CN107085115A - 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 - Google Patents
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107085115A CN107085115A CN201710305794.6A CN201710305794A CN107085115A CN 107085115 A CN107085115 A CN 107085115A CN 201710305794 A CN201710305794 A CN 201710305794A CN 107085115 A CN107085115 A CN 107085115A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- double
- aleutian
- sandwich elisa
- detection kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human Parvovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体以及显色液,其中捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,包被浓度为5~20μg/ml;检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为4~40μg/ml;酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。本发明提供的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,利用AMDV‑VP2蛋白分别免疫小鼠和家兔,制成捕捉抗体和检测抗体,对病毒抗原进行双向夹持,通过对酶标二抗与检测抗体结合的检测,实现了对AMDV抗原的检测。本研究建立的DAS‑ELISA检测方法具有敏感、特异、稳定、简便等优点,适用于一线检疫人员进行大规模病原检测。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域,特别涉及一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
背景技术
水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AMD)是由水貂阿留申病毒(AleutianMink Disease Virus,AMDV)引起的水貂慢性传染性疾病,主要侵害水貂的免疫系统,以浆细胞弥漫性增生和持续性病毒血症为特征。该病在欧洲、美洲、亚洲等国家均有发生,我国的东北地区以及山东、新疆、内蒙古等地普遍流行,阳性率在20%~30%,个别可达71%。AMD不仅能引起一定程度的死亡,还可导致水貂的繁殖力和毛皮质量严重下降,造成不可弥补的经济损失,是危害水貂养殖业健康发展的重要疫病之一。
水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus,AMDV)属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvovirinae)、阿留申貂病毒属(Amdovirus)。该病毒粒子分为结构蛋白和非结构蛋白两类,其中结构蛋白VP2是AMDV的主要免疫原性抗原,与致病性密切相关,VP2基因也已成为研究AMDV毒力、致病性、抗原性和建立检测方法的首选基因。由于AMD特殊的致病机理,至今尚无有效预防该病的常规疫苗,也无有效治疗该病的特异性药物。目前防控该病的主要手段是通过检疫淘汰策略净化种群,因此建立一种快速有效的诊断方法对AMD的控制和清除具有重要意义。
申请公布号为CN105242042A的发明专利公开了一种水貂阿留申病毒抗体快速检测试剂盒,可以通过间接ELISA法对水貂AMDV病毒抗体进行检测,其特异性较传统的对流免疫电泳法(CIEP)更高,但是间接ELISA法和CIEP法的检测靶标是抗体,需要对貂群进行频繁采血,而对貂采血难度较大、对貂的应激也较大,因此适用范围有限。而双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)的灵敏性和特异性均较高,更重要的是,该方法只需采集貂粪即可进行检测,适用于兽医临床样品的大规模检测。因此,对于AMDV检测的DAS-ELISA方法进行探索和优化,以提供最佳的检测条件和方法,成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
本发明具体技术方案如下:
本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体以及显色液,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,包被浓度为5~20μg/ml;所述单克隆抗体由ADV-1G5杂交瘤细胞株分泌产生,所述ADV-1G5杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13829;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为4~40μg/ml;
所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。
所述捕捉抗体由经4次免疫的BALB/c小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合形成的ADV-1G5杂交瘤细胞产生,所述检测抗体由经3次免疫的兔脾细胞产生,均具有良好的特异性,适于应用;经与对照组比较,捕捉抗体和检测抗体在上述范围内时具有较好的检测效果。
进一步地,所述捕捉抗体的包被浓度为10μg/ml,所述检测抗体的浓度为8μg/ml。
实验例表明,上述浓度分别为捕捉抗体和检测抗体的最佳工作浓度。
进一步地,所述酶标板的包被方法如下:用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液对所述捕捉抗体进行稀释,包被温度为4~37℃,包被时间为1~12h。
通过上述方法进行包被,可显著提高包被的稳定性、降低包被浓度,节约捕捉抗体的用量。
进一步地,所述酶标板的包被温度为4℃,包被时间为12h。
实施例表明,上述条件为酶标板的最佳包被条件。
进一步地,所述酶标抗体的使用方法如下:将酶标抗体用1%的脱脂奶粉稀释2000~8000倍,在37℃下作用30~90min。
在上述条件下,酶标抗体具有较好的灵敏性,与检测抗体的结合率较高、牢固程度较好。
进一步地,所述试剂盒还包括封闭液、洗涤缓冲液、显色液以及终止液中的至少一种。
进一步地,所述封闭液为5%脱脂奶粉、5%胎牛血清、5%马血清、3%BSA或5%BSA中的一种。
