CN105283763A - 用于前列腺癌的生物标志物检测中的方法和阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于确定个体中前列腺癌相关的疾病状态的方法，其包含以下步骤，或由以下步骤组成：a)从所述个体提供待测试样品；b)通过测量所述测试样品中一种或多种选自表1确定的组的生物标志物的表达，确定所述测试样品的生物标志物签名；其中所述测试样品中一种或多种选自表1确定的组的生物标志物的表达对于所述个体中一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是指示性的。本发明还提供用于该方法的阵列和试剂盒。

Description

用于前列腺癌的生物标志物检测中的方法和阵列
发明领域
本发明提供用于确定前列腺癌相关疾病状态的方法，以及用于这些方法的阵列和试剂盒。
发明背景
使用血液中的前列腺特异性抗原(PSA)对前列腺癌(PC)的早期检测减少了未筛过的人中的PC死亡。然而，由于通常使用的临界值PSA的中度特异性，对有助于在具有中度升高的PSA的人中增强风险分类的另外的生物标志物有迫切的需求。
前列腺癌(PC)在西方国家是与癌症相关的死亡的第二大原因[1]，而为了改进PC患者的预后，早期且特异性的诊断至关重要。八十年代晚期，在临床中引入了基于血液的生物标志物前列腺特异性抗原(PSA)，而在今天用作PC风险的指示物以及作为患者活组织检查进一步检测的一个参数[2,3]。PSA的引入导致了早期诊断的PC病例的数量增加，但是PSA对于恶性疾病的中度特异性已经引起了对于不必要的活组织检查的成本和潜在副作用以及过度诊断和过度治疗的风险的主要关注[2-4]。实际上，基于总血清PSA水平(tPSA)(≥4ng/ml)选择进行活组织检查的65％-75％的人不患有PC(www.cancer.org)。因此，为了改进风险分类，使得临床医生能够选择适当的患者进行活组织检查测试，需要确定另外的和/或更特异性的生物标志物。
为了改进测试PC时的特异性，已经进行了几种尝试以联合tPSA值与其它参数，例如PSA随着时间的变化(PSA速率)，与前列腺体积相关的PSA(PSA密度)，或PSA的年龄特异性范围[2,3]。然而，目前仅观察到了对tPSA试验诊断能力的无改进或仅中度改进[2]。相反，已经证实了区分tPSA和游离(未结合的)PSA提高所述试验的表现，特别是对于具有中间范围(4-10ng/ml)水平的tPSA的人。实际上，已经表明具有游离PSA对tPSA比率(％fPSA)在18-25％以下的人与显著较高的风险患有PC相关[5-7]。尽管如此，这一特定患者群体中的25-50％不患有PC，但他们仍然被选择进行活组织检查测试[7，8]。最近，已经表明一组四种激肽释放酶标志物作为活组织检查结果的潜在预示物[9,10]，而tPSA，游离PSA与称为2proPSA的游离PSA子部分的组合也可以改进诊断准确性[11]。
然而，对于能够用于检测前列腺癌和/或根据风险对前列腺癌分层(特别是在活组织检查和/或治疗之前)的另外的、更特异性的，生物标记物仍然存在显著的未满足的临床需要。
发明公开
也已经开展主要的工作以确定与PC相关的另外的，新的血清生物标志物，最初使用各种经典的生物化学技术。迄今，人激肽释放酶2[12,13]，尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活剂[14]，[11]转化生长因子β1(TGF-β1)[3,15,16]，以及白细胞介素-6(IL-6)[16-18]已特别被表明作为潜在的血清标志物。尽管前景看好，将需要进一步的验证研究来探索和确认这些标志物的预后能力[2-4]、此外，使用传统的蛋白质组学技术也已经表明了另外的潜在PC标志物[19,20]，但是这些观察仍待使用独立的患者群进行验证[21]。另外，对于试验的灵敏度，动态范围，和/或处理量也提出了严重的技术问题[22,23]。为此，已经建立了亲和蛋白质组学作为一种高通量替代，其能够以多重、灵敏且快速的方式靶向未分级的蛋白质组，例如血清和血浆[24-27]。
在这种情况下，本发明人之前已经设计了重组单链片段可变(scFv)抗体微阵列平台用于复杂蛋白质组的蛋白表达概况分析(profiling)[26,28,29]。使用这一亲和蛋白质组学技术平台，本发明人已经能够以一种快速，灵敏以及可重现的方式，概况分析范围广泛的天然的，直接标记的蛋白质组，包括血清，血浆，尿液，完整细胞，细胞裂解物，以及组织提取物[28,30,31]。我们已经揭示所述平台可以用于鉴定候选生物标记物签名(signature)，用于例如诊断，预后，分类，以及用于基于证据的治疗选择[32-37]。
本发明人研究了亲和蛋白组是否可以用于验证和甚至进一步改善以血浆样品为目标来自常规PSA测量的风险组分类，其中患者样品根据目前建立的临床实践被分为四种生化定义的风险群体[38-41]。该数据表明可以鉴定血浆蛋白签名，其能够准确确定PC(“恶性生物标志物签名”)并用于将患者分为当前以及新的与PC风险相关的亚组，其从长远来看具有有助于更多的PC个体化治疗的潜力。
因此，本发明的第一个方面提供用于确定个体中前列腺癌相关的疾病状态的方法，其包含以下步骤，或由以下步骤组成：
a)提供来自所述个体的待测试样品；
b)通过测量所述测试样品中一种或多种选自表1中定义的组的生物标志物的表达，确定所述测试样品的生物标志物签名；
其中，所述测试样品中一种或多种选自表1中定义的组的生物标志物的表达对于所述个体中一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是指示性的。
通过“前列腺癌相关疾病状态”我们表示前列腺癌的存在或不存在，前列腺癌组或亚组(A,BC,C1,C2或D,下文定义)和/或在个体中前列腺癌发生的可能性(优选的，在给定的时间框内)。
通过“生物标志物”我们表示天然存在的生物分子，或其组分或片段，其测量能够提供在确定前列腺癌相关疾病状态中有用的信息，例如，前列腺癌的预后。例如，所述生物标志物可以是天然存在的蛋白或碳水化合物部分，或抗原组分或其片段。
优选的待测试样品提供自哺乳动物。所述哺乳动物可以是任意的驯养动物或农场动物。优选的，所述哺乳动物是大鼠，小鼠，或豚鼠，猫，狗，马或灵长类。最优选的，所述哺乳动物是人。优选的样品是细胞或组织样品(或其衍生物)，其包含以下物质，或由以下物质组成：粗制血，预分级的血，血浆，血浆细胞，前列腺细胞或同样优选的，衍生于细胞或组织样品的蛋白或核酸，所述细胞或组织包含以下物质，或由以下物质组成：血浆，血浆细胞或前列腺细胞。优选的测试和对照样品来自同一种类。
在一个实施方案中，根据本发明的第一个方面的方法进一步包含以下步骤，或由以下步骤组成：
c)提供来自未患前列腺癌的个体的一种或多种对照样品；
d)通过在步骤(b)中测量所述对照样品中一种或多种生物标志物的表达，确定所述对照样品的生物标志物签名；
其中一种或多种前列腺癌相关疾病状态在以下事件中定义：在步骤(b)中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的表达与步骤(d)中测量的对照样品中一种或多种生物标志物的表达不同。
在进一步的或另外的实施方案中，所述方法包含以下步骤，或由以下步骤组成：
e)提供来自患有前列腺癌的个体的对照样品；
f)通过在步骤(b)中测量所述对照样品中一种或多种生物标志物的表达，确定所述对照样品的生物标志物签名；
其中一种或多种前列腺癌相关疾病状态在以下事件中定义：在步骤(b)中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的表达对应步骤(f)中测量的对照样品中一种或多种生物标志物的表达。
通过“对应对照样品中的存在和/或量”我们表示所述存在和/或量与步骤(e)中提供的对照样品的相同；或与步骤(e)中提供的对照样品(例如，阳性对照样品)比步骤(c)中提供的对照样品(例如，阴性对照样品)(或与代表相同样品的预定义参考值)更接近。优选的存在和/或量为步骤(e)中提供的对照样品的至少60％，例如至少65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。
