KR20150008177A

KR20150008177A - 실용 가능한 암 진단 대체 법

Info

Publication number: KR20150008177A
Application number: KR1020147034524A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 피어스올; 마이클 에이치. 카돈
Original assignee: 유트로픽스 파마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2015-01-21
Also published as: EP2847592A4; CN111856013A; US20180246106A1; WO2013170176A3; US20150301053A1; CN104541170A; CN107315088A; WO2013170176A2; JP2018013498A; EP3236262A2; JP6748050B2; KR102062416B1; JP2015519565A; HK1245888A1; EP3236262B1; EP3236262A3; EP2847592A2

Abstract

본 발명은 다양한 암과 관련된 진단 방법으로 BH3 프로파일 진단 방법의 개선을 포함한다.

Description

실용 가능한 암 진단 대체 법 {SURROGATE FUNCTIONAL DIAGNOSTICS TEST FOR CANCER}

우선권

본 출원서 청구는 2012년 5월 10일 출원된 미국 지역신청 61/645,253호 및 2013년 3월 13 일 출원된 미국 지역신청 61/780,752에 의거, 이들 각각은 본 출원에 그 전체가 참고로 인용 된다.

발명 분야

본 발명은 인간 시료에서 종양 평가 시 유용한 방법에 관련한다.

배경

특정 항암 치료와 더불어 예측 및 예후 바이오 마커의 사용은 약물 개발 시간, 약물효능개선, 임상 의사 결정 참고에 중요하다. 항암치료의 많은 발전에도 화학요법은 아직도 효율과 효능 면에서 많은 문제점이 있다. 화학 요법 의 일반적 성능 저하에 대한 이유는 환자 개개인의 질병에 부적합 하다는 것 이다. 치료제 와 더불어 정확한 진단에 의한 맞춤의학으로 이 문제를 완화 할 수 있다.

현재 임상 종양학에 유용한 바이오 마커 소수이다. 부분적으로 이것은 인지된 마커는 종종 약물대사에 상관 관계는 있지만 일반적이지 않다는데 기인한다. "바이오마커" 생물학이 동반치료 약리학과 병렬하더라도 약물이 어떻게 환자에 작용할지 예측하는 것은 아직 미지수 이다. 이에 임상발전을 위해서는 환자에게 유용한 방법을 평가할 수 있는 의료과학자의 참여가 필요하다.

BH3 프로파일로 화학요법에 따른 암세포의 일반적인 반응을 측정한다. 특히, BH3 분석으로 세포사멸을 관장하는 미토콘드리아 표면의 단백질 기능을 측정할 수 있다. 많은 화학요법은 이 세포사멸을 효율적으로 하는데 의존한다. 검사 판독 값은 BH3 도메인 중 전구 세포사멸 BH3 단백질에 미토콘드리아의 반응을 제공한다. 반면에 BH3 프로파일로 치료 시 일반적인 화학 반응 또는 민감도 정보를 제공하지만, 이 방법으로는 의사의 치료 방법 선택에 부족하다.

발명요약

따라서, 본 발명은 환자 맞춤 항암치료 방법을 제공하는데 환자의 종양 혹은 암 세포 조직의 BH3 프로파일, 환자의 하나 이상 임상학적 요인 결정, 하나 이상의 암 치료제의 임상반응 양상 분류로 구성되고 이에 따라 임상반응에 관련한 BH3 프로파일 특이성 및/혹은 민감도를 증가시켜 하나 이상의 임상요인을 선택한다.

일부 실시 예와 본 원에 나타난 바와 같이, 다양한 임상요인은 그것이 세포사멸에 관련됨과 별도로, 테스트를 단순한 예지가 아닌 예측할 수 있게끔 변환 시킴으로써BH3 프로파일의 예측력을 향상시킨다.

일부 실시 예로 본 신청에서는 시타라빈 또는 시타라빈 기반 화학치료, 특정 연령 백혈병 환자의 세포 유전 학적 프로파일 또는 상태 일치 하는 아자시티딘에 예상 가능한 반응을 진단하는 방법을 제공한다.

다른 양태로, 이 발명은 환자의 암 치료방법을 제시하는데, 이는 환자의 흡수 가능한 암세포와 하나 이상의 BH3 peptide시발 정도로 구성되고, 환자의 암세포로부터 한 개 이상의 임상학적 요인을 면역세포 화학 법 및 형광 in situ hybridization으로 결정하고, 다수의 암 치료에 부합하는 가능성을 결정한다.

다른 양태로, 이 발명은 AML 환자에 반응하는 시타라빈 and/or 아자시티딘을 결정하고, AML 환자 암 조직의BH3 양상, 연령군 and/or세포 유전 학적 상태로로 하나 이상의 임상 요인을 결정하고 다수의 암 치료에 부합하는 가능성을 결정한다.

발명의 자세한 내용은 아래 기술되어 있다. 비록 에에 기술된 방법이 현재의 방법과 시약이 유사하지만, 설명된 방법과 시료를 이에 기술한다. 발명의 다른 기능, 목적과 장점은 기술과 출원으로 분명할 것이다. 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 첨부 된 명세서와 청구 범위 에서, 단수 형태는 복수를 포함한다. 다르게 정의되지 않는 한 여기에서 사용하는 모든 기술과 과학적 용어는 현재 유용되는 것과 같은 의미를 가진다.

대략적 도면 설명
도 1은 대표적인 BH3 프로파일 데이터 이다. 도면은 과 자극과 저 자극된 세포주의 패턴을 비교하였다. MRL-14은 MRL-11 (MTS 분석에서 치료억제제 활성에 상응되는) 에 비해 BIM 0.3, PUMA 0.3 과 NOXA가 과 자극 되였다.
도 2는 치료억제 활성도에 대한 전통적인 성장활성 억제 EC50 MTS분석의 비교이다.
도 3은 8개의 부착 세포주의 BH3 양상이다.
도 4는 9개의 부유 세포주의 BH3 양상이다.
도 5는 부유 세포주의BH3 양상이다.
도 6은 부착 세포주의 BH3 양상이다.
도 7은 MCL1억제제 EC50 에 대한 자극, 부유세포의 각각의 peptide 이다.
도 8은 MCL1억제제 EC50 에 대한 자극율, 부유세포, multi-peptide 알고리듬 이다.
도 9는 MCL1억제제 EC50 에 대한 자극율, 부착세포, 개개 peptide알고리듬 이다.
도 10은 MCL1억제제에 대한 부유세포 자극율, multi-peptide 알고리듬 이다.
도 11은 kasein spindle 단백질 억제제 (KSP inh), MM, 백혈세포주 이다.
도 12a-d는 환자의 BH3 양상이다.
도 13a-b는 시타라빈 처리된 AML 단백질의 점 좌표 그래프와 BIM 환자의ROC 그래프이다.
도 14는 AML 무반응 (NR) 과 완전반응 (CR)환자의 BH3 peptide에 대한 시타라빈 처리된 AML 환자의 BH3 양상이다.
도 15는 시타라빈 처리된 AML 환자의 다양한 ROC 분석 커브이다.
도 16a-h는 세포유전학적 상태에 따른 BH3 peptide 반응 예상이다.
도 17a-h는 시타라빈 처리된 AML 환자의 BIM (0.1) 자극과 BIM (BCL2L11) 단백질 정도와 반응 예상 상관 관계이다.
도 18은 전반적 생존 (OS) 과 정상 생존 (EFS, 무질병 생존) 에 대한 AML 환자를BIM (0.1) 퍼센트 자극의 재 그룹이다.
도 19는 BH3 양상, 개개 BH3 peptide 모델의 구획 분석이다.
도 20은 BH3 양상, 결합된BH3 peptide 모델 (2 peptide)의 구획 분석이다.
도 21은 BH3 양상, 결합된BH3 peptide 모델 (3/4 peptide)의 구획 분석이다.
도 22는 BH3 양상, 개개 BH3 peptide 모델의 연속적 다양성 분석이다.
도 23은 BH3 양상, 결합된BH3 peptide 모델 (2 peptide)의 연속적 다양성 분석이다.
도 24는 BH3 양상, 결합된BH3 peptide 모델 (3/4 peptide)의 연속적 다양성 분석이다.
도 25는 아자시티딘 처리된 집단으로부터 AML 환자의 BH3 양상으로 자극값의 전체치료 정도로 사용된다.
도 26은 AML 환자의 BIM+NOXA 제외 아자시티딘 반응이 BIM 과 NOXA 각각보다 우월하다는 것을 보여준다.
표1은 세포에서 치료억제제 반응과 BH3 양상 모음이다.
표2는 MCL1 억제제의 첨부 데이터 요약이다.
표3은 시타라빈 처리된 AML 환자의 환자 집단에 대한 임상 병리학적 변화를 보여준다.
표4는 시타라빈 처리된 AML 환자이다. 선택반응에 BH3 양상 생화학 지표 분석과 의미이다.
표5는 부분과 연속적 다양성의 세포 모델에서 아자시티딘 효율성 요약이다.

발명의 상세기술

현재 발명은 부분적으로BH3 양상 측정의 민감도와 특이성이 어떤 임상지표를 현저히 향상 시킬 수 있다는데 기반한다. 여기에서 진단적 접근은 직접적 관련이 없는 세포사멸을 포함한 BH3 반응과 인간의 치료효율분석을 가능하게 한다. 예를 들어 현재의 발명가들은 시타라빈 과 아자시티딘에 기반한 화학적 치료에 반응되는 백혈병환자는 BH3 양상, 연령, 세포 유전학적 상태에 따라 분류되어 예상할 수 있다는 것을 밝혀 냈다.

다른 양태로, 발명은 환자의 암 치료의 방법을 결정하는데 이는 환자의 종양 또는 암 시료에서 BH3 양상 분석, 환자의 하나이상 임상요소 결정, 하나 이상 암 치료제에 대한 임상학적 반응 가능성에 환자분류로 구성되며 여기에서 하나 이상의 임상학적 요인은 임상반응에 관련한 BH3 프로파일 특이성 및/혹은 민감도를 증가시켜 하나 이상의 임상요인을 선택한다.

다른 양태로, 이 발명은 환자의 암 치료방법을 제시하는데, 이는 환자의 흡수 가능한 암세포와 하나 이상의 BH3 peptide시발 정도로 구성되고, 환자의 암세포로부터 한 개 이상의 임상학적 요인을 면역세포 화학법 및 형광 in situ hybridization으로 결정하고, 다수의 암 치료에 부합하는 가능성을 결정한다.

일부 다른 양태의 실시 예로 암은 예를 들어 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 여포 성 림프 종, 급성 림프 구성 백혈병 (ALL), 만성 림프 구성 백혈병 과 비 Hodgkin 림프 종 (맨틀 세포 림프 종, 확산 대형 B 세포 림프 종)과 같은 혈액 암 이다.

일부 실시 예로, 발명은 하나 이상의 항암 치료제, 화학치료, 수술, 보조 요법 (수술 전)과 선행치료 (수술 후) 등의 암 치료의 효율성을 예측 한다. 다른 실시 예로, 암 치료제로는 하나 이상의 BH3 mimetic, 후생 유전학적 변성 시약, 토포 아소머레이즈 억제제, cyclin-dependent kinase 억제제, kinase-spindle 단백질 안정시약 등이 있다. 역시 다른 실시 예로, 암 치료제로 proteasome억제제, 세포주기 조절 (cyclin dependent kinase억제제와 같은 비 제한적 방법에 의한), 세포후생 유전학적 조절 (하나이상의 histone deacetylase (HDAC), 아자시티딘, deciabine 과 같은 비 제한적 방법에 의한), anthracycline 혹은 anthracenedione (하나 이상의 epirubicin, doxorubicin, mitoxantrone, daunorubicin, idarubicin과 같은 비 제한적 방법에 의한), 백금 기반의 치료 (하나이상의 carboplatin, cisplatin, oxaliplatin과 같은 비 제한적 방법에 의한), 시타라빈 혹은 시타라빈 기반 치료, BH3 mimetic (하나 이상의 BCL2, BCLXL, MCL1같은 비 제한적 방법에 의한), MCL1 억제제 가 있다.

일부 실시 예로, BH3 양상은 환자 암세포의 투과로 구성되는데, 이는 하나 이상의 BH3 peptide 가 연결된 미토콘드리아 세포막 포텐셜의 변화를 결정하고 정량 한다. 여기에 기술한 임상요소에 따른 이 계측은 환자의 반응 혹은 여러 치료방법에 따라 차별성에 도움을 준다.

이들 또는 다른 실시 예에서, BH3 프로파일은 펩티드를 사용하는데, 여기에서 펩티드는BIM, BIM2A, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK, PUMA2A 이다. 일부 실시 예에서, 펩티드는 0.1 μM 내지 200 μM 의 농도와 여러 농도로 사용한다. 일부 실시 예에서, 시료를BH3 프로파일은 시료의 침투하여 미토콘드리아에 대한 접근을 허용 한다. 이러한 또는 다른 구체 예에서, BH3 프로파일은BH3 프로파일을 결정하는 단계와AML 환자의 암세포 시료에 BIM 을 접촉시키는 것을 포함한다.

