ES2619116B1 - Biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer colorrectal de aparición precoz - Google Patents

Abstract

Biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer colorrectal de aparición precoz.#La presente invención proporciona un nuevo biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer colorrectal de aparición precoz, el gen NOMO-1 o cualquiera de sus productos de expresión. Así, la invención también se refiere a un método in vitro de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer colorrectal de aparición precoz, en el que es necesaria la cuantificación de dicho biomarcador en una muestra biológica que comprende células tumorales.

Description

La presente invención se refiere en general al campo de la biomedicina, particularmente a la predicción de cáncer, la detección, el diagnóstico, seguimiento y tratamiento, y más particularmente, a métodos para detectar cánceres colorrectales de aparición temprana o precoz (CCRp) sobre la base de la menor expresión o ausencia del gen NOMO-l.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer colorrectal (CCR), especificamente el CCR de aparición precoz (CCRp) presenta una incidencia del 2-8% de todos los CeR, y en las últimas décadas ha ido en aumento, alcanzado cifras de incidencia de un 11 % dentro de los cánceres de colon , y de un 18% dentro de los cánceres de recto (Ahnen DJ , et al. Mayo Clinic Proceedings. 2014;89(2):216-24). Su impacto a nivel poblacional es innegable, y hasta hace poco subyacía la idea de que este subgrupo de pacientes que presentaban CCRp, dentro del grupo general de pacientes que presentan CCR, venía originado principalmente por formas hereditarias de CCR. Sin embargo, los últimos estudios rechazan estas teorías y proponen la implicación en la aparición de CCRp en este subgrupo de pacientes, a la estabilidad de secuencias de microsatélites (EMS), entendiéndose por microsatélites pequeñas secuencias de AON no codificantes repetidas que se encuentran en el genoma de los individuos (Perea J, el al. Warld J Gastreoenterol 2010; 16(29): 3697-3703; Perea J, et al. J Mol Diagn 2014; 16: 11626). Más aún, el CCRp en sujetos jóvenes, excepto en los casos donde el componente hereditario es la principal causa de la enfermedad, está asociado a la Inestabilidad de Microsatélites (lMS), constituyendo estos pacientes un subgrupo específico dentro de los pacientes que padecen CCR global, por lo que determinar cuáles son los marcadores y mecanismos moleculares subyacentes se convierte en una necesidad primordial.

El CCRp ha evolucionado desde la controversia de su historia natural y pronóstico, hasta la caracterización de una importante heterogeneidad dentro de este grupo (Losi L, et al. Am J Gastroenterol 2005; 100: 2280-2287). Además, se ha propuesto que la

edad de aparición podría ser un criterio con un peso mayor a la hora de subclasificar el CCR (Perea J, et al. J Mol Díagn 2014; 16: 116-26). la mayoría de los estudíos concluyen que hay características diferenciales dentro del grupo de pacientes que padecen CCRp, no solo desde un punto de vista clínico, sino y más llamativamente, de acuerdo con algunos aspectos moleculares diferenciales: alto grado de hípometílacíón de UNE-1 (Antelo M, et al. PloS One. 2012; 7 (9) :e45357); y mayor frecuencia de alteraciones cromosómicas y genéticas (incluyendo algunas variantes de susceptibilidad), pudiendo indicar cierta predisposición familiar, o herencia (Giráldez MD, et al. Carcinogenesis. 2012; 33: 613-19; Giráldez MD, et al. Clin Cancer Res. 2010 16(22):5402-13; Arriba M, et al. Mol Carcinog. 2015 Mar 25); o rasgos singulares, como el mecanismos de mantenimiento de telómeros (Boardman LA, et al. PloS ONE 8(1 1): e80015; Kírzín S, et al. PloS ONE 9(8): e103159). Aparte de estas aproximaciones, hasta la fecha, no existe ningún marcador molecular o genético que se pueda asociar al CCRp.

La heterogeneidad fenotípica y genotípica de los pacientes que padecen CCRp, surge claramente de los estudios clínicos. Los resultados obtenidos en diferentes estudios clínicos ponen de manifiesto que se pueden distinguir dos entidades distintas, (1) un subtipo hereditario, por lo general con agregación familiar, que representa un porcentaje relativamente bajo de los casos, con las características clínico-patológicas específicas del síndrome de Lynch, y (2) un subtipo "esporádico", a menudo sin antecedentes familiares de CCR, con características de ubicación e histopatología distintas a los individuos clasificados en el subgrupo (1). Además, existe una variabilidad significativa en los mecanismos subyacentes al desarrollo de CCRp y, sin duda, es una gran preocupación para los médicos y oncólogos, específicamente de cara a la identificación de métodos de prevención, diagnóstico y manejo clínico de la enfermedad. En este sentido, no existen en el estado de la técnica marcadores capaces de diagnosticar de manera efectiva a este subgrupo de pacientes que padecen CCRp, dentro de la población global de individuos que padecen CCR.

