BRPI0716720A2 - mÉtodos para detectar um estado de doenÇa ou suscetibilidade a doenÇa em um indivÍduo mamÍfero e para detectar um anticorpo e dois ou mais anticorpos em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivÍduo mamÍfero, e, uso do mÉtodo - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DETECTAR UM ESTADO DE DOENÇA OU SUSCETIBILIDADE A DOENÇA EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO E PARA DETECTAR UM ANTICORPO E DOIS OU MAIS ANTICORPOS EM UMA AMOSTRA DE TESTE COMPREENDENDO UM FLUIDO CORPORAL DE UM INDIVÍDUO MAMÍFERO, E, USO DO MÉTODO. A invenção refere-se geralmente ao campo de ensaios diagnósticos ou prognósticos e, em particular, refere-se a ensaios para a detecção de anticorpos em uma amostra compreendendo fluido corporal do paciente, sendo que referidos anticorpos são usados como marcadores biológicos de um estado de doença ou suscetibilidade a doença. O ensaio baseia-se na titulação cruzada do fluido corporal do paciente a ser testado tanto no que se refere ao anticorpo e a um antígeno usado para detectar o anticorpo por meio de ligação específica.

Description

"MÉTODOS PARA DETECTAR UM ESTADO DE DOENÇA OU SUSCETIBILIDADE A DOENÇA EM UM INDIVÍDUO MAMÍFERO E PARA DETECTAR UM ANTICORPO E DOIS OU MAIS ANTICORPOS EM UMA AMOSTRA DE TESTE COMPREENDENDO UM FLUIDO CORPORAL DE UM INDIVÍDUO MAMÍFERO, E, USO DO MÉTODO" Campo da invenção

A invenção refere-se ao campo dos ensaios diagnósticos ou prognósticos e, em particular, refere-se a ensaios para a detecção de anticorpos em uma amostra compreendendo fluido corporal do paciente, sendo que referidos anticorpos são usados como marcadores biológicos de um estado de doença ou suscetibilidade a doença. Fundamentos da invenção

Muitos ensaios diagnósticos, prognósticos e/ou a monitoramento de ensaios baseiam-se na detecção de um marcador biológico de um estado de doença particular ou suscetibilidade a doença particular. Referidos marcadores biológicos são, comumente, proteínas ou polipeptídios que são característicos de uma doença particular ou associada com suscetibilidade a doença.

Nos anos mais recentes tornou-se aparente que anticorpos e, em particular, autoanticorpos, também podem servir como marcadores biológicos de doença ou suscetibilidade a doença. Autoanticorpos são anticorpos naturalmente ocorrentes dirigidos a um antígeno que o sistema imunológico de um indivíduo reconhece como estranho, ainda que referido antígeno tenha se originado efetivamente no indivíduo. Eles podem estar presentes na circulação como autoanticorpos livres circulantes ou em forma de complexos imunes circulantes consistindo de autoanticorpos ligados a seu antígeno-alvo. Diferenças entre uma proteína de tipo selvagem expressa por células "normais" e uma forma alterada da proteína produzida por uma célula adoecida ou durante um processo de doença podem, em alguns casos, levar ao fato de a proteína alterada ser reconhecida pelo sistema imunológico de um indivíduo como "não-própria" e elicitando, portanto, uma resposta imune naquele indivíduo. Isto pode ser uma resposta imune humoral (i.e., mediada por células B) que leva à produção de autoanticorpos imunologicamente específicos para a proteína alterada.

O WO 99/58978 descreve métodos para uso na detecção/diagnóstico de câncer que se baseiam na avaliação da resposta imune de um indivíduo a dois ou mais marcadores de tumor distintos. Estes métodos envolvem geralmente contactar uma amostra de fluido corporal colhida do indivíduo com um grupo de dois ou mais antígenos marcadores de tumor distintos, cada um derivado de uma proteína marcadora de tumor separada, e detectar a formação de complexos dos antígenos marcadores de tumor ligados a autoanticorpos circulantes imunologicamente específicos para as proteínas marcadoras de tumores. A presença de referidos autoanticorpos circulantes é considerada como uma indicação da presença de câncer.

Ensaios que medem a resposta imune do indivíduo à presença de proteína marcadora de tumor em termos de produção de autoanticorpos proporcionam uma alternativa para a medição correta ou detecção de proteína marcadora de tumor em fluidos corporais. Referidos ensaios constituem substancialmente a detecção indireta da presença de proteína marcadora de tumor. Devido à natureza da resposta imune, é provável que autoanticorpos possam ser elicitados por uma quantidade muito pequena de proteína marcadora de tumor circulante, e métodos indiretos que se baseiam na detecção da resposta imune a marcadores de tumor serão, consequentemente, mais sensíveis do que métodos para a medição direta de marcadores de tumor em fluidos corporais. Portanto, métodos de ensaio baseados na detecção de autoanticorpos podem ser de valor particular em um estágio precoce no processo de doença e, possivelmente, com relação à seleção de pacientes assintomáticos, pacientes assintomáticos, por exemplo, na seleção para identificar indivíduos "em risco" de desenvolver doença entre uma população de indivíduos assintomáticos, ou para identificar indivíduos que desenvolveram uma doença entre uma população de indivíduos assintomáticos. Adicionalmente, métodos de ensaio baseados na detecção de autoanticorpos podem ser de valor particular em um estágio precoce no processo de doença e, possivelmente, também podem ser usados para identificar indivíduos que desenvolveram uma doença entre uma população de indivíduos sintomáticos. Adicionalmente, eles podem ser úteis para a detecção mais precoce de doença recorrente. Os métodos de ensaio também podem ser de valor na seleção ou no monitoramento de terapias para uma doença.

Anticorpos e autoanticorpos também podem servir como marcadores biológicos de outros estados de doenças ou suscetibilidades a doenças, dentre as quais a artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), cirrose biliar primária (PBC), tireoidite autoimune (p. ex. tireoidite de Hashimoto), gastrite autoimune (p. ex. anemia perniciosa), adrenalite autoimune (p. ex., doença de Addison), hiperparatireoidismo autoimune, diabetes autoimune (p. ex., diabetes de tipo 1), miastenia grave, são meramente exemplos.

Os presentes inventores perceberam que, quando se usa, de forma diagnostica ou prognostica, ensaios baseados na detecção de anticorpos para avaliar o estado de doença, progressão da doença ou suscetibilidade a doença de um indivíduo dentro de uma população, surgem dificuldades em proporcionar uma metodologia de ensaio padronizada apropriada para toda a população de indivíduos a ser selecionada, porque as quantidades absolutas de anticorpo presentes variam drasticamente de indivíduo para indivíduo. Isto pode produzir uma elevada incidência de resultados negativos falsos, por exemplo, entre indivíduos apresentando uma baixa quantidade de anticorpos. De maneira análoga, há uma dificuldade em se classificar resultados positivos verdadeiros porque a variação entre as quantidades absolutas de anticorpo de indivíduo para indivíduo significa que é difícil determinar um limiar para o resultado de ensaio positivo que é apropriado para todos os indivíduos da população selecionada.

Os presentes inventores determinaram que o desempenho e, mais especificamente, a utilidade clínica e a confiabilidade dos ensaios baseados na detecção de anticorpos, particularmente autoanticorpos, como marcadores biológicos de doença, podem ser aperfeiçoados drasticamente por meio de inclusão de uma etapa de titulação de antígenos. Testando-se a amostra suspeita de conter anticorpos contra uma série de diferentes quantidades de antígeno, e construindo-se uma curva de titulação, é possível identificar de forma confiável resultados positivos verdadeiros da seleção independentemente da quantidade de anticorpo presente na amostra. Uma abordagem do tipo referido é contrária a métodos do estado da técnica que titulam antígeno meramente para construir uma curva de calibração de forma a permitir a identificação da concentração de antígeno mais apropriada a ser usada para detectar anticorpos em amostras de pacientes efetivos. Nestes métodos, propõe-se apenas uma medição de ponto único para o diagnóstico efetivo. Assim, estes métodos não permitirão variação em quantidades do anticorpo a ser detectado, de indivíduo para indivíduo, resultando na incidência de falsos positivos e falsos negativos. Os presentes inventores verificaram que métodos de ensaio baseados na titulação de antígeno apresentam maior especificidade e sensibilidade do que a medição da reatividade de autoanticorpos numa única concentração de antígeno.

Os inventores determinaram adicionalmente que métodos de ensaio que combinam a titulação de antígeno com a titulação simultânea da amostra de teste oferecem vantagens maiores do que métodos baseados apenas na titulação de antígeno, particularmente no contexto da detecção de autoanticorpos. Estes assim-chamados métodos de "titulação cruzada" da matéria-objeto da presente invenção. Sumário da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção proporciona- se um método para detectar um estado de doença ou suscetibilidade a doença em um indivíduo mamífero, sendo que referido método compreende detectar um anticorpo em uma amostra de teste, sendo que a amostra de teste compreende um fluido corporal de referido indivíduo mamífero e sendo que referido anticorpo é um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, sendo que referido método compreende:

(a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste:

(i) contactar a diluição da amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de um antígeno específico para referido anticorpo,

(ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno usada na etapa (i),

(b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada na etapa (a), e

(c) determinar a presença ou ausência de referido estado de doença ou suscetibilidade a doença com base na quantidade de ligação específica entre referido anticorpo e referido antígeno para cada diluição de amostra de teste e quantidade de antígeno testada.

De acordo com um segundo aspecto da invenção proporciona- se um método para detectar um anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, sendo que referido anticorpo é um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, sendo que referido método compreende: (a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste:

(i) contactar a diluição da amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de um antígeno específico para referido anticorpo,

(ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno usada na etapa (i),

(b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada na etapa (a), sendo que a presença na amostra de teste de anticorpo reativa com o antígeno usado no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção proporciona- se um método para detectar um anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, sendo que referido anticorpo é dirigido a uma substância estranha introduzida em referido indivíduo mamífero, sendo que o método compreende:

(a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste:

(i) contactar a diluição da amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de um antígeno específico para referido anticorpo,

(ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno usada na etapa (i),

(b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada na etapa (a), e sendo que a presença, na amostra de teste, de anticorpo reativo com o antígeno usado no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste.

Em todos os aspectos da invenção o indivíduo mamífero é, de preferência, um humano.

Em todos os aspectos da invenção o anticorpo pode ser um

autoanticorpo.

Em todos os aspectos da invenção o método é realizado, de preferência, in vitro em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal obtido ou preparado do indivíduo mamífero.

Em todos os aspectos da invenção, a etapa (a) do ensaio envolverá, de preferência, contactar cada diluição de amostra de teste com cada quantidade de antígeno usada no ensaio, de tal forma que todas as possíveis combinações de diluições de amostra de teste e quantidades de antígeno são testadas.

Uma característica particular da invenção em todos os seus aspectos é que a avaliação, de se o anticorpo relevante está ou não presente na amostra de teste, é com base na quantidade de ligação específica observada em cada combinação de diluição de amostra de teste e concentração de antígeno testada, em outras palavras, os valores coletivos, ao invés de apenas uma leitura a uma única concentração de antígeno ou para uma única diluição da amostra de teste. Assim, a determinação da presença ou ausência de estado de doença, ou de suscetibilidade a doença ou de anticorpos a uma substância estranha em uma amostra de paciente pode ser obtida diretamente com base nestes valores coletivos. Em uma concretização, a avaliação é realizada com base na presença de uma curva em forma geral de S ou sigmóide quando a quantidade de ligação específica é plotada contra a quantidade de antígeno para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste. Como se perceberá dos Exemplos aqui indicados, os inventores observaram que os métodos da invenção apresentam maior sensibilidade com especificidade pelo menos equivalente a métodos de diagnóstico ou de detecção baseados apenas em titulação de antígeno, e reduzem a incidência de determinações positivas falsas e negativas falsas.

A presente invenção será descrita agora adicionalmente. Nas passagens a seguir, diferentes características dos vários aspectos da invenção são definidas em maior detalhe. Cada característica assim definida, em conexão com um aspecto da invenção, pode ser combinadas com características descritas em conexão com qualquer outro aspecto da invenção, exceto se indicado claramente em contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferidas ou vantajosas, exceto se indicado claramente em contrário. Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 mostra uma série de curvas de titulação cruzada para detecção de autoanticorpos contra p53 (Fig.l, de a até d) e c-myc (Fig.l, de e até h) em amostras de soro colhidas de pacientes com câncer de mama. Em cada experimento, seis diferentes diluições do soro do paciente foram testadas separadamente quanto à ligação específica contra uma série de titulações de quantidades variáveis de antígeno c-myc ou p53 recombinante (diluição sérica de 1/10.000 é efetivamente um controle "sem soro"). Para cada antígeno, curvas separadas de ligação específica (expressas como absorbância a 650 nm) versus concentração de antígeno foram plotadas para cada diluição do soro do paciente.

A Figura 2 ilustra um exemplo de um layout de placa de titulação usado para realizar ensaios OSAAC (Optimal Serum and Antigen Concentration) [concentração ótima de antígeno e soro] de acordo com exemplo 3. Nota - as diluições de soro e antígeno são mostradas em placas separadas, enquanto que, na prática, as diluições de soro e antígeno são adicionadas em poços correspondentes na mesma placa única.

