CN104520441A - 用于测定对抗癌疗法的完全反应的方法 - Google Patents
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Abstract
用于按照氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂疗法通过定量CD 133表达水平来鉴别具有结肠直肠癌的分子或完全缓解的患者的方法。还提供了用于通过定量血清CD133RNA水平来检测癌症干细胞的方法。
Description
本申请要求于2012年5月1日提交的美国临时专利申请No 61/640,789的权益,该美国临时专利申请的整体内容以引用的方式并入本文中。
发明背景
本申请与2011年10月25日发布的美国专利8,044,033有关,该美国专利的整体内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明整体上涉及分子生物学和肿瘤学领域。更具体来说,其涉及用于检测癌症干细胞和用于测定对抗癌疗法的反应的方法。
背景技术
结肠直肠癌是美国癌症相关死亡的第二大最常见原因(Jemal等人,2005)。接受用于转移性结肠直肠癌的第一线和第二线组合化学疗法的患者的基准中值总存活期目前分别是17-20个月和10-12个月(Douillard等人,2000;Goldberg等人,2004;Tournigand等人,2004;Rothenberg等人,2003;Hurwitz等人,2004;Giantonio等人,2005;Cunningham等人,2004;Diaz Rubio等人,2005)。不幸的是,五年总存活期仅仅占5-8%。
已经使用多种组合疗法来处理这种形式的癌症。将贝伐单抗(bevacizumab)或西妥昔单抗(cetuximab)与细胞毒性化学疗法组合可产生60-80%的反应率,从而使更多患者转变成手术可切除的,而非范围介于2-10%之间的总完全反应(CR)率(Hurwitz等人,2004;Diaz Rubio等人,2005;Hochster,2006)。然而,关于化学疗法的2-10%CR患者的自然史了解很少,因为大多数会在两年内复发。这些手术CR患者的自然史可能与通过化学疗法呈现的CR患者的自然史最相近。
在异种移植物模型中,与任一单独治疗形态相比,将塞来昔布(celecoxib)(XCEL)(Pfizer,New York,NY)(一种选择性COX-2抑制剂)添加到化学疗法或放射疗法中显著增加抗肿瘤功效(Cianchi等人,2001;Masferrer等人,2000;Sheng等人,1998;Milas,2003)。近年来,研究显示经受XCEL(与卡培他滨(capecitabine)组合)+/-放射疗法的66位转移性结肠直肠癌患者经历毒性降低且六十六位患者中有十九位(29%)使用单独XCEL(n=9)或XCEL和放射(n=12)出乎意料地实现CR,参见例如美国专利8,044,033。然而,仍然没有方法可以预测哪些患者在这种疗法后实现CR或确定患者中是否保留残余癌症干细胞。
发明内容
在第一实施方案中,提供一种用于治疗受试者的方法,其包括(a)选择已经接受或正在接受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法且经测定具有升高的CD133表达水平的受试者,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和环加氧酶-2(COX-2)酶抑制剂;和(b)向该受试者施用另一抗癌疗法。举例来说,在某些方面,受试者经测定在血液中具有升高的CD133表达水平。在一些方面,该CD133表达升高是CD133RNA或蛋白质表达升高。举例来说,受试者可能经测定具有当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5.、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0的CD133RNA表达水平(例如表达水平介于0.56和7.0之间)。如本文中所使用,CD133RNA表达水平是表示为相对于GAPDH mRNA对照的CD133mRNA数量(参见例如Iinuma等人,2011,其整体内容以引用的方式并入本文中)。本领域技术人员将认识到CD133水平也可以标准化为任何其它对照基因表达水平(例如看家基因)且虽然原始数值将不同,但可以从评估得到相同信息。在其它方面,经测定具有升高的CD133表达水平的受试者经测定具有大于无癌症对照受试者的表达水平的表达水平。举例来说,升高的CD133水平可以是血清CD133RNA水平,其比来自无癌症对照受试者的样品中的CD133表达水平大约2、4、6、8倍和10、20或30倍(例如比对照受试者的水平大不到约10倍)。
在另一方面,实施方案的方法进一步包括为另一抗癌疗法选择经测定相对于对照水平具有升高的癌胚抗原(CEA)、CD133、细胞角蛋白(CK)19和/或CK20表达(例如mRNA表达)的受试者。
因此,在另一个实施方案中,提供一种用于治疗受试者的方法,其包括(a)选择如下受试者:已经接受或正在接受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;且经测定具有如下CD133RNA表达水平(例如血液中):(i)当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56(例如介于0.56和7.0之间或更大)或(ii)大于来自无癌症对照的样品中的CD133RNA表达水平(例如比对照受试者大约2到10倍);和(b)向该受试者施用另一抗癌疗法。
在另一个实施方案中,提供一种检测受试者中的癌症干细胞(或检测存在癌症干细胞的风险)的方法,其包括测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133表达,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂,其中CD133表达水平升高表示受试者中存在癌症干细胞(或存在癌症干细胞的风险)。在一些方面,CD133表达升高是蛋白质或RNA表达水平升高。举例来说,实施方案的方法可以包括测定CD133RNA表达水平,其中大于约0.56(当标准化为GAPDH RNA水平时)或介于约0.56和7.0之间或更大的RNA表达水平表示受试者中存在癌症干细胞。在一些方面,介于约0.56和7.0之间或介于约0.56和6.0、5.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5或1.0之间的CD133RNA表达水平表示受试者中存在癌症干细胞。在其它方面,方法包括确定受试者是否具有大于无癌症对照受试者的血清CD133RNA(例如大约2到10倍)的血清CD133RNA水平以鉴别受试者具有癌症干细胞、处于具有癌症干细胞的生物标志物的风险中或具有癌症干细胞的生物标志物。在其它方面,实施方案的方法进一步包括测定受试者中的CEA、CK19和/或CK20表达(例如mRNA表达),其中相对于对照水平的升高的CEA、CK19和/或CK20表达表示受试者中存在癌症干细胞或受试者中存在癌症干细胞的风险增加。
在另一方面,提供一种检测受试者中的癌症干细胞的生物标志物的方法,其包括(a)测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133RNA表达,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;和(b)如果是如下情况,那么将该受试者鉴别为具有癌症干细胞的生物标志物:(i)该样品中的CD133RNA表达水平大于约0.56;或(ii)大于来自无癌症对照的样品中的CD133RNA表达水平。
在另一个实施方案中,提供一种检测受试者中的癌症干细胞的生物标志物的方法,其包括测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133表达,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂,其中升高的CD133表达水平表示受试者中存在癌症干细胞的生物标志物。在某些方面,方法进一步包括如果样品中的CD133RNA表达水平小于约0.56或小于来自无癌症对照的样品中的CD133表达水平,那么将受试者鉴别为不具有癌症干细胞的生物标志物。举例来说,在某些方面,将受试者鉴别为不具有或不具有癌症干细胞的生物标志物包括报告(例如电子或书面报告)受试者具有(或不具有)癌症干细胞的生物标志物。
在另一个实施方案中,提供一种确定受试者是否需要另一抗癌疗法的方法,其包括测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133表达,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂,其中升高的CD133表达水平表示受试者需要另一抗癌疗法。在一些方面,CD133表达升高是蛋白质或RNA表达水平升高。举例来说,实施方案的方法可以包括测定CD133RNA表达水平,其中大于约0.56或介于约0.56和7.0之间或更大的RNA表达水平表示受试者需要另一抗癌疗法。在一些方面,升高的CD133表达水平大于来自无癌症对照的样品中的CD133RNA表达水平(例如大2到10倍)。在其它方面,实施方案的方法进一步包括测定受试者中的例如CEA、CK19和/或CK20的另一生物标志物基因的表达(例如mRNA表达),其中CEA、CK19和/或CK20表达升高表示受试者需要另一抗癌疗法。
在另一个实施方案中,提供一种用于确定受试者是否需要另一抗癌疗法的方法,其包括(a)测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133RNA表达,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;和(b)如果该样品中的CD133RNA表达水平大于约0.56或大于来自无癌症对照的样品中的CD133表达水平,那么将该受试者鉴别为需要另一抗癌疗法。在其它方面,方法包括如果样品中的CD133RNA表达水平小于约0.56或小于来自无癌症对照的样品中的CD133表达水平,那么将受试者鉴别为不需要另一抗癌疗法。举例来说,在某些方面,将受试者鉴别为需要(或不需要)另一抗癌疗法包括报告(例如电子或书面报告)受试者需要(或不需要)另一抗癌疗法。
在一个相关实施方案中,提供一种用于测定受试者对抗癌疗法的完全反应的方法,其包括:(a)测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133RNA表达,该疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;和(b)如果该样品中的CD133RNA表达水平(i)当标准化为GAPDH RNA水平时小于约0.56或(ii)小于来自无癌症对照的样品中的CD133RNA表达水平,那么将该受试者鉴别为对抗癌疗法具有完全反应。
在某些方面,选择经测定具有升高的CD133、CEA、CK19和/或CK20表达水平的受试者包括测量受试者中(例如来自受试者的样品中)的CD133、CEA、CK19和/或CK20表达。在其它方面,选择受试者可以包括获得提供受试者的CD133、CEA、CK19和/或CK20表达水平的报告,例如书面或电子报告。
在某些方面,实施方案的方法包括测定受试者中的CD133、CEA、CK19和/或CK20表达水平。在一些方面,测定CD133、CEA、CK19和/或CK20蛋白质表达水平。可以用于测定该蛋白质表达的方法包括(但不限于)质谱学、适体结合分析或使用抗体的免疫检测方法(例如蛋白质印迹(Western blot)、ELISA或IHC)。在其它方面,测定CD133、CEA、CK19和/或CK20表达水平包括测定RNA表达水平。可以用于测定RNA表达水平的方法包括(但不限于)核酸杂交(例如RNA印迹(Northern blot)或阵列杂交)、核酸测序或反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。在其它方面,实施方案的方法进一步包括报告受试者的CD133表达水平(例如书面或电子报告)。在其它方面,实施方案的方法包括报告受试者的CD133、CEA、CK19和/或CK20表达水平;报告受试者是否包含癌症干细胞;或报告受试者是否对抗癌疗法具有完全反应。
在其它方面,实施方案的方法包括测定或获得受试者中除CD133以外的至少第二种基因的表达水平。在一些情况下,该第二种基因是在癌细胞中或在癌症干细胞中表达的基因。在其它方面,第二种基因是参考基因。实施方案的某些方面涉及测定或获得受试者(或来自受试者的样品中)的CD133RNA表达水平。在某些方面,CD133RNA表达水平是与参考RNA表达相比的相对表达水平。举例来说,在一些情况下,参考RNA可以是编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的RNA,参见例如以引用的方式并入本文中的NCBI登记号NM_002046。同样,其它生物标志物基因(例如CEA、CK19和/或CK20)的表达可以相对于参考基因(例如GAPDH)的表达来测定。