일부 실시 예에서, 시료는 냉동 종양 조직 표본, 배양 된 세포, 순환 종양세포, 로부터 및 포르말린 고정 파라핀 포매 종양 조직 시료 (예: 항체 기반 BH3 프로파일을 위한) 로부터 얻어진 생검 조직 이다. 다른 실시 예에서, 시료는 인간 종양 유래 세포주 이다. 다른 실시 예에서, 시료는 암 줄기 세포 이다. 다른 실시 예에, 시료는 고형 종양의 생검 (예컨대, 하나 또는 대장, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 신장, 난소 또는 일차 종양 이상의 비 제한의 방식으로) 으로부터 얻어진다. 다른 실시 예에서, 시료는 상피 기원인데, 이는 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 또는 다른 상피 세포 결합 항체가 결합 된 고체 기질 또는 구슬로부터 얻어진다. 다른 실시 예에서, 시료는 간엽 기원인데 이는 예를 들면, 신경 세포 부착 분자 (N-CAM) 또는 뉴로 필린 또는 다른 중간 엽 세포가 고체 기질 또는 구슬에 결합한 항체와 결합하여 얻어진다. 다른 실시 예에서, 시료는 비 - 고형 종양 의생검으로부터 유도 된다. 다른 실시 예에서, 시료는 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프 구성 백혈, 만성 림프구 백혈병, 맨틀 세포 림프 종, 파생 큰 B 세포 림프 종 및 비 Hodgkin 림프 종 환자의 생검에서 얻어진다. 다른 실시 예에서, 시료는 고체 매트릭스 또는 비드 에 결합 된 항 CD138 항체생검 샘플로부터 선택 되는 다발성 골수종 세포 이다. 다른 실시 예에서, 암 세포 는CD45 항체에 결합되는 급성 골수성 백혈병이다. 또 다른 실시 예에서, 암 세포는 비- B 세포 고갈 에 의해 얻어진 lymphogenous 만성 백혈병 또는 큰 B 세포 림프종이다. 다른 실시 예에서, 시료는 순환 종양 세포로부터 유래 된다.

다양한 실시 예에서, 임상 팩터는 하나 이상의 나이, 유전 학적 상태, 성능, 조직 학적 서브 클래스, 성별, 질병 단계이다. 다른 실시 예에서, 상기 방법은 돌연변이 상태, 단일 염기 다형성, 정상 상태의 단백질 수준 및 동적 단백질 수준으로부터 추가의 바이오 마커의 측정을 통해 테스트에 더욱 특이성 및 / 또는 감도를 부여한다. 다른 실시 예에서, 상기 방법은 환자의 임상적 반응을 예측 하는 단계를 포함한다. 다른 실시 예에서, 임상적 반응 은 최소 약 1, 2, 3또는 약 5 년간 진행/생존율이다.

특정 구현 예에서, 프라이밍은 다음 식으로 정의된다:

AUC 는 곡선 아래지역 또는 신호강도; DMSO 는 기준선 대조군; CCCP (Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)은 기준선 양성 대조군을 포함하는 미토콘드리아 전자 전달계의 전자 캐리어들의 정상활동 하는 동안 설정된 양성자 그레디언트의 언 커플 링 에이전트 로서 작용 하는 단백질 합성의 이펙터이다. 일부 실시 예에서, 곡선 아래의 면적은 균질 시간 - 분해 형광 (HTRF) 에 의해 확립된다. 일부 실시 예에서, 시간은 약 0 내지 약 300 분, 약 0내지 약 30 분 사이 발생한다. 일부 실시 예에서, 곡선 아래의 영역은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 에 의해 확립된다. 일부 실시 예에서, 신호 강도는 약 5 분 내지 약 300 분 사이에 발생한 단일 시점의 측정 이다.

다른 실시 예에서, 상기 방법은BH3 프로파일 분석 및 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK -1 kinase의 인산화 상태 및Bcl -2 의 70 번째 위치의 serine 인산화를 분석하여; 이는AML 환자 치료 시 시타라빈 또는시타라빈기반 화학 요법 및/또는 아자시티딘 효율성에 연관된다.

다른 실시 예에서, 상기 방법은BH3 프로파일 분석 및 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK -1 kinase의 인산화 상태 및Bcl -2 의 70 번째 위치의 serine 인산화를 분석하여; 이는MM 환자 화학치료 시 효율성에 연관된다.

일부 실시 예에서, 암은 AML 및/또는 MM 이며, 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 유전 학적 상태 이다; 또는 암은 AML 및/또는 MM 이고 암 치료는 시타라빈 또는시타라빈기반 화학 요법 및/또는 아자시티딘, 또는 암 치료는 시타라빈 또는시타라빈기반 화학 요법 및/또는 아자시티딘 이며 임상 인자는 연령 프로파일 및/또는 유전 학적 상태, 또는 암 치료 또는 시타라빈 또는시타라빈기반 화학 요법 및/또는 아자시티딘이며; 암은 AML 및/또는 MM 이고; 임상 요인은 연령 프로파일 및/또는 세포 유전 학적 상태이다.

대표적인 임상 의사 결정

일부 실시 예에서, 본 출원에서 기술된 방법은 치료에 대한 진단, 예후 및 반응을 평가하는 환자의 평가에 유용하다. 다양한 양태에서, 본 발명은 종양 또는 혈액 암을 평가 하는 단계를 포함한다. 다양한 실시 예에서, 평가는 치료 진단, 예후 및 반응으로부터 선택 될 수 있다.

진단은 암과 같은 가능한 질환 또는 장애를 식별하기 위해 시도 하는 과정을 말한다. 예후 는 암 같은 질병 또는 질환의 가능성을 예측하는 결과를 의미한다. 전체 예후는 종종 예상 기간, 기능, 진행 감소, 간헐적인 위기, 또는 응급, 예측 불가능한 위기와 같은 질병 의 과정에 대한 설명이 포함되어 있다. 치료를 받을 때 치료에 대한 반응은 환자의 의료 결과 의 예측 이다. 치료 에 대한 반응은 비 제한적인 예에 의한, 병리학적 완전반응, 생존 및 무 진행 생존, 진행 시간, 재발의 확률 의 방법으로 정할 수 있다.

다양한 실시 예에서, 본 방법은 환자가 특수 치료를 받을지 여부에 관한 임상적 결정을 도와준다. 일 실시 예에서, 본 방법은 선행 및/또는 보조 화학 요법 또는 항암 및/또는 보조 화학 요법에 비-반응성에 대한 양성 반응의 예측이다. 일 실시 예에서, 본 방법을 통해 전-세포 사멸 에이전트 또는 세포 사멸을 통해 동작하는 에이전트 및/또는 세포 사멸 또는 세포 자멸 이펙터 무반응 에이전트를 통해 동작하는 하지 않는 에이전트 및/또는 세포 사멸을 통해 작동하지 않는 에이전트에 양성 반응을 예측할 수 있다. 다양한 실시 예에서, 본 발명은 예를 들어 투여 또는 보류 되어야 할 암 환자의 치료를 지시한다.

일 실시 예에서, 본 방법은 환자가 제한 없이 단일 단독 보조제 요법을 포함하여, 기본 주요 또는 초기 치료 후 치료 보조제를 투여 할지 여부에 관한 임상적 결정을 지시한다. 보조제 치료라는 보조적 요법은 주 메인 또는 초기 치료 에 부가된 치료 이다. 비 제한적인 예로서, 보조제 요법은 일반적으로 모든 검출 가능한 질병이 제거 된 수술 후 주어진 추가적인 처리 일 수도 있지만, 통계적으로 불가사의한 질환의 재발위험 때문에 시행한다.

일부 구체 예에서, 본 방법은 보조제 요법을 포함하는 환자의 치료를 지시한다. 예를 들어, 환자는 보조 요법 등의 치료를 받을 수 있는 특정 치료 에 반응하게 점수화 된다. 또한, 본 방법은 유도 및/또는 하지 않는 전-세포사멸 방식 또는 그렇지 않은 처리로, 비 제한적인 예로서 보조제 요법 종류를 지시 할 수 있다. 일 실시 예에서, 본 방법은 환자가 되지 않거나 특정 치료의 반응 여부를 지시하여, 환자에 보조제 요법 실시여부를 지시 할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시 예에서, 본 방법으로 환자의 응답 가능성에 따라 보조제 요법의 제공여부를 제공한다. 이러한 방식으로, 환자의 삶의 질과 관리의 비용이 개선 될 수 있다.

다양한 실시 예에서, 본 방법은 환자가 예를 들어, 수술 전에 축소 및/또는 다운 그레이드 치료하는 선행항암 치료여부에 관한 임상적 결정을 지시한다. 일부 실시 예에서, 선행항암 치료는 수술 전에 암 환자 에게 시행하는 화학요법을 의미한다. 일부 실시 예에서, 선행항암 치료는 본원에 기재된 것을 포함하여 수술 전에 암 환자에게 투여제제를 의미한다. 선행항암 화학 요법의 암의 종류는 일반적으로 간주 되는, 예를 들어, 유방, 대장, 난소, 자궁, 방광, 폐암이다.

일부 구체 예에서, 본 방법은 환자에 특정 유형의 치료를 할지 여부에 관한 임상적 결정을 지시한다. 따라서, 몇몇 실시 예에서, 본 방법은 환자의 치료를 위한 안내테스트이다.

몇몇 실시 예에서, 본 방법은 환자가 특정한 치료에 응답 가능성에 대한 정보를 제공한다. 일부 구체 예에서, 본 방법은 반응의 높은 가능성을 제공하고 적극적인 치료를 포함한 치료를 지시 할 수 있다. 일부 구체 예에서, 본 방법은 반응의 낮은 가능성을 제공하고 보다 나은 삶의 질 에 대한 화학 요법 에서 효과가 불필요한 독성 을 피하기 위해 적극적인 치료 및 완화 치료의 사용을 포함하는 치료의 종료를 지시 할 수 있다.

예시적인 실시 예에서, 본 방법은 특정 치료에 대한 반응의 가능성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 일부 실시 예에서, 본 방법은 전-세포 자멸사 제 및/또는 세포 자멸사에 의한 약제 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 구동되는 세포 자멸사를 통해 작동제에 대한 응답 의 높거나 낮은 확률을 나타낸다. 다양한 실시 예에서, 세포 사멸 및/또는 직접 단백질 변조에 의해 구동 세포 사멸을 통해 동작하는 약제는ABT-263 (Navitoclax), and obatoclax, WEP, bortezomib, and carfilzomib이다. 일부 구체 예에서, 본 방법은 세포 사멸을 통하지 않은 약제 및/또는 단백질 직접 변조에 의해 구동되는 세포 사멸을 통해 작동하지 않는 약제를 통해 응답의 높거나 낮은 확률을 나타낸다. 다양한 실시 예에서, 세포 자멸사를 통해 동작하지 않는 실시 약제는kinesin spindle protein inhibitors, cyclin-dependent kinase inhibitor, Arsenic Trioxide (TRISENOX), MEK inhibitors, pomolidomide, 아자시티딘, decitibine, vorinostat, entinostat, dinaciclib, gemtuzumab, BTK inhibitors, PI3 kinase delta inhibitors, lenolidimide, anthracyclines, 시타라빈, melphalam, Aky inhibitors, mTOR inhibitors 이다.

예시적인 실시 예에서, 본 방법은 환자가 전 세포자멸사 약제 또는 암 치료를 위한 세포 자멸사를 통한 약제를 수신 할지 여부를 나타낼 것이다. 다른 예시적인 실시 형태에서, 본 방법은 환자가 세포자멸을 통해 작동하지 않는 치료제를 수신 할지 여부를 나타낼 것이다.

특정 실시 예에서, 본 방법은 본원에 기재된 치료(약제포함)의 암 환자의 반응을 예측 하는데 유용하다. 예시적인 실시 예에서, 본 발명은 시타라빈 및 아자시티딘에 대한 AML 환자의 가능성을 예측 하고, 환자의BH3 프로파일, 연령 프로파일 및 세포 유전 인자 의 평가를 포함한다.

다양한 실시 예에서, 암 치료는 본원에 기재된 방법을 기반으로 투여 또는보류한다. 예시적인 치료는 수술 적 절제, 방사선 치료 (본원에 기재된 화합물의 사용 또는 방사선 치료 병행 포함), 화학 요법, 약력학적 치료, 타겟 요법, 면역 요법 및 부가 요법 (예를 들어, 진통제, 이뇨제, 항 이뇨제, 항 바이러스제, 항생제, 영양제, 빈혈 치료제, 혈액 응고 치료제, 뼈 치료제, 정신과 및 심리 치료) 을 포함한다.

대표적인 치료

예시적인 실시 예에서, 본 발명은 치료약제를 선택한다. 이러한 제제의 예로는 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 항암제, 화학 요법, 수술, 보조치료 및 선행 항암 요법을 포함한다. 일 실시 예에서, 암 치료 는 하나 또는BH3 유사체, 후생 유전학적 개질제, 토포 이소머라제 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제 의 이상, 키네신 스핀들 단백질 안정 제 이다. 다른 실시 예에서, 암 치료는 프로테아좀 억제제; 및/또는 세포주기 조절 (비 제한적인 예로 사이클린-의존성 키나제 억제제에 의해); 및/또는 세포 후생 유전학적 기전의 변조 (비 제한적인 예로, 하나 이상의 히스톤 디 아세틸 라제 (HDAC) (예를 들면 하나 이상의vorinostat또는 entinostat), 아자시티딘, decitabine); 및/또는anthracycline 또는anthracenedione (예를 들어, 하나 이상의epirubicin, doxorubicin, mitoxantrone, daunorubicin, idarubicin에 의해); 및/또는 백금계 (예를 들면, 하나 이상의carboplatin, cisplatin, and oxaliplatin 비 제한적 예로) 의 치료; 시타라빈 또는 시타라빈-기반 화학 요법; BH3 유사체 (예로, 하나 이상의BCL2 , BCLXL 또는 MCL1의 비 제한적인 의해); 및 MCL1 의 억제제이다.

다양한 실시 예 에서, 암 치료에 관한 본 발명은 제한 없이US 특허 공보US 2012-0225851 및 국제 특허 공개 공보 WO 2012/122370에 기재된 것을 포함하며, 이와 관련하여 내용은 본원에 그 전체가 참조로 인용된다.