通过“与对照样品中的存在和/或量不同”我们表示所述存在和或量与步骤(c)中提供的对照样品(或与代表相同样品的预定义参考值)不同。优选的所述存在和/或值不多于包含前列腺癌细胞或由前列腺癌细胞组成的对照样品的40％，例如，不多于39％,38％,37％,36％,35％,34％,33％,32％,31％,30％,29％,28％,27％,26％,25％,24％,23％,22％,21％,20％,19％,18％,17％,16％,15％,14％,13％,12％,11％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％或0％。
优选的，所述一种或多种对照样品对于待测试个体是年龄和/或性别匹配的。也就是说，健康个体与待测的年龄大致相同(例如，5岁之内)且性别相同。
优选的，在步骤(b)中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的存在和/或量与预定义参考值相比。
因此，优选的是在步骤(b)中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的存在和/或量与步骤(d)中测量的一种或多种生物标志物的存在和/或量或与预定义的参考值显著差异(例如，统计学差异)。因此，优选的是在步骤(b)中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的存在和/或量与步骤(f)中测量的一种或多种生物标志物的存在和/或量或与预定义的参考值显著对应(即统计学相似)。例如，如在随附的实施例中讨论的，在测试样品和对照样品中特定生物标志物的存在和/或量之间的显著差异可以归类为那些其中p<0.05(例如，其中p<0.04,p<0.03,p<0.02或其中p<0.01)。
优选的，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量测试样品中一种或多种选自表1中定义的组的生物标志物的存在和/或量，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,或67种选自表1中定义的组的生物标志物。
步骤(b)可以包含测量IL-4的表达，或由测量IL-4的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-12的表达，或由测量IL-12的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-9的表达，或由测量IL-9的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-1a的表达，或由测量IL-1a的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量HLA-DR的表达，或由测量HLA-DR的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-3的表达，或由测量IL-3的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量ICAM的表达，或由测量ICAM的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量CD40的表达，或由测量CD40的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-18的表达，或由测量IL-18的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-1b的表达，或由测量IL-1b的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量GLP-1的表达，或由测量GLP-1的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-11的表达，或由测量IL-11的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量VEGF的表达，或由测量VEGF的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量胱抑素C(CystatinC)的表达，或由测量胱抑素C的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量C1-INH的表达，或由测量C1-INH的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量MCP-3的表达，或由测量MCP-3的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-13的表达，或由测量IL-13的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TNF-β的表达，或由测量TNF-β的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量C1s的表达，或由测量C1s的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量整联蛋白α-10的表达，或由测量整联蛋白α-10的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量C3的表达，或由测量C3的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量GLP-1R的表达，或由测量GLP-1R的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IgM的表达，或由测量IgM的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-16的表达，或由测量IL-16的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TM肽的表达，或由测量TM肽的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量Mucine-1的表达，或由测量Mucine-1的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-2的表达，或由测量IL-2的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IFN-γ的表达，或由测量IFN-γ的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量CD40配体的表达，或由测量CD40配体的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-10的表达，或由测量IL-10的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量GM-CSF的表达，或由测量GM-CSF的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量因子B的表达，或由测量因子B的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量C4的表达，或由测量C4的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量整联蛋白α-11的表达，或由测量整联蛋白α-11的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