As Figuras de 3 a 7 mostram uma série de curvas de titulação cruzada para a detecção de autoanticorpos contra p53, ECD6 (também conhecido como o domínio extracelular de HER2) e um fragmento a 3' de ECD6 em amostras de soro colhidas de pacientes com câncer de mama primário e indivíduos de controle normais. Em cada experimento, testou-se separadamente seis diferentes diluições do soro do paciente quanto à ligação específica contra uma série de titulações de quantidade variadas de antígenos de fragmentos p53 recombinante, ECDp ou ECD6 a 3'. Para cada antígeno, curvas separadas de ligação específica (expressas como absorbância a 650 nm) versus concentração de antígeno foram plotadas para cada diluição do soro do paciente. A Figura 3 mostra curvas de titulação representativas para a detecção de autoanticorpos anti-p53 no soro de um paciente com câncer de mama primário (quadro a) ou de um indivíduo de controle normal (quadro b). A Figura 4 mostra curvas de titulação representativas para a detecção de autoanticorpos anti-ECD6 (usando antígeno ECD6) no soro de um paciente com câncer de mama primário (quadro a) ou de um indivíduo de controle normal (quadro b). A Figura 5 mostra curvas de titulação representativas para a detecção de autoanticorpos anti-ECD6 (usando antígeno ECD6 3') no soro de um paciente com câncer de mama primário (quadro a) ou de um indivíduo de controle normal (quadro b). A Figura 6 mostra curvas de titulação representativas para a detecção de autoanticorpos anti-p53 ou autoanticorpos anti-ECD6 no soro do mesmo paciente com câncer de mama primário usando antígeno p53 (quadro A), antígeno ECD6 (quadro B) ou antígeno ECD6 3' (quadro C). A Figura 7 (quadros de a até d) mostra curvas de titulação adicionais referidas no Exemplo 3. Descrição detalhada da invenção

Em termos gerais, a invenção proporciona um método de ensaio imunológico para detectar um anticorpo que serve como um marcador biológico para um estado de doença ou suscetibilidade a doença, caracterizado pelo fato de que duas ou mais diluições diferentes de uma amostra a ser testada quanto à presença do anticorpo (a amostra de teste) são analisadas, cada uma, quanto à ligação específica contra diferentes quantidades de antígeno específicas para o anticorpo, e curvas de titulação separadas da quantidade de ligação de anticorpo/antígeno versus a quantidade de antígeno testada são produzidas para cada diluição diferente da amostra de teste. Colocado de forma simples, o ensaio baseia-se na titulação cruzada tanto da amostra de teste e do antígeno usado como um reagente no ensaio imunológico.

As características gerais de ensaios imunológicos, por exemplo, ELISA, ensaios rádio-imunológicos e análogos, são bem conhecidas por aqueles com prática na técnica (ver Immunoassay, E. Diamandis e T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Ensaios imunológicos para a detecção de anticorpos apresentando uma especificidade imunológica particular requerem geralmente o uso de um reagente (antígeno) que apresenta reatividade imunológica específica com o anticorpo em teste. Dependendo do formato do ensaio, este antígeno pode ser imobilizado sobre um suporte sólido. Uma amostra a ser testada quanto à presença do anticorpo é colocada em contato com o antígeno e, se anticorpos da especificidade imunológica requerida estiverem presentes na amostra, eles reagirão imunologicamente com o antígeno para formar complexos anticorpo-antígeno que podem, então, ser detectados ou medidos quantitativamente. O método da invenção é caracterizado pelo fato de que duas ou

mais diluições diferentes da amostra a ser testada quanto à presença do anticorpo são testadas, cada uma, contra uma pluralidade de diferentes quantidades de antígeno (também referido aqui como uma série de titulações de antígeno). O ensaio precisa envolver testar pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste, mas pode envolver testar três, quatro, cinco, ou de seis a dez ou ainda mais diluições diferentes da amostra de teste. Cada diluição separada da amostra de teste é testada contra pelo menos duas e, de preferência, pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete ou mais diferentes quantidades do antígeno. Ensaios típicos também podem incluir um controle negativo que não contém qualquer antígeno e/ou uma amostra de teste negativa de controle, como por exemplo, uma diluição a 1/10.000 da amostra de teste.

Neste contexto, o termo "antígeno" refere-se a uma substância compreendendo pelo menos um determinante antigênico ou epítopo capaz de interagir especificamente com o anticorpo-alvo que se deseja detectar, ou qualquer agente de captura que interage especificamente com a região variável ou regiões determinadoras de complementaridade de referido anticorpo. O antígeno será tipicamente uma macromolécula biológica sintética ou naturalmente ocorrente, como por exemplo, uma proteína ou peptídeo, um polissacarídeo ou um ácido nucleico e pode incluir anticorpos ou fragmentos dos mesmos, como anticorpos anti-idiotipo.

Leitores versados na técnica perceberão que, no método da invenção, a quantidade de determinantes antigênicos ou epítopos obteníveis para ligação ao anticorpo-alvo é importante para estabelecer uma série de titulações. Em muitos formatos de ensaio a quantidade de determinantes antigênicos ou epítopos disponível para ligação está diretamente correlacionada com a quantidade de moléculas de antígeno presentes. No entanto, em outras concretizações, como em determinados sistemas de ensaio de fase sólida, a quantidade de epítopos ou determinantes antigênicos expostos pode não correlacionar-se diretamente com a quantidade de antígeno, mas pode depender de outros fatores, como fixação à superfície sólida. Nestas concretizações, referências feitas aqui a "diferentes quantidades de antígeno" em uma série de titulações podem ser consideradas como referindo a diferentes quantidades do epítopo ou determinante antigênico.

A quantidade relativa ou absoluta de ligação específica entre anticorpo (presente na diluição da amostra de teste) e antígeno é determinada para cada combinação diferente de diluição de amostra de teste e quantidade de antígeno (epítopo ou determinante antigênico) testado. Os resultados são então usados para plotar ou calcular uma série de curvas da quantidade (relativa ou absoluta) de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade de antígeno testado, sendo que uma curva separada é gerada para cada diluição de amostra de teste usada no ensaio. Resultados típicos são ilustrados, apenas a título de exemplo, nas Figuras anexas para detecção de um número de diferentes anticorpos. A presença na amostra de teste de anticorpo reativo com o antígeno usado no ensaio é determinada com base na quantidade de ligação específica observada em cada quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada no ensaio e é indicada usualmente pela presença de uma curva em forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes de amostra de teste.

As quantidades absolutas de ligação específica entre anticorpo e antígeno geralmente não são materiais, exceto se isto for indicado para produzir uma medição quantitativa. Para uma simples determinação "sim/não" da presença ou ausência de anticorpos é suficiente que se produza apenas uma curva com a forma correta para pelo menos duas das diferentes diluições de amostra de teste testadas no ensaio. Se não houver variação na ligação detectável com relação às diferentes quantidades de antígeno testadas para qualquer uma das diluições de amostra de teste testadas, então isto pode ser classificado como uma ausência de uma quantidade detectável de anticorpo. Em concretizações preferidas da invenção o método é não- quantitativo. Isto pode então fornecer uma determinação sim/não da presença ou ausência de anticorpo usando uma relação proporcional isenta de dimensão que é independente da força do sinal. Uma medida da quantidade de anticorpo presente em uma amostra particular pode, se desejado, ser derivada dos resultados do ensaio de titulação cruzada. Em concretizações não-limitantes envolvendo testes clínicos de uma população de pacientes, é possível estabelecer um valor de corte para classificar um resultado em um paciente particular como positivo, em comparação com resultados obtidos de um grupo de controle constituído de indivíduos normais, por exemplo, um valor de corte de desvios padrão da média de +2 do grupo normal. Amostras de pacientes em que a ligação específica de antígeno a anticorpo-alvo (p. ex., o valor obtido após correção para ligação não-específica) cai abaixo deste valor de corte para pelo menos uma concentração de antígeno podem ser classificadas como positivas.

Em outras concretizações não-limitantes da invenção é possível usar um sistema de calibração para classificar amostras de teste desconhecidas como positivas ou negativas. Um sistema de calibração pode basear-se no uso de amostras de controle positivas e negativas conhecidas. Amostras de calibrador/controle positivas e negativas podem ser analisadas em paralelo com a(s) amostra(s) de teste(s) usando-se a metodologia de ensaio da invenção. Amostras de teste desconhecidas são avaliadas como positivas ou negativas por meio de comparação com as amostras de controle positivas e negativas conhecidas usadas como calibradores.

O método da invenção é vantajoso para uso em ensaios clínicos diagnósticos, prognósticos, preditivos e/ou para monitoramento de ensaios em que as quantidades absolutas de anticorpos-alvos presentes podem variar enormemente de paciente para paciente. Os inventores observaram que se os referidos ensaios se baseiam na detecção da ligação de anticorpos usando uma concentração/quantidade simples de antígeno de teste, amostras de paciente contendo uma quantidade de anticorpo que se encontra na extremidade muito baixa ou na extremidade muito alta da faixa fisiológica normal (da quantidade de anticorpo) em toda a população podem não ser detectadas devido a limitações da metodologia de ensaio; amostras com uma baixa quantidade de anticorpo podem ser classificadas como resultados negativos falsos, enquanto que aqueles com níveis muito elevados de anticorpos podem encontrar-se fora da escala para a detecção precisa dentro da metodologia de ensaio selecionada.

Em todas as concretizações da invenção o anticorpo detectado usando-se a metodologia de ensaio de titulação cruzada pode ser um autoanticorpo.

O método de ensaio de titulação cruzada da invenção é particularmente vantajoso para a detecção de anticorpos/autoanticorpos como marcadores biológicos do estado de doença ou da suscetibilidade em que há considerável variação de paciente para paciente, tanto nas quantidades absolutas do anticorpo/autoanticorpo presentes no paciente, como também na especificidade dos anticorpos/autoanticorpos, em particular a afinidade do anticorpo/autoanticorpo por seu antígeno-alvo. Respostas de autoanticorpo, em virtude de sua própria natureza, podem variar significamente de paciente para paciente, sendo que ocorre variação tanto nas quantidades absolutas de autoanticorpo presentes como também na especificidade/afinidade dos autoanticorpos. O método da invenção pode considerar esta variação de paciente para paciente, permitindo, com isto, desenvolver um formato de ensaio padrão (vantajoso para uso nos testes de todos os indivíduos dentro de uma população) para qualquer dado anticorpo/autoanticorpo.

Interações entre autoanticorpos e seus antígenos-alvos são geralmente de baixa afinidade, mas a intensidade de ligação pode variar de paciente para paciente, como indicado acima. O método da invenção é particularmente vantajoso para detecção de ligação de baixa afinidade, porque é possível inferior um resultado positivo a partir da forma das curvas de titulação geradas para cada diluição de amostra de teste usada no ensaio.

O método da invenção difere de métodos de ensaio baseados apenas em titulação de antígeno (i.e., ensaios que envolvem teste de uma única amostra de teste contra uma série de titulações de antígenos) pelo fato de que permite a detecção de sinais produzidos pela ligação de anticorpos de baixa abundância e/ou de baixa afinidade que, de outra forma, poderiam ser mascarados por ligação não-específica (do antígeno usado no ensaio) com componentes não-alvo na amostra de teste.

Os inventores observaram considerável variação inter-antígeno e também intra-antígeno na diluição ótima de amostra de teste requerida para a detecção ótima de anticorpos-alvo. Assim, a mesma amostra de teste do paciente pode apresentar uma primeira diluição ótima para detecção de anticorpos para um primeiro antígeno, e uma diluição ótima diferente para detecção de anticorpos para um segundo antígeno derivado de uma proteína diferente (variabilidade inter-antígeno). A "diferença" na diluição ótima de amostra de teste para dois antígenos derivados de diferentes proteínas pode ser de várias ordens de magnitude. Por exemplo, uma diluição ótima de uma dada amostra de teste para detecção de anticorpos para um primeiro antígeno (proteína A) poderia ser de 1:800, mas a mesma amostra de teste pode requerer uma diluição ótima de 1:50 para detecção de anticorpos para um segundo antígeno (proteína B). É possível observar um efeito similar quando os antígenos usados são fragmentos diferentes da mesma proteína, ou uma proteína de comprimento pleno e um sub-fragmento desta proteína (variabilidade intra-antígeno). Assim, se a amostra de teste tiver que ser testada quanto à reatividade contra um grupo de antígenos diferentes (que são derivados de diferentes proteínas ou fragmentos de uma única proteína ou uma combinação dos mesmos), a diluição ótima de amostra de teste requerida para cada antígeno no quadro poderia ser diferente. O método da invenção contorna este problema por meio de testes de diversas diluições da amostra de teste contra diversas diluições de cada antígeno no grupo, cada vez que o método é realizado em um ambiente clínico. Assim, cada antígeno no grupo será testado automaticamente nesta diluição "ótima" de amostra de teste.

Os inventores também observaram que podem ocorrer diferenças inter-indivíduos na diluição ótima de amostra de teste para um antígeno particular. Assim, para qualquer antígeno dado, uma amostra de teste de um primeiro indivíduo pode fornecer um resultado ótimo a uma primeira diluição de amostra de teste (p. ex., 1:100), enquanto que, quando uma amostra de teste de um segundo indivíduo é testada usando-se o mesmo antígeno, uma diluição diferente da amostra de teste pode ser ótima (p. ex., 1:500). O método da invenção é capaz de considerar referida variação de paciente para paciente porque, para cada antígeno testado, testa-se uma faixa de diluições de amostra de teste contra uma faixa de diluições de antígeno cada vez que o ensaio é realizado em um ambiente clínico. Assim, o método da invenção usará sempre a diluição ótima de amostra de teste para cada antígeno testado contra cada amostras de teste. O método da invenção também proporciona uma salvaguarda

contra a variação diária no desempenho de ensaios imunológicos usados para a detecção de autoanticorpos/anticorpos para fins diagnósticos, prognósticos e/ou de monitoramento (estado de doença ou terapia). Observa-se freqüentemente que pode haver considerável variação diária na intensidade de sinal quando se realiza ensaios imunológicos para detecção de anticorpos em amostras compreendendo fluido corporal do pacientes. Referida variação poderia surgir, por exemplo, devido a diferenças na maneira pela qual as amostras foram obtidas e armazenadas antes do teste. Referidos fatores podem tornar difícil classificar os resultados de ensaios clínicos com certeza, por exemplo, com base em um valor de limiar simples de ligação anticorpo/antígeno. A presente invenção minimiza os efeitos de referida variação diária porque um resultado positivo para a presença de anticorpo é claramente evidente a partir da forma das curvas de titulação geradas para cada diluição de amostra de teste usada no ensaio, independentemente da intensidade do sinal.

Uma outra vantagem adicional do método da invenção é que ele permite a diluição da amostra do paciente, mas ainda produz resultados consistentes, e também que ele produzirá geralmente o mesmo resultado qualitativo de seleção (positivo/negativo) usando-se fluidos corporais de diferentes fontes em um indivíduo (p. ex., sangue ou soro versus fluido de ascite ou efusão pleural), embora a concentração absoluta de anticorpos possa ser diferente nos diferentes fluidos.

