultados consistentes, y tambien que se producira generalmente el mismo resultado de escrutinio cualitativo (positivo/negativo) utilizando fluidos corporales de diferentes fuentes en un individuo (p. ej. sangre o suero frente a lfquido asdtico o efusion pleural), incluso aunque la concentracion absoluta de autoanticuerpos pueda ser diferente en los diferentes fluidos.

El metodo de la invencion puede llevarse a cabo en cualquier formato adecuado que permita el contacto entre multiples diluciones de una muestra sospechosa de contener el anticuerpo y multiples cantidades diferentes de un antigeno. Convenientemente, el contacto entre diluciones diferentes de la muestra y diferentes cantidades del antfgeno puede tener lugar en camaras de reaccion separadas pero paralelas, tales como los pocillos de una placa de microtitulacion. Se pueden aplicar en forma de recubrimiento cantidades variables del antfgeno sobre los pocillos de la placa de microtitulacion mediante la preparacion de diluciones seriadas a partir de una provision de antfgeno a traves de los pocillos de la placa de microtitulacion. La provision de antfgeno puede ser de concentracion conocida o desconocida. A continuacion se pueden anadir alfcuotas de las diluciones preparadas de la muestra de ensayo a los pocillos de la placa, manteniendo constante el volumen de la muestra de ensayo en cada pocillo. Las cantidades absolutas de antfgeno anadidas a los pocillos de la placa de microtitulacion pueden variar dependiendo de factores tales como la naturaleza del autoanticuerpo diana, la naturaleza de la muestra sometida a ensayo, las diluciones de la muestra de ensayo, etc., como apreciaran los expertos en la tecnica. Generalmente las cantidades de antfgeno y las diluciones de la muestra de ensayo se seleccionaran de manera que se produzca un intervalo de intensidad de la senal que caiga dentro del intervalo de deteccion aceptable de la lectura de salida elegida para la deteccion de la union autoanticuerpo/antigeno en el metodo. Las cantidades y diluciones tfpicas para someter a ensayo las muestras de suero humano que se sospecha que contienen autoanticuerpos marcadores antitumorales se dan en los ejemplos adjuntos. A modo de ejemplo solamente, las diluciones tfpicas de la muestra de ensayo pueden variar en el intervalo de 1/30 a 1/10.000 (o 1:50 a 1:1600). Las cantidades de antfgeno sometidas a ensayo puede variar normalmente en el intervalo de 0,01 pg/ml a 10 pg/ml, (o 0,16 nM a 160 nM) aunque no se pretende que sean limitantes.

Como se ha mencionado anteriormente, tambien es posible construir las curvas de titulacion para dos o mas diluciones de la muestra de ensayo a partir de una sola provision de antfgeno incluso cuando la concentracion absoluta de antfgeno en la provision sea desconocida. Siempre que se utilice una misma solucion de partida y se diluya seriadamente de la misma manera, es posible comparar los resultados de los analisis separados de titulacion para este antfgeno ejecutados en diferentes muestras de ensayo de partida.

En una realizacion adicional del analisis se pueden inmovilizar diferentes cantidades de antfgeno (determinantes antigenicos o epftopos) en localizaciones o sitios de reaccion discretos sobre un soporte solido. El soporte completo, o una zona discreta del mismo que comprende una subfraccion de los sitios de reaccion, se puede poner en contacto a continuacion con una dilucion de la muestra de ensayo y detectar o medir la union del autoanticuerpo al antfgeno por separado en cada una de las localizaciones o sitios de reaccion discretos. Los soportes solidos adecuados tambien incluyen micromatrices, por ejemplo matrices en las que los sitios discretos o las aplicaciones en la matriz comprenden diferentes cantidades de antfgeno. Las micromatrices se pueden preparar mediante la inmovilizacion de diferentes cantidades de un antfgeno concreto en sitios de reaccion discretos que se pueden resolver en la matriz. En otras realizaciones, la cantidad real de las moleculas de antfgeno inmovilizadas se puede

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mantener sustancialmente constante, pero el tamano de los sitios o aplicaciones en la matriz se puede variar con el fin de alterar la cantidad de epftopo de union disponible, proporcionando una serie de titulacion de los sitios o aplicaciones con diferentes cantidades de epftopo de union disponible. En tales realizaciones, la concentracion en la superficie bidimensional del epftopo o los epftopos de union sobre el antigeno es importante en la preparacion de la serie de titulacion, en lugar de la cantidad absoluta de antigeno. Los mecanismos para la preparacion y la interrogacion de las micromatrices de protemas/peptidos son generalmente conocidos en la tecnica.

Se entendera a partir de la discusion anterior que en todas las realizaciones de la invencion, la variacion en la cantidad de antigeno se puede lograr cambiando la densidad del antigeno o epftopo contra el que se someten a ensayo las diluciones de la muestra de ensayo, o manteniendo la densidad del antigeno o epftopo pero aumentando el area de superficie sobre la cual se inmoviliza el antigeno, o ambos.

Se pueden utilizar micromatrices para realizar multiples analisis para autoanticuerpos de diferente especificidad en paralelo. Esto se puede realizar utilizando matrices que comprenden multiples conjuntos de antigenos diferentes, comprendiendo cada conjunto un antigeno concreto en multiples cantidades o concentraciones diferentes. El termino "antfgenos" diferentes abarca antigenos derivados de protemas o polipeptidos diferentes (tales como antigenos derivados de protemas no relacionadas codificadas por genes diferentes) y tambien antigenos que derivan de diferentes epftopos peptfdicos de una unica protema o polipeptido. Una micromatriz dada puede incluir exclusivamente conjuntos de diferentes antigenos obtenidos de protemas o polipeptidos diferentes, o exclusivamente conjuntos de antigenos diferentes derivados de epftopos peptfdicos diferentes de una unica protema o polipeptido, o una mezcla de los dos en cualquier proporcion. Cabe senalar que en todas las realizaciones de la invencion, se prefiere que cada serie de titulacion de antfgeno individual comprenda diferentes cantidades o concentraciones de solo un tipo de antigenos y no mezclas de antfgenos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "fluido corporal", cuando se refiere al material que se va a someter a ensayo para determinar la presencia de anticuerpos utilizando el metodo de la invencion, incluye, entre otros, plasma, suero, sangre completa, orina, sudor, linfa, heces, fluido cerebroespinal, ascitis, efusion pleural, ftquido seminal, esputo, material aspirado de pezon, seroma post-operatorio o ftquido de drenaje de heridas. Como se ha mencionado, los metodos de la invencion se llevan a cabo preferiblemente in vitro en diluciones de una muestra de ensayo que comprende fluido corporal retirado del sujeto sometido a ensayo. El tipo de fluido corporal usado puede variar dependiendo de la identidad del autoanticuerpo que se va a someter a ensayo y la situacion clmica en la que se utiliza el analisis. En general, se prefiere realizar los analisis sobre muestras de suero o plasma. La muestra de ensayo puede incluir componentes adicionales ademas de los fluidos corporales, tales como por ejemplo diluyentes, conservantes, agentes estabilizantes, tampones, etc. Las diluciones de la muestra de ensayo se pueden preparar usando cualquier diluyente adecuado. El lector experto apreciara que la razon para la preparacion de diluciones de la muestra de ensayo es simplemente producir una serie de muestras de ensayo que contengan cada una cantidades absolutas diferentes del autoanticuerpo diana a detectar en el inmunoanalisis. No se pretende excluir otros medios para obtener las "muestras de ensayo" que contienen cantidades variables del anticuerpo diana. A modo de ejemplo, una muestra de ensayo extrafda de un paciente podna ser de hecho "concentrada" en lugar de diluida, por ejemplo, usando dialisis, con el fin de obtener una muestra de ensayo que contiene una concentracion mas alta del autoanticuerpo que existe naturalmente. En otras realizaciones, tales como cuando el fluido corporal extrafdo del paciente esta relativamente diluido con respecto al autoanticuerpo diana, el fluido corporal podna ser concentrado primero (p. ej. por dialisis o tecnicas similares) para preparar una provision concentrada que a continuacion se utiliza para preparar una serie de diluciones para su uso en un analisis de acuerdo con la invencion.

El termino "antfgeno" se utiliza en la presente memoria en un sentido amplio para referirse a cualquier sustancia que exhibe reactividad inmunologica espedfica con un anticuerpo diana a detectar. Los antfgenos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, protemas de origen natural, protemas recombinantes o sinteticas o polipeptidos, peptidos sinteticos, peptidomimeticos, etc., tambien polisacaridos y acidos nucleicos. Espedficamente, cuando se utiliza "antfgeno" en la presente memoria se pretende que abarque cualquier agente de captura, ya sea de origen humano, procedente de mairftferos, o de otro modo, capaz de una interaccion inmunologica espedfica con las regiones variables o determinantes de complementariedad del autoanticuerpo que va a ser detectado. Por ejemplo los anticuerpos anti-idiotfpicos pueden ser considerados como un antfgeno para este proposito como lo pueden los antfgenos generados mediante presentacion en fagos.

Ciertos antfgenos pueden comprender o estar derivados de protemas o polipeptidos aislados de fuentes naturales, incluyendo pero no limitados a protemas o polipeptidos aislados a partir de tejidos o fluidos corporales del paciente. En tales realizaciones, el antfgeno puede comprender sustancialmente la totalidad de la protema de origen natural, esto es, la protema sustancialmente en la forma en la que esta aislada de la fuente natural, o puede comprender un fragmento de la protema de origen natural. Para ser eficaz como antfgeno en el metodo de la invencion cualquiera de tales "fragmentos" debe conservar la reactividad inmunologica con los autoanticuerpos para los cuales se utilizara para el ensayo. Los fragmentos adecuados pueden, por ejemplo, prepararse mediante escision qmmica o enzimatica de la protema aislada.

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Dependiendo de la naturaleza precisa del analisis en el que se va a utilizar, el antigeno puede comprender una biomolecula de origen natural (p. ej. una protema, o fragmento de la misma), conectada a una o mas moleculas adicionales que confieren alguna caractenstica deseable no presente de forma natural en la biomolecula. Por ejemplo, la biomolecula (p. ej. fragmento de protema o polipeptido) puede ser conjugada con un marcador indicador, tal como por ejemplo un marcador fluorescente, marcador colorante, marcador luminiscente, radiomarcador o metal pesado tal como oro coloidal. En otras realizaciones se puede expresar una protema o fragmento como una protema de fusion. A modo de ejemplo, las protemas de fusion puede incluir una etiqueta peptfdica en el extremo N o C para ayudar a la purificacion del antigeno expresado de forma recombinante.

Dependiendo del formato del analisis en el que se vaya a utilizar, el antigeno puede ser inmovilizado sobre un soporte solido tal como, por ejemplo, los pocillos de una placa de microtitulacion, cuentas de micromatrices o chips o cuentas magneticas. La inmovilizacion puede realizarse a traves de adsorcion no covalente o anclaje covalente.

