CN105754951B - 抗羊痘病毒k3l蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株杂交瘤细胞株K3L25，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：C2015222。本发明的杂交瘤细胞株K3L25及所分泌的单克隆抗体表现出良好的免疫原性，可在制备早期诊断试剂或早期检测羊痘病毒感染试剂中的应用，也可在制备基础试验中使用的试剂中应用。

Description

抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，确切讲本发明涉及一种抗羊痘病毒K3L蛋白的杂交瘤细胞株以及其分泌的抗羊痘病毒K3L全蛋白的单克隆抗体，以及这种杂交瘤细胞或抗体在制备检测或检测羊痘病毒试剂的应用。

背景技术

羊痘是羊疫病中一种高度接触性和具有毁灭性病毒病，被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告的动物疫病，以发热、结膜炎、鼻炎、皮肤和粘膜的痘疮、呼吸困难及死亡为特征。羊痘主要流行于非洲、中东、印度、尼泊尔土耳其的一些地区，国内主要流行于青海、甘肃、湖南和内蒙等地区。羊痘病毒（Sheeppox virus, SPV）属于痘病毒科、脊索动物痘病毒亚科、山羊痘病毒属，主要通过气溶胶、近距离接触或昆虫叮咬传播，绵羊是绵羊痘病毒主要的宿主，各年龄段均能感染，但是死亡病例主要发生于羔羊，死亡率高达100%，给养羊业造成重大的经济损失，被认为是经济上潜在的生物武器。因此，绵羊痘的诊断和防控一直是研究的热点。

中国发明专利2011103869424公开了一种羊痘病毒属病毒，包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的芯片检测装置。该专利通过设计特异性探针，可对羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒进行同时鉴定。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测羊痘病毒属山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的方法。

中国发明专利申请2013105940610和201310594930X分别公开了用于羊痘病毒胶体金检测试剂条的胶体金、金标抗体及其制备方法。所述胶体金中采用羊痘病毒P32单克隆抗体的最适宜标记量，所制备金标抗体复合物在可见光范围内进行扫描出现最大的吸收峰。这些方法都是针对病毒复制中、后期的核酸或者结构蛋白而建立起来的，因此，它们只能在病毒感染宿主12h甚至更长的时间之后才能检测出病毒是否存在。而本发明所制备的抗K3L蛋白的单克隆抗体在羊痘病毒早期感染检测中的应用，最早可在病毒感染细胞2小时检测到K3L的表达，24小时达到最大。因此，本发明涉及到的K3L抗体的制备可在羊痘病毒早期检测试剂或试剂盒中的应用。

发明内容

本发明提供一种抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体。

本发明的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：C20152222。

上述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25可分泌单克隆抗体。

本发明所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25可在制备诊断试剂或检测羊痘病毒感染试剂中的应用。而本发明所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25所分泌的单克隆抗体也可在制备诊断试剂或检测羊痘病毒感染试剂中的应用。

此外，本发明的杂交瘤细胞株K3L25及所分泌的单克隆抗体也可在制备试验用的试剂中应用。

本发明的抗K3L蛋白的单克隆抗体制备方法是：由于羊痘病毒K3L基因中GC含量很高，经过前期摸索发现，通过常规方法直接克隆羊痘病毒的基因并不能表达获得K3L可溶性蛋白。因此，本发明根据SPV K3L基因序列，进行密码子偏好性分析和密码子优化改造后合成K3L基因全序列，与pUC57载体连接后，再将连接产物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒并测序，将测序正确的重组质粒命名为pUC57-K3L。将K3L基因亚克隆至原核表达载体pET11d中，重组质粒命名为pET11d- K3L，再将重组质粒转化至BL21（DE3）plysS感受态细胞中，以IPTG为诱导剂对重组菌进行诱导表达，得到重组K3L可溶性蛋白，大量表达后通过收集上清，进行蛋白的收集和处理，最终将获得蛋白免疫Balb/c小鼠，并将小鼠的脾脏采集分离脾淋巴细胞与准备好的SP2/0细胞进行融合杂交，经细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养后，进行杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化，冻存细胞并进行获得的单克隆抗体的特性鉴定后获得本发明的单克隆抗体。