实施方案的某些方面涉及经测定具有升高的CD133表达的受试者。在一些方面,CD133表达升高是来自受试者的全血、血清或组织样品中的表达升高。在一些方面,实施方案的方法可以包括从受试者获得生物样品。应认识到样品可以直接从受试者获得(例如通过从受试者抽血)或可以通过第三方(例如医生或实验室)获得。在某些方面,生物样品可以是血液、血清、粪便或组织样品。在某些方面,实施方案的方法涉及评估、获得或比较来自无癌症对照受试者的样品中的CD133水平。在一些方面,无癌症受试者是从未患癌症且从未接受抗癌疗法的受试者。在其它方面,对照受试者是年龄匹配对照,例如年龄在10、5或2岁内的待评估受试者的对照。
实施方案的方面涉及已经或正在接受抗癌疗法和任选地另一抗癌疗法的受试者,该疗法包括施用氟胞苷衍生物、COX-2酶抑制剂。在一些特定方面,受试者已经或正在接受包括施用塞来昔布和卡培他滨的抗癌疗法。在某些方面,受试者已经或正在接受抗癌疗法,包括施用氟胞苷衍生物、COX-2酶抑制剂和放射疗法。在其它方面,受试者已经或正在接受包括施用塞来昔布、卡培他滨和放射的抗癌疗法。
在某些方面,实施方案的受试者是犬、猫、马、牛或人类受试者。在一些方面,受试者被诊断患有或先前被诊断患有结肠直肠癌(例如转移性结肠直肠癌)。在其它方面,受试者正在治疗或先前治疗过结肠直肠癌。举例来说,结肠直肠癌可以是转移性结肠直肠癌,例如包含结节转移(例如孤立性或群集性结节转移)的癌症。在一些方面,实施方案的受试者可以进一步定义为已经或先前已经患有卡培他滨诱发性手足综合症(hand-foot syndrome;HFS)的受试者。
在其它方面,实施方案的受试者是不包含升高的CD133表达水平(例如升高的CD133RNA表达水平)的受试者。因此,实施方案的某些方面可以包含受试者不包含癌症干细胞的报告;或受试者对抗癌疗法具有完全反应的报告。
实施方案的方面涉及涉及COX-2酶抑制剂的抗癌疗法。在某些方面,该COX-2酶抑制剂是选择性COX-2抑制剂。举例来说,在一些方面,COX-2选择性酶抑制剂可以是美洛昔康(meloxicam)、伐地昔布(valdecoxib)(BextraTM)、塞来昔布(CelebrexTM)、罗非昔布(rofecoxib)(VioxxTM)或萘普生(naproxen)(AleveTM)。虽然在一个优选实施方案中,COX-2抑制剂是塞来昔布,但预期包括除塞来昔布以外的COX-2抑制剂作为本发明的一个实施方案。在某些情况下,向受试者施用的塞来昔布的剂量可以定义为小于约200mg b.i.d、大于200mgb.i.d或约200mg b.i.d。
在某些方面,实施方案涉及涉及氟胞苷衍生物的抗癌疗法。举例来说,氟胞苷衍生物可以是衍生物5'-脱氧-5-氟胞苷衍生物或美国专利No.4,966,891中所述的衍生物,该美国专利以引用的方式并入本文中。在某些方面,氟胞苷衍生物是卡培他滨。在某些方面,卡培他滨是经口施用。举例来说,卡培他滨可以约850到约1300mg/m2/d、约900到约1250mg/m2/d的剂量或约1000mg/m2/d的剂量施用。
实施方案的某些方面涉及向受试者(例如经测定具有升高的CD133表达水平的受试者)施用另一抗癌疗法。在一些方面,另一抗癌疗法包含放射疗法、化学疗法、免疫疗法或手术。在某些方面,另一抗癌疗法是放射疗法。该放射疗法可以涉及例如向受试者施用约25到约65Gy、约35到约50Gy或约35到约45Gy放射。此外,在某些情况下,放射疗法包括3-D适形规划技术。在一些方面,另一抗癌疗法包括用氟胞苷衍生物、COX-2酶抑制剂和任选地放射疗法治疗。
如本文说明书中所使用,“一个(a/an)”可以意指一个或多个。如本文权利要求中所使用,当结合单词“包含”使用时,单词“一个”可以意指一个或多于一个。
除非明确地表示仅是指替代物或替代物是互相排斥的,否则在权利要求中使用术语“或”是用于意指“和/或”,但本公开支持仅是指替代物和“和/或”的定义。如本文中所使用,“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
在整个本申请中,术语“约”是用于表示值包括用于测定该值的装置、方法所产生的误差的固有变化或研究受试者之间存在的变化。
本发明的其它目标、特点和优点将从以下详细描述而变得显而易见。然而,应了解详细描述和特定实施例当表示本发明的优选实施方案时仅以说明方式给出,因为在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员来说将从这一详细说明而变得显而易见。
附图说明
以下图示形成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。可以通过参考这些图示中的一个或多个结合本文中呈现的特定实施方案的详细描述来更好地理解本发明。
图1:可归因于XCEL的常见不利事件(n=65)(研究1);
图2:根据疾病部位的反应率(研究1);
图3:接受XCEL作为第一线或第二线疗法的患者的卡普兰-迈耶存活期分析(Kaplan-Meier survival analysis)。曲线图说明无进展存活期(研究1);
图4:接受XCEL作为第一线或第二线疗法的患者的卡普兰-迈耶存活期分析;曲线图说明总存活期(研究1);
图5:事件图表分析(n=21)(研究2);
图6:在已切除(n=6)和未切除患者(n=13)中的完全反应持续时间(研究2);
图7:在已切除和未切除患者(n=19)中的无进展存活期和总存活期(研究2);
图8:可归因的不利事件(研究2);
图9:来自结肠直肠癌诊断的事件图表分析(研究3);
图10A-B:维持相对于不维持XCEL的RFS(图10A)和OS(图10B)(研究3);
图11:当标准化为GusB和GAPDH看家基因时的CD133mRNA拷贝数结果的比较;结果显示标准化为GusB或GAPDH提供类似结果,从而表明任何等效看家基因可以用于该标准化。
具体实施方式
I.本发明
近来已经证明化学治疗剂和COX-2抑制剂(例如塞来昔布)的组合(XCEL疗法)高度有效治疗转移性结肠直肠癌。事实上,最新研究已经显示多达29%的治疗患者可以实现CR(美国专利8,044,033)。然而,即使鉴于该等成果,仍没有预测哪些患者在该疗法后展现CR的方法。具体来说,先前没有方法能确定例如XCEL等疗法是否可有效地提供完全反应以相对于只是处于临床缓解阶段但仍然包含癌症干细胞的那些受试者来说,实现分子缓解(即,通过有效杀死可能存在于所治疗受试者中的癌症干细胞来实现)。对于疗法这是一个重大障碍,因为无法鉴别可能需要另一抗癌疗法的患者直到癌症复发。相反,已经实现分子缓解的患者可能要继续经受不需要的疗法。
本文中详述的研究证明了已经经受抗癌疗法(XCEL)的受试者中的CD133表达增加可用于确定该受试者是否对该疗法已经具有完全反应。具体来说,发现血液样品中的CD133RNA表达升高表示存在癌症干细胞。因此,通过评估经受或已经经受的患者中的CD133表达,相对于已经具有完全反应的患者可以鉴别具有残余癌症干细胞的抗癌疗法患者。具体来说,已经发现对疗法具有完全反应的患者具有小于约0.56的血清CD133RNA水平(当标准化为GAPDH mRNA水平时)。同样,与健康无癌症对照受试者相比,完全反应者展现显著低于健康对照的血清CD133RNA水平。因此,根据实施方案评估CD133RNA水平允许在发现患者仍然包含癌症干细胞的情况下进行早期其它治疗性介入。同样,可以在对疗法显示完全反应的受试者中中断抗癌疗法(和可伴随疗法的显著副作用)。
II.检测基因表达
在某些实施方案中,本文中所提供的方法涉及检测测定受试者中的基因表达。在一些方面,测定CEA、CD133、CK19和/或CK20的表达水平。举例来说,在一些实施方案中,测定CD133包括定量CD133RNA或蛋白质表达。在一些方面,定量CD133表达包括相对于参考基因测定CD133表达。本文中论述用于测定CD133表达水平的方法同样适用于测定其它生物标志物基因(例如CEA、CK19和/或CK20)的表达水平。
在临床诊断和/或监测受试者时,相较于来自未患癌症或对抗癌疗法已经具有完全反应的受试者的相应生物样品中的水平(即参考水平)检测CD133的表达增加表示受试者包含癌症干细胞(或受试者需要另一抗癌疗法)。
本领域技术人员已知任何临床诊断并不一定是基于单一分离方法进行的。因此,实施方案的方法可以包括测定或获得除CD133表达水平以外两种、三种或更多种生物标志物的表达水平或存在和/或一个或多个临床症状以诊断受试者。
A.核酸检测
在一些实施方案中,评估CD133表达可以涉及定量mRNA表达。举例来说,使RNA反转录(RT)为cDNA、随后相对定量PCRTM(RT-PCRTM)可用于测定特定mRNA(例如CD133编码RNA,例如由NCBI登记号NM_001145847.1、NM_001145848.1、NM_001145849.1、NM_001145850.1、NM_001145851.1、NM_001145852.1或NM_006017.2提供的那些RNA,其中每一个都以引用的方式并入本文中)的相对浓度。通过测定特定mRNA的浓度相对于参考RNA(例如编码对照基因的RNA,例如GAPDH)有所变化,可以表明编码特定mRNA种类的基因差异表达。在某些方面,mRNA表达可以相对于该参考mRNA的表达进行定量。举例来说,用于相对于GAPDH定量CD133mRNA表达的方法先前已经描述于Iinuma等人,2011中,其整体内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中,可以使如上文所述的扩增产物经受序列分析以使用标准序列分析技术鉴别特定种类的变化。在某些方法中,基因的详尽分析是通过使用设计成用于最佳测序的引物对的序列分析进行。本发明实施方案提供可以使用这些类型的分析中的任一种或全部的方法。使用已知序列CD133和/或参考基因,寡核苷酸引物可以设计成允许整个给定基因的序列(或蛋白质编码序列)扩增,其随后可以通过直接测序来分析。同样,DNA测序可以用于检测和/或定量CD133或其它标志物或参考基因的表达。用于该等序列的方法包括(但不限于)可逆终止子方法(例如由和BioSciences所使用的)、焦磷酸测序(例如来自Roche的454测序)和通过连接测序(例如Life TechnologiesTM SOLiDTM测序)
在PCRTM中,扩增的靶DNA的分子数目随着反应的每个循环增加接近两倍直到一些试剂变得有限。随后,扩增率变得逐渐变小直到在循环之间扩增的靶不再增加。如果绘制X轴上是循环数目且Y轴上是扩增靶DNA的浓度的log的曲线图,那么特征形状的曲线是通过连接绘制的点而形成。从第一个循环开始,直线斜率是正的且恒定的。这可以说是曲线的线性部分。在试剂变得有限后,直线斜率开始减小且最后变成零。此时,扩增的靶DNA的浓度变得渐近某一固定值。这可以说是曲线的平台部分。
在PCRTM扩增的线性部分中靶DNA的浓度与在反应开始之前靶的起始浓度成正比。通过测定已经完成相同循环数目且在其线性范围内的PCRTM反应中靶DNA的扩增产物的浓度,可以测定原始DNA混合物中特定靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是由从不同组织或细胞分离的RNA合成的cDNA,那么可以对于各组织或细胞测定靶序列所来源的特定mRNA的相对丰度。PCRTM产物的浓度和相对mRNA丰度之间的这一正比仅在PCRTM反应的线性范围内是正确的。
在曲线的平台期部分中靶DNA的最终浓度是通过反应混合物中试剂的可用性来测定的并且与靶DNA的原始浓度无关。因此,在对于RNA群体来说可以通过RT-PCRTM测定mRNA种类的相对丰度之前必须满足的第一个条件是当PCRTM反应是处于其曲线的线性部分中时必须对扩增的PCRTM产物的浓度进行取样。
对于RT-PCRTM实验来说必须满足以成功测定特定mRNA种类的相对丰度的第二个条件是可扩增cDNA的相对浓度必须标准化为某一独立标准物。RT-PCRTM实验的目标是相对于样品中所有mRNA种类的平均丰度测定特定mRNA种类的丰度。
用于竞争性PCRTM的大多数方案利用大约与靶一样丰富的内部PCRTM标准物。如果在其线性阶段期间对PCRTM扩增的产物进行取样,那么这些策略是有效的。如果当反应接近平台期阶段时对产物取样,那么丰度较小的产物变得相对过量存在。许多不同RNA样品的相对丰度的比较(例如针对差异表达检查RNA样品时的情况)变得以使得RNA的相对丰度的差异显得小于其实际情况的方式改变。如果内部标准物比靶更丰富,那么这不是一个重要问题。如果内部标准物比靶更丰富,那么可以在RNA样品之间进行直接线性比较。
用于检测RNA表达的RNA印迹技术也为本领域技术人员所熟知。RNA印迹涉及使用RNA作为靶。简单地说,使用探针靶向已经固定于合适的基质(经常是硝化纤维滤膜)上的RNA种类。不同种类应在空间上进行分隔以有助于分析。这经常伴随进行核酸种类的凝胶电泳,随后“印迹”到滤膜上。随后,将所印迹的靶与探针(例如经标记探针)在促进变性和再杂交的条件下一起孵育。因为该探针是设计成与靶进行碱基配对,所以探针将在复性条件下结合靶序列的一部分。然后除去未结合的探针,且完成检测。
在一些实施方案中,在凝胶分离和用溴化乙锭染色以及在UV光下目测后定量核酸。在一些实施方案中,如果核酸由使用整体放射或荧光标记的核苷酸合成或扩增来产生,那么随后在分离后可以使产物暴露于x射线膜或在适当刺激光谱下目测。
在一些实施方案中,间接实现目测。在分离核酸后,使经标记的核酸与靶序列接触。使探针缀合于发色团或放射性同位素。在另一个实施方案中,使探针缀合于结合配偶体,例如抗体或生物素,且结合对的另一成员带有可检测部分。上述情况的一个实例描述于以引用的方式并入本文中的美国专利No.5,279,721中,其公开用于自动电泳和转移核酸的设备和方法。该设备允许电泳和印迹而对凝胶无外部操作且理想地适合于进行根据本发明实施方案的方法。
B.蛋白质的检测