Se puede utilizar cualquier medio de anclaje adecuado siempre que este no afecte adversamente a la capacidad del antigeno para reaccionar inmunologicamente con el anticuerpo diana en un grado significativo.

La invencion no se limita al analisis en fase solida, sino que tambien abarca los analisis que, en su totalidad o en parte, se llevan a cabo en fase lfquida, por ejemplo, analisis con cuentas en fase de solucion.

En una realizacion, los antfgenos se pueden marcar con un ligando que facilite la inmovilizacion, tal como biotina. El antfgeno se puede diluir a continuacion a un intervalo de titulacion adecuado y despues se deja reaccionar con autoanticuerpos en muestras de pacientes en solucion. Los complejos inmunitarios resultantes se puede inmovilizar a continuacion en un soporte solido a traves de una interaccion ligando-receptor (p. ej. biotina-estreptavidina) y realizar el resto del analisis como se describe a continuacion.

Para facilitar la produccion de antfgenos polipeptfdicos biotinilados para su uso en los metodos de analisis de la invencion, los ADNc que codifican un antfgeno del polipeptido completo, una version truncada del mismo o un fragmento antigenico del mismo pueden ser expresados como una protema de fusion marcada con una protema o etiqueta polipeptfdica a la que se puede anclar el co-factor de biotina a traves de una reaccion enzimatica. Los vectores para la produccion de antfgenos recombinantes biotinilados estan disponibles comercialmente de numerosas fuentes.

Una ventaja adicional de la utilizacion del enfoque de titulacion cruzada con antfgenos biotinilados es que el analisis es capaz de distinguir entre la union del componente biotina a anticuerpos anti-biotina y la verdadera union del antfgeno a su autoanticuerpo cognado. Los autores de la presente invencion han observado que una cantidad significativa de la poblacion humana produce naturalmente anticuerpos anti-biotina que podnan conducir a la produccion de resultados falsos positivos en analisis basados en el uso de antfgenos biotinilados.

Como se ha mencionado, el "inmunoanalisis" utilizado para detectar anticuerpos de acuerdo con la invencion puede estar basado en mecanismos convencionales conocidos en la tecnica, con la excepcion de que se utilizan multiples cantidades de antfgeno para crear una serie de titulacion que puede hacerse reaccionar con multiples diluciones diferentes de la muestra de ensayo seleccionada. En una realizacion mas preferida, el inmunoanalisis puede ser un ELISA. Los ELISA son generalmente bien conocidos en la tecnica. En un ELISA "indirecto" tfpico un antfgeno que tiene especificidad por los anticuerpos sometidos a ensayo se inmoviliza sobre una superficie solida (p. ej. los pocillos de una placa de analisis de microtitulacion convencional, o la superficie de una microcuenta o una micromatriz) y una muestra que comprende el fluido corporal que se va a someter a ensayo para determinar la presencia de autoanticuerpos se pone en contacto con el antfgeno inmovilizado. Cualquiera de los autoanticuerpos de la especificidad deseada presente en la muestra se unira al antfgeno inmovilizado. Los complejos de autoanticuerpo/antfgeno unidos se pueden detectar a continuacion utilizando cualquier metodo adecuado. En una realizacion preferida, se utiliza un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana secundario marcado, que reconoce espedficamente un epttopo comun para una o mas clases de inmunoglobulinas humanas, para detectar los complejos autoanticuerpo/antfgeno. Tfpicamente, el anticuerpo secundario sera anti-IgG o anti-IgM. El anticuerpo secundario esta generalmente marcado con un marcador detectable, tfpicamente un marcador enzimatico tal como, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina, que permite la deteccion cuantitativa mediante la adicion de un sustrato para la enzima que genera un producto detectable, por ejemplo un producto coloreado quimioluminiscente o fluorescente. Se pueden utilizar otros tipos de marcadores detectables conocidos en la tecnica.

La invencion se refiere a un metodo para detectar anticuerpos que son marcadores biologicos de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad. Este aspecto concreto de la invencion excluye preferiblemente los analisis disenados para someter a ensayo los anticuerpos producidos como resultado de una sensibilizacion por vacuna o un protocolo de inmunizacion, distinto de la vacunacion con marcadores para el cancer. Por lo tanto, los analisis de acuerdo con este aspecto de la invencion preferiblemente no incluyen los analisis disenados para someter a ensayo la presencia de anticuerpos anti-virales o anti-bacterianos despues de la vacunacion/inmunizacion.

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El anticuerpo es un autoanticuerpo. Como se indico anteriormente, el termino "autoanticuerpo" se refiere a un anticuerpo de origen natural dirigido a un antigeno que el sistema inmunitario de un individuo reconoce como foraneo incluso si ese antigeno realmente se origino en el individuo. Los autoanticuerpos incluyen anticuerpos dirigidos contra formas alteradas de protemas de origen natural producidas por una celula enferma o durante un proceso de enfermedad. La forma alterada de la protema se origina en el individuo, pero puede ser considerado por el sistema inmunitario del individuo como "no propia" y por lo tanto provocar una respuesta inmunitaria en ese individuo en forma de autoanticuerpos inmunologicamente espedficos para la protema alterada. Tales formas alteradas de una protema pueden incluir, por ejemplo, mutantes que tienen la secuencia de aminoacidos alterada, opcionalmente acompanada de cambios en la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, formas truncadas, variantes de empalme, glicoformas alteradas, etc. En otras realizaciones, el autoanticuerpo se puede dirigir a una protema que esta expresada en exceso en un estado de enfermedad, por ejemplo como resultado de amplificacion genica o regulacion transcripcional anormal. La expresion en exceso de una protema que no se encuentra normalmente por las celulas del sistema inmunitario en cantidades significativas, puede desencadenar una respuesta inmunitaria que conduce a produccion de autoanticuerpos. En otras realizaciones adicionales el autoanticuerpo se puede dirigir a una forma fetal de una protema que se expresa en un estado de enfermedad. Si una protema fetal que normalmente se expresa solo en las primeras etapas de desarrollo antes de que el sistema inmunitario sea funcional se expresa en un estado de enfermedad, la forma fetal puede ser reconocida por el sistema inmunitario como "extrana", desencadenando una respuesta inmunitaria que conduce a la produccion de autoanticuerpos .

En una realizacion, el anticuerpo puede ser un autoanticuerpo espedfico para una protema marcadora de tumores, y mas particularmente un autoanticuerpo anti-tumoral "asociado al cancer".

El termino autoanticuerpo anti-tumoral "asociado al cancer" hace referencia a un autoanticuerpo que se dirige contra un epftopo presente en las formas de protemas marcadoras de tumores que se expresan preferentemente en el estado de enfermedad del cancer. La presencia de tales autoanticuerpos es caractenstica del estado de enfermedad del cancer, o de predisposicion al cancer en pacientes asintomaticos.

En aplicaciones preferidas, el metodo de la invencion se utilizara para detectar la presencia de autoanticuerpos antitumorales asociados al cancer en muestras de ensayo derivadas de sujetos o pacientes humanos (aunque el metodo se puede utilizar en muestras de ensayo derivadas de otros mairnferos no humanos), y muy preferentemente adoptara la forma de un inmunoanalisis in vitro, realizado en dos o mas diluciones de una muestra de ensayo que comprende una muestra de fluido corporal tomada del sujeto/paciente. La muestra de fluido corporal puede diluirse en cualquier tampon adecuado y puede ser tratada para su almacenamiento a largo plazo o de otro modo antes de la prueba.

Los inmunoanalisis in vitro son no invasivos y pueden repetirse tan a menudo como se considere necesario para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos en un paciente, ya sea antes de la aparicion de la enfermedad, como en el escrutinio de individuos "en riesgo", o durante todo el curso de la enfermedad (comentado adicionalmente mas adelante con relacion a las aplicaciones preferidas del metodo).

En realizaciones particulares, pero no limitantes, los metodos de la invencion pueden comprender inmunoanalisis para detectar (simultaneamente) dos o mas tipos de autoanticuerpos, teniendo cada uno especificidad por diferentes epttopos en protemas marcadoras de tumores iguales o relacionadas (p. ej. diferentes isoformas o variantes codificadas por un unico gen) o por epttopos de diferentes protemas marcadoras de tumores (es decir, las protemas codificadas por diferentes genes). Estos metodos tfpicamente implicaran el uso de un panel de dos o mas conjuntos de antfgenos, derivandose cada conjunto de antfgenos normalmente de una protema marcadora de tumores diferente (diferente en este contexto significa protemas que son productos de genes diferentes) aunque, como se senalo anteriormente un conjunto de antfgenos tambien podna implicar diferentes epftopos en la misma protema marcadora de tumores. Un "conjunto" de los antfgenos se refiere a un solo antfgeno que se va a someter a ensayo a diferentes cantidades/concentraciones en el metodo de la invencion. Estos metodos, que pueden ser denominados en lo sucesivo "analisis de panel", utilizan un panel de dos o mas conjuntos de antfgenos para controlar la respuesta inmunitaria global de un individuo a un tumor u otro cambio carcinogenico/neoplasico. Estos metodos detectan asf un "perfil" de la respuesta inmunitaria en un individuo dado, indicando que marcadores tumorales provocan una respuesta inmunitaria que da como resultado la produccion de autoanticuerpos. El uso de un panel de dos o mas antfgenos para controlar la produccion de autoanticuerpos contra dos o mas marcadores tumorales diferentes generalmente es mas sensible que la deteccion de autoanticuerpos contra marcadores individuales y proporciona una frecuencia mucho menor de resultados falsos negativos (veanse los documentos WO 99/58978 y WO 2004/044590).

Por lo tanto, la invencion proporciona un metodo para construir un perfil de produccion de autoanticuerpo para dos o mas anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto marnffero en el que al

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menos uno de dichos autoanticuerpos es un marcador biologico de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, cuyo metodo comprende:

(a) preparar dos o mas diluciones diferentes de dicha muestra de ensayo y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

(i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con dos o mas conjuntos de antfgenos, en donde cada uno de dichos conjuntos de antfgenos es espedfico para uno de dichos autoanticuerpos que van a ser detectados en la muestra de ensayo y en donde cada conjunto de antigenos comprende una pluralidad de cantidades diferentes del mismo antigeno,

(ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el autoanticuerpo y el antigeno para cada cantidad de antigeno en cada conjunto de antfgenos utilizados en la etapa (i),

(b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antigeno para cada dilucion de la muestra de ensayo con cada conjunto de antigenos utilizados en la etapa (a), en donde la presencia en la muestra de ensayo de autoanticuerpo reactivo con uno cualquiera de los conjuntos de antfgenos usados en el analisis se indica mediante una curva generalmente en forma de S o sigmoidea para al menos dos diluciones diferentes de la muestra de ensayo con ese conjunto de antigenos.