다양한 실시 예 에서, 본 발명은 암 치료에 제한 없이 하나 또는 그 이상의 다음을 포함한다. thiotepa and CYTOXAN cyclosphosphamide 같은alkylating agents; busulfan, improsulfan 및 piposulfan 같은alkyl sulfonates; benzodopa, carboquone, meturedopa, 및uredopa 같은aziridines; altretamine, triethylenemelamine, trietylenephosphoramide, triethiylenethiophosphoramide and trimethylolomelamine 를 포함한ethylenimines 및 methylamelamines; acetogenins (예., bullatacin 및 bullatacinone); camptothecin (합성유사체topotecan 포함); bryostatin; cally statin; CC-1065 (adozelesin, carzelesin및bizelesin 합성유사체 포함); cryptophycins (예., cryptophycin 1 및cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (합성유사체 포함, KW-2189 및CB 1-TM1); eleutherobin; pancratistatin; sarcodictyin; spongistatin; chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard같은nitrogen mustards; carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, and ranimnustine 같은nitrosureas; enediyne antibiotics (예., calicheamicin, especially calicheamicin gammall 및 calicheamicin omegall (예., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) 같은antibiotics; dynemicin, including dynemicin A; clodronate 같은 bisphosphonates; esperamicin; 및 neocarzinostatin chromophore 과 관련된 chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores), aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, caminomycin, carzinophilin, chromomycinis, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, ADRIAMYCIN doxorubicin (including morpholino- doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, 2-pyrrolino-doxorubicin and deoxy doxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycin C, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU) 같은 mitomycins; denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate같은folic acid 유사체; fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine 같은purine유사체; ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, 시타라빈, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine같은pyrimidine유사체; calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; anti-adrenals such as minoglutethimide, mitotane, trilostane 같은 androgens; frolinic acid같은 folic acid replenisher; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; demecolcine; diaziquone; elformithine; elliptinium acetate; an epothilone; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainine; maytansine and ansamitocins 같은 maytansinoids; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; phenamet; pirarubicin; losoxantrone; podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxane; rhizoxin; sizofuran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2',2"-trichlorotriethylamine; trichothecenes (예., T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidine); urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ("Ara-C"); cyclophosphamide; thiotepa; taxoids, 예., TAXOL paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE Cremophor-free, albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및TAXOTERE doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); chloranbucil; GEMZAR gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; cisplatin, oxaliplatin and carboplatin 같은platinum 유사체; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; vincristine; NAVELBINE. vinorelbine; novantrone; teniposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; irinotecan (Camptosar, CPT-11) (5-FU 및 leucovorin와irinotecan의 치료규칙 포함); topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO); retinoic acid 같은 retinoids; capecitabine; combretastatin; leucovorin (LV); oxaliplatin treatment regimen (FOLFOX) 포함 oxaliplatin; lapatinib (Tykerb); PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR (예., erlotinib (Tarceva)) 저해제 및 세포증식 감소VEGF-A, dacogen, velcade, 및 약리학적 염기, 산 혹은 위의 유사체.

대표적인 탐지 방법

다양한 실시 예에서, 본 방법은 단백질 및/또는 핵산의 존재 유무, 또는 레벨을 평가 하는 단계를 포함한다. 다양한 실시 예에서, 본 방법은 단백질 및/또는 핵산의 존재 유무, 또는 레벨을 평가 하여BH3 프로파일의 특이성 및/또는 민감성을 향상시킬 수 있다. 일부 실시 예에서, 평가는 환자의 응답 마커이다. 일부 구체 예에서, 본 방법은 하나 이상의 면역 염색, 웨스턴 블롯팅, 형광면역 염색, ELISA, FACS 혹은 본원에 기재된 다른 방법을 사용하여 측정을 한다. 본 방법은 조직이나 체액에 특정한 항원 결정기를 식별하는 종양 표본 (예를 들어 생검 또는 조직 또는 체액) 과 항체를 접촉시키는 단계를 포함 할 수 있고, 그것은 암 상태의 지표이다.

체액 또는 조직으로부터 항원 검출 에는 직접 방법과 간접 방법의 두 가지 전략이 일반적으로 있다. 직접적인 방법은 한 단계 염색을 하는데, 체액 또는 조직 샘플의 항원과 직접 반응하는 표지 된 항체 (예, FITC가 결합된 항혈청)을 포함 할 수 있다. 간접법은 체액 또는 조직 항원과 반응하는 비 표지 1 차 항체에 1차 항체와 반응하는 표지 된 이차 항체를 포함한다. 표지는 방사성, 형광, 바이오틴과 같은 hapten 혹은horse radish peroxidase or alkaline phosphatase같은 단백질을 포함 할 수 있다. 이러한 분석을 수행 하는 방법은 이 분야에 잘 알려져 있다. 참조Harlow et al. (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988), Harlow et al. (Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1999), Virella (Medical Immunology, 6th edition, Informa HealthCare, New York, 2007), and Diamandis et al. (Immunoassays, Academic Press, Inc., New York, 1996). 이러한 분석을 수행하기 위한 키트는 Clontech Laboratories, LLC. (Mountain View, CA)와 같은 곳 에서 시판 되고 있다.

다양한 실시 예에서, 항체는 전체 항체 및/또는 임의의 항원 결합 단편 (예를 들면, 항원 - 결합 부분) 및/또는 이들의 단일 사슬 을 포함하기도 한다 (예를 들면 최소 두 개의heavy (H) chains 과 두 개의 light (L) chain의 이황화 결합인 Fab 단편, V_H, C_L and CH1도메인 으로 된 monovalent단편; F(ab)₂단편, 힌지에서 이황화브릿지에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는bivalent 단편; V_H와 CH1도메인 으로 된Fd 단편; 항체 단일 팔의V_L and V_H 도메인 으로 이루어진Fv 단편). 다양한 실시 예에서, 절연 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 기능적 단편 이기 때문에 폴리 클로날 및 모노클로날 항체가 유용하다.

다양한 종의 표적에 대한 항체의 결합을 측정하는 표준 분석법은 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함해 이 분야 에 공지되어 있다. 항체의 결합 동력학 (예: 결합 친화도)은 Biacore분석과 같은 업계에 공지 된 표준 검정 에 의해 평가 될 수 있다.

다른 실시 예에서, 측정은 핵산의 존재 유무, 또는 레벨을 평가 하는 단계를 포함한다. 당 업자는 다수의 방법이DNA/RNA수준을 검출 또는 정량화 하는데 적절한 마커가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

유전자 발현은 예를 들어, low-to-mid-plex기법을 사용하여 측정 하며 이는reporter gene assays, 노던 블롯, fluorescent in situ hybridization (FISH), 전사 PCR (RT-PCR)등 이다. 유전자 발현은, 예를 들어, higher-plex기술을 이용하여 측정을 하는데 이는 serial analysis of gene expression (SAGE), DNA microarrays. Tiling array, RNA-Seq/whole transcriptome shotgun sequencing (WTSS), high-throughput sequencing, multiplex PCR, multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), DNA sequencing by ligation, and Luminex/XMAP 이다. 당 업자는 다수의 방법이 microarrays, RT-PCR (including quantitative PCR), nuclease protection 분석 과 노던 블롯 같은arrays가 샘플 내 바이오 마커 의 RNA 산물의 수준을 정량화 하는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

대표적인 암 환자

일부 실시 예에서, 본 발명은 암 치료를 결정하기 위한 방법을 제공 및/또는 환자의 종양 또는 암 세포 시료를 포함한다. 암 또는 종양은 조절할 수 없이 증가된 세포 및/또는 비정상적으로 증가된 세포의 생존 및/또는 신체 기관과 시스템의 정상적인 기능을 방해하는 세포의 사멸의 억제 제어되지 않는 성장을 의미한다. 암 또는 종양을 갖는 주체는 주체의 몸에 존재하는 객관적으로 측정 가능한 암세포를 갖는 대상 이다. 본 발명 에 포함됨은 양성 및 악성 암뿐만 아니라 휴면 종양 또는 micrometastatses 이다. 원래 위치 와 근원 장기로부터 이동하는 암은 결국 영향을 받는 장기의 기능 저하를 통해 피사체의 죽음으로 이어질 수 있다.

다양한 실시 예에서, 본 발명은 전이내재성 암 또는 암 전이에 적용 가능하다. 전이는 신체의 주 사이트에서 다른 장소로 암의 확산을 의미한다. 암 세포는 기본 종양에서부터 림프 와 혈관에 침투하여, 탈피 혈류를 순환 하고, 몸의 다른 부위의 정상 조직에서 먼 부위 (전이)에서 증가 할 수 있다. 전이는 근 또는 원 부위가 될 수 있다. 전이는 종양 세포가 기본 종양에서 혈류를 통해, 먼 부위에 정착하는 대한 우발 순차적인 과정이다. 새로운 위치 에서, 세포는 혈액 공급을 확립하고 생명을 위협하는 덩어리를 형성하도록 성장할 수 있다. 종양 세포 내의 자극 및 억제 분자 경로는 이 동작을 조절하고, 먼 위치에 있는 종양 세포 와 숙주 세포 사이의 상호 작용은 중요하다. 전이는 특정 증상의 모니터링에 더하여 종종 자기 공명 영상 (MRI) 스캔, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔, 혈액 혈소판 수, 간 기능 연구, 흉부 X 선 및 뼈 스캔의 단독 또는 조합을 사용하여 검출된다.

본원에 기재된 방법은 암의 예후, 암 진단, 암의 치료 및/또는 진단, 예후, 치료, 예방 또는 성장, 진행의 완화 및/또는 악성 종양 및 증식성 질환의 전이 증가와 연관된 세포 생존 또는 세포사멸 억제로 향한다. 일부 실시 예에서, 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 여포성 림프 종, 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 등을 포함한 혈액암이지만, 한정되지 않고, 맨틀 세포 림프 종, 확산 큰 B 세포 림프종을 포함한 비-Hodgkin림프종이다. 일부 실시 예에서, 암은 고형 종양이지만, 비소 세포 폐 암종, 난소암, 흑색 종, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 실시 예에서 ,본 발명은 다음의 암 중 하나 이상에 관한 것이다 : 급성 림프 구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신 피질 암, 에이즈 관련 암, 항문 암, 부록 암, 성상 세포종 (예를 들어 어린 시절 소뇌 또는 대뇌 ), 기저 세포 암, 담도 암, 방광암, 뼈 종양 ( 예를 들어, 골육종, 악성 섬유 조직 구종), 뇌간 신경 교종, 뇌종양, 뇌 종양 (예를 들면 소뇌 성상 세포종, 대뇌 성상 세포종 / 악성 신경 교종, 뇌실막 세포종, 수 모세포종, 천막 상부 원시 신경 외배엽 종양, 시각 통로 및 시상 하부 신경 교종), 유방암, 기관지 선종 / 유암종 , 버킷 림프 종, 카르시 노이드 종양, 중추 신경계 림프 종, 소뇌 성상 세포종, 자궁 경부암, 만성 림프 구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수 증식 성 질환, 대장 암, 피부 T 세포 림프 종, 결합 조직 형성 소 원형 세포 종양, 자궁 내막 암, 뇌실막 세포종, 식도암, 유잉 육종, 두개 외 생식 세포 종양, extragonadal 생식 세포 종양, 간외 담도 암, 눈 의 암, 담낭암, 위암 (위) 암, 위장관 간질 종양 (GIST), 생식 세포 종양 (예를 들어 두개 외, extragonadal, 난소), 임신성 융모 성 종양, 신경 교종 (예를 들어, 뇌간, 대뇌 성상 세포종, 시각 통로 및 시상 하부), 위 유암종, 머리와 목 암, 심장 암, 간세포 (간) 암, 하인두암 시상 하부 및 시각적 통로 교종, 안구 흑색 종, 췌도 세포 암종 (내분비 췌장) , 신장 암 (신 세포 암), 후두암, 백혈병 (예 : 급성 림프 성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프 구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털 세포), 입술 및 구강암, 지방 육종, 간암 , 폐암 (예 : 비-소세포, 소세포), 림프 종 (예 : AIDS 관련, 버킷, 피부 T 세포 지킨, 비호 지킨, 원발성 중추 신경계), 수 모세포종, 흑색 종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 구강암, 여러 내분비 종양 증후군, 다발성 골수종, 균 상식 육종, 골수이 형성 증후군, 골수이 형성 / 골수 증식 질환, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수 증식 질환, 만성, 비강 및 부비동 암, 비강 인두 암종, 신경 모세포종, 비 - 호 지킨 림프 종, 비 - 소세포 폐암, 구강암, 인두 암, 골육종, 난소 암, 췌장암, 췌장암, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경 암, 인두 암, 갈색 세포종, 송과체 성상 세포종 및/또는 germinoma, pineoblastoma 및 천막 상부 원시 신경 외배엽 종양, 뇌하수체 선종 , 형질 세포 종양 / 다발성 골수종 , pleuropulmonary 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프 종, 전립선 암, 직장암, 신 세포 암 (신장 암), 신우 및 요관, 망막 모세포종, 횡문근 육종, 타액선 암, 육종 (예를 들면 유잉 가족, 카포시, 연조직, 자궁암), 세자리 (Sezary) 증후군, 피부암 (예 nonmelanoma, 흑색 종, 메르켈 세포), 소세포 폐암, 소장 암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위암, 천막 상부 원시 신경 외배엽 종양, t 세포 림프 종, 고환암, 인후 cancerm, 흉선종 과 흉선 암, 갑상선암, 영양막 종양, 요관 및 신우 암, 요도 암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각 통로 와 시상 하부 신경 교종, 외음부 암, 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 및 윌름 종양.