O método da invenção será realizado em qualquer formato vantajoso que permita o contato entre múltiplas diluições de uma amostra suspeita de conter o anticorpo e múltiplas diferentes quantidades de um antígeno. De maneira vantajosa, o contato entre diferentes diluições da amostra e diferentes quantidades do antígeno pode ocorrer em câmaras de reação separadas, porém paralelas, como os poços de uma placa de microtitulação. Quantidades variáveis do antígeno podem ser revestidas nos poços da placa de microtitulação via a preparação de diluições seriais de um estoque de antígeno em todos os poços da placa de microtitulação. O estoque de antígeno pode ter concentração conhecida ou desconhecida. É possível adicionar então frações de diluições preparadas da amostra de teste nos poços da placa, sendo que o volume da amostra de teste é mantido constante em cada poço. As quantidades absolutas de antígeno adicionadas nos poços da placa de microtitulação podem variar dependendo de referidos fatores como a natureza do anticorpo-alvo, a natureza da amostra sob teste, diluições da amostra de teste, etc, como o perceberão aqueles versados na técnica. De uma maneira geral, as quantidades de antígeno e as diluições da amostra de teste serão selecionadas de forma a produzir uma faixa de intensidade de sinal que se encaixa dentro da faixa de detecção aceitável da leitura selecionada para detecção da ligação anticorpo/antígeno no método. Quantidades e diluições típicas para testes de amostras de soro humanas suspeitas de conter autoanticorpos marcadores anti-tumor são dadas nos exemplos anexos. Apenas a título de exemplo, diluições típicas da amostra de teste podem variar na faixa de 1/30 a 1/10.000 (ou de 1:50 a 1:1600). As quantidades testadas de antígeno podem variar tipicamente na faixa de 0,01 μg/ml a 10 μg/ml, (ou de 0,16 nM a 160 nM) embora isto não deva ser limitante.

Como indicado previamente, também é possível construir curvas de titulação para duas ou mais diluições da amostra de teste partindo de um estoque simples de antígeno, ainda que a concentração absoluta de antígeno no estoque seja desconhecida. Desde que se use uma mesma solução de consumo simples, e diluída serialmente da mesma maneira, é possível comparar os resultados de ensaios de titulação separados para este antígeno e realizados em diferentes amostras de teste de partida.

Em uma concretização adicional do ensaio diferentes quantidades do antígeno (determinantes antigênicos ou epítopos) podem ser imobilizadas em locais ou sítios de reação diferentes sobre um suporte sólido. Todo o suporte, ou uma área distinta do mesmo compreendendo uma subfração dos sítios de reação, pode então ser colocado em contato com uma diluição da amostra de teste, e a ligação do anticorpo ao antígeno detectado ou medido separadamente em cada um dos diferentes locais ou sítios de reação. Suportes sólidos vantajosos também incluem microconjuntos, por exemplo, conjuntos em que pontos ou sítios distintos no conjunto compreendem diferentes quantidades do antígeno. Microconjuntos podem ser preparados imobilizando-se diferentes quantidades de um antígeno particular em sítios de reação separáveis, distintos, no conjunto. Em outras concretizações a quantidade efetiva de moléculas de antígeno imobilizadas pode ser mantida substancialmente constante, mas o tamanho dos sítios ou pontos no conjunto variaram em termos de ordem de forma a alterar a quantidade de epítopo de ligação disponível, proporcionando uma série de titulação de sítios ou pontos com diferentes quantidades de epítopo de ligação disponível. Em referidas concretizações a concentração superficial bidimensional do(s) epítopo(s) de ligação no antígeno é importante para a preparação de séries de titulação, ao invés da quantidade absoluta de antígeno. Técnicas para a preparação e investigação de microconjuntos de proteínas/peptídeos são de conhecimento geral na técnica.

A partir da discussão acima deve-se compreender que em todas as concretizações da invenção é possível obter variação da quantidade de antígeno via alteração da densidade de epítopos ou antígenos contra os quais as diluições de amostra de teste são testadas, ou via manutenção da densidade de antígenos ou epítopos, mas aumentando a área de superfície sobre a qual o antígeno é imobilizado, ou ambos.

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E possível usar microconjuntos para realizar múltiplos ensaios para anticorpos de diferentes especificidades em paralelo. Isto pode ser realizado usando-se conjuntos compreendendo múltiplos conjuntos de diferentes antígenos, sendo que cada conjunto compreende um antígeno particular em múltiplas e diferentes quantidades ou concentrações. O termo "diferentes antígenos" compreende antígenos derivados de diferentes proteínas ou polipeptídios (como antígenos derivados de proteínas não relacionadas codificadas por genes diferentes) e também antígenos que são derivados de diferentes epítopos peptídicos de uma única proteína ou polipeptídio. Um dado microconjunto pode incluem exclusivamente conjuntos de diferentes antígenos derivados de diferentes proteínas ou polipeptídios, ou exclusivamente conjuntos de diferentes antígenos derivados de diferentes epítopos peptídicos de uma única proteína ou polipeptídio, ou uma mistura dos dois em qualquer proporção. Deveria-se observar que em todas as concretizações da invenção é preferível que cada série de diluições de antígenos individuais compreenda diferentes quantidades ou concentrações de apenas um tipo de antígeno, e não misturas de antígenos.

Como usado aqui o termo "fluido corporal", quando se refere ao material a ser testado quanto à presença de anticorpos usando-se o método da invenção, inclui, entre outros, plasma, soro, sangue integral, urina, suor, linfa, fezes, fluido cerebroespinhal, ascites, efiisão pleural, fluido seminal, esputo, aspirado de bicos dos seios, seroma pós-operatório ou fluido de drenagem de feridas. Como previamente indicado, os métodos da invenção são realiados, de preferência, in vitro em diluições de uma amostra de teste compreendendo fluido corporal removido do indivíduo de teste. O tipo de fluido corporal usado pode variar dependendo da identidade do anticorpo a ser testado e da situação clínica em que o ensaio é usado. De uma forma geral, prefere-se realizar os ensaios em amostras de soro ou plasmática. A amostra de teste pode incluir componentes adicionais além do fluido corporal, como por exemplo, diluentes, conservantes, agentes estabilizadores, tamponantes etc. Diluições da amostra de teste podem ser preparadas usando qualquer diluente vantajoso. O leitor versado na técnica perceberá que a razão para a preparação das diluições da amostra de teste é meramente produzir uma série de amostras de teste, sendo que cada uma contém quantidades diferentes do anticorpo-alvo a ser detectado no ensaio imunológico. Não se pretende excluir outros meios de obter "amostras de teste" contendo quantidades variáveis do anticorpo-alvo. A título de exemplo, uma amostra de teste removida de um paciente poderia, efetivamente, ser "concentrada" em lugar de diluída, por exemplo, usando-se diálise, de forma a se obter uma amostra de teste contendo uma concentração maior do anticorpo do que ocorre naturalmente. Em outras concretizações, como quando o fluido corporal removido do paciente é relativamente diluído com relação ao anticorpo-alvo, o fluido corporal poderia ser primeiramente concentrado (p. ex., por meio de diálise ou técnicas similares) para preparar um estoque concentrado que, então, é usado para preparar uma série de diluições para uso em um ensaio de acordo com a invenção.

O termo "antígeno" é usado aqui em um sentido amplo para referir a qualquer substância que apresenta reatividade imunológica específica com um anticorpo-alvo a ser detectado. Antígenos vantajosos podem incluir, embora sem limitação, proteínas naturalmente ocorrentes, polipeptídeos ou proteínas recombinantes ou sintéticas, peptídeos sintéticos, miméticos de peptídeos, etc, também polissacarídeos e ácidos nucleicos. Especificamente, onde se usa aqui a expressão "antígeno" ela deve compreender qualquer agente de captura, seja de origem humana, origem mamífera ou outra, capaz de interação imunológica específica com as regiões variável ou determinadora de complementaridade do anticorpo a ser detectado. Por exemplo, anticorpos anti-idiotípicos podem ser considerados como um antígeno para este fim, como muitos antígenos gerados por apresentação de fago.

Determinados antígenos podem compreender ou podem ser derivados de proteínas ou polipeptídios isolados de fontes naturais, incluindo, embora sem limitação, proteínas ou polipeptídios isoladas de tecidos ou fluidos corporais do paciente. Nessas concretizações o antígeno pode compreender substancialmente toda a proteína naturalmente ocorrente, i.e. proteína que se encontra substancialmente na forma em que é isolada da fonte natural, ou ela pode compreender um fragmento da proteína naturalmente ocorrente. Para ser efetivo como um antígeno no método da invenção, qualquer "fragmento" do tipo referido precisa conservar a reatividade imunológica com os anticorpos contra os quais ele será testado. Fragmentos vantajosos poderiam ser preparados, por exemplo, por meio de clivagem química ou enzimática da proteína isolada.

Dependendo da natureza precisa do ensaio em que ele será usado, o antígeno pode compreender uma biomolécula naturalmente ocorrente (p. ex., uma proteína, ou fragmento da mesma), ligada a uma ou mais outras moléculas que conferem algumas características desejáveis não presentes naturalmente na biomolécula. Por exemplo, a biomolécula (p. ex., fragmento de proteína ou polipeptídio) pode ser conjugada com um marcador revelador, como por exemplo, um marcador fluorescente, marcador colorido, marcador luminescente, rádio-marcador ou metal pesado, como ouro coloidal. Em outras concretizações, uma proteína ou fragmento pode ser expresso como uma proteína de fusão. A título de exemplo, proteínas de fusão podem incluir um peptídeo marcador na ponta N ou C para contribuir na purificação do antígeno expresso recombinantemente.

Dependendo do formato do ensaio em que ele será usado, o antígeno pode ser imobilizado sobre um suporte sólido, como por exemplo, os poços de uma placa de microtitulação, chips ou pérolas magnéticas ou pérolas de microconjunto. A imobilização pode ser efetuada via adsorção não- covalente ou ligação covalente. É possível usar qualquer meio de fixação vantajoso desde que ele não afete adversamente a capacidade do antígeno em reagir imunologicamente com o anticorpo-alvo de forma significativa.

A invenção não é limitada a ensaios de fase sólida, mas também compreende ensaios que, integralmente ou em parte, são realizados em fase líquida, por exemplo, ensaios com pérolas em fase solução.

Em uma concretização, antígenos podem ser marcados com um ligante que poderia facilitar a imobilização, como biotina. O antígeno pode então ser diluído a uma faixa de titulação vantajosa e, então, deixado reagir com autoanticorpos em amostras do paciente em solução. Os complexos imunes resultantes podem ser imobilizados então em um suporte sólido via uma interação ligante-receptor (p. ex., biotina-estreptavidina) e o restante do ensaio é realizado como descrito abaixo.

Para facilitar a produção de antígenos de polipeptídeo biotinilado para uso nos métodos de ensaio da invenção, cDNAs que codificam um antígeno de polipeptídeo de comprimento pleno, uma versão truncada do mesmo ou um fragmento antigênico do mesmo, podem ser expressos como uma proteína de fusão marcada com um marcador de proteína ou polipeptídio a que o co-fator de biotina pode ser ligado via uma reação enzimática. Vetores para a produção de antígenos biotinilados recombinantes podem ser obtidos comercialmente de diversas fontes.

Uma vantagem adicional do uso da abordagem de titulação cruzada com antígenos biotinilados é que o ensaio é capaz de distinguir entre ligação do componente de biotina a anticorpos anti-biotina, e ligação verdadeira do antígeno a seu anticorpo cognato. Os inventores observaram que um número significativo da população humana produz naturalmente anticorpos anti-biotina que poderia levar à produção de resultados positivos falsos em ensaios baseados no uso de antígenos biotinilado.

Como previamente indicado, o "ensaio imunológico" usado para detectar anticorpos de acordo com a invenção pode basear-se em técnicas convencionais conhecidas na técnica, com exceção de que se usa múltiplas quantidades de antígeno para criar uma série de titulações que podem ser reagidas com múltiplas diluições diferentes da amostra de teste selecionada. Em uma concretização mais preferida, o ensaio imunológico pode ser um ELISA. ELISAs são geralmente bem conhecidos na técnica. Em um ELISA "indireto" típico, um antígeno apresentando especificidade para os anticorpos em teste é imobilizado sobre uma superfície sólida (p. ex., os poços de uma placa de ensaio de microtitulação convencional, ou a superfície de uma microesfera ou um microconjunto) e uma amostra compreendendo fluido corporal a ser testado quanto à presença de anticorpos é colocada em contato com o antígeno imobilizado. Quaisquer anticorpos com a especificidade desejada presente na amostra ligar-se-ão ao antígeno imobilizado. Os complexos antígeno/anticorpo ligados podem então ser detectados usando-se qualquer método vantajoso. Em uma concretização preferida, um anticorpo de imunoglobulina anti-humano secundário marcado, que reconhece especificamente um epítopo comum a uma ou mais classes de imunoglobulinas humanas, é usado para detectar os complexos anticorpo/antígeno. Tipicamente, o anticorpo secundário será anti-IgG ou anti-IgM. O anticorpo secundário é marcado usualmente com um marcador detectável, tipicamente um marcador de enzima, como por exemplo, peroxidase ou fosfatase alcalina, permitindo a detecção quantitativa por meio da adição de um substrato para a enzima que gera um produto detectável, por

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exemplo, um produto colorido, fluorescente ou quimioluminescente. E possível usar outros tipos de marcadores detectáveis conhecidos na técnica.

A invenção refere-se a um método para detectar anticorpos que são marcadores biológicos de um estado de doença ou suscetibilidade a doença. Este aspecto particular da invenção exclui, de preferência, ensaios projetados para testar quanto a anticorpos produzidos como um resultado de uma exposição a vacina ou protocolo de imunização, diferentemente da vacinação com marcadores de câncer. Portanto, de preferência, ensaios de acordo com este aspecto da invenção não incluem ensaios projetados para testar quanto à presença de anticorpos anti-virais ou anti-bacterianos após vacinação/imunização.

