CN1804629A - 检测猪圆环病毒2型抗体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术领域。试剂盒采用超滤纯化的酵母分泌表达的PCV2 Cap蛋白为检测抗原，应用间接ELISA原理检测猪血清中猪圆环病毒2型的抗体，用于猪群猪圆环病毒2型感染的血清学检测，敏感性和特异性均高于93％。试剂盒的核心物质包被抗原为超滤纯化的毕赤酵母分泌表达的PCV2 Cap蛋白，其具有与天然PCV2一样优良抗原性，但没有PCV2潜在散毒的危害。应用本试剂盒检测血清样品，具有背景反应低，阴阳性血清显色OD值对比明显的优点。本发明试剂盒生产成本低廉、可大量检测样品，而且特异性强、敏感性高，具有良好的应用前景。

Description

检测猪圆环病毒2型抗体的试剂盒

一技术领域

本发明为检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的间接ELISA试剂盒，属于兽医生物技术领域。用于猪圆环病毒2型的抗体检测，以此判断猪群中猪圆环病毒2型感染情况以及对该病流行情况进行监测。

二背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是新发现的一种重要病原微生物，可引起5～12周龄的仔猪发生多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wastingsysdrome，PMWS)。PMWS主要引起仔猪进行性消瘦，生长发育迟缓，皮肤苍白，贫血，黄疸等特征症状。此外，研究表明PCV2可导致感染猪的免疫抑制，目前发现该病原与猪的多种疾病综合征有关。自1991年在加拿大首次报道以来，包括我国在内的世界上许多国家和地区都报道了该病的发生。近年来，该病的发生呈上升趋势，给世界的养猪业造成了相当大的经济损失。PCV2属于圆环病毒科，圆环病毒属，基因组为单链、环状闭合的DNA，大小约为1768bp或1767bp。该病毒有两个主要的阅读框：ORF1和ORF2。ORF1编码为病毒复制相关的蛋白；而ORF2全基因长为705bp，编码234Aa的病毒核衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白是PCV-2的主要抗原性蛋白，即PCV-2感染猪产生的特异性抗体大部分都是针对Cap蛋白的。

由于猪圆环病毒2型感染对养猪业造成严重的危害，各国政府都投入了大量的人力和财力对该病进行深入广泛的研究。关于本病诊断方法的研究成果不断涌现。建立了检测病原的PCR方法、ISH方法和免疫荧光方法；对与特异性抗体的检测方法也有较多的研究报道，本实验室建立了检测PCV2抗体的间接免疫荧光方法。Walker(2000)以分离的PCV2细胞培养物为抗原，以PCV2特异性单克隆抗体作为竞争性反应物，检测PCV2抗体，C-ELISA的敏感性和特异性达到99.58％和97.14％。由于PCV2ORF2编码基因中含有较多的大肠杆菌稀有密码子且编码部分跨膜蛋白，所以我们试验用大肠杆菌表达系统来生产完整的重组PCV2Cap蛋白没有成功，然而我们的实验结果表明巴斯德毕赤不但能高效分泌表达重组PCV2Cap蛋白，而且获得的重组PCV2Cap蛋白具有优良的抗原性。通常猪的血清中不存在毕赤酵母相关蛋白的抗体，因此应用酵母表达的重组蛋白为检测抗原建立的ELISA用于检测血清样品，具有背景反应低，阴阳性血清显色OD值对比明显，结果易判断的优点。

三发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，用于猪圆环病毒2型的抗体检测。测试剂盒具有高度的特异性、敏感性，可大量生产，大大降低了检测成本，检测成本低廉，适于推广。本发明可应用于养猪业中猪圆环病毒2型感染的检测、流行病学调查、类症鉴别等。

技术方案

应用间接ELISA方法检测抗体，对样品的阴阳作出准确的诊断，最为关键几个环节是检测抗原的抗原性、纯度和包被剂量，标准样品，反应条件和参数，以及能够校正样品的背景反应、操作误差的检测和结果判断体系。