Por lo tanto, hay una necesidad no cubierta desde el punto de vista clínico, en el campo de los marcadores útiles para el diagnóstico, pronóstico yJo seguimiento de CCRp, que además muestren una alta fiabilidad. Así, la determinación de marcadores exactos y confiables que identifiquen y clasifiquen a los pacientes en situación de padecer o que ya padecen este tipo de cáncer, y su uso en métodos de diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de este tipo de pacientes, permitirán por un lado, mejorar la caracterización de los pacientes que padecen CCRp, así como asignarles una terapia individualizada y adecuada para cada caso clínico particular.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona un nuevo biomarcador de diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de CeR, preferiblemente de CCRp. el gen NOMO-1 (Nodal ModuJator 1), o cualquiera de sus productos de expresión. De la misma manera la presente invención describe un método in vitre de diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de CeR, preferiblemente CCRp, que comprende la detección y/o cuantificación de la presencia o ausencia, y/o del nivel de expresión del gen NOMO-1, o cualquiera de sus productos de expresión, en una muestra biológica, preferiblemente en una muestra biológica que contiene células tumorales.

Como muestran los ejemplos de la presente invención. el acido nucleico aislado de las muestras tumorales obtenidas de pacientes que padecen CCRp. han puesto de manifiesto que el gen NOMO-1 no se encuentra o bien lo presentan en un número disminuido de copias respecto a muestras de referencia, preferentemente muestras tumorales de individuos que padecen CCR. Así, la presente invención demuestra que el análisis de la presencia o ausencia y/o del nivel de expresión del biomarcador NOMO-1, es un método útil para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento del CCRp. De hecho, tal y como se ilustra mas abajo, los inventores han visto que en pacientes con CCRp tiene lugar una deleción parcial o completa de al menos una copia del gen NOMO-1, lo cual da lugar a la no detección del gen (ausencia) o a una disminución en el número de copias del mismo respecto un control. Por tanto, la deleción parcial o total de al menos una copia de NOMO-1 confiere riesgo a desarrollar o aparición de CCRp.

Por ello, un primer aspecto de la invención se refiere al uso in vitre del gen NOMO-1 y/o de sus productos de expresión, como marcador, de ahora en adelante "marcador o biomarcador de la invención", para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de CCRp.

A efectos de la presente invención, el término "marcador", "biomarcador" o "marcador biológico" se refiere a una molécula, como por ejemplo una secuencia nucleotídica o génica, o una secuencia polipeptídica o proteica, que es indicativa de un estado patológico particular, ofreciendo información de interés clínico sobre el estado de la afectación de un sujeto respecto a una patología particular. A efectos de la presente invención, el termino biomarcador se refiere al gen NOMO-1 y/o a sus productos de expresión.

A efectos de la presente invención, el termino "cáncer colorrectal" o "cáncer de colon"

o "CCR", incluye cualquier tipo de neoplasia del colon, recto o apéndice. El cáncer de colon se puede detectar mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, tacto rectal, prueba de sangre oculta en heces (PSOH), sigmoidoscopia, colonoscopia, colonoscopia virtual, enema de bario con doble contraste, ecografía, biopsia o resonancia magnética nuclear (RMN). A efectos de la presente invención, el término "cáncer colorrectal de aparición precoz" o "cáncer de colon de aparición precoz" o "CCRp" se refiere a aquel CCR que aparece en sujetos jóvenes, a una edad en la que no es habitual presentar este tipo de neoplasias. A efectos de la presente invención se considera que es CCRp cuando el individuo en el momento del diagnóstico presenta una edad menor o igual a 45 años.

El término "diagnóstico", tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, al proceso por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad. En particular, el término "diagnóstico de cáncer colorrectal de aparición precoz", "CCR de aparición precoz" o "CCRp" se refiere a la capacidad de identificar o detectar la presencia de CCRp. La detección de CCRp, tal y como es entendida por un experto en la materia, no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas herramientas estadísticas incluyen la determinación de intelValos de confianza, la determinación del valor p, el test de Student o las funciones discriminantes de Fisher, etc. (véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 ó de 0,0001. Preferiblemente, las enseñanzas de la presente invención permiten detectar correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

El término "pronóstico" se refiere al procedimiento mediante el cual se establece una predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo o curso de una enfermedad, preferiblemente, neoplásica, más preferiblemente CCRp, incluyendo recaída, capacidad de diseminación metastásica o respuesta a un determinado tratamiento.

El término "predicción" o "pronostico" o "seguimiento", tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a la probabilidad de que un paciente, tal como un paciente que sufre CCRp. responda favorable o desfavorablemente a un determinado tratamiento, y a la extensión de dichas respuestas, o de que el paciente sobreviva, tras la eliminación quirúrgica de un tumor primario y/o la quimioterapia por un periodo de tiempo sin que se produzca recurrencia del CCRp.

