KR20150137118A - 전립선암의 바이오마커 검출에서 사용하기 위한 방법 및 어레이 - Google Patents

전립선암의 바이오마커 검출에서 사용하기 위한 방법 및 어레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 개체로부터 테스트 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 테스트 시료에서의 발현을 측정하는 것에 의해 테스트 시료의 바이오마커 시그니처를 결정하는 단계를 포함하거나, 상기 단계들로 구성된, 개체에서 전립선암-관련 질환 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 테스트 시료에서의 발현이 상기 개체에서 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태를 나타내는 것인 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 사용하기 위한 어레이 및 키트를 제공한다.

Description

전립선암의 바이오마커 검출에서 사용하기 위한 방법 및 어레이{METHODS AND ARRAYS FOR USE IN BIOMARKER DETECTION FOR PROSTATE CANCER}
본 발명은 전립선암-관련 질환 상태(prostate cancer-associated disease state)를 결정하는 방법, 및 이러한 방법에서 사용하기 위한 어레이 및 키트를 제공한다.
혈액 중 전립선 특이적 항원 (PSA)을 이용한 전립선 암(PC)의 조기 검출은 미선별(unscreened) 남성들 중 PC-사망을 감소시킨다. 그러나, 통상적으로 사용되는 컷-오프에서 PSA의 높지 않은(modest) 특이성 때문에, 약간 상승된 PSA를 갖는 남성들 중 강화된 위험도 분류(risk classification)에 기여하는 추가적인 바이오마커에 대한 시급한 요구가 존재한다.
전립선암 (PC)은 서구 국가들에서 암 관련 사망 중 2위의 주요한 사망 원인이고 [1] PC 환자의 예후를 개선하기 위해, 조기의 특이적 진단이 매우 중요하다. 혈액-기반 바이오마커인 전립선 특이적 항원 (PSA)은 1980년대 말에 의료계에 도입되었고 현재 PC에 대한 위험도 지표 및 환자 생검의 추가적인 테스트를 위한 하나의 파라미터로 이용되고 있다 [2, 3]. PSA의 도입은 조기 진단 PC 케이스의 수를 증가시켰으나, 악성 질환에 대한 PSA의 높지 않은 특이성은 불필요한 생검의 비용 및 잠재적인 부작용과 과다-진단 및 과다-치료의 위험에 대한 심각한 우려를 야기시켰다 [2-4]. 실제로, 총 혈청 PSA 수준 (tPSA)(≥ 4 ng/ml)에 근거하여 생검을 위해 선택된 남성들 중 65-75%는 PC를 갖지 않는다 (www.cancer.org). 따라서, 임상의가 생검 테스트를 위한 적합한 환자를 선택할 수 있도록 위험도 분류를 개선하기 위해, 추가적인 및/또는 보다 특이적인 바이오마커가 정의되어야 한다.
PC에 대해 테스트할 때, 특이성을 개선하기 위해, tPSA 값을 다른 파라미터들, 예를 들면, 시간에 따른 PSA 변화 (PSA 속도), 전립선 용적 대비 PSA (PSA 밀도), 또는 PSA의 연령 특이적 범위를 조합하려는 여러 시도가 이루어졌다 [2, 3]. 그러나, 현재까지 tPSA 분석의 진단력의 개선이 현재까지 전혀 관찰되지 않거나 또는 보통 정도로만 관찰되었다 [2]. 대조적으로, tPSA와 유리 (결합되지 않은) PSA 간의 구별이 분석능(assay performance)을, 특히, tPSA의 중간 범위 (4-10 ng/ml) 수준을 갖는 남성들에 대해 증가시키는 것으로 입증되었다. 실제로, 18-25% 미만의 tPSA에 대한 유리 PSA의 비율 (%fPSA)을 갖는 남성들이 유의성 있게 더 높은 PC를 가질 위험도와 연관된 것으로 확인되었다 [5-7]. 그러나, 이 특정한 환자군의 25-50%는 PC를 갖지 않으나, 그들은 모두 생검 테스트를 위해 선택된다 [7, 8]. 최근에, 4개의 칼리그레인(kallikrein) 마커의 패널이 생검 결과(biopsy outcome)의 잠재적인 예측자로 시사되었고 [9, 10], tPSA, 유리 PSA와 2proPSA로 불리는 유리 PSA 소분획물(subfraction)의 조합이 또한 진단 정확도를 개선시킬 수 있는 것으로 시사되었다 [11].
그러나, 전립선암을 검출하고 및/또는 특히, 생검 테스트 및/또는 치료 전에위험도에 따라 전립선암을 계층화(stratify)하기 위해 이용될 수 있는, 추가적이고, 보다 특이성이 높은 바이오마커에 대한 중대한 충족되지 않은 임상적 요구가 존재한다.
또한, 처음에 다양한 고전적인 생화학적 기술들을 이용하여, PC와 연관된 추가적이고, 신규한 혈청 바이오마커를 정의하기 위한 중대한 노력들이 이루어졌다. 현재까지, 인간 칼리크레인 2(human kallikrein 2) [12, 13], 유로키나아제-타입 플라스미노겐 활성자(urokinase-type plasminogen activator) [14], [11], 전환 성장 인자 β1(transforming growth factor β1: TGF-β1) [3, 15, 16], 및 인터루킨-6(interleukin-6: IL-6) [16-18]가 잠재적인 혈청 마커로 구체적으로 시사되었다. 유망하지만, 이러한 마커들의 예후 능력(prognositic capability)을 탐색하고 확인하기 위해 추가적인 검증 연구가 요구될 것이다 [2-4]. 또한, 추가적인 잠재적 PC 마커들이 전통적인 프로테옴 기법(proteomic technique)을 이용하여 시사되었으나 [19, 20], 이러한 관찰은 독립적인 환자 코호트(cohort)를 이용하여 검증되어야 한다 [21]. 또한, 분석 민감도, 동적 범위(dynamic range), 및/또는 처리율(throughput)에 대해 심각한 기술적 이슈가 제기되었다 [22, 23]. 이에 대해, 친화도 프로테오믹스(affinity proteomics)가 비-분획화(non-fractionated) 프로테옴, 예를 들면, 혈장 및 혈청을 다중의, 민감하고 신속한 방식으로 표적화할 수 있는 고-효율 대안(high throughput alternative)으로 확립되었다 [24-27].
이러한 배경에서, 본 발명자들은 이전에 복잡한 프로테옴의 단백질 발현 프로파일링을 위한 재조합 단쇄 단편 가변(single chain fragment variable: scFv) 항체 마이크로어레이 플랫폼을 설계했다 [26, 28, 29]. 이 친화도 프로테옴 기술 플랫폼을 이용하여, 본 발명자들은 혈청, 혈장, 소변, 온전한(intact) 세포, 세포 용해물, 및 조직 추출물(tissue extract)을 포함한, 광범위한 가공하지 않은, 직접 표지된 프로테옴(crude, directly labeled proteme)을 신속하고, 민감하고 재현가능한 방식으로 프로파일링할 수 있었다 [28, 30, 31]. 본 발명자들은 이 플랫폼이 예를 들면, 진단, 예후, 분류(classification), 및 증거-기반 치료법 선택(evidence-based therapy selection)을 위한 후보 바이오마커 시그니처(biomarker signature)를 식별하기 위해 이용될 수 있다는 것을 입증했다 [32-37].
본 발명자들은 친화도 프로테오믹스가 현재 확립된 의료 관행에 따라 4개의 생화학적으로 정의된 위험도 그룹으로 계층화되는 환자 시료를 이용한 일상적인 PSA 측정으로부터 혈장 시료를 표적화하는 위험도 그룹 분류를 검증하고 더 개선하기 위해 이용될 수 있는지 여부를 조사하였다 [38-41]. 데이터는 PC를 정확하게 찾아낼 수 있고 ("악성 바이오마커 시그니처(a malignant biomarker signature)") 환자를 PC 위험도와 관련된 현재의 서브그룹 및 새로운 서브그룹으로 계층화할 수 있는 혈장 단백질 시그니처를 확인할 수 있다는 것을 보여주었고, 이는 장기적으로 PC의 보다 맞춤화된(individualized) 치료에 기여할 잠재력을 갖는다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 개체에서 전립선암-관련 질환 상태(prostate cancer-associated disease state)를 결정하는 방법으로서:
a) 상기 개체로부터의 테스트 시료(sample to be tested)를 제공하는 단계;
b) 테스트 시료에서 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 의해 상기 테스트 시료의 바이오마커 시그니처(biomarker signature)를 결정하는 단계;를 포함하거나 또는 상기 단계들로 구성되고,
상기 테스트 시료에서 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 개체에서 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태를 나타내는 것인 방법을 제공한다.
"전립선암-관련 질환 상태(prostate cancer-associated disease state)"는 전립선암의 존재 또는 부재, 전립선암 그룹 또는 서브그룹 (하기에 정의된, A, B C, C1, C2 또는 D) 및/또는 개체에서 전립선암이 (바람직하게는 주어진 기간 내에) 일어날 가능성(likelihood)을 의미한다.
"바이오마커(biomarker)"는 그의 측정이 전립선암-관련 질환 상태의 결정, 즉, 전립선암의 예후(prognosis)에 유용한 정보를 제공할 수 있는 천연(naturally occurring) 생물 분자, 또는 그의 성분 또는 단편을 의미한다. 예를 들면, 바이오마커는 천연 단백질 또는 탄수화물 모이어티(moiety), 또는 그의 항원성 성분 또는 단편일 수 있다.
바람직하게는, 테스트 시료는 포유동물로부터 제공된다. 포유동물은 가축 또는 농장 동물(farm animal)일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 랫트, 마우스, 기니어 피그, 고양이, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유동물은 인간이다. 바람직하게는, 시료는 미가공(crude) 혈액, 사전-분획(pre-fractionated) 혈액, 혈장, 형질 세포(plasma cell), 전립선 세포를 포함하거나 그로 구성된 세포 또는 조직 시료 (또는 그의 파생물(derivative)), 또는 동등하게 바람직한, 혈장, 형질 세포 또는 전립선 세포를 포함하거나, 또는 그로 구성된 세포 또는 조직 시료로부터 유래된 단백질 또는 핵산이다. 바람직하게는, 테스트 시료 및 대조군 시료는 동일한 종으로부터 유래된다.
일 구체에에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법은
c) 전립선암에 걸리지 않은 개체로부터의 하나 이상의 대조군 시료를 제공하는 단계;
d) 상기 대조군 시료에서 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 의해 상기 대조군 시료의 바이오마커 시그니처를 결정하는 단계;를 더 포함하거나 또는 이들로 구성되며,
상기 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 테스트 시료에서의 발현이 상기 단계 (d)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 대조군 시료에서의 발현과 상이한 경우, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태가 확인된다.
또 다른 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은
e) 전립선암에 걸린 개체로부터의 대조군 시료를 제공하는 단계;
f) 상기 대조군 시료에서 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 의해 상기 대조군 시료의 바이오마커 시그니처를 결정하는 단계;를 더 포함하거나 또는 이들로 구성되고,
상기 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 상기 테스트 시료에서의 발현이 상기 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 상기 대조군 시료에서의 발현과 일치하는 경우, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태가 확인된다.
"대조군 시료에서의 존재 및/또는 양과 일치한다(corresponds to the presence and/or amount in a control sample)"는 존재 또는 양이 단계 (e)에서 제공된 대조군 시료의 것과 동일하거나; 또는 단계 (c)에서 제공된 대조군 시료(예를 들면, 음성 대조군)의 것(또는 동일한 것을 대표하는 설정된(predetermined) 기준값)보다 단계 (e)에서 제공된 대조군 시료(즉, 양성 대조군)의 것에 더 가깝다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 존재 및/또는 양은 단계 (e)에서 제공된 대조군 시료의 것의 적어도 60%, 예를 들면, 적어도 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
"대조군 시료에서의 존재 및/또는 양과 다르다(different to the presence and/or amount in a control sample)"는 존재 및/또는 양이 단계 (c)에서 제공된 대조군 시료의 것(또는 동일한 것을 대표하는 설정된 기준값)과 다르다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 존재 및/또는 양은 전립선암 세포를 포함하거나 또는 그로 구성된 대조군 시료의 것의 40% 이하, 예를 들면, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 0%이다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 대조군 시료는 테스트 대상 개체에 대해 연령 및/또는 성별이 일치된다. 다시 말하면, 건강한 개체는 테스트 대상 개체와 거의 동일한 연령이고(예를 들면, 5년 이내), 동일한 성별이다.
바람직하게는, 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 테스트 시료에서의 존재 및/또는 양이 설정된 기준값(predetermined reference value)와 비교된다.