1检测抗原——酵母分泌表达的PCV2Cap蛋白的制备方法

本发明应用酵母分泌表达的PCV-2Cap蛋白经超滤纯化后作为检测抗原。在本实验室的前期研究中，获得了高效分泌表达PCV-2核衣壳全蛋白(Cap蛋白)的工程酵母菌株，建立了其发酵工艺，并证明重组Cap蛋白具有很好的抗原性，从而为本发明打下良好的物质基础。在此基础上经过多次的工艺改进和实验验证建立了本发明中检测抗原的制备方法：

1)参照文献“猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达.中国病毒学，2005，20(2)：125-129”中描述的方法，进行酵母菌株X-33/pPICZα-ORF2和对照空载体转化酵母菌的培养和发酵，发酵时间为72h。

2)8000rpm/min离心10min收集酵母发酵液的上清。将上清液用0.45μm滤膜过滤后进行2步超滤纯化，滤芯的规格分别为5K和30K。除去上清液中的部分无机盐、小分子肽、色素和大分子的杂蛋白，得到浓缩纯化的重组PCV2Cap蛋白和对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白。

2标准PCV2抗体阳性血清与标准PCV2抗体阴性血清

在ELISA检测过程中，不同操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，比如：加样和反应时间的误差等，操作误差会导致检测样品OD值的误差，但待检样品OD值/标准阳性样品OD值可消除误差、准确反映检测结果，是优化的判定标准。本发明研制了标准PCV2抗体阳性血清与标准PCV2抗体阴性血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。

标准阳性血清的制备，取PCV2阴性且未免疫的1月龄健康猪，用PK-15细胞增殖的PCV2JS株(10^3.67TCID₅₀/mL)通过滴鼻和肌肉注射接种各2mL，15天后，同法免疫一次。二免后5天采血用间接免疫荧光法(IFA)检验为阳性，次日无菌静脉采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封，-20℃保存。

阴性血清的制备取经检验合格的非免疫猪，无菌静脉采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封，-20℃保存。3 ELISA检测板条的抗原包被剂量和包被方法

包被检测抗原的微孔板条是ELISA试剂盒的核心材料，检测抗原的包被量是一个重要的参数。抗原包被量过高会使检测样品产生较高的背景反应，抗原包被量过又低不能与样本中抗体的充分结合，从而产生假阳性和假阴性的结果。本发明通过方阵试验确定了检测抗原的最佳包被量为3μg/孔。尽管通常猪体中不存在酵母抗原的抗体，而且检测抗原酵母表达的Cap蛋白经过超滤纯化，但考虑到Cap蛋白的纯度不是100％，存在的少量酵母蛋白会潜在的对检测样品产生一些背景反应，在微孔板条的制造中包被了对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白，以便在结果判定中去除可能产生的背景误差。微孔板条的包被方法如下：

1)将浓缩纯化的重组PCV2 Cap蛋白用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释为30μg/mL，将浓缩纯化的对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白按相同的稀释倍数进行稀释。

2)按100μL/孔将稀释的重组PCV2 Cap蛋白和对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白以相邻列的方式(见表1)将检测抗原包被96孔酶标板，37℃作用2h。

3)PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次后，用含1％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)的PBST4℃封闭8h。

4)PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次，室温晾干，用锡箔包装袋进行真空包装。

1.酶标板上抗原包被和样品添加的模式

      阳      阴       阳      阴      阳       阴      阳     阴       阳      阴      阳      阴

      性      性       性      性      性       性      性     性       性      性      性      性

      抗      抗       抗      抗      抗       抗      抗     抗       抗      抗      抗      抗

      原      原       原      原      原       原      原     原       原      原      原      原

注：P-表示加阳性血清：N-表示加阴性血清；S1，S2，S3，S4，S5，S6等表示加各被检样品。1，3，5，7，9，11列用阳性抗原包被：2，4，6，8，10，12列用阴性抗原包被。阳性抗原：重组PCV2 Cap蛋白；阴性抗原：空载体转化酵母菌发酵产生蛋白。

4检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒，包括：

1)ELISA板条：每个试剂盒装有2块锡箔包装真空包装的ELISA板，每块ELISA板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，检测抗原为超滤纯化的酵母分泌表达的PCV2Cap蛋白，规格为12孔×8条；