在一些方面,实施方案的方法涉及检测CD133蛋白质的表达。举例来说,可以使用用于结合、纯化、除去、定量和/或另外一般检测蛋白质组分(例如CD133)的免疫检测方法。根据本发明实施方案制备的抗体可以用于检测CD133。一些免疫检测方法包括(列举几种)酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射测定分析、荧光免疫分析、化学发光分析、生物发光分析和蛋白质印迹。多种适用免疫检测方法的步骤已经描述于科学文献中,例如Doolittle和Ben-Zeev,1999;Gulbis和Galand,1993;De Jager等人,1993;和Nakamura等人,1987,每一篇以引用的方式并入本文中。
一般来说,免疫结合方法包括获得怀疑含有CD133蛋白质、多肽和/或肽的样品,并且根据本发明实施方案使该样品与第一抗CD133抗体在有效允许形成免疫复合物的条件下接触。该抗体将优选地连接于固体载体,例如以列矩阵形式,且含有生物标志物蛋白质抗原组分的样品将施加到该固定抗体中。将从管柱洗涤出不需要的组分,留下与固定抗体免疫复合的抗原,然后通过从管柱除去蛋白质和/或肽来收集生物标志物蛋白质抗原。
免疫结合方法还包括用于检测和定量样品中的CD133的量的方法。本文中,将获得样品且使该样品与抗体接触,然后检测和定量在特定条件下形成的免疫复合物的量。
依据抗原检测,所分析的生物样品可以是怀疑含有表达CD133的细胞的任何样品,例如血清或全血样品、组织提取物或另一种生物流体。
在足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的有效条件和一段时间下使所选生物样品与抗体接触一般就是将抗体组合物简单地添加到样品中并且孵育混合物足够长以使抗体与(即结合于)存在的任何CD133蛋白质抗原形成免疫复合物的一段时间。此后,一般将洗涤样品-抗体组合物(例如组织切片、ELISA培养板、斑点印迹或蛋白质印迹)以除去任何非特异性结合抗体种类,从而仅允许那些特异性结合于初级免疫复合物内的抗体被检测到。
一般来说,免疫复合物形成的检测在本领域中是众所周知的并且可以通过应用许多方法来实现。这些方法一般是基于标记或标志物的检测,例如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任一种。涉及此类标记的用途的美国专利包括3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149和4,366,241,其中的每一个以引用的方式并入本文中。当然,如本领域中所已知,通过使用次级结合配体(例如第二抗体)和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合配置可能会发现额外优点。
在一些实施方案中,用于检测的CD133抗体(例如抗CD133抗体)自身可连接于可检测标记,其中随后将简单地检测这一标记,从而允许组合物中初级免疫复合物的量被测定出。在一些实施方案中,变得结合于初级免疫复合物内的第一抗体可以借助于对于该抗体具有结合亲和性的第二结合配体来检测。在某些实施方案中,第二结合配体可以连接于可检测标记。第二结合配体自身经常是抗体,其因此可以被称为“次级”抗体。在足以允许形成次级免疫复合物的有效条件和一段时间下使初级免疫复合物与经标记的次级结合配体或抗体接触。随后一般洗涤次级免疫复合物以除去任何非特异性结合的经标记的次级抗体或配体,且随后检测次级免疫复合物中的残余标记。
其它方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上文所述,将对于抗体具有结合亲和性的第二结合配体(例如抗体)用于形成次级免疫复合物。洗涤后,再次在足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的有效条件和一段时间下,使次级免疫复合物与对于第二抗体具有结合亲和性的第三结合配体或抗体接触。该第三配体或抗体连接于可检测标记,从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。如果需要的话,这种系统可以提供信号放大。
一种免疫检测方法使用两种不同抗体。使用第一步骤生物素化单克隆或多克隆抗体检测靶抗原,然后使用第二步骤抗体检测连接于复合生物素的生物素。在那种方法中,首先将待测试的样品在含有第一步骤抗体的溶液中孵育。如果靶抗原存在,那么一些抗体结合于该抗原以形成生物素化抗体/抗原复合物。随后通过在抗生蛋白链菌素(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA和/或补充生物素化DNA的连续溶液中孵育来扩增抗体/抗原复合物,其中每一步骤将额外生物素位点添加到抗体/抗原复合物中。重复扩增步骤直到实现合适的扩增水平,此时将样品在含有针对生物素的第二步骤抗体的溶液中孵育。这种第二步骤抗体例如经可用于通过组织酶学使用色原底物检测抗体/抗原复合物的存在的酶标记。在合适的扩增下,可以产生肉眼可见的缀合物。
另一已知的免疫检测方法利用免疫-PCR方法。PCRTM方法直到与生物素化DNA一起孵育为止是类似于康托尔法(Cantor method),然而,用释放抗体的低pH值或高盐缓冲液洗涤出DNA/生物素/抗生蛋白链菌素/抗体复合物,以替代使用多轮抗生蛋白链菌素和生物素化DNA孵育。然后使用所得洗液用合适的引物和适当对照进行PCRTM反应。至少理论上,可以利用PCRTM的巨大扩增能力和特异性来检测单一抗原分子。
本发明实施方案的免疫检测方法在诊断和预后例如多种形式的发炎性疾病(例如KD)的病状中具有明显效用。本文中,使用怀疑含有CD133生物标志物蛋白质、多肽、肽和/或突变体的生物和/或临床样品。然而,这些实施方案也适用于非临床样品,例如在滴定抗原或抗体样品时,例如在鉴别发炎细胞介体时。
III.抗癌疗法
如上文所详述,实施方案的某些方面涉及抗癌疗法的用途。举例来说,在一些方面,在用使用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂的方案治疗后选择受试者来施用另一抗癌疗法。在一些情况下,该另一抗癌疗法可以是用氟胞苷衍生物(例如卡培他滨)和COX-2酶抑制剂(例如塞来昔布)进一步治疗。在其它方面,另一疗法可以是用化学疗法、放射线疗法、免疫疗法、基因疗法、手术疗法或其组合治疗。
A.化学疗法
在某些实施方案中,受试者可以用另一化学治疗剂治疗。化学治疗剂的实例包括(但不限于)烷化剂,例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide);磺酸烷基酯,例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa);乙烯亚胺和曱基蜜胺(methylamelamine),包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基亚胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine);多聚乙酰(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone));喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);卡利斯达汀(callystatin);CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin))、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素(尤其是隐藻素1和隐藻素8);海兔毒素(dolastatin);倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1);艾植塞洛素(eleutherobin);水鬼蕉碱(pancratistatin);匍枝珊蝴醇(sarcodictyin);海绵抑素(spongistatin);氮芥,例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲,例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素,例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γII和加利车霉素ωII;达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A;双磷酸盐,例如氯膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯代阿霉素和脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)例如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物,例如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,例如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素,例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺,例如米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,例如亚叶酸;醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸;恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);倍思塔布(bestrabucil);比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);得弗伐胺(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);埃夫密辛(elformithine);乙酸依利醋铵(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟基脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);罗尼达宁(lonidainine);类美登素(maytansinoid),例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);丙脒腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫比达摩(mopidanmol);硝拉维林(nitraerine);喷司他丁(pentostatin);凡那明(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖复合物;雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三乙撑亚胺苯醌(triaziquone);2,2',2″-三氯三乙胺;单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、弗纳库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和胺癸盯(anguidine);氨基甲酸乙酯(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);(pipobroman);哌泊溴烷(gacytosine);阿糖胞苷(“Ara-C”);环磷酰胺;紫杉烷(taxoid),例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel)吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;铂配位络合物,例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin);长春碱(vinblastine);铂;依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌;长春新碱(vincristine);长春瑞滨(vinorelbine);诺凡特龙(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);柔红霉素(daunomycin);氨基喋呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸,例如视黄酸;卡培他滨(capecitabine);卡铂(carboplatin)、普鲁苄肼(procarbazine)、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、诺维本(navelbine)、法尼基蛋白质转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
B.放射疗法
在本发明的某些优选实施方案中,塞来昔布和卡倍他滨可以用于使细胞对放射疗法致敏。放射疗法可以包括例如γ射线、X射线和/或将放射性同位素直接递送到肿瘤细胞。在某些情况下,根据本发明的方法也可以使用微波和/或UV照射。X射线的剂量范围在长时间(3到4周)50到200伦琴的日剂量到2000到6000的单次剂量伦琴范围内。放射性同位素的剂量范围变化广泛,且取决于同位素的半衰期、所发出的放射的强度和类型和赘生性细胞的摄取。