따라서, 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 테스트 시료에서의 존재 및/또는 양이 단계 (d)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 존재 및/또는 양, 또는 설정된 기준값과 유의성 있게 상이한(즉, 통계적으로 상이한) 것이 바람직하다. 따라서, 단계 (b)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 테스트 시료에서의 존재 및/또는 양이 단계 (f)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 존재 및/또는 양, 또는 설정된 기준값과 유의하게 일치(즉, 통계적으로 유사)하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 수반된 실시예에서 논의되는 바와 같이, 테스트 시료와 대조군 시료에서의 특정한 바이오마커의 존재 및/또는 양 간의 유의성 있는 차이는 p<0.05 (예를 들면, p<0.04, p<0.03, p<0.02 또는 p<0.01)인 것으로 분류될 수 있다.
바람직하게는 단계 (b)는 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 또는 67개 이상의 바이오마커의 테스트 시료에서의 존재 및/또는 양을 측정하는 것을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
단계 (b)는 IL-4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-12의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-9의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1a의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 HLA-DR의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 ICAM의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 CD40의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-18의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1b의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GLP-1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-11의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 VEGF의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 시스타틴 C(Cystatin C)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C1-INH의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-13의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-β의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C1s의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인테그린 α-10의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인테그린 GLP-1R의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IgM의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-16의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TM-펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 뮤신-1(Mucine-1)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-2의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IFN-γ의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 CD40 리간드의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-10의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GM-CSF의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인자 B의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인테그린 α-11의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-8의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-4의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 LDL(1)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-β(1)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-7의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 에오탁신(Eotaxin)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 란테스(Rantes)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 β-갈락토시다아제의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 렙틴(Leptin)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 뮤신-1(Mucin-1)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 LDL(2)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 JAK3의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1β의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 프로페르딘(Properdin)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-5의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 Apo-A1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 LDL의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-α의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 BTK의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TGF-β(2)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-4(1)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-4(2)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GLP의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 안지오모틴(Angiomotin)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-6의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 루이스 X(Lewis X)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C1q의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 시알릴 루이스 X(Sialyl Lewis X)의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TGF-β의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1ra의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TGF-β1의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 PSA의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
따라서, 단계 (b)는 IL-4의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-12의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-9의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1a의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 HLA-DR의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-3의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 ICAM의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 CD40의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-18의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1b의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GLP-1의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-11의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 VEGF의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 시스타틴-C의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C1-INH의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-3의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-13의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-β의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C1s의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인테그린 α-10의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C3의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GLP-1R의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IgM의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-16의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TM-펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 뮤신-1의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-2의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IFN-γ의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 CD40 리간드의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-10의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GM-CSF의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인자 B의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C4의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 인테그린 α-11의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-8의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-4의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 LDL (1)의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-β(1)의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-7의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 에오탁신의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 란테스의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 β-갈락토시다아제의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 렙틴의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 뮤신-1의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 LDL (2)의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 JAK3의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1β의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 프로페르딘의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-5의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 Apo-A1의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 LDL의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-α의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 BTK의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TNF-β(2)의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-4 (1)의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-4 (2)의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 GLP의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 안지오모틴의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 MCP-1의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-6의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 루이스 X의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 C1q의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 시알릴 루이스 X의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TGF-β의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 IL-1ra의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 TGF-β1의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b)는 PSA의 발현을 측정하는 것을 포함하지 않을 수 있다.
"발현(expression)"은 mRNA 또는 단백질과 같은 유전자 산물의 수준 또는 양을 의미한다.
"TM 펩티드(TM peptide)"는 10TM 단백질로부터 유래된 펩티드로서, 하기의 서열번호 1의 scFv 항체 구조체(construct)가 특이성을 갖는 것인 펩티드를 의미한다(CDR 서열에 밑줄침):
Figure pct00001
[서열번호 1]
따라서, 이 scFv는 10TM 단백질로의 결합에 대해 이 scFv와 경쟁하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 1에 존재하는 것과 동일한 CDR을 포함할 수 있다.
이러한 항체는 정제 목적을 위한 친화도 택(affinity tag) (예를 들면, C-말단에)을 갖도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 하기의 서열번호 2의 친화도 택이 이용될 수 있다:
DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAAHHHHHH
[서열번호 2]
단백질 및/또는 핵산의 농도를 검출 및/또는 측정하는 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조한다.
단백질의 검출 및/또는 측정을 위한 바람직한 방법은 단일클론 및/또는 다중클론 항체를 이용한 샌드위치 분석법을 포함하는, 웨스턴 블롯(Western blot), 노던-웨스턴 블롯(North-Western blot), 면역흡착 분석(ELISA), 항체 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이(TMA), 면역침전, 인 시투 혼성화(in situ hybridisation) 및 기타 면역조직화학 기법, RIA(radioimmunoassay), 면역방사 분석법(immunoradiometric assay)(IRMA) 및 면역효소 분석법(immunoenzymatic assay)(IEMA)을 포함한다. 대표적인 샌드위치 분석법이 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호에서 David 등에 의해 개시된다. 슬라이드 상의 세포의 항체 염색은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 세포학 실험실 진단 테스트(cytology laboratory diagnostic test)에서 잘 알려진 방법에서 이용될 수 있다.
통상적으로, ELISA는 일반적으로 고체상 분석에서 유색 반응 생성물을 생성시키는 효소의 사용을 포함한다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 및 포스파타아제와 같은 효소가 널리 이용되고 있다. 포스파타아제 반응을 증폭시키는 방법은 제2 효소계를 위한 조효소로 작용하는 NAD를 생성하기 위해 NADP를 기질로 이용하는 것이다. 대장균의 피로포스파타아제(pyrophosphatase)는 조직에 존재하기 않고, 안정하며, 우수한 반응 색상을 생성하므로, 우수한 접합체를 제공한다. 루시퍼라아제와 같은 효소에 기반한 화학-발광 시스템이 또한 이용될 수 있다.
비타민인 비오틴과의 접합이 빈번하게 이용되며, 이는 비오틴이 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 효소-결합 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응에 의해 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
따라서, 일 구체예에서, 단계 (b)는 표 1(A)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(A)에 열거된 바이오마커 중 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(A)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (b)는 표 1(B)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(B)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 또는 6개 이상의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(B)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(C)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(C)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(C)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(D)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(D)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(D)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(E)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(E)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(E)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(F)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(F)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(F)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(G)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(G)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(G)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(H)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(H)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 또는 5개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(H)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(I)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(I)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(I)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(A)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(A)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 또는 38개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(A)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(B)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(B)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(B)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(C)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(C)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(C)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(D)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(D)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2 또는 3개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(D)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(E)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(E)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(E)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(F)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(F)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(F)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(G)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(G)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(G)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(H)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(H)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 또는 46개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(H)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(I)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(I)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(I)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(J)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(J)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(J)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b)는 표 2(K)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(K)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 단계 (b)는 표 2(K)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태는 임상적으로 유의한(clinically significant) 전립선암의 발생 가능성(likelihood)을 결정하는 것이거나 또는 이를 포함한다. 바람직하게는, 특정한 기간(timeframe) 내에 임상적으로 유의한 전립선암의 발병 가능성은 예를 들면, 1개월, 2개월 3개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 15년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년, 55년, 60년, 75년, 80년 이내이거나 또는 테스트되는 개체의 자연적인 수명 내에서 결정된다.
대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 위험도 그룹 A (낮은 위험도), 위험도 그룹 B (중간 위험도), 위험도 그룹 C (증가된 위험도), 위험도 서브그룹 C1 (약간 증가된 위험도), 위험도 서브그룹 C2 (중요하게 증가된 위험도) 및 위험도 그룹 D (high risk)을 구별하기 위한 것이다.
일 구체예에서, "낮은 위험도(low risk)"는 특정한 기간 내에 임상적으로 유의한 전립선암을 갖거나 또는 발병하는 2% 또는 그보다 낮은 가능성, 예를 들면, ≤1.5%, ≤1.0%, ≤0.5%, ≤0.1%, ≤0.05%, ≤0.01%, ≤0.005% 또는 ≤0.001% (또는 이들 중 임의의 두 값 사이)를 의미한다. 일 구체예에서, "중간 위험도(moderate risk)"는 특정한 기간 내에 임상적으로 유의한 전립선암을 갖거나 또는 발병하는 >2% 및 ≤10%의 가능성, 예를 들면, ≤9%, ≤8%, ≤7%, ≤6%, ≤5%, ≤4%, ≤3% 또는 ≤2.5% (또는 이들 중 임의의 두 값 사이)를 의미한다. 일 구체예에서, "증가된 위험도(increased risk)"는 특정한 기간 내에 임상적으로 유의한 전립선암을 갖거나 또는 발병하는 >10% 및 ≤50%의 가능성, 예를 들면, ≤45%, ≤40%, ≤35%, ≤30%, ≤25%, ≤20%, ≤15%, ≤12.5%, ≤11.0% 또는 ≤10.5% (또는 이들 중 임의의 두 값 사이)를 의미한다. 일 구체예에서, "중요하게 증가된 위험도(importantly increased risk)"는 특정한 기간 내에 임상적으로 유의한 전립선암을 갖거나 또는 발병하는 >50% 및 ≤85%의 가능성, 예를 들면, ≤80%, ≤75%, ≤70%, ≤65%, ≤60%, ≤55%, ≤52.5%, ≤51.0% 또는 ≤50.5% (또는 이들 중 임의의 두 값 사이)를 의미한다. 일 구체예에서, "높은(high)"은 특정한 기간 내에 임상적으로 유의한 전립선암을 갖거나 또는 발병하는 >90% 및 ≤100%의 가능성, 예를 들면, 100%, ≤100%, ≤99%, ≤98%, ≤97%, ≤96%, ≤95%, ≤92.5%, ≤90%, ≤87.5%, ≤86%, ≤85.5% 또는 ≤85.1% (또는 이들 중 임의의 두 값 사이)를 의미한다. 바람직하게는, "낮은(low)", "중간(moderate)", "증가된(increased)", "중요하게 증가된(importantly increased)", 및 "높은(high)" 위험도 그룹은 인접하고(contiguous); 따라서, 하나의 위험도 그룹에 대한 중간값을 이용하는 경우, 인접한 위험도 그룹도 따라서 조정된다. 예를 들면, ≤1.0%의 낮은 위험도 값이 이용되는 경우, 중간 위험도 그룹은 >1.0%부터 전개될 것이다. 바람직하게는, 특정한 기간은 1개월, 2개월, 3 개월, 5 개월, 6 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 8 년, 9 년, 10 년, 15 년, 20 년, 25 년, 30 년, 25 년, 40 년, 55 년, 60 년, 75 년, 80 년 또는 테스트되는 개체의 자연적인 수명 내이고, 가장 바람직하게는, 5 년이다.
이 그룹들은 유리 PSA %(%free) 및 총 PSA의 수준에 근거하여 정의될 수 있다: tPSA ≤0.70 ng/ml를 갖는 그룹 A; 2.1-8.0 ng/ml의 tPSA 및 %fPSA ≥27.9%를 갖는 그룹 B; 5.0-10.3 ng/ml의 tPSA 및 %fPSA ≤12.6%를 갖는 그룹 C 및 24.6-724 ng/ml의 tPSA를 갖는 그룹 D. 그룹 A 및 B 환자들은 치료가 필요하지 않다. 그룹 C는 다양한 그룹이고, 서브그룹 C1 및 C2로 나눠질 수 있다. 그룹 C1은 그룹 A 및 B에 더 유사하고, 즉, 전립선암에 대한 낮은 위험도를 갖고 따라서, 생검 및 치료에 대한 필요성이 낮거나/없고, 그룹 C2는 그룹 D에 더 유사하고, 즉, 암 그룹이고, 따라서, 생검 및 치료에 대한 필요를 시사한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 위험도 그룹 A (낮은 위험도)와 위험도 그룹 D (높은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 위험도 그룹 B (중간 위험도)와 위험도 그룹 D (높은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 위험도 그룹 C (증가된 위험도)와 위험도 그룹 D (높은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 위험도 그룹 A (낮은 위험도)와 위험도 그룹 B (중간 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 그룹 A (낮은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 그룹 B (중간 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 그룹 D (높은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)와 위험도 그룹 A (낮은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)와 위험도 그룹 B (중간 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다. 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)과 위험도 그룹 D (높은 위험도)를 구별하기 위한 것이거나 또는 이를 포함한다.
그러나, 대안적인 또는 추가적인 구체예에서, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태는 전립선암의 존재 또는 부재의 결정(즉, 전립선암의 진단)이거나 또는 그를 포함한다. 바람직하게는, 전립선암의 진단은 단계 (b)에서, 표 1(A)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상의 발현, 예를 들면, 표 1(A)에 열거된 바이오마커 중 적어도 2, 3, 또는 4개의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다. 상기 방법은 단계 (b)에서 표 1(A)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 일 구체예에서, 전립선암의 존재는 위험도 서브그룹 C2 또는 D로의 분류(classification)에 의해 표시된다. 일 구체예에서, 전립선암의 존재는 위험도 서브그룹 C2로의 분류에 의해 표시된다. 일 구체예에서, 전립선암의 존재는 위험도 서브그룹 D로의 분류에 의해 표시된다. 일 구체예에서, 전립선암의 존재가 표시되는 경우, 상기 방법은 현재의 권고안(예를 들면, 암세포의 외과적 수술에 의한 제거, 방사선요법 및/또는 화학요법)에 따라 전립선암에 대한 환자의 생검 및/또는 치료를 포함한다.