-8的表达，或由测量IL-8的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量MCP-4的表达，或由测量MCP-4的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量LDL(1)的表达，或由测量LDL(1)的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TNF-β(1)的表达，或由测量TNF-β(1)的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-7的表达，或由测量IL-7的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量Eotaxin的表达，或由测量Eotaxin的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量Rantes的表达，或由测量Rantes的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量β–半乳糖苷酶的表达，或由测量β–半乳糖苷酶的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量瘦素的表达，或由测量瘦素的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量粘蛋白1的表达，或由测量粘蛋白1的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量LDL(2)的表达，或由测量LDL(2)的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量JAK3的表达，或由测量JAK3的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-1β的表达，或由测量IL-1β的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量备解素(properdin)的表达，或由测量备解素的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-5的表达，或由测量IL-5的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量Apo-A1的表达，或由测量Apo-A1的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量LDL的表达，或由测量LDL的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TNF-α的表达，或由测量TNF-α的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量BTK的表达，或由测量BTK的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TNF-β(2)的表达，或由测量TNF-β(2)的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量MCP-4(1)的表达，或由测量MCP-4(1)的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量MCP-4(2)的表达，或由测量MCP-4(2)的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量GLP的表达，或由测量GLP的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量血管动蛋白(angiomotin)的表达，或由测量血管动蛋白的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量MCP-1的表达，或由测量MCP-1的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-6的表达，或由测量IL-6的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量LewisX的表达，或由测量LewisX的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量C1q的表达，或由测量C1q的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量唾液酸化LewisX的表达，或由测量唾液酸化LewisX的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TGF-β的表达，或由测量TGF-β的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量IL-1ra的表达，或由测量IL-1ra的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量TGF-β1的表达，或由测量TGF-β1的表达组成。可替换的或者另外，步骤(b)可以包含测量PSA的表达，或由测量PSA的表达组成。
因此，步骤(b)可以不包含测量IL-4的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-12的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-9的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-1a的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量HLA-DR的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-3的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量ICAM的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量CD40的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-18的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-1b的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量GLP-1的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-11的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量VEGF的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量胱抑素C的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量C1-INH的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量MCP-3的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-13的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TNF-β的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量C1s的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