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时在本文中用于描述将治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送到靶细胞中或与靶细胞直接并置的过程。为了实现细胞杀死或停滞,将两种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送到细胞中。
C.抗激素药剂
在某些方面,另一抗癌疗法是抗激素疗法,其用于调控或抑制激素对肿瘤的作用,例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括例如他莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene);抑制芳香酶的芳香酶抑制剂,其调控肾上腺中的雌激素产生,例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole);和抗雄激素,例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,尤其是那些抑制异常细胞增殖所涉及的信号传导通道中的基因表达的反义寡核苷酸,例如PKC-α、Ralf和H-Ras;核糖酶,例如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂;疫苗,例如基因疗法疫苗和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
D.免疫疗法药剂
在一些中,另一抗癌疗法是免疫疗法。免疫治疗剂一般依靠使用免疫效应细胞和分子靶向并破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对于肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。抗体单独可以用作疗法的效应物或其可以募集其它细胞以实际上实现细胞杀死。抗体也可以缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅用作靶向剂。可选地,效应物可以是带有直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在一些实施方案中,免疫疗法可以包括向患者施用一种或多种肿瘤抗原(例如癌症疫苗)或使患者的免疫细胞暴露于癌症抗原(例如自体细胞免疫疗法)。可用于治疗性方法中的抗原包括(但不限于)前列腺酸磷酸酶(PAP)、MUC1、HER2/neu、5T4(例如从牛痘病毒载体表达的5T4)和整个杀死的癌细胞。
一般来说,肿瘤细胞必须带有适于靶向的某一种标志物,即不存在于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标志物且这些肿瘤标志物中的任一种在本发明文中可以适于靶向。常见肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿器肿瘤相关抗原、胚胎性抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯寡糖抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。
E.基因疗法
在一些实施方案中,另一抗癌疗法是基因疗法(例如治疗性多核苷酸组合物)。用于表达基因产物的病毒载体在本领域中是众所周知的,且包括真核表达系统,例如腺病毒、腺病毒相关病毒、反转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒(包括牛痘病毒)和人乳头状瘤病毒(包括SV40)。可选地,施用表达构建体可以用基于脂质的载体(例如脂质体或DOTAP:胆固醇小泡)来完成。所有这些方法在本领域中都是众所周知(参见例如Sambrook等人,1989;Ausubel等人,1998;Ausubel,1996)。
递送编码以下基因产物之一的载体将对靶组织具有组合的抗过度增生作用。
E.手术疗法
在一些方面,另一抗癌疗法是手术疗法(例如在手术切除术肿瘤之前或期间)。约60%患癌症的人将经受某一类型的手术,其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和减轻性手术。洽愈性手术是可以结合其它疗法的癌症治疗使用,例如本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代性疗法。
洽愈性手术包括切除术,其中从身体上除去、割去和/或破坏癌性组织的全部或一部分。肿瘤切除术是指从身体上除去肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除术以外,通过手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微镜控制手术(莫氏手术(Mohs'surgery))。另外预期本发明可以结合除去浅表癌、癌前期或次要量的正常组织使用。
在切除部分或所有癌细胞、组织或肿瘤时,可能会在身体内形成空腔。可以通过用另一抗癌疗法对区域进行灌注、直接注射或局部施用来完成治疗。可以重复该治疗,例如每1、2、3、4、5、6或7天一次,或每1、2、3、4和5周一次,或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月一次。这些治疗也可以具有不同剂量。
F.其它治疗剂
在一些实施方案中,其它抗癌疗法包括施用另一药剂,例如消炎剂。消炎剂在本文中定义成是指已知或怀疑在治疗或预防受试者的发炎时有益的药剂。皮质类固醇是一类主要消炎剂。皮质类固醇可以是短效、中效或长效的,并且可以各种方法递送。本发明中所涵盖的皮质类固醇的非限制性清单包括口服皮质类固醇,例如:可的松(cortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、强的松(prednisone)和地塞米松(dexamethasone)。
另一类主要消炎剂是非类固醇消炎剂。非类固醇消炎剂包括一类用于治疗发炎和疼痛的药物。这一类药物的准确作用方式是未知的。这一类药剂的成员的实例包括(但不限于)布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、吡罗昔康(piroxicam)、萘普生、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、依托度酸(etodolac)、氟灭酸(flufenamic acid)、二氟苯水杨酸(diflunisal)、奥沙普秦(oxaprozin)、罗非昔布和塞来昔布。本领域技术人员将熟悉这些药剂。这个种类中包括水杨酸盐和水杨酸盐的衍生物,例如乙酰水杨酸、水杨酸钠、胆碱水杨酸盐、胆碱水杨酸镁和二氟苯水杨酸。
其它消炎剂包括抗风湿病药剂,例如金盐(例如硫代苹果酸金钠(gold sodium thiomalate)、金硫代葡萄糖(aurothioglucose)和金诺芬(auranofin))、抗风湿病药剂(例如氯奎(chloroquine)、羟氯奎(hydroxychloroquine)和青霉胺(penicillamine))、抗组胺剂(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯芬胺(chlorpheniramine)、氯马斯汀(clemastine)、羟嗪和曲普利啶(triprolidine))和免疫抑制剂(例如甲氨喋呤、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、环孢素和咪唑硫嘌呤)。本发明所涵盖的其它免疫抑制剂是他克莫司(tacrolimus)和依维莫司(everolimus)。他克莫司抑制干扰与T细胞活化相关的白细胞介素-2产生,抑制细胞毒性T细胞的分化和增殖。如今,其是世界公认的免疫抑制剂疗法的基础。本领域技术人员将熟悉这些药剂,和这一类药剂的其它成员,以及这些药剂的作用机制和关于使用这些药剂的指示。
预期其它药剂可以用作其它抗癌疗法或与本发明实施方案组合。这些其它药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体上调和GAP连接的药剂、细胞抑制和分化剂、细胞粘着抑制剂或增加过度增生细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子;干扰素α、β和γ;IL-2和其它细胞因子;F42K和其它细胞因子类似物;或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。另外预期细胞表面受体或其配体(例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL)的上调将通过对过度增生细胞形成自分泌或旁分泌作用而加强本发明的细胞凋亡诱导能力。通过提高GAP连接数目来增加细胞间信号传导将增加对相邻过度增生细胞群体的抗过度增生作用。在其它实施方案中,细胞抑制或分化剂可与本发明组合用于改善治疗的抗过度增生功效。预期细胞粘着抑制剂改善本发明的功效。细胞粘着抑制剂的实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛弗斯特丁(Lovastatin)。另外预期增加过度增生细胞对细胞凋亡的敏感性的其它药剂(例如抗体c225)可与本发明组合用于改善治疗功效。
IV.治疗性施用
在一些实施方案中,向患者施用有效量的抗癌剂或其组合(例如塞来昔布和卡倍他滨)。如本文中所使用,术语“有效量”是定义为导致当单独施用或与另一细胞毒性疗法组合时施用其的患者的生理变化所必需的本发明的塞来昔布和/或卡倍他滨的量。如本文中所使用,术语“治疗有效量”是定义为消除、减少、延缓或最小化疾病的副作用(例如癌症或HFS)的塞来昔布和卡倍他滨的量。本领域技术人员容易认识到在很多情况下,本发明的方法可能不会提供治愈,而是仅可能提供部分益处,例如减轻或改善至少一种症状。在一些实施方案中,具有一些益处的生理变化也被视为治疗有益的。另外应清楚治疗有效量可取决于包括同时或依序施用其它治疗性方案。因此,应了解在某些实施方案中,物理变化可以使得第二治疗性治疗有效性增强。
举例来说,塞来昔布和卡倍他滨可以自身或以药物组合物的形式向受试者施用以治疗癌症。药物组合物可以常规方式使用有助于将蛋白质加工成在药学上可以使用的制剂的一种或多种生理上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂来配制。适当配制是取决于所选施用途径。
在一些方面,本发明的方法涉及全身制剂,包括那些设计成用于通过注射(例如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射)施用的制剂,以及那些设计成用于经皮、经粘液、吸入、经口或经肺施用的制剂。在最优选实施方案中,塞来昔布和卡倍他滨是通过经口施用来递送。
关于注射,可以将本发明的蛋白质配制在水性溶液中,优选地在生理上相容的缓冲液中,例如汉氏溶液(Hanks'solution)、任氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂,例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
可选地,蛋白质可以呈粉末形式以在使用之前用合适的媒介物(例如无菌的无热原水)复原。
A.有效剂量
实施方案的抗癌疗法(例如塞来昔布和卡倍他滨)一般将以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病病状,本发明的分子或其药物组合物是以治疗有效量施用或应用。治疗有效量是有效改善或预防所治疗患者的症状或延长其存活期的量。治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内,尤其根据本文中所提供的详细公开内容。
对于全身施用,治疗有效剂量可以最初从体外分析来估计。举例来说,剂量可以在动物模型中配制以实现循环浓度范围,包括如在细胞培养所测定的IC50。该信息可用于更精确地测定适用于人类的剂量。
初始剂量也可以使用在本领域中众所周知的技术从体内数据(例如动物模型)来估计。本领域技术人员可以容易地基于动物数据优化对人类的施用。
剂量和时间间隔可以个别调整以提供足以维持治疗作用的分子的血浆水平。用于通过注射施用的常用患者剂量在每天约0.1到5mg/kg、优选地每天约0.5到1mg/kg的范围内。治疗有效血清水平可以通过每天施用多次剂量来实现。
在局部施用或选择吸收的情况下,蛋白质的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效局部剂量而无需过度实验。
当然,施用分子的量将取决于所治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重程度、施用方式和主治医生的判断。
当可检测到症状或即使当其不可检测到时,可以间歇地重复疗法。疗法可以单独提供或与其它药物组合提供。
B.毒性
优选地,抗癌疗法(例如塞来昔布/卡倍他滨组合疗法)的治疗有效剂量将提供治疗益处而不会引起明显毒性。