传染病的防控过程中，如有针对病原的某一特定分子进行早期的检测可为后期的防控措施的制定带来极大便利，为减少疾病的进一步传播带来好处。目前羊痘病毒的诊断主要是对临床样品和细胞培养物PCR分析。而目前已报到的血清学方法，主要是羊痘病毒晚期表达基因的来建立，如基于结构蛋白P32（王永志等，2011，中国畜牧兽医，38（9）：101-105），其主要用于病毒感染后期（如细胞感染48h以上）的检测和诊断。而本发明所制备的抗K3L蛋白的单克隆抗体在羊痘病毒早期感染检测中的应用，最早可在病毒感染细胞2小时检测到K3L的表达，24小时达到最大。因此，本发明涉及到的K3L抗体的制备可在羊痘病毒早期检测试剂或试剂盒中的应用。而本发明所制备的抗K3L蛋白的单克隆抗体在羊痘病毒早期感染检测中的应用，最早可在病毒感染细胞2小时检测到K3L的表达，24小时达到最大。因此，本发明涉及到的K3L抗体的制备可在羊痘病毒早期检测试剂或试剂盒中的应用。

附图说明

附图1为SPV K3L在密码子优化前的密码子质量分布GC含量图。

附图2为SPV K3L在密码子优化后的密码子质量分布GC含量图。

附图3为SPV K3L在密码子优化前所使用的密码子某一位置的质量位点图。

附图 4为SPV K3L在密码子优化后所使用的密码子与附图3同一位置的质量位点图。

附图5为SPV K3L在密码子优化前密码子GC含量图。

附图6为SPV K3L在密码子优化后密码子GC含量图。

附图7为重组pUC57-K3L载体用克隆引物进行PCR扩增结果，从图7中可见获得了预期大小的目的片段。

附图8为用BanH I和 Xba I对质粒pUC57-K3L和pET11d-K3L进行双酶切后的电泳图，其中A图为质粒pUC57-K3L，B图为质粒pET11d-K3L，电泳显示均有预期大小的片段。

附图9为对pET11d-K3L测序结果。

附图10为对 SPV K3L蛋白表达的 SDS-PAGE 分析结果，其中：泳道M:蛋白marker;泳道NC:未诱导的全细胞裂解液;泳道1:15℃诱导16小时的全细胞裂解液;泳道2:37℃诱导4小时的全细胞裂解液;泳道NC1:未诱导的细胞裂解液上清;泳道NC2:未诱导的细胞裂解液沉淀;泳道3:15℃诱导16小时的细胞裂解液上清;泳道4:15℃诱导16小时的细胞裂解液沉淀;泳道5:37℃诱导4小时的细胞裂解液上清;泳道6:37℃诱导4小时的细胞裂解液沉淀。箭头（→）指示的为目的蛋白。

附图11为用His纯化柱进行纯化后得到较纯的K3L重组目的蛋白的电泳图。

附图12 K3L重组蛋白的纯化后的Western Blot分析图，结果表明纯化后的重组蛋白为His重组蛋白。

附图13为K3L单抗经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit的检测图，检测表明K3L为IgG2a亚类。

附图14为Western Blot鉴定K3L单克隆抗体的活性的电泳图，其中：1为重组蛋白，2和3为绵羊痘病毒感染12 h和24h后蛋白，4为未感染Vero细胞蛋白对照。