La secuencia nucleotídica del gen NOMO-1 es la de número de referencia al GeneBank: ENSG00000274779. En una realización más preferida, el gen NOMO-1 comprende la secuencia SEO ID NO: 1, y más preferiblemente, consiste en la SEO ID NO: 1. El gen NOMO-1 codifica una proteína que forma parte de un complejo proteico que participa en la vía de señalización nodal durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El término "producto de la expresión", tal y como se utiliza en esta descripción, hace referencia a cualquier producto de transcripción (ARN, incluyendo formas de reordenamiento alternativo) o expresión (proteína) de este gen, a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o expresión. Los productos de expresión de este gen son , preferiblemente, el ARNm de SEO ID NO: 3 (NM_014287) codificante para la proteína nomo-1. La secuencia peptídica de la proteína nomo-1 es la de número de referencia en el GenBank NP _055102.3. En una realización más preferida, el producto de expresión del gen NOMO-1 comprende la secuencia SEO ID NO: 2, y más preferiblemente, consiste en la SEQ ID NO: 2.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitre para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de CCR de aparición precoz, de ahora en adelante "método in vitro de la invención", que comprende: (a) detectar y/o cuantificar el número de copias y/o el nivel de expresión del gen NOMO-1 , y/o de su producto de expresión, en una muestra biológica aislada de un individuo, (b) comparar la cantidad detectada en la etapa (a) con una cantidad de referencia, y (c) asignar al individuo de (a) al grupo de pacientes con riesgo de desarrollar o padecer CCRp, cuando la cantidad detectada en (a) es inferior a la cantidad de referencia.

En una realización más preferida, el método in vitro de la invención comprende en la etapa (a) detectar y/o cuantificar el número de copias del gen NOMO-1, (b) comparar la cantidad detectada en la etapa (a) con una cantidad de referencia, y (e) asignar al individuo de (a) al grupo de pacientes con predisposición, riesgo de desarrollar o diagnóstico de CCRp, cuando la cantidad detectada en (a) es inferior a la cantidad de referencia.

A efectos de la presente invención, el término "alelo", tal como aquí se utiliza, se refiere a una, dos o más formas de un gen, locus o polimorfismo genético. A veces, los diferentes alelos pueden dar lugar a diferentes fenotipos; sin embargo, otras veces, los diferentes alelos tendrán el mismo resultado en la expresión de un gen. La mayoría de los organismos multicelulares tienen dos juegos de cromosomas, es decir, que son diploides. Estos cromosomas se denominan cromosomas homólogos. Los organismos diploides tienen una copia de cada gen (y un alelo) en cada cromosoma. Si ambos alelos son iguales, son homocigotos. Si los alelos son diferentes, son heterocigotos.

De esta manera, la expresión "al menos una copia del gen NOMO-1 está parcial o completamente delecionado" significa que al llevar a cabo la etapa (a) del procedimiento o no se detecta el gen NOMO-1 (lo cual quiere decir que la única copia de dicho gen está delecionada en la muestra del individuo) o bien se detecta una disminución en el número de copias del gen como consecuencia de la deleción total o parcial de una o más copias del mismo respecto a controles bien establecidos (tal y como se ilustra más abajo).

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, cuando se lleva a cabo la etapa (a) no se detecta el gen NOMO-1 en la muestra del paciente. En una realización más preferida aún, el sujeto en el que no se detecta el gen NOMO-1, es un individuo que muestra una deleción en homocigosis del gen NOMO-1 , siendo indicativo de una predisposición o riesgo a desarrollar CCRp, o padece CCRp. En otra realización más preferida aún, el método de la invención se caracteriza por que en la etapa (a) el gen presenta al menos una copia, parcial o completamente delecionada. En otra realización más preferida aún, éste se caracteriza por que en la etapa (e) la ausencia de expresión del gen NOMO-1 respecto a la cantidad de referencia, o la ausencia de al menos una copia, parcial o completamente delecionada del gen NOMO-1 , es indicativo de un diagnóstico, predisposición o riesgo a desarrollar CCRp.

En otra realización más preferida aún, en la etapa (e) la disminución en al menos un 50% en el número de copias del gen NOMO-1 respecto a la cantidad de referencia, es indicativo de un diagnóstico, predisposición o riesgo a desarrollar CCRp.

A la hora de determinar en una muestra de un paciente la ausencia del gen NOMO-1

o bien la disminución en el número de copias se llevan a cabo metodologías diferentes pero a la vez complementarias. De acuerdo con realizaciones preferidas del método in vitro descrito en la presente invención, se pueden genotipar el ácido nucleico obtenido de la muestra aislada del sujeto, y esto será indicativo de que ha habido deleción completa de la(5) copia(s) del gen NOMO-t, y en consecuencia, que existe predisposición o riesgo a desarrollar CCRp. Si el genotipo obtenido mediante el análisis del gen NOMO-1 no es concluyente (es decir, no permite determinar que hay una ausencia completa de NOMO-1), se determina cuál es el número de copias presentes en la muestra del paciente y se compara con el número de copias de una muestra control. Si se observa que el número de copias del gen NOMO-1 en el paciente es inferior al número de copias del control, implicará que una o más copias del gen NOMO-1 en la muestra del individuo han sido delecionadas y, en consecuencia , existe predisposición a desarrollar CCRp.

La expresión "total o parcialmente delecionado" significa que se deleciona el gen completo o bien un fragmento del mismo (por ejemplo, un exón de NOMO-1 ). Cuando en la presente invención se utilice la expresión "ausencia" relativo al gen NOMO-1 quiere decir que cuando se lleva a cabo la etapa (a), de acuerdo con el método descrito en la presente invención, no se detecta ninguna copia del gen NOMO-1 en la muestra del individuo.