本文中所述的分子的毒性可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定,例如通过测定LD50(群体50%的致死剂量)或LD100(群体100%的致命剂量)。有毒和治疗作用之间的剂量比是治疗指数。展现高治疗指数的蛋白质是优选的。从这些细胞培养分析和动物研究获得的数据可用于配制无毒性以用于人类的剂量范围。本文中所述的蛋白质的剂量优选地在循环浓度范围内,包括具有极小毒性或无毒性的有效剂量。剂量可以在这一范围内变化,取决于所用剂型和所用施用途径。精确配制、施用途径和剂量可以通过个别医生鉴于患者病状来选择。(参见例如Fingl等人,1975)。
C.药物制剂
本发明的药物组合物可以包含溶解或分散于药学上可接受的载剂中的有效量的抗癌剂或其组合(例如塞来昔布和卡倍他滨)。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当酌情施用于动物(例如人类)时不会产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。药物组合物的制备将根据本公开而为本领域技术人员所已知,如以引用的方式并入本文中的Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990所示例。此外,对于动物(例如人类)施用,应了解制剂将满足如FDA生物标准办公室所需的无菌、致热、一般安全性和纯度标准。
如本文中所使用,如本领域技术人员所已知的,“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、这类类似材料和其组合(参加例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,第1289-1329页,其以引用的方式并入本文中)。除非任何常规载剂与活性成分不相容,否则预期将其用于治疗或药物组合物中。
本发明的组合物可以包含不同类型的载剂,这取决于其是以固体、液体还是气溶胶形式施用,和其是否需要无菌以用于例如注射的施用途径。本发明可以通过以下方式施用:静脉内,皮内,动脉内,腹膜内,病灶内,颅内,关节内,前列腺内,胸膜内,气管内,鼻内,玻璃体内,阴道内,直肠内,表面,肿瘤内,肌肉内,腹膜内,皮下,结膜下,血管内,粘膜内,心包内,脐内,眼内,经口,表面,局部,吸入(例如气溶胶吸入),注射,输注,连续输注,直接、经由导管、经由灌洗、以软膏形式、以脂质组合物(例如脂质体)形式沐浴靶细胞的局部灌注,或通过其它方法或上述方法的任何组合,如本领域技术人员所已知(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,其以引用的方式并入本文中)。
向动物患者施用的本发明的组合物的实际剂量可以通过身体和生理学因素来测定,例如体重、病灶的严重程度、所治疗的疾病类型、先前或同时的治疗性介入、患者的特发病和施用途径。负责施用的开业医生将会在任何情况下测定组合物中的活性成分的浓度和用于个别受试者的适当剂量。
在某些实施方案中,药物组合物可以包含例如至少约0.1%的活性化合物。在其它实施方案中,活性化合物可以占单位重量的约2%到约75%或例如约25%到约60%,和从其中可得到的任何范围。在其它非限制性实例中,剂量也可以包含约5mg/kg/体重到约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重到约500毫克/kg/体重等,可以基于如上文所述的数量来施用。
在任何情况下,组合物可以包含多种抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。另外,防止微生物的作用可以通过防腐剂来实现,例如多种抗菌剂和抗真菌剂,包括(但不限于)对羟苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
在根据本发明的组合物以液体形式提供的实施方案中,载剂可以是溶剂或分散介质,包含(但不限于)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如甘油三酯、植物油、脂质体)和其组合。可以维持适当的流动性,例如通过使用包衣,例如卵磷脂;通过分散于载剂(例如液体多元醇或脂质)中来维持所需粒径;通过使用表面活性剂,例如羟丙基纤维素;或此类方法的组合。在许多情况下,其将优选包括等张剂,例如糖、氯化钠或其组合。
无菌可注射溶液是通过视需要将所需量的活性化合物与以上所列举的多种其它成分合并在适当溶剂中,随后过滤灭菌来制备。一般来说,分散液是通过将多种无菌活性成分合并到含有基础分散介质和/或其它成分的无菌媒介物中而制备的。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下,优选制备方法是真空干燥或冻干技术,其由其先前无菌过滤的液体介质产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。必要时,液体介质应适当地经过缓冲,且在注射之前首先用足够生理盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。还涵盖用于直接注射的高度浓缩组合物的制备,其中使用DMSO作为溶剂导致极快的渗透,从而将高浓度的活化剂递送到小区域中。
组合物必须在制造和贮存条件下是稳定的,并且防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。应了解内毒素污染应在安全水平下保持最低程度,例如小于0.5ng/mg蛋白质。
在特定实施方案中,可注射组合物的长时间吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)来实现。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解,以下实施例中所公开的技术表示发明者所发现的技术在本发明的实践中发挥良好作用,且因此可以被认为构成用于其实践的优选方式。然而,根据本公开,本领域技术人员应了解,可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在所公开的特定实施方案中进行许多改变且仍然获得同样或类似结果。
实施例1
研究1的材料和方法
患者
得克萨斯大学(University of Texas)M.D.Anderson癌症中心的机构审查委员会批准了这一回顾性扩展群组研究。在2000年10月和2003年12月之间,七十四位转移性结肠直肠癌患者接受了卡培他滨和同时接受了塞来昔布(n=66)或罗非昔布(n=2)、布洛芬(n=2)、舒林酸(n=2)和大剂量阿司匹林(aspirin)(n=2)。这项研究分析了接受卡培他滨和塞来昔布(XCEL)的六十六位患者。
治疗
除了以1250mg/m2/d b.i.d开始的四位患者和以900mg/m2/d b.i.d开始的六位老年患者,未接受同时放射疗法的患者经口接受每天两次(b.i.d)1000mg/m2/d剂量的卡培他滨,每21天持续14天。接受放射疗法的所有34位患者都接受了1000mg/m2/d b.i.d的卡培他滨。在放射期间的周一到周五且继续1000mg/m2/d b.i.d.的卡培他滨,每21天持续14天。以3-D适形规划技术使用18MV光子将放射递送到靶区域。放射剂量是35-40Gy(n=18)或>45Gy(n=15),其中一位患者缺少放射剂量。所有66位患者都接受了连续口服塞来昔布200mg b.i.d,其中一个目标是减轻卡培他滨诱发性HFS;而所有患者都具有与肿瘤(n=37)或肌骨胳系统(n=29)有关的疼痛。十五位患者需要其它阿片类物质。在这一研究期间无患者接受吡哆醇,有反应的患者(那些癌胚抗原(CEA)水平下降、疼痛控制改善或肿瘤大小稳定或减小的患者)继续XCEL直到其经历完全缓解、疾病进展或无法忍受的副作用。所有患者都经历由放射和/或塞来昔布引起的疼痛减轻,但未在所有患者中进行形式上的疼痛评分。塞来昔布与卡培他滨一起继续防止HFS并改善存活期。在对单独XCEL或XCEL和放射起反应后,在肿瘤变得相当大后,六位患者以治愈目的对其肿瘤进行了切除且四位患者在术后服用XCEL;两位患者进行了射频消融术且一位患者对原发性结肠进行了减轻性切除。
评估和定义
使所有患者经受常规临床检查、实验室分析和计算机断层分析。如果原地治疗,则在放射疗法期间每周检查患者,或每6-9周随身体检查、实验室测试和计算机断层分析而检查患者。使用国家卫生研究院(National Institutes of Health)的常见毒性标准(Common ToxicitiesCriteria;CTC)2.0版来对治疗相关毒性进行分级。使用RECIST标准评估肿瘤反应。完全反应是定义为可测量或可评估疾病的完全影像学消失或稳定的最小影像学发现;部分反应是定义为可测量疾病的最长尺寸减小至少50%;稳定疾病是定义为最长尺寸减小不到25%;这些反应或稳定必须至少通过3个月时间间隔评估来证实;进行性疾病是定义为肿瘤的最长尺寸生长超过25%或发展新病变。总反应率是定义为完全和部分反应率的总和且肿瘤控制率是定义为总反应率与稳定疾病率的总和。死亡日期是通过癌症登记或通过在社会保障死亡索引(Social Security Death Index)(ssdi.genealogy.rootsweb.com)中搜索患者社会保障号来确定。数据收集的截止点是2004年4月。
统计分析
连续变量是使用平均值(±标准偏差)或中值(范围)来概括。使用威尔科克森秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)对患者亚组(放射、手术、高或低乳酸脱氢酶(LDH)和高或低CEA)的这些变量进行比较。分类变量概括于频率表中。视情况使用卡方检验(chi-square test)或费雪精确检验(Fisher's exact test)对这些变量的重要亚组进行比较。无进展存活期是定义为从开始XCEL疗法到疾病进展或任何原因引起的死亡的时间。总存活期是定义为从开始XCEL疗法到任何原因引起的死亡的时间。如果患者未有进展或死亡,那么在最后随访日检查患者。使用Kaplan和Meier的方法概括无进展和总存活期分布。使用时序检验(log-rank test)分析亚组的无进展和总存活期差异。使用比例风险(Cox)回归模型评估无进展存活期和总存活期的预测值的多变量模型。P<0.05被视为统计上显著的。
实施例2
组合疗法的作用(研究1)
患者的基线临床和治疗特征概括在表1中。接受第一线XCEL的24位患者的中值年龄是73岁(范围是45-86岁),且7位患者是78岁或78岁以上。在接受XCEL作为第二线疗法的42患者中,9位仍然对第一线治疗有反应或对基于伊立替康的治疗敏感,其余33位患者的疾病在第一线治疗期间有进展。接受放射的34位患者中有二十四位(71%)先前接受第一线化学疗法。
表1
基线患者、疾病和治疗特征(n=21)
毒性
XCEL治疗的中值持续时间是7.2个月(范围是1.5-38个月)。对于图1中所概括的除一位以外的患者(n=65)都会得到不良事件。中断XCEL的最常见原因是进行性疾病(n=46)。最常见毒性是所有级别(56%)的淋巴球减少症,其中24%是3/4级淋巴球减少症。1、2和3级HFS的发病率分别是14%、15%和2%且到HFS发作和峰值的中值时间分别是3.8个月(n=17)和6.0个月(n=12)。百分之九十的2/3级HFS发生在6个月以后。在14到32个月的XCEL后3位患者出现轻微血清肌酸酐升高(1.6-2.0mg/dL),这在中断塞来昔布后是可逆的。塞来昔布也因2级皮疹(n=1)和2级焦虑(n=3)而中断。一位56岁男性在第3和4个XCEL循环时大概因为体位性低血压而经历两次晕厥事件。注意到无胃肠出血、其它心血管或死亡。
反应率
在66位患者中,13位(20%)实现完全反应(CR),12位(18%)实现部分反应(PR),且25位(38%)具有稳定疾病(SD),产生38%的总反应率(95%CI,26-51%)和76%的肿瘤控制率(95%CI,60-83%)。在使用第一线XCEL的24位患者中,4位(17%)实现CR,其中总反应率为34%(95%CI,16-55%)和肿瘤控制率为84%(95%CI,63-95%)。在使用5FU和伊立替康后有进展且接受第二线XCEL的28位患者中,2位(7%)实现CR,其中总反应率为25%(95%CI,11-45%)和肿瘤控制率为68%(95%CI,45-80%)。当包括所有9位第一线伊立替康反应者时,第二线总反应率是40.5%(95%CI,27-53%)。接受第一线XCEL的患者或在对基于伊立替康的疗法产生第一线反应后显著出现完全反应,其中9位患者中有7位实现完全反应加上一位接近完全反应(表2和表3)。完全反应的最常见部位是结节转移(51%),随后是腹膜(40%)。对于具有广泛多内脏转移的患者观察到无CR,但在除骨骼和骨盆转移以外的所有部位都可见部分反应(图2)。在以治愈目的进行手术的六位患者中,在单独XCEL(n=2)或XCEL和放射(n=4)情况下,一位具有病理学CR,4位具有PR且1位具有SD。
表3.使用或不使用放射的第一线或第二线XCEL反应
存活期分析