En una realizacion de este metodo cada uno de dichos dos o mas autoanticuerpos sera un marcador biologico de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, sin embargo, esta dentro del alcance de la invencion combinar un analisis de titulacion cruzada para un antigeno marcador de la enfermedad con un analisis de titulacion cruzada para cualquier otro tipo de autoanticuerpo, que puede o no ser un marcador de la enfermedad, en la misma muestra de ensayo.

De cualquier manera el criterio para determinar si los autoanticuerpos relevantes estan o no estan presentes en la muestra de ensayo se basa en la cantidad de union espedfica observada a cada una de las diferentes concentraciones de antigeno con respecto a cada antigeno diferente en el ensayo, en otras palabras los valores colectivos para cada antigeno en lugar de una lectura a una sola concentracion para cada antfgeno. Por lo tanto, la determinacion de la presencia o ausencia de estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad en base a la presencia de dos o mas tipos de autoanticuerpos en una muestra del paciente puede estar basada en estos valores colectivos para cada antigeno. Preferiblemente, la evaluacion se realiza sobre la base de la presentacion de una curva generalmente en forma de S o sigmoidea para al menos dos diluciones diferentes de la muestra de ensayo con respecto a cualquiera o todos los antfgenos presentes en la prueba.

Para evitar dudas, los analisis basados en el uso de un solo tipo de antfgeno para detectar anticuerpos pueden ser denominados en la presente memoria como "analisis de un solo marcador", mientras que los analisis basados en el uso de un panel de dos o mas antfgenos se denominan "analisis de panel".

En una realizacion preferida del metodo de analisis de panel, al menos uno y preferiblemente todos los anticuerpos detectados en el analisis son autoanticuerpos reactivos con protemas marcadoras de tumores.

Los analisis de titulacion cruzada de acuerdo con la invencion se pueden adaptar para su uso en la deteccion de autoanticuerpos contra esencialmente cualquier protema marcadora de tumores para la que se puede preparar un antfgeno adecuado, como un analisis de un solo marcador o como un componente de un analisis de panel. En particular, el metodo puede adaptarse para detectar/medir autoanticuerpos inmunologicamente espedficos para una cualquiera o cualquier combinacion de dos o mas de las siguientes protemas marcadoras de tumores, mediante el uso de los antfgenos correspondientes:

Protema del receptor del factor de crecimiento epidermico EGFR (Downward et al (1984) Nature. 307: 521527; Robertson et al.(2001) Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126;177-81);

MUC1 (Batra, S. K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology. 12: 271-283);

Myc (c-myc) (Blackwood, E. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609); p53 (Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 18871893);

ras (o Ras) (Capella, G. et al. (1991) Environ Health Perspectives. 93: 125-131);

BRCA1 (Scully, R. et al. (1997) PNAS 94: 5605-10);

BRCA2 (Sharan, S. K. et al. (1997) Nature. 386: 804-810);

APC (Su, L. K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 2728-2731;Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92: 3046-50); CA125 (Nouwen, E. J. et al. (1990) Differentiation. 45: 192-8; Norum LF, et al., Tumour Biol. 2001 Jul- Ag;22(4):223-8; Perey L, et al., Br J Cancer. 1990 Oct;62(4):668-70; Devine PL, et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun;12(3):709-17);

PsA (Rosenberg, R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248: 935-939);

Antfgeno carcinoembrionario CEA (Duffy, M.J. (2001) Clin Chem, Abr 47 (4): 624-30) ;

CA19.9 (Haga, Y. et al (1989) Clin Biochem (1989) Oct 22(5): 363-8);

NY-ESO-1 (antfgeno cancer/testmulo; Chen, Y.-T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 1914-1918, 1997);

PSMA (antfgeno de membrana espedfico de prostata; Israeli, R. S. et al., Cancer Res. 53: 227-230, 1993);

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PSCA (antfgeno de celulas madre prostaticas; Reiter, R. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998);

EpCam (molecula de adherencia celular epitelial; Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 3542-3546, 1990);

HER2-neu (tambien conocido como c-erbB2) (Coussens, L. et al., Science 230: 1132-1139, 1985);

EDC6, que es un nombre alternativo para el dominio extracelular de HER2.

CAGE (Jager D, et al., Cancer Res. 1999 Dec 15;59(24):6197-204; Mashino K, et al., Br J Cancer. 2001 Sep 1;85(5):713-20);

Citoqueratinas (Moll R, et al., Cell. 1982 Nov;31(1):11-24; Braun S, et al., N Engl J Med. 2000; 342: 525533). El termino "citoqueratina" se utiliza genericamente para referirse a cualquier miembro de la familia de las citoqueratinas para las que los autoanticuerpos correspondientes funcionan como marcadores tumorales. Los ejemplos preferidos son las citoqueratinas 5/14, 8/18 (Kim MJ, Ro JY, Ahn SH, Kim HH, Kim SB, Gong G Hum Pathol. 2006 Sep;37(9):1217-26. Epub 2006 Jul 18); las citoqueratinas 7, 20 (Vang R, Gown AM, Barry TS, Wheeler DT, Yemelyanova A, Seidman JD, Ronnett BM. Am J Surg Pathol. 2006 Sep;30(9):1130-1139); y las citoqueratinas 8/18/19 (Barak V, Goike H, Panaretakis KW, Einarsson R. Clin Biochem. 2004 Jul;37(7):529-40).

Recoverina (Maeda A, et al., Cancer Res. 2000 Apr 1;60(7):1914-20);

Calicremas (Kim H, et al., Br J Cancer 2001;84:643-650; Yousef GM, et al., Tumor Biol 2002;23:185-192). El termino "calicrema" se utiliza genericamente para referirse a cualquier miembro de la familia de las calicremas para las que los autoanticuerpos correspondientes funcionan como marcadores tumorales. Los ejemplos preferidos son las calicremas 1 a 15 (KLK 1-15/Hk1-Hk15) (Obiezu CV, Diamandis EP. Cancer Lett. 2005 Jun 16;224(1):1-22;Diamandis EP, Yousef GM. Clin Chem. 2002 Ag;48(8):1198-205), y en concreto KLK 4-7 (Prezas P, Arlt MJ, Viktorov P, Soosaipillai A, Holzscheiter L, Schmitt M, Talieri M, Diamandis EP, Kruger A, Magdolen V. Biol Chem. 2006 Jun;387(6):807-11; Diamandis EP, Yousef GM, Luo LY, Magklara A, Obiezu CV. The new human kallikrein gene family: implications in carcinogenesis. Trends Endocrinol Metab. 2000 Mar;11(2):54-60. Review.);

Anexinas (Hudelist G, et al., Breast Cancer Res Treat. 2004 Aug;86(3):281-91; Gerke, V. & Moss, S.E. Physiological Reviews 2002 82: 331-371). El termino "anexina" se utiliza genericamente para referirse a cualquier miembro de la familia de las anexinas para las que los autoanticuerpos correspondientes funcionan como marcadores tumorales. Los ejemplos preferidos son las anexinas 1 y 2 (Pedrero, J.M.G., Fernandez, M.P., Morgan, O., Zapatero, A. H., Gonzalez, M.V., Nieto, C. S. & Rodrigo, J.P. American Journal of Pathology 2004 164(1): 73-79; Brichory, F.M., Misek, D.E., Yim, A., Krause, M.C., Giordano, T. J., Beer, D.G., Hanash, S.M. 2001 Medical Sciences 98(17): 9824-9829) y anexina XI-A (Fernandez-Madrid, F., Tang, N., Alansari, H., Granda, J. L., Tait, L., Amirikia, K. C., Moroianu, M., Wang, X. & Karvonen, R.L. Cancer Research 2004 64: 5089-5096);

a-fetoprotema (AFP) (Stiller D, et al., Acta Histochem Supl. 1986;33:225-31);

GRP78 (Block TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Enero 18;102(3):779-84; Hsu WM, et al., Int J Cancer. 2005 Mar 1;113(6):920-7);

Mamaglobina (Zehentner BK, et al., Clin Chem. 2004 Nov;50(11):2069-76; Zehentner BK, Carter D. Clin Biochem. 2004 Apr;37(4):249-57);

raf (Callans LS. et al., Ann Surg Oncol. 1995 Jan;2(1):38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. 1998 Dic;189(1-2):119-25);

beta gonadotropina corionica humana b-HCG (Ayala AR, et al., Am J Reprod Immunol. 1983 Apr- May;3(3):149-51; Gregory JJ Jr, et al., Drugs. 1999 Abr; 57(4):463-7); antfgeno 4-5 (Krause P, et al., J Immunol Methods. 2003 Dec;283(1-2):261-7);

NY-BR-1 (Jage D, Stockert E, Gure AO, Scenlan MJ, Karbach J, Jage E, Knuth A, Old LJ, Chen YT. (2001) Identification of a tissue-specific putative transcription factor in breast tissue by serological screening of a breast cancer library. Cancer Res 61 (5): 2055-61);

Livina (Kasof GM, Gomes BC (2001) Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family. J Biol Chem, 276 (5): 3238-46);

Survivina (Ambrosini G, Adida C, Altieri DC (1997) A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nature Med, 3 (8): 917-21);

MUC2 (gMcoprotema)

Griffiths B, Matthews DJ, West L, Attwood J, Povey S, Swallow DM, Gum JR Kim YS (1990) Assignment of the polymorphic intestinal mucin gene MUC2 to chromosome-11p15. Ann Hum Genet, 54: 277-85.

Endostatina (Standker L, Schrader M, Kanse SM, Jurgens M, Forssmann WG, Preissner KT (1997) Isolation and characterisation of the circulating form of human endostatin. FEBS Lett, 420 (2-3): 129-33;

Bcl-2 (Tsujimoto Y, Croce CM (1986) Analysis of the structure, transcripts, and protein products of Bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma. PNAS USA, 83 (14): 5214-8);

BIRC7 (Wu Hy, Ma Yh, Zhu Yk, Shen Y, Gu CM, Ye ZY, Lin HL (2006) The expression of BIRC7 protein and mRNA in non-Hodgkin's lymphoma. Leukemia & Lymphoma 47 (6): 1110-6);

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Protemas de choque termico (el termino protemas de choque termico se utiliza genericamente para referirse a cualquier protema de choque termico para las que los autoanticuerpos correspondientes funcionan como marcadores tumorales) incluyendo pero no exclusivamente:HSP70 (Tauchi K, Tsutsumi Y, Hori S, Yoshimura S, Osamura Ry, Watanabe K (1991) Expression of heat shock protein-70 and c-myc protein in human breast-cancer - an immunohistochemical study. Jap J Clin Oncol, 21 (4): 256-63); HSP27 (Differential expression of alphaB-crystallin and Hsp27-1 in anaplastic thyroid carcinomas because of tumor-specific alphaB-crystallin gene (CRYAB) silencing.Mineva I, Gartner W, Hauser P, Kainz A, Loffler M, Wolf G, Oberbauer R, Weissel M, Wagner L. Cell Stress Chaperones. 2005 Autumn; 10(3:171-84); y CRYAB (Seitz S, Korsching E, Weimer J, Jacobsen A, Arnold N, Meindl A, Arnold W, Gustavus D, Klebig C, Petersen I, Scherneck S. Genes Chromosomes Cancer. 2006 Jun;45(6):612-27).