附图15为ELISA检测SPV感染细胞后K3L蛋白的表达量图。

附图16为显示被检测到细胞中羊痘病毒的K3L蛋白定位的免疫荧光分析图。

附图17为DAPI对细胞核进行的染色后的免疫荧光分析图。

附图18图16和17叠合后的免疫荧光图。

具体实施方式

本发明以下结合实施例进行解说。以下内容仅用于说明本发明的相关内容细节，不应将其理解为对本发明保护范围的限定。

1.毒株和细胞

本发明所使用的毒株系绵羊痘病毒古浪株，所使用的毒株和所使用的Vero细胞和SP2/0细胞均由申请人（中国农业科学院兰州兽医研究所）保存。

2.主要试剂

pUC57克隆载体、Top10感受态细胞、质粒提取试剂盒、XbaⅠ及BamHⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司；DMEM培养基、RPMI -1640细胞培养基和胎牛血清均购自Gibco公司；胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；pET11d 表达载体、BL21（DE3）plysS 宿主菌、His结合树脂和硝酸纤维素膜购自Novagen 公司；琼脂粉、蛋白胨和酵母粉均购自OXOID公司；氨苄青霉素（AMP）、IPTG、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊 IgG以及弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自 Sigma 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG购自Biowrold公司；预染蛋白marker、SuperSignal West Femto 化学发光底物购自Thermo Fisher 公司；X光底片、显影及定影液均购自柯达公司；A型口蹄疫病毒（FMDV-A）、羊口疮病毒（ORFV）和小反刍兽疫病毒（PPRV）三种病原的抗体ELISA检测试剂盒均购自中国农业科学院兰州兽医研究所诊断中心；其他试剂均为国产分析纯。

3.主要仪器

智诚ZWY-240恒温培养振荡器，Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机，Eppendorf5810R 高速冷冻离心机，Mastercycle Eppendorf PCR仪，精宏DNP-9052电热恒温培养箱，良平JA2003电子天平，Heal Force BIOsafe 12生物安全柜，伯乐半干转膜仪。

一、SPV K3L全基因密码子优化合成、克隆与鉴定

根据SPV K3L基因序列，进行密码子偏好性分析和密码子优化后合成全序列。合成产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下切下大小约为300 bp的目的条带，用AXYGEN公司DNA凝胶回收试剂盒对目的基因进行纯化；将绵羊痘病毒K3L基因PCR产物与pUC57载体4 ℃连接过夜，反应体系为：回收的DNA片段4 µL，pUC57 载体1 µL，Solution Ⅰ5 µL；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，37 ℃静置培养过夜；用灭菌的枪尖挑取单克隆菌落置于含有AMP抗性的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜；取2mL过夜培养物，按照大连宝生物质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒并进行酶切鉴定，反应体系为：pUC57-SPV K3L 10 µL，BamHⅠ1 µL，XbaⅠ1 µL，10×K buffer 2 µL，加入ddH2O至20 µL；将20 µL重组质粒的酶切鉴定产物全部用于琼脂糖胶核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行分析并拍照。结果参见附图7和附图8，酶切后的小片段大小约为270 bp，表明SPV K3L基因正确插入pUC57载体中。将重组质粒送Invitrogen公司测序鉴定，结果表明插入片段正确未产生突变。

密码子优化前的SPV K3L基因序列为：SEQ ID NO.1；

密码子优化后的SPV K3L基因序列为：SEQ ID NO.3；

SPV K3L氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

经过本发明的密码子优化后，密码子等级提高，质量更高，GC含量明显下降，有利于K3L在大肠杆菌中可溶性表达，相应的结果参见附图1至附图6。图2中显示密码子优化后SPV的高质量的密码子占的比例比优化前（图1）大大提高，而图4中显示的密码子优化后的SPV K3L所有的核苷酸序列位点的质量比优化前（图3）有所提高，而图6显示的是SPV K3L密码子优化后的GC含量比优化前（图5）有所下降。这将有利于K3L在大肠杆菌中可溶性表达。

二、SPV K3L基因原核表达载体的构建

将pET11d原核表达载体与鉴定正确的pUC57-SPV K3L重组质粒于37 ℃水浴条件下进行BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，反应体系为：pET11d/pUC57-SPV K3L 10µL，BamHⅠ1µL，XhoⅠ1 µL，2×K buffer 2 µL，加入ddH2O至20 µL（参见附图8A）；按胶回收试剂盒说明书回收载体及目的片段，将载体及目的片段于16 ℃水浴条件下进行连接，反应体系为：SPV K3L基因回收片段15µL，pET11d载体回收片段3 µL，10×T4连接酶buffer 2.5 µL，T4 DNA连接酶 1µL加入ddH2O至25 µL；将连接产物转化至BL21（DE3）plysS感受态细胞，37 ℃振荡培养过夜；取2 mL过夜培养物，按照大连宝生物质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒并进行酶切鉴定，反应体系为：pET11d-SPV K3L 10µL，BamHⅠ1µL，XhoⅠ1 µL，10×K buffer 2 µL，加入ddH2O至20 µL；将20 µL重组质粒的酶切鉴定产物全部用于琼脂糖胶核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行分析并拍照。酶切后的小片段大小约为270 bp，结果参见图8B所示，表明SPV K3L基因正确插入pET11d载体中。将重组质粒送Invitrogen公司测序鉴定，结果表明插入片段正确未产生突变，参见附图9。