无进展存活期(PFS)和总存活期(OS)的多变量分析的结果概括于表4中。中值PFS对于第一线XCEL是8.3个月(95%CI,7.1-16.8个月),而对于第二线伊立替康难治组是6.7个月(95%CI,4.0-11.9个月)(图3)。中值总存活期对于第一线XCEL是26.9个月(95%CI,18.0个月-未到达终点[NR]),而对于第二线伊立替康难治是17.8个月(95%CI,14.7-31.5个月)(图4)。当包括9位第一线反应患者时,中值无进展和中值总存活期分别是8.3(5.4-14.5)个月和19.3个月(95%CI,16.2-31.5)。在接受XCEL和放射物(>45Gy)的患者中21.2个月的中值PFS未导致中值OS延长(P=0.75),而患者子集的中值PFS和OS也未到达。具有正常CEA水平(P=0.02)和正常LDH水平(P<0.0001)的患者的有利中值PFS导致具有正常LDH(P=0.005)的患者的OS得到改善;在进行手术和射频消融术的患者中也注意到OS的改善(P=0.003)。
表4.接受使用或不使用放射的XCEL的患者的时间事件分析*
讨论
与使用卡培他滨单一疗法的历史对照相比,使用放射的XCEL导致远远优越的完全反应率、中值无进展存活期和中值总存活期。这些发现也有利地类似于转移性结肠直肠癌的第一线和第二线治疗中的组合化学疗法,但进行交叉研究比较中存在许多警告(表5)。目前研究发现受其回顾性设计和小样品大小,和混淆塞来昔布在反应率分析而非毒性中的作用的放射使用限制;但是,患者的肿瘤特征类似于其它研究且在呈现正常LDH水平的37位患者(56%)中实现31个月的中值总存活期(与高度选择的手术系列相容的发现)。29此外,已经接受所有三种药剂5-FU、伊立替康和奥沙利铂的患者中仅18位患者(28%),因为超过70%的患者从奥沙利铂在美国不可用的时期起接受XCEL。基于绘制已经接受5FU、伊立替康和奥沙利铂的患者的百分比与中值存活期的格罗斯模型(Grothey's model),中值总存活期计划是14个月,从而暗示了XCEL的持久抗肿瘤活性(Grothey等人,2004)。
表5.XCEL与其它第一线和第二线疗法的交叉研究比较
放射在历史上被视为用于转移性结肠直肠癌患者的减轻工具,但却是用于局部晚期直肠癌患者的治疗的支柱,在该等患者中在同时输注5FU或卡培他滨的情况下已经观察到20-30%的完全病理学反应(Dawson等人,2000;Janjan等人,2000;Lin等人,2005)。逐步升高剂量的放射和同时肝动脉输注氟脱氧尿苷是与增加的反应率(包括完全反应)和仅具有肝转移的患者的存活期有关(Ben-Josef等人,2005)。该研究和其它研究可能会预示化学放射超越在所选转移性结肠直肠癌患者的治疗中的减轻作用的趋势,尤其是鉴于十九位(29%)完全反应。完全反应的详细临床和肿瘤特征将在另一报告中讨论。在异种移植物胰腺肿瘤模型中卡培他滨、塞来昔布和放射三型治疗在被遮挡和被照射的肿瘤中产生协同的抗肿瘤作用,从而表明在目前研究中也观察到远距离作用(Blanquicett等人,2005)。相比之下,组合高剂量罗非昔布和快速推注5-FU和甲酰四氢叶酸或组合塞来昔布和卡培他滨、伊立替康的II期研究发现转移性结肠直肠癌患者未增加抗肿瘤活性(Becerra等人,2003;El-Rayes等人,2005)。
控制在1000mg/m2/d bid的卡培他滨剂量的早期研究指示XCEL与相较于单独卡培他滨(p=0.037)较低的2/3级HFS发病率(12.5%相对于34.2%)和减少的3/4级腹泻相关(Lin等人,2002)。在这一具有比较久的随附的扩大研究中,XCEL产生17%的2/3级HFS,其中90%是发生在6个月以后且中值HFS发作和峰值分别发生在3.8个月和6个月。相比之下,患者在六周的1250mg/m2/d卡培他滨内经历HFS发作(93%)和最严重事件(67.9%)且高达17%是3级HFS。当前研究中减小的HFS表现不能简单地仅归因于较低剂量1000mg/m2/d的卡培他滨,因为卡培他滨以750-1000mg/m2/d bid开始,而伊立替康也产生35%HFS(Patt等人,2004)。更重要的是,在XCEL研究中所观察到的6个月的HFS峰值之前使用单一疗法卡培他滨的一半患者将经历肿瘤进展(2-4个月)(Van Cutsem等人,2001;Hoff等人,2001;Hoff等人,2004;Lee等人,2004)。此外,缺乏HFS时程也会使得难以进行HFS发病率的交叉研究比较,因为塞来昔布可能不仅影响HFS发病率,而且还可能延迟其发作和峰值(Abushullaih等人,2002;Hoff等人,2004;Lee等人,2004)。然而,这一假设正在国家癌症研究所(National Cancer Institute)资助的前瞻性随机化III期研究中进行测试,该研究对分为放射或无放射的转移性结肠直肠和转移性乳癌患者的卡培他滨诱发性HFS比较塞来昔布相对于安慰剂。
使用XCEL改善临床结果和降低毒性支持我们的初始假设,COX-2活化(发炎的关键主力)可能是介导HFS和结肠直肠癌进展的常见机制(图6)。HFS带有发炎以及偶然关节炎突发的所有四种疾病特有的病征且HFS病变的活检揭露急性发炎性皮肤和血管损伤(Nagore等人,2000;Lin等人,2002)。有趣的是,也涉及发炎的腹泻和间接胆红素血症的发病率也似乎被XCEL降低(Lin等人,2002)。也已知许多非5FU细胞毒性剂(例如脂质体阿霉素、阿糖胞苷、长春瑞滨、多烯紫杉醇以及血管内皮生长因子受体(VEGFR)的细胞抑制性酪氨酸激酶抑制剂)会引起HFS,从而指示使手足组织容易受这些致病药剂影响的常见病理生理学途径(Nagore等人,2000;Escudier等人,2005;Demetri等人,2005)。虽然未在正常手足组织中进行研究,但在实验性模型和患者中都充分记录了对化学疗法和/或放射有反应的肿瘤中的COX-2活化(Mercer等人,2005;Altorki等人,2005)。用塞来昔布和化学疗法共同治疗可消除化学疗法诱发的前列腺素E2水平而非肿瘤中的COX-2表达的增加(Altorki等人,2005)。此外,血小板聚集增加是归因于血栓烷A2的无阻挠作用(Topol,2005),选择性COX-2抑制剂下调VEGF(VEGFR的配体)且上调内皮抑素和凝血栓蛋白-1,从而倾向于有利于微血管损伤的血管生成环境(Kang等人,2002;Ma等人,2002)。这些抗血管生成机制解释了使用XCEL的快速肿瘤反应、改善的存活期和罕见逆肾功能异常(Kang等人,2002)。相比之下,HFS的病理生理学将是促血管生成性(急性发炎性)组织损伤,因此同时使用塞来昔布可减少卡培他滨诱发性HFS。幸好未见长期使用塞来昔布所见的罕见但致命的胃肠和心血管事件(Goldstein等人,2000;Solomon等人,2005),因为目前研究较小且涉及靶向肿瘤内皮细胞的相对短期XCEL,该等肿瘤内皮细胞的周转率(2.4-13天)比正常组织(47-23,000天)快20-2000倍(Hobson和Denekamp,1984)。
总之,卡培他滨和塞来昔布结合放射可改善肿瘤反应和存活期,同时可以显著降低HFS对转移性结肠直肠癌患者的毒性,从而暗示COX-2活化作为常见介体。对在正常和肿瘤组织中体内COX-2活化对化学疗法和/或放射的机制的进一步了解可能会产生通过增强抗血管生成策略(包括使用化学放射,同时保持微血管健康,尤其是在重要器官中)中断COX-2信号传导途径并改善肿瘤控制的最佳方式。
实施例3
研究2的材料和方法
患者和治疗
得克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心的机构审查委员会批准了这一回顾性研究。从2000年10月到2003年12月,所有六十六位患者都同时接受平均日剂量1000mg/m2/d bid的卡培他滨(Xeloda,Roche Nutley,NJ)每21天持续14天或周一到周五和放射以及每天200mgPO b.i.d.的塞来昔布(Pfizer,NY)。
评估和定义
在接受先前所述的XCEL之前使所有患者都经受常规临床检查、实验室分析和计算机断层分析。所有患者数据都将独立地审查且回顾描绘CR的影像学图像并由两位独立放射学家商定。所有19位患者都具有转移性癌症的病理学证明()。使用国家卫生研究院关于不良事件的常见术语标准3.0版来对治疗相关毒性进行分级。使用RECIST标准评估肿瘤反应,其中完全反应是定义为可测量或可评估疾病的完全影像学消失和肿瘤标志物的正常化。死亡日期是通过使用社会保障号搜索(ssdi.genealogy.rootsweb.com)来确定。存活期收集的截止点是2005年10月。
统计分析
连续变量是使用平均值(±标准偏差)或中值(范围)来概括。分类变量概括于频率表中。视情况使用卡方检验或费雪精确检验对这些变量的重要亚组进行比较。到完全反应的时间是定义为开始XCEL疗法到首次记录的影像学完全反应的时间。完全反应的持续时间是定义为到第一次CR到第一次复发或死亡的时间。无进展存活期是定义为从开始XCEL疗法到疾病进展或任何原因引起的死亡的时间。总存活期是定义为从开始XCEL疗法到任何原因引起的死亡的时间。如果患者未有进展或死亡,那么在最后随访日检查患者。使用Kaplan和Meier的方法概括无进展和总存活期分布。所有反应率、无进展存活期和总存活期都是基于95%置信区间(CI)来计算。叙述性地使用符号化事件相对于时间来建立事件图表。
实施例4
组合疗法的作用(研究2)
患者的基线人口统计数据概括于表1中。所有十九位完全反应者是在具有孤立性/群集性结节转移(n=7)或内脏转移(n=5)和/或已经对第一线伊立替康有反应(n=9)的21位患者中。不良肿瘤特征是结节阳性原发性(84%)、肝外疾病(80%)、多灶性疾病(68%)、同步原发性(33%)和大于5cm肿瘤(24%)。良好肿瘤特征是孤立性转移(42%)、正常乳酸脱氢酶水平(95%)和癌瘤胚胎抗原水平<200ng/ml(95%)和先前对第一线治疗的反应(43%)。然而,所有患者都是不可切除的(n=17)或临界可切除的(n=2),包括9位孤立性内脏转移患者,3位在手术探测时发现不可切除,3位已经先前进行手术,且3位具有禁止手术的重大医学合并症(Janjan等人,2000)。关于XCEL治疗和后续疗法的疾病的自然史是通过表2和图5中的事件图表来概括。
完全反应
对于已切除患者来说,到CR的中值时间是6.5个月(范围,2.5-12.5个月)且CR的中值持续时间是13个月,但对于未切除患者来说却未到达(图6)。具有升高的癌瘤胚胎抗原水平的所有九位患者都经历了CEA的正常化(未示出)。在未切除患者中,最常见CR部位是结节疾病(43%),随后是肝(36%)和癌病(21%)。在6位手术患者中,在手术之前对XCEL的反应是病理学CR(n=1)、部分反应(n=4)和稳定疾病(n=1)。除了使用XCEL后有进展但对第一线XELIRI有优良反应的一位无顺应性患者,九位第一线反应者中有八位实现了CR。未实现CR的八位孤立性或群集性结节疾病患者中仅有一位是55岁男性,其是IFL难治的,然后在使用XCEL加上放射后享有稳定疾病18个月。他的疾病稳定保持18个月,随后发展了肺和骨骼转移并且目前在诊断后51.5个月以上还活着。
PFS和OS以及复发
在XCEL情况下的五年PFS对于所有患者和非手术组分别是57%和71%。五位患者保持XCEL,其中最长是43个月以上(图5)。五年OS对于所有患者和非手术患者分别是64%和92%(图7),对于所有患者来说都在54个月时到达中值OS,因为手术组中有三例死亡。仅一位未切除孤立性腹膜转移CR患者在24个月时死亡,因为她在6个月XCEL、随后XCEL加上放射后中断后,她拒绝其它疗法。从CR日到复发的中值时间是14个月(95%CI,6-17个月)。所有八位复发(41%)都发生在原始部位(除了已切除患者),同样要分成未切除患者(29%)和已切除患者(67%)之间,主要在已切除患者中进行的后续治疗概括于表2中。已切除患者具有庞大肿瘤(8-15cm)且仅一位对XCEL具有CR的事实可以部分解释这组中的高复发和死亡率。有趣的是,那些进行阳性边缘切除术的患者继续进行辅助XCEL,与那些具有阳性边缘的患者相比仍然活着。
毒性
尽管事实上XCEL的中值持续时间是12个月(范围,1.8-43个月),中断XCEL的最常见原因是由治疗或手术引起的CR(n=8)且两位因2级焦虑而中断塞来昔布而两位因后来1级血清肌酸酐升高而中断。类似于先前报告,最常见且唯一的3/4级毒性是未知临床显著性的淋巴球减少症(28%)。最常见1/2级毒性是腹泻(44%),随后是HFS(28%)。怀疑无法解释的轻微体重增加(n=2)和骨质疏松症(n=1)。血液毒性限于1级嗜中性白细胞减少症和血小板减少症。与无顺应性患者的-2的MCV相比,在XCEL治疗之前和之后平均红细胞体积(mean corpuscularvolume;MCV)的中值增加是10(范围是5-20)。
使用XCEL结合多峰性疗法实现高可持续CR率,导致尽管具有许多不良肿瘤特征但具有仅肝以及肝外转移的所选结肠直肠癌患者的史无前例的五年存活期。令人惊讶地,未切除CR患者的五年PFS(70%)和OS(92%)超过具有最良好的可切除唯肝转移的患者的历史对照(Fong等人,1999;Taieb等人,2005)。六位已切除患者的存活期也是良好的,因为六位患者中有三位进行了R1切除术(Abdalla等人,2004)。目前研究较小且是回顾性的,但代表计划外的全面的患者子集,对于在第一线或第二线设定中采用XCEL的患者也发现其延长的存活期。鉴于13位患者(62%)进行化学放射且9位患者(47%)是第一线反应者,该研究未定义塞来昔布在存活期结果中的作用。在前瞻性研究中验证XCEL之前,如果可行,具有可切除的结肠直肠癌转移的患者应经受治愈性切除术(Fong,2000;Topham和Adam,2002;Abdalla等人,2004;Adam等人,2001;Kemeny等人,1999)。然而,通过这一研究挑战放射仅起减轻作用的传统观点,尤其是在具有腹膜后结节转移的患者中,其中实现50%的CR率。这些神经丰富的腹膜后结节区域中的进行性疾病会不利于生活质量。