进一步地,所述封闭液为5%的脱脂奶粉。
封闭液的作用是将酶标板中未被吸附的位点进行封闭,以降低非特异性吸附,避免吸附杂质对实验结果造成干扰,降低假阳性结果发生的概率。
进一步地,封闭条件为37℃下1~3h。
该条件下封闭液可以起到较好的封闭效果,降低本底干扰。
进一步地,所述显色液为TMB显色液,显色时间为5~20min。
显色时间在该范围内时,可以使显色充分、提高实验结果的准确性和显色效率。
本发明的有益效果如下:本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,利用AMDV-VP2蛋白分别免疫小鼠和家兔,制成鼠抗AMDV单克隆抗体和兔抗AMDV多克隆抗体,分别作为捕捉抗体和检测抗体,对病毒抗原进行双向夹持,通过对酶标二抗与检测抗体结合的检测,实现了对AMDV抗原的检测;通过对实验方法进行优化,确定了最佳反应条件。本研究建立的DAS-ELISA检测方法具有敏感、特异、稳定、简便等优点,适用于一线检疫人员进行大规模病原检测。
附图说明
图1为实验例1中VP2重组表达蛋白SDS-PAGE电泳图;
图2为实验例1中VP2重组表达蛋白Western Blotting分析结果;
图3为实验例2中pAb和mAb的IFA检测结果;
其中:A:pAb感染CRFK细胞的IFA检测结果;B:pAb产生细胞的IFA检测结果;C:mAb感染CRFK细胞的IFA检测结果;D:mAb产生细胞的IFA检测结果;
图4为实验例3中阳性样品组的棋盘法实验结果;
图5为实验例3中阴性样品组的棋盘法实验结果;
图6为实验例6中特异性实验的结果;
图7为实验例7中敏感性实验的结果;
图8为实验例8中DAS-ELISA和PCR实验结果比较。
具体实施方式
下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,包被浓度为5μg/ml;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为4μg/ml;
所述酶标抗体为山羊抗兔IgG-HRP。
实施例2
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,包被浓度为20μg/ml;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为40μg/ml;
所述酶标抗体为山羊抗兔IgG-HRP。
实施例3
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将捕捉抗体稀释为10μg/ml,包被条件为37℃、1h;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为8μg/ml;
所述酶标抗体为山羊抗兔IgG-HRP,用1%的脱脂奶粉稀释2000倍。
实施例4
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将捕捉抗体稀释为10μg/ml,包被条件为37℃、2h;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为8μg/ml;
所述酶标抗体为山羊抗兔IgG-HRP,用1%的脱脂奶粉稀释8000倍。
实施例5
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将捕捉抗体稀释为10μg/ml,包被条件为4℃、12h;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为8μg/ml;
所述酶标抗体为山羊抗兔IgG-HRP,用1%的脱脂奶粉稀释5000倍。
实施例6
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为5%脱脂奶粉。
实施例7
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为5%胎牛血清。
实施例8
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为5%马血清。
实施例9
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为3%BSA。
实施例10
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为5%BSA。
实施例11
如实施例6所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括TMB显色液。
对照例1
如实施例3所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其中所述捕捉抗体的包被条件为37℃、0.5h。
对照例2
如实施例3所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其中所述捕捉抗体的包被条件为4℃、14h。
对照例3
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为1%BSA。
对照例4
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为8%BSA。
对照例5
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,还包括封闭液,所述封闭液为3%胎牛血清。
对照例6
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其中所述酶标抗体用1%的脱脂奶粉稀释1000倍。
对照例7
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其中所述酶标抗体用1%的脱脂奶粉稀释10000倍。
实验例1
阿留申病毒VP2抗原的制备与鉴定
(1)选取VP2基因600~1755nt区域进行合成并连接pET-30a(+)载体,阳性质粒转化BL21感受态细胞,挑取单克隆,进行摇瓶培养,提取质粒后进行测序;
(2)选取测序结果为阳性的菌于37℃摇床培养过夜,摇起的菌液以1﹕100接种量转入Kanamycin LB液体培养基,37℃培养至OD600nm值为0.4~0.6时,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃继续培养4h;
(3)收集诱导的菌体,1×PBS洗涤1次后重悬,利用超声波细胞破碎仪破碎菌体后离心,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析,确定目的蛋白表达情况;
(4)将表达的带组氨酸标签的VP2蛋白利用Ni-NTA Agarose进行纯化后,对包涵体蛋白进行复性,以AMDV阳性血清作为一抗进行Western Blotting分析,超滤浓缩后-80℃保存备用。