일 실시 예에서, 암은 AML이다. AML은 미국에서 약 13,000명이 새로 진단되고, 매년 9,000 명이 사망하는 두번째 가장 흔한 백혈병 이다. 승인된 치료법이 존재하지만, 많은 백혈병 환자의 예후가 나쁘고 성공적인 치료의 가능성은 낮다. AML에 대한 치료의 현재 표준은 안트라사이클린 에이전트 (예, daunarubicin, idarubicine 또는mitoxantrone 같은)와 함께 사이토신 아라비노사이드 (ara-C) 유도이다. 이것의 최적 치료 계획 은 일반적으로 고용량 의 시타라빈 투여후 및/또는 줄기 세포 이식에 의해 이어진다. 이러한 치료는 젊은 환자의 결과를 개선 했다. 진전은 모든-트랜스 레티노 산 (ATRA) 또는 삼산화 비소에 의한 표적 치료에서 우수한 생존율의 결과를 도출한 급성 골수성 백혈병의 치료 에서 보였다. 그러나, 대부분의 AML 환자를 나타내는 60세 이상의 환자의 치료는 아직 수수께끼로 남아있다. 환자의 65~85%가 처음에는 기존의 치료에 반응 하지만, 이러한 반응자의 65 % 는 재발이 야기되고, 많은 환자는 질병에 굴복하게된다. 적어도 이러한 이유 및 앞서 언급한 치료가 심각한 부작용이 있을 수 있기 때문에, 본 발명의 예측 테스트는 이러한 소송을 완화시킬수 있는 치료의 사용을 안내 할 수있다. 일부 구체 예에서, 본 발명은 적절한 환자에 적당한 치료를 일치시켜 성공적인 치료의가능성을 향상시킨다. 더불어, AML 환자의 치료반응을 예측하는 시험은 현재 존재하지 않는다.

용어 주체는 달리 정의 되지 않는 한, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지같은 포유류 또는 원숭이, 침팬지, 또는 비비와 같은 비-인간 영장류이다. 용어 "주체"와 " 환자 "는 같은 의미로 사용된다.

대표적인 표본

일부 구체 실시예 에서, 본 발명은 생체 검사 또는 외과 표본 샘플을 포함한 종양 시료의 측정을 포함한다. 일부 실시예 에서, 시료 는 종양 세포를 순환, 냉동 종양 조직 표본, 배양 된 세포로부터 선택되고, 포르말린 고정 파라핀 포매 종양 조직 시료 (예: 항체 기반 BH3 프로파일 링). 일부 실시예 에서, 생검생검 인간 이다. 다양한 실시예 에서, 생검은 종양 세포를 순환, 냉동 종양 조직 표본, 배양 세포 중 어느 하나이며, 포르말린 고정 파라핀 포매 종양 조직 시료 (예: 항체 기반 BH3 프로파일링).

일부 구체 예에서, 종양 시료는 냉동 종양 조직 (동결 절단) 시료와 같은 생검 샘플 일 수있다. 이 분야에서 공지 된 바와 같이, 동결 절단을 위해 냉동실 내에 마이크로톰을 포함한 크라이오스탯을 사용할 수 도 있다. 수술 표본을 금속 조직 디스크 상에 놓고, 금속척에 고정 하여 약 -30 ℃ 내지 약 -20 ℃로 급속동결한다. 시편은 폴리 에틸렌 글리콜, 폴리 비닐 알코올과 같은 겔에 고정 한다. 냉동된 조직은 저온 유지 장치의 마이크로톰 부분으로 냉동 절단하고 조직섹션은 선택적으로 유리 슬라이드에 부착시켜 염색 된다.

일부 구체 실시예 에서, 종양 시료는 배양된 세포와 같은 생검 샘플 일 수있다. 이러한 세포는 공지된 통상의 세포 배양 기술을 이용하여 처리 될 수있다. 이 세포들은 순환 하는 종양 세포일 수있다.

일부 구체 예에서, 종양 표본은 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 샘플같은 생체 검사 표본 일 수있다. 이 분야에서 공지 된 바와 같이, 생검 표본은 포르말린 (물과 포름 알데히드의 혼합물) 또는 보존 할 수있는 몇 가지 다른 유체용기에 배치 될 수있다. 조직 샘플은 고온 파라핀 왁스주형 내에 배치 될 수있다. 조직을 보호하는 고체 블록을 형성 하기 위해 왁스를 냉각한다. 포함 된 조직이 파라핀 왁스 블록을 마이크로톰에 배치하여 매우 얇은 조각으로 잘라낸다.

특정 구체 예에서, 종양 시료 (또는 생검)는100 mg 이하의 조직 또는 특정 실시 양태 에서, 약 50 mg 이하의조직을 포함한다. 종양 표본 (또는 생검)은 약 20 mg에서 50 mg 즉, 약 35 mg의 조직을 함유 할 수있다.

조직은 예를 들어, 하나 또는 그 이상 (예, 1, 2, 3, 4, 또는 5) 바늘 생검으로서 획득 될 수있다 (예, 14게이지 바늘 또는 다른 적절한 크기를 사용하여). 일부 실시 예에서, 생검은 가늘고 긴 바늘을 의심되는 영역에 삽입하여 주사기로 흡인 하고 분석을 위한 유체나 세포를 끌어 낸다. 일부 실시 예에서, 생검은 코어 생검에 의해 이루어 지는데 절삭 팁이 있는 큰 바늘을 의심되는 영역 에서 조직을 흡인한다. 일부 실시 예에서, 생검은 진공 보조 생검인데 이 흡입 장치는 바늘을 통해 추출되는 유체 및 세포의양을 증가 한다. 일부 실시 예에서, 생검은 X 레이, 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI) 또는 초음파와 같은 촬영 절차와 결합 되는 영상 유도 조직 검사 이다. 다른 실시 예에서, 이 샘플은 레이저 유방 생검, 진공 보조 생검 시스템 안내MAMMOTOME® 생검 시스템 과 같은 장치를 통해 획득 될 수있다.

특정 구현 예에서, 시료는 인간 종양 유래 세포주 이다. 특정 구현 예에서, 시료 는 암 줄기 세포 이다. 다른 실시 예에서, 시료는 대장, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 신장, 난소 또는 일차 종양 의생 검과 같은 고형 종양의 생검에서 유래 한다.

특정 구현 예에서, 시료 는 상피 기원이다. 일부 구체 예에서, 상피 시료는 항 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 또는 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 다른 상피 세포 결합 항체로부터 선택에 의해 농축 된다.

특정 구현 예에서, 시료 는 중간엽 기원이다. 일부 실시 예에서, 중간엽 시료는 신경 세포 부착 분자 (N- CAM) 또는 뉴로 필린 시험편고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 또는 다른 중간엽 세포 결합 항체와생검 샘플로부터 선택에 의해 농축 된다.

특정 실시 양태에서, 시료는 예를 들어, 여기에 기술된 암세포, 비-고형 종양 생검에서 얻어진다. 특정 실시 예에서, 시료는 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 확산 큰 B 세포 림프종 및 비Hodgkin림프종을 가진 환자의 생검에서 얻어진다. 특정 실시 예에서, 시료는 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 항 CD138 항체 생검 샘플로부터 선택에 의해 농축 된 다발성 골수종 세포 이다. 특정 실시 예에서, 시료는CD45-지향 항체에 결합된 급성 골수성 백혈병 세포 이다. 특정 실시 예에서, 시험편은 만성 림프구성 백혈병 또는 비-B 세포 고갈에 의해 얻어진 확산 큰 B 세포 림프종이다.

일부 실시예 에서, 시료는 순환 종양 세포로부터 유래 된다.

BH3 Profiling

다양한 실시 예에서, 본 발명은 BH3 프로파일을 포함한다. 다양한 실시 예에서, 본 발명은 적어도 2, 3, 4, 5,6,7,8,9,10개의 BH3 펩티드들이 한번에 평가되는 BH3 프로파일을 포함한다. 일부 구체 예에서, 본 방법은BH3 단일 펩티드의 평가와는 대조적으로 여러 펩디드 분석을 포함한다. 일부 실시 예에서, BH3 펩타이드패널은 한 명의 환자 시료에서 스크리닝 하였다.

일부 실시 예어서, BH3프로파일은BIM, BIM2A, BAD, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK, 및 PUMA2A의 하나이상의 펩티드의 사용을 포함한다. 일부 실시 예에서, 본원에 그 전체 가 참조로 인용된다내용 있는 US 특허 제 8,168,755 에 기재된 바와 같이BH3프로파일은BIM, BIM2A, BAD, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK, 및 PUMA2A의 하나이상의 항체의 사용 및 천연으로 형성되는 두개의Bcl-2 단백질로 형성된 이종 중 하나 이상 에 대해 지시된 항체의 사용을 포함한다. 예를 들어 첫 번째 Bcl-2 단백질 (예: Bim, Bid, Bad, Puma, Noxa, Bak, Hrk, Bax, 또는 Mule)와 두 번째 Bcl-2 단백질 (예: Mcl-1, Bcl-2, Bcl-XL, Bfl-1 or Bcl-w). 일부 실시 예에서, BH3 프로파일은 스테이플 펩티드의 사용을 포함하는데 (예를 들면 단백질이 더 엄격한 세포에 침투 할 수 있도록 하는 탄화수소 결합을 갖는3-D 알파-헬릭스 단백질 세그먼트의 합성촉진을 통해 생성된 펩티드) 설명한 바와 같이, 예를 들면, Verdine, et al. "Stapled Peptides for Intracellular Drug Targets" Methods in Enzymology, Volume 503 (Chap. 1), 본원에 그 전체가 참조로 인용된다.

일 실시 예에서, 펩티드는 약 0.1내지 약 200μM의 농도로 사용된다. 일부 구체 예에서, 약 0.1에서 약 150, 약 0.1 내지 약 100 또는 약 0.1 내지 약 50, 약 0.1 내지 약 50, 또는 약 0.1 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 5, 약 1 내지 약 150 또는, 약 1 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5 μM, 또는 약 10내지 약 100 μM의 펩타이드가 사용된다. 일부 실시 예에서, 약 0.1, 또는 약 0.5, 또는 약 1.0, 또는 약 5, 또는 약 10, 또는 약 50, 또는 약 100, 또는 약 150, 또는 약 200 μM펩티드의 농도가 사용된다. 일 실시 예에서, BH3 프로파일은permeabilizing시편을 포함한다.

BH3 프로파일 및 미국 특허 번호7,868,133; 8,221,966; 및 8,168,755 및US 특허 공보 제 2011/0130309에 설명되어 있는방법에 대한 유용한 시약은 본 명세서에 그 전체가 참조로 인용된다.

간단히, 이론에 의해서 제한 되기를 바라지 않고, 비정상적인 표현형의 결과로서, 암세포는 세포사멸 경로를 차단한다. 이 차단은 암 세포를 어느 치료에 내성 갖게 하고, 놀라울 정도로, 일부 암 세포는 다른 치료에 민감하게 한다. "종양 유전자 중독" 의 개념은 생존을 위한 특정 단백질에 취득한 암세포의 의존성 또는 중독현상을 설명한다. BH3 프로파일은 암세포에서 특정 세포사멸 조절 단백질에 의존하고, 종속 단백질을 식별하는 경우을 결정한다. 암 세포는 항상 그렇지는 않지만, 세포사멸을 거치도록 되어있고, 이 기능은 자신의 그렇지 않으면 의도하지 않은 생존을 위한 모든anti-apoptotic Bcl-2 family에 의존 하는 것이 이들 세포의 기능이다. 이것이 암 세포 치료에 반응하는 가능성에 대한 통찰력을 제공한다.

이론에 의해서 제한 되기를 바라지 않고, 암 세포는 예컨대 DNA 손상, 유전적 불안정성, 비정상적인 성장 인자신호, 비정상 혹은 결핍 매트릭스 상호관계들중 어떤 것이 전형적으로 고유의 (미토콘드리아) 세포사멸 경로를 통해 세포 자멸사를 유도 한다. 그러나 이러한 세포사멸의 신호에 반하여 암세포는 생존한다. 종종, 그렇게 함으로써 이들 세포는 만성세포사멸 신호에 선택된 차단에 크게 의존 하게된다. 이러한 적응은 암세포에 대한 생존 메커니즘을 제공하는 한편 이러한 적응은 또한 특별한 세포사멸 유도 치료법 암세포 민감하게 만든다. 고유 세포사멸에 의해 세포가 죽는 중요한 이벤트는 미토콘드리아 외막 (MOMP) 의 투과성과effector caspases를 활성화 시키는 분자의 방출이다. 많은 경우에, MOMP 는 주요 매개체이고, 고유의 세포 사멸 경로 에 돌아올 수없는 지점이다. Bcl-2 family단백질은 MOMP 의 주요 조절인자이며, 그들의 활동은 림프 및 여러 고형 종양암의 발병에 연결되어 화학요법에 저항의 주요 매개체로 많은 암에서 생각된다.

BCL-2 단백질은 전생존 (항 세포사멸) 과 전세포 사멸 구성원 간의 서로 다른 단백질 - 단백질 상호 작용에 의해 조절된다. 이러한 상호 작용은 BH3 (Bcl-2 homology domain-3)의 결합을 통해 주로 발생한다. 세포사멸을 시작하는 신호가 대부분 미토콘드리아의 상류에서 발생해서짧은, BH3 전용, Bcl -2 family를 미토콘드리아로 이동을 초래하고 이곳에서이것들이 MOMP를 활성화하거나 민감화한다. 활성화 BH3 전용 단백질인Bim과 Bid는 전세포 사멸 단백질Bax와 Bak에 결합 또는 직접 이 이펙터를 활성화 하며, 또한Bcl-2, Mcl-1, Bfl-1, Bcl-w, Bcl-xL에 결합하여 항 세포사멸 Bcl -2 family 단백질을 억제 한다. sensitizer BH3 단백질인 Bad, Bik, Noxa, Hrk, Bmf과 Puma는한 세포사멸 Bcl-2 family 단백질인 Bcl-2, Mcl-1, Bfl-1, Bcl-w, Bcl-xL에 결합하여 그들의 항 세포사멸기능을 방해한다. 이론에 의해서 제한되기를 바라지 않고, 각각 증감 단백질은 독특한 특이성 프로파일을 갖는다. 예를 들어, Noxa (A와 B)는 Mcl -1에 높은 친화력을 가지며, Bad는 Bcl-xL, Bcl -2에 강하지만 약하게 Mcl -1에, Puma는 세 가지 모두에 잘 결합한다. 이들 단백질 의 항 세포사멸 기능은 활성제 BH3 단백질 저기 Bim 및 Bid의 봉쇄 이다. 이러한 민감 펩티드의 활성제 변위의 결과로 Bax/Bak 매개 세포사멸 발생한다. 이러한 상호 작용 은 제한성, 항상성, 세포사멸, 세포 자멸의 민감도 및세포 자멸의 차단을 포함하는 다양한 결과를 가질 수있다.