No55 (Fossa A, Siebert R, Aasheim HC, Maelandsmo GM, Berner A, Fossa SD, Smeland EB Gaudernack G (2000) Identification of a nucleolar protein No55 as a tumour-associated auto-antigen in patients with prostate cancer. Br J Cancer 83 (6): 743-9).

Activador del Plasminogeno de tipo Uroquinasa (uPA) (Booyse FM, Osikowicz G, Feder S, Scheinbuks J (1984) Isolation and characterisation of a urokinase-type plasminogen activator (MR = 54,000) from cultures human epithelial cells indistinguishable from urinary urokinase. J Biol Chem 259 (11): 7198-205);

Tetranectina (protema de union a plasminogeno) (Clemmensen I, Petersen LC, Kluft C (1986)Purification and characterization of a novel, Oligomeric, Plasminogen Kringle 4 binding-protein from human plasma -Tetranectin. Eur J Biochem 156 (2): 237-333);

Prolactina (Riddle O, bates RW, Dykshorn SW (1933) The preparation, identification and assey of prolactin - A hormone of the anterior pituitary. Am J Physiol 105 (1): 191-216);

Osteopontina (Butler WT, Martin TJ, Raisz LG, Slavkin HC Termine JD, Rodan GA, Veis A (1988) Osteopontin - Structure and biological activity. CBA Foundation Symposia 136: 203-206; Kiefer MC, Bauer DM, Barr PJ (1989) The CDNA and derived amino-acid sequence for human Osteopontin. Nuclei Acids Res 17 (8): 3306-3306);

Protema espedfica de epidfdimo humano (HE4) Kirchoff C, Habben I, Ivell R, Krull N (1991) A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase-inhibitors. Biology of Reproduction 45 (2): 350-357);

Inhibidor de tripsina asociado a tumores (TATI) (Huhtala ML, Kahanpaa K, Seppala M, Halila H, Stenman UH (1983) Excretion of a tumour associated trypsin-inhibitor (TATI) in urine of patients with Gynecological Malignancy. Int J Cancer 31 (6): 711-714, 1983;

Inhibina (Chari S, Hopkinson CRN, Fritze E, Sturm G, Hirschhauser C. (1977) Partial-Purification of Inhibin from Human Testicular Extracts. ACTA Endocrinologia 85 (Suppl 212) : 215-219) ;

Vimentina (Yang YC, Li X, Chen W. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2006 Sep;38(9):602-10);

Cox-1 y Cox-2 (Xu Z, Choudhary S, Voznesensky O, Mehrotra M, Woodard M, Hansen M, Herschman H, Pilbeam C. Cancer Res. 2006 Jul 1;66(13):6657-64; Cervello M, Montalto G. World J Gastroenterol. 2006 Aug 28;12(28):5113- 5121).

Se apreciara que se pretende que la invencion no este destinada a la deteccion de los autoanticuerpos para los marcadores tumorales espedficos mencionados anteriormente a modo de ejemplo solamente.

Se pueden emplear metodos de analisis de acuerdo con la invencion basandose en la deteccion de autoanticuerpos marcadores anti-tumorales (en forma de analisis de un solo marcador o de un panel) en una variedad de situaciones clmicas diferentes. En particular, el metodo se puede utilizar en la deteccion o el diagnostico de cancer en sujetos humanos sintomaticos o asintomaticos, en la evaluacion de la prognosis de un paciente diagnosticado con cancer, en la prediccion de la respuesta a la terapia, en el seguimiento del progreso del cancer u otra enfermedad neoplasica en un paciente, en la deteccion de un cambio neoplasico temprano o carcinogenico temprano en un sujeto humano asintomatico, en el escrutinio de una poblacion de sujetos humanos asintomaticos, con el fin de identificar los sujetos que estan en riesgo creciente de desarrollar el cancer o para diagnosticar la presencia de cancer, en la prediccion de la respuesta de un paciente con cancer al tratamiento anti-cancer (por ejemplo, vacunacion, terapias anti-factor de crecimiento o de transduccion de la senal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), en el seguimiento de la respuesta de un paciente con cancer al tratamiento anti-cancer (p. ej. vacunacion, terapias anti-factor de crecimiento o de transduccion de senal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), en la deteccion de una enfermedad recurrente en un paciente previamente diagnosticado de cancer que se ha sometido a tratamiento contra el cancer para reducir la cantidad de cancer presente, o en la seleccion de una terapia anti-cancer (p. ej. vacunacion, terapias anti-factor de crecimiento o transduccion de la senal, radioterapia, terapia endocrina, quimioterapia para el tratamiento con anticuerpos humanos), en la deteccion de una enfermedad recurrente en un paciente al que previamente se ha diagnosticado de cancer que ha experimentado un tratamiento anticanceroso para reducir la cantidad de cancer presente, o en la seleccion de una terapia anti-cancerosa (p. ej. vacunacion, terapias anti-factor de crecimiento o transduccion de la senal, radioterapia, terapia endocrina, quimioterapia para el tratamiento con anticuerpos humanos) para su uso en un paciente concreto.

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Los autores de la presente invencion han observado generalmente que los niveles de autoanticuerpos asociados con el cancer muestran una correlacion positiva con el estado de la enfermedad (vease tambien WO 99/58979). Por lo tanto, cuando el metodo de la invencion se usa en aplicaciones clmicas generalmente se toman generalmente como indicacion del estado de enfermedad cancerosa niveles incrementados de autoanticuerpos marcadores anti- tumorales, en comparacion con controles adecuados, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria.

Cuando los inmunoanalisis se usan en el diagnostico del cancer en un individuo humano (sintomatico o asintomatico para el cancer), la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con individuos control "normales", se toma generalmente como una indicacion de que el individuo tiene cancer. Los individuos de control "normales" seran preferiblemente controles emparejados por edad que no tienen un diagnostico de cancer basado en criterios clmicos, de formacion de imagenes y/o bioqmmicos. Una aplicacion particularmente util de este metodo es para someter a ensayo sujetos humanos que ya manifiestan los smtomas del cancer (p. ej. basandose en la criterios clmicos, de formacion de imagenes y/o bioqmmicos) con el fin de ayudar a elaborar o confirmar un diagnostico de cancer.

Cuando los inmunoanalisis se usan para predecir la respuesta de un paciente con cancer a un tratamiento anticancer (p. ej. vacunacion, terapias anti-factor de crecimiento o de transduccion de la senal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con los individuos control "normales", se puede tomar como una indicacion de si es probable o no que el individuo que responda al tratamiento anti-cancer. Los individuos de control "normales" seran preferiblemente controles emparejados por edad que no tienen un diagnostico de cancer basado en criterios clmicos, de formacion de imagenes y/o bioqmmicos. Para cada uno de los tratamientos enumerados anteriormente, puede establecerse una relacion entre el nivel de autoanticuerpos en comparacion con los controles y las probabilidades de exito del tratamiento mediante la observacion de los resultados de tal tratamiento en los pacientes cuyo estado de autoanticuerpos se controla durante todo el tratamiento. La relacion previamente establecida se puede utilizar a continuacion para predecir la probabilidad de exito para cada tratamiento en un paciente determinado basandose en la evaluacion del estado de autoanticuerpos.

Cuando los inmunoanalisis se utilizan en el seguimiento de la evolucion del cancer o de otra enfermedad neoplasica en un paciente, la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con un "control normal", se toma como una indicacion de la presencia de cancer en el paciente. El "control normal" pueden ser los niveles de autoanticuerpos presentes en los individuos de control, preferiblemente emparejados por edad, que no tienen ningun diagnostico de cancer basado en criterios clmicos, de formacion de imagenes y/o bioqmmicos. Alternativamente, el "control normal" puede ser un nivel de "referenda" establecido para el paciente concreto sometido a ensayo. El nivel de "referenda" puede ser, por ejemplo, el nivel de autoanticuerpos presentes cuando se realizo un primer diagnostico de cancer o un diagnostico de cancer recurrente. Cualquier aumento por encima del nivel de referencia se tomana como una indicacion de que la cantidad de cancer presente en el paciente ha aumentado, mientras que cualquier disminucion por debajo de la referencia se tomana como una indicacion de que la cantidad de cancer presente en el paciente ha disminuido. El valor de "referencia" tambien puede ser, por ejemplo, el nivel antes de comenzar un nuevo tratamiento. Un cambio en el nivel de autoanticuerpos se tomana como una indicacion de la eficacia de la terapia. La direccion del "cambio" (es decir, aumento frente a disminucion) que indica una respuesta positiva al tratamiento dependera de la naturaleza precisa del tratamiento. Para cualquier tratamiento dado la direccion del "cambio" en los niveles de autoanticuerpos que indica un resultado positivo puede determinarse facilmente, por ejemplo mediante el control de los niveles de autoanticuerpos en comparacion con otros indicadores clmicos o bioqmmicos de respuesta al tratamiento.

Cuando los inmunoanalisis se utilizan en el escrutinio de una poblacion de sujetos humanos asintomaticos esto puede ser para identificar a los sujetos que tienen un riesgo mayor de desarrollar cancer, los individuos que tienen un nivel elevado de anticuerpos, en comparacion con los individuos de control "normales", se identifican por estar "en riesgo" de desarrollar cancer. Los individuos de control "normales" seran preferiblemente controles emparejados por edad no identificados por tener alguna predisposicion a desarrollar cancer o un riesgo elevado significativo de desarrollar cancer. Una excepcion a esto puede ser que la edad es en sf misma un factor de riesgo importante.

Cuando los inmunoanalisis se usan en el escrutinio de una poblacion de sujetos humanos asintomaticos esto puede ser para diagnosticar el cancer en aquellos sujetos que ya han desarrollado un cancer, puntuandose los individuos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos en comparacion con los individuos de control "normales" por tener cancer o alguna forma de cambio neoplasico. Los individuos "normales" de control seran preferiblemente controles emparejados por edad no identificados por tener alguna predisposicion a desarrollar cancer o un riesgo elevado significativo de desarrollar cancer. Una excepcion a esto puede ser cuando la edad es en sf misma un factor de riesgo importante. Alternativamente, el "control normal" puede ser un nivel de "referencia" establecido para el paciente concreto sometido a ensayo. El nivel de "referencia" puede ser, por ejemplo, el nivel de autoanticuerpos presentes cuando el paciente sometio a ensayo en primer lugar y se encontro que tema niveles no elevados por encima de una poblacion de "control normal". Cualquier aumento a partir de entonces frente a esta medida de

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referencia se tomana como una indicacion de la presencia de cancer en ese individuo. As^ el individuo podna a traves de un ensayo de referencia convertirse en su propio control para una futura medicion de autoanticuerpos.