En otra realización más preferida, el método in vitro de la invención comprende en la etapa (a) detectar y/o cuantificar el nivel de expresión del gen NOMO-1, y/o de su producto de expresión, en una muestra biológica aislada de un individuo, (b) comparar la cantidad detectada en la etapa (a) con una cantidad de referencia, y (c) asignar al individuo de (a) al grupo de pacientes con riesgo de desarrollar o padecer CCRp, cuando la cantidad detectada en (a) es inferior a la cantidad de referencia.

En una realización más preferida, el método in vitro de la invención comprende en la etapa (a) detectar y/o cuantificar el número de copias del gen y el nivel de expresión del gen NOMO-1, y/o de su producto de expresión, en una muestra biológica aislada de un individuo, (b) comparar la cantidad detectada en la etapa (a) con una cantidad de referencia, y (e) asignar al individuo de (a) al grupo de pacientes con riesgo de desarrollar o padecer CCRp, cuando la cantidad detectada en (a) es inferior a la cantidad de referencia.

En una realización más preferida del método in vitro de la invención, éste se caracteriza por que el gen NOMO-1 comprende la secuencia SEO ID NO: 1 y más preferentemente aún, el gen NOMO-1 consiste en la SEO ID NO: 1. En otra realización más preferida, el producto de expresión del gen NOMO-1 comprende la SEa ID NO: 2 y más preferentemente aún, consiste en la SEa ID NO: 2.

La muestra biológica procedente del sujeto bajo estudio es una muestra biológica que contiene un ácido nucleico, por ejemplo, ADN , ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ARN, ARN nuclear heterogéneo (ARNnh), ARNm, etc., del sujeto a evaluar. A efectos de la presente invención el término "muestra biológica aislada" se refiere, pero no se limita, a poblaciones celulares y a tejidos y/o fluidos biológicos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica puede contener cualquier material adecuado para detectar el biomarcador que se desee y puede comprender células y/o material no-celular del sujeto. Preferiblemente, la "muestra biológica aislada comprende células tumorales", y tal y como se utiliza en la descripción, se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia tumoral o un aspirado por aguja fina. En una realización más preferida, la muestra biológica aislada para la determinación del número de copias del gen NOMO1 y/o de los niveles de expresión del biomarcador de la invención es una muestra de tejido de colon, preferentemente obtenida por biopsia.

Por otra parte, la muestra biológica es una muestra de un fluido biológico. Los términos "fluido biológico" y "biofluido" se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a fluidos acuosos de origen biológico. El biofluido se puede obtener desde cualquier localización (tales como sangre, plasma, suero, orina, bilis, líquido cefalorraquídeo, humor vitreo o acuoso, o cualquier secreción corporal), un exudado (como el líquido obtenido a partir de un absceso o cualquier otro sitio de infección o inflamación), o el líquido obtenido a partir de una articulación (por ejemplo, una

articulación normal o una articulación afectada por una enfermedad como la artritis reumatoide). En una realización preferida, el biofluido de la invención es preferentemente sangre, concentrado leucocitario, células mononucleares de sangre periférica o linfocitos de sangre periférica.

La muestra puede ser tomada de un humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o caninos. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el "individuo" o "sujeto", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, del cual procede la muestra biológica aislada del paso (a ) del método in vitro de la invención es un mamífero. En una realización más preferida, el mamífero es un humano, hombre o mujer de cualquier edad o raza.

La detección y/o cuantificación del número de copias del gen NOMO-1 se refiere a determinar si se detecta amplificación del gen o no y en qué medida. También incluye por tanto, la determinación del nivel de expresión del gen NOMO-1 y/o de su producto de expresión en la muestra biológica aislada, se refiere a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa. Esta medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración tanto del número de copias en material genómico, como del producto de la expresión del gen, preferiblemente mRNA, basada en una señal que se obtiene y que está correlacionada directamente con el número de moléculas del producto de la expresión del gen presente en la muestra. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad -puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del producto de la expresión génica) o un sistema de medida biológica (por ejemplo, la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).

De acuerdo con la presente invención, la detección del número de copias o de la cantidad de producto de la expresión del gen puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de la cantidad de DNA o del producto de la expresión de los genes conocido por el experto en la materia. En una realización preferida, la detección del número de copias del gen se realiza amplificando un fragmento de DNA que contiene el gen y comparar el número de copias con un gen de referencia del que se sabe que existen dos copias. El análisis del número de copias se realiza mediante RTqPCT. En el caso de la determinación de la cantidad de producto de la expresión del gen se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total de la muestra biológica aislada lo cual puede llevarse a cabo por métodos conocidos por un experto en la materia. El análisis del nivel de ARNm se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RTLCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funciona liza das con anticuerpos o por cualquier otro medio.

En otra realización preferida, la detección de la cantidad de producto de la expresión del gen se realiza determinando el nivel de proteína nomo-1 , mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, Western blot, ELlSA, (Enzyme-linked ¡mm unosorbent a ssay), RIA (radioinmunoensayo), EIA (inmunoensayo enzimático), DAS-E LISA (anticuerpos doble sandwich ELlSA), técnicas basadas en el uso de biochips o microarrays de proteínas como anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como las tiras reactivas. Otras formas de detección y cuantificación de la proteína incluyen las técnicas de cromatografía de afinidad, de unión al ligando ensayos, etc.