2)洗涤液：10倍浓度的pH7.4PBST溶液100mL；

3)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG使用液1瓶，22ml/瓶；

4)血清稀释液：1％牛血清白蛋白(BSA)溶液50mL；

5)底物显色液：A：柠檬酸0.467g+NaH₂PO₄.H₂O 1.841g加水定容至100mL，加邻笨二氨(OPD)40mg配制而成；B：3％H₂O₂10mL；A和B均需4℃密封、避光、保存；每10mL显色液A加30％H₂O₂150μL混匀即用；

6)终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液100mL；

7)标准PCV-2阳性血清：0.5mL；

8)标准PCV-2阴性血清：0.5mL。

5试剂盒用于检测猪圆环病毒2型抗体操作方法

1)加入血清样品：被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清用血清稀释液将作1∶40倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，于37℃下作用45min后，弃去反应孔中的液体；将每个孔用200μL的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续3min，在每次洗涤后将反应孔中的液体甩掉，最后一次甩掉洗涤液后，在纸巾上拍干，除去残留的液体。

2)每个反应孔加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG使用液，室温作用45min，洗涤3-5次；

3)每个反应孔中加入100μL加入显色底物，37℃避光作用15min；

4)终止反应：向每孔中加入50μL终止液终止反应；

5)用酶标仪测定OD值：在490nm波长下测定各孔吸光度OD值。

6ELISA检测结果的判定标准

[1].计算样品与阳性血清的比值(S/P)的公式

$S/P=\frac{\mathrm{Sp}-\mathrm{Sn}}{\mathrm{Pp}-\mathrm{Pn}}$

Sp：被检血清与阳性抗原反应孔OD值

Sn：被检血清与阴性抗原反应孔OD值

阳性血清与阳性抗原反应孔OD均值：Pp＝(A1+B1)/2

阳性血清与阴性抗原反应孔OD均值：Pn＝(A2+B2)/2

阴性血清与阳性抗原反应孔OD均值：Np＝(C1+D1)/2

阴性血清与阴性抗原反应孔OD均值：Nn＝(C2+D2)/2

[2].判定标准：

a)Pp-Pn与Np-Nn的比值(P/N)必须大于或等于2，试验结果才有效。否则，应进行重复试验。

b)如果S/P小于或等于0.3，说明为抗猪圆环病毒2型抗体阴性；

c)如果S/P大于0.3，且小于0.4，判定该样品为可疑，应重复试验；

d)如果S/P大于或等于0.4，样品为抗猪圆环病毒2型抗体阳性。

7试剂盒的特异性、敏感性

分别应用本发明Cap-ELISA和(间接免疫荧光法)IFA对256份来自江苏、安徽、浙江、上海、山东及福建等地猪场的送检血清进行了对比检测。检测结果分析表明：本发明检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒的敏感性为93.94％，特异性为98.39％。

有益效果

1敏感性高、特异性好

本发明应用酵母分泌表达的重组PCV-2Cap蛋白作为包被抗原，在材料选择上具有新意。猪被PCV-2感染后，最先产生的抗体是针对该病毒的核衣壳(Cap)蛋白抗抗体，而且此抗体可在猪体内持续存在5个月以上。通过Western-blot试验，证实酵母分泌表达的重组PCV-2Cap蛋白具有良好的反应原性，保证了检测试剂盒的高度敏感性。

应用重组PCV-2Cap蛋白为包被抗原建立检测PCV-2抗体的间接ELISA方法与间接免疫荧光法分别对180份临床血清样品进行检测，符合率为98.9％。

应用检测PCV-2抗体的的ELISA方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒标准阳性血清、猪瘟病毒标准阳性血清、伪狂犬病毒标准阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清和猪细小病毒阳性血清进行检测，结果均为阴性，从而表明该ELISA方法具有良好的特异性。

本发明研制的试剂盒采用超滤纯化酵母分泌表达的PCV2Cap蛋白为检测抗原，应用间接ELISA原理检测猪血清中猪圆环病毒2型的抗体，用于猪群猪圆环病毒2型感染的血清学检测，敏感性和特异性均高于93％。