본 발명의 제1 양태의 일 구체예에서, 단계 (b)는 표 1 및/또는 표 2에 정의된 바이오마커 모두의 상기 테스트 시료에서의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다.
또 다른 또는 추가적인 구체예에서, (단계 (c)의) 전립선암에 걸리지 않은 개체는 어떠한 전립선-관련 질환에도 걸리지 않는다. 바람직하게는, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 어떠한 질환이나 질병에 걸리지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 건강한 개체이다.
또 다른 또는 추가적인 구체예에서, (단계 (e)의) 전립선암에 걸리지 않은 개체는 어떠한 전립선-관련 질환에도 걸리지 않는다. 바람직하게는, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 어떠한 질환이나 질병에 걸리지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 달리 건강한 개체이다. 일 구체예에서, 전립선암에 걸린 개체는 그룹 A, 그룹 B, 그룹 C, 그룹 C1, 서브그룹 C1, 서브그룹 C2, 또는 서브그룹 D에 속한다. 바람직하게는, 단계 (e)는 이 그룹들 각각 또는 그의 조합으로부터의 하나 이상의 개체로부터 유래된 대조군 시료를 제공하는 것을 포함한다.
또 다른 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b), (d) 및/또는 단계 (f)는 상기 하나 이상의 바이오마커에 결합할 수 있는 제1 결합제를 이용하여 수행된다.
바람직하게는, 상기 제1 결합제는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 그로 구성된다
용어 "항체(antibody)"는 합성 항체, 재조합 항체, 또는 항체 하이브리드를 포함하고, 예를 들면, 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변 및/또는 불변 영역의 파아지-표시(phage display)에 의해 생성된 단쇄 항체 분자(single-chain antibody molecule), 또는 당업자에게 알려진 면역분석 포맷(immunoassay format)에서 항원에 결합할 수 있는 기타 면역상호작용 분자(immunointeractive molecule)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 또한 애피바디(affibody) 및 앱타머(aptamer)와 같은, 항체-유사 결합제의 사용을 포함한다.
항체의 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관여되는 기법의 일반적 검토를 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299에서 찾을 수 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 제1 결합 분자들 중 하나 이상은 앱타머일 수 있다 (Collett et al., 2005, Methods 37:4-15 참조).
항체 라이브러리 (Clackson et al, 1991, Nature 352, 624-628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97), 펩티드 라이브러리 (Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), 발현된 cDNA 라이브러리 (Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), 애피바디와 같은, 항체 프레임워크가 아닌 다른 스카폴드(scaffold)에 기반한 라이브러리 (Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40) 또는 앱타머에 기반한 라이브러리 (Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31)와 같은 분자 라이브러리(molecular library)가 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 선택된 주어진 모티프(motif)에 대해 특이적인 결합 분자들이 선택되는 소스로서 이용될 수 있다.
분자 라이브러리는 인 비보로 원핵 세포 (Clackson et al, 1991, op . cit .; Marks et al, 1991, op . cit .) 또는 진핵 세포 (Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6)에서 발현될 수 있거나 또는 세포의 관여 없이, 인 비트로에서 발현될 수 있다 (Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).
단백질 기반 라이브러리가 이용되는 경우, 잠재적 결합 분자의 라이브러리를 코딩하는 유전자가 종종 바이러스에 패키징되고 잠재적 결합 분자가 바이러스의 표면에 표시된다 (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra; Smith, 1985, supra).
아마 가장 일반적으로 이용되는 표시(display) 시스템은 그들의 표면에 항체 단편을 표시하는 필라멘트형 박테리오파아지(filamentous bacteriophage)이고 상기 항체 단편은 상기 박테리오파아지의 외피 단백질(minor coat protein)과의 융합체로 발현된다 (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra). 그러나, 표시를 위한 다른 적합한 시스템은 다른 바이러스 (EP 39578), 박테리아 (Gunneriusson et al, 1999, supra; Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21), 및 효모 (Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56)를 사용하는 것을 포함한다.
또한, 소위 리보솜 표시 시스템(ribosome display system)에서 폴리펩티드 산물의 그를 코딩하는 mRNA로의 결합 (Hanes & Pluckthun, 1997, supra; He & Taussig, 1997, supra; Nemoto et al, 1997, supra), 또는 대안적으로 폴리펩티드 산물의 그를 코딩하는 DNA로의 결합 (US Patent No. 5,856,090 및 WO 98/37186 참조)을 이용하는 표시 시스템이 개발되었다.
항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인이 항원 인식(antigen recognition)에 관여되며, 이는 조기 프로테아제 처리(early protease digestion) 실험에 의해 최초로 인정되었다. 설치류 항체의 "인간화(humanization)"에 의해 추가적인 확인이 발견되었다. 결과적으로 수득되는 항체가 설치류 모 항체(rodent parented antibody)의 항원 특이성을 보유하도록 설치류 기원의 가변 도메인이 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다 (Morrison et al (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81, 6851-6855).
항원 특이성이 가변 도메인에 의해 부여되고, 불변 도메인과 독립적이라는 것이 모두 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는, 항체 단편의 박테리아 발현을 포함하는 실험으로부터 알려져 있다. 이 분자들은 Fab-유사 분자 (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자 (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); VH 및 VL 파트너 도메인이 유연성 있는 올리고펩티드를 통해 결합된 것인 단쇄 Fv (ScFv) 분자 (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85, 5879) 및 단리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 (dAbs) (Ward et al (1989) Nature 341, 544)를 포함한다. 그들의 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 관련된 기법의 일반적 검토를 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299에서 찾을 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 온전한 항체(intact antibodies), Fv　단편 (예를 들면, 단쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 단편 (예를 들면, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인 (예를 들면,　VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체 (단일 포맷 및 듀얼 포맷[즉, dAb-링커-dAb]을 포함한 dAb)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 단쇄 Fv (scFv)이다.
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 항체-유사 결합제, 예를 들면, 애피바디(affibody) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하거나 그로 구성될 수 있다.
"scFv 분자"는 VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한 올리고펩티드를 통해 결합된 분자를 의미한다.
전체 항체(whole antibody)가 아니라, 항체 단편을 이용하는 장점은 여러 개이다. 단편의 더 작은 크기가 개선된 약리적 특성, 예를 들면, 고형 조직의 더 우수한 침투력(penetration)을 가져올 수 있다. 보체 결합과 같은 전체 항체의 효과기(effector) 기능이 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편이 모두 대장균에서 발현되고 그로부터 분비되므로, 다량의 상기 단편의 용이한 생산을 가능하게 한다.
전체 항체, 및 F(ab')2 단편은 "이가(bivalent)"이다. "이가"는 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 두 개의 항원 결합 부위(antigen combining site)를 갖는다는 것을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 일가(monovalent)이어서, 단 하나의 항원 결합 부위를 갖는다.
항체는 단일클론성이거나 또는 다중클론성일 수 있다. 적절한 단일클론 항체가 공지된 기법, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)에 개시된 기법들에 의해 제조될 수 있다.
잠재적인 결합 분자가 라이브러리로부터 선택될 때, 정의된 모티프를 갖는 하나 이상의 셀렉터 펩티드(selector peptide)가 통상적으로 이용된다. 셀렉터 펩티드를 위한 모티프의 설계에서, 펩티드에 구조, 감소된 유연성을 제공하는 아미노산 잔기, 또는 결합 분자와의 상호작용을 가능하게 하는 하전된, 극성 또는 소수성 곁사슬을 제공하는 아미노산이 이용될 수 있다. 예를 들면:
(i) 프롤린은 그의 곁사슬이 알파 탄소 및 질소 모두에 결합하기 때문에 펩티드 구조를 안정화시킬 수 있고;
(ii) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판은 방향족 곁사슬을 가지며, 고도로 소수성이나, 루이신 및 이소루이신은 지방족 곁사슬을 갖고 또한 소수성이고;
(iii) 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘은 염기성 곁사슬을 갖고, 중성 pH에서 양전하를 띠게 되나, 아스파르테이트 및 글루타메이트는 산성 곁사슬을 갖고 중성 pH에서 음전하를 띨 것이며;
(iv) 아스파라긴 및 글루타민은 중성 pH에서 중성이나 수소 결합에 참여할 수 있는 아미드 기를 포함하고;
(v) 세린, 트레오닌, 및 티로신 곁사슬은 수소 결합에 참여할 수 있는, 히드록시기를 포함한다.
통상적으로, 결합 분자의 선택은 결합 분자의 타입에 상응하는 스팟으로의 결합을 분석하기 위해 어레이 기술 및 시스템의 이용을 포함할 수 있다.
따라서, 제1 결합제는 예를 들면, 재조합 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 그의 결합 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제1 결합제는 표면에 고정화될 수 있다.
선택적으로, 상기 테스트 시료 중 하나 이상의 바이오마커는 검출가능한 모이어티로 표지된다. 상기 대조군 시료 중 하나 이상의 바이오마커는 대안적으로 또는 추가적으로 검출가능한 모이어티로 표지된다.
"검출가능한 모이어티(detectable moiety)"는 직접적으로 또는 간접적으로 그의 존재 및/또는 상대적 양 및/또는 위치(예를 들면, 어레이 상의 위치)가 결정될 수 있게 하는 모이어티를 포함한다.
적합한 검출가능한 모이어티는 당해 분야에서 잘 알려져 있다.
예를 들면, 검출가능한 모이어티는 특정한 조건에 노출되면, 검출될 수 있는, 형광 및/또는 발광 및/또는 화학발광 모이어티일 수 있다. 이러한 형광 모이어티는 형광 모이어티의 여기를 유발하여, 검출될 수 있는 특정한 파장에서 검출가능한 형광을 발광하게 할 수 있도록, 특정한 파장 및 강도의 방사(즉, 광)에 노출되어야 할 수 있다.
대안적으로, 검출가능한 모이어티는 (바람직하게는, 검출될 수 없는) 기질을 시각화되고 및/또는 검출될 수 있는 검출가능한 산물로 전환시킬 수 있는 효소일 수 있다. 적합한 효소의 예는 하기에서, 예를 들면, ELISA 분석과 관련하여 보다 상세하게 검토된다.
바람직하게는, 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 및 효소 모이어티(enzymatic moiety)로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 검출가능한 모이어티는 비오틴이다.
명확하게, 검출 대상 물질(예를 들면, 본 명세서에 기재된 대조군 시료 및/또는 테스트 시료 중 하나 이상의 바이오마커 및/또는 선택된 단백질의 검출에서 사용하기 위한 항체 분자)은 검출가능한 모이어티가 용이하게 검출될 수 있도록 하기 위해 충분한 양의 적절한 동위원소(atomic isotope)를 가져야 한다.
또 다른 또는 추가적인 구체예에서, 단계 (b), (d) 및/또는 단계 (f)는 상기 하나 이상의 바이오마커에 결합할 수 있는 제2 결합제를 포함하는 분석을 이용하여 수행되고, 상기 제2 결합제는 검출가능한 모이어티를 포함한다.
방사성- 또는 기타 표지가 본 발명의 방법의 시료에 존재하는 바이오마커 및/또는 결합 모이어티에 공지된 방법으로 내포(incorporate)될 수 있다. 예를 들면, 결합제가 폴리펩티드인 경우, 이는 예를 들면, 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적절한 아미노산 전구체를 이용하여 생합성되거나 또는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 99 mTc, 123I, 186Rh, 188Rh and 111In과 같은 표지가 예를 들면, 결합 모이어티에 있는 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 123I를 내포시키기 위해, IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys . Res. Comm . 80, 49-57)이 이용될 수 있다. 참조문헌 ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989)은 다른 방법들을 상세하게 기술한다. 기타 검출가능한 모이어티(예를 들면, 효소, 형광, 발광, 화학발광, 또는 방사성 모이어티)를 단백질에 접합시키는 방법이 당해 분야에서 잘 알려져 있다.
테스트 대상 시료 중 바이오마커가 간접적으로 상기 단백질의 존재, 양, 및/또는 위치를 결정하는 것을 보조하는 모이어티로 표지될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해할 것이다. 따라서, 상기 모이어티는 다성분 검출가능한 모이어티(multicomponent detectable moiety)의 하나의 성분을 구성할 수 있다. 예를 들면, 테스트 대상 시료 중 바이오마커가 비오틴으로 표지될 수 있으며, 이는 검출가능한 표지에 융합되거나 또는 달리 결합된 스트렙타비딘을 이용한 후속 검출을 가능하게 한다.