Em determinadas concretizações da invenção o anticorpo pode ser um autoanticorpo. Como indicado acima, o termo "autoanticorpo" refere- se a um anticorpo naturalmente ocorrente dirigido a um antígeno que, no sistema imunológico de um indivíduo, é reconhecido como estranho ainda que o antígeno tenha sido efetivamente originado no indivíduo. Autoanticorpos incluem anticorpos dirigidos contra formas alteradas de proteínas naturalmente ocorrentes produzidas por uma célula adoecida ou durante um processo de doença. A forma alterada da proteína origina-se no indivíduo, mas pode ser reconhecida pelo sistema imunológico do indivíduo como "não-própria" e, assim, elicitar uma resposta imune naquele indivíduo em forma de autoanticorpos imunologicamente específicos para a proteína alterada. Referidas formas alteradas de uma proteína podem incluir, por exemplo, mutantes apresentando seqüência de aminoácidos alterada, opcionalmente acompanhada por alterações na estrutura secundária, terciária ou quaternária, formas truncadas, variantes de recomposição, glicoformas alteradas etc. Em outras concretizações, o autoanticorpo pode ser dirigido a uma proteína que é superexpressa em um estado de doença, por exemplo, como um resultado da amplificação de gene ou regulação transcricional anormal. A superexpressão de uma proteína que não é encontrada normalmente por células do sistema imunológico em quantidades significativas pode disparar uma resposta imune que leva à produção de autoanticorpos. Em outras concretizações adicionais, o autoanticorpo pode ser dirigido a uma forma fetal de uma proteína que se torna expressada em um estado de doença. Se uma proteína fetal, que é expressa normalmente apenas em estágios precoces do desenvolvimento antes que o sistema imunológico se torne funcional, é expressada em um estado de doença, a forma fetal pode ser reconhecida pelo sistema imunológico como "estranha", disparando uma resposta imune que leva à produção de autoanticorpo. Em uma concretização, o anticorpo pode ser um autoanticorpo

específico para uma proteína marcadora de tumor, e, mais particularmente, um autoanticorpo anti-tumor "associado com câncer".

O termo autoanticorpo anti-tumor "associado com câncer" refere-se a um autoanticorpo que é dirigido contra um epítopo presente em formas de proteínas marcadoras de tumor que são expressas, de preferência, no estado de doença de câncer. A presença de referidos autoanticorpos é característica do estado de doença de câncer, ou de pré-disposição a câncer em pacientes assintomáticos.

Em aplicações preferidas, o método da invenção será usado para detectar a presença de autoanticorpos anti-tumor associados com câncer em amostras de teste derivadas de indivíduos humanos ou pacientes (embora o método possa ser usado em amostras de teste derivadas de outros mamíferos não-humanos), e apresentarão, mais preferivelmente, a forma de um ensaio imunológico in vitro, realizado em duas ou mais diluições de uma amostra de teste compreendendo uma amostra de fluido corporal colhida do indivíduo/paciente. A amostra de fluido corporal pode ser diluída em qualquer tamponador vantajoso e pode ser tratada para armazenamento de longo prazo ou, de outra forma, antes dos testes.

Ensaios imunológicos in vitro são não-invasivos e podem ser repetidos tão freqüentemente quanto se considerar necessário para formar um perfil de produção de autoanticorpos em um paciente, seja antes do início da doença, como na seleção de indivíduos "em risco", ou durante o curso da doença (discutido adicionalmente abaixo com relação a aplicações preferidas do método).

Em concretizações particulares, mas não limitantes, os métodos da invenção podem compreender ensaios imunológicos para detectar (simultaneamente) dois ou mais tipos de autoanticorpos, cada um apresentando especificidade para diferentes epítopos na mesma proteína marcador de tumor ou outras relacionadas (p. ex., variantes ou isoformas diferentes codificadas por um único gene) ou para epítopos em diferentes proteínas marcadoras de tumor (significando proteínas codificadas por genes diferentes). Estes métodos envolverão tipicamente o uso de um grupo de dois ou mais conjuntos de antígenos, sendo que cada conjunto de antígenos é derivado usualmente de uma diferente proteína marcadora de tumor (neste contexto, "diferente" significa proteínas que são os produtos de genes diferentes), embora não observado acima um conjunto de antígenos também poderia envolver diferentes epítopos na mesma proteína marcadora de tumor. Um "conjunto" de antígenos refere-se a um antígeno simples a ser testado em diferentes quantidades/concentrações no método da invenção. Estes métodos, que podem ser referidos a seguir como "ensaios de grupo", usam um grupo de dois ou mais conjuntos de antigenos para monitorar a resposta imune global de um indivíduo a um tumor ou outra alteração carcinogênica/neoplásica. Assim, estes métodos detectam um "perfil" da resposta imune em um dado indivíduo, indicando quais marcadores de tumor elicitam uma resposta imune resultando em produção de autoanticorpos. O uso de um grupo de dois ou mais antígenos para monitorar a produção de autoanticorpos contra dois ou mais marcadores de tumor diferentes é geralmente mais sensível do que a detecção de autoanticorpos para marcadores simples, e proporciona uma freqüência muito menor de resultados negativos falsos (ver WO 99/58978 e WO 2004/044590, cujos teores são incorporados aqui integralmente por referência).

Portanto, em uma concretização não-limitante, a invenção proporciona um método para detectar dois ou mais anticorpos em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, sendo que pelo menos um de referidos anticorpos é um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, sendo que referido método compreende:

(a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste:

(i) contactar a diluição da amostra de teste com dois ou mais conjuntos de antígenos, sendo que cada um de referidos conjuntos de antígenos é específico para um de referidos anticorpos a serem detectados na amostra de teste e sendo que cada conjunto de antígenos compreende uma pluralidade de diferentes quantidades do mesmo antígeno,

(ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno em cada conjunto de antígenos usado na etapa (i),

(b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste com cada conjunto de antígenos usado na etapa (a), sendo que a presença na amostra de teste de anticorpo reativa com qualquer um dos conjuntos de antígenos usados no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste com aquele conjunto de antígenos.

Em uma concretização deste método cada um de referidos dois ou mais anticorpos serão um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, no entanto encontra-se dentro do escopo da invenção o como combinar um ensaio de titulação cruzada para um antígeno marcador de doença com um ensaio de titulação cruzada para qualquer outro tipo de anticorpo, que pode ou não ser um marcador de doença, na mesma amostra de teste.

De qualquer forma, a avaliação de se os anticorpos relevantes estão ou não presentes na amostra de teste é com base na quantidade de ligação específica observada em cada uma das diferentes concentrações de antígenos com relação a cada diferente antígeno no teste, ou, em outras palavras, os valores coletivos para cada antígeno ao invés de uma leitura a uma concentração única para cada antígeno. Assim, a determinação da presença ou ausência de estado de doença ou suscetibilidade a doença com base na presença de dois ou mais tipos de anticorpo em uma amostra de paciente pode basear-se nestes valores coletivos para cada antígeno. De preferência, a avaliação é feita com base na demonstração de uma curva em forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes de amostra de teste com relação a qualquer um ou a todos os antígenos presentes no teste.

Para dirimir qualquer dúvida, ensaios baseados no uso de um único tipo de antígeno para detectar anticorpos podem ser referidos aqui como "ensaios de marcador simples", enquanto que ensaios baseados no uso de um grupo de dois ou mais antígenos são referidos como "ensaios de grupos".

Em uma concretização preferida do método de ensaio de grupos, pelo menos um e, de preferência, todos os anticorpos detectados no ensaio são autoanticorpos reativos com proteínas marcadoras de tumor. Ensaios de titulação cruzada de acordo com a invenção podem ser adaptados para uso na detecção de autoanticorpos a substancialmente qualquer proteína marcadora de tumor para a qual um antígeno vantajoso pode ser preparado, como um ensaio de marcador simples ou como um componente de um ensaio de grupos. Em particular, o método pode ser adaptado para detectar/medir autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer um ou qualquer combinação de dois ou mais das proteínas marcadoras de tumor a seguir, por meio do uso dos antígenos correspondentes:

"Epidermal growth factor receptor protein EGFR" [Proteína de

receptor do fator de crescimento epidérmico EGFR] (Downward et al (1984) Nature. 307:521-527; Robertson et al.(2001) Archives of Pathology and LaboratoryMedicine 126; 177-81);

MUCl (Batra, S. K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology. 12:271-

283);

Myc (c-myc) (Blackwood, Ε. M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell. 5:597-609);

p53 (Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J. 3:3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1887-1893);

ras (ou Ras) (Capella, G. et al. (1991) Environ Health

Perspectives. 93:125-131);

BRCAl (Scully, R. et al. (1997) PNAS 94:5605-10);

BRCA2 (Sharan, S. K. et al. (1997) Nature. 386:804-810);

APC (Su, L. K. et al. (1993) Câncer Res. 53:2728-2731;

Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92:3046-50);

CA125 (Nouwen, E. J. et al. (1990) Differentiation. 45:192-8; Norum LF, et al., Tumour Biol. julho-agosto de 2001; 22 (4):223-8; Perey L, et al., Br J Câncer, outubro de 1990; 62 (4):668-70; Devine PL, et al., Anticancer Res. maio-junho de 1992; 12 (3):709-17); PSA (Rosenberg, R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248:935-939);

Carcinoembryonic antigen CEA (Duffy, M.J. (2001) Clin Chem, Apr 47 (4):624-30); CA 19.9 (Haga, Y. et al (1989) Clin Bioehem (1989) Oet

22(5):363-8);

NY-ESO-I (cancer/testis antigen; Chen, Y. -T. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 94:1914-1918, 1997);

PSMA (prostate specific membrane antigen; Israeli, R. S. et al., Câncer Res. 53:227-230, 1993);

PSCA (prostate stem cell antigen); Reiter, R. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 95:1735-1740, 1998);

EpCam (epithelial cellular adhesion molecule); Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 87:3542-3546, 1990); HER2-neu (também conhecido como c-erbB2) (Coussens, L.

et al., Science 230:1132-1139, 1985);

EDC6, que é um nome alternativo para o domínio extracelular

de HER2.

CAGE (Jager D, et al., Câncer Res. 15 de dezembro de 1999; 59 (24):6197-204; Mashino K, et al., Br J Câncer. 01 de setembro de 2001; 85 (5):713-20);

Cytokeratins (Moll R, et al., Cell. novembro de 1982; 31 (1):11-24; Braun S, et al., N Engl J Med. 2000; 342:525-533). O termo "citoqueratina" é usado genericamente para referir-se a qualquer membro da família de citoqueratinas para a qual os autoanticorpos correspondentes funcionam como marcadores de tumor. Exemplos preferidos são citoqueratinas 5/14, 8/18 (Kim MJ, Ro JY, Ahn SH, Kim HH, Kim SB, Gong G Hum Pathol. setembro de 2006; 37 (9):1217-26. Epub 18 de julho de 2006); citoqueratinas 7, 20 (Vang R, Gown AM, Barry TS, Wheeler DT, Yemelyanova Α, Seidman JD, Ronnett BM. Am J Surg Pathol. setembro de 2006; 30 (9):1130-1139); e citoqueratinas 8/18/19 (Barak V, Goike H, Panaretakis KW, Einarsson R. Clin Biochem. julho de 2004; 37 (7):529-40) .

Recoverina (Maeda A, et al., Câncer Res. 1 de abril de 2000;60(7): 1914-20);

Kallikreins [Calicreínas] (Kim H, et al., Br J Câncer 2001; 84:643-650; Yousef GM, et al., Tumor Biol 2002; 23:185-192). O termo "calicreína" é usado genericamente para referir a qualquer membro da família de calicreínas para a qual os autoanticorpos correspondentes funcionam como marcadores de tumor. Exemplos preferidos são calicreínas de 1 a 15 (KLK 1- 15/Hkl-Hkl5) (Obiezu CV, Diamandis EP. Câncer Lett. 16 de junho de 2005; 224(1):1-22; Diamandis EP, Yousef GM. Clin Chem. agosto de 2002;48 (8):1198-205), e, em particular, KLK 4-7 (Prezas P, Arlt MJ, Viktorov P, Soosaipillai A, Holzscheiter L, Schmitt M, Talieri M, Diamandis EP, Kruger A, Magdolen V. Biol Chem. junho de 2006;387 (6): 807-11; Diamandis EP, Yousef GM, Luo LY, Magklara A, Obiezu CV. "The new human kallikrein gene family:implications in carcinogenesis". Trends Endocrinol Metab. marco de 2000; 11 (2):54-60. Review.);

Anexinas (Hudelist G, et al., Breast Câncer Res Treat. agosto de 2004;86 (3):281-91; Gerke, V. & Moss, S. E. Physiological Reviews 2002 82:331-371). O termo "anexina" é usado genericamente para referir a qualquer membro da família de anexinas para o qual os autoanticorpos correspondentes funcionam como marcadores de tumor. Exemplos preferidos são as anexinas 1 e 2 (Pedrero, J.M. G., Fernandez, M. P., Morgan, O., Zapatero, A. H., Gonzalez, Μ. V., Nieto, CS. & Rodrigo, J. P. American Journal of Pathology 2004 164(1):73-79; Brichory, F. M., Misek, D. E., Yim, A., Krause, M. C, Giordano, T.J., Beer, D. G., Hanash, S. M. 2001 Medicai Sciences 98(17):9824-9829) e anexina XI-A (Fernandez-Madrid, F., Tang, N., Alansari, H., Granda, J. L., Tait, L., Amirikia, K. C, Moroianu, M., Wang, X. & Karvonen, R. L. Câncer Research 2004 64:5089-5096);

α-fetoproteína (AFP) (Stiller D, et ai, Acta Histochem Suppl- 1986;33:225-31);

GRP78 (Block TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 18 de janeiro de 2005; 102 (3):779-84; Hsu WM, et al., Int J Câncer. 1 de março de 2005;113(6):920-7);

Mamaglobina (Zehentner BK, et al., Clin Chem. novembro de 2004;50 (11):2069-76; Zehentner BK, Carter D. Clin Biochem. abril de 2004;37 (4):249-57);

raf (Callans LS. et al., Ann Surg Oncol. janeiro de

1995;2( 1):38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. dezembro de 1998; 189(1-2):119-25);

"beta-human chorionic gonadotropin b-HCG" (Ayala AR, et al., Am J Reprod Immunol. abril-maio de 1983; 3 (3):149-51; Gregory JJ Jr, et al., Drugs abril de 1999; 57 (4):463-7);

antígeno 4-5 (Krause P, et al., J Immunol Methods. dezembro de 2003;283(l-2):261-7);

NY-BR-I (Jage D, Stockert E, Gure AO, Scenlan MJ, Karbach J, Jage E, Knuth A, Old LJ, Chen YT. (2001) "Identification of a tissue- specific putative transcription factor in breast tissue by serological screening of a breast câncer library". Câncer Res 61 (5):2055-61);

Livina (Kasof GM, Gomes BC (2001) "Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family". J Biol Chem, 276 (5):3238-46);

Survivina (Ambrosini G, Adida C, Altieri DC (1997) "A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in câncer and lymphoma". Nature Med, 3 (8):917-21);

MUC2 (glicoproteína)

Griffiths B, Matthews DJ, West L, Attwood J, Povey S, Swallow DM, Gum JR Kim YS (1990) "Assignment of the polymorphic intestinal mucin gene MUC2 to chromosome-1 Ip 15". Ann Hum Genet, 54:277-85.