量整联蛋白α-10的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量C3的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量GLP-1R的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IgM的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-16的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TM肽的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量Mucine-1的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-2的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IFN-γ的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量CD40配体的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-10的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量GM-CSF的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量因子B的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量C4的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量整联蛋白α-11的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-8的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量MCP-4的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量LDL(1)的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TNF-β(1)的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-7的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量Eotaxin的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量Rantes的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量β-半乳糖苷酶的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量瘦素的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量粘蛋白1的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量LDL(2)的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量JAK3的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-1β的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量备解素的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-5的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量Apo-A1的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量LDL的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TNF-α的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量BTK的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TNF-β(2)的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量MCP-4(1)的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量MCP-4(2)的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量GLP的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量血管动蛋白的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量MCP-1的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-6的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量LewisX的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量C1q的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量唾液酸化的LewisX的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TGF-β的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量IL-1ra的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量TGF-β1的表达。可替换的或者另外，步骤(b)可以不包含测量PSA的表达。
通过“表达”我们表示基因产物例如mRNA或蛋白的水平或量。
通过“TM肽”我们表示衍生于10TM蛋白的肽，以下的scFv抗体构建物SEQIDNO:1对其具有特异性(其中CDR序列以下划线表示)：
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGFHWVRQAPGKGLEWVSLISWDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSWVFGGGTKLTVLG
[SEQIDNO:1]
因此，可以使用这一scFv或与这一scFv竞争结合10TM蛋白的任意抗体，或其抗原结合片段。例如，所述抗体，或其抗原结合片段，可以包含如SEQIDNO:1中所示的相同的CDRs。
本领域的技术人员应当理解这种抗体可以带有亲和标签产生(例如，在C端)用于纯化的目的。例如，可以利用以下SEQIDNO:2的亲和标签：
DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAAHHHHHH
[SEQIDNO:2]
检测和/或测量蛋白和/或核酸的浓度的方法对于本领域的技术人员是已知的，见例如，Sambrook和Russell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。