Cuando los inmunoanalisis se usan en el control de la respuesta de un paciente con cancer a tratamiento anti-cancer (p. ej. vacunacion, terapias anti-factor de crecimiento o de transduccion de la senal, radioterapia, terapia endocrina, terapia con anticuerpos humanos, quimioterapia), la presencia de una alteracion del nivel de autoanticuerpos despues del tratamiento se toma como una indicacion de que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento. Un nivel de referencia de autoanticuerpos tomado antes de iniciar el tratamiento se puede utilizar para fines comparativos con el fin de determinar si el tratamiento da como resultado un aumento o disminucion en los niveles de autoanticuerpos. Un cambio en el nivel de autoanticuerpos se tomana como una indicacion de la eficacia de la terapia. La direccion del "cambio" (es decir, aumento frente a disminucion) que indica una respuesta positiva al tratamiento dependera de la naturaleza precisa del tratamiento. Para cualquier tratamiento dado la direccion del "cambio" en los niveles de autoanticuerpos que indica un resultado positivo puede determinarse facilmente, por ejemplo mediante el control de los niveles de autoanticuerpos en comparacion con otros indicadores clmicos o bioqmmicos de respuesta al tratamiento.

El metodo de la invencion se puede utilizar para predecir y/o controlar la respuesta de un individuo esencialmente a cualquier tratamiento conocido contra el cancer. Esto incluye, por ejemplo, la terapia con anticuerpos humanos en la que se infunden en el paciente anticuerpos monoclonales o policlonales, siendo un ejemplo no limitante espedfico el tratamiento con el anticuerpo anti-factor de crecimiento Herceptin™ (Baselga, J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14 (3), 737-744, 1996). La presencia de una respuesta de autoanticuerpos natural puede mejorar o inhibir la eficacia del tratamiento con infusion de anticuerpos terapeuticos artificialmente. Utilizando el metodo de la invencion, es posible correlacionar la respuesta a cualquier tratamiento anti-cancer, incluyendo terapia de anticuerpos, con los niveles naturales de autoanticuerpos antes y durante el curso del tratamiento en cualquier paciente o grupo de pacientes. Este conocimiento puede a su vez utilizarse para predecir como respondera otros pacientes (o el mismo paciente en el caso de tratamiento repetido) al mismo tratamiento.

Cuando los inmunoanalisis se usan en la deteccion de enfermedad recurrente, la presencia de un nivel aumentado de autoanticuerpos en el paciente, en comparacion con un "control normal", se toma como una indicacion de que la enfermedad ha reaparecido. El "control normal" puede consistir en niveles de autoanticuerpos presentes en individuos de control, preferiblemente emparejados por edad que no tienen ningun diagnostico de cancer basado en criterios clmicos, imagenologicos y/o bioquimicos. Alternativamente, el "control normal" puede ser un nivel de "referencia" establecido para el paciente concreto sometido a ensayo. El nivel de "referencia" puede ser, por ejemplo, el nivel de autoanticuerpos presentes durante un periodo de remision de la enfermedad basado en criterios clmicos, de formacion de imagenes y/o bioquimicos.

El metodo de analisis de la invencion se puede aplicar en la deteccion de muchos tipos diferentes de cancer, cuyos ejemplos son el cancer de mama, de vejiga, colorrectal, de prostata, de pulmon, de pancreas y de ovario. Los analisis pueden complementar los metodos de escrutinio y vigilancia existentes. Por ejemplo, en el caso de cancer de mama primarios se podnan utilizar inmunoanalisis para autoanticuerpos para alertar a los medicos de la realizacion de biopsias de pequenas lesiones en los mamogramas que no parecen radiograficamente sospechosas o para llevar a cabo la obtencion de imagenes de la mama o para repetir la toma de imagenes antes de lo previsto. En la medicina clmica, se espera que los metodos de analisis de la invencion que sean mas objetivos y reproducibles en comparacion con las tecnicas de formacion de imagenes actuales (es decir, mamograffa y ultrasonido), cuyo exito puede ser dependiente del operario.

Los "analisis de panel" se pueden adaptar teniendo en cuenta la aplicacion clmica particular. Un panel de antfgenos para la deteccion de autoanticuerpos contra al menos p53 y HER2-neu (c-erbB2) es particularmente util para muchos tipos de cancer y, opcionalmente, se puede complementar con otros marcadores que tienen una asociacion conocida con el cancer concreto, o una etapa del cancer concreto, a detectar. Por ejemplo, para el cancer de mama el panel podna incluir adicionalmente MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o mamaglobina y/o EpCAm y/o EGFR y/o citoqueratinas y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o anexina 11A y/o survivina mientras que para el cancer de vejiga el panel podna opcionalmente incluir MUC 1 y/o c-myc, para cancer colorrectal ras y/o APC y/o MUC2, para el cancer de prostata PSA y/o BRCA-1 y/o BRCA2 y/o p62, para el cancer de ovario BRCA1 y/o BRCA2 y/o CA125 y/o beta-HCG y/o calicremas y/o APC y para el cancer de pulmon livina y/o survivina y/o EpCAm y/o recoverina y/o citoqueratinas y/o 1-myc y o CEA y/o MUC 1 y/o recoverina, para el cancer hepatocelular aFp y/o beta HCG y/o gp78 y/o p62 y/o survivina. Hay otras realizaciones preferidas en las que p53 o HER2-neu no son necesariamente esenciales.

En el caso de cancer de mama los paneles adecuados podnan seleccionarse entre los siguientes:

p53 y MUC 1 con HER2-neu y/o c-myc, y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales; p53 y c-myc con HER2-neu y/o MUC1 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales;

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p53 y BRCA1 con c-Erb2 y/o MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales; p53 y BRCA2 con HER2-neu y/o MUC 1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales;

HER2-neu y MUC 1 con p53 y/o c-myc, y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales;

HER2-neu y c-myc con p53 y/o MUC1 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales;

HER2-neu y BRCA1 con p53 y/o MuC 1 y/o c-myc y/o BRCA2 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales;

HER2-neu y BRCA2 con p53 y/o MuC 1 y/o c-myc y/o BRCA1 y/o PSA y/o NY-ESO-1 y/o NY-BR-1 y/o EpCAm y/o mamaglobina y/o survivina y/o anexina 11A y/o citoqueratinas y/o EpCAm opcionales.

Tales paneles tambien podnan incluir p53 y/o c-myc y/o NY-ESO-1 y/o BRCA2.

En el caso de cancer colorrectal los paneles adecuados podnan seleccionarse por ejemplo entre los siguientes:

p53 y ras con HER2-neu y/o APC y/o MUC 2 opcionales; p53 y APC con HER2-neu y/o Ras y/o MUC2 opcionales;

Ras y APC con p53 y/o HER2-neu y/o MUC2 opcionales. Tales paneles tambien podnan incluir CEA y/o CEA19-9.

En el caso de cancer de prostata los paneles adecuados podnan seleccionarse por ejemplo entre los siguientes: p53 y PSA con BRCA1 y/o BRCA2 y/o HER2-neu y/o p62;

HER2-neu y PSA con p53 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o p62 opcionales.

Tales paneles tambien podnan incluir PSMA y/o PSCA y/o calicremas.

En el caso de cancer de ovario los paneles adecuados podnan seleccionarse por ejemplo entre los siguientes: p53 y CA125 con HER2-neu y/o BRCA1 y/o BrCa2 y/o APC opcionales;

HER2-neu y CA125 con p53 y/o BRCA1 y/o BRCA2 y/o APC opcionales.

Tales paneles tambien podnan incluir anexinas y/o CAGE y/o 4-5.

En el caso del cancer de pulmon los paneles adecuados se pueden seleccionar entre: p53 y NY-ESO-1, opcionalmente con marcadores adicionales;

HER2, anexinas, livina, survivina, recoverina, MUC 1, c-myc ,1-myc, CEA, beta HCG CAGE, y 4-5.

Cuando el metodo de la invencion se utiliza para llevar a cabo un "analisis de panel" basado en dos o mas antfgenos marcadores de tumor derivados de protemas diferentes, al menos uno de los antfgenos del panel debe ser sometido a ensayo en un analisis de titulacion cruzada de acuerdo con la invencion, basado en un ensayo de dos o mas diluciones de la muestra de ensayo frente a multiples cantidades diferentes de antfgeno para formar una serie de curvas de titulacion, una para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada. Preferiblemente, cada uno de los antfgenos que forman el panel se somete a ensayo de acuerdo con el analisis de titulacion cruzada de la invencion y una serie de curvas de titulacion trazadas/calculadas para cada antfgeno individual en el panel.

La invencion tambien contempla que se pueda utilizar un analisis de titulacion cruzada para la deteccion de al menos un anticuerpo anti-marcador tumoral combinado con un analisis disenado para detectar al menos una protema marcadora de tumores (que puede estar relacionada o no relacionada con el antfgeno utilizado en el analisis de titulacion cruzada) en la misma muestra del paciente. De este modo, los analisis para autoanticuerpos anti- marcadores tumorales y los analisis para protemas marcadoras de tumores se puede llevar a cabo en paralelo en una unica muestra del paciente.

En una realizacion adicional, el metodo de inmunoanalisis de la invencion se puede utilizar en la seleccion de una vacuna contra el cancer para su uso en un paciente concreto. En esta realizacion se somete a ensayo una muestra de fluido corporal tomada del paciente usando un panel de dos o mas antfgenos, cada uno correspondiente a una protema marcadora de tumores diferente, para determinar la fuerza relativa de la respuesta inmunitaria del paciente a cada una de las protemas marcadoras de tumores diferentes. La "fuerza de la respuesta inmunitaria" a una o varias protemas marcadoras de tumores dadas se indica por la presencia y/o la cantidad de autoanticuerpos asociados con cancer espedficos para esa protema marcadora de tumores detectada usando el inmunoanalisis; donde los autoanticuerpos se cuantifican, a mayor nivel de auto-anticuerpos asociados al cancer, mas fuerte es la respuesta inmunitaria. La protema o protemas marcadoras de tumores identificadas por provocar la respuesta inmunitaria mas fuerte o respuestas fuertes en el paciente (es decir, el nivel mas alto de autoanticuerpos) es o son seleccionadas despues para formar la base de una vacuna contra el cancer para su uso en el paciente.