바람직하게는, 제2 결합제는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들면, 재조합 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 그로 구성된다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 하나 이상의 제2 결합제는 검출가능한 모이어티로 표지(label)될 수 있고, 예를 들면, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 효소적(enzymatic moiety) 모이어티로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티(예를 들면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료, 예를 들면, Alexa647)이다.
본 발명의 제1 양태의 일 구체예에서, 상기 방법은 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 포함하거나 또는 그로 구성된다.
혈청 또는 혈장 단백질을 검출하기 위한 바람직한 분석은 단일클론 및/또는 다중클론 항체를 이용한 샌드위치 분석을 포함한, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), IRMA(immunoradiometric assay) 및 IEMA(immunoenzymatic assay)를 포함한다. 대표적인 샌드위치 분석이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호에서 David 등에 의해 기술된다. 슬라이드 상의 세포의 항체 염색은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 세포학 실험실 진단 테스트(cytology laboratory diagnostic test)에서 잘 알려진 방법에서 이용될 수 있다.
따라서, 일 구체에에서, 분석은 일반적으로 고체상 분석(solid phase assay)에서 유색 반응 생성물을 생성시키는 효소의 사용을 포함하는 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)이다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 및 포스파타아제와 같은 효소가 널리 이용되고 있다. 포스파타아제 반응을 증폭시키는 방법은 제2 효소계를 위한 조효소로 작용하는 NAD를 생성하기 위해 NADP를 기질로 이용하는 것이다. 대장균의 피로포스파타아제(pyrophosphatase)는 조직에 존재하기 않고, 안정하며, 우수한 반응 색상을 생성하므로, 우수한 접합체(conjugate)를 제공한다. 루시퍼라아제와 같은 효소에 기반한 화학-발광 시스템이 또한 이용될 수 있다.
비타민인 비오틴과의 접합이 빈번하게 이용되며, 이는 비오틴이 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 효소-결합 아비딘 또는 스트렙타비딘(streptavidin)과의 반응에 의해 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
대안적인 구체예에서, 단백질 검출을 위해 이용되는 분석은 편리하게는 형광 분석(fluorometric assay)이다. 따라서, 제2 결합제의 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티, 예를 들면, Alexa 형광단 (예를 들면, Alexa-647)이다.
바람직하게는, ROC AUC 값에 의해 결정된, 상기 방법의 서술적 정확도(predicative accuracy)은 적어도 0.50, 예를 들면, 적어도 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 또는 적어도 0.99이다. 보다 바람직하게는, ROC AUC 값에 의해 결정된, 상기 방법의 서술적 정확도는 0.80 이상 (가장 바람직하게는 1)이다.
본 발명의 제1 양태의 방법에서, 단계 (b)는 비드-기반 어레이 또는 표면-기반 어레이를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 구성된 군으로부터 선택된다.
SVM(support vector machine), 예를 들면, http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html (예를 들면, e1071 1.5-24)로부터 이용가능한 것들을 이용하여 전립선암-관련 질환 상태를 결정하는 방법이 수행될 수 있다. 그러나, 기타 적합한 수단들도 이용될 수 있다. SVM은 또한 본 명세서에서 정의된 바와 같이 표 1의 바이오마커들 중 하나 이상을 포함하거나 또는 그로 구성된 바이오마커 시그니처의 ROC AUC를 결정하기 위해 이용될 수 있다.
SVM은 분류 및 회귀(regression)를 위해 이용되는 일련의 관련된 지도 학습 방법(supervised learning method)들이다. 각각 두 개의 카테고리 중 하나에 속하는 것으로 표시된, 일련의 학습 예가 주어지면, SVM 학습(training) 알고리즘은 새로운 예가 하나의 카테고리 또는 나머지 카테고리에 속하는지 여부를 예측하는 모델을 구축한다. 직관적으로, SVM 모델은 개별적인 카테고리의 예들이 가능한 한 넓은 명확한 갭(gap)에 의해 나누어지도록, 공간에서 점으로 맵핑된 예들의 기술(representaton)이다. 새로운 예가 동일한 공간에 맵핑되고, 그들이 갭의 어느 면에 속하는지에 근거하여 카테고리에 속하는 것으로 예측된다.
보다 공식적으로, SVM은 고차원 또는 무한 차원 공간(infinite dimensional space)에 초평면(hyperplane), 또는 일 세트의 초평면을 구축하고, 이는 분류, 회귀 또는 기타 작업을 위해 이용될 수 있다. 직관적으로, 임의의 종류의 가장 근접한 학습 데이터포인트(training datapoint)까지 가장 큰 거리(소위 기능적 마진(functional margin))를 갖는 초평면에 의해 우수한 분리가 달성되며, 이는 일반적으로 마진이 더 클수록, 분류자(classifier)의 일반화 오류가 더 작기 때문이다. SVM에 관한 추가적인 정보를 위해, 예를 들면, Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-167을 참조한다.
본 발명의 일 구체예에서, SVM은 공지된 작용제(즉, 공지된 조직학적 등급(histological grade)의 전립선암 세포 또는 공지된 원격 전이-없는 생존율(distant metastasis-free survival)을 갖는 전립선암 환자로부터의 전립선암 세포)의 바이오마커 프로파일을 이용하여 본 발명의 방법을 수행하기 전에 "학습된다(trained)". 이러한 학습 시료를 운영하는 것에 의해, SVM은 어떤 바이오마커 프로파일이 특정한 특징과 연관되는지를 학습할 수 있다. 학습 과정이 완료되면, SVM은 테스트된 바이오마커 시료가 특정한 전립선암 시료 타입(즉, 특정한 전립선암-관련 질환 상태)으로부터 유래되었는지 여부를 테스트할 수 있다.
그러나, 이 학습 절차는 SVM을 필요한 학습 파라미터로 미리-프로그래밍하는 것에 의해 우회될 수 있다. 예를 들면, 특정한 전립선암-관련 질환 상태에 속하는 세포가 전술된 예에서 상술된 값 및/또는 조절 패턴(regulation pattern)을 이용하여 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 측정을 이용하는 것에 의해 공지된 SVM 파라미터에 따라 식별될 수 있다.
SVM을 데이터의 적절한 선택(즉, 공지된 전립선암 상태, 전립선암 서브타입 상태 및/또는 공지된 전립선암 위험도 그룹의 세포로부터의 바이오마커 측정)으로 학습시키는 것에 의해 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 조합에 대해 적절한 SVM 파라미터가 결정될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
대안적으로, 표 1 및/또는 표 2 데이터가 당해 분야에서 공지된 적절한 통계적 방법에 따라 특정한 전립선암-관련 질환 상태를 결정하기 위해 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 65%의 정확도, 예를 들면, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정확도를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 65%의 민감도, 예를 들면, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 민감도를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 65%의 특이성, 예를 들면, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 특이성을 갖는다.
"정확도(accuracy)"는 방법의 정확한 결과물(outcome)의 비율을 의미하고, "민감도(sensitivity)"는 양성으로 정확하게 분류된 모든 양성 화합물의 비율을 의미하며, "특이성(specificity)"은 음성으로 정확하게 분류된 모든 음성 화합물의 비율을 의미한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 단계 (b), (d) 및/또는 단계 (f)는 어레이를 이용하여 수행된다.
어레이 자체는 당 분야에서 잘 알려져 있다. 통상적으로, 어레이는 고체 지지체의 표면에 형성된, 각각 한정된 영역을 갖는, 간격을 두고 배치된(spaced apart)(즉, 별개의(discrete)) 영역 ("스팟(spot)" )을 갖는 선형 또는 이차원 구조로 형성된다. 어레이는 또한 각각의 비드가 분자 코드, 또는 색상 코드에 의해 식별되거나 또는 연속적 흐름에서 식별될 수 있는 것인 비드 구조일 수 있다. 각각의 스팟이 용액으로부터 일정 종류의 분자를 흡착하는 것인 일련의 스팟 상에 시료를 통과시키는 것인 분석이 또한 순차적으로 수행될 수 있다. 고체 지지체는 통상적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 통상적으로 이용되는 중합체는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드(bead), 디스크, 실리콘 칩, 마이크로플레이트, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막, 니트로셀룰로오스 막, 나일론 막, 기타 다공성 막, 비-다공성 막(non-porous membrane)(예를 들면, 특히, 플라스틱, 중합체, 퍼스펙스(perspex), 실리콘), 복수의 중합체 핀(polymeric pin), 또는 복수의 마이크로타이터 웰(microtitre well), 또는 단백질, 폴리뉴클레오티드, 및 기타 적합한 분자의 고정화 및/또는 면역분석의 수행에 적합한 기타 표면의 형태일 수 있다. 결합 과정(binding process)은 당 분야에서 잘 알려져 있고 일반적으로 단백질 분자, 폴리뉴클레오티드, 등을 고체 지지체에 가교 공유결합시키거나 또는 물리적으로 흡착시키는 것으로 구성된다. 대안적으로, 친화도-택 또는 유사한 구조물을 통한 프로브의 친화도 커플링(affinity coupling)이 이용될 수 있다. 접촉 또는 비-접촉 인쇄(non-contact printing), 마스킹(masking), 또는 포토리소그래피(photolithography)와 같은 잘-알려진 기법을 이용하는 것에 의해, 각 스팟의 위치가 정의될 수 있다. 리뷰를 위해, Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) 및 Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9)을 참조한다.
통상적으로 어레이는 마이크로어레이이다. "마이크로어레이(microarray)"는 적어도 약 100/cm2, 및 바람직하게는 적어도 약 1000/cm2의 별개 영역들의 밀도를 갖는 영역들의 어레이라는 의미를 포함한다. 마이크로어레이 내의 영역들은 전형적인 크기, 예를 들면, 약 10-250 ㎛ 범위의 직경을 갖고, 어레이 내의 다른 영역들로부터 동일한 거리만큼 떨어져 있다. 어레이는 대안적으로 마크로어레이 또는 나노어레이일 수 있다.
(앞서 검토된) 적합한 결합 분자가 일단 식별되고 단리되면, 당업자는 분자 생물학 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 어레이를 제조할 수 있다; 하기 실시예를 참조한다.
상기 어레이는 비드-기반 어레이(bead-based array)일 수 있으나, 바람직하게는 표면-기반 어레이, 예를 들면, 마크로어레이(macroarray); 마이크로어레이(microarray); 나노어레이(nanoarray)로 구성된 군으로부터 선택된 어레이이다.
그러나, 상기 방법은:
(i) 시료에 존재하는 바이오마커를 비오틴으로 표지하는 단계;
(ii) 비오틴-표지된 단백질을 표면에 있는 별개의 위치에 고정화된 복수 개의 scFv를 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계로서, 상기 scFv는 표 1의 단백질 중 하나 이상에 대해 특이성을 갖는 것인 단계;
(iii) 상기 고정화된 scFv를 형광 염료를 포함하는 스트렙타비딘 접합체와 접촉시키는 단계; 및
(iv) 어레이 표면에 있는 별개의 위치에서 염료의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있고,
상기 어레이 표면에서 염료의 발현은 상기 시료에서 표 1로부터의 바이오마커의 발현을 나타낸다.
본 발명의 제1 양태의 방법은 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 상기 하나 이상의 바이오마커를 코딩하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자이다 (가장 바람직하게는 mRNA 분자이다).
단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사선 사진 촬영(autoradiography) 및 인 시투 혼성화(in situ hybridisation)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현은 DNA 마이크로어레이를 이용하여 결정된다.
따라서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것은 하나 이상의 결합 모이어티를 이용하여 수행되고, 상기 결합 모이어티 각각은 개별적으로, 표 1에 표시된 바이오마커 중 하나를 코딩하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 또는 핵산 분자로 구성된다.
상기 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO (바람직하게는 DNA)를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다. 바람직하게는 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이 (예를 들면, 15개 내지 35개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이)이다.
일 구체예에서, 상기 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티를 포함하고, 예를 들면, 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들면, 방사성 원소); 또는 효소적 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, 상기 검출가능한 모이어티는 방사성 원소를 포함하거나 또는 그로 구성되고, 예를 들면, 상기 방사성 원소는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중 수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
그러나, 상기 모이어티는 형광 모이어티일 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 제공되는 시료는 미분획(unfractionated) 혈액, 혈장, 혈청, 조직액(tissue fluid), 전립선 조직, 전립선 액(prostate juice), 담즙 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 미분획 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 제공되는 시료는 혈장이다.
본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합제를 포함하는, 개체에서 전립선암의 존재를 결정하기 위한 어레이(array)를 제공한다.
바람직하게는, 상기 어레이는 표 1에 정의된 단백질 각각에 대한 하나 이상의 결합제를 포함한다.
본 발명의 제3 양태는 본 발명의 제1 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에서 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 예후(prognostic) 및/또는 진단 마커로서의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 표 1에 정의된 바이오마커 모두는 예후 및/또는 진단 마커로 이용된다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제1 양태에서 정의된 바와 같은 예후 및/또는 진단 마커로서 사용하기 위한, 본 발명의 제1 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에서 정의된 바와 같은 단리된 결합제를 제공한다.