En una realización más preferida aún, la detección del número de copias y/o de la cantidad de producto de la expresión del NOMO-1 se realiza mediante RT-qPCR y la detección de su producto de expresión, se lleva a cabo preferentemente mediante Western-blot o ELlSA.

En una realización preferida del método in vitre de la invención, es posible también,

además

de la detección de un fragmento de las proteínas usadas como

biomarcadores,

la detección y cuantificación de una variante funcionalmente

equivalente de las mismas.

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a proteínas sustancialmente homólogas a la proteína codificada por el gen NOMO-1. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, siempre con la condición de que dichas variantes son funcionalmente equivalentes a la proteína original. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.

La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que la proteína o el fragmento de la proteína en cuestión mantiene esencialmente las propiedades inmunológicas descritas en este documento. Dichas propiedades inmunológicas se pueden determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos anteriormente.

El término "fragmento", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una porción de la proteína codificada por el gen NOMO-1 o de una de sus variantes.

El nivel de expresión de un gen o de su producto de expresión, determinado en una muestra biológica procedente del sujeto sometido a estudio se dice que es "mayor" que el nivelo cantidad de referencia de dicho gen o de su producto de expresión cuando, de acuerdo con la invención, el nivel de dicho gen o de su producto de expresión en la muestra biológica del sujeto o individuo es de, al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más, con respecto al nivel de referencia de dicho gen o de su producto de expresión. Análogamente, el nivel de expresión de un gen o de producto de expresión, determinado en una muestra biológica procedente del sujeto o individuo sometido a estudio se dice que es "menor" que el nivelo cantidad de referencia de dicho gen o de su producto de expresión cuando, de acuerdo con la invención, el nivel de dicho producto de expresión en dicha muestra biológica del sujeto es de, al menos 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o incluso más, más bajo que el nivel de referencia para dicho producto de expresión de dicho gen. A efectos de la presente invención el término menor también hace referencia a la ausencia completa de expresión del gen o de su producto de expresión.

El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación del gen NOMO-1 y/o de su producto de expresión en una muestra biológica control. La cantidad de referencia adecuada puede ser determinada por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia puede ser el control negativo, esto es, la cantidad detectada por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen la enfermedad. Alternativamente, también puede ser la cantidad detectada por el método de la invención en muestras de individuos que padecen CCR, pero que no es de aparición precoz. En una realización preferida, la cantidad de referencia procede de una muestra biológica aislada que puede comprender o no células tumorales, donde dicha muestra puede proceder de un individuo control sano o que no padece CCRp o de un individuo que padece CCR, siempre que no sea de aparición precoz. Una "muestra de referencia", como se usa aquí, se refiere a una muestra obtenida de un grupo de sujetos sanos que no tiene un estado de enfermedad o fenotipo particular. Preferiblemente, la muestra de referencia puede incluir muestras de la mucosa del colon de pacientes que no sufren cáncer de colon o que no tienen antecedentes de cáncer de colon. Por otra parte, la muestra de referencia podría ser una muestra o un conjunto de muestras de cáncer de colon obtenidas de pacientes diagnosticados con CCR de aparición no precoz.

Dicha cantidad de referencia, de acuerdo con la presente invención, permite discriminar la presencia de CCRp respecto de individuos que padecen CCR de aparición no precoz y, por tanto, puede ser utilizado en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución de un CCRp.

Las etapas (a) y/o (b) del método in vitro de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un equipo robótica para la detección y/o cuantificación, en el paso (a), del número de copias y/o de la cantidad de expresión del gen NOMO-1, o de su producto de expresión, en la muestra biológica aislada.

Además de los pasos especificados anteriormente, el método in vitro de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con el pre-tratamiento de la muestra biológica aislada previamente a su análisis.

Por tanto, el método in vitre de la invención es útil para establecer el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de CCRp.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de CCRp, de ahora en adelante "kit de la invención", que comprende los cebadores, sondas, anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, necesarios para detectar el número de copias y/o la cantidad de expresión del gen NOMO-1 y/o de su producto de expresión, preferentemente, en una muestra biológica aislada.

Los cebadores, sondas y/o anticuerpos comprendidos en el kit de la invención presentan complementariedad, y por tanto, capacidad de hibridación, con el gen NOMO-1 y/o con al menos un producto de expresión del mismo. En general, el kit de la invención comprende todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención descrito anteriormente. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, enzimas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit puede contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. Preferiblemente, el kit de la invención comprende los oligonuclétidos de SEO ID NO: 4 y SEO ID NO: 5.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso in vitre del kit de la invención para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de CCRp, preferentemente en una muestra biológica aislada, según se describe a lo largo del presente documento.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o

pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del método de la invención en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de CCRp. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la in vención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma

Ejemplo 1. Determinación del gen NOMO-1 como biomarcador en el diagnóstico y ca racterización de pacientes que padecen CCRp respecto a pacientes que padecen CCR.