三、SPV K3L基因的诱导表达

取50 µL阳性菌液过夜培养物至5 mL LB培养基，37 ℃振荡培养至 OD600=0.6时，加入IPTG至终浓度为 1 mM 诱导表达4 h。吸取1 mL诱导后的菌液，5500 r/min离心 10min 收集菌体，加入80 µL PBS重悬菌体后加入20 µL 5×SDS-PAGE loading buffer，混合均匀，置于沸水中处理5 min，SDS - PAGE检测目的蛋白表达情况。结果如图10所示，重组蛋白大小约为 35 ku，与预期大小一致。

四、SPV K3L重组蛋白的抗原性分析

蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，半干法转印至NC膜。将膜浸在封闭液中4 ℃封闭过夜，分别用SPV标准阳性血清为一抗，HRP标记的兔抗山羊IgG为二抗进行 Western-blot分析，最后参照Thermo Fisher公司SuperSignal West Femto化学发光底物操作说明，对目的条带进行显影，对重组蛋白反抗原性进行分析。结果如图12所示，SPV 标准阳性血清能够识别SPV K3L重组蛋白，表明SPV K3L蛋白能够刺激动物机体产生特异性抗体，即SPV K3L具有抗原性，能够作为检测SPV感染的候选蛋白。

五、SPV K3L重组蛋白的纯化

用His纯化柱进行纯化后得到较纯的K3L重组目的蛋白（图11），并对纯化后的蛋白进行Western Blot分析，结果表明纯化后的重组蛋白为His重组蛋白（图12）。

将1 mL重组菌接入100 ml 含有AMP抗性的LB培养基，37 ℃振荡培养至 OD₆₀₀=0.6，按优化的表达条件进行诱导表达；5500 r/min离心10 min收集菌体，弃上清，用10 mLPBS重悬菌体后进行超声破碎，超声程序为：超声5 s，停8 s；超声完毕后，取1mL菌体裂解液12000 r/min离心10 min，分别收集上清及沉淀，沉淀用与上清相同体积的PBS重悬，SDS-PAGE分析SPV K3L重组蛋白的可溶性。各取10 µL上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图11所示，重组蛋白大部分以可溶形式存在于上清之中。重组蛋白使用Novagen公司His结合树脂说明书进行纯化，各取10 µL样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图12所示，纯化后的重组蛋白条带较为单一，没有其他杂蛋白的污染。

六、用重组蛋白SPV K3L免疫BALB/c小鼠

选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行如下免疫程序：初次免疫时，用100 µg纯化后的重组蛋白SPV K3L与等量弗式完全佐剂混合，经乳化后皮下多点注射；首免后14天，用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。二免后14天采血并分离血清，用0.2 µg纯化的重组蛋白SPV K3L包被ELISA板，进行间接ELISA试验，测定血清效价，结果显示制备的鼠抗血清效价为1：100000。

纯化的重组蛋白SPV K3L经SDS-PAGE电泳后，半干法转印至NC膜。将膜浸在封闭液中4 ℃ 封闭过夜，分别用制备的鼠抗血清为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行Western-blot分析，最后参照Thermo Fisher公司SuperSignal West Femto化学发光底物操作说明，对目的条带进行显影，对制备的SPV K3L蛋白鼠抗血清进行鉴定。结果如图12所示，制备的鼠抗血清能够特异的识别SPV K3L蛋白，表明制备的鼠抗血清质量可靠，可用于基础试验中SPV K3L蛋白的检测。