Endostatina (Standker L, Schrader M, Kanse SM, Jurgens M, Forssmann WG, Preissner KT (1997) "Isolation and characterisation of the circulating form of human endostatin" . FEBS Lett, 420 (2-3): 129-33;

Bcl-2 (Tsujimoto Y, Croce CM (1986) "Analysis of the structure, transcripts, and protein products of Bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma". PNAS USA, 83 (14):5214-8); 5

BIRC7 (Wu Hy, Ma Yh, Zhu Yk, Shen Y, Gu CM, Ye ZY, Lin HL (2006) "The expression of BIRC7 protein and mRNA in non- Hodgkin's lymphoma" . Leukemia & Lymphoma 47 (6):1110-6);

Proteínas de choque de calor (o termo "proteínas de choque de calor" é usado genericamente para referir a quaisquer proteínas de choque de calor para as quais os autoanticorpos correspondentes funcionam como marcadores de tumor) incluindo, mas não exclusivamente: HSP70 (Tauchi K, Tsutsumi Y, Hori S, Yoshimura. S, Osamura Ry, Watanabe K (1991) "Expression of heat shock protein-70 and c-myc protein in human breast- cancer-an immunohistochemical study". Jap J Clin Oncol, 21 (4):256-63); HSP27 ("Differential expression of alphaB-crystallin and Hsp27-1 in anaplastic thyroid carcinomas because of tumor-specific alphaB-crystallin gene (CRYAB) silencing". Mineva I, Gartner W, Hauser P, Kainz A, Loffler M, Wolf G, Oberbauer R, Weissel M, Wagner L. Cell Stress Chaperones. outono de 2005; 10 (3):171-84); e CRYAB (Seitz S, Korsching E, Weimer J, Jacobsen A, Arnold N, Meindl A, Arnold W, Gustavus D, Klebig C, Petersen I, Scherneck S. Genes Chromosomes Câncer. 2006 Jun; 45 (6):612-27).

No55 (Fossa A, Siebert R, Aasheim HC, Maelandsmo GM, Berner A, Fossa SD, Smeland EB Gaudernack G (2000) "Identification of a nucleolar protein No55 as a tumour-associated auto-antigen in patients with prostate câncer". Br J Câncer 83 (6):743-9). Urokinas-type Plasminogen Activator (uPA) (Booyse FM, Osikowicz G, Feder S, Scheinbuks J (1984) "Isolation and characterisation of a urokinase-type plasminogen activator (MR = 54.000) from cultures human epithelial cells indistinguishable from urinary urokinase". J Biol Chem 259 (11):7198-205);

Tetraneetina (proteína de ligação de plasminogênio) (Clemmensen I, Petersen LC, Kluft C (1986) "Purifieation and characterization of a novel, Oligomeric, Plasminogen Kringle 4 binding- protein from human plasma -Tetranectin". Eur J Bioehem 156 (2):237-333);

Prolaetina (Riddle O, bates RW, Dykshorn SW (1933) "The preparation, identification and assay of prolactin - A hormone of the anterior pituitary" . Am J Physiol 105 (1):191-216);

Osteopontina (Butler WT, Martin TJ, Raisz LG, Slavkin HC, Termine JD, Rodan GA, Veis A (1988) "Osteopontin - Strueture and biological activity". CBA Foundation Symposia 136:203-206; Kiefer MC, Bauer DM, Barr PJ (1989) "The CDNA and derived amino-acid sequence for human Osteopontin". Nueleie Acids Res 17 (8):3306-3306);

Proteína específica para epidídimio humano (HE4) Kirchoff C, Habben I, Ivell R, Krull N (1991) "A major human epididymis-specific eDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase- inhibitors". Biology of Reproduction 45 (2):350-357);

Inibidor de tripsina associado com tumor [Tumour Asscociated Trypsin Inhibitor] (TATI) (Huhtala ML, Kahanpaa K, Seppala M, Halila H, Stenman UH (1983) "Excretion of a tumour associated trypsin-inhibitor (TATI) in urine of patients with Gynecological Malignancy" . Int J Câncer 31 (6):711-714, 1983;

Inhibin (Chari S, Hopkinson CRN, Fritze E, Sturm G, Hirschhauser C. (1977) "Partial-Purification of Inhibin from Human Testicular Extracts". ACTA Endocrinologia 85 (Supl. 212):215-219); Vimentina (Yang YC, Li X, Chen W. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), setembro de 2006; 38 (9):602-10);

Cox-I e Cox-2 (Xu Z, Choudhary S, Voznesensky O, Mehrotra M, Woodard M, Hansen M, Hersehman H, Pilbeam C. Câncer Res. 1 de julho de 2006;66 (13):6657-64; Cervello M, Montalto G. World J Gastroenterol. 28 de agosto de 2006; 12 (28):5113-5121).

Deve-se considerar que a invenção não deve limitar-se à detecção de autoanticorpos para os marcadores de tumor específicos listados acima apenas a título de exemplo.

Métodos de ensaio de acordo com a invenção baseados na detecção de autoanticorpos de marcador anti-tumor (em forma de ensaio de grupos ou marcador simples) podem ser usados numa variedade de situações clínicas diferentes. Em particular, o método pode ser usado na detecção ou diagnóstico de câncer em indivíduos humanos sintomáticos ou assintomáticos, na avaliação do prognóstico de um paciente diagnosticado com câncer, na predição de resposta a terapia, no monitoramento do progresso de câncer ou de outra doença neoplásica em um paciente, na detecção de alteração neoplásica precoce ou carcinogênica precoce em um indivíduo humano assintomático, na seleção de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para, ou identificar aqueles indivíduos que se encontram em risco maior de desenvolver câncer, ou diagnosticar a presença de câncer, na predição da resposta de um paciente de câncer ao tratamento anticâncer (p. ex., vacinação, terapias anti-fator de crescimento ou de transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia humana com anticorpos, quimioterapia), no monitoramento da resposta de um paciente de câncer ao tratamento anticâncer (p. ex., vacinação, terapias anti-fator de crescimento ou de transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioterapia), na detecção de doença recorrente em um paciente previamente diagnosticado como apresentando câncer e que foi submetido a tratamento anticâncer para reduzir a quantidade de câncer presente, ou na seleção de uma terapia anticâncer (p. ex., vacina, terapias anti-fator de crescimento ou transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, tratamento com anticorpos humanos, quimioterapia), para uso em um paciente particular.

Os inventores observaram de uma forma geral que níveis de autoanticorpos associados com câncer apresentam uma correlação positiva com estado de doença (ver também WO 99/58979, cujo teor é incorporado aqui por referência). Assim, quando o método da invenção é usado em aplicações clínicas, níveis incrementados de autoanticorpos de marcadores anti-tumor, em comparação com controles vantajosos, são considerados de uma forma geral como indicação do estado de doença de câncer, exceto se indicado aqui de outra forma.

Quando os ensaios imunológicos são usados no diagnóstico de câncer em um indivíduo humano (quer sintomático ou assintomático para câncer), a presença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle "normais", é considerada usualmente como uma indicação de que o indivíduo tem câncer. Os indivíduos de controle "normais" serão, de preferência, controles de idades equiparadas não apresentando qualquer diagnóstico de câncer baseado em critérios clínicos, de diagnóstico por imagem e/ou bioquímicos. Uma aplicação particularmente útil do método é no teste de indivíduos humanos que já manifestam sintomas de câncer (p. ex., com base em critérios clínicos, de diagnóstico por imagem e/ou bioquímicos) para auxiliar na preparação ou na confirmação de um diagnóstico de câncer.

Quando os ensaios imunológicos são usados na predição da resposta de um paciente de câncer ao tratamento anticâncer (p. ex., vacinação, terapias anti-fator de crescimento ou de transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioterapia), a presença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle "normais", pode ser considerada uma indicação de se o indivíduo apresenta ou não probabilidade de responder ao tratamento anticâncer. Os indivíduos de controle "normais" serão, de preferência, controles de idades equiparadas não apresentando qualquer diagnóstico de câncer com base em critérios clínicos, de diagnóstico por imagem e/ou bioquímicos. Para cada um dos tratamentos listados acima, uma relação entre o nível de autoanticorpos comparado com controles e sucesso provável do tratamento pode ser determinada por meio de observação do resultado de referido tratamento em pacientes cujo status de autoanticorpos é monitorado ao longo do tratamento. A relação previamente estabelecida pode então ser usada para predizer a probabilidade de sucesso para cada tratamento em um dado paciente, com base na avaliação do status de autoanticorpos.

Quando os ensaios imunológicos são usados no monitoramento do progresso de câncer ou outra doença neoplásica em um paciente, a presença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com um "controle normal", é considerada como uma indicação da presença de câncer no paciente. O "controle normal" pode consistir de níveis de autoanticorpos presentes em indivíduos de controle, de preferência, de idades equiparadas, não apresentando qualquer diagnóstico de câncer baseado em critérios clínicos, de diagnóstico por imagem e/ou bioquímicos. Alternativamente, o "controle normal" pode ser um nível de "linha de base" determinado para o paciente particular em teste. O nível de "linha de base" pode ser, por exemplo, o nível de autoanticorpos presentes quando se realizou um primeiro diagnóstico de câncer ou um diagnóstico de câncer recorrente. Qualquer aumento acima do nível de linha de base poderia ser considerado como uma indicação de que a quantidade de câncer presente no paciente aumentou, enquanto que qualquer diminuição abaixo da linha de base poderia ser considerada como uma indicação de que a quantidade de câncer presente no paciente diminuiu. O valor de "linha de base" também pode ser, por exemplo, o nível antes de se iniciar um novo tratamento. Uma alteração no nível de autoanticorpos poderia ser considerada como uma indicação da eficácia da terapia. O sentido da "alteração" (i.e. aumento versus diminuição) indicando uma resposta positiva ao tratamento será dependente da natureza precisa do tratamento. Para qualquer tratamento dado, o sentido da "alteração" nos níveis de autoanticorpos indicando um resultado positivo pode ser facilmente determinado, por exemplo, por meio de monitoração dos níveis de autoanticorpos em comparação com outros indicadores clínicos ou bioquímicos de resposta ao tratamento.

Quando os ensaios imunológicos são usados na seleção de uma população de indivíduos humanos assintomáticos, isto pode ser para identificar aqueles indivíduos que se encontram em risco maior de desenvolver câncer, indivíduos apresentando um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle "normais", são identificados como estando "em risco" de desenvolver câncer. Os indivíduos de controle "normais" serão, de preferência, controles de idades equivalentes não identificados como apresentando qualquer predisposição de desenvolver câncer ou qualquer risco significativamente elevado de desenvolver câncer. Uma exceção para isto pode ser onde a própria idade é um fator de risco importante.

Quando os ensaios imunológicos são usados na seleção de uma população de indivíduos humanos assintomáticos, isto pode ser para diagnosticar câncer naqueles indivíduos que já desenvolveram um câncer, sendo que indivíduos apresentando um nível elevado de autoanticorpos em comparação com indivíduos de controle "normais" são classificados como apresentando câncer ou alguma forma de alteração neoplásica. Os indivíduos de controle "normais" serão, de preferência, controles de idades equiparadas não identificados como apresentando qualquer predisposição de desenvolver câncer ou qualquer risco significativamente elevado de desenvolver câncer. Uma exceção para isto pode ser onde a própria idade é um fator de risco importante. Alternativamente, o "controle normal" pode ser um nível de "linha de base" determinado para o paciente particular em teste. O nível de "linha de base" pode ser, por exemplo, o nível de autoanticorpos presentes quando o paciente foi testado inicialmente e diagnosticado como apresentando níveis não elevados acima de uma população de "controle normal". Qualquer aumento subsequente contra esta medição de linha de base poderia ser considerada como uma indicação da presença de câncer naquele indivíduo. Assim, o indivíduo poderia tornar-se, por meio de um teste de linha de base do tipo referido, seu próprio controle para medição futura de autoanticorpos.

Quando os ensaios imunológicos são usados no monitoramento da resposta de um paciente de câncer ao tratamento anticâncer (p. ex., vacinação, terapias anti-fator de crescimento ou de transdução de sinal, radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioterapia), a presença de um nível alterado de autoanticorpos após tratamento é considerado como uma indicação de que o paciente respondeu positivamente ao tratamento. Um nível de linha de base de autoanticorpos considerado antes do início do tratamento pode ser usado para fins de comparação para se determinar se o tratamento resulta em um aumento ou numa diminuição dos níveis de anticorpos. Uma alteração do nível de autoanticorpos poderia ser considerada como uma indicação da eficácia da terapia. A direção da "alteração" (i.e. aumento versus diminuição) indicando uma resposta positiva ao tratamento dependerá da natureza precisa do tratamento. Para qualquer dado tratamento, o sentido da "alteração" dos níveis de autoanticorpos, indicando um resultado positivo, pode ser facilmente determinada, por exemplo, por meio de monitoramento dos níveis de autoanticorpos em comparação com outros indicadores clínicos ou bioquímicos de resposta ao tratamento.

O método da invenção pode ser usado na predição e/ou no monitoramento da resposta de um indivíduo a, substancialmente, qualquer tratamento anticâncer conhecido. Isto inclui, por exemplo, terapia com anticorpos humanos em que anticorpos monoclonais ou policlonais são infundidos no paciente, sendo que um exemplo específico não-limitante é tratamento com o anticorpo anti-fator de crescimento Herceptina™ (Baselga, J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14(3), 737-744, 1996). A presença de uma resposta natural de autoanticorpos pode incrementar ou inibir a eficácia do tratamento com anticorpos terapêuticos infundidos artificialmente. Usando o método da invenção é possível correlacionar resposta a qualquer tratamento anticâncer, incluindo terapia com anticorpos, com níveis naturais de autoanticorpos antes ou durante o curso do tratamento em qualquer paciente ou grupo de pacientes. Este conhecimento pode ser usado, por sua vez, para predizer como outros pacientes (ou o mesmo paciente, no caso de tratamento repetido) dependerá do mesmo tratamento.