본 발명의 제5 양태는
A) 본 발명의 제1 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에서 정의된 하나 이상의 제1 결합제, 또는 본 발명의 제2 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에 따른 어레이; 및
B) 본 발명의 제1 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에서 정의된 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 전립선암의 존재를 결정하기 위한 키트를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 키트는 본 발명의 제1 양태 또는 그의 구체예 또는 그의 구체예의 조합에서 정의된 바와 같은 제2 결합제를 포함한다.
본 발명의 제6 양태는 실질적으로 본 명세서에 기재된, 개체에서 전립선암-관련 질환 상태의 존재를 결정하기 위한 방법 또는 용도를 제공한다.
실질적으로 본 명세서에 기재된, 개체에서 전립선암-관련 질환 상태의 존재를 결정하기 위한 어레이 또는 키트.
본 발명의 특정한 양태를 구현하는, 바람직한, 비-한정적 실시예가 하기 도면 및 표를 참조하여 기재될 것이다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

표 3. 연구에 포함된 환자 시료의 임상 연구 파라미터
그룹 시료 수 tPSA (ng/ml) % PSA (유리/전체)
A 20 <0.70 n/aa
B 20 2.1-8.0 ≥ 27.9%
C 20 4-10 ≤ 12.6%
D 20 24.6-724 n/aa
a)n/a = not applicable
Figure pct00006
도 1. 재조합 scFv 항체 마이크로어레이의 평가. A) 1440개의 데이터 포인트 (대조군을 포함한 180개의 프로브 x 8개의 재현물(replicate))를 포함하는 대표적인 마이크로어레이의 스캐닝된 이미지. 이미지는 80% 레이저 파워(laser power) 및 80% PMT-이득값(PMT-gain)에서 스캐닝했다. B) 분석-내 재현성(intra-assay reproducibility), 즉, 스팟-대-스팟 변이(spot-to-spot variation). 162개의 상이한 항체 및 8개의 스팟 재현물(spot replicate)에 기초한 데이터. C) 분석-간 재현성(inter-assay reproducibility), 즉, 어레이-대-어레이(array-to-array) 변이. 각각 162개의 상이한 항체를 포함하는, 2개의 독립된 어레이 상에서 분석된 하나의 시료에 근거한 데이터.
도 2. PC를 가질 증가된 위험도를 갖는 환자 그룹의 단백질 발현 프로파일링. A (최저 위험도) 내지 D(최고 위험도)로 나타낸 4개의 위험도 그룹은 tPSA 및 유리 PSA의 %에 근거하여 선험적으로 정의되었다. A) 유의성 있게 차등적으로 발현된 분석물 (p<0.05)을 윌콕슨 부호-순위 검정(Wilcoxon's signed-rank test)을 이용하여 식별하고, 히트 맵(heat map)에 나타냈다; 녹색- 하향-조절, 적색- 상향 조절, 및 흑색- 동일한 수준. B) 각 환자 코호트를 학습 세트(training set)(시료의 75%) 및 테스트 세트(시료의 25%)로 나누었다. C) 모든 162개의 항체를 이용한, 즉, 필터링되지 않은 데이터(unfiltered data)를 이용한, SVM 기반 방식을 이용한 환자 코호트 A 내지 D의 분류(claissification). SVM 모델을 학습 세트에서 학습시키고, 독립된 테스트 세트에서 테스트하고, ROC AUC 값으로 표현했다.
도 3. 위험도 그룹 C(중간-범위의 tPSA 및 낮은 유리 PSA %)의 계층화(stratification). A) 모든 162개의 항체에 기반한, 즉, 필터링되지 않은 데이터를 이용한, 비지도 계층적 클러스터링(unsupervised hierarchical clustering)은 C1(황색) 및 C2(청색)로 나타낸, 두 개의 서브그룹으로의 분리를 가져왔다. B) 필터링되지 않은 데이터에 근거한 주성분 분석(principle component analysis)(PCA)은 서브그룹 C1 (황색) 및 C2 (청색)로의 계층화를 확인했다. C) 윌콕슨 부호-순위 검정을 이용하여 유의성 있게 차등적으로 발현된 분석물 (p<0.05)을 식별하고 히트 맵에 나타냈다; 녹색- 하향-조절, 적색- 상향 조절, 및 흑색- 동일한 수준. D-E) 10-플렉스(plex) 사이토카인 샌드위치 항체 분석(MSD)을 이용한, 선택된 분자의 항체 마이크로어레이 데이터의 검증(validation). 관찰된 신호의 대부분이 MSD 분석의 검출 하한보다 높았던, 두 개의 분석물 TNF-α (D) 및 IL-8 (E)에 대한 데이터만 표시된다. MSD 데이터를, 이 두 개의 분석물이 차등적으로 발현되는 것으로 나타난 경우에서 상응하는 마이크로어레이 데이터와 비교했다 (C1 대 C2).
도 4. 최초의 위험도 그룹 A, B, 및 D 대비 서브그룹 C1 및 C2의 단백질 발현 프로파일링. SVM-LOO 교차-검증(cross-validation)을 이용하여 시료를 분류하고 ROC AUC-값을 결정했다. 윌콕슨 부호-순위 검정을 이용하여 유의성 있게 차등적으로 발현된 분석물 (p<0.05)을 식별하고 히트 맵에 나타냈다; 적색- 상향 조절, 녹색- 하향-조절, 및 흑색- 동일한 수준. A) A, B 및 D, 각각 대비 C1의 SVM-LOO 교차-검증. B) C1 대 A, B, 및 D 각각에 대한 유의성 있게 차등적으로 발현된 분석물 (p<0.05)을 보여주는 히트 맵. C) A, B 및 D, 각각 대비 C2의 SVM-LOO 교차-검증. D) C2 대 A, B, 및 D 각각에 대한 유의성 있게 차등적으로 발현된 분석물 (p<0.05)을 보여주는 히트 맵. E) C1 대 C2, C1 대 D, A 대 C2, 및 B 대 C2에 대한 상응하는 마커의 발현 수준과 A 대 D를 구별하는 악성 시그니처(malignant signature)의 비교.
실시예
개요
혈액 중 전립선 특이적 항원 (PSA)를 이용한 전립선암(PC)의 조기 검출은 미선별(unscreened) 남성들 중 PC-사망을 감소시킨다. 그러나, 통상적으로 사용되는 컷-오프에서 PSA의 높지 않은(modest) 특이성 때문에, 약간 상승된 PSA를 갖는 남성들 중 강화된 위험도 분류(risk classification)에 기여하는 추가적인 바이오마커에 대한 시급한 요구가 존재한다. 이 연구에서, 재조합 항체 마이크로어레이를 전체 PSA 및 유리 PSA%의 수준에 근거하여 4개의 위험도 군으로 선험적으로 분리된, 일상적인 PSA-측정으로부터 80개의 혈장 시료의 단백질 발현 프로파일링을 위해 적용했다. 결과는 PC를 정확하게 찾아내고(악성 바이오마커 시그니처(malignant biomarker signature)), 가장 중요하게는 생화학적으로 정의된 PC 위험도 그룹과 중간 내지 높은 상관관계를 보이는 혈장 단백질 프로파일이 식별될 수 있다는 것을 보여주었다. 특히, 데이터는 또한 선험적으로 이질적인(heterogeneous) 것으로 알려져 있었던, 중간-범위 PSA 및 낮은 유리 PSA %를 갖는 위험도 그룹이, 각각 최저 위험도 그룹 및 최고 위험도 그룹에 보다 유사한, 두 개의 서브그룹으로 더 계층화될 수 있다는 것을 시사했다. 결론적으로, 이 개념 입증(proof-of-concept) 연구에서, 본 발명자들은 PC의 위험도 그룹과 연관된, 혈장 단백질 바이오마커 시그니처가 친화도 프로테오믹스(affinity proteomics)를 이용하여 가공되지 않은 혈장 시료(crude plasma sample)로부터 식별될 수 있다는 것을 확인했다. 이 방식은 보다 장기적인 관점에서 PC 환자의 개선된 위험도 분류에 대한 새로운 기회를 제공할 수 있다.
재료 및 방법
임상 시료(clinical samples)
본 발명자들은 스웨덴, 말모의 스카인 대학병원, 임상화학과(Dept. of Clinical Chemistry, Skane University Hospital, Malmo Sweden)에서 일상적으로 수행되는 PSA 테스트를 위해 의뢰된 50 내지 70세의 남성 80명으로부터의 식별이 제거된(de-identified) EDTA 항-응고 혈액 시료를 이용했다. 이 시료들에 대해 어떠한 임상 정보나 환자 식별자는 보유되지 않았고, 시료를 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다(표 3). WHO 96/670 (PSA-WHO) 및 WHO 68/668 (유리 PSA-WHO) 캘리브레이터(calibrator)에 대해 교정된, 듀얼-표지 DELFIA Prostatus
Figure pct00007
전체/유리 PSA-분석(Perkin-Elmer, Turku, Finland)을 이용하여 전체 PSA 및 유리 PSA의 수준을 결정하였다. 검출가능한 범위는 tPSA에 대해 0.10 내지 250 ng/ml이었고, 유리 PSA에 대해 0.04 내지 250 ng/ml이었다. tPSA의 측정에 대한 변동 계수(coefficients of variation: CV)는 tPSA에 대해 ≤10.6%이고, 유리 PSA에 대해 ≤7.3%이었다. 유리 PSA % 및 전체 PSA의 수준에 근거하여 시료를 4개의 그룹으로 나누었다: A (n=20)는 tPSA ≤ 0.70 ng/ml를 갖고; B (n=20)는 2.1-8.0 ng/ml의 tPSA 및 %fPSA ≥ 27.9%를 가졌으며; C (n=20)는 5.0-10-3 ng/ml의 tPSA 및 %fPSA ≤ 12.6%을 가졌고; 및 D (n=20)는 24.6-724 ng/ml의 tPSA를 가졌다. 이러한 식별이 제거된 시료의 4개의 그룹은 PC 진단 또는 결과의 위험도의 매우 상이한 카테고리를 반영하여, 그룹 A는 유의한 PC의 매우 낮은 장기적 위험도를 갖고, 그룹 B는 전립선 질환의 약간 증가된 위험도를 가지나 임상적으로 유의한 PC의 낮은 가능성을 갖고, 그룹 C는 PC의 중요하게 증가된 위험도를 가지며, 그룹 D는 PC의 임상적으로 유의하거나 진행된 단계의 매우 높은 위험도를 갖는다 [38-41]. 수행된 절차는 1975년 헬싱키 선언에 따랐다.
혈장 시료의 표지(Labelling of plasma samples)
EDTA 항-응고 혈장 시료를 하나의 작은 조정으로, 혈청 프로테옴에 대해 이전에 최적화된 프로토콜[28, 29]을 이용하여 표지하였다. 혈장 시료가 응고되는 것을 방지하기 위해, 프로토콜 전체에서 사용된 PBS 완충액에 4 mM의 최종 농도까지 EDTA를 첨가하였다. 요약하면, 시료를 4℃에서 16 000 x g로 20분 동안 원심분리하고, 그 후 5 ㎕의 시료를 4 mM EDTA PBS로 45배 희석하여, 약 2 mg/ml의 총 단백질 농도가 되게 하였다. 희석된 시료를 얼음 상에서 0.6 mM EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL, USA)와 함께 2시간 동안 인큐베이션시키고, 그 후, 4℃에서 72시간 동안 4 mM EDTA-PBS에 대한 투석에 의해 미반응 비오틴을 제거했다. 최종적으로, 시료를 분주하고, 마이크로어레이 실험에서 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
scFv 의 제조 및 정제
주로 면역조절(immunoregulation)에 관련된, 62종의 상이한 분석물에 대한 162개의 인간 재조합 scFv 항체 단편이 n-CoDeR 라이브러리로부터 선택되고 [42], Bioinvent International AB (157개의 scFv 클론; Lund, Sweden) 및 M. Ohlin 교수(5개의 뮤신-1 특이적 클론; 스웨덴, 룬드, 룬드 대학교, 면역학과)로부터 친절하게 제공받았다 (지지 정보(Supporting Information) 표 3). 이러한 파아지-표시 유래 scFv 항체의 특이성, 친화도 (1-10 nM 범위), 및 온-칩 기능성(on-chip functionality)을 (i) 엄격한 파아지-표시 선택 프로토콜 [42], (ii) 표적 분석물 당 복수 개의 클론 (=4) 및 (iii) 마이크로어레이 적용을 위해 개조된 분자 설계 [26, 27]를 이용하여 확인하였다. 또한, 여러 항체들의 특이성/반응성 패턴은 명확하게 규명된 혈청 시료, 및 ELISA, MSD(Meso Scale Discovery), CBA(cytometric bead array) 및 MS(mass-spectrometry)와 같은 직교 방법(orthogonal method)을 이용하고, 또한 스파이킹 및 블록킹 실험(spiking and blocking experiment)을 이용하여 이전에 검증되었다 (Supporting Information Table 3) [31, 33, 34, 36]. 모든 scFv를 100 ml E. coli 배양물에서 제조하고, Ni2 +-NTA 아가로오스 (Qiagen, Hilden, Germany)에서의 친화도 크로마토그래피를 이용하여 발현 상층액으로부터 정제하였다. 결합 분자들을 250mM 이미다졸 (Saveen Werner, Malmo, Sweden)로 용리시키고, PBS에 대해 투석시키고, 마이크로어레이 실험에서 사용하기 전까지 4℃에서 보관했다. 10% SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 scFv의 온전성(integrity) 및 순도를 평가하였다. 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정하였다.