七、细胞融合

在加强免疫小鼠3d后进行细胞融合。摘出小鼠眼球取血后，脱臼处死小鼠，放入70%酒精瓶中放置2 min后，于超净工作台内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤找到脾脏，用镊子取下，放入200目不锈钢滤膜中轻轻研碎，用PBS轻轻冲洗下细胞，之后放入37℃下的离心机中3000 rpm离心10 min，弃上清后备用；制备饲养细胞时，脱臼处死小鼠，放入70%酒精瓶中放置2 min后，于超净工作台内将小鼠固定于泡沫板上，解开腹部皮肤，用注射器吸取PBS轻轻注入腹膜下，从另一边再将含有饲养细胞的液体洗出，之后放入37℃下的离心机中3000 rpm离心10 min，弃上清后备用。于40℃水浴烧杯中，为了减轻PEG2000毒性，缓慢将PEG2000滴加到轻轻顺时针摇动的融合离心管中，时间控制在1 min之内，之后加入20%FBS的1640细胞培养基，轻轻吹起细胞，将细胞铺到6个96空培养板中，每孔100 μL。将培养板标记好后，放入37℃的含5% CO₂的细胞培养箱中培养，在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

将所得到杂交瘤细胞系送交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏物命名为：K3L25，其保藏编号为CCTCC No：C20152222。

八、阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆培养

首先，通过方正实验确定K3L作为抗原最佳包被量。将0.5、1.0、2.0、4.0μg的K3L纯化蛋白包被96孔板，每个浓度6个孔分别设置为3个阳性3个阴性。用不同稀释倍数的K3L纯化蛋白免疫鼠阳性血清进行方正滴定，同时以未免疫鼠阴性血清作为阴性对照。

用每孔0.5 μg纯化的K3L蛋白包被96孔ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3-4次，每次3-5 min；每孔加入200 μL的5%脱脂奶粉的PBST，37℃封闭2h; PBST洗涤3-4次，每次3-5 min，于折叠的纱布上拍干；加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的OPD底物溶液0.1ml，37℃暗处温育10 min分钟。各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。测OD值判断结果，在ELISA检测仪上，使用492nm检测。以阴性对照OD值的2.1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。挑选出抗羊痘病毒K3L蛋白的杂交瘤细胞单克隆。

按照上述方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，通过有限稀释法将原有的孔用HAT选择培养基稀释后重新分到96孔培养板中，之后观察细胞的形态和数量。调整细胞为3～10个细胞/ml。取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存。

九、单克隆抗体的大量制备及抗体、效价测定

通过腹腔注射0.5ml降植烷于8周龄BALB/C鼠， 2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。将获得的腹水于1000g离心10 min，弃去上层油脂和底部沉淀，收集上清分装与-20℃，测定腹水中单克隆抗体含量可达到8 mg/ml。

十、单克隆抗体的生物学分析

（1）单克隆抗体亚型鉴定

采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，主要参照试剂盒说明书进行操作。K3L单抗经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit检测后，为IgG2a亚类，鉴定结果见图13，表明本发明获得的单克隆抗体为IgG2a。

（2）免疫活性分析（WB）

采用Western blot分析获得的单克隆抗体的免疫活性。将重组纯化K3L蛋白、绵羊痘病毒感染12h和24h的细胞收集裂解产物以及未感染细胞蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，之后转印到NC膜上，将膜浸在封闭液中4 ℃封闭过夜，分别1:100稀释的单克隆抗体诱导小鼠的腹水为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行Western-blot分析，最后参照ThermoFisher公司SuperSignal West Femto化学发光底物操作说明，对目的条带进行显影，对制备的SPV K3L蛋白单克隆抗体进行鉴定。结果如图14所示，制备的鼠腹水抗体能够特异的识别SPV K3L蛋白，表明制备的抗体质量可靠，可用于基础试验中SPV K3L蛋白的检测。

（3）K3L抗体检测病毒感染细胞后不同时间的分析

将羊痘病毒接种Vero细胞，分别于感染后2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时和48小时收集细胞及培养液，然后包被ELISA板子，用抗羊痘病毒K3L蛋白杂交瘤细胞上清为抗体进行检测SPV感染细胞后K3L蛋白的表达量图。结果见图15，表明在羊痘病毒感染细胞后2小时就可以检测K3L蛋白。随着时间的增加，强度越来越强。表明K3L单克隆抗体可以用于羊痘病毒感染的早期诊断。