Quando os ensaios imunológicos são usados na detecção de doença recorrente, a presença de um nível incrementado de autoanticorpos no paciente, em comparação com um "controle normal", é considerada como uma indicação de que a doença recidivou. O "controle normal" pode compreender níveis de autoanticorpos presentes em indivíduos de controle, de preferência, de idades pareadas e não apresentando qualquer diagnóstico de câncer com base em critérios clínicos, de diagnóstico por imagem e/ou bioquímicos. Alternativamente, o "controle normal" pode ser um nível de "linha de base" determinado para o paciente particular em teste. O nível de "linha de base" pode ser, por exemplo, o nível de autoanticorpos presentes durante um período de remissão da doença com base em critérios clínicos, de diagnóstico por imagem e/ou bioquímicos.

O método de ensaio da invenção pode ser aplicado na detecção de muitos tipos diferentes de câncer, cujos exemplos compreendem câncer de mama, bexiga, colorretal, próstata, pulmão, pancreático e ovariano. Os ensaios podem complementar métodos existentes de seleção e vigilância. Por exemplo, no caso de câncer de mama primário, ensaios imunológicos para autoanticorpos poderiam ser usados para alertar médicos para biopsiarem pequenas lesões em mamogramas que, do ponto de vista radiográfico, não parecem suspeitas, ou para realizarem diagnóstico por imagem de mama, ou para repetirem diagnóstico por imagem mais cedo do que planejado. Na clínica, espera-se que os métodos de ensaio da invenção sejam mais objetivos e reproduzíveis em comparação com técnicas correntes de diagnóstico por imagem (i.e. mamografia e ultrassom), cujo sucesso pode ser dependente do operador.

"Ensaios de grupos" podem ser ajustados considerando a aplicação clínica particular. Um grupo de antígenos para detecção de autoanticorpos para pelo menos p53 e HER2-neu (c-erbB2) é particularmente útil para muitos tipos de câncer, e pode ser suplementado opcionalmente com outros marcadores apresentando uma associação conhecida com o câncer particular, ou um estágio do câncer particular, a ser detectado. Por exemplo, para câncer de mama o grupo poderia incluir adicionalmente MUC 1 e/ou c- myc e/ou BRCAl e/ou BRCAl e/ou PSA e/ou mamaglobina e/ou EpCam e/ou EGFR e/ou citoqueratinas e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou anexina IlA e/ou survivina, enquanto que no caso de câncer da bexiga o grupo poderia incluir opcionalmente MUC 1 e/ou c-myc, no caso de câncer colorretal ras e/ou APC e/ou MUC2, no caso de câncer da próstata PSA e/ou BRCA 1 e/ou BRCA2 e/ou p62, no caso de câncer ovariano BRCAl e/ou BRCA2 e/ou CA125 e/ou beta-HCG e/ou calicreínas e/ou APC e, no caso de câncer de câncer do pulmão livina e/ou survivina e/ou EpCam e/ou recoverina e/ou citoqueratinas e/ou 1-myc e ou CEA e/ou MUC 1 e/ou recoverina, no caso de câncer hepatocelular AFP e/ou beta HCG e/ou gp78 e/ou p62 e/ou survivina. Há outras concretizações preferidas em que p53 ou HER2-neu não são necessariamente essenciais.

No caso de câncer de mama, grupos vantajosos poderiam ser selecionados dentre os seguintes:

p53 e MUC 1 com HER2-neu e/ou c-myc opcionais, e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

p53 e c-myc com, opcionalmente, HER2-neu e/ou MUCl e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

p53 e BRCAl com, opcionalmente, c-erB2 e/ou MUC 1 e/ou c-myc e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

p53 e BRCA2 com, opcionalmente, HER2-neu e/ou MUC 1 e/ou c-myc e/ou BRCAl e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

HER2-neu e MUC 1 com, opcionalmente, p53 e/ou c-myc, e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

HER2-neu e c-myc with optional p53 e/ou MUCl e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

HER2-neu e BRCAl com, opcionalmente, p53 e/ou MUC 1 e/ou c-myc e/ou BRCA2 e/ou PSA e/ou NY-ESO-I e/ou NY-BR-I e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina HA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam;

HER2-neu e BRCA2 with optional p53 e/ou MUC 1 e/ou c- myc e/ou BRCA1 e/ou PSA e/ou NY-ESO-1 e/ou NY-BR-1 e/ou EpCam e/ou mamaglobina e/ou survivina e/ou anexina IlA e/ou citoqueratinas e/ou EpCam.

Referidos grupos também poderiam incluir p53 e/ou c-myc e/ou NY-ESO-I e/ou BRCA2.

No caso de câncer colorretal, grupos vantajosos poderiam ser

selecionados, por exemplo, dentre os seguintes:

p53 e ras com, opcionalmente, HER2-neu e/ou APC e/ou

MUC 2; MUC2; MUC2.

p53 e APC com, opcionalmente, HER2-neu e/ou Ras e/ou

Ras e APC com, opcionalmente, p53 e/ou HER2-neu e/ou

Referidos grupos também poderiam incluir CEA e/ou CAl9-9. No caso de câncer da próstata, grupos vantajosos poderiam ser selecionados, por exemplo, dentre os seguintes:

p53 e PSA com, opcionalmente, BRCAl e/ou BRCA2 e/ou HER2-neu e/ou p62;

HER2-neu e PSA com, opcionalmente, p53 e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou p62.

Referidos grupos também poderiam incluir PSMA e/ou PSCA

e/ou calicreínas.

No caso de câncer ovariano, grupos vantajosos poderiam ser selecionados, por exemplo, dentre os seguintes:

p53 e CA125 com, opcionalmente, HER2-neu e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou APC;

HER2-neu e CA125 com, opcionalmente, p53 e/ou BRCAl e/ou BRCA2 e/ou APC.

Referidos grupos também poderiam incluir anexinas e/ou CAGE e/ou 4-5.

No caso de câncer do pulmão, grupos vantajosos podem ser selecionados dentre:

p53 e NY-ESO-1, opcionalmente com marcadores adicionais;

HER2, anexinas, livina, survivina, recoverina, MUC 1, c-myc, 1 -myc, CEA, beta HCG, CAGE e 4-5.

Onde o método da invenção é usado para realizar um "ensaio de grupo" com base em dois ou mais antígenos marcadores de tumor derivados de diferentes proteínas, pelo menos um dos antígenos no grupo precisa ser testado em um ensaio de titulação cruzada de acordo com a invenção, com base em testes de duas ou mais diluições da amostra de teste contra múltiplas e diferentes quantidades do antígeno para formar uma série de curvas de titulação, uma para cada diluição de amostra de teste usada. De preferência, cada um dos antígenos que forma o grupo é testado de acordo com o ensaio de titulação cruzada da invenção e uma série de curvas de titulação plotadas/calculadas para cada antígeno individual no grupo.

A invenção também considera que é possível usar um ensaio de titulação cruzada para a detecção de pelo menos um anticorpo de marcador anti-tumor, em combinação com um ensaio projetado para detectar pelo menos uma proteína marcadora de tumor (que pode ser relacionada ou não- relacionada com o antígeno usado no ensaio de titulação cruzada) na mesma amostra do paciente. Assim, ensaios para autoanticorpos de marcador anti- tumor e ensaios para proteínas marcadoras de tumor podem ser realizados em paralelo numa única amostra do paciente.

Em uma concretização adicional, o método de ensaio imunológico da invenção pode ser usado na seleção de uma vacina anticâncer para uso em um paciente particular. Nesta concretização, uma amostra de fluido corporal colhida do paciente é testada usando-se um grupo de dois ou mais antígenos, cada um correspondendo a uma diferente proteína marcadora de tumor, para determinar a intensidade relativa da resposta imune do paciente para cada uma das diferentes proteínas marcadoras de tumor. A "intensidade da resposta imune" a uma dada proteína marcadora de tumor ou proteínas marcadoras de tumor é indicada pela presença e/ou pela quantidade de autoanticorpos associados com câncer específicos para aquela proteína marcadora de tumor detectada usando-se o ensaio imunológico; onde autoanticorpos são quantificados, quanto maior o nível de autoanticorpos associados com câncer, tanto mais forte é a resposta imune. A proteína marcadora de tumor ou proteínas marcadoras de tumor identificada(s) como elicitando a resposta imune mais forte, ou respostas fortes no paciente (i.e. o nível mais elevado de autoanticorpos) é ou são selecionados então para formar a base de uma vacina anticâncer para uso no paciente.

A utilidade do método da invenção não se limita à detecção de autoanticorpos anti-tumor, embora o ensaio seja particularmente útil para tal fim. Câncer é apenas um exemplo de uma doença em que a detecção de autoanticorpos pode ser usada como um marcador biológico para estado de doença/suscetibilidade a doença. Os inventores mostraram que se obtém vantagens substanciais por meio do uso de uma abordagem de titulação cruzada para detectar autoanticorpos em amostras de paciente. Portanto, é razoável concluir que será possível obter vantagens similares por meio do uso da abordagem da titulação cruzada para detectar autoanticorpos que são marcadores biológicos para doenças diferentes de câncer. Portanto, o método é aplicável à detecção de qualquer autoanticorpo que serve como um marcador biológico para um estado de doença ou suscetibilidade a doença, em qualquer doença que foi mostrada (ou que pode ser mostrada) como estando associada com produção de autoanticorpos.

Outras aplicações do método da invenção incluem, embora sem limitação, detecção de autoanticorpos que são marcadores biológicos de doença autoimune, como por exemplo, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), cirrose biliar primária (PBC), tireoidite autoimune (p. ex., tireoidite de Hashimoto), gastrite autoimune (p. ex., anemia perniciosa), adrenalite autoimune (p. ex., doença de Addison), hiperparatireoidismo autoimune, diabetes autoimune (p. ex., diabete de tipo 1) ou miastenia grave e seleção de amostras de paciente quanto a doença renal ou hepática levando a insuficiência ou falha de qualquer órgão, e para a seleção de amostras de paciente pós-transplante para detectar a presença de anticorpos dirigidos contra qualquer tecido adoecido (que foi deixado in situ após o transplante) ou contra o tecido transplantado. Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um método para detectar um anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, sendo que referido anticorpo é dirigido para uma substância estranha introduzida em referido indivíduo mamífero, sendo que o método compreende:

(a) contactar separadamente duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de

um antígeno específico para referido anticorpo,

(b) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada combinação de amostra de teste e antígeno usado na etapa (a),

(c) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de

amostra de teste usada na etapa (a), sendo que a presença, na amostra de teste, de anticorpo reativa com o antígeno usada no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos dois diferentes concentrações da amostra de teste. Neste aspecto da invenção, é possível usar a metodologia de titulação cruzada para avaliar a resposta imune de um indivíduo mamífero, e, de preferência, um indivíduo humano, para qualquer substância estranha introduzida em referido indivíduo.

Em uma concretização, a substância estranha pode ser um

agente terapêutico, como por exemplo, uma droga ou pró-droga, terapia com anticorpos humanos ou vacina. O método da invenção pode ser usado para avaliar se a administração de um agente terapêutico a um paciente dispara uma resposta imune levando à produção de anticorpos específicos para um epítopo no agente terapêutico, ou um componente de um veículo de fornecimento, excipiente, veículo etc. administrado com o agente terapêutico.

Os antígenos usados nesta concretização da invenção podem ser sintéticos ou naturalmente ocorrentes.

A natureza precisa do agente terapêutico não limita a invenção. Em concretizações não-limitantes, o método da invenção pode ser usado para avaliar resposta imune a pequenas moléculas sintéticas, substâncias naturalmente ocorrentes, agentes biológicos naturalmente ocorrentes ou produzidos sinteticamente, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes, opcionalmente em combinação com excipientes, veículos ou veículos de fornecimento.

Em uma concretização útil, o método da invenção pode ser usado para avaliar a resposta imune a uma porção não-alvo de um agente terapêutico ou vacina. Por porção "não-alvo" compreende-se uma parte componente do agente terapêutico ou vacina administrado que, no caso de um agente terapêutico, não contribui diretamente para a atividade terapêutica ou, no caso de uma vacina, não se destina a elicitar a produção de anticorpos no hospedeiro. A porção não-alvo pode estar presente, por exemplo, para facilitar a purificação do agente terapêutico ou vacina ou pode ser projetada para auxiliar no fornecimento, absorção ou objetivação da vacina/agente terapêutico. Exemplos de referidas porções "não-alvo" incluem, embora sem limitação, ligantes ou marcadores comumente ligados a polipeptídeos expressos recombinantemente, como marcadores de biotina, marcadores de histidina etc.

Em outra concretização deste aspecto da invenção, a

substância estranha pode ser um agente infeccioso, como fungo, bactérias, vírus ou parasita.

A invenção será melhor compreendida com referência aos exemplos experimentais não-limitantes a seguir: Exemplo 1 - Protocolo geral para a titulação de OSAAC (Optimal Serum and Antigen Concentration) !"concentração ótima de antígeno e soro] de antígeno em um ensaio de autoanticorpos

Amostras de antígenos marcadores de tumor podem ser preparadas por meio de expressão recombinante, seguindo métodos análogos àqueles descritos no WO 99/58978.

Em resumo, cDNAs que codificam os antígenos marcadores de interesse foram clonados no vetor pET21 (Invitrogen) que foi modificado para codificar um marcador de biotina e um marcador de óxhistidina para auxiliar na purificação da proteína expressa. Os clones resultantes são desenvolvidos em uma célula hospedeira bacteriana vantajosa (em corpos de inclusão), as bactérias lisadas e desnaturadas e os antígenos expressos recuperados por meio de colunas de afinidade de quelato de níquel (Hi-trap, comercialmente obtenível da Amersham, de acordo com o protocolo do fabricante). Os antígenos expressos foram renaturados por meio de diálise em tamponador apropriado, e o rendimento de proteína expressa foi avaliado por meio de SDS-PAGE, western blot e ELISA, e quantificado antes do armazenamento. Exceto se indicado de outra forma, todos os antígenos usados nos exemplos a seguir foram preparados por meio de expressão recombinante a partir do vetor pET21 modificado, e, portanto, foram expressos como proteínas de fusão compreendendo um marcador de biotinilação N-terminal (derivado de pET21) e um marcador His C-terminal.