SDS-PAGE结果如图1所示,重组菌经IPTG诱导获得高效表达,包涵体中出现55kDa左右的目的蛋白条带,与预期结果相符;Western Blotting结果如图2所示,显示目的蛋白与AMDV阳性血清呈特异性反应,说明重组表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性。
实验例2
抗体的制备与鉴定
1.捕捉抗体的制备与鉴定
(1)将阿留申病毒VP2抗原与FCA等体积混合,按照60ug/只的剂量,对10只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠进行皮下注射免疫;
(2)此后每隔14d免疫一次,剂量为30ug/只,以IFCA为佐剂;
(3)于第4次免疫后的第7d进行眼眶取血,用间接ELISA法检测血清抗体效价,并用50ug抗原对免疫血清效价最高的小鼠进行腹腔冲击;
(4)腹腔冲击3d后,取免疫后小鼠脾细胞,采用PEG法将其与SP2/0细胞进行融合,融合细胞采用HAT半固体培养基筛选培养,得到ADV-1G5杂交瘤细胞;
(5)以阿留申病毒为包被抗原建立间接ELISA方法,对杂交瘤细胞上清进行检测;阳性杂交瘤细胞株鉴定亚类后扩大培养,以此制备腹水;
腹水采用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化,通过间接ELISA测定mAb效价,并用IFA法鉴定mAb的特异性。
2.鉴定抗体的制备与鉴定
(1)将阿留申病毒VP2抗原与FCA等体积混合,按照1mg/只的剂量,对若干只新西兰大白兔进行皮下多点注射免疫;
(2)14d后进行第二次免疫,剂量为1mg/只,以IFCA为佐剂;
(3)再次间隔14d后进行第三次免疫,剂量为1mg/只,无佐剂;
(4)于第三次免疫后的第7d进行耳缘静脉采血,收获兔血清,通过间接ELISA检测pAb的效价,并用间接免疫荧光(IFA)检测pAb反应活性。
实验结果显示,以纯化的VP2蛋白作为包被抗原,间接ELISA方法检测pAb和mAb的效价分别为1﹕12800和1﹕204800。经Southern Biotech亚类鉴定试剂盒鉴定,mAb为IgG2aκ亚型。IFA检测结果如图3所示,pAb和mAb均能与感染AMDV的CRFK细胞反应,出现绿色荧光,与未感染的CRFK细胞则无反应,表明得到的pAb和mAb均具有较好的特异性。
实验例3
DAS-ELISA实验方法的建立
1.捕捉抗体和检测抗体最佳工作浓度的确定
通过棋盘滴定法确定两者的最佳工作浓度。将mAb按倍比稀释为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml包被酶标板,将pAb倍比稀释为4000μg/ml、800μg/ml、400μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、8μg/ml、4μg/ml和0μg/ml,加入1:5000稀释的山羊抗兔IgG-HRP,进行DAS-ELISA试验检测纯化AMDV抗原,同步设立CRFK细胞抗原为阴性对照。选择OD450nm值接近1,P/N值最大孔所对应的mAb和pAb浓度作为最佳工作浓度。
实验结果如图4和图5所示,最佳工作浓度为:mAb的包被浓度为10μg/ml,pAb的浓度为8μg/ml
2.包被条件的确定
用pH 9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释mAb,分别按照实施例3~5和对照例1~2提供的包被条件对酶标板进行包被。在捕捉抗体和检测抗体的最佳工作浓度条件下,确定mAb的最佳包被条件。
结果显示,实施例1~3提供的条件较对照例1~2提供的条件更佳,其中最佳包被条件为实施例5提供的4℃、12h。
3.封闭液和封闭时间的确定
捕捉抗体和检测抗体为最佳工作浓度,包被条件最佳,分别采用实施例6~10和对照例3~5中提供的封闭液,于37℃下分别作用0.5h、1h、2h、3h、4h、5h,测定OD450nm的值,确定最佳封闭液和封闭时间。
结果显示,最佳封闭液为实施例6提供的5%脱脂奶粉,最佳封闭时间为1h。
4.抗原最佳作用时间的确定
在已确定的最佳反应条件下,包被、封闭后,采用实施例6所述的试剂盒,加入纯化的AMDV,37℃分别反应15min、30min、60min、90min、120min、150min,进行DAS-ELISA试验,确定待检抗原的最佳作用时间。
结果显示,抗原的最佳作用时间为60min。
5.酶标抗体稀释度和作用时间的确定
在上述确定的最佳试验条件下,将山羊抗兔IgG-HRP分别按照实施例3~5和对照例6~7中提供的方法进行稀释,于37℃下分别作用15min、30min、60min、90min、120min,测定OD450nm的值,确定酶标抗体的最佳稀释度和作用时间。
结果显示,酶标抗体的最佳稀释倍数为实施例5提供的1:5000,最佳作用时间为30min。
6.显色时间的确定
在上述优化的最佳反应条件下,每孔加入100μL的实施例11提供的TMB显色液,室温条件下分别避光显色1min、3min、5min、10min、15min、20min、30min后,每孔加入100μL浓度为2mol/L的H2SO4终止反应,分别检测OD450nm,确定最佳显色时间。
结果显示,最佳显色时间为5min。
实验例5
判定标准的确定
采用上述经优化的DAS-ELISA方法检测30份经PCR确定为阴性的样品,计算OD450nm的平均值和标准差(SD),根据公式cut-off即可确定阳性判定标准。
根据实验结果,cut-off value=0.134+3*0.025=0.21,即当OD450nm>0.21时,则判定样品为AMDV阳性。
实验例6
特异性试验
以优化的最佳检测条件同步检测CPV、CDV、MEV 3种病毒,同时设立AMDV阴、阳性对照和CRFK细胞培养物的空白对照,检验该方法的特异性。
实验结果如图6所示,只有AMDV的检测结果为阳性,其他3种病毒及CRFK细胞培养物的检测结果均为阴性,说明该方法特异性良好,不易产生假阳性结果。
实验例7
敏感性试验
将纯化的AMDV用PBS稀释至64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL,采用建立的DAS-ELISA方法对其进行检测,以AMDV的稀释度为横坐标,读取的OD450nm值为纵坐标,绘制标准曲线,分析该方法的敏感性。
实验结果如图7所示,当AMDV浓度为2μg/mL时结果仍为阳性,而当浓度为1μg/mL时结果则为阴性,说明该方法的最低检出量可以达到2μg/mL,敏感性较好。
实验例8
符合率试验
取102份临床肛拭子样品,利用建立的DAS-ELISA与PCR方法同时对其进行检测,比较两者的检测结果,确定符合率。
实验结果如图8所示,其中阴性样品的符合率100%,阳性样品的符合率93.75%,总符合率96.875%,批间和批内变异系数均小于10%。表明该方法重复性较好,适宜用于对大批量样品进行分析。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体,其中:
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体,包被浓度为5~20μg/ml;所述单克隆抗体由ADV-1G5杂交瘤细胞株分泌产生,所述ADV-1G5杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13829;
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒VP2蛋白多克隆抗体,浓度为4~40μg/ml;
所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。
2.如权利要求1所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述捕捉抗体的包被浓度为10μg/ml,所述检测抗体的浓度为8μg/ml。
3.如权利要求1所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述酶标板的包被方法如下:用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液对所述捕捉抗体进行稀释,包被温度为4~37℃,包被时间为1~12h。
4.如权利要求3所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述酶标板的包被温度为4℃,包被时间为12h。
5.如权利要求1所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述酶标抗体的使用方法如下:将酶标抗体用1%的脱脂奶粉稀释2000~8000倍,在37℃下作用30~90min。
6.如权利要求1所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,还包括封闭液、洗涤缓冲液、显色液以及终止液中的至少一种。
7.如权利要求6所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述封闭液为5%脱脂奶粉、5%胎牛血清、5%马血清、3%BSA或5%BSA中的一种。
8.如权利要求7所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述封闭液为5%的脱脂奶粉。
9.如权利要求8所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,封闭条件为37℃下1~3h。
10.如权利要求6所述的水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于,所述显色液为TMB显色液,显色时间为5~20min。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710305794.6A CN107085115B (zh) | 2017-05-03 | 2017-05-03 | 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710305794.6A CN107085115B (zh) | 2017-05-03 | 2017-05-03 | 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107085115A true CN107085115A (zh) | 2017-08-22 |
CN107085115B CN107085115B (zh) | 2018-11-16 |
Family
ID=59612940
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710305794.6A Expired - Fee Related CN107085115B (zh) | 2017-05-03 | 2017-05-03 | 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107085115B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107365360A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-21 | 吉林大学 | 抗原肽‑微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用 |
CN110376375A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-10-25 | 中国农业科学院特产研究所 | 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 |
CN112986562A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-06-18 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种水貂阿留申病毒vp2蛋白抗体竞争elisa检测试剂盒及其检测方法 |
CN113388010A (zh) * | 2020-03-11 | 2021-09-14 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN203745472U (zh) * | 2014-04-01 | 2014-07-30 | 张金玲 | 水貂阿留申病毒检测用的对流免疫电泳成孔装置 |
US20170101691A1 (en) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Mark Stahl | Elimination of pathogenic infection in farmed animal populations |
-
2017
- 2017-05-03 CN CN201710305794.6A patent/CN107085115B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN203745472U (zh) * | 2014-04-01 | 2014-07-30 | 张金玲 | 水貂阿留申病毒检测用的对流免疫电泳成孔装置 |
US20170101691A1 (en) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Mark Stahl | Elimination of pathogenic infection in farmed animal populations |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
姜亦飞,等: "水貂阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备", 《山东农业科学》 * |