세포 사멸 신호 전달이 차단 되는 암세포의 특징은 기능 미토콘드리아 표면에BH3 단일 활성화 단백질의 축적이며, 이 단백질들의결과로 항 세포사멸 단백질에 의해 격리된다. 자신의 이펙터 표적 단백질의 축적 및 근접은 " BH3 primed "상태에서 Bcl -2 family 단백질의antagonism 으로 증가된 감도로 설명된다.

일부 실시 예에서, NOXA (A 또는 B )에 높은 사멸 반응을 얻은 세포는Mcl -1 primed 인 반면, 펩티드Bad에 높은 반응은 Bcl-xL 또는 Bcl -2의 사멸 차단을 제공한다는 것을 나타낸다. 일부 실시 예에서, Puma는 전체 Bcl -2 family 프라이밍을 반영한다. 이렇게의 Mcl -1나 Bcl-xL또는 두개 모두 또는 몇몇의 Bcl -2 패밀리에 의존하는 세포는 쉽게 구별되 적절한 치료에 따라 맞추어 질 수 있도록 한다. 이들 펩티드의 미토콘드리아에서의 응답차이는 Mcl -1 또는 Bcl-xL이 고유 신호에 영향을 하나의 경로를 통해 작동하는 것으로 알려진 치료법의 사용을 안내한다. 일부 구체 예에서, 본 방법으로 Mcl -1 또는 Bcl-xL의 상위 전체 타겟팅 처치를 표시 또한 금기한다.

BH3 프로파일 분석은 암세포가 프라이밍 상태뿐만 아니라 발생한 프라이밍 구성을 식별하며 이것은 예측값을 갖는다

대표적인 임상 요인 및 추가 바이오 마커

일부 실시 예에서, 본 발명은 임상적 요인의 평가를 포함한다. 일부 실시 예에서, 본 발명은 환자의 반응 평가를 위한 BH3 프로파일 및/또는 임상적 요인의 평가를 포함한다. 일부 실시 예에서, BH3 프로파일 연구와 함께 환자의 응답정보를 제공하는 임상 인자는 세포사멸에 연결 되지 않을 수있다. 일부 실시 예에서, 임상 적 요인은 비-세포 사멸에 영향을 미치는 것이다.

일 실시 예에서, 임상 인자는 표 3 에 나타낸다.

일 실시 예에서, 임상 팩터는 하나이상 나이, 유전 학적 상태, 성능, 조직 학적 서브 클래스, 성별, 질병상태 이다.

일 실시 예에서, 임상 적 요인은 연령이다. 일 실시 예에서, 환자의 연령 프로파일은 약 10 이상, 또는 약 20 이상, 또는 약 30 이상, 또는 약 40 이상, 또는 약 50 이상, 또는 약 60 이상, 또는 약 70 이상, 또는 약 80이상으로 분류한다.

일 실시 예에서, 임상적 요인은 유전 학적 상태이다. 유전자가 삭제되거나 불활성화된 윌름 종양 및망막 모세포종과 같은 일부 암 에서, 일반적으로 종양 억제 와 관련된 염색체 영역들이 삭제되거나 변이에 의해 암 의 진행이 개시된다. 예를 들어, 결실, 역전 및 전좌는 일반적 신경 교종, 비-소세포 폐암, 백혈병 및 흑색종의 염색체 영역 9p21 에서 검출된다. 이론에 의해서 제한되기를 바라지 않고, 이러한 염색체 변화는종양 억제cyclin-dependent kinase inhibitor 2A를 비활성화 할 수있다. 특정 유전자의 이러한 삭제와 함께, 염색체의 많은 부분이 손실 될 수 있다. 예를 들어, 염색체 1P와 16q는 일반적으로 고체 종양 세포에서 삭제된다. 유전자 카피 수의 유전자 중복 및 증가는 암에 기여할 수 있으며, 전사 분석 또는 카피 수 변동 어레이로 검출 할 수있다. 예를 들어, 염색체 영역 12q13-q14는 많은 육종에서 증폭 된다. 이 염색체 영역은 MDM2 라는 결합 단백질을 암호화하고 있으며, 이것은 p53 이라는 종양억제제 에 결합 하는 것으로 알려져있다. MDM2가 증폭 될 때, 종양 형성을 초래하는 세포 성장을 조절로 p53을 방지한다. 또한, 특정 유방암은ERBB2 유전자 의 카피 수의 과발현 및 증가 와 연관되는데 이는 인간 표피 성장 인자 수용체 2 를 암호화 하고 있다. 또한, 염색체 1q와 3q같은 염색체 수 획득은암 위험증가와 관련된다.

세포 유전학 상태는 당 업계에 공지된 다양한 방식으로 측정 할 수있다. 예를 들어, FISH 전형적인 핵형 및 가상 핵형 분석 (예, comparative genomic hybridization arrays, CGH and single nucleotide polymorphism arrays)을 사용할 수있다. 예를 들어, FISH 특정 유전자좌에서 염색체 재 배열을 평가하기 위해 사용될 수 있고, 이러한 현상은 질병 위험 상태와 연관된다. 일부 실시 예에서, 세포 유전학 상태는 바람직한, 중간, 또는 바람직하지 않은이다.

일 실시 예에서, 임상 인자는 성능이다. 성능 상태는 모든 시스템 및 당 업계에 공지 된환자의 성능 상태를 기록하기 위한 방법을 사용하여 정량화 할 수있다. 측정은 종종환자가 화학 요법을 받을지, 도즈 조정 및 완화 치료의 강도를 판정 하도록 할 수 있는지 여부를 결정하는데 사용된다. Karnofsky 점수와Zubrod 점수등 다양한 채점 시스템 이있다. 병렬 채점 시스템은 이는 정신 의학의Diagnostic and Statistical Manual (DSM)의 다섯 번째 축으로 통합된 Global Assessment of Functioning (GAF) 점수를 포함한다. 높은 성능 상태 (예를 들어, 적어도 80 % 또는Karnofsky scoring system을 이용하여 적어도 70 %) 질병 상태의 진행을 방지하는 처리를 나타내고, 화학 요법 및/또는 방사선 치료를 수용 하는 환자의 능력을 향상시킬 수있다. 예를 들어, 이러한 실시 예에서, 환자는 외래 자기 관리 할 수있다. 다른 실시 예에서, 평가는 성능이 낮은 상태로 환자를 나타낸다 (예를 들어, 50 % 미만, 30 % 미만 또는 20 % 미만의Karnofsky scoring system을 사용하여) 통상적인 방사선 치료를 허용 하도록, 및/또는 화학 요법은 허용 될 수 있다. 이들 실시 예에서, 환자는 주로 침대 나 의자에 국한 되고, 심지어 자기 관리를 위해 사용할 수 없다.

Karnofsky 점수는 100 에서 0에 "perfect" 건강과 0 은 "죽음"으로 실행된다. 점수는 10의 간격으로 행하는데: 여기에서, 100%는 정상으로 불만 및 질병의 부재; 90%는 정상적인 활동, 몇 가지 증상이나 질병 의 징후, 80%는 정상적인 활동시 약간의 어려움, 어떤 증상이나 징후; 70%는 정상 활동이나 작업 할 수없는, 자기를 돌보는; 60%는 대부분의 개인 요구 사항을 처리 할 수 있고, 도움을 필요로 한다; 50 % , 자주 도움을 필요로 하며 자주 치료를 필요로 함; 40 % 는 비활성화되어 특별한 보호와 도움이 필요하다; 30 % 는 심각하게 비활성화, 입원 표시는 하지만 죽음의 위험 없음; 20%, 긴급 입원 을 필요로하는 매우 아프 지원 조치 또는 치료 를 필요로 ; 및 10 % 가 빈사, 급속 진행성 치명적인 질병 과정 이다 .

성능 상태Zubrod 채점 시스템은, 완전히 활성화, 제한없이 모든 사전 질병 성능을 수행 할 수있는 0; 제한적 육체적 격렬한 활동에 외래 및 조명이나 앉아있는 자연, 예를 들면, 빛 하우스 작업, 사무의 작업을 수행 할 수 있는1; 외래 모든 자기 관리 할 수 있지만, 촬영, 어떤 작업 활동을 깨어있는 시간의 50 % 이상에 대한 수행 할 수없는 2; 침대나 의자 시간을 깨어있는 시간의 50 % 이상에 국한 제한된 자기 관리 3; 4 완전히 비활성화, 어떤 자기 관리 불능, 완전히 침대나 의자에 국한; 5, 사망.

일 실시 예에서, 임상적 요인은 조직학적 서브 클래스 이다. 일부 구현 예에서, 종양 조직 학적 표본은Elston & Ellis, Histopathology, 1991, 19:403-10 에 따라 등급을 매기고, 그 내용은 본원에 그 전체가 참조로 인용 되어있다.

일 실시 예에서, 임상적 요인은 성별이다. 일 실시 예에서, 성별은 남성이다. 다른 실시 예에서, 성별은 여성이다.

일 실시 예에서, 임상적 요인은 질병 단계이다. 전체 스테이지를 그룹화하여 비 제한적인 예로서, 단계I 암은 신체의 한 부분에 지역화; 단계 II 암은 진행된 지역 이며 단계III 암도 마찬가지 이다. 암은 단계 II 또는 단계 III 암의 지정은 특정 유형여부에 따라 달라질 수 있다. 하나의 비 제한적인 실시 예에서, Hodgkin병은 단계 II 에서는 다이어프램의 한쪽에만 영향받는 있는 반면, 단계 III는 영향을 받는 림프절이 위와아래에 나타낸다. 단계 II 및 III의 특정 기준은 진단에 따라 다르다. 단계 IV 암은 종종 전이, 또는 다른 장기 나 몸 전체에 퍼져 있다.

일부 실시 예에서, 임상적 인자는 혈액 질환에서 French-American-British (FAB) (예 dysmyelopoiesis 의 존재 및 골수성 및 적혈구 모세포의정량화를 나타냄) 분류 시스템 이다. 일 실시 예에서, 급성 림프구성 백혈병에 대한 FAB 는 L1-L3 이며, 급성 골수성 백혈병에 대해서는 M0-M7 이다.

다른 실시 예에서, 상기 방법은 돌연변이 상태, 단일 염기 다형성, 정상 상태의 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준에서 선택된 추가의 바이오 마커의 측정을 포함한다. 다른 실시 예에서, 상기 방법은 환자의 임상적 반응을 예측하는 단계를 포함한다. 다른 실시 예에서, 임상적 반응은 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5년간 진행/무사 생존율이다.

연령 프로파일 및 성능 상태와 같은 다양한 임상적 요인이 확인되었다. 세포 유전학, 분자 이벤트와 같은 진단의 상태측정은 정적 제한없이MLL, AML/ETO, Flt3-ITD, NPM1 (NPMc+), CEBPα, IDH1, IDH2, RUNX1, ras, 및 WT1 같은 유전자의 돌연변이, TET2 및 ASXL의 후생 유전 학적 수정, 뿐만 아니라 세포 신호 단백질 프로파일의 변화로도 이용되어왔다.

일부 실시 양태에서, 예방적 방법은 본 출원에 기술된 방법에 의한 암으로 될 가능성이 있는 환자에게 투여하는 치료를 포함한다. 일부 실시 예에서, 대상자가 암에 대한 유전적 소인 (예. 유전적 위험인자), 이전 에피소드 (새로운 암 및/또는 재발), 가족력, 암 유발 요건에 노출(예: 환경요건), 약학유전학정보 (약동학, 약물 동태학적 유전자형의 효과 또는 치료의효능 프로파일)중에 하나이상에 적용되는 경우 암으로 될 가능성이 높아진다.

일부 실시 예에서, 대상자가 암에 대한 위험성이 높은 것을 특징으로 하는 경우 암으로 진행될 가능성이 높다. 일부 실시 예에서, 대상자가 피사체암 유전적 소인에 의해 특징 되는 경우 암으로 진행될 가능성이 높다. 이 분야에 공지된 바와 같이 일부 실시 예에서, 암의 유전적 소인은 유전 임상학적 인자이다. 이러한 임상적 인자의 예로서, 적어도 대장, 자궁, 소장, 위, 요로 암에서 HNPCC, MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2을 포함 할 수있다, 일부 실시 예에서, 대상자가 암의 이전 에피소드에 의해 특징 되는 경우 암으로 진행될 가능성이 높다. 일부 구현 양태에서, 대상자는 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6, 암 이전 에피소드로 앓고 있다. 일부 실시 예에서, 대상자는 암의 가족력에 의해 특징 되는 경우 암으로 진행될 가능성이 높다. 일부 실시 예에서, 부모 및/또는 조부모 및/또는 형제 자매 및/또는 이모/삼촌 및/또는 큰 이모/큰 삼촌, 및/또는 사촌으로 정의된다. 일부 실시 예에서, 대상자가 암 유도제 (예를 들어 환경 요건)의 노출에 의해 특징 되는 경우 암 으로의 가능성이 높다. 예를 들어, 강한 햇빛에 피부가 노출되는 경우 피부암에 대한 임상 요인이다. 예를 들면, 흡연은 폐, 입, 후두, 방광, 신장 암, 및 여러 다른 기관에 대한 임상 요인이다.

또한, 몇몇 실시 예에서, 다음의 임상적 요인중 하나는 여기에 설명된 방법에 유용할 수있다: 성; 유전적 위험 인자; 가족의 역사; 개인의 역사; 인종과 민족; 특정 조직의 기능; 다양한 양성 조건 (예를 들어 비 증식성 병변); 이전 흉부 방사선; 발암 물질의 노출등을 들 수있다.

또한 여전히, 몇몇 실시 예에서, 다음과 같은 임상적 요인의 하나가 본원에 기술된 방법에 유용 할 수있다: 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3의 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK-1 키나제의 인산화상태 및 에서 Bcl-2 의70위치에 세린 인산화.