Números de acesso GenBank para uma quantidade de cDNAs marcadores (ou as proteínas codificadas) são como a seguir: P53:B003596

c-myc:V00568

HER2 (erbB-2) isoforma a: NP 004439

1. Antígenos foram diluídos a concentrações apropriadas em 0,1 M de tamponador de carbonato, depois diluídos serialmente para formar uma faixa de titulação semilog (ver tabela 1). Diluições de antígeno foram dispensadas a 50 μΐ/poço nas fileiras de uma placas de microtitulação Falcon de acordo com o layout da placa usando-se uma estação de pipetagem robótica Tecan Evolyzer. Placas foram cobertas e armazenadas a 4°C durante 48 h.

2. Placas foram lavadas uma vez em PBS + 0,1 % tween 20 usando-se um lavador de placas automatizado, depois batidas até secarem sobre papel de tecido.

3. Placas foram bloqueadas com tamponador de incubação com alto teor de sal (HSB, PBS + 0,5M NaCl + 0,1 % de caseína) a 200 μΐ/poço durante 90 minutos (cobertas para armazenamento a 4°C).

4. Durante a incubação de bloqueio, amostras de soro foram descongeladas, submetidas a agitação suficiente para se obter um vórtice e diluídas serialmente em uma série semi-log de 1/30 a 1/10.000 em HSB à temperatura ambiente em tubos.

5. Placas foram esvaziadas e batidas até secarem sobre papel de tecido. Amostras de soro diluídas foram dispensadas a 50 μΐ/poço em todos os poços da placa de microtitulação usando-se uma pipeta eletrônica de multi- canais para formar uma faixa de titulação semi-log (ver tabela 1). Placas foram cobertas e incubadas durante 90 minutos à temperatura ambiente com agitação.

6. Etapa de lavagem: Placas foram lavadas três vezes em PBS + 0,1 % de tween 20 usando-se um lavador de placas automatizado, depois batidas até secarem sobre papel de tecido.

7. Ig anti-humana de coelho conjugada com peroxidase de

rabanete (Jackson, 1/10.000 em HSB) foi dispensada a 50 μΐ/poço em todos os poços da placa de microtitulação. Ig anti-camundongo de coelho conjugada com HRP (1/1000 em HSB) foi dispensada em poços de controle contendo anticorpo anti-antígeno. Placas foram então incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação.

8. Placas foram lavadas como na etapa 6.

9. Substrato TMB previamente preparado foi adicionado a 50 μΐ/poço e a placa foi incubada na bancada durante 10 min. Placas foram batidas cuidadosamente para misturar.

10. A densidade óptica de poços foi determinada a 650 nm

usando-se um protocolo de leitora de placas convencional. Tabela 1: Layouts de placas convencionais

A

B

C

D

E

1 2 3 4 5_6 7 8 9 10 11 12

antígeno 10 μ5θΓθ a 1 em 30 antígeno 10 μ§/ηι15θΓθ a 1 em 100 antígeno 10 μ§/πι1 Soro a 1 em 300 antígeno 10 μg/ml Soro a 1 em 1000 antígeno 10 μg/ml Soro a 1 em 3000 antígeno 10 μ^ΓηΙ Soro a Iem 10000 antígeno 3 μg/ml Soro a 1 em 30 antígeno 3 μ§/ιτι1 Soro a 1 em 100 antígeno 3 μg/ml Soro a 1 em 300 antígeno 3 μg/ml Soro a 1 em 1000 antígeno 3 μβ'ηιΐ Soro a 1 em 3000 antígeno 3 μg/ml Soro a 1 em 10000 antígeno 1 μg/mlSoro a 1 em 30 antígeno μg/mlSoro a 1 em 100 antígeno 1 μ^ηιΐ Soro a 1 em 300 antígeno 1 μg/ml Soro a 1 em 1000 antígeno 1 μg/ml Soro a 1 em 3000 antígeno 1 μg/ml Soro a 1 em 10000 antígeno 0,3 μ^πη^ΟΓΟ a 1 em 30 antígeno 0,3 μ^ιηΐ Soro a 1 em 100 antígeno 0,03 μg/ml Soro a 1 em 300 antígeno 0,03 μ^ιηΐ Soroa 1 em 1000 antígeno 0,03 pg/ml Soroa 1 em 3000 antígeno 0,03 μ§/πιΙ Soro a 1 em 10000 antígeno 0,1 μ&ω Soro a 1 em 30 antígeno 0,1 μΕ/ml Soro a 1 em 100 antígeno 0,1 μΒ/ml Soro a 1 em 300 antígeno 0,1 μg/mlSoro a 1 em 1000 antígeno 0,1 μg/ml Soro a 1 em 3000 antígeno 0,1 μ g/ml Soro a 1 em 10000 F

G

H

Curvas de titulação de antígenos foram construídas usando-se valores médios de duplicatas para cada amostra na faixa de diluições de soro. Um valor correspondente ao nível de ligação não-específica para cada diluição de soro foi calculado subtraindo-se um nível de fundo (soro a 1/10.000 e nenhum antígeno) do valor obtido para liquefação a nenhum antígeno para cada diluição de soro. Isto foi então usado para corrigir a ligação não-específica em cada conjunto de duplicatas. Exemplo 2 - Detecção de autoanticorpos em câncer de mama primário

Os dados a seguir foram obtidos de um estudo-piloto para avaliar a sensibilidade e a reprodutibilidade de um grupo de ensaios de autoanticorpos de titulação cruzada (OSAAC) em câncer de mama primário (PBC). O estudo incluiu soro de 14 mulheres sem evidência de câncer e amostras de soro pré-operatório de 14 mulheres com câncer de mama primário. As amostras normais e de câncer foram equiparadas quanto à idade. O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo dado no

exemplo 1 usando-se os antígenos p53 e c-myc. Duas amostras normais (uma para p53) precisaram ser removidas do estudo porque elas demonstraram níveis sustentados e extremamente elevados de ligação de autoanticorpos em toda uma faixa de concentrações de soro e de antígenos. A Figura 1 oferece exemplos de curvas obtidas quando o

ensaio de titulação cruzada foi usado para medir autoanticorpos p53 e c-myc no soro. Isto pode ser observado em algumas amostras (p. ex., amostras 17179 e 18781), uma faixa de titulações foi obtida, sendo que os soros mais

antígeno 0,03 μ^ιηΐ Soro a 1 em 30 antígeno 0,03 μ^ω Soro a 1 em 100 antígeno 0,03 μ^ιηΐ Soro a 1 em 300 antígeno 0,03 μg/ml Soroa 1 em 1000 antígeno 0,03 μ§/ιη1 Soroa 1 em 3000 antígeno 0,03 μ^ηιΐ Soro a 1 em 10000 antígeno 0,01 μ^ηιΐ Soro a 1 em 30 antígeno 0,01 μ^ηιΐ Soro a 1 em 100 antígeno 0,01 μ^πιΐ Soro a 1 em 300 antígeno 0,01 μ g/ml Soroa 1 em 1000 antígeno 0,01 μ g/ml Soroa 1 em 3000 antígeno 0,01 μ^πι^οΓΟ a 1 em 10000 tamponador de carbonato tamponador de carbonato tamponador de carbonato tamponador de carbonato tamponador de carbonato tamponador de carbonato 10

20

concentrados deram os sinais mais fortes, como esperado. No entanto, em outras amostras (p. ex., amostras 19150 e 18057), as curvas foram substancialmente planas, mas o sinal crescia à medida que a concentração de soro aumentava. Isto deveu-se à ligação não-específica de imunoglobulinas do soro e foi compensado pela correção da ligação não-específica, como descrito acima.

Níveis de autoanticorpos foram expressos como a densidade óptica (650 nm) devida à ligação com o antígeno de teste, menos aquela devida à ligação não-específica. O valor de corte normal foi calculado como o 95° percentual (média + 2 desvios padrão) do grupo normal. Amostras foram consideradas positivas se apresentassem níveis acima do valor de corte em pelo menos 2 diluições de soro entre 1/30 e 1/1000 e 2 concentrações de antígenos entre 10 μg/ml e 1 μg/ml. As amostras positivas são identificadas na tabela 2.

Tabela 2

antígeno p53

amostras de soro positivas

normal JOOl

total c-myc

total

1/14 (7%)

JOOl J041

PBC

17179 18781

18237 19502

18927 19622

combinado positivo para p53

7/14 (50 %)

17179 18781

18237 18964

combinado positivo para p53

2/14(14%) 5/14(36%)

Tabela 2: Positividade de medições de AAb em soros normais e de câncer de mama. Uma amostra foi avaliada como sendo positiva se o valor corrigido para ligação não-específica fosse maior do que a média + 2SE> das amostras normais testadas em pelo menos duas concentrações de antígenos e duas diluições de soro.

Exemplo 3 - Análise da sensibilidade e especificidade de ensaios de titulação cruzada, em comparação com titulação de antígeno apenas Medições de autoanticorpos (AAb) foram realizadas em 14 mulheres 15 com câncer de mama primário (PBC) usando-se tanto um ensaio de titulação cruzada (OSAAC) como também um método de titulação de antígeno apenas, em que as medições de autoanticorpos só foram realizadas a uma diluição de soro de 1/100. Amostras foram consideradas positivas se elas excedessem níveis de corte tanto a 10 como também a 3 μ^πιΐ em uma curva de titulação de antígeno. A Tabela 2 abaixo mostra uma comparação direta dos dois métodos: Tabela 3

antígeno método de titulação de antígeno ensaio OSAAC

p53 sensibilidade 5/14(36%) 7/14(50%)

especificidade 13/14(93%) 13/14(93%)

c-myc sensibilidade 3/14(21%) 5/14(36%)

especificidade 12/14(86%) 12/14(86%)

Tabela 3: Comparação do método de titulação de antígeno para

cálculo da sensibilidade de AAb em apenas uma diluição de soro, em comparação com ensaio OSAAC.

Pode-se observar que, usando uma série de curvas de titulação de antígeno em que tanto a concentração de antígeno como também a concentração de soro são variadas, obteve-se uma maior sensibilidade e uma especificidade pelo menos igualmente boa em comparação com curvas de titulação em que apenas a concentração de antígeno é variada.

O ensaio de titulação cruzada (OSAAC) para medição de autoanticorpos mostrou ser superior a um ensaio baseado em titulação de antígeno contra uma diluição simples do soro, em termos de sensibilidade para a detecção de câncer de mama primário. Este é o caso para ambos os anticorpos p53 e c-myc e não há razão para presumir que isto não seja verdadeiro para uma faixa de antígenos. Sem desejar ater-se à teoria, o requerente considera que há uma quantidade de razões para a maior sensibilidade observada de ensaios baseados na titulação cruzada de antígeno e amostra de teste. (i) O formato do ensaio apresenta uma faixa dinâmica muito mais ampla. Isto proporciona o escopo para detectar tanto anticorpos com baixa afinidade a alta concentrações de antígeno, como também alta abundância de anticorpos que, de outra forma, se atrelariam à alta concentração de antígeno.

(ii) Anticorpos de baixa abundância que podem ser mascarados por altos níveis de ligação não-específica podem ser detectados a baixa concentração de soro.

(iii) Os critérios estringentes para definir uma amostra como positiva (acima da média + 2SD de uma população normal durante pelo menos 2 concentrações de antígeno e 2 diluições de soro) aplicados aqui significam que o técnico pode mostrar-se confiar muito mais em que uma medição positiva é um positivo verdadeiro.

Exemplo 4 - Detecção de soros de câncer de mama primário por meio de titulação cruzada de antígeno

Usou-se neste estudo soros de mulheres com câncer de mama primário (PBC, n=8 (6 soros PBC foram os mesmos entre todos os antígenos e 2 soros PBC foram específicos para p53 ou as proteínas ECD6)) e mulheres sem evidência de doença maligna (n=10). O ensaio foi realizado em duplicata usando-se uma modificação do protocolo geral descrito no Exemplo 1. Placas de microtitulação foram revestidas com proteínas de antígeno: p53 recombinante, ECD6 (também conhecido como o domínio externo de HER2), ou um fragmento ECD6 a 3'. O antígeno ECD6 compreende aminoácidos de 1 a 647 da seqüência de aminoácidos de HER2 (erbB-2) de comprimento pleno mostrada sob o número de acesso NM_004439 fundida a uma seqüência de biotinilação N-terminal e um marcador His C-terminal. O antígeno de fragmento ECD6 a 3' compreende aminoácidos de 361 a 647 da seqüência de aminoácidos de HER 2 (erbB-2) de comprimento pleno mostrada sob o número de acesso NM 004439, novamente fundida a uma seqüência de biotinilação N-terminal e um marcador His C-terminal.

Os antígenos foram titulados serialmente no sentido descendente de cada placa a concentrações (do topo ao fundo) de 160 nM, 50 nM, 16 nM, 5 nM, 1,6 nM, 0,5 nM, 0,16 nM. Um controle de tamponador "sem antígeno" só foi incluído como a linha inferior de cada placa. Os antígenos foram deixados adsorver durante 48 horas, sendo que após este período as placas foram lavadas e bloqueadas durante 90 min com PBS contendo caseína (0,1 % peso/volume) e NaCl (0,5M).

Durante a incubação de bloqueio, preparou-se um conjunto de titulações seriais de soro em tubos, a diluições de 1:1600, 1:800, 1:400, 1:200, 1:100 e 1:50. Após remoção do tamponador de bloqueio, estes foram adicionados às placas revestidas com antígeno (diluições de 1:1600, 1:800, 1:400, 1:200, 1:100 e 1:50 adicionadas em todas as placas, da esquerda para a direita) e incubadas durante 90 min. O restante do ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 1. (O layout da placa encontra-se resumido na Figura 2).