항체 마이크로어레이의 제조 및 가공
요약하면, 비-접촉 디스펜서(non-contact dispenser)(SciFlexarrayer S11, Scienion, Berlin, Germany)를 이용하여 scFv 마이크로어레이를 제조하고 이전에 최적화된 셋-업에 따라 가공했다 [28, 29]. 통틀어, 180개의 scFv 및 대조군을 Blank Polymer Maxisorp 슬라이드 (NUNC A/S, Roskilde, Denmark)에 8개의 재현물(replicate)로, 각 위치당 0.05-0.4 mg/ml의 scFv 농도로 한 방울(300 pL)씩 배치(array)했다. 180개의 프로브를 3개의 열(column)로 배열하고, 각 열은 60개의 행(row)을 포함했다 (도. 1A). AlexaFlour-647 표지된 스트렙타비딘 (10 ㎍/ml)을 위치 대조군(position control)으로 인쇄하고, 인쇄 완충액(printing buffer)(PBS)을 음성 대조군(negative control)로 포함시켰다. 인쇄 후에, 슬라이드를 건조시키고 PBS o/n 중 5% (w/v) 탈지 우유 (Semper AB, Sundbyberg, Sweden)로 블록킹시켰다. 그 후, 슬라이드를 Protein Array Workstation (Perkin Elmer Life & Analytical Sciences, Wellesley, MA, USA)에 배치하고, PBS 중 0.5% (w/v) Tween-20 (PBS-T)으로 4분 동안 세척했다. 그 후, PBS 중 1% (w/v) 탈지 분유 및 1% (v/v) Tween-20 (PBS-MT)에 1:2로 희석된, 표지 시료 70 ㎕를 주입하고, 60분 동안 교반하면서 인큐베이션시켰다. 2차 세척 후에, 어레이를 PBS-MT 중 1 ㎍/ml Alexa-647 접합 스트렙타비딘 350 ㎕와 함께 60분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후에, 어레이를 질소 기체의 흐름 하에 건조시키고, 공초점 마이크로어레이 스캐너(confocal microarray scanner)(ScanArray Express, Perkin Elmer Life & Analytical Sciences)로 5 ㎛ 해상도(resolution)에서, 5개의 상이한 스캐너 셋팅(50% PMT 이득(gain) 및 70% 레이저 파워 (50/70), 70/70, 80/80, 80/90, 및 90/90)을 이용하여 스캐닝하였다. ScanArray Express 소프트웨어 버전 4.0 (Perkin Elmer Life & Analytical Sciences)을 이용하여 신호 강도를 정량하였다. 국소 백그라운드를 차감하고, 가능한 국소 결함(local defect)을 보충하기 위해, 두 개의 최고 및 최저 재현물을 자동적으로 배제시켰다. 제시된 신호 강도는 나머지 4개의 재현물 스팟에 대한 평균값을 나타낸다. 불포화 스팟만 분석에서 고려하였다.
마이크로어레이 데이터 정규화( Microarray data normalization)
DNA 마이크로어레이에 대해 개발된 정규화와 유사한, 세미-글로벌 정규화 방식(semi-global normalization approach)[32, 33]을 이용하여, 데이터 세트의 칩-대-칩 정규화(chip-to-chip normalization)를 수행하였다. 각 분석물에 대해 변동 계수(CV)를 먼저 계산하고 정렬하였다(rank). 모든 시료에 대해 최저 CV-값을 보이는 분석물의 15 퍼센트를 확인했고, 이는 24개의 분석물에 해당했으며, 이들을 각 시료에 대한 칩-대-칩 정규화 인자(normalization factor)를 계산하기 위해 이용했다. 정규화 인자 Ni를 Si가 각 시료에서 24개의 분석물에 대한 신호 강도의 합이고, μ는 모든 시료에 대해 평균된 24개의 분석물에 대한 신호 강도의 합인, Ni=Si/μ에 의해 계산하였다. 하나의 시료로부터 생성된 각 데이터 세트를 정규화 인자 Ni로 나누었다. 신호 강도의 Log2 값을 추가적인 분석을 위해 이용했다.
데이터 분석
80개의 환자 시료를 tPSA 및 %fPSA의 값에 근거하여 4개의 그룹(n=20)으로 나누었다. 초기 분류 분석을 위해, 4개의 위험도 그룹 각각을 학습 세트 (n=15)와테스트 세트 (n=5)로 나누었다. 시료를 분류하기 위해, 본 발명자들은 R에서 지도 학습(supervised learning) 방법인 SVM (support vector machine)을 이용했다 [43]. 선형 커널(linear kernel)을 이용하여 지도 분류(supervised classification)를 수행하고, 제약 비용(cost of contraints)을, R 함수 SVM의 디폴트 값인 1로 설정했고, 과잉적합(overfitting)을 피하기 위해 이를 조정하기 위한 어떠한 시도도 하지 않았다. 학습 세트를 이용하여 SVM 모델을 학습시키고, 동결시키고, 테스트 세트에 적용했다. SVM을 학습시키기 전에 데이터의 여과를 수행하지 않았고, 즉, 어레이 상의 모든 항체로부터의 데이터를 분석에 포함시켰다. 또한, SVM 결정 값(decision value)을 이용하여 ROC(receiver operating characteristics) 곡선을 작성하고, AUC (area under the curve)를 계산하였다. Cluster 및 Treeview [44]의 비지도 계층적 클러스터링(unsupervised hierarchial clustering)을 이용하여, C 그룹을 C1 (n = 10) 및 C2 (n=10)로 나타낸 2개의 서브그룹으로 분리할 수 있었다. 보다 작은 시료 수 때문에, 이 경우 학습 세트와 테스트 세트로의 분리가 가능하지 않았고, 따라서, SVM을 단일잔류 교차 검증(leave-one-out cross-validation) 기법을 이용하여 학습시켰다. 상대적 단백질 수준에 근거하여 유의성 있게 상향- 또는 하향-조절된 혈장 단백질 (p < 0.05)을 정의하고, 윌콕슨 부호-순위 검정을 이용하여 확인하였다. 시료를 주성분 분석(PC) 소프트웨어 프로그램(Qlucore Omics Explorer, Lund, Sweden) 및/또는 Cluster and Treeview를 이용하여 가시화시켰다.
검증(validation) 실험
항체 마이크로어레이 결과를 검증하기 위한 시도로, 모든 80개의 EDTA-혈장 시료에 대해 인간 Th1/Th2 10-plex MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA) 분석을 수행하였다. MSD 96-플레이트의 각 웰을 공간적으로 구별된 전극 스팟(spatially distinct electrode spot)으로 IFN-α, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 및 TNF-β에 대한 항체로 미리-관능화(pre-functionalize)시켰다. 제조사에 의해 제공된 프로토콜 및 전기화학발광-기반 판독(electrochemiluminiscence-based readout)에 따라 MSD SECTOR® 장치에서 분석을 수행했다. 검출 한계를 표준 곡선 중 영점(zero point)에 대한 표준 편차의 2.5배 신호로 정의하였다.
결과
이 연구에서, 본 발명자들은 자체적으로 개발된 재조합 항체 마이크로어레이를 이용하여, PC를 가질 위험도의 다양한 수준에 있는 80명의 환자로부터의 비-분획, 비오티닐화 EDTA-혈장 시료의 단백질 발현 프로파일링을 수행했다. 시료는 PC 진단 또는 결과(outcome)의 위험도의 상이한 카테고리를 반영하여, tPSA 및 %fPSA에 근거하여 4개의 위험도 그룹으로 선험적으로 분류되었었다 (표 3).
scFv 마이크로어레이의 평가
도 1A에 대표적인 마이크로어레이 이미지가 도시되며, 이는 균일한 스팟 형태, 높은 신호-대-잡음(signal-to-noise) 비, 및 동적 신호 강도(dynamic singal intensity)가 얻어졌다는 것을 보여준다. 모든 80개의 시료가 성공적으로 프로파일링되었다; 따라서, 모든 80개의 시료로부터의 어레이 데이터를 후속 통계적 분석을 위해 이용할 수 있었다. 스팟-대-스팟 변이(spot-to-spot variation)를 분석하여 분석-내 재현성(intra-assay reproducibility)을 평가하고, 0.95의 평균 결정계수(coefficient of determination) (R2)를 얻었다 (도 1B). 독립적인 어레이에서 단일 시료를 분석하는 것에 의해 분석-간 재현성, 즉, 어레이-대-어레이 변이(array-to-array variation)를 평가하여, 0.96의 R2-값을 얻었다 (도 1C).
위험도 그룹의 분류
먼저, 본 발명자들은 그룹 A는 최저 위험도를 나타내고, 그룹 D는 최고 위험도를 나타내는 것인 A 내지 D로 표시된, 4개의 전립선암 위험도 그룹의 집중적인 (62개의 분석물) 혈장 프로테옴 프로파일을 결정하였다 (표 3). 윌콕슨 부호-순위 검정을 이용하여 3 내지 44개의 차등적으로 발현된 (p < 0.05) 혈장 분석물을 식별하였고, 이들이 도 2A에 히트 맵으로 도시된다. 데이터는 단 3개의 분석물만이 두 개의 최저 위험도 그룹, A와 B 간에 차등적으로 발현되었다는 것을 보여주었다. 따라서, 임상적 관점에서 예상할 수 있는 바와 같이, 데이터는 두 개의 최저 위험도 그룹 간에 작은 차이만을 암시했다. 대조적으로, 37, 44, 및 30개의 탈-조절된(de-regulated) 분석물이 최고 위험도 그룹 D 대비 그룹 A, B, 또는 C에 대해 관찰되어, 큰 (더 큰) 차이를 나타냈다. 보다 상세하게, 여러 보체(complement) 단백질(예를 들면, C3, C4, C1q, 인자 B 및 프로페르딘)이 고 위험도 그룹 D에서 하향-조절되는 것으로 확인되었으나, 상향-조절된 분석물은 TH1 (예를 들면, IL-2, IL-3 및 INF-α) 및 TH2 (예를 들면, IL-4, IL-10) 사이토카인 모두의 복잡한 패턴을 보였다. 가장 중요하게, 그룹 A (매우 낮은 PC-위험도)와 그룹 D(PC의 임상적으로 유의하거나 또는 진행된 단계의 매우 높은 위험도)를 구별하는 바이오마커 시그니처가 PC를 정확하게 찾아내는 악성 바이오마커 시그니처로 간주될 수 있다.
다음으로, 본 발명자들은 관찰된 단백질 발현 프로파일에 근거하여, 4개의 위험도 그룹 (A 내지 D)을 분류하는 어레이 플랫폼의 능력을 평가하였다. 이를 위해, 각 환자 그룹을 학습 세트 (시료의 75%)와 테스트 세트 (시료의 25%)로 나누었다 (도 2B). 따라서, SVM 모델을 학습 세트에서 학습시키고, 그 후, 독립적인 테스트 세트에 적용시켰다. 결과는 위험도 그룹이 상이한 정확도(accuracy)로 구별될 수 있고, 그룹 B와 D는 0.68의 AUC를 보이고, 그룹 A와 B는 0.84의 AUC를 보이며(단 3종의 분석물에 근거함), 그룹 A와 D는 0.72의 AUC를 보인다는 것을 보여주었다(도 2C). 따라서, 데이터는 악성 시그니처(malignant signature)가 그룹 A (매우 낮은 위험도)와 그룹 D (PC의 임상적으로 유의한 또는 진행된 단계의 매우 높은 위험도)를 잘 구별하기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여주었다(도 2A 및 2C 참조). 대조적으로, 그룹 C는 나머지 다른 3개의 위험도 그룹으로부터 구별될 수 없었다(모든 경우에 AUC = 0.5). 이에 대해, 그룹 C는, 모두 생검 테스트를 위해 선택되나, 그 중 25 내지 50% 만이 실제로 PC를 갖는 이질적 환자 그룹 (중간-범위 tPSA, 낮은 유리 PSA %)을 나타낸다는 것이 주목된다. 따라서, 이 이질적 환자 그룹의 계층화가 PC 발병의 보다 높거나 보다 낮은 위험도를 갖는 환자를 식별하기 위한 핵심 수단(instrument)일 수 있다.