2检测试剂盒可大量生产

目前，在检测猪圆环病毒2型抗体方面，应用较为广泛的是以感染PCV-2的PK细胞为基础的间接免疫荧光法和全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法。国内也有以原核表达的PCV-2部分Cap蛋白为检测抗原的间接ELISA方法，但于原核表达的重组Cap蛋白存在抗原性弱和存在大肠杆菌的自身融合蛋白和杂蛋白的问题，敏感性和特异性还需进一步提高。本发明使用的包被抗原为酵母分泌表达的重组PCV-2Cap蛋白，其优点在于重组蛋白在表达时就形成正确折叠，而且被分泌到酵母发酵液中，发酵液中重组蛋白的浓度高。重组Cap蛋白抗原性和反应原性好，易于稳定、大量获得，纯化方法易于实现(两步超滤即可实现)，重组Cap蛋白的批间质量易于控制、包被浓度易于确定，从而为PCV-2抗体检测试剂盒的大量、稳定生产提供有力保证。

3检测成本低廉，适于推广

本发明检测猪圆环病毒2型抗体ELISA试剂盒与间接免疫荧光方法的检测符合率为98.9％，检测猪圆环病毒2型抗体ELISA试剂盒的敏感性和特异性分别为93.94％和98.39％。现有进口检测试剂盒检测每份血清样品的费用在40元左右，高昂的检测费用使许多生产单位难以接受。本发明对每份血清样品检测费用在5元左右，大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。

四具体实施方式

4.1包被抗原的制备和鉴定

1)参照文献“猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达.中国病毒学，2005，20(2)：125-129.”中描述的方法，，进行酵母菌株X-33/pPICZα-ORF2和对照空载体转化酵母菌的培养和发酵，发酵时间为72h。

2)8000rpm/min离心10min收集酵母发酵液的上清。将上清液用0.45μm滤膜过滤后进行2步超滤纯化，滤芯的规格分别为5K和30K，以除去上清液中的部分无机盐、小分子肽、色素和大分子的杂蛋白，得到浓缩纯化的重组PCV2Cap蛋白和对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白。

3)应用BAC方法测定重组PCV2Cap蛋白的含量，并进行蛋白电泳和Westen-blot鉴定。重组Cap蛋白的分子量约为27kD，对PCV2阳性血清应呈阳性结果；对阴性血清检测应呈阴性结果；与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪肺疫、猪伪狂犬、猪细小病毒感染等阳性血清无反应。

4.2标准阳性血清与标准阴性血清的制备和鉴定

标准阳性血清的制备，取PCV2阴性且未免疫的1月龄健康猪，用PK-15细胞增殖的PCV2JS株(10^3.67TCID₅₀/mL)通过滴鼻和肌肉注射接种各2mL，15天后，同法免疫一次。二免后5天采血用间接免疫荧光法(IFA)检验为阳性，便无菌静脉采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以1ml量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封。

阴性血清的制备取经检验合格的非免疫猪，无菌静脉采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以1ml量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封。

4.3检测猪圆环病毒2型抗体间接ELISA的建立及其标准化

本发明所建立的以纯化酵母分泌表达的PCV-2Cap蛋白为包被抗原的检测PCV2抗提间接ELISA方法(Cap-ELISA)通过以下步骤实现：

4.3.1方阵试验确定抗原包被浓度和血清稀释倍数  采用棋盘法测定。取96孔ELISA板2块，将提纯的重组Cap蛋白用pH9.6的CBS做1∶10、1∶20、1∶40至1∶1280稀释，自左向右依次分别加入1-8列，每个稀释度8个重复，每孔100μL，后于37℃包被2h。取出后用PBST洗涤三次，每次持续3分钟。后用含1％BSA的PBST于4℃下封闭8h后，洗涤同前。将标准阳性血清、标准阴性血清用PBST做1∶10、1∶20、1∶40至1∶1280稀释也按同样的稀释倍数稀释，自上而下分别A-H的反应孔中，每个稀释度8个重复，每孔100μL，于37℃放置1h，取出后洗涤同前。接着每孔中加入100μL稀释至工作浓度的兔抗猪酶标二抗，于37℃作用45min，随后洗涤同前。继而向每孔中加入100μL底物显色液(已加入H₂O₂的OPD溶液)，于37℃避光作用15min，最后加入50μL 2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上检测OD₄₉₀值。取阳性血清OD₄₉₀值约为1.0、阳性血清OD₄₉₀/阴性血清OD₄₉₀的比值最大，且阴性血清OD₄₉₀值在0.2左右所在孔的抗原浓度和血清稀释液作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。确定最佳抗原工作浓度为30μg/ml，而血清最佳稀释倍数为1∶40。