用于检测和/或测量蛋白的优选方法包括Western印迹，North-Western印迹，免疫吸附试验(ELISA)，抗体微阵列，组织微阵列(TMA)，免疫沉淀，原位杂交以及其它免疫组织化学技术，放射免疫试验(RIA)，免疫放射测定试验(IRMA)和免疫酶试验(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心试验。示例性的夹心试验由David等描述于美国专利号4,376,110和4,486,530中，特此通过提述并入本文。细胞在载玻片上的抗体染色可以用于细胞学实验室诊断测试中公知的方法中，如本领域技术人员所公知的。
典型的，ELISA涉及酶的使用，其产生有色反应产物，通常在固相试验中。酶例如辣根过氧化物酶和磷酸酶已经被广泛使用。放大磷酸酶反应的一种方法是使用NADP作为底物以产生NAD，其现在作为第二酶系统的辅酶作用。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供了一种良好的缀合物，因为这种酶不存在于组织中，稳定并产生良好的反应颜色。也可以使用基于酶如萤光素酶的化学发光系统。
经常使用与维生素生物素缀合因为这可以通过其与酶联亲合素或链霉亲合素的反应容易的检测，所述维生素生物素以很强的特异性和亲和力结合酶联亲合素或链霉亲合素。
因此，在一个实施方案中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种表1(A)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3或4种表1(A)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(A)中所列的各个生物标志物的表达。
在一个实施方案中，步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种表1(B)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5或6种表1(B)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(B)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(C)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5，6，7或8种表1(C)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(C)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(D)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或11种表1(D)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(D)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(E)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5，6，7或8种表1(E)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(E)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(F)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5，6，7或8种表1(F)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(F)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(G)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5，6，7或8种表1(G)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(G)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(H)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4或5种表1(H)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(H)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，所述方法包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种表1(I)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3，4，5，6，7，8或9种表1(I)中所列的生物标志物。所述方法可以包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(I)中所列的各个生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(A)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37或38种表2(A)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(A)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(B)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41或42种表2(B)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(B)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(C)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28或29种表2(C)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(C)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(D)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2或3种表2(D)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(D)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(E)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51或52种表2(E)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(E)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(F)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或16种表2(F)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(F)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(G)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13或14种表2(G)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(G)