위험도 그룹 C의 계층화
위험도 그룹 C가 더 계층화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 필터링되지 않은 데이터에 근거하여, 즉, 어레이에 포함된 모든 항체로부터의 데이터를 이용하여 비지도 계층적 클러스터링(unsupervised hierachial clustering)을 수행하였다. 결과는 위험도 그룹 C가 실제로 C1 및 C2로 표시된, 두 개의 별개의 서브그룹으로 계층화될 수 있다는 것을 보여주었다 (도 3A). 유사하게, 주성분 분석(PCS)을 이용하여, C 코호트의 명확한 세분(subdivision)을 관찰하였다 (도 3B). 또한, C1 대 C2에 대해, 49개의 유의성 있게 차등적으로 (p<0.05) 발현된 혈장 분석물을 관찰하였다 (도 3C). 보다 상세하게, 3개의 보체 단백질(C1q, 인자 B 및 C4)이 C1에서 상향-조절되었고, 나머지 차등적으로 발현된 단백질은 C1에서 하향-조절되었다. 후자에 속하는 분석물의 군은 다수의 사이토카인 (예를 들면, IL-6 및 IL-4), 보체 단백질 (예를 들면, C1-INH 및 C1s), 및 세포 표면 단백질 (예를 들면, ICAM, HLA-DR, 뮤신-1 및 CD-40)을 포함했다. 종합하면, 데이터는 이질적(heterogeneous) 위험도 그룹 C가 다수의 탈-조절된 분석물을 이용하여, 두 개의 구별되는 서브그룹 C1 및 C2로 계층화될 수 있다는 것을 보여주었다.
어레이 데이터를 검증하기 위해, 독립적인 10-plex 사이토카인 샌드위치 항체 마이크로어레이 (MSD)를 적용했다 (도 3D 및 3E). C2 대비 C1에서 관찰된 TNF-α(Fig. 3D) 및 IL-8 (IL-8) (Fig. 3E)의 하향 조절은 MSD 데이터에 의해 검증될 수 있었다.
서브그룹 C1 및 C2 의 위험도 계층화
위험도 그룹 C의 계층화된 세분의 생물학적 효과를 평가하기 위해, 서브그룹 C1 및 C2의 단백질 발현 프로파일을 나머지 3개의 원래의 위험도 그룹 A, B, 및 D의 단백질 발현 프로파일과 비교하였다. C1의 경우에, 결과는 C1이 위험도 그룹 D와 잘 구별될 수 있으나(AUC = 0.82), 위험도 그룹 A 및 B와는 그렇지 않다(두 경우에서, AUC=0.5)는 것을 보여주었다(도 4A). 또한, 47개의 차등적으로 발현된 분석물이 D 대비 C1에서 관찰되었으나, 각각 A 및 B 대비 C1에서는 16개 및 15개만이 관찰되었다 (도 4B). 전자의 경우에, 상향-조절된 보체 단백질 (예를 들면, C1q, C3, 및 인자 B) 및 하향 조절된 사이토카인 (예를 들면, TGF-α1, IL-1ra, IL-6 및 MCP-1) 및 세포 표면 마커 (예를 들면, ICAM, CD40 및 루이스 X)의 패턴이 D 대비 C1에서 관찰되었다.
대조적으로, 결과는 C2가 위험도 그룹 A (AUC=0.72) 및 B (AUC=0.75)로부터 잘 구별될 수 있으나, 위험도 그룹 D로부터 그렇지 않다 (AUC=0.57)는 것을 보여주었다 (도 4C). 이 경우, 22개 및 28개의 탈-조절 분석물이 각각, A 및 B 대비 C2에서 관찰되었으나, D 대비 C2에서는 단지 5개만이 관찰되었다 (도 4D). A 대비 C2에서 단지 2개의 하향-조절된 분석물 (C1q 및 IL-4)이 관찰되었으나, A 및 B 대비 C2에서 상향-조절된 사이토카인 (예를 들면, IL-1ra, MCP-1, 및 IL-6) 및 세포 표면 마커 (예를 들면, CD40, 루이스X 및 시알릴 루이스X)의 패턴이 관찰되었다. 종합하면, 결과는 C1은 최저 위험도 그룹 A 및 B에 더 유사하나, C2는 최고 위험도 그룹 D에 더 높은 유사도를 보여서, C1 그룹이 낮은 위험도 환자를 대표하고, C2 그룹이 높은 위험도 환자를 대표한다는 것을 나타냈다.
마지막으로, 생물학적 타당성(biological relevance)을 더 조명하기 위해, 본 발명자들은 위험도 그룹 D (PC의 임상적으로 유의한 또는 진행된 단계의 매우 높은 위험도) (도 2A) 대비 위험도 그룹 A (매우 낮은 위험도)를 구별하는 악성 시그니처 (33개의 바이오마커)의 중첩(overlap)을 전술된 시그니처의 상응하는 마커들의 발현 수준과 비교하였다 (도 4E). 데이터는 악성 바이오마커 시그니처의 상당한 부분이 또한 C2 대비 C1 (33개의 바이오마커 중 27개) 및 D 대비 C1 (33개의 바이오마커 중 29개)에서 차등적으로 발현되나, C2 대비 A 및 C2 대비 B를 구별하는 시그니처와 중첩이 훨씬 더 작다는 것을 보여주었다. 따라서, 데이터는 또한 PC를 정확하게 찾아내는 악성 바이오마커 시그니처의 생물학적 타당성을 나타냈다.
검토
혈액 혈장은 PC의 조기 검출 및 위험도 분류를 위한 바이오마커의 이상적 공급원(source)일 수 있는 최소로 침습적이고 임상적으로 잘 규명된 시료 포맷이다. 결과적으로, 혈장은 다수의 대규모 프로테옴 연구에서 이 목적을 위해 평가되었다 [19, 20]. 그러나, 단백질의 수 및 동적 범위(dynamic range)에 대한 혈장 시료의 고유한 복잡성 때문에, 미-분획 시료의 고전적 프로테옴 분석은 PC의 분류에 유용하지 않을 것으로 주장되었다 [21]. 사전-분획화(pre-fractionation)가 시료 복잡성을 감소시키나, 이는 왜곡된 단백질 수율/회수 및 재현성과 민감도에 대한 심각한 이슈와 연관되었다 [22, 23]. 이러한 맥락에서, 본 발명자들은 최근에 재조합 항체 마이크로어레이에 의해 대표되는, 친화도 프로테오믹스가 가공되지 않은 프로테옴(crude protemes)에서 고-존재(high-abundant) 및 저-존재(low-abundant) 분석물을 프로파일링하기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여주었다 [26, 27]. 이전에, 단일 혈청 마커, 트롬보스폰딘-1(TSP-1)이 항체 마이크로어레이를 이용하여 양성 전립선 질환과 악성 전립선 질환을 구별할 수 있다는 것이 확인되었다 [45]. 이 개념-입증 연구에서, 본 발명자들은 PC의 위험도 그룹과 연관된 최초의 다중(multiplexed) 후보 혈장 단백질 바이오마커 시그니처를 판독하기 위해 친화도 프로테오믹스를 이용했다. 따라서, PC의 재조합 항체 마이크로어레이-기반 분석은 PC-관련 바이오마커(PC-associated biomarker)의 차세대를 정의하기 위한 잠재적인 경로를 보여주었다.
혈액 혈장 프로테옴은 고전적 혈장 단백질, 및 조직 유출 단백질(tissue leakage protein)로 구성된다. 인간 면역계가 세균 감염에서 증식하는 종양에 이르기까지, 신체의 항상성의 미묘한 변화까지 감지하는 고유한 능력이 면역계를 질환의 원격 및 조기 센서로 이용할 독특한 기회를 제공한다 [46]. 실제로, 면역서명(immunosignaturing)은 상당한 관심을 끌었고 [47], 특히, 면역감시(immunosurveillance)가 종양 발달에서 중요한 인자라는 것을 보여주는 최근의 연구 때문이다 [48]. 이에 대해, 본 발명자들은 주로 면역조절성 분석물을 표적화하는 재조합 항체 마이크로어레이를 설계하고 적용했다 [26, 27]. 이전에, 본 발명자들은 암 진단 [32, 33], 증거-기반 치료법 선택(evidence-based therapy selection) [35], 및 유방암 재발의 위험도 예측[37]을 위한 어레이 설계의 가능성을 보여주었다. 이 발견(discovery) 연구에서, 본 발명자들은 적용 범위를 확장시켰고, 두 개의 최저 위험도 그룹과 최고 위험도 그룹을 명확하게 구별하는, PC의 위험도 그룹 계층화를 위한 그의 잠재적 용도를 시사했다.
잠재적 PC 환자의 위험도 분류는 현재, 위험도 분류의 여러 모델 [3, 50, 51] 중 하나인 혈청 PSA 분석(tPSA 및 %free PSA) [49]을 이용하여 의료기관에서 수행될 수 있다. 이 방식이 다수의 종양의 검출을 가능하게 하나, 악성 질환에 대한 낮은 특이성으로 인해 여러 환자가 불필요한 생검 테스트를 받게 하고 있다 [3]. 임상의가 위험도 분류를 위한 보다 적합한 도구에 대해 접근할 수 있다면, 이 수는 상당히 감소될 수 있다. 특히, 중간-범위 tPSA (4-10ng/ml) 및 낮은 %fPSA를 갖는 환자 그룹은 이질적이어서, PC와 전립선 비대증의 혼합을 포함하는 것으로 알려져 있다 [7, 49]. 4개의 미리-정해진 위험도 그룹을 분류하기 위한 본 발명자들의 시도에서, 결과는 실제로, 중간-범위 tPSA (4-10ng/ml) 및 낮은 %fPSA를 갖는 환자군(그룹 C)은 나머지 3개의 위험도 그룹과 구별될 수 없다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명자들의 데이터는 그룹 C가 매우 이질적인 환자 그룹이라는 현재의 관념을 더 뒷받침했다.
그러나, 본 발명자들의 데이터는 오히려 그룹 C가 현재의 문헌들 [2, 3, 5, 49]로부터 예측되는 바와 같이, 각각 원래의 최저 및 최고 위험도 그룹을 더 닮은, 두 개의 별개의 서브그룹, C1 및 C2로 구별될 수 있다는 것을 시사했다. 암 환자의 맞춤화된 치료를 목표로 하는 경우, 이절적 환자군을 특정한 암을 가질(발병할) 더 높은 위험도 및 더 낮은 위험도의 보다 정확한 서브그룹으로 계층화하는 능력이 중요할 것이다. 궁극적으로, 이는 PC 환자를 관리할 수 있는 새로운 가능성을 제공할 수 있다. 그러나, 이 발견 연구는 포함된 환자의 완전한 임상적 기록이 입수가능하지 않다는 사실에 의해 부분적으로 제한되고, 관찰된 후보 바이오마커 시그니처가 잘 규명된 환자의 더 크고, 독립적인 코호트를 대상으로 하는, 후속 연구에서 적절하게 검증될 것이다. 특히, 초기 검증을 위해 이용된 직교 방법 (MSD)으로 검출될 수 있었던 두 개의 사이토카인, IL-6 및 TNF-α가 본 발명자들에 의한 C1과 C2의 구별을 뒷받침했다.
후보 바이오마커 시그니처를 보다 상세하게 조사했을 때, PC의 높은 위험도 및 낮은 위험도를 반영하는 것으로 이미 알려진 생물학적으로 타당한, 신규한 다수의 분석물을 관찰했다. 요약하면, TGF-α1은 PC와 관련된 것으로 입증되었고, 예를 들면, PC 모델에서 세포 진행, 보다 높은 종양 등급, 및 전이를 촉진하는 것으로 확인되었고, 뒤이어 잠정적인 바이오마커로 제안되었다 [3, 4, 52]. 따라서, 본 발명자들은 최고 위험도 그룹 D 대비, 두 개의 최저 위험도 그룹 A 및 B에서 TGF-α1이 하향 조절된다는 것을 발견하였다. 또한, TGF-α1은 C2 (높은 위험도) 대비 A와 B, D 대비 C1 (낮은 위험도), 및 C2 대비 C1에서 하향 조절되었다. IL-6의 경우, 이 사이토카인은 또한 PC의 잠재적 바이오마커로 제안되었다 [3, 4]. 본 발명자들의 데이터는 높은 위험도 그룹 (D 또는 C2) 대비 낮은 위험도 그룹 (A, B, 또는 C1)의 다양한 비교에서 각각 하향 조절되었다는 것을 보여주었다. 또한, 낮은 위험도 그룹에서 하향 조절되는 것으로 알려진 다른 사이토카인, 예를 들면, IL-1ra 및 MCP-1 [53, 54]도 높은 위험도 그룹 (D 또는 C2) 대비 낮은 위험도 그룹 (A, B 또는 C1)의 여러 비교들에서 하향 조절되는 것으로 확인되어, 본 발명자들의 보고된 관찰을 더 뒷받침하였다. 또한, 루이스 X가 낮은 위험도 그룹에서 하향 조절되었다는 관찰은 이전의 결과와 일치하여, 루이스 X가 전립선암에서 예후 파라미터(prognostic parameter)라는 것을 나타냈다 [55]. 이러한 관찰은 또한 PC를 정확히 찾아내는 것으로 관찰된 후보 악성 바이오마커 시그니처를 지지했다는 것에 유이해야 한다. 현재까지, 보체 단백질은 PC와 관련하여 중요하게 보고된 바 없었다. 본 발명자들의 데이터는 여러 보체 단백질, 예를 들면, C1q, C3, C4, 프로페르딘, 및/또는 C1-INH의 상이한 조합이 각각 높은 위험도 그룹 대비 다양한 낮은 위험도 그룹에서 상향 조절되었다는 것을 보여주었다. 임상 연구에서 이전에 보고된 바 없으나, C1q는 전립선암 세포주에서 보호적 역할을 보이는 것으로 확인되었다 [56].