4.3.2血清样品稀释液的选择分别以PBST、1％BSA、1％犊牛血清、5％犊牛血清作为稀释液稀释已知的阴、阳性血清，每一浓度稀释液重复五孔，在其它条件相同的情况下，进行ELISA测定，计算各组P/N值。以P/N值最大且N值较低作为选择依据。确定的血清稀释液为1％BSA。

4.3.3血清作用时间的确定  用1％BSA将已知的阴、阳性血清做1∶40稀释至最佳稀释倍数后，分别于37℃下作用15min、30min、45min、60min，在其它条件及操作方法相同的情况下，进行ELISA检测，取P/N最大且N值较低的一组确定为最佳作用时间。最终确定血清作用时间为37℃作用45min。

4.3.4酶标二抗作用时间的选择  应用抗原包被板对标准阴、阳性血清进行ELISA检测，在其它条件及操作方法相同的情况下，将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG(DAKO公司)用1％BSA稀释后于37℃及室温下分别作用10min、15min、20min、25min、30min，观察OD值及P/N变化，取P/N最大且N值较低的一组确定为最佳作用时间。确定兔抗猪酶标二抗作用时间为37℃45min。

4.3.5底物及终止液的选择  在其他条件相同的情况下，于室温下及37℃下分别用OPD(OD₄₉₀)、TMB(OD₆₃₀)作为底物，检测已知的阴、阳性血清，分别加入2M H₂SO₄、2NHCL、0.12％HF作为终止液，于终止后30min内每隔10min在酶标仪上读值，计算其P/N比值，选择合适的底物。确定OPD为显色底物，终止液为2M H₂SO₄。

4.3.6底物作用时间的选择  采用已知的阴、阳性血清，应用选定的OPD底物显色液，分别于室温及37℃作用10min、15min、20min、25min、30min后用终止液2M H₂SO₄终止反应，于终止后10min内在酶标仪上读值，以确定底物作用的时间及作用温度。最后确定底物OPD的作用时间为37℃15min或室温20min。

4.3.7Cap-ELISA操作程序的确定

按以上各项所确定的优化条件进行操作，即得到本发明的最佳操作程序：取出已包被检测抗原并封闭好的ELISA板条，用血清稀释液将被检血清以及标准阴、阳性血清作1∶40稀释，100μL/孔加入反应孔中，室温作用45min后，弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200μL的洗涤液充分洗涤3-5次，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去；最后一次除去洗涤液后，在吸水纸上拍打，除去残留的液体；每孔加入100μL酶标二抗，37℃作用45min，洗涤3-5次。每孔中加入100μL OPD底物显色液，37℃避光作用15min；向每个反应孔中加入50μL的终止液，终止反应。用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度A值，读值并计算和判定结果。

4.4检测结果判定标准的确定

应用本研究建立的检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒(Cap-ELISA)对240份经间接免疫荧光方法(IFA)检测、已知阴阳性的血清样品进行检测。以标准PCV2抗体阳性血清为参照计算S/P值，应用TG-ROC软件分析检测结果，TG-ROC(two-graph receiver operation characteristic)是一个利用MS-EXCEL确定某一诊断方法阴阳性临界值(cut-off values)的软件。根据分析结果得出Cap-ELISA进行PCV2抗体检测的判定标准：

a)P/N的比值必须大于或等于2，试验结果才有效。否则，应进行重复试验。

b)如果S/P小于或等于0.3，说明为抗猪圆环病毒2型抗体阴性；

c)如果S/P大于0.3，且小于0.4，判定该样品为可疑，应重复试验；

d)如果S/P大于或等于0.4，样品为抗猪圆环病毒2型抗体阳性。

4.5检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒组装

1)ELISA板条：每个试剂盒装有2块锡箔包装真空包装的ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA板条规格为12孔×8条。