Se recogieron un total de 34 muestras de tejido tumoral de individuos diagnosticados consecutivamente de CCRp, a la edad igualo menor de 45 años. Además, también se recogieron 17 muestras de tejido tumoral individuos diagnosticados consecutivamente de CCR pero a edad mayor o igual de 70 años, con el fin de compararlos con el grupo de individuos jóvenes que presentaban CCRp. Las características clínicas de ambos grupos de pacientes incluidos en el estudio se muestran en la Tabla 1. Se analizó también la inestabilidad de microsatélites (lMS) y las mutaciones relacionadas con el síndrome de Lynch, para todos los individuos (Tabla 1). El seguimiento de todos ellos se continuó durante al menos cinco años tras la cirugía. Todos los pacientes incluidos en el estudio firmaron el consentimiento informado.

En las muestras de los sujetos jóvenes menores de 45 años se descartó el origen hereditario de la presencia de CCRp, así como la presencia de otros tumores sólidos, tales como el cáncer de endometrio y el glioblastoma.

Tabla 1. Características clínicas de los pacientes incluidos en el presente estudio.

CCRp n ('lo)

CCR ancianos n ('lo)

Pacientes

34 17

Media de edad (OS)'

38.65 (5.2) 79.5 (5.2)

Sexo Masculino Femenino

19(56) 15 (44) 7(41.2) 10(58.8)

l ocalizac ión Colon derecho Colon izquierdo Recto

11 (32 4) 17 (50) 6 (17 6) 7(41.2) 3 (17.6) 7(41.2)

Diferenc iación tumoral" Pobremente diferenciado

2/27 (7.4) 0/16 (O)

Tumores mucinosos Células en "Anillo de 5ello.. 2

10/27 (37) O(O) 1/16 (6.3) 0/16 (O)

Estadificación de Astler Coller modificada A B C O

7 (20.6) 17 (50) 3 (8.8) 7 (206) 3 (17.6) 6 (35.3) 6 (35.3) 2 (1 1 8)

Pólipos asociados Número medio de pólipos (05)1 Tipo Adenomatosos Hiperplásicos Mixtos

21 (61 8) 2.3 (3) 7 (33.3) 3 (14.3) 11 (52.4) 12 (706) 2.8 (3.5) 6 (50) 2(16.7) 4 (33.3)

CCR sincrónico o metacrónico Recurrencia3 Mortalidad relacionada Supervivencia Libre de enfermedad (D5)1 Supervivencia Global (05)1

3 (8.8) 4 (14.8) 7 (206) 57.7 (436) 675 (37.2i 3 (17.6) 2 (20) 3 (17.6) 27.2 (37.8) 27.3 (32.3i

IMS Mutaciones en los genes MMR

7 (20.6) 6 (17 6) 1 (5.9) O (O)

Historia familiar de cáncer Familias Amsterdam 1I Positivas. Casos esporádicos.

9 (265) 12(353) O (O) 10 (588)

1 Análisis estadístico llevado a cabo mediante la t de Student. 2 Las proporciones mostradas se

5 basadas en el variable número total de casos ya que se excluyen aquellos en los que solo se obtuvo biopsia de los casos (estad íos O, por ejemplo) 3 Los casos que muestran recu rrencia son aquellos con estadios iniciales C o menores. OS: Desviación estándar. CCR: Cáncer Colorrectal; CCRp: Cáncer Colorrectal de aparición precoz. 1M S: Inestabilidad de Microsatélites. MMR: Sistema de reparación de errores del AoN.

El ADN total fue extraído de las muestras de tejido tumoral mediante técnicas

convencionales. La cantidad y pureza de las muestras de AON fueron realizadas en el

Nanodrop (Thermo Scientific D-1000).

Para la detección de la presencia o ausencia del gen NOMO-1 (SEO ID NO: 1) en las muestras obtenidas de dichos pacientes se llevó a cabo una RT-qPCR para cuantificar el número de alelos relativos de dicho gen en cada paciente. La RT-qPCR se realizó mediante el FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (2x con.) en StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Lite Technologies-lnvitrogen, California, U.S.A.). Brevemente, un fragmento del gen NOMO-1 (SEO ID NO: 1) se amplificó en el DNA obtenido de las muestras aisladas de los sujetos incluidos en el estudio usando los siguientes cebadores: cebador directo S'-agctccatgtggatggagtc-3' (SEO ID NO: 4) y cebador reverso: 5'-acggatgaagtacagagttc-3' (SEO ID NO: 5). Como control interno para la normalización de los niveles de expresión génica, se utilizó el gen 36b4 (SEO ID NO: 6) fue amplificado en el mismo ADN usando los siguientes cebadores: cebador directo: 5'-cagcaagtgggaaggtgtaatcc-3' (SEO ID NO: 8) y cebador reverso 5'cccattctatcatcaacgggtacaa-3' (SEO ID NO: 9), Para la reacción de qRT-PCR se utilizó una concentración de 15 ng de ADN y un volumen final de reacción de 1 O ~ 1. Se empleó SYBR Green (Roche, FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) Applied Science, Germany) para la detección de los productos de la PCR. Las reacciones One-step RT-PCR reactions se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos cubiertas con un film adhesivo (MicroAmp Optical Adhesive Film, Life Technologies-Invitrogen, California, U,S.A) para evitar la evaporación de las muestras. Las condiciones de la RT-qPCR fueron 10 minutos a 95°C seguido de 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos, posteriormente a 58°C durante 45 segundos y a 72°C durante 15 segundos. Estas reacciones se llevaron a cabo en un termociclador StepOnePlus de Applied Biosystems y los resultados se obtuvieron con el software RQ Manager (Applied Biosystems). Los datos se analizaron de acuerdo con el método de análisis de expresión relativa ddCt descrito previamente por Pfaffl (Pfaffl et al., 2002. Nucleic Acids Res. May 1 ;30(9):e36). Los datos de la presencia o ausencia y/o de los niveles de expresión del gen NOMO-1 en las muestras de los pacientes analizados se encuentran normalizados en escala Log1 O.