종합하면, 본 발명자들은 친화도 프로테오믹스를 이용하여 PC 및 PC 위험도 그룹과 연관된 후보 혈장 바이오마커 시그니처를 상술했다. 독립적인 환자 코호트를 표적으로 하여, 결과들은 임상적 파라미터에 근거하여 선험적으로 정의된, 통상적인 위험도 그룹이 계층화될 수 있고, 심지어 더 하부-계층화되어(sub-stratified), 잠재적으로 신규하고, 개선된(refined) PC 위험도 그룹을 기술할 수 있다는 것을 나타냈다.
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Claims (112)

  1. 개체에서 전립선암-관련 질환 상태(prostate cancer-associated disease state)를 결정하는 방법으로서:
    a) 상기 개체로부터의 테스트 시료를 제공하는 단계;
    b) 상기 테스트 시료에서 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 의해 상기 테스트 시료의 바이오마커 시그니처(biomarker signature)를 결정하는 단계;를 포함하거나 또는 그로 구성되고,
    상기 테스트 시료에서 표 1에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현은 상기 개체에서 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태를 나타내는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    c) 전립선암에 걸리지 않은 개체로부터의 하나 이상의 대조군 시료를 제공하는 단계;
    d) 상기 대조군 시료에서 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 의해 상기 대조군 시료의 바이오마커 시그니처를 결정하는 단계;를 더 포함하거나 또는 그로 구성되며,
    상기 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 테스트 시료에서의 발현이 상기 단계 (d)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 대조군 시료에서의 발현과 상이한 경우, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태가 확인되는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    e) 전립선암에 걸린 개체로부터의 대조군 시료를 제공하는 단계;
    f) 상기 대조군 시료에서 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것에 의해 상기 대조군 시료의 바이오마커 시그니처를 결정하는 단계;를 더 포함하거나 또는 그로 구성되고,
    상기 단계 (b)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 테스트 시료에서의 발현이 상기 단계 (f)에서 측정된 상기 하나 이상의 바이오마커의 상기 대조군 시료에서의 발현과 일치하는 경우, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태가 확인되는 것인 방법.
  4. 청구항 1, 2, 또는 3에 있어서, 단계 (b)는 표 1(A)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(A)에 열거된 바이오마커 중 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(A)에 열거된 바이오마커 각각의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  6. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(B)에 열거된 바이오마커 중 하나 이상, 예를 들면, 표 1(B)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 또는 6개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(B)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  8. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(C)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(C)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  9. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(C)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  10. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(D)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(D)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  11. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(D)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  12. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(E)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(E)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  13. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(E)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  14. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(F)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(F)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  15. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(F)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  16. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(G)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(G)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  17. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(G)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  18. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(H)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(H)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  19. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(H)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  20. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(I)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 1(I)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  21. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1(I)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  22. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(A)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(A)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 또는 38개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  23. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(A)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  24. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(B)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(B)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  25. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(B)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  26. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(C)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(C)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  27. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(C)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  28. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(D)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(D)에 열거된 바이오마커 중 2, 또는 3개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  29. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(D)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  30. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(E)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(E)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  31. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(E)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  32. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(F)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(F)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  33. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(F)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  34. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(G)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(G)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  35. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(G)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  36. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(H)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(H)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 또는 46개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  37. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(H)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  38. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(I)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(I)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  39. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(I)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  40. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(J)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(J)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  41. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(J)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  42. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(K)에 열거된 바이오마커로부터의 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, 표 2(K)에 열거된 바이오마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개 이상의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  43. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 2(K)에 열거된 바이오마커 모두의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  44. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태는 임상적으로 유의한 전립선암의 발생 가능성의 결정(즉, 전립선암의 예후)이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
  45. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 그룹 A(낮은 위험도), 위험도 그룹 B(중간(moderate) 위험도), 위험도 그룹 C(증가된 위험도), 위험도 서브그룹 C1(약간(moderately) 증가된 위험도), 위험도 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도), 및 위험도 그룹 D(높은 위험도)를 구별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  46. 청구항 22, 23, 또는 44에 있어서, 상기 방법은 위험도 그룹 A(낮은 위험도)와 위험도 그룹 D(높은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  47. 청구항 24, 25, 44, 또는 46에 있어서, 상기 방법은 위험도 그룹 B(중간 위험도)와 위험도 그룹 D(높은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  48. 청구항 26, 27 또는 44 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 그룹 C(증가된 위험도)와 위험도 그룹 D(높은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  49. 청구항 28, 29 또는 44 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 그룹 A(낮은 위험도)와 위험도 그룹 B(중간 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  50. 청구항 30, 31 또는 44 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  51. 청구항 32, 33 또는 44 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 그룹 A(낮은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  52. 청구항 34, 35 또는 44 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 그룹 B(중간 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  53. 청구항 36, 37 또는 44 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C1(약간 증가된 위험도)과 위험도 그룹 D(높은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  54. 청구항 38, 39 또는 44 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)와 위험도 그룹 A(낮은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  55. 청구항 40, 41 또는 44 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)와 위험도 그룹 B(중간 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  56. 청구항 42, 43 또는 44 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위험도 서브그룹 C2(중요하게 증가된 위험도)와 위험도 그룹 D(높은 위험도)를 구별하기 위한 것인 방법.
  57. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태는 전립선암의 존재 또는 부재의 결정(즉, 전립선암의 진단)이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
  58. 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 하나 이상의 전립선암-관련 질환 상태는 전립선암의 존재 또는 부재의 결정(즉, 전립선암의 진단)이거나 또는 그를 포함하는 것인 방법.
  59. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 표 1 및/또는 표 2에 정의된 바이오마커 모두의 상기 테스트 시료에서의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  60. 청구항 2에 있어서, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 어떠한 전립선-관련 질환에도 걸리지 않은 것인 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 어떠한 질환이나 질병에 걸리지 않은 것인 방법.
  62. 청구항 2, 60, 또는 61에 있어서, 상기 전립선암에 걸리지 않은 개체는 건강한 개체인 것인 방법.
  63. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 단계 (f)는 상기 하나 이상의 바이오마커에 결합할 수 있는 제1 결합제를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 제1 결합제는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 재조합 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 것인 방법.
  66. 청구항 63 또는 64에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인(binding domain)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 청구항 63 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합제는 표면에 고정화되는 것인 방법.
  68. 청구항 1 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 테스트 시료 중 상기 하나 이상의 바이오마커는 검출가능한 모이어티(detectable moiety)로 표지되는 것인 방법.
  69. 청구항 2 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군 시료 중 상기 하나 이상의 바이오마커는 검출가능한 모이어티로 표지되는 것인 방법.
  70. 청구항 68 또는 69에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 효소적(enzymatic moiety) 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  71. 청구항 68, 69, 또는 70에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 비오틴인 것인 방법.
  72. 청구항 63 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 단계 (f)는 상기 하나 이상의 바이오마커에 결합할 수 있는 제2 결합제를 포함하는 분석(assay)을 이용하여 수행되고, 상기 제2 결합제는 검출가능한 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 제2 결합제는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 재조합 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 것인 방법.
  75. 청구항 72 또는 73에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  76. 청구항 72 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 결합제는 검출가능한 모이어티를 표지되는 것인 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 효소적 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티(예를 들면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료, 예를 들면, Alexa647)인 것인 방법.
  79. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  80. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 단계 (f)는 어레이를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  81. 청구항 80에 있어서, 상기 어레이는 비드-기반 어레이(bead-based array)인 것인 방법.
  82. 청구항 80에 있어서, 상기 어레이는 표면-기반 어레이(surface-based array)인 것인 방법.
  83. 청구항 80 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이는 마크로어레이(macroarray); 마이크로어레이(microarray); 나노어레이(nanoarray)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  84. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
    (i) 시료에 존재하는 바이오마커를 비오틴으로 표지하는 단계;
    (ii) 비오틴-표지된 단백질을 표면에 있는 별개의 위치에 고정화된 복수 개의 scFv를 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계로서, 상기 scFv는 표 1의 단백질 중 하나 이상에 대해 특이성을 갖는 것인 단계;
    (iii) 상기 고정화된 scFv를 형광 염료를 포함하는 스트렙타비딘 접합체와 접촉시키는 단계; 및
    (iv) 어레이 표면에 있는 별개의 위치에서 염료의 존재를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 어레이 표면에서 염료의 발현은 상기 시료에서 표 1로부터의 바이오마커의 발현을 나타내는 것인 방법.
  85. 청구항 1 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)는 상기 하나 이상의 바이오마커를 코딩하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  86. 청구항 85에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자인 것인 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA 분자인 것인 방법.
  88. 청구항 85, 86, 또는 87에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 방사선 사진 촬영(autoradiography) 및 인 시투 혼성화(in situ hybridisation)로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  89. 청구항 85 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것은 DNA 마이크로어레이를 이용하여 결정되는 것인 방법.
  90. 청구항 85 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것은 하나 이상의 결합 모이어티를 이용하여 수행되고, 상기 결합 모이어티 각각은 개별적으로, 표 1에 표시된 바이오마커 중 하나를 코딩하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 것인 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 핵산 분자를 포함하거나 또는 핵산 분자로 구성된 것인 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  93. 청구항 91 또는 92에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA를 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  94. 청구항 91 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이인 것인 방법.
  95. 청구항 91 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 15 내지 35개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이인 것인 방법.
  96. 청구항 91 내지 95 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  97. 청구항 96에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티(예를 들면, 방사성 원소); 또는 효소적 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  98. 청구항 97에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 방사성 원소를 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 방법.
  99. 청구항 98에 있어서, 상기 방사성 원소는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중 수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 청구항 97에 있어서, 상기 결합 모이어티의 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티인 것인 방법.
  101. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 제공되는 시료는 미분획(unfractionated) 혈액, 혈장, 혈청, 조직액(tissue fluid), 전립선 조직, 전립선 액(prostate juice), 담즙 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  102. 청구항 101에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 제공되는 시료는 미분획 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  103. 청구항 101 또는 102에 있어서, 단계 (b), (d) 및/또는 (f)에서 제공되는 시료는 혈장인 것인 방법.
  104. 청구항 63 내지 78, 또는 91 내지 100 중 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 결합제를 포함하는, 개체에서 전립선암의 존재를 결정하기 위한 어레이.
  105. 청구항 104에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제는 표 1에 정의된 단백질 모두에 결합할 수 있는 것인 어레이.
  106. 청구항 1 내지 103 중 어느 한 항에 정의된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 청구항 1 내지 103 중 어느 한 항에 정의된 예후 및/또는 진단 마커로서의 용도.
  107. 청구항 106에 있어서, 표 1에 정의된 바이오마커 모두는 예후 및/또는 진단 마커로 이용되는 것인 용도.
  108. 청구항 1 내지 103 중 어느 한 항에 정의된 예후 및/또는 진단 마커로 사용하기 위한, 청구항 63 내지 78 또는 청구항 91 내지 100 중 어느 하나에 정의된 단리된 결합제.
  109. A) 청구항 63 내지 78 중 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 제1 결합제 또는 청구항 80 내지 83, 또는 청구항 104 또는 105에 따른 어레이;
    B) 청구항 1 내지 103 중 어느 한 항에 정의된 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 전립선암의 존재를 결정하기 위한 키트.
  110. 청구항 109에 있어서, 청구항 91 내지 100 중 어느 한 항에 정의된 제2 결합제를 더 포함하는 것인 키트.
  111. 실질적으로 본 명세서에 기재된, 개체에서 전립선암의 존재를 결정하기 위한 방법 또는 용도.
  112. 실질적으로 본 명세서에 기재된, 개체에서 전립선암의 존재를 결정하기 위한 어레이 또는 키트.
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