일부 실시 예에서, 임상 인자는 국한되지 않는 인터루킨 6를 포함하는 사이토카인의 발현 수준 이다. 일부 실시 예에서, 인터루킨 6 발현은 환자예후의 호불을 포함하는 MM환자의 반응의 가능성과 상관 한다.

특정 구체 예에서, 반응 가능성은 백분율 프라이밍을 평가함으로써 결정된다. 특정 실시 양태에서, 프라이밍은 하기 식에 의해 정의된다:

AUC는곡선 또는 신호세기의 어느 영역을 포함하고; DMSO는기준선 대조군을 포함하고; 그리고 CCCP (카르보닐 시안화 m 클로로페닐 히드라존)는 미토콘드리아 전자 전달계의 기준선 양성 대조군을 포함한 전자 캐리어들의 정상적인 활동 하는 동안 설정 양성자 구배의 언커플링 에이전트로 작용 하여 단백질 합성의 이펙터를 포함한다. 일부 실시 예에서, 곡선 아래의 영역은 균일시간-분해형광 (HTRF)에 의해 확립된다. 일부 실시 예에서, 시간은 약 0 에서 약 300 분, 약 0 에서 약 30 분에서 사이를 통해 발생한다. 일부 실시 예에서, 곡선 아래의 영역은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 확립된다. 일부 실시 예에서, 신호 강도는 약 5 분 내지 약 300 분 사이에 발생한 단일 시점의 측정이다.

다른 실시 예에서, 상기 방법 에서는BH3 프로파일 및 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK -1 키나제의 인산화 상태 및Bcl-2 의 위치 70 에서 세린의 인산화를 결정하는 단계를 포함; 시타라빈 또는 시타라빈 기반 화학 요법 및/또는 아자시티딘과 AML 환자 치료에 효능성 상관관계를 결정한다.

다른 실시 예에서, 상기 방법은BH3 프로파일 분석 및 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK-1 키나제 의 인산화 상태 및Bcl-2 의 70위치 에서 세린인산화 측정을 포함하며; MM환자의 화학 치료의 효능성 상관관계를 결정한다.

또 다른 실시 예에서, 암은 AML 및/또는 MM이며 임상적 요인은 연령 프로파일 및/또는 유전학적 상태 이고; 또는 암은 AML 및/또는 MM이고 암치료는 시타라빈 또는 시타라빈 계 화학요법 및/또는 아자시티딘이며, 또는 암치료는 시타라빈 또는 시타라빈계 화학요법 및/또는 아자시티딘이며 임상인자는 연령 프로파일 및/또는 유전학적 상태이거나 또는 암치료는 시타라빈, 또는 시타라빈계 화학요법 및/또는 아자시티딘 이며; 암은 AML 및/또는 MM 이고; 임상 요인은 연령 프로파일 및/또는 세포 유전학적 상태이다.

본 발명은 또한 종양 또는 암세포 시료의 평가를 단순화 할 수 키트를 제공한다. 본 발명 의 전형적인 키트는 다음, 예컨대, 하나 이상의BH3 펩티드를 검출하는 각종 시약을 포함한다. 키트는 또한, 예를 들어 다음과 같은 항체와 같이 다양한 검출 방법에 유용한 검출 시약들 중 하나 이상을 포함 할 수있다. 키트는 플레이트, 주사기 등을 포함하는 평가 에 필요한 물질을 포함 할 수있다. 키트는 시약의 사용을 지시하는 상기기술 된 라벨 또는 인쇄 지시를 포함 할 수있다. 키트는 테스트될 치료를 포함 할 수있다.

참조 숫자 표시와 관련하여 사용될 때 용어 "약" 은 언급된 숫자 표시의 10 %를 더하거나 뺀 참조 숫자 표시까지를 의미한다. 예를 들면, 언어는 "약 50" 는45-55의 범위를 커버한다.

본원에서 사용된 단어 "포함한다" 및 그 유사어는 비제한적으로 의도되는데, 항목의 설명은 재료, 조성물, 장치 및 이 기술의 방법에 유용 할 수 있는 항목을 배제하지 않는다. 유사하게, "할수있다", "가능하다"용어 및 그 유사어는 비 제한적으로 의도되는데 실시 예 또는 그 구성 요소 또는 특징을 포함하지 않는, 본 기술 의 다른 실시 예를 배제하지 않고 특정 요소 또는 특징을 포함 할 수 있다. "포함 "은 포함하다, 함유하다, 가진다와 같은 개방형 용어 이지만 본원에서는, 본 기술 또는 실시를 청구 하는 것으로, 인용 된 성분을 "구성" 또는 "본질적으로 구성된"과 같이 보다 제한적인 용어를 사용하여설명 될 수있다.

다르게 정의되지 않는 한, 여기의 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고있다. 본원에 기재된 것과 유사 하거나 동등한 임의의 방법 및 물질은, 본 발명의 실시 또는 시험 에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기재되어있다. 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.

본 발명은 다음의 비 제한적인 예에 의해 예시된다.

예

예 1: 치료 개발에 세포 기반 연구

방법론: 세포의 경우, 웰당 7.5 X 10³ 세포를 반응액 ((300 mM Trehalose, HEPES-KOH pH 7.4. 80 mM KCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0.1% BSA and 5 mM Succinate)에 현탁한다. 세포를 디기 토닌에 투과 가능하게 하고 양이온 염료 JC -1, β-머캅토에탄올과 함께 로딩 한다. 세포를384-웰 마이크로타이터 플레이트의웰에 분주한후, BH3 도메인 펩티드(Bim, Bid, Bad, NoxaA, Bim2A, Puma, Bmf, Hrk 및 Bik)의 하나 와 함께 배양 한다. HPLC에 의해 확인된 상기 분석에 사용된 펩타이드는 합성하였고, 순도 95% 이상이다. 펩티드 동일성은 질량 분석법에 의해 확인 하였다. DMSO는음성 대조군으로서 포함 하였다. 전체 미토콘드리아 막 탈분극 1 mM의 FCCP (p 트리플루오로메톡시 카르보닐 시안화 페닐 히드라존) 로 세포를 처리하여 측정하고, 이 샘플은 분석 표준 및 양성 대조군으로 사용 하였다. 펩티드 (및 FCCP) 첨가는 적절히 프라임된 세포의 막 전위 감소의 결과를 보였고, 이는 545 nm 인여기 및 590 nm 인발광을 이용한 Tecan Genios 플레이트 판독기에 JC -1 형광 감소 로서 측정된다. 이 프로세스의 동역학은 각 펩티드에 따라 다르고, 엔드 포인트는 180 분의 시간 과정을 통해 달성 운동 트레이스에서 기록되었다. 각 펩티드에 대한 형광 감소는 FCCP 반응에 대해 보정되었고, 막 전위의 손실 퍼센트 (% DYm)로보고하였다. 각 실험은 세포주당 각각 3회 수행 하였다.

사이클린 -의존성 키나아제 억제제 개발: 치료 억제 활성에 의한 세포주와BH3프로파일의 상관 관계는 전-세포사멸 펩티드가 세포주기에 영향을 미치는 발달 치료제에 반응을 구별하기위한 세포주에 이용되고있다는 것을 나타낸다. 이러한 세포주에서 대표적인 BH3 프로파일 데이터는 도 1에 있고, 세포에서의 세포주기 변조 에이전트 치료 효능은 도 2에 있다. 고형 종양 악성 종양 유래 8개의 접착세포의 전체 BH3 프로파일은 도 3에, 비-고형 종양 유래의 부유세포에 대한 모든 펩티드의 BH3 프로파일은 도 4에 있다. 부착 및 부유 세포주뿐만 아니라 정량된 BH3프로파일 유사체의 사이클린 의존성 키나제 억제제의 치료 효과는 표1에서 정리하였다. 특히, 부착 및 부유 세포주에서의 낮은 BIM 펩타이드의 %반응과 치료 활성의 상관 관계는 도 5 및 도 6에 있다. NOXA 및 PUMA 펩티드에 대한 %반응은 특히, BIM (PUMA + BIM_부착; NOXA + BIM_부유)과 함께 할때, 차별쪽인 성향이다.

세포주기 조절은 본질적으로 세포주기를 단절 시켜서 으로 주로 세포 증식 억제제로 사용할수 있도록 설계 되었다. BH3 프로파일은, 다른 한편으로는, 프로-세포 사멸 신호를 받아야하는 세포의 성향을 측정하도록 설계된다. 따라서, 이 실시 예에서, 본 BH3 프로파일의 특히 예기치 않은 진단에 사용은 기계적 프로-세포 사멸 신호에 연결되지 않은 제제의 치료적 효능을 서술 한다.

BH3 유사체 ( MCL -1 억제제 개발): BH3프로파일과 치료 억제제 활동으로 처리된 세포 주의 상관 관계는 프로-세포 사멸 펩타이드가 모두 부유 (도 7) 및 부착 세포 (도 9)에서 효능을 차별성을 보여준다. 특히, 낮은BIM, PUMA, NOXA, BAD 및 HRK펩티드의 %반응은, 모든 각각 부유 세포주의 치료 활성과 상관 관계가 있다. 부유세포의 치료 효과와 상관 관계가 있는 Multimarker 알고리즘은BIM+PUMA, BIM+NOXA, PUMA+NOXA, BIM+PUMA+NOXA, BIM+PUMA+NOXA+HRK, and BIM+PUMA+NOXA+HRK+BAD를 포함한다 (도 8). 고형 종양에서의 부착 세포주에서, BIM, PUMA 와 NOXA는 각각 개별적으로, MCL-1 억제제의 효능과 상관 관계를 보인 반면, multimarker 알고리즘은 이전에 언급한 부유세포에서의 상관관계와 동일하다. (BIM+PUMA, BIM+NOXA, PUMA+NOXA, BIM+PUMA+NOXA, BIM+PUMA+NOXA+HRK, and BIM+PUMA+NOXA+HRK+BAD) (도 10)

치료 효과를 예측 할 때 이 데이터는 특히, multimarker 방식이 개별 마커를 통해 얻는정보에 추가 된다. 이것은MCL-1이특이적 NOXA 및 비특이적 PUMA (또한 BCL2 및 BCLxl 에 결합)의한 변조에 비추어 예상치 않은 결과이다. 이러한 접근 방식 내에서 여러 마커의 포함에 의해 부여된 가중치가 개별의MCL-1 억제제 보다 치료 효과 의 상관 관계가 높다는 것을 제공한다. 효능 및 BH3프로파일, 개별적과 멀티 마커 알고리즘치료에 대한 데이터는 표 2에 제공된다.

키네신 스핀들 단백질 ( KSP ) 억제제 개발: KSP 억제제는 8 다발성 골수종/백혈병 유래 인간 세포주에 대한 항 증식분석에서 테스트 되었다. BH3 프로파일은 동시에 이들 세포주 에서 수행 하였다. 데이터는의 항 증식 특성을 가진 화합물의 BH3프로파일 판독(PUMA와 BAD에 대한 % 프라이밍, 각각) 사이의 상관 관계의 강한 표시를 산출한다. (도 11)

KSP 억제제 활성의 상관 관계는 MCL1 단백질의 농도에 의해 조절 될 수있다. 이것이 유일한 메커니즘인 경우에, MCL1의 레귤레이터로써의 NOXA가 효능의 적절한 예측 될 것이다. 사실, 예기치 않은 결과가 각각 PUMA (MCL1, BCL2 및 BCLxl의 변조)와 BAD (effector of BCL2 및 BCLxl의 이펙터)에서 나와 이들 세포주에서 치료 효과를 구별 할 수 있었다.

스핀들 키네신 단백질 억제제는미세 소관 구조와의 상호작용 및 재 모델링으로 항암 활성을 조절한다. 그러한 작용메커니즘은 이들 제제의 작용으로 미토콘드리아의 반응 및 후속 신호에 의해 예측 될 수 있다는 것이 놀라운 일이다.

예 2 : 종양 환자 기반 코호트를 이용한 연구

AML ( 시타라빈 기반 치료 [표준관리]), 방법론: AML 환자 코호트: 새로 진단된 AML 환자의 샘플은1999년 9월부터 2007년 3월 사이에 화학 요법 관리를 유도 하기 전에 말초혈액 또는 골수 대기음 (BM) 수집에서 얻었다. 표본은 임상 검토위원회의 승인 규정 및 프로토콜 (연구소 01-473)에 따라 일상적인 진단 평가시 취득 했다. 동의서는 헬싱키 선언에 따라 얻었다. 피콜 정화후, T 세포와 B 세포에서 CD3/CD19 세포 결핍을 제거했다. 개별 세포의 분취액을 원심 분리하고90 % FBS/10 % DMSO 에 재현 한후 액체 N₂ 에 동결 보존 하였다. 병리학적 분류, 세포 유전학 분석 및 돌연변이 상태를 얻었다; 임상 지표는 보조 표와 도면에 표시되었다.

환자 치료: 환자는 표준 기준에 따른 반응으로 분류 하였다. 62 명의 환자 중 48명은 시타라빈 + 안트라사이클린, 시타라빈 + 비 안트라사이클린 7 명, 시타라빈 + 플루다라빈 8 명을 시행 하였다 (한 환자는시타라빈 +비 안트라사이클린 후 이어서시타라빈 + 플루다라빈을 처리 하였다 [모두 무반응]). CR=정상 골수 형태, 절대 호중구는1,000이상계산, 혈소판은 > 100K 과 상승 헤모글로빈을 계산한다. 원발성 내성=2회의 유도 화학 요법 후 잔류 백혈병 (동일 또는 다른 요법이 될 수있다). 재발은 이전의 CR환자의 골수에서 > 5 % 또는 말초 혈액에서이다.