La utilidad del metodo de la invencion no se limita a la deteccion de autoanticuerpos anti-tumorales, aunque el analisis es particularmente util para este proposito. El cancer es solo un ejemplo de una enfermedad donde la deteccion de autoanticuerpos se puede usar como un marcador biologico para el estado de

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enfermedad/susceptibilidad a la enfermedad. Los autores de la presente invencion han demostrado que se obtienen ventajas sustanciales mediante el uso de un enfoque de titulacion cruzada para detectar autoanticuerpos en muestras de pacientes. Por tanto, es razonable concluir que se obtendran ventajas similares con el uso del enfoque de titulacion cruzada para detectar autoanticuerpos que son marcadores biologicos para enfermedades distintas del cancer. El metodo es aplicable por lo tanto a la deteccion de cualquier autoanticuerpo que sirva como un marcador biologico para un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, en cualquier enfermedad que se ha demostrado (o se puede demostrar) que esta asociada con la produccion de autoanticuerpos.

Otras aplicaciones del metodo de la invencion incluyen, pero no estan limitadas a, la deteccion de autoanticuerpos que son marcadores biologicos de enfermedades autoinmunitarias, tales como por ejemplo la artritis reumatoide, el lupus eritematoso generalizado (LEG), cirrosis biliar primaria (CBP), tiroiditis autoinmune (p. ej. tiroiditis de Hashimoto), gastritis autoinmune (p. ej. anemia perniciosa), adrenalitis autoinmune (p. ej. enfermedad de Addison), hipoparatiroidismo autoinmune, diabetes autoinmune (p. ej. diabetes de Tipo 1) o miastenia grave y el escrutinio de muestras de pacientes para la enfermedad renal o hepatica que conduce a insuficiencia o fallo de cualquier organo, y para el escrutinio de muestras de pacientes post-trasplante para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el tejido enfermo (que se ha dejado in-situ tras el trasplante) o contra el tejido trasplantado.

Se describe un metodo para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mairnfero, en donde dicho anticuerpo esta dirigido a una sustancia foranea introducida en dicho sujeto mairnfero, comprendiendo el metodo:

(a) por separado poner en contacto dos o mas diluciones diferentes de dicha muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antfgeno espedfico para dicho anticuerpo,

(b) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada combinacion de muestra de ensayo y antfgeno usada en la etapa (a),

(c) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en la etapa (a), en donde la presencia en la muestra de ensayo de anticuerpo reactivo con el antfgeno usado en el analisis esta indicada por una curva generalmente en forma de S o sigmoidea para al menos dos diferentes concentraciones de la muestra de ensayo.

Aqrn la metodologfa de titulacion cruzada se puede utilizar para evaluar la respuesta inmunitaria de un sujeto mairnfero, y preferiblemente un sujeto humano, a cualquier sustancia foranea introducida en dicho sujeto.

La sustancia foranea puede ser un agente terapeutico, tal como por ejemplo un farmaco o profarmaco, una terapia con anticuerpo humano o vacuna. El metodo puede ser usado para evaluar si la administracion de un agente terapeutico a un paciente desencadena una respuesta inmunitaria que conduce a la produccion de anticuerpos espedficos para un epftopo en el agente terapeutico, o un componente de un vehfculo de liberacion, excipiente, portador etc. administrado con el agente terapeutico.

Los antfgenos pueden ser sinteticos o de origen natural.

El metodo se puede utilizar para evaluar la respuesta inmunitaria a las pequenas moleculas sinteticas, sustancias de origen natural, agentes biologicos de origen natural o producidos sinteticamente, o cualquier combinacion de dos o mas de los anteriores, opcionalmente en combinacion con excipientes, portadores o vehfculos de liberacion.

El metodo se puede utilizar para evaluar la respuesta inmunitaria a una porcion no diana de un agente terapeutico o vacuna. Por porcion "no diana" se entiende una parte componente del agente terapeutico o vacuna administrados que, en el caso de un agente terapeutico, no contribuye directamente a la actividad terapeutica o, en el caso de una vacuna, no se pretende que provoque la produccion de anticuerpos en el anfitrion.

La porcion no diana puede estar presente, por ejemplo, para facilitar la purificacion del agente terapeutico o vacuna o se puede disenar para que ayude a la liberacion, la absorcion o el redirecionamiento del agente terapeutico/vacuna. Los ejemplos de tales porciones "no diana" incluyen, pero no estan limitados a, conectores o marcadores comunmente unidos a polipeptidos expresados recombinantemente, tales como marcas de biotina, etiquetas de histidina etc.

La sustancia foranea puede ser un agente infeccioso, tal como hongos, bacterias, virus o parasitos.

La invencion se comprendera mejor con referencia a los siguientes ejemplos experimentales no limitantes:

Ejemplo 1 - Protocolo general para la titulacion de antfgeno mediante Concentracion de Suero y de Antfgeno Optima (OsAaC) en un analisis de autoanticuerpos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Las muestras de antfgenos marcadores tumorales se pueden preparar mediante expresion recombinante, siguiendo metodos analogos a los descritos en el documento WO 99/58978.

Brevemente, los ADNc que codificaban los antigenos marcadores de interes se clonaron en el vector pET21 (Invitrogen), que habfa sido modificado para codificar una etiqueta de biotina y una etiqueta 6xhistidina para ayudar en la purificacion de la protema expresada. Los clones resultantes se cultivaron en una celula anfitriona bacteriana adecuada (en cuerpos de inclusion), las bacterias se lisaron y se desnaturalizaron y los antigenos expresados se recuperaron por medio de columnas de afinidad con quelato de mquel (Hi-Trap, asequible comercialmente de Amersham, siguiendo el protocolo del fabricante). Los antigenos expresados se renaturalizaron mediante dialisis en tampon apropiado y el rendimiento de la protema expresada se evaluo mediante SDS-PAGE, transferencia Western y ELISA y se cuantifico antes de su almacenamiento. A menos que se indique lo contrario, todos los antigenos utilizados en los siguientes ejemplos se prepararon mediante la expresion recombinante del vector pET21 modificado y por lo tanto se expresaron como protemas de fusion que comprendfan una etiqueta de biotinilacion N- terminal (derivada de pET21) y una etiqueta His C-terminal.

Los numeros de acceso GenBank para diversos ADNc marcadores (o las protemas codificadas) son los siguientes: P53: B003596 c-myc: V00568

HER2 (erbB-2) isoforma a: NP_004439

1. Los antigenos se diluyeron a concentraciones apropiadas en tampon carbonato 0,1 M, despues se diluyeron seriadamente para formar un intervalo de titulacion semi log (vease la tabla 1). Las diluciones del antfgeno se dispensaron en 50pl/pocillo en las filas de una placa de microtitulacion Falcon de acuerdo con la disposicion de la placa utilizando una estacion robotica de pipeteado Tecan Evolyzer. Las placas se cubrieron y se almacenarom a 4°C durante 48 h.

2. Las placas se lavaron una vez en PBS + Tween 20 al 0,1% utilizando un lavador de placas automatico, a continuacion se secaron presionando sobre un panuelo de papel.

3. Las placas se bloquearon con tampon de incubacion de alta concentracion de sal (HSB, PBS + NaCl 0,5 M + casema al 0,1%) a 200 pl/pocillo durante 90 minutos (almacenar cubiertas a 4°C).

4. Durante la incubacion de bloqueo, las muestras de suero se descongelaron, se sometieron a vortice y se diluyeron seriadamente en una serie de semi log de 1/30 a 1/10.000 en HSB a temperatura ambiente en tubos.

5. Las placas se vaciaron y se secaron presionando sobre un panuelo de papel. Las muestras de suero diluidas se dispensaron a 50 pl/pocillo en todos los pocillos de la placa de microtitulacion usando una pipeta multicanal electronica para formar un intervalo de titulacion semi log (vease tabla 1). Las placas se cubrieron y se incubaron durante 90 min a temperatura ambiente con sacudimiento.

6. Etapa de lavado: las placas se lavaron tres veces en PBS + Tween 20 al 0,1% utilizando un lavador de placas automatico, despues se secaron presionando sobre un panuelo de papel.

7. Se dispenso anti-Ig humana de conejo conjugada con peroxidasa de rabano picante (Jackson, 1/10.000 en HSB) a 50 pl/pocillo en todos los pocillos de la placa de microtitulacion. Se dispenso anti-Ig de raton de conejo conjugada con HRP (1/1000 en HSB) en los pocillos de control que conteman anticuerpo anti-antfgeno. Las placas se incubaron a continuacion a temperatura ambiente durante 1 hora con sacudimiento.

8. Las placas Se lavaron como en la etapa 6.

9. Se anadio sustrato TMB preparado previamente a 50 pl/pocillo y la placa se incubo en el banco durante 10 min. Las placas se golpearon suavemente para mezclar.

10. La densidad optica de los pocillos se determino a 650 nm utilizando un protocolo de lector de placas normalizado.

5

10

15

20

25

Tabla 1: Disenos de placas convencionales

1 2 3 4 CD LO OO h- CD O 11 12

A

antigeno 10 |jg/ml antfgeno 10 jg/ml antfgeno 10 jg/ml antfgeno 10 jg/ml antfgeno 10 jg/ml antfgeno 10 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

B

antigeno 3 jg/ml antfgeno 3 jg/ml antfgeno 3 jg/ml antfgeno 3 jg/ml antfgeno 3 jg/ml antfgeno 3 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

C

antigeno 1 jg/ml antfgeno 1 jg/ml antfgeno 1 jg/ml antfgeno 1 jg/ml antfgeno 1 jg/ml antfgeno 1 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

D

antfgeno 0,3 jg/ml antfgeno 0,3 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

E

antfgeno 0,1 jg/ml antfgeno 0,1 jg/ml antfgeno 0,1 jg/ml antfgeno 0,1 jg/ml antfgeno 0,1 jg/ml antfgeno 0,1 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

F

antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml antfgeno 0,03 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

G

antfgeno 0,01 jg/ml antfgeno 0,01 jg/ml antfgeno 0,01 jg/ml antfgeno 0,01 jg/ml antfgeno 0,01 jg/ml antfgeno 0,01 jg/ml

Suero a 1 en 30 Suero a 1 en 100 Suero a 1 en 300 Suero a 1 en 1000 Suero a 1 en 3000 Suero a 1 en 10000

H

tampon carbonato tampon carbonato tampon carbonato tampon carbonato tampon carbonato tampon carbonato

Las curvas de titulacion de antigeno se construyeron utilizando los valores medios de los duplicados para cada muestra de toda la gama de diluciones de suero. Un valor que corresponde al nivel de la union no espedfica para cada dilucion de suero se calculo restando un nivel de fondo (suero a 1/10.000 y sin antigeno) del valor obtenido para la union sin antigeno para cada dilucion de suero. Esto se uso a continuacion para corregir la union no espedfica en cada conjunto de duplicados.