王元智,等: "抗水貂阿留申病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立", 《中国畜牧兽医学会生物技术分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会 论文集》 * |
王建科,等: "水貂肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立", 《中国兽医科学》 * |
王建科: "抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107365360A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-21 | 吉林大学 | 抗原肽‑微球及制备方法和在水貂阿留申病检测中的应用 |
CN110376375A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-10-25 | 中国农业科学院特产研究所 | 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 |
CN113388010A (zh) * | 2020-03-11 | 2021-09-14 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒 |
CN113388010B (zh) * | 2020-03-11 | 2022-09-13 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 新型冠状病毒重组蛋白s1抗原及双抗原夹心elisa抗体检测试剂盒 |
CN112986562A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-06-18 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种水貂阿留申病毒vp2蛋白抗体竞争elisa检测试剂盒及其检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107085115B (zh) | 2018-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107085115A (zh) | 一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 | |
CN107937352B (zh) | 用于检测小反刍兽疫病毒h蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条 | |
CN108614121B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用 | |
CN101023098A (zh) | 乙肝病毒s抗原的检测方法 | |
CN107058239B (zh) | 一种抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用 | |
Venkatesan et al. | Expression and evaluation of recombinant P32 protein based ELISA for sero-diagnostic potential of capripox in sheep and goats | |
CN104749361A (zh) | 猪圆环病毒2型抗原捕获elisa试剂盒 | |
CN103163299A (zh) | 禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 | |
CN116023506B (zh) | Asfv非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用 | |
CN103436496A (zh) | 抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 | |
CN116836270B (zh) | 一种抗蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途 | |
CN105296441A (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒毒株及其应用 | |
CN106279378A (zh) | 水痘带状疱疹病毒gE抗原及其在检测抗水痘带状疱疹病毒抗体中的用途 | |
CN103323585A (zh) | 一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法 | |
CN105445457B (zh) | 检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体及试剂盒 | |
CN109799342A (zh) | 一种o型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒 | |
CN114807178B (zh) | 非洲猪瘟病毒p72蛋白c末端多表位重组抗原及应用 | |
CN102183658B (zh) | 一种基于重组ul55蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法 | |
CN105754951B (zh) | 抗羊痘病毒k3l蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
CN111208302B (zh) | 利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫o型抗体的化学发光检测试剂盒 | |
CN108486069A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒低含量样品的病毒分离方法 | |
CN103342740B (zh) | 一种检测禽戊型肝炎病毒特异性抗体的阻断elisa方法 | |
CN110452883B (zh) | 禽白血病p27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN109589406A (zh) | 一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法 | |
CN115746130B (zh) | 鸭呼肠孤病毒单克隆抗体NDRV-σC及其检测试剂盒和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20181116 |