세포 유전학적 위험 여부 결정: 세포 유전학적 위험의 결정은CLIA 인증 세포 유전학 실험실에 의해 수행 되었다. 요약하면, 환자는 표준 그룹에 따라 분류 하였다: 유리한 = inv16, t(8:21), T(15;17) 중간 = 이배체 , -y, 불충분 한 중기, 불리한 = 다른 모든 , -5, -7, + (8) , t (6; 9) , 11q, PH1+, 기타.

BH3 프로파일: 피콜 정제, 생동결, 전처리 AML 표본은 해동후 FACS 완충액 (1 % FBS, 2mM EDTA, PBS)에 FCR 차단 시약 (Miltenyi Biotec, Auburn CA)과 현탁하고, 해동 한 얼음에 10 분 동안 다음에 얼음에서 20 분 동안 항체CD45-V450 (BD Biosciences, San Jose CA), CD3-Biotin (BD Bioscience, San Jose CA), 및 CD20-Biotin (eBiosciences, San Diego CA)로 염색 한다. 샘플을 다시 FACS 현탁후 얼음에서 20 분 동안 이차 항체Streptavidin-APC (BD Biosciences, San Jose CA)으로 반응 시킨다. 염색 후, AML 표본은 digitonin (Sigma-Aldrich, St Louis MO)으로 투과시키고, 180 분 동안 실온에서 펩티드(BIM 100μM, BIM 0.1μM, PUMA 100μM, PUMA 10μM, NOXA 100μM, BAD 100μM, BMF 100μM, HRK 100μM, 또는 PUMA2A 100μM) 또는 디메틸 설폭사이드 (DMSO [1 %]) 또는 카르보닐 시안화 m-클로로페닐 하이드라존 (CCCP [10μM])과 튜브 당 2 x 10⁵ 세포를 뉴메이어 버퍼 (80mM KCl, 10mM HEPES, 40μM EDTA, 40μM EGTA, 5mM Succinate, 300mM Trehalose, 0.1% BSA, pH 7.4)에서 반응시킨다. 샘플은 세포가 불충분하여 이용할수 없는 경우를 제외하고는 중복 실행 되었다. 전위차 JC-1미토콘드리아 염색약 (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY)은 분석 45분전에 추가하였다.

샘플은BD FACS 디바 소프트웨어를 사용하여FACS CantoII (BD Biosciences, San Jose CA) 로 분석 하였다. 검색군은의 희미한 CD45, 낮은 SSC, CD3 와 CD20 음성으로 하였다. 전술 한 바와 같이 성숙 림프구를 나타내는 강하게 염색된 CD45 세포는 분석에서 제외 하였다. 언 커플링 시약 컨트롤에 대한 미토콘드리아 탈분극 유도의 전-세포사멸 펩티드 정량화 성향이 퍼센트 프라이밍 이라고 정의한다. 검색군을 위해 이것은 배경 (음성 대조군)으로 DMSO에 대한PE 채널로 표준화하고 중간 신호 강도를 사용하여 계산 하였으며, CCCP 를 100 % 프라이밍 (양성 대조군)으로 사용하였다.

통계적 분석: BH3 프로파일 바이오 마커의 예측 값은 바이오 마커 상태 (프라이밍 %) 사이의 관계를 시험함으로써 환자가 반응자 또는 비 반응자로 특징 되었는지 여부를 조사 하였다. 단 변량 비교는 맨-휘트니 테스트를 사용하여 만들었고, 모든 보고 된 p-값은 양면 이다. p< 0.01에서 위양성 의 위험을 제한하기 위해 중요성에 대한 임계값과 통계 분석 계획(P 값 > 0.01 과 < 0.05 경계선 중요하게 고려되었다 )을 미리 정하였다. 마커의예측 능력은 곡선 (AUC)의 면적 통계량을 사용하여 평가 하였다. 생존 엔드 포인트는 콕스 비례 위험 회귀 분석을 사용하여 분석하였다. 다변량 분석은 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 수행 하고, 상기 기준을 사용하여 환자의 임상 정보로부터 조절 변수를 사용 하였다. OS 및 EFS는 추세에 대한 logrank 시험에 의해 %프라이밍과 유의한 상관 관계를 사용 하였다. 분석은 SAS 소프트웨어, 버전 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC), R버전2.14.2 (R Core Team; Vienna, Austria), 및/또는 Graphpad Prism버전5.04 (La Jolla, CA)를 사용하여 수행되었다.

R 환자 코호트 특성: AML 환자의 임상 병리학적 변수 (표3)에 시타라빈기반 요법의 반응상태를 상대적으로 층화 하였다. 맨-휘트니 분석으로 임상 변수와 화학 반응의 랜덤하지 않은 연결을 테스트 하였다. 테스트 변수중 오직 연령 프로필과 세포 유전학적 위험 계층화는 반응에 대해 랜덤하지 않음을 나타냈다 (각각 P=0.008, P=0.006). 이 두 비 확률 변수는 이후 BH3 프로파일 바이오 마커에 대한 설명 다변량 분석에 사용되었다.

환자 표본의 BH3 프로파일: 62의 유용히 보존된 AML 환자 표본이 이 연구의 일환으로 BH3프로파일 되었고, 61이 분석 가능한 데이터를 제공했다. 이전의 통계 분석에 고려 에서 제외된 하나의 샘플은 트리판 블루 배제에 의해 확인 한바 가능한 세포 분석이 부족하였다. 즉, 62 중 61의 환자 표본은 BH3 프로파일에 의해 분석 될 수 있었고 98.4 % 의 전체 기술의 성공을 나타낸다. 이 시편과 관련된 기술적인 문제는 언급한 대로 분명히 부적합한 생존세포 동결은 즉각적으로 해동시 영향을 미친다는 점에 일치한다.

모든 펩티드는 이전AML 표본의 실험전에 이러한 연구의 개시 백분율에 프라이밍 값의 동적 범위를 제공 하도록 최적화하였다. 가장 주목 할만한것은100 μM BIM 은 AML 환자 표본의 대부분 (또는 포화 근처)에서 포화로 나타났다는 것이다. 따라서, 100 μM의 BIM 에 더불어, BIM 또한 0.1 μM에서 퍼센트 프라이밍 값의 동적 범위를 제공하기 위해 결정된농도를 분석하였다. 대표적인 데이터는, 도 12에 있는 두개의 NR 및 CR 환자이다. 개별 환자의 반복 샘플에 대한 변화 (CV) 의 전체 계수는 일반적으로 제한된 실행 간 변화와 기술적으로 강력한 분석을 나타내는 3~5% 이다.

바이오 마커 펩타이드 분석에서, 높은 BIM (0.1)%의 프라이밍 점수는 높은 수준 의 통계적 유의성 (p = 0.0000018) (도 13)의 반응과 상관한다. 다른 BH3 프로파일 바이오 마커의 분석은 표4에 나타나 있다. 산출통계학적인 유의성 외에도BIM (0.1), PUMA (10)에 의해 표시된 반응은 (P = 0.0064) (도 14) 와 상당한 연관을 보여준다.

BIM (0.1) 개별 환자의 프라이밍 점수 는 반응군과 비 반응군 (도 2)으로 분리 되었을 때, 명확한 추세가 나타났다. 시타라빈 기반 요법에 반응을 나타낼 가능성이 AML 환자는 반응할 가능성이 없는 환자에 비해 (퍼센트 프라이밍 = 13.2 ± 13.4 [SD]) 높은 BH3 프로파일 프라이밍 하는 경향 (퍼센트 프라이밍 = 36.8 ± 21.2 [SD])이다. 동시에 정확하게 비 반응자들을 분리 하면서 정확한 가능성 반응자 식별이 바이오 마커의 민감도 및 특이성 확립에서, 수신기 연산자 특성 (ROC) 플롯은 올바르게 개별 표본 을 구별 할 수있는 바이오 마커 의 능력 의 뛰어난 표시인0.83 [95%CI:0.73,0.94] 의AUC를 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 수치 에서, 하나의 바이오 마커는89.7 % 응답자의 식별을 달성한 반면, 동일한 시간에 59.1 % 의 환자는 무반응 이었다. 원하는 감도 차단 이 92.3 % 이상인 경우, 특이성 은 여전히 가능성 응답자의 54.6 % 이다.

연령과 세포 유전학 역시 이 데이터 세트에서 AML의 예후 인자 인 것으로 나타났다 (표 3). 연령 프로필과 세포 유전학에BIM(0.1) % 프라이밍 바이오 마커의 추가가 예후 정보의 추가에 도움이 되는지를 확인 하기위해 연령 프로필과 세포 유전학을 BIM(0.1) %프라이밍 다변량 분석에 연속적으로 추가 하였다. BIM(0.1)에 연령 프로파일의 첨가는이전BIM(0.1) AUC=0.83 으로부터0.89 AUC의 증가를 산출한다 (도 15).또한, BIM(0.1)이 환자의 연령 프로필과 세포 유전학적 위험에 맞춰질 경우, AUC는 0.91로 증가된다. 이 후자의 조정 내에서, >90 % 감도가 >70 %의 비 반응군 으로부터 분리와 식별 동시 달성된다 (도 15).

환자는 세포 유전학적 위험 상태에 의해 구별한 후 반응자 와 비 반응자를 식별하는 의미에 대한 맨 - 휘트니에 의해 이 하위 그룹을 분석 하였다. 중간 위험 (N = 33)의 서브 그룹에서 BIM (0.1)은 매우 유의(P=0.0017)하게 더 차별 응답 과 연관이 있었고, 비선호그룹(N = 23 )의 BIM (0.1)은 여전히 유의 하였다(P=0.023) (도 16). 여기에서의 p 값은 조합 코호트의BIM (0.1) 분석에 비해 다소 감소되어 있지만, 이것은 일반적으로 환자의 하위 분류 번호로 인하여 감소된 통계적 전력의 현상이다. 흥미롭게도, BAD와 HRK 분석 모두 응답 차별에 흥미롭게 중요한 p-값을 산출 (각각 p=0.0017 및 p=0.0055) 하였다. ; 그러나, 이것은 단지 중간 위험군 (도 16)에서만 관찰 하였다. 응답 차별에 이러한 바이오 마커의 ROC분석에 의한 민감도와 특이도 평가는 중간 그룹에서BIM(0.1)은 0.875 AUCs, BAD는 0.875, HRK는 0.823이고, 불리한 그룹에 대한 BIM (0.1)은 0.790 이다 (도 16). 이들 AUCS 는 독립적 인 하위 그룹 에서 비 반응 군 에 비해 대응 에 다소 불균형 서브 그룹핑 (중간 8 NR , 25 CR, 불리한15 NR, 9 CR) 혜택을 누릴 수 있음을 유의해야한다.오직5 유리한 환자 데이터만 있었서 , 이 그룹의 통계 분석은 가능하지 않았다.

BIM (0.1) BH3 프로파일 퍼센트 프라이밍 및 BIM ( BCL2L11 ) 단백질 수준의 비교: BIM BH3 프로파일의 예측능력이 BIM 단백질 수준을 단지 다시 포기만 하는지 여부를 평가하기 위해, 상관 관계 또는 부족이 본 연구 내에서 AML 환자 표본에 있는지 여부에 대한 평가가 수행 되었다. BIM 의 단백질 수준과R² = 0.0396를 산출하는 %의 프라이밍에는 상관 관계가 존재하지 않는것을 알 수 있었다 (도 17).

프로파일과 RPPA 의 데이터가 있는 코호트 전체 환자의 부분 집합 에서 모두BIM (0.1)의 BH3 프로파일은 유의한 p-값 (p=0.0048) (도 17)을 유지한다. 주목할 점은 분석능력이 우리의 이전 분석에 비하여 감소되었는데 이는 샘플 크기가 N = 62 에서N = 43으로 감소 하고, 가장 높은 점수의 BH3 프로파일 시편 중 RPPA데이터가 없는 많은 샘플들에 기인한다. BCL2L11 단백질 수준에 표본이 동일한 집합 에 대한 응답 차별에 대한 p-값은 p=0.33 (도 17)이다. 이러한 데이터로BH3 프로파일 전체 단백질 수준과는 상관 관계가 없으며, BH3 프로파일이 AML 환자에서 시타라빈 반응을 예측하는 기준에 새로운 패러다임을 제공 할 수있다는 강력한 증거를 제공한다.

예 3: 2차 임상 엔드 포인트: 전체 생존 기간과 무사고 생존

BH3 프로파일 바이오 마커는전체 생존 기간 (OS) 및 무사고 생존 (EFS)의 2차 임상 엔드 포인트와의 상관 관계에 대해 분석 하였다. 콕스 비례 분석를 사용한 연속 변수 모델은 BIM (0.1)은 EFS (p=0.14) 또는 OS (p=0.057)에 대해 유의하지 않다는 것으로 나타났다. NOXA %프라이밍 및 EFS 사이의 콕스 비례 위험 분석도 p=0.089로 유의하지 않았다. 테스트한 다른 모든 펩타이드는 OS 또는 EFS 와 % 프라이밍 (모두 p>0.10) 중 하나를 사이에 유의한 상관 관계 또는 추세를 보이지 않았다. 또한, 조정 변수 환자 연령 프로필과 세포 유전학적 위험 상태에 다변량 분석은 BH3 프로파일 바이오 마커 및 OS 와 EFS 임상 엔드 포인트 사이에 유의한 상관 관계를 산출 하는데 실패했다.

흥미롭게도, 파티션 모델 분석에서, 환자 코호트가 BIM %프라이밍에 의해 텍스타일 (높은 프라이밍, 중급 프라이밍 및 낮은 프라이밍)로 나뉠 때, 대응하는 OS는 각각 250.7, 168.2 및 32.7 주 (p=0.029, 트렌드 logrank 시험)의 중앙값을 얻었다 (도 18). 이텍스타일의 같은 분석으로 EFS를 실시 하였을 때는, EFS의 중앙값은 낮은 프라이밍, 중간 프라이밍, 높은 프라이밍 텍스타일에서 각각26.1, 71.3, 160.7 주였다 (p=0.044, 트렌드 logrank 시험) (도 18).