Ejemplo 2 - Deteccion de autoanticuerpos en cancer de mama primario

Los siguientes datos se obtuvieron de un estudio piloto para evaluar la sensibilidad y la reproducibilidad de un panel de analisis de titulacion cruzada de autoanticuerpos (OSAAC) en cancer de mama primario (PBC). El estudio incluyo suero de 14 mujeres sin evidencia de cancer y muestras de suero pre-operatorias de 14 mujeres con cancer de mama primario. Muestras normales y de cancer se emparejaron por edades.

El analisis se llevo a cabo de acuerdo con el protocolo dado en el ejemplo 1 usando los antigenos p53 y c-myc. Tuvieron que ser retiradas del estudio dos muestras normales (una para p53) ya que demostraron niveles extremadamente altos y sostenidos de union a autoanticuerpos a traves de un intervalo de concentraciones de suero y antfgeno.

La Figura 1 muestra ejemplos de curvas obtenidas cuando se utilizo el analisis de titulacion cruzada para medir autoanticuerpos p53 y c-myc en suero. Se puede observar que para algunas muestras (p. ej. muestras 17179 y 18781), se obtuvieron intervalos de titulacion dando las senales mas fuertes los sueros mas concentrados como se esperaba. Sin embargo en otras muestras (p. ej. muestras 19150 y 18057), las curvas fueron esencialmente planas pero con una senal creciente a medida que aumentaba la concentracion de suero. Se considero que esto se debfa a

la union no espedfica de las inmunoglobulinas del suero y se compenso por la correccion de la union no espedfica como se ha descrito anteriormente.

Los niveles de autoanticuerpos se expresan como la densidad optica (650 nm) debida a la union al antigeno de 5 ensayo menos la debida a la union no espedfica. Se calculo el corte normal como el percentil 95o (media + 2 desviaciones tipicas) del grupo normal. Las muestras se consideraron positivas si mostraban niveles por encima del corte en al menos 2 diluciones de suero entre 1/30 y 1/1000 y 2 concentraciones de antfgeno entre 10 jg/ml y 1 |jg/ml. Las muestras positivas se identifican en la tabla 2.

10 Tabla 2: Positividad de las mediciones de AAb en sueros normales y de cancer de mama. Una muestra se considero positiva si el valor corregido de la union no espedfica era mayor que la media + 2 DT de las muestras normales sometidas a ensayo en al menos dos concentraciones de antfgeno Y dos diluciones de suero.

Antfgeno

Muestras de suero positivas

Normal PBC

p53

J001 17179 18781

18237 19502

18927 19622

asociacion p53 + ve

Total

1/14 (7%) 7/14 (50%)

c-myc

J001 17179 18781

J041 18237 18964

asociacion p53 + ve

Total

2/14 (14%) 5/14 (36%)

Ejemplo 3 - Analisis de la sensibilidad y especificidad de los analisis titulacion cruzada en comparacion con titulacion 15 de antfgeno solo

Las mediciones de autoanticuerpos (AAb) se realizaron en 14 mujeres con cancer de mama primario (PBC) usando tanto un analisis de titulacion cruzada (OSAAC) como un metodo de titulacion de antfgeno solo en el que las mediciones de autoanticuerpos se realizaron unicamente a una dilucion de suero de 1/100. Las muestras se 20 consideraron positivas cuando superaron los niveles de corte, tanto a 10 como 3 pg/ml en una curva de titulacion del antigeno. La Tabla 2 de mas abajo muestra una comparacion directa de los dos metodos:

Tabla 3: Comparacion del metodo de titulacion del antfgeno de calculo de las sensibilidades de AAb en solo una dilucion de suero en comparacion con el analisis de OSAAC.

25

Antigeno

Metodo de titulacion antigeno Analisis OSAAC

p53

sensibilidad 5/14 (36%) 7/14 (50%)

especificidad 13/14 (93%) 13/14 (93%)

c-myc

sensibilidad 3/14 (21%) 5/14 (36%)

especificidad 12/14 (86%) 12/14 (86%)

Se puede observar que mediante el uso de una serie de curvas de titulacion de antfgeno en las que se vanan tanto la concentracion de antfgeno como la concentracion de suero, se obtuvieron tanto una sensibilidad mayor como al menos una especificidad tan buena en comparacion con las curvas de titulacion en las que se vana solo la 30 concentracion de antfgeno.

Se ha demostrado que el analisis de titulacion cruzada (OSAAC) para la medicion de autoanticuerpos es superior a un ensayo basado en la titulacion del antfgeno frente a una sola dilucion de suero en terminos de sensibilidad para la deteccion de cancer de mama primario. Este es el caso de los anticuerpos tanto p53 como c-myc y no hay ninguna 35 razon para suponer que este no sea el caso para una serie de antfgenos. Sin estar limitado por la teona, el solicitante considera que hay numerosas razones para la mayor sensibilidad observada en los analisis basados en la titulacion cruzada de antfgeno y muestra de ensayo.

5

10

15

20

25

30

35

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45

50

55

(i) El formato de analisis tiene un intervalo dinamico mucho mas amplio. Esto proporciona el alcance para detectar tanto los anticuerpos de baja afinidad a concentraciones altas de antigeno, as^ como los anticuerpos de alta abundancia que de otro modo se acoplanan a la alta concentracion de antigeno.

(ii) Se pueden detectar anticuerpos de baja abundancia que pueden estar enmascarados por altos niveles de union no espedfica a una concentracion de suero baja.

(iii) Los criterios estrictos para definir una muestra como positiva (por encima de la media + 2 DT de una poblacion normal para al menos 2 concentraciones de antigeno y 2 diluciones de suero) aplicados aqu significan que el tecnico puede estar mas convencido de que una medicion positiva es un verdadero positivo.

Ejemplo 4 - Deteccion de sueros de cancer de mama primario mediante titulacion cruzada de antigenos

Se utilizaron en este estudio sueros de mujeres con cancer de mama primario (PBC, n = 8 (los 6 sueros PBC fueron los mismos entre todos los antigenos y 2 sueros PBC fueron espedficos para cualquiera de las protemas p53 o ECD6)) y de mujeres que no tienen evidencia de enfermedad maligna (n = 10). El analisis se realizo por duplicado utilizando una modificacion del protocolo general descrito en el Ejemplo 1. Brevemente se recubrio un conjunto de placas de microtitulacion con protemas antigenicas: p53, ECD6 (tambien conocido como el dominio externo HER2), o un fragmento 3' de ECD6 recombinantes. El antfgeno ECD6 comprende los aminoacidos 1 a 647 de la secuencia de aminoacidos de HER2 (erbB-2) completa mostrada con el acceso NM_004439 fusionada a una secuencia de biotinilacion N-terminal y una etiqueta His C-terminal. El antigeno del fragmento 3' de ECD6 comprende los aminoacidos 361 a 647 de la secuencia de aminoacidos de HER2 (erbB-2) completa mostrada en el acceso NM_004439, fusionada de nuevo a una secuencia de biotinilacion N-terminal y una etiqueta His C-terminal.

Los antfgenos se titularon seriadamente para cada placa a concentraciones (de arriba abajo) de 160 nM, 50 nM, 16 nM, 5 nM, 1,6 nM, 0,5 nM, 0,16 nM. Se incluyo un control "sin antigeno" de tampon solo como fila inferior de cada placa. Se dejo que los antfgenos se adsorbieran durante 48 horas, despues de lo cual las placas se lavaron y se bloquearon durante 90 min con PBS que contema casema (0,1% p/v) y NaCl (0,5 M).

Durante la incubacion de bloqueo se preparo un conjunto de titulaciones de suero seriadas en tubos, a diluciones de 1:1600, 1:800, 1:400, 1:200, 1:100 y 1:50. Tras la eliminacion del tampon de bloqueo, estas se anadieron a las placas recubiertas de antigeno (diluciones 1:1600, 1:800, 1:400, 1:200, 1:100 y 1:50 anadidas a traves de las placas de izquierda a derecha) y se incubaron durante 90 min. El resto del analisis se realizo como se describe en el Ejemplo 1. (El diseno de la placa se resume en la Figura 2)

Se construyeron curvas de titulacion de antfgeno utilizando los valores medios de los duplicados para cada muestra de todo el intervalo de diluciones de suero. Se alcanzo un valor correspondiente al nivel respuesta de autoanticuerpos restando el fondo no espedfico (respuesta del suero frente al antfgeno 0,16 nM).

Resultados

En las Figuras 3 a 7 se muestran curvas de titulacion representativas. Se puede observar que para algunas muestras (p. ej. muestras 20642 y 20620 para ECD6), se obtuvo un intervalo de titulaciones dando las senales mas fuertes los sueros mas concentrados como se esperaba. Sin embargo en otras muestras (p. ej. muestras MVV272 y EAO220 para el fragmento 3' ECD6), las curvas fueron esencialmente planas pero con una senal creciente a medida que aumentaba la concentracion de suero. Se considero que esto se debfa a la union no espedfica de inmunoglobulinas del suero.

Los cortes positivos se calcularon como la media + 2 DT de la poblacion normal. Las muestras se consideraron positivas si mostraban niveles por encima del corte en ambas rondas y a concentraciones de antfgeno 160 Nm o 50 nM. La Tabla 4 demuestra que una dilucion de suero de 1:100 utilizada actualmente para la deteccion de autoanticuerpos no es siempre optima. Ademas, la tabla muestra que hay una variacion inter-antfgeno de la dilucion de suero optima. El nivel mas alto de sensibilidad para ECD6 fue del 75% cuando el suero se diluyo 1:50. Esto era lo contrario para el fragmento 3' de ECD6 donde 1:50 tuvo una sensibilidad de 0%. Esto fue debido en parte al aumento de la senal frente al fragmento 3' de ECD6 en las muestras normales analizadas (p. ej. muestras MMV272 y EAO220).

Dilucion en suero

Tabla 4: Sensibilidad del analisis de autoanticuerpos frente a 8 muestras de PBC analizadas para cada antfgeno. Una muestra se considero positiva si el valor corregido de la union no espedfica era superior a la media + 2 DT de 5 las muestras normales sometidas a ensayo a cualquiera de las dos concentraciones de antigeno.

1:1600 1:800 1:400 1:200 1:100 1:50

p53

0% 25% 37,5% 37,5% 37,5% 37,5%

ECD6

25% 37,5% 50% 50% 50% 75%

3' de ECD6

37,5% 37,5% 37,5% 37,5% 12,5% 0%

La Tabla 5 resume la especificidad del analisis donde el suero se diluye a diferentes concentraciones. No se observo diferencia en la especificidad del analisis utilizando las muestras analizadas en este ensayo.