在使用XCEL或手术后的第一线反应或化学放射后,患者继续使用XCEL以抑制肿瘤再生长,导致第一线反应者中的90%的CR率和未切除患者中的70%的持续CR率。这种高CR率可能是第一线疗法的唯一结果(因为不存在CR)且仅根据在用化学放射治疗的局部晚期直肠癌患者中所预期的总病理学CR率(6-30%)和微观肿瘤率(20-30%)将证明是可行的(Lin等人,2005;Kim等人,2005)。即使仅一位患者在肝和经过照射的直肠中证实病理学CR(5%),也无其它CR患者进行手术。有趣的是,中断XCEL的14位患者(包括具有多灶性转移的9位患者)中有六位(43%)在36个月的中值随访时保持CR,从而暗示在这一研究中病理学CR率可能会高于5%。另外,15位患者在实现CR后继续XCEL将会抑制微观肿瘤再生长,因为在14个月(95%CI,6-17个月)的中值时间后在XCEL中断后所有复发都发生在初始肿瘤部位,对于结肠直肠癌来说,微观肿瘤足以在所报告的每天0.083mm(每天0.008-0.262mm)的中值线性生长率或130天(53-1570天)的中值体积倍增时间下变得影像学可检测到的(Bolin等人,1983)。
在动物模型中,在长时间抗血管生成或节律性治疗后,由抑制微观肿瘤细胞再生长所引起的CR使人联想到肿瘤休眠模型(O'Reilly等人,1997;O'Reilly等人,1996)。其支持如下声明:XCEL可以在节律性给药范例后偶然地抗血管生成(Browder等人,2000;Kerbel和Kamen,2004)。此外,肿瘤血管生成的假定靶之一是骨髓源性循环内皮祖细胞(CEP),其通过表面标志物与特征为CD34和CD133表达的造血干细胞(HSC)几乎难以区分(Lyden等人,2001;Peichev等人,2000)。低剂量节律性环磷酰胺导致CEP正常化,而最大耐受剂量的大剂量环磷酰胺动员出能存活的CEP,这与接受辅助化学疗法的乳癌患者中的发现一致(Bertolini等人,2003;Furstenberger等人,2006)。与节律性化学疗法相比,组合间歇环磷酰胺与节律性环磷酰胺的反应产生最耐久的肿瘤反应(Shaked,2005)。通过流式细胞术或通过CD133mRNA测量的CEP水平在人类癌症中升高且与癌症进展有关(Mancuso等人,2003;Lin等人,2002)。CEP水平的降低或正常化与对抗血管生成疗法的反应有关(Willett等人,2004)。发明者怀疑升高的MCV(Sussman等人,2003)、最低限度的骨髓抑制但显著淋巴球减少对HSC的作用可能超过旁观者,而是对CEP动员具有直接或间接作用(Furstenberger等人,2006)。相反,CEP的数目和功能与心血管风险因子反相关,且独立地预测心血管事件和死亡(Hill等人,2003;Werner等人,2005),潜在地解释了由抗癌疗法引起的心血管事件增加。4
除与塞来昔布有关的心脏和肾毒性(Lin等人,2005)以外,发明者在服用XCEL超过24个月的患者中观察到无法解释的适度体重增加(n=2)和1级骨质疏松症(n=1)。即使在70%患者中XCEL继续使用超过12个月,但总毒性概况是良好的。在CR以外继续维持XCEL可能会导致使用化学放射的患者的10-30%或使用化学疗法的患者的1-5%过度治疗,假定这些患者可能已经在全部和微观肿瘤中实现完全病理学CR。因为XCEL经口自我施用,所以一位患者稍后承认无顺应性,与顺应患者中的平均+10相比,其峰值MCV在XCEL之前和之后是-2。连续的MCV可以用作卡培他滨顺应性的替代者(Sussman等人,2003)。
总之,在所选转移性结肠直肠癌患者中XCEL导致史无前例的持续CR率、PFS和OS,从而使亚急性疾病转变成慢性疾病。XCEL全部口服、安全且便宜并且可以广泛地适用于所有第一线反应者的事实可能具有深远的影响,因为使用靶向药剂的较新第一线化学疗法是昂贵的且不会改善CR率,尽管将反应率改善到80%(Hurwitz等人,2004;Diaz Rubio等人,2005;Hochster,2006)。在对第一线奥沙利铂组合有反应的患者中CR在XCEL情况下也是可实现的。使用或不使用选择性COX-2抑制剂的节律性化学疗法的研究迄今为止报告了极少抗肿瘤活性,因为包括仅既往多次治疗或治疗难治的患者而不结合放射疗法(Werner等人,2005;Shaked等人,2005;Kieran等人,2005;Spieth等人,2003)。除鉴别塞来昔布对卡培他滨诱发性手足综合症的作用的进行中的随机化III期研究以外,发明者打算除临床特征以外从分子上将这些CR患者分类并且更好地了解CR在肿瘤休眠关系中的机制,并使用CEP和其它标志物作为替代标志物来优化XCEL的剂量和时间表持续时间。
实施例5
研究3的材料和方法
患者
机构审查委员会批准了这一研究。所有十九位不可切除转移性结肠直肠癌患者都是从2001年2月到2003年11月开始XCEL(卡培他滨是每天1000mg/m2BID和塞来昔布是200mgPO BID)。十一位患者进行第一线伊立替康和5FU或卡培他滨且8位患者采用XCEL+放射作为第一线疗法。六位患者进行阴性边缘(R0)或微观边缘(R1)切除术,其中一位在XCEL之前是病理学CR且两位进行总阳性边缘(R2)切除术。所有患者每2-3个月都进行临床检查、实验室和CT扫描。维持XCEL(延伸辅助疗法)是定义为除放射或手术CR(n=14)以外继续XCEL。
评估和定义
主要研究者和两位认证放射学家审查了所有CT扫描图像。根据RECIST标准将CR定义为可测量或不可测量的疾病完全消失。有效CR(eCR)是用来描述不能完全消退的解剖结构(例如结节)的正常化。证实的CR包括那些通过满足RECIST标准具有CR或实现eCR或病理学CR的患者。接近CR(nCR)是定义为根据CT扫描可测量疾病几乎完全消失(95-99%)。无复发存活期(RFS)是定义为从第一次放射CR到第一次复发、进展或死亡的时间。无进展存活期(PFS)时间是定义为从开始XCEL到任何原因引起的可测量疾病复发、进展或死亡的时间。OS是定义为从第一次放射CR到任何原因引起的死亡的时间。使用国家癌症研究所关于不良事件的常见毒性标准3.0版来对治疗相关毒性进行分级。
统计分析
使用中值(范围)概括连续变量且分类变量概括于频率表中。如果患者的疾病未有进展或如果患者未死亡,那么在最后随访日检查该患者。死亡日期是通过使用社会保障号搜索(ssdi.genealogy.rootsweb.com)或电话随访来确定。因此,所检查的OS时间有可能大于所检查的RFS和PFS时间。计算RFS、PFS和OS的卡普兰-迈耶估计值,且使用时序检验进行群组比较。所分析的预后和治疗因素包括:维持疗法(是或否)、切除术(未切除/R1-2或R0)、部位(肝内或肝外)、肿瘤大小(>8cm或更小)、转移次数(单次相对于多灶)、诊断时的初始阶段(II期或III/IV期)、IV期疾病之前的无病时间间隔(6个月或更短)、XCEL之前的LDH(正常相对于异常)、放射(是或否)和对基于第一线伊立替康的治疗的反应(是或否)。
实施例6
组合疗法研究3的作用
患者特征
患者人口统计数据概括于表6中。详细治疗和存活期特征示出于表7和图9中。所有患者都具有病理学转移证明(n=15)或升高的肿瘤标志物和明确的影像学转移证明(n=4)。不良预后因素包括呈现时的结节阳性原发性或IV期疾病(16/19,84%)、肝外疾病(13/19,68%)或多灶性疾病(10/19,53%)或肿瘤大小>8cm(5/16,31%)、对基于第一线伊立替康的治疗的抗性(3/19,16%)。良好的预后特征是正常乳酸脱氢酶水平(16/19,84%)、癌瘤胚胎抗原水平<200ng/ml(18/19,95%)、对第一线疗法有反应(11/19,58%)和孤立性转移(9/19,47%)。转移之前的中值无病时间间隔是5.7个月(95%CI,3.9-23.5个月)。在使用XCEL+放射的新辅助化学疗法缩小大小后,在开始疗法之前,五位进行转移性疾病R0切除术且一位进行R1切除术且两位进行R2切除术。病理学发现:一位病理学CR、两位微观残余疾病和五位宏观疾病。十二位患者进行放射疗法(35-50.4Gy)和XCEL且八位对第一线伊立替康方案有反应。
表6:基线患者、疾病和治疗特征(n=19)
完全反应
所有十九位患者都具有至少一个报告,指示由两个独立性放射学审查之一承认的无影像学疾病证据。第二个独立性审查也能够检验19位患者除4位以外所有人的放射学发现。证实的CR患者包括1位病理学CR患者、3位eCR、4位CR和7位手术切除患者(4位R0切除术、1位R1切除术和2位R2切除术)。有趣的是,在未完全影像学消退的具有孤立性肝转移的患者中发生病理学CR。四位未证实的CR患者仅回顾性明显的,其中两位患者各自的腹股沟结节或腹膜肿块无法与放射改变后进行区分;且在两位接近CR患者中。发现一位接近CR患者在弥漫性腹部结节(>3cm)中具有在化学放射后消退到亚厘米结节的残余1.2cm胃肝结节。其它接近CR患者具有孤立性肝转移,在放射疗法加上XCEL后已经从3cm消退到2mm(表7)。具有升高的血清癌瘤胚胎抗原(CEA)或升高的CA19.9水平的所有患者都具有在CR期间正常化的其CEA或CA19.9。
RFS
在CR后5到27个月,九位患者在随访期间复发。两年RFS是57%(表8)。未到达中值RFS(95%置信区间[CI],17个月-[NR]未到达),矛盾的是,两年RFS对于14位未切除和R1-2切除患者是71%(95%CI,0.51-1.00)而对于五位R0切除患者是20%(95%CI,0.03-1.00),其中一位是病理学CR患者(p=0.07)或相对于0%,不包括这一位病理学CR患者(p=0.015)。两年RFS估计值对于维持XCEL组是73%(95%CI,0.54到1.00)而未维持XCEL是0%(p=0.002)(图10A)。其它预后和治疗因素并不预测RFS(表8)。与其它报告一致,除了在CR后中断或未开始维持XCEL的已切除患者,所有复发都仅仅原位发生。在九位复发中,五位使用单独XCEL或XCEL和放射再治疗,两位进行射频消融术,且一位在指示原位复发性质的吻合部位进行切除术。敏感性分析使用不包括具有未证实CR的4位患者的数据集计算时序检验,报告于表8中。预测RFS和OS的结果类似,其中扩大RFS(p=0.0005)优点以不用实现R0切除术。在未切除和R1-2切除患者(p=0.069)中和在接受维持XCEL的患者(p=0.002)中也观察到矛盾的PFS优点。
表8:到用于无复发存活期(RFS)和总存活期(OS)的事件分析的时间,n=19。
OS
四位患者在随访期间死亡,包括未接受任何维持疗法的3位R0切除患者和在维持XCEL八个月后决定没有进一步疗法的1位未证实的CR患者。从CR起和从诊断起估计的3年存活率分别是79%(95%CI,0.59-1.00)和95%(95%CI,0.85-1.00)。从XCEL起和从转移发作起的中值OS分别到达51.9个月(95%CI,45个月-未到达[NR])和73.3个月(95%CI,NR-NR月)。改善的OS与维持XCEL相关(p=0.04)(图10B),从CR起的四年OS达到93%,而不无任何其它预后或治疗因素(表8)。
毒性
毒性极其类似于先前报告(与图8一致的结果)。18一位患者在两年XCEL后因1级血清肌酸酐升高而中断塞来昔布。在XCEL后相较于基线的中值平均红细胞体积(MCV)增加是11.5(95%CI,8-14)。在这一组中遇到无心血管毒性且已经接受XCEL持续12个月或更长时间的所有患者也都每天接受81mg乙酰水杨酸。
讨论
维持XCEL而非任何其它所测量的预后或治疗因素赋予存活期优势。可以将这一作用归因于CR差异,因为证实的CR患者100%享有3年PFS,而未证实的CR患者是0%,而R0-2切除患者是37%。有趣的是,八位非手术CR患者中有五位在24个月外继续维持XCEL(范围是27-50.3个月),相比之下,未证实的CR患者未接受维持XCEL或接受小于6个月的维持XCEL。观察结果是偶然的且分析仅仅是基于来自XCEL数据库从2000年10月到2003年11月的所有“CR”患者。即使存在选择偏差,存活期的量值仍然引起争论且R0-1切除患者的RFS和OS与历史对照一致。即使这一研究仅包括19位患者,但根据单变量时序分析,那些采用维持XCEL的患者出现RFS和OS的统计显著差异。
假设维持XCEL靶向结肠直肠癌微转移,因为在使用XCEL时无患者复发。所有9位复发都原位发生,除了四位R0切除情况,这与大多数(84%)CR患者在第一年内原位复发的其它报告一致。在目前研究中从CR到复发的中值时间是13.1个月,足以微转移而以对于结肠直肠癌所报告的每天0.083mm的中值线性生长率(范围是每天0.008-0.262mm变得影像学可检测到的时间。在按照新辅助XCEL加上放射的已切除患者中,我们发现一位具有病理学CR且两位具有微观残余疾病,这些发现使人联想到经化学放射治疗的LARC患者。有时,在对组合化学疗法有反应的转移性结肠直肠癌患者中也见到微观疾病或病理学CR。九位第一线伊立替康反应者中有八位已经使用单独XCEL或XCEL和放射实现CR(88%),这是仅通过组合微观残余疾病率和病理学CR率可实现的比率。病理学CR率未知,但可能高于所观察到的5%(1/19),因为14位患者未进行切除术且3年RFS对于整个群已经达到57%。扩大的临床经验表明CR后的维持XCEL似乎使用其它第一线组合化学疗法可再现。使用维持XCEL有效靶向结肠直肠癌微转移产生耐久临床CR,这类似于肿瘤异种移植物将退回到休眠的肿瘤休眠模型的发现。
实施例7
患者样品中的CD133表达的分析