AML 과 아자시티딘: 13개의 인간 AML 유래 세포주는를 BH3 프로파일 하였고, 상관 관계 분석은 시험관내 아자시티딘 반응을 수행했다. BH3 유사체를 이용하여 파티션 모델은 개별 펩타이드 파생 모델 (도 19), 두 개의 펩타이드 모델 (도 20), 3 혹은 이 이상 펩티드 (도 21)을 사용하여 더 민감 (IC50<2 uM) 과 덜 민감 (IC50>2uM) 한AML 유래 세포주사이에 통계적으로 유의한 (p<0.01) 아자시티딘 반응을 구별 하였다. 연속 변수 분석을 사용하여, R²> 0.7 개별 펩타이드 파생 알고리즘 (도 22) 및 Puma (전체-프라이밍 표식)이 적용될때 두 개의 펩티드 (도 23)와 3 개 이상의 펩티드 (도 24)를 포함하는 조합 BH3 펩타이드 모델의 상대적 _[ _log _]IC50s값을 적용했다. 통계적으로 유의한 p-값은 대부분Puma (p<0.01) 을 포함하여 모델을 추적 할 수 있다. 결과는 표.5에 요약되어있다.

아자시티딘은 후생 유전 학적 약제로 알려진 항암제의 클래스에 속하는 것으로, 세포사멸의 직접조절 미토콘드리아 생물학에는 용이하지 않다. 따라서, 아자시티딘치료 효능 극한 세포사멸 경로 및 미토콘드리아 생물학을 위해 설계된 메트릭에 의해 예측 될 수 있다는 놀라운 일이다. 참조, Vo et al . (Cell . 2012; 151(2):344-355) 아자시티딘의 효과는 BH3 파생 메트릭에 의해 예측 되지 않았다.

아자시티딘결과에 대한 BH3 프로파일의 목적으로 일차 AML 환자 시료의 검사를 진행했다.

BH3 메트릭에서 얻어진 알고리즘에 대한 부가 데이터는 azacytdine 처리된 AML 환자에서 생성 되었다. 본 연구에서N = 28 조합집단(13 (9 stable/CR; 4 refract/NR) 시편과15 (all NR/refract))을 포함한다. 한 시료는 평가하지 않았다. 모든 27의 시편의 상대적 반응 (19 NR, R 8) 에 대하여 분석 하였다. 이집단에 대한 보고 점수의 범위는 도 25에서 보여지며, 점수의 범위는 반응 및 전체 생존 기간 (OS) 및 이벤트 프리 생존 (EFS)같은 다른 임상 엔드 포인트를 측정 할 수있는지에 대해 치료범위를 제공 한다는 것을 나타낸다.

개별 마커중, BIM 및 NOXA만 반응과 경계 상당한 연관을(각각 P=0.05, P=0.02) 얻었다. 다른 모든 바이오 마커 P-값이 0.1 이상이다. 그러나, 현재 설명된BIM과 NOXA의 조합방식은 반응의 상관 관계 (P 는 = 0.001)가 매우 유의 하였다. 또한, 민감도/특이도에 대한 ROC는 0.91 이었다. 이것은 단 변량 분석 이며 임상 조절 변수를 감안하면 강한 통계적 일 수있다 (예를 들어, 연령, 유전 학적 상태 등) (도 26).

등가물

통상의 실험을 사용하여 인식 하거나 확인할 수있을 것이고, 특정 실시예에 대한 수많은 등가물은 본원에 구체적으로 설명했다. 이러한 등가물은 아래 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

실질법적 지정

여기에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 명세서에 그 전체가 참조로 인용된다.

본 출원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 자신의 발명을 위해서만 제공된다. 본원에서 아무 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공개에 선행하는 자격이 되지 않는 승인으로서 구성되지 않았다.

Claims

환자의 암 치료를 결정 하는 방법에 있어서,
환자의 종양 또는 암세포 시험편BH3 프로파일을 결정;
하나 또는 그 이상 환자의 임상 적 요인 결정
하나 이상의 암 치료 에 대한 임상 반응의 가능성에 대한 환자를 분류;
하나 이상의 임상적 요인은 임상 반응과 연관에 대해BH3 프로필의 특이성 및/또는 감도를 증가시키기 위해 선택되는 것을 특징으로하는 방법.
청구1의 방법, 상기에서는 암 은 혈액 암 이다.
청구2의 방법, 상기에서는 혈액암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종, 여포성 림프종, 급성 림프 성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병, 비-Hodgkin림프종 으로부터 선택된다.
청구3의 방법, 상기에서는 비-Hodgkin림프종은 맨틀 세포 림프종과 확산된 큰 B 세포 림프종으로부터 선택된다.
청구1의 방법, 상기에서는 암은 고형 종양이다.
청구5의 방법, 상기에서는 고형 종양은 비소 세포 폐암 종, 난소 암 및 흑색 종 으로부터 선택된다.
청구1의 방법, 상기에서는 암 치료는 하나 이상의 항암제, 화학 요법, 수술, 보조 치료 및 선항암 치료이다.
청구7의 방법, 상기에서는 암 치료는 하나이상의BH3 유사체, 후생 유전학적 개질제, 토포 이소머라제 억제제, 사이클린-의존성 키나제 억제제, 키네신 주축 단백질안정제이다.
청구7의 방법, 상기에서는 암치료는 프로테아좀 저해제 이다.
청구7의 방법, 상기에서는 암치료는 세포 주기 조절의 변조기이다.
청구10의 방법, 상기에서는 세포 주기 조절의 변조기는사이클린-의존성 키나제 억제제이다.
청구7의 방법, 상기에서는 암치료는 세포의 후생 유전학적 기작 변조기이다.
청구12의 방법, 상기에서는 세포의 후생 유전학적 기작 변조기는 하나 이상의 보리노스탯 또는 엔티노스탯을 포함하는 히스톤 디아세틸라제 (HDAC)의 저해제이다.
청구12의 방법, 상기에서는 후생 유전학적 기작 변조기는 아자 시티딘 이다.
청구12의 방법, 상기에서는 후생 유전학적 기작 변조기는 데시타빈이다.
청구17의 방법, 상기에서는 암치료는 안트라사이클린 또는 안트라센 이다.
청구16의 방법, 상기에서는 안트라사이클린 또는 안트라센은 하나 이상의 에피루비신, 독소루비신, 미 톡산 트론, 다우노루비신, 이다루비신 이다.
청구17의 방법, 상기에서는 치료는 백금기반 치료 이다.
청구18의 방법, 상기에서는 백금계 치료제는 하나 이상의 카르보플라틴, 시스플라틴, 및 옥살리플라틴이다.
청구17의 방법, 상기에서는 치료는 시타라빈 또는 시타라빈기반 화학요법 이다.
청구7의 방법, 상기에서는 암치료는BH3 유사체 이다.
청구21의 방법, 상기에서는 BH3유사체는 하나 이상의 BCL2, BCLXL 및 MCL1 이다.
청구7의 방법, 상기에서는 암치료는MCL1저해제이다.
청구1의 방법, 상기에서는BH3 양상은 환자 암세포의 투과로 구성되는데, 이는 하나 이상의 BH3 peptide 가 연결된 미토콘드리아 세포막 전위의 변화를 결정하고 정량; 및 세포사멸-유발 화학 요법제 에 대한 미토콘드리아 막 전위의 손실과 상관한다.
청구1의 방법, 상기에서는BH3 프로파일은 펩티드의 사용을 포함하고, 펩티드는 하나 이상의BIM, BIM2A, BAD, BID, HRK, PUMA, NOXA, BMF, BIK, 및 PUMA2A이다.
청구24의 방법, 상기에서는 펩티드를 0.1 μM 내지 200 μM의농도로 사용 된다.
청구1의 방법, 상기에서는 시료는 냉동 종양 조직 표본, 배양된 세포, 순환 종양세포 로부터 선택생검 및 포르말린 고정 파라핀 포매 종양조직 표본이다.
청구1의 방법, 상기에서는 시편은 인간 종양유래 세포주 이다.
청구1의 방법, 상기에서 시편은 암 줄기세포 이다.
청구1의 방법, 상기에서 시편은 고형 종양생검 으로부터 유도 된다.
청구30의 방법, 상기에서 시편은 대장, 유방, 전립선, 폐, 췌장, 신장, 또는 난소 일차 종양생검 으로부터 유도 된다.
청구1의 방법, 상기에서 시편은 상피 기원 이다.
청구32의 방법, 상기에서는 상피 시편은 항 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 또는 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 다른 상피 세포 결합 항체와 생검 샘플로부터 선택에 의해 강화된다.
청구1의 방법, 상기에서 시편은 중간엽 기원 이다.
청구34의 방법, 상기에서는 중간엽 시편 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된신경 세포 부착 분자 (N- CAM) 또는 뉴로필린 또는 다른 중간엽 세포 결합 항체 와 생검 샘플로부터 선택에 의해 강화된다.
청구1의 방법, 상기에서 시료는 비- 고형 종양의생검 으로부터 유도 된다.
청구36의 방법, 상기에서 시편은 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 파생 큰 B 세포 림프종 및 비 호지킨 림프종을 가진 환자의 생검에서 얻어진다.
청구37의 방법, 상기에서 시편은 다발성 골수종 세포인데 이는 고체 매트릭스 또는 비드에 결합된 항 CD138 항체 생검 샘플로부터 선택에 의해 농축 된다.
청구37의 방법, 상기에서는 암세포는CD45-지향 항체에 결합함으로써 농축되는 급성 골수성 백혈병 이다.
청구37의 방법, 상기에서 암세포는 만성 림프구성 백혈병 또는 비-B 세포 고갈에 의한 확산 큰 B 세포 림프종이다.
청구1의 방법, 상기에서 시편은 순환 종양세포로부터 유래 된다.
청구1의 방법, 상기에서 임상요인은 하나이상 연령, 세포 유전학적 상태, 성능, 조직학적 하위 클래스, 성별, 질병의 단계이다.
청구1의 방법, 추가의 돌연변이 상태, 단일 염기 다형성, 정상 단백질 수준, 및 동적 단백질 수준에서 선택된 추가의 바이오 마커를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법이다.
청구1의 방법, 상기에서 상기 방법은 환자의 임상적 반응예측을 포함한다.
청구44의 방법, 상기에서 임상적 반응은 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 5 년간 진행/무사고 생존율이다.
청구1의 방법, 상기에서 임상반응의 확률은 다음 식으로 정의 된다:

AUC는 곡선 또는 신호세기의 어느 영역을 포함하고;
DMSO는 기준선 대조군을 포함하고; 그리고
CCCP (카르보닐 시안화 m 클로로페닐 히드라존)은 미토콘드리아 전자 전달계의 기준선 양성 대조군을 포함한 전자 캐리어들의 정상적인 활동 하는 동안 설정 양성자 구배의 언커플링 에이전트로 작용 하여 단백질 합성의 이펙터를 포함한다.
청구46의 방법, 상기에서 곡선 아래의 영역은 균일시간-분해형광 (HTRF) 에 의해 확립된다.
청구46의 방법, 상기에서 시간은 약 0 에서 약 300 분, 약 0 에서 약 30 분에서 사이를 통해 발생한다.
청구46의 방법, 상기에서 곡선 아래의 영역은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 에 의해 확립된다.
청구46의 방법, 상기에서 신호 강도는 약 5 분 내지 약 300 분 사이에 발생한 단일 시점의 측정이다.
청구1의 방법, 상기에서는BH3 프로파일 및 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK -1 키나제의 인산화 상태 및Bcl-2 의 위치 70 에서 세린의 인산화를 결정하는 단계를 포함; 시타라빈 또는 시타라빈 기반 화학 요법 및/또는 아자시티딘과 AML 환자 치료에 효능성 상관관계를 결정한다.
청구1의 방법, 상기에서는BH3 프로파일 및 하나 이상의 세포 표면 마커 CD33, 세포 표면 마커 CD34, FLT3 돌연변이 상태, p53의 돌연변이 상태, MEK -1 키나제의 인산화 상태 및Bcl-2 의 위치 70 에서 세린의 인산화를 결정하는 단계를 포함; 화학 요법의 MM 환자 치료에 효능성 상관관계를 결정한다.
청구1의 방법, 상기에서 암은 AML 및/또는 MM 이며 임상적 요인은 연령 프로파일 및/또는 유전학적 상태이다.
청구1의 방법, 상기에서 암은 AML 및/또는 MM이고 암 치료는 시타라빈 또는시타라빈기반 화학요법 및/또는 아자시티딘 이다.
청구1의 방법, 상기에서 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈계 화학요법 및/또는 아자시티딘이며 임상적 요인은 연령 프로파일 및/또는 세포 유전학적 상태이다.
청구1의 방법, 상기에서 암 치료는 시타라빈 또는 시타라빈계 화학요법 및/또는 아자시티딘이며; 암은 AML 및/또는 MM이고; 임상요인은 연령 프로파일 및/또는 세포 유전학적 상태이다.
환자의 암 치료를 결정하는 방법에 있어서,
하나 이상의 BH3 도메인 펩티드와 환자의 투과 가능 암 세포를 접촉시키는 단계;
면역 염색법 및/또는 형광in situ hybridization (FISH) 에 의한 환자 암세포의 하나 이상 임상적 인자 존재 유무를 판정하는 단계; 및
하나 이상의 암 치료에 대한 임상반응 가능성에 대한 환자의 분류.
AML 환자의 시타라빈 및/또는 아자시티딘 반응을 결정 하기 위한 방법으로:
AML 환자의 암세포 시편BH3 프로파일을 결정;
하나 또는 그 이상 환자의 임상적 요인 결정
상기 하나 이상의 임상적 요인은 연령 프로파일 및/또는 유전학적 상태로부터 선택되고; 그리고,
하나 이상의 암 치료에 대한 임상반응의 가능성에 대한 환자의 분류를 포함한다.
청구58의 방법, 상기에서는BH3 프로파일을 결정은 단계 와AML 환자의 암세포 시험편의 BIM 과의 접촉을 포함한다.