Todos los resultados se expresan como los valores de la media ± desviación estándar (SO) y las variables categóricas se expresan en forma de número de casos y su porcentaje. Las diferencias se consideraron significativas cuando el valor p<0.05. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el programa SPSS v.11.5 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Los resultados de la detección de la presencia o ausencia del gen NOMO-1 en el grupo de pacientes jóvenes que padecen CCRp, ha puesto de manifiesto que los 34 individuos analizados mostraron amplificación residual de dicho gen, siempre muy inferior a la mitad de las copias detectadas en tejido sano, es decir un 100% de los individuos analizados mostraron perdida homocigota del gen NOMO-t, ya que no se pudo detectar la presencia de dicho gen. En cambio, de los 17 pacientes ancianos con CCR, sólo dos casos mostraron pérdida homocigota de NOMO-t, mientras que cinco presentaron pérdida heterocigota, y en los otros 10 casos, el gen NOMO-1 mostró presencia normal. Por lo tanto, dentro de la población anciana que estaban diagnosticados con CCR, solo 2 de 17 individuos mostraron ausencia del gen NOMO1, poniendo de manifiesto que sólo un 11.7% de la población anciana con CCR presentó deleción homocigota de dicho gen.

Para validar los resultados obtenidos en ese primer grupo de pacientes, se amplió la muestra a un grupo CCRp independiente de 41 individuos en total, representativos de tres instituciones independientes: Hospital Universitario de Salamanca (Salamanca, España), Unidad Clínica del Cáncer Familiar del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) (Madrid, España) y Hospital 12 de Octubre (Madrid, España). Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado antes de su inclusión en el estudio.

Para el análisis de la detección de la presencia o ausencia (preferiblemente analizando la presencia del número de alelas del gen) y/o de los niveles de expresión de NOMO-1, en el nuevo grupo de pacientes, se procedió tal y como se ha explicado previamente. Por lo tanto, se analizó la presencia del gen NOMO-1 (SEO ID NO: 1) mediante RT-qPCR en las muestras de tejido tumoral obtenidas del nuevo grupo de pacientes jóvenes que presentaban CCRp (grupo de validación). Los resultados obtenidos muestran que del total de 41 nuevos casos, 27 mostraron pérdida homocigota (ausencia total de expresión del gen NOMO-1); 7 mostraron pérdida heterocigota (amplificación al 50% del gen NOMO-1 respecto al grupo con CCR de individuos ancianos), y 7 mostraron una expresión normal del gen NOMO-1.

A continuación, se agruparon todos los resultados obtenidos, tanto del primer grupo de pacientes, como del segundo grupo (grupo de validación), obteniendo un total de 75 individuos que padecen CCR de aparición precoz. Esta agrupación, tal y como se observa en la Tabla 2, confirmó que 61 individuos (81.3% del total de la población

analizada) mostraron pérdida del gen NOMO-1 , confirmándose por tanto que dichos pacientes presentan deleción homocigota del gen NOMO-1. Por otro lado, 7 individuos (9.3% del total de la población analizada) presentó deleción heterocigota del gen NOMO-1 , y los restantes 7 individuos (9.3% del total de la población analizada),

5 mostraron una expresión normal de dicho gen. Estos resultados ponen de manifiesto la utilidad del gen NOMO-1 como biomarcador específico para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de pacientes que padecen CCRp.

Posteriormente, se quiso determinar si el fenotipo de IMS podría influir en el

10 diagnóstico de CCRp, también asociado a la ausencia en mayor o menor grado de expresión del gen NOMO-1 . Se subdividió a los pacientes en función del fenotipo de IMS que presentaban (Tabla 2). Así, los pacientes jóvenes que presentaron un fenotipo de EMS mostraron la mayoría pérdida homocigota del gen NOMO-1 (54 de 59) (91 .5%), mientras que sólo 7 de 16 pacientes que tenían fenotipo IMS mostraron

15 perdida homocigota del gen (43.74%) (Tabla 2). Por lo tanto, la pérdida heterocigota

del gen NOMO-1 parece ser rara en los casos de individuos con CCRp que muestran

fenotipo EMS (3.3%, 2/59), Y bastante más frecuente en los casos de individuos con

CCRp que muestran fenotipo IMS (31.2%, 5/16) (Tabla 2).

20 Tabla 2. Análisis de la expresión del gen NOMO-1 en los grupos de pacientes con CCR de aparición precoz respecto a la presencia de fenotipo EMS o IMS.