测定接受XCEL疗法的患者的血清CD133mRNA水平。在所有情况下,通过RT-PCR测定CD133血清mRNA水平且将所有值标准化为样品的GAPDH表达水平(参见例如Iinuma等人,2011)。这些研究的结果如下示出于表9中。从2012年1月1日起,由“*”指示的所有患者都仍活着。因此,这些患者呈现延长的缓解期,在一些情况下超过10年。值得注意的是,存活的患者全部都呈现极低血清CD133RNA水平。事实上,除由%指示的患者(这位患者在采血之前未接受疗法)外,所有CD133RNA水平都小于1.0(如标准化为GAPDH),意味着与GAPDH转录物相比,存在较少CD133转录物的拷贝。已经复发的患者的平均CD133RNA水平超过1,000(1,444.6215)且由“*”指示的患者的平均CD133RNA水平是0.3381(除患者42外)。因此,这些极低CD133水平预示着完全反应和不存在疾病复发。
表9:具有完全反应的患者的CD133mRNA水平
*指示从2012年1月起存活的患者;“日期_DIA”指示诊断日期;“日期_BLO”指示抽血日期;“平均_DIF”指示如通过RT-PCT测定的血液样品中的CD133 RNA水平(标准化为GAPDH)。
%指示当取得血液样品以测定CD133水平时受试者尚未接受疗法。
其它研究试图定量用如上文所述的XCEL疗法治疗的第二组患者的CD133水平。然而,在这种情况下,使用实时RT-PCR获得绝对mRNA拷贝数值(表10)。在一些情况下,将这些值标准化为两种看家基因中的任一种:GAPDH和GUSB(最右侧的4个管柱)。如图11中可见,使用GusB或GAPDH作为看家基因以标准化所产生的基本上等效结果。重要的是,在这些分析中,不仅与疾病复发的癌症患者的水平相比,而且与在健康无癌症受试者中所观察到的水平相比,显示竞争反应的所有患者都具有显著更低的血清CD133RNA水平。
表10:完全反应者和健康对照的CD133mRNA水平
*指示对XCEL疗法显示完全反应的患者(例如在延长时期后仍然无病)。对照表示来自无癌症对照受试者的样品;“POS HI”和“POS LO”表示癌症复发且分成分别具有相对高的CD133和相对低的CD133的两个群体的患者。
***
根据本公开,本文中所公开和要求保护的所有方法都可以进行和执行而无过度实验。虽然已经依据优选实施方案描述本发明的组合物和方法,但对于本领域技术人员显而易见,在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下,变化可以应用于本文中所述的方法和方法的步骤或步骤顺序。更具体地说,显而易见,可以用化学上和生理学上相关的某些药剂替代本文中所述的药剂,同时将会实现相同或类似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有该等类似替代物和修改都视为在如随附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (52)
1.一种用于在受试者中测定对抗癌疗法的完全反应的体外方法,其包括:
(a)测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133 RNA表达水平,所述疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;和
(b)如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平(i)当标准化为GAPDH RNA水平时小于约0.56,或(ii)小于来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平,那么将所述受试者鉴别为对所述抗癌疗法具有完全反应。
2.如权利要求1所述的方法,其包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平小于来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平的一半,那么将所述受试者鉴别为对所述抗癌疗法具有完全反应。
3.如权利要求2所述的方法,其包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平小于来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平的三分之一,那么将所述受试者鉴别为对所述抗癌疗法具有完全反应。
4.如权利要求1所述的方法,其中将所述受试者鉴别为对所述抗癌疗法具有完全反应包括所述受试者对所述抗癌疗法已经具有完全反应的报告。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述报告是书面或电子报告。
6.如权利要求4所述的方法,其包括向所述受试者、健康护理提供者或保险公司报告。
7.如权利要求1所述的方法,其中所述无癌症对照是年龄匹配对照。
8.一种检测受试者中的癌症干细胞的生物标志物的体外方法,其包括:
(a)测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133 RNA表达水平,所述疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;和
(b)如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56,那么将所述受试者鉴别为具有癌症干细胞的生物标志物。
9.如权利要求8或1所述的方法,其中所述生物样品是血清样品。
10.如权利要求8或1所述的方法,其中测定CD133 RNA表达包括核酸杂交。
11.如权利要求8或1所述的方法,其中测定CD133 RNA表达包括RT-PCR。
12.如权利要求8所述的方法,其进一步包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时小于约0.56,那么将所述受试者鉴别为不具有癌症干细胞的生物标志物。
13.如权利要求8所述的方法,其进一步包括测定所述样品中的至少第二种基因的表达水平。
14.如权利要求13所述的方法,其进一步包括测定所述受试者的生物样品中的CEA、CK19或CK20的表达水平,其中相对于对照水平CEA、CK19或CK20的表达水平升高指示受试者中存在癌症干细胞的生物标志物。
15.如权利要求8所述的方法,其中将所述受试者鉴别为具有癌症干细胞的生物标志物包括所述受试者具有癌症干细胞的生物标志物的报告。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述报告是书面或电子报告。
17.如权利要求8所述的方法,其进一步包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56,那么将所述受试者鉴别为具有癌症干细胞。
18.如权利要求17所述的方法,其进一步包括报告所述受试者是否具有癌症干细胞。
19.如权利要求8所述的方法,其进一步包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时小于约0.56,那么将所述受试者鉴别为对所述抗癌疗法具有完全反应。
20.如权利要求19所述的方法,其进一步包括报告所述受试者是否对所述抗癌疗法具有完全反应。
21.一种用于治疗受试者的方法,其包括:
a)选择如下受试者:已经接受或正在接受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法,所述疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;且经测定具有如下CD133 RNA表达水平:(i)当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56;或(ii)大于来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平;和
b)向所述受试者施用另一抗癌疗法。
22.如权利要求21所述的方法,其中所述另一抗癌疗法包括用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂治疗。
23.如权利要求21所述的方法,其中所述另一抗癌疗法包括放射疗法、化学疗法、免疫疗法或手术。
24.如权利要求21所述的方法,其中选择受试者包括测量所述受试者的CD133 RNA表达水平。
25.如权利要求21所述的方法,其包括选择经测定具有当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56的CD133 RNA表达水平的受试者。
26.如权利要求25所述的方法,其包括选择经测定具有当标准化为GAPDH RNA水平时介于约0.56和7.0之间的CD133 RNA表达水平的受试者。
27.如权利要求21所述的方法,其包括选择经测定具有大于来自无癌症对照的样品的CD133 RNA表达水平的CD133 RNA表达水平的受试者。
28.如权利要求27所述的方法,其包括选择经测定具有比来自无癌症对照的样品的CD133 RNA表达水平高不到10倍的CD133 RNA表达水平的受试者。
29.如权利要求21所述的方法,其中所述无癌症对照是年龄匹配对照。
30.如权利要求21所述的方法,其中所述结肠直肠癌是转移性结肠直肠癌。
31.如权利要求21所述的方法,其中所述结肠直肠癌是具有结节转移的转移性结肠直肠癌。
32.如权利要求21所述的方法,其中所述氟胞苷衍生物是卡培他滨。
33.如权利要求21所述的方法,其中所述COX-2酶抑制剂是美洛昔康、伐地昔布、塞来昔布、罗非昔布或萘普生。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述COX-2酶抑制剂是塞来昔布。
35.如权利要求21所述的方法,其中所述受试者进一步经测定具有相对于对照水平的升高的CEA、CK19或CK20表达水平。
36.一种确定受试者是否需要另一抗癌疗法的体外方法,其包括:
(a)测定已经经受或正在经受治疗结肠直肠癌的抗癌疗法的受试者的生物样品中的CD133 RNA表达水平,所述疗法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂;和
(b)如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平(i)当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56,或(ii)大于来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平,那么将所述受试者鉴别为需要另一抗癌疗法。
37.如权利要求36所述的方法,其包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56,那么将所述受试者鉴别为需要另一抗癌疗法。
38.如权利要求37所述的方法,其包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时介于约0.56和7.0之间,那么将所述受试者鉴别为需要另一抗癌疗法。
39.如权利要求36所述的方法,其包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平大于来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平,那么将所述受试者鉴别为需要另一抗癌疗法。
40.如权利要求39所述的方法,其包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平比来自无癌症对照的样品中的CD133 RNA表达水平高不到10倍,那么将所述受试者鉴别为需要另一抗癌疗法。
41.如权利要求36所述的方法,其中所述无癌症对照是年龄匹配对照。
42.如权利要求36所述的方法,其中所述生物样品是血清样品。
43.如权利要求36所述的方法,其中测定CD133 RNA表达包括核酸杂交。
44.如权利要求36所述的方法,其中测定CD133 RNA表达包括RT-PCR。
45.如权利要求36所述的方法,其进一步包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时小于约0.56,那么将所述受试者鉴别为不需要另一抗癌疗法。
46.如权利要求36所述的方法,其进一步包括测定所述样品中的至少第二种基因的表达水平。
47.如权利要求46所述的方法,其进一步包括测定所述样品中的CEA、CK19或CK20的表达水平,其中相对于对照水平CEA、CK19或CK20的表达水平升高指示所述受试者需要另一抗癌疗法。
48.如权利要求36所述的方法,其中将所述受试者鉴别为需要另一抗癌疗法包括所述受试者需要另一抗癌疗法的报告。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述报告是书面或电子报告。
50.如权利要求36所述的方法,其进一步包括如果所述样品中的所述CD133 RNA表达水平当标准化为GAPDH RNA水平时大于约0.56,那么向所述受试者施用另一抗癌疗法。
51.如权利要求50所述的方法,其中所述另一抗癌疗法包括用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制剂治疗。
52.如权利要求50所述的方法,其中所述另一抗癌疗法包括放射疗法、化学疗法、免疫疗法或手术。
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