2)洗涤液：10倍浓度的pH7.4PBST(PBS+0.05％Tween-20)溶液100mL；

3)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG使用液1瓶，22ml/瓶；

4)血清稀释液：1％BSA溶液50mL；

5)底物显色液：A：柠檬酸0.467g+NaH₂PO₄.H₂O1.841g加水定容至100mL，加邻笨二氨(OPD)40mg配制而成；B：3％H₂O₂10mL；A和B均需4℃密封、避光、保存；每10mL显色液A加30％H₂O₂150μL混匀即用。

6)终止液：2mol/L的H₂8O₄溶液50mL；

7)标准PCV-2阳性血清：0.5mL；

8)标准PCV-2阴性血清：0.5mL。

4.6敏感性和特异性试验

4.6.1Cap-ELISA和IFA对比检测  为了分析本发明检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒(Cap-ELISA)的敏感性和特异性，分别应用Cap-ELISA和间接免疫荧光试验(IFA)和对江苏、安徽、浙江、上海、山东及福建等地猪场送检的256份血清样品进行了对比检测。不同地区来源血清样品的检测结果见表2。IFA和Cap-ELISA对256份送检样品的阳性检测出数分别为132和126，阳性率分别为51.56％和49.22％，两种方法的检测符合率为96.09％。本发明检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒的敏感性为93.94％，特异性为98.39％。

                   表2：Cap-ELISA和IFA检测样品的结果

样品来源	样品数	IFA阳性数	Cap-ELISA
						阳性率(％)	阳性数	阳性率(％)
			江苏安徽上海山东浙江福建总计	825542263912256	45202012269132				54.8836.3747.6246.1566.677551.56	43201912248126	52.4436.3745.2446.1561.5466.6749.22

4.6.2交叉试验  随机抽取一批检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，对实验室保存的一些病原的标准阳性血清进行检测，结果表明猪细小病毒病阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清、猪乙型脑炎阳性血清、猪瘟阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪气喘病阳性血清检测的S/P值均小于0.3，为阴性结果，进一步说明本发明检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒具有良好的特异性。

Claims (3)

1.检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的间接ELISA试剂盒，包括，

1)ELISA板条：每个试剂盒装有2块锡箔包装真空包装的ELISA板，每块ELISA板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，检测抗原为超滤纯化的酵母分泌表达的PCV2Cap蛋白，规格为12孔×8条；

2)洗涤液：10倍浓度的pH7.4PBST溶液100mL；

3)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG使用液1瓶，22ml/瓶；

4)血清稀释液：1％牛血清白蛋白(BSA)溶液50mL；

5)底物显色液：A：柠檬酸0.467g+NaH₂PO₄.H₂O1.841g加水定容至100mL，加邻笨二氨(OPD)40mg配制而成；B：3％H₂O₂10mL；A和B均需4℃密封、避光、保存；每10mL显色液A加30％H₂O₂150μL混匀即用；

6)终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液100mL；

7)标准PCV-2阳性血清：0.5mL；

8)标准PCV-2阴性血清：0.5mL。

2.根据权利要求1所述检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，检测抗原酵母分泌表达的PCV2 Cap蛋白的制备方法为：

1)参照文献“猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达.中国病毒学，2005，20(2)：125-129.”中描述的方法，进行酵母菌株X-33/pPICZα-ORF2和对照空载体转化酵母菌的培养和发酵，发酵时间为72h；

2)8000rpm/min离心10min收集酵母发酵液的上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后进行2步超滤纯化，滤芯的规格分别为5K和30K，得到浓缩纯化的重组PCV2Cap蛋白和对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白。

3.根据权利要求1或2所述检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，ELISA微孔板条的检测抗原包被剂量和包被方法为：

1)将浓缩纯化的重组PCV2Cap蛋白用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为30μg/mL，将浓缩纯化的对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白按相同的稀释倍数进行稀释；

2)按100μL/孔将稀释的重组PCV2Cap蛋白和对照空载体转化酵母菌发酵产生的蛋白以相邻列的方式包被96孔微孔板，37℃作用2h后，置4℃作用8h；

3)将包被了抗原的微孔板用PBST洗涤3次后，用1％BSA 37℃封闭2h；

4)将封闭好的微孔板用PBST洗涤3次，室温晾干，真空包装，置4℃保存。