Curvas de titulação de antígeno foram construídas usando-se valores de duplicatas para cada amostra em toda a faixa de diluições de soro. Um valor correspondente ao nível de resposta de autoanticorpos foi obtido subtraindo-se o fundo não-específico (a resposta do soro contra 0,16 nM de antígeno). Resultados

Curvas de titulação representativas são mostradas nas Figuras de 3 a 7. Pode-se observar que, para algumas amostras, (p. ex., amostras 20642 e 20620 para ECD6), obteve-se uma faixa de titulações, sendo que os soros mais concentrados forneceram os sinais mais fortes, como esperado. No entanto, em outras amostras (p. ex., amostras MVV272 e EA0220 para fragmento ECD6 a 3'), as curvas foram substancialmente planas, mas o sinal aumentava à medida que a concentração de soro crescia. Considerou-se que isto se deve à ligação não-específica das imunoglobulinas do soro. Valores de corte positivos foram calculados como a média + 2SDs da população normal. Considerou-se amostras como sendo positivas se elas mostrassem níveis acima do valor de corte em ambas as passagens e a concentrações de antígeno de 160 nM ou 50 nM. A Tabela 4 demonstra que uma diluição de soro de 1:100 correntemente usada para detecção de autoanticorpos não é sempre ótima. Adicionalmente, a tabela mostra que há variação inter-antígeno da diluição de soro ótima. O nível mais elevado de sensibilidade para ECD6 foi de 75 % quando o soro foi diluído a 1:50. Isto foi o oposto para o fragmento ECD6 a 3' em que 1:50 apresentou uma sensibilidade de 0 %. Isto deveu-se em parte a sinal aumentado contra fragmento ECD6 a 3' nas amostras normais analisadas (p. ex., amostras MMV272 e EA0220). Tabela 4

Diluição do soro

1:1600 1:800 1:400 1:200 1:100 1:50

p53 0% 25% 37,5% 37,5% 37,5% 37,5%

ECD6 25 % 37,5% 50% 50% 50% 75%

ECD6 a 3' 37,5% 37,5% 37,5% 37,5% 12,5% 0%

Tabela 4: Sensibilidade do ensaio de autoanticorpos contra 8 amostras de PBC analisadas para cada antígeno. A sample was judged to be positive if the ligação não-específica corrected value was higher than the mean + 2SD of the normal amostras tested at either of two concentração de antígenos.

A Tabela 5 resume a especificidade do ensaio em que soro é diluído a diferentes concentrações. Não se observou qualquer diferença na especificidade do ensaio usando-se as amostras analisadas neste ensaio. Tabela 5

Diluição do soro

1:1600 1:800 1:400 1:200 1:100 1:50

p53 100% 100% 100% 100% 100% 100%

ECD6 100% 100% 100% 100% 100% 100% ECD6 a 3' 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Tabela 5: Especificidade do ensaio de autoanticorpos com as amostras de PBC. Uma amostra foi avaliada como sendo positiva se o valor corrigido para ligação não-específica fosse maior do que a média + 2SD das amostras normais testadas a qualquer das duas concentrações de antígeno.

Na Tabela 6, a diluição ótima do soro é comparada para os 6 soros de PBC que foram analisados contra todos os antígenos. A diluição ótima de soro é a diluição mais alta em que é possível detectar uma resposta de autoanticorpos. A título de exemplo, o soro 20628 pôde ser diluído a 1:800 e foi possível detectar uma resposta (i.e. autoanticorpos) contra p53, mas o mesmo soro precisou ser diluído a 1:50 para a detecção de autoanticorpos para ECD6. A diluição ótima para este antígeno seria, portanto, de 1:50, de modo que todas as respostas de autoanticorpos positivas puderam ser identificadas. Tabela 6

soro p53 ECD6 ECD6a3' diluição ótima

20593 - - - .

20641 - 1:50 - 1:50 20620 - 1:1600 1:1600 1:1600 20639 -

20628 1:800 1:50 - 1:50

20642 1:400 1:400 - 1:400

Tabela 6: Diluição inter-indivíduo ótima das 6 amostras de soro de PBC que foram analisadas contra todos os antígenos. Onde a menor diluição é apresentada, isso foi necessário para detectar uma resposta de autoanticorpos contra P53, ECD6 ou fragmento ECD6 a 3'.

A Tabela 7 resume a sensibilidade do ensaio que foi globalmente incrementada para a detecção de câncer de mama primário quando se usa o método de titulação cruzada para detectar autoanticorpos contra cada um dos antígenos testados. Tabela 7

titulação cruzada soro a 1:100 sensibilidade 66,7 % 33,3 % especificidade 100% 100%

Tabela 7: Sensibilidade e especificidade global do ensaio usando ambos, ECD6 e fragmento ECD6 a 3' se o ensaio de titulação cruzada for usado em lugar de soro diluído a 1:100 para as 6 amostras de soro de PBC analisadas contra todos os antígenos. Conclusões

O ensaio OSAAC para a medição de autoanticorpos mostrou ser superior à titulação de antígeno apenas em termos de sensibilidade à detecção de câncer de mama primário. Este é o caso para autoanticorpos p53, ECD6 e ECD6 a 3' e não há razão para presumir que isto não é verdadeiro para todos os autoanticorpos de marcador de tumor. Poderia parecer que isto se deve ao fato de que este formato de ensaio apresenta uma faixa dinâmica muito mais ampla. Isto proporciona o escopo para detectar tanto autoanticorpos de baixa afinidade a altas concentrações de antígeno, bem como autoanticorpos de alta abundância que, de outra forma, poderiam atrelar-se a uma alta concentração de antígeno. Adicionalmente, parece ser possível que autoanticorpos de alta abundância, que podem ser mascarados por altos níveis de ligação não-específica, podem ser detectados a baixa concentração de soro.

Todas as patentes, pedidos de patentes, e referências publicadas aqui citados são incorporados integralmente por referência. Embora esta invenção tenha sido mostrada e descrita particularmente com referência a concretizações preferidas, aqueles versados na técnica compreenderão que é possível realizar várias alterações em forma e detalhes sem afastar-se do escopo da invenção abrangida pelas reivindicações.

Claims (36)

1. Método para detectar um estado de doença ou suscetibilidade a doença em um indivíduo mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende detectar um anticorpo em uma amostra de teste, sendo que a amostra de teste compreende um fluido corporal de referido indivíduo mamífero e sendo que referido anticorpo é um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, sendo que referido método compreende: (a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste: (i) contactar a diluição da amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de um antígeno específico para referido anticorpo, (ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno usada na etapa (i), (b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada na etapa (a), e (c) determinar a presença ou ausência de referido estado de doença ou suscetibilidade a doença com base na quantidade de ligação específica entre referido anticorpo e referido antígeno para cada diluição de amostra de teste e quantidade de antígeno testada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência de referido estado de doença ou suscetibilidade a doença é determinada com base nos valores coletivos da quantidade de ligação específica para todas as diluições de amostra de teste e quantidades de antígeno testadas.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência de referido estado de doença ou suscetibilidade a doença é determinada avaliando-se as curvas obtidas na etapa (c) quanto à presença de uma ou mais curvas em forma geral de S ou sigmóides.

4. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de que a presença de referido anticorpo na amostra de teste é indicada pela presença de uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste.

5. Método para detectar um anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero sendo que referido anticorpo é um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, caracterizado pelo fato de que referido método compreende: (a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste: (i) contactar a diluição da amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de um antígeno específico para referido anticorpo, (ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno usado na etapa (i), (b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada na etapa (a), sendo que a presença na amostra de teste de anticorpo reativa com o antígeno usado no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste.

6. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de que o autoanticorpo é específico para uma proteína marcadora de tumor.

8. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato de que o antígeno compreende uma proteína marcadora de tumor ou um fragmento antigênico ou epítopo do mesmo.

9. Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que a proteína marcadora de tumor é selecionada do grupo que consiste de MUC1, MUC16, c-myc, EGFR, p53, ras, BRCAl, BRCA2, APC, HER2-neu, PSA, CEA, CAl9,9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, citoqueratina, recoverina, calicreína, anexina, AFP, b-HCG , GRP78, CA125, mamaglobina, raf, NY-BR-1, livina, survivina, MUC2, endostatina, Bcl-2, BIRC7, HSP70, No55, uPA, tetranectina, prolactina, osteopontina, HE4, TATI, inibina, vimentina, cox-1 e cox-2.

10. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é no diagnóstico, prognóstico ou monitoramento de câncer.

11. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é na seleção de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para identificar aqueles indivíduos que se encontram em risco maior de desenvolver câncer, sendo que as amostras a serem testadas usando o método são amostras de fluido corporal colhidas dos indivíduos, e sendo que indivíduos apresentando um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, são identificados como estando em risco de desenvolver câncer.

12. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é na detecção de alteração neoplásica precoce ou carcinogênica precoce em um indivíduo humano assintomático, sendo que a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporal colhida do indivíduo, e sendo que a presença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, é considerada como uma indicação de alteração neoplásica precoce ou carcinogênica precoce no indivíduo.

13. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é na seleção de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para identificar aqueles indivíduos que desenvolveram um câncer, sendo que as amostras a serem testadas usando o método são amostras de fluido corporal colhidas dos indivíduos, e sendo que indivíduos apresentando um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, são diagnosticados como apresentando um câncer.

14. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é no teste de uma população de indivíduos humanos sintomáticos para identificar aqueles indivíduos que desenvolveram um câncer, sendo que as amostras a serem testadas usando o método são amostras de fluido corporal colhidas dos indivíduos, e sendo que indivíduos apresentando um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com indivíduos de controle normais, são diagnosticados como apresentando um câncer.

15. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é no monitoramento do progresso de câncer ou de outra doença neoplásica em um paciente, sendo que a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporal colhida de um paciente humano, e sendo que a presença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com um controle normal, é considerada como uma indicação da presença de câncer no paciente.

16. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é na detecção de doença recorrente em um paciente humano previamente diagnosticado como apresentando câncer, sendo que referido paciente foi submetido a tratamento anticâncer para reduzir a quantidade de câncer presente, sendo que a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporal colhida do paciente, e sendo que a presença de um nível incrementado de autoanticorpos no paciente, em comparação com um controle normal, é considerada como uma indicação de que a doença recidivou.

17. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é na avaliação do prognóstico de câncer, sendo que a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporal colhida de um paciente humano, e sendo que a presença de um nível elevado de autoanticorpos, em comparação com um controle normal, é considerada como uma indicação do prognóstico do paciente do seu câncer.

18. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é na predição de resposta a tratamento anticâncer, sendo que a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporal colhida de um paciente humano, e sendo que comparação do nível de autoanticorpos é em referido paciente com uma relação previamente estabelecida entre níveis de autoanticorpos e provável resultado de tratamento é usada para fornecer uma indicação de se o paciente responderá a referido tratamento anticâncer.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo fato de que o tratamento anticâncer é vacinação, terapia de transdução de sinal ou fator de anticrescimento, radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos ou quimioterapia.

20. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 9 caracterizado pelo fato de que é no monitoramento da resposta de um paciente de câncer humano ao tratamento anticâncer, sendo que a amostra a ser testada usando o método é uma amostra de fluido corporal colhida do paciente, e sendo que uma alteração no nível de autoanticorpos após tratamento é considerada como uma indicação de se o paciente respondeu ou não ao tratamento.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o tratamento é vacinação, terapia de transdução de sinal ou fator de anticrescimento, radioterapia, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos ou quimioterapia e uma alteração no nível de autoanticorpos após tratamento é considerada como uma indicação de que o paciente respondeu 0 positivamente ao tratamento.

22. Método de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo característico de, ou associado com, uma doença autoimune.

23. Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), cirrose biliar primária (PBC), tireoidite autoimune, tireoidite de Hashimoto, gastrite autoimune, anemia perniciosa, adrenalite autoimune, doença de Addison, hiperparatireoidismo autoimune, diabetes autoimune ou miastenia grave.

24. Método de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo característico de, ou associado com, doença renal ou hepática levando a insuficiência ou falha de qualquer órgão.

25. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o anticorpo é direcionado para um epítopo presente em tecido transplantado no indivíduo mamífero.

26. Método para detectar um anticorpo em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, sendo que referido anticorpo é direcionado para uma substância estranha introduzida em referido indivíduo mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste: (i) contactar a diluição da amostra de teste com uma pluralidade de diferentes quantidades de um antígeno específico para referido anticorpo, (ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno usada na etapa (i), (b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste usada na etapa (a), e sendo que a presença, na amostra de teste, de anticorpo reativo com o antígeno usado no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste.

27. Método de acordo com a reivindicação 26 caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é um humano.

28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27 caracterizado pelo fato de que a substância estranha é um agente terapêutico.

29. Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma droga, pró-droga, ou terapia com anticorpos.

30. Método de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27 caracterizado pelo fato de que a substância estranha é uma vacina.

31. Método de acordo com a reivindicação 28 ou reivindicação 29 caracterizado pelo fato de que a substância estranha é uma porção não-alvo de um agente terapêutico ou vacina.

32. Método de acordo com a reivindicação 31 caracterizado pelo fato de que a porção não-alvo é biotina.

33. Método de acordo com a reivindicação 26 ou reivindicação 27 caracterizado pelo fato de que a substância estranha é um agente infeccioso, como fungo, bactérias, vírus ou parasita.

34. Método para detectar dois ou mais anticorpos em uma amostra de teste compreendendo um fluido corporal de um indivíduo mamífero, sendo que pelo menos um de referidos anticorpos é um marcador biológico de um estado de doença ou suscetibilidade a doença, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) preparar duas ou mais diluições diferentes de referida amostra de teste e realizar as etapas (i) e (ii) a seguir com relação à diluição de cada amostra de teste: (i) contactar a diluição da amostra de teste com dois ou mais conjuntos de antígenos, sendo que cada um de referidos conjuntos de antígenos é específico para um de referidos anticorpos a serem detectados na amostra de teste e sendo que cada conjunto de antígenos compreende uma pluralidade de diferentes quantidades do mesmo antígeno, (ii) detectar a quantidade de ligação específica entre o anticorpo e o antígeno para cada quantidade de antígeno em cada conjunto de antígenos usados na etapa (i), (b) plotar ou calcular uma curva separada da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada diluição de amostra de teste com cada conjunto de antígenos usados na etapa (a), sendo que a presença, na amostra de teste, de anticorpo reativo com qualquer um dos conjuntos de antígenos usados no ensaio é indicada por uma curva com forma geral de S ou sigmóide para pelo menos duas diluições diferentes da amostra de teste com aquele conjunto de antígenos.

35. Método de acordo com a reivindicação 34 caracterizado pelo fato de que pelo menos um de referidos dois ou mais anticorpos é um autoanticorpo.

36. Método de acordo com a reivindicação 35 caracterizado pelo fato de que pelo menos um de referidos dois ou mais anticorpos é um autoanticorpo específico para uma proteína marcadora de tumor.