CCRp Grupo original (n:34)

CCRp Grupo de validación (n:41 ) CCRp Total (n:75)

EMS

IMS EMS IMS EMS IMS

Deleción homocigota NOMO-1

31 3 23 4 54 7

Deleción heterocigota NOMO-1

O O 2 5 2 5

Expresión normal NOMO-1

O O 3 4 3 4

CCRp. Cáncer Colorrectal de apancl6n precoz. IMS. Inestabilidad de Mlcrosatélltes. EMS. Estabilidad de Microsatélites.

Para confirmar que la ausencia de expresión del gen NOMO-1, tanto en homocigosis

como en heterocigosis, es un marcador específico en el diagnóstico de CCRp, se

cuantificaron los alelas de dicho gen en diferentes muestras de tejido tumoral de

individuos con una edad menor de 50 años, y que padecían otros tipos de cáncer, tales como, poliposis adenomatosa familiar, glioblastoma multiforme y carcinoma de endometrio de aparición precoz. Los resultados obtenidos respecto a la expresión del gen NOMO-1 en las muestras de dichos pacientes pusieron de manifiesto que en

5 ninguno de dichos tumores analizados se produjo una alteración en el número de alelos de dicho gen respecto a una cantidad de referencia, siendo su cantidad normal en todos ellos, respecto al nivel de expresión del gen endógeno analizado y tomado como referencia.

10 Por lo tanto, a la luz de los resultados mostrados en el presente documento, la ausencia de expresión del gen NOMO-1 es un marcador clínico de CCRp, específicamente útil en el diagnóstico y/o pronóstico de dicha patología. Así, el diagnóstico precoz de dichos individuos permite diseñar terapias especificas para este tipo de pacientes, así como utilizar el gen NOMO-1 como diana terapéutica para el

15 tratamiento de dichos individuos.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método in vitro de diagnóstico, pronóstico, o seguimiento de la evolución del cáncer colorrectal de aparición precoz (CCRp) en un individuo que comprende: a) delectar y/o cuantificar el número de copias y/o el nivel de expresión del gen NOMO-1 , y/o de su producto de expresión, en una muestra biológica aislada de dicho individuo, b) comparar la cantidad detectada en la etapa (a) con una cantidad de referencia, y

   e) asignar al individuo de (a) al grupo de pacientes con riesgo de desarrollar o padecer CCRp, cuando la cantidad detectada en (a) es inferior a la cantidad de referencia.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1 donde la etapa (a) comprende delectar y/o cuantificar el número de copias del gen NOMO-1.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1 donde la etapa (a) comprende detectar y/o cuantificar el número de copias y el nivel de expresión del gen NOMO-1 .

4. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el gen NOMO-1 comprende la SEO ID NO: 1 y el producto de expresión del gen NOMO-1 comprende la SEO ID NO: 2.

5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que en la etapa (c) la ausencia de expresión del gen NOMO-1 respecto a la cantidad de referencia, es indicativo de un diagnóstico, predisposición o riesgo a desarrollar CCRp.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que en la etapa (c) la disminución en al menos un 50% en el número de copias del gen NOMO-1 respecto a la cantidad de referencia, es indicativo de un diagnóstico, predisposición o riesgo a desarrollar CCRp.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 dónde la detección del número de copias y/o niveles de expresión del gen NOMO-1 se lleva a cabo mediante cualquiera de los métodos que comprenden: RT-PCR, RT-qPCR, microarray, northern blot, o cualquiera de sus combinaciones, y/o la detección del producto de expresión del gen NOMO-1 se lleva a cabo mediante cualquiera de los

   métodos que comprenden: inmunohistoquímica, ELlSA, inmunomarcaje, o cualquiera de sus combinaciones.

8. 8.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la cantidad de referencia se obtiene de una muestra biológica aislada de un sujeto sano, o de un sujeto que padece CCR.

9. 9.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la muestra biológica aislada se selecciona de la lisia que consiste en una muestra de tejido y una muestra de fluido biológico.

10. 10.

    Método según la reivindicación 9 donde la muestra de tejido es una muestra de tejido tumoral, preferentemente biopsia.

11. 11.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

12. 12.

    Uso in vitro del gen NOMO-1 y/o de su producto de expresión como marcador para el diagnóstico, pronóstico °seguimiento de la evolución de CCRp.

13. 13.

    Uso in vitro según la reivindicación 12 donde el gen NOMO-1 comprende la SEO ID NO: 1, Y su producto de expresión comprende la SEO ID NO: 2.

14. 14.

    Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 donde el individuo es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

15. 15.

    Kit para diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución del CCRp que comprende los oligonucleótidos que comprenden las SEO ID NO: 4 y SEO ID NO: 5, que permiten detectar y/o cuantificar el número de copias y/o el nivel de expresión del gen NOMO-1 , y/o su producto de expresión.

16. 16.

    Kit según la reivindicación 15 caracterizado por que comprende adicionalmente sondas, anticuerpos, reactivos, o cualquier combinación de los mismos.

17. 17.

    Uso in vitro del kit según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 para diagnóstico, pronóstico o seguimiento de la evolución del CCRp.