10

Dilucion en suero

Tabla 5: Especificidad del analisis de autoanticuerpos con las 10 muestras de PBC. Una muestra se considero positiva si el valor corregido de la union no espedfica era superior a la media + 2 DT de las muestras normales 15 sometidas a ensayo a cualquiera de dos concentraciones de antfgeno.

1:1600 1:800 1:400 1:200 1:100 1:50

p53

100% 100% 100% 100% 100% 100%

ECD6

100% 100% 100% 100% 100% 100%

3' de ECD6

100% 100% 100% 100% 100% 100%

En la Tabla 6 la dilucion optima de suero se compara con los 6 sueros de PBC que se analizaron frente a todos los antfgenos. La dilucion optima de suero es la dilucion mas alta en la que se puede detectar una respuesta de

20 autoanticuerpos. A modo de ejemplo, el suero 20628 se pudo diluir a 1:800 y se pudo detectar una respuesta (es decir, autoanticuerpos) contra p53, pero se necesito diluir el mismo suero a 1:50 para la deteccion de los autoanticuerpos para ECD6. La dilucion optima para este antfgeno sena por lo tanto 1:50 de manera que todas las respuestas de autoanticuerpos positivas pudieran ser identificadas.

25 Dilucion optima por antfgeno

Tabla 6: Dilucion inter-individuo optima de las 6 muestras de suero PBC que se analizaron frente a todos los antfgenos. Donde se muestra la dilucion mas baja que se requirio para detectar una respuesta de autoanticuerpos

contra cualquiera de P53, ECD6 o fragmento 3 'ECD6.

30

Suero

P53 ECD6 ECD6 3' Dilucion optima

20593

- - - -

20641

- 1:50 - 1:50

20620

- 1:1600 1:1600 1:1600

20639

- - - -

20628

1:800 1:50 - 1:50

20642

1:400 1:400 - 1:400

La Tabla 7 resume el aumento de la sensibilidad de ensayo general para la deteccion del cancer de mama primario cuando se usa el metodo de titulacion cruzada para detectar autoanticuerpos contra cada uno de los antfgenos sometidos a ensayo.

Tabla 7: Sensibilidad y especificidad del analisis total utilizando tanto ECD6 como el fragmento 3' de ECD6 si se utiliza el analisis de titulacion cruzada en lugar de suero diluido a 1:100 para las 6 muestras de suero de PBC

analizadas frente a todos los antigenos.

Titulacion Cruzada Suero a 1:100

Sensibilidad

66,7% 33,3%

Especificidad

100% 100%

5 Conclusiones

Se ha demostrado que el analisis OSAAC para la medicion de autoanticuerpos es superior a la titulacion del antfgeno solo en terminos de sensibilidad para la deteccion de cancer de mama primario. Este es el caso para los autoanticuerpos p53, ECD6 y 3' de ECD6 y no hay ninguna razon para suponer que esto no sea cierto para todos los 10 autoanticuerpos marcadores tumorales. Parece que esto es debido al hecho de que este formato de analisis tiene un intervalo dinamico mucho mas amplio. Esto proporciona el alcance para detectar tanto autoanticuerpos de baja afinidad a elevadas concentraciones de antfgeno, como autoanticuerpos de alta abundancia que de otro modo se acoplanan a la elevada concentracion de antfgeno. Ademas, parece posible que los autoanticuerpos de baja abundancia que pueden estar enmascarados por los altos niveles de union no espedfica puedan ser detectados a 15 una baja concentracion de suero.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos en un sujeto mairnfero, en donde dicho autoanticuerpo es un marcador biologico de un estado de enfermedad o susceptibilidad a la enfermedad, cuyo metodo comprende:

   (a) preparar dos o mas diluciones diferentes de una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de dicho sujeto mamffero y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

   (i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antigeno espedfico para dicho anticuerpo,

   (ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada cantidad de antfgeno utilizada en la etapa (i),

   (b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antigeno para cada dilucion de la muestra de ensayo utilizada en la etapa (a), para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos en dicho sujeto antes del comienzo de la enfermedad, o a lo largo del transcurso de la enfermedad.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el metodo se repite para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el autoanticuerpo es espedfico para una protema marcadora tumoral.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el antigeno comprende una protema marcadora de tumores o un fragmento antigenico o un epftopo de la misma, seleccionandose preferiblemente la protema marcadora de tumores del grupo que consiste en MUC1, MUC16, c-myc, EGFR, p53, ras, BRCA1, BRCa2, APC, HER2-neu, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-I, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, citoqueratina, recoverina, calicrema, anexina, AFP, b-HCG, GRP78, CA125, mamaglobina, raf, NY-BR-I, livina, survivina, MUC2, endostatina, Bcl-2, BIRC7, HSP70, No55, uPA, tetranectina, prolactina, osteopontina, HE4, TATI, inhibina, vimentina, cox-1 y cox-2.
5. 5. El uso del metodo de la reivindicacion 3 o 4 para uno de los siguientes:

   (a) el diagnostico, pronostico o seguimiento del cancer;

   (b) el escrutinio de una poblacion de sujetos humanos asintomaticos para identificar los sujetos que tienen riesgo creciente de desarrollar cancer, en donde las muestras que se van a someter a ensayo usando el metodo son muestras de fluido corporal tomadas de los sujetos, y en donde los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con los individuos de control normales, se identifican por tener riesgo de desarrollar cancer;

   (c) la deteccion del cambio neoplasico temprano o carcinogenico temprano en un sujeto asintomatico humano, en donde la muestra que se va a someter a ensayo usando el metodo es una muestra de fluido corporal tomada del sujeto, y en donde la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con los individuos de control normales, se toma como una indicacion de cambio neoplasico temprano o carcinogenico temprano en el sujeto;

   (d) el escrutinio de una poblacion de sujetos humanos asintomaticos para identificar a aquellos sujetos que han desarrollado un cancer, en donde las muestras que se va a someter a ensayo usando el metodo son muestras de fluido corporal tomadas de los sujetos, y en donde los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con los individuos de control normales, se diagnostican por tener un cancer;

   (e) el ensayo sobre una poblacion de sujetos humanos sintomaticos para identificar aquellos sujetos que han desarrollado un cancer, en donde las muestras que se va a someter a ensayo usando el metodo son muestras de fluido corporal tomadas de los sujetos, y en donde los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con los individuos de control normales, se diagnostican por tener un cancer;

   (f) el seguimiento del progreso del cancer u otra enfermedad neoplasica en un paciente, en donde la muestra que se va a someter a ensayo usando el metodo es una muestra de fluido corporal tomada de un paciente humano, y en donde la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con un control normal, se toma como una indicacion de la presencia de cancer en el paciente;

   (g) la deteccion de una enfermedad recurrente en un paciente humano previamente diagnosticado de cancer, cuyo paciente ha experimentado tratamiento contra el cancer para reducir la cantidad de cancer presente, en donde la muestra que se va a someter a ensayo usando el metodo es una muestra de fluido corporal tomada del paciente, y en donde la presencia de un nivel creciente de autoanticuerpos en el paciente, en comparacion con un control normal, se toma como una indicacion de que la enfermedad ha reaparecido;

   (h) la evaluacion del pronostico del cancer, en donde la muestra que se va a someter a ensayo usando el metodo es una muestra de fluido corporal tomada de un paciente humano, y en donde la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparacion con un control normal, se toma como una indicacion del pronostico del paciente a partir de su cancer;

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   (i) la prediccion de la respuesta al tratamiento contra el cancer, en donde la muestra que se va a someter a ensayo usando el metodo es una muestra de fluido corporal tomada de un paciente humano, y en donde la comparacion del nivel de autoanticuerpos en dicho paciente con una relacion previamente establecida entre los niveles de autoanticuerpos y el resultado probable del tratamiento se utiliza para proporcionar una indicacion de si el paciente respondera a tal tratamiento contra el cancer, en donde el tratamiento contra el cancer es posiblemente la vacunacion, la terapia anti-factor de crecimiento o de transduccion de la senal, la radioterapia, la terapia endocrina, la terapia con anticuerpos humanos o la quimioterapia;

   (j) el seguimiento de la respuesta de un paciente de cancer humano al tratamiento contra el cancer, en donde la muestra que se va a someter a ensayo usando el metodo es una muestra de fluido corporal tomada del paciente, y en donde un cambio en el nivel de autoanticuerpos despues del tratamiento se toma como una indicacion de que el paciente ha respondido o no al tratamiento, en donde el tratamiento es posiblemente la vacunacion, la terapia anti-factor de crecimiento o de transduccion de la senal, la radioterapia, la terapia endocrina, la terapia con anticuerpos humanos o la quimioterapia y un cambio en el nivel de autoanticuerpos despues del tratamiento se toma como una indicacion de que el paciente ha respondido positivamente al tratamiento.
6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el autoanticuerpo es caractenstico de o esta asociado con una enfermedad autoinmunitaria, en donde la enfermedad autoinmunitaria es preferiblemente artritis reumatoide, lupus eritematoso generalizado (LEG), cirrosis biliar primaria (CBP), tiroiditis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, gastritis autoinmune, anemia perniciosa, adrenalitis autoinmune, enfermedad de Addison, hipoparatiriodismo autoinmune, diabetes autoinmune o miastenia grave.
7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en donde el autoanticuerpo es caractenstico de o esta asociado con una enfermedad renal o hepatica que conduce a insuficiencia o fallo de cualquier organo.
8. 8. Un metodo para construir un perfil de produccion de autoanticuerpo para dos o mas autoanticuerpos en un sujeto mairnfero, en donde al menos uno de dichos anticuerpos es un marcador biologico de un estado de enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, cuyo metodo comprende:

   (a) preparar dos o mas diluciones diferentes de una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de dicho sujeto mai^ero y llevar a cabo las siguientes etapas (i) y (ii) con respecto a cada dilucion de la muestra de ensayo:

   (i) poner en contacto la dilucion de la muestra de ensayo con dos o mas conjuntos de antfgenos, en donde cada uno de dichos conjuntos de antfgenos es espedfico para uno de dichos anticuerpos que van a ser detectados en la muestra de ensayo y en donde cada conjunto de antfgenos comprende una pluralidad de cantidades diferentes del mismo antfgeno,

   (ii) detectar la cantidad de union espedfica entre el anticuerpo y el antfgeno para cada cantidad de antfgeno en cada conjunto de antfgenos utilizado en la etapa (i),

   (b) trazar o calcular una curva separada de la cantidad de union espedfica frente a la cantidad de antfgeno para cada dilucion de la muestra de ensayo con cada conjunto de antfgenos utilizado en la etapa (a), para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos en dicho sujeto antes del comienzo de la enfermedad o a lo largo del transcurso de la enfermedad.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde el metodo se repite para construir un perfil de produccion de autoanticuerpos.
10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, en donde al menos uno de dichos dos o mas autoanticuerpos es un autoanticuerpo autoespedfico para una protema marcadora de tumores.