（4）免疫荧光分析亚细胞定位

将羊痘病毒GY株感染Vero细胞和对照组的Vero细胞用4%的多聚甲醛固定20 min，室温干燥后，用含有0.1% Tween-20，pH7.4 的PBS洗涤3次，10 min/次；5% BSA温育30 min后，加入用0.1% Tween-20，pH7.4 的PBS 1:100倍稀释的羊痘病毒K3L蛋白单克隆抗体诱导小鼠的腹水为一抗，于37℃作用1 h后，用上述方法洗涤；再加入1:100倍稀释的罗丹明标记的山羊抗鼠IgG抗体，于37℃作用30 min后，用同样的方法洗涤。最后用90%的甘油封片，荧光显微镜观察结果。间接免疫荧光检测结果见图16、图17和图18。其中图16显示的是被检测到羊痘病毒表达K3L蛋白，图17为DAPI对细胞核进行的染色，图18为图16和图17叠合后对K3L对蛋白情况的观察。结果表明感染组出现明显的红色荧光，通过绿色荧光可见细胞出现明显的聚合，且聚合度越高的地方，荧光越强，细胞浆内有荧光，而细胞核中没有荧光，表明K3L主要在细胞浆中存在。

（5）抗体特异性分析

分别采用A型口蹄疫病毒（FMDV-A）、羊口疮病毒（ORFV）和小反刍兽疫病毒（PPRV）和SPV四种病原包被ELISA板，用抗羊痘病毒K3L蛋白杂交瘤细胞上清为抗体进行检测，结果参见表1。结果表明，上述三种病毒均不能与本发明中的单克隆抗体发生反应，而能与SPV发生反应。

结论

通过上述方法，可获得绵羊痘病毒重组K3L蛋白及其高免血清，结果表明该蛋白具有良好的抗原性，可作为检测绵羊痘病毒检测的候选蛋白；用该重组K3L蛋白免疫BALB/c小鼠，制备的单克隆抗体能够特异性识别SPV K3L蛋白，可用于SPV感染后K3L蛋白的检测。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 267

<212> DNA

<213> 密码子优化前的SPPV K3L基因序列

<400>

atgtcatcga atagcgattt ggcattttgt tacgttttac ctaacattaa tgaagtaaca 60

gatggtattg tgtgtataag agataacatt gtatatgtaa aactaattaa ctatggtttg 120

gaagcacttg taatagatta tgttaatata aacatggatc aaatgaataa tataaaaaaa 180

acattagtta ataaattaat taatgtgcaa attataagga tgaacaaaat aaaaggatat 240

attgatgtaa aaatttataa taacaac 267

<210> 2

<211> 89

<212> PRT

<213> SPV K3L蛋白序列

<400>

Met Ser Ser Asn Ser Asp Leu Ala Phe Cys Tyr Val Leu Pro Asn

1 5 10 15

Ile Asn Glu Val Thr Asp Gly Ile Val Cys Ile Arg Asp Asn Ile

16 20 25 30

Val Tyr Val Lys Leu Ile Asn Tyr Gly Leu Glu Ala Leu Val Ile

31 35 40 45

Asp Tyr Val Asn Ile Asn Met Asp Gln Met Asn Asn Ile Lys Lys

46 50 55 60

Thr Leu Val Asn Lys Leu Ile Asn Val Gln Ile Ile Arg Met Asn

61 65 70 75

Lys Ile Lys Gly Tyr Ile Asp Val Lys Ile Tyr Asn Asn Asn

76 80 85 89

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> 密码子优化后的SPV K3L基因序列

<400>

atgtcaagta actccgacct ggcgttttgc tatgtgctgc cgaatatcaa cgaagtcacg 60

gatggtattg ttttcattaa agataacatt gtgtatgtta aactgatcaa ctacggcctg 120

gaagcgctgg tcattgatta tgtggacatc aacatggatc agatgaacaa cattaagaaa 180

accctggtta acaaactgat caatgtccaa atcgtgcgta tgaataaaat caaaggctac 240

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Claims (6)

1.抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No：C2015222。

2.权利要求1所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25在制备早期诊断试剂或早期检测羊痘病毒感染试剂中的应用。

4.权利要求2所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25分泌的单克隆抗体在制备早期诊断试剂或早期检测羊痘病毒感染试剂中的应用。

5.权利要求1所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25在制备试验用抗羊痘病毒试剂中的应用。

6.权利要求2所述的抗羊痘病毒K3L蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株K3L25分泌的单克隆抗体在制备试验用抗羊痘病毒试剂中的应用。

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