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(H)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45或46种表2(H)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(H)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(I)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23种表2(I)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(I)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(J)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28或29种表2(J)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(J)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换的或者另外的实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量一种或多种来自表2(K)中所列的生物标志物的生物标志物的表达，例如，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或13种表2(K)中所列的生物标志物。步骤(b)可以包含以下项，或由以下项组成：测量表2(K)中所列的所有生物标志物的表达。
在可替换或另外的实施方案中，一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是或包括确定发生临床上有意义的前列腺癌的可能性。优选的，确定在特定时间范围内发生临床上有意义的前列腺癌的可能性，例如，在1个月，2个月，3个月，5个月，6个月，1年，2年，3年，4年，5年，6年，7年，8年，9年，10年，15年，20年，25年，30年，35年，40年，55年，60年，75年，80年之内，或在被测试个体的自然寿命之内。
在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于区分风险组A(低风险)，风险组B(中等风险)，风险组C(增加的风险)，风险亚组C1(中度增加的风险)，风险亚组C2(大量增加的风险)以及风险组D(高风险)。
在一个实施方案中，通过“低风险”我们表示在特定时间范围内2％或更低的几率患有或者形成临床上有意义的前列腺癌，例如，≤1.5％,≤1.0％,≤0.5％,≤0.1％,≤0.05％,≤0.01％,≤0.005％或≤0.001％(或在任意两个这些点之间)。在一个实施方案中，通过“中度风险”我们表示在特定时间范围内>2％且≤10％的几率患有或者形成临床上有意义的前列腺癌，例如，≤9％,≤8％,≤7％,≤6％,≤5％,≤4％,≤3％或≤2.5％(或在任意两个这些点之间)。在一个实施方案中，通过“增加的风险”我们表示在特定时间范围内>10％且≤50％的几率患有或者形成临床上有意义的前列腺癌，例如，≤45％,≤40％,≤35％,≤30％,≤25％,≤20％,≤15％,≤12.5％,≤11.0％或≤10.5％(或在任意两个这些点之间)。在一个实施方案中，通过“大量增加的风险”我们表示在特定时间范围内>50％且≤85％的几率患有或者形成临床上有意义的前列腺癌，例如，≤80％,≤75％,≤70％,≤65％,≤60％,≤55％,≤52.5％,≤51.0％或≤50.5％(或在任意两个这些点之间)。在一个实施方案中，通过“高”我们表示在特定时间范围内>90％且≤100％的几率患有或者形成临床上有意义的前列腺癌，例如，100％,≤100％,≤99％,≤98％,≤97％,≤96％,≤95％,≤92.5％,≤90％,≤87.5％,≤86％,≤85.5％或≤85.1％(或在任意两个这些点之间)。优选的，所述“低”，“中度”，“增加的”，“大量增加的”和“高”风险组是连续的；因此，当对于一个风险组使用中间值时，相应地调整相邻的风险组。例如，如果使用低风险值为≤1.0％，中度风险组跨度将从>1.0％。优选的，特定时间范围为1个月，2个月，3个月，5个月，6个月，1年，2年，3年，4年，5年，6年，7年，8年，9年，10年，15年，20年，25年，30年，35年，40年，55年，60年，75年，80年之内，或在被测试个体的自然寿命之内。最优选的，5年。
这些组可以基于％游离的和总PSA的水平确定：组A具有tPSA≤0.70ng/ml；组B具有tPSA为2.1-8.0ng/ml，％fPSA≥27.9％；组C具有tPSA为5.0-10-3ng/ml，％fPSA≤12.6％和组D具有tPSA为24.6-724ng/ml。组A和B患者不需要治疗。组C为相异组，且可以分为亚组C1和C2。亚组C1与组A和B更相似，例如，对于前列腺癌具有低风险并因此对于活组织检查和治疗低需求/没有需求，而组C2与组D即癌症组更相似，且因此，指示对于活组织检查和治疗的需要。
在一个实施方案中，所述方法用于或包括区分风险组A(低风险)和风险组D(高风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险组B(中度风险)和风险组D(高风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险组C(增加的风险)和风险组D(高风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险组A(低风险)和风险组B(中度风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险亚组C2(大量增加的风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险组A(低风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险组B(中度风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险组D(高风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C2(大量增加的风险)和A(低风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C2(大量增加的风险)和风险组B(中度风险)。在可替换的或另外的实施方案中，所述方法用于或包括区分风险亚组C2(大量增加的风险)和风险组D(高风险)。
然而，在可替换的或者另外的实施方案中，所述一种或多种前列腺癌相关疾病状态是或者包括前列腺癌的存在或不存在(即前列腺癌的诊断)。优选的，前列腺癌的诊断包含以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量一种或多种列于表1(A)中所列的生物标志物的表达，例如，至少2，3或4种列于表1(A)中的生物标志物。所述方法可以包括以下项，或由以下项组成：在步骤(b)中测量表1(A)中所列的各种生物标志物的表达。在一个实施方案中，通过分类到风险亚组C2或D中指示前列腺癌的存在。在一个实施方案中，通过分类到风险亚组C2中指示前列腺癌的存在。在一个实施方案中，通过分类到风险亚组D中指示前列腺癌的存在。在一个实施方案中，其中指示前列腺癌的存在，所述方法包括患者根据目前的推荐对于前列腺癌的活组织检查和/或治疗(例如，手术移除癌细胞，放射疗法和/或化学疗法)。
在本发明的第一个方面的一个实施方案中，步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量测试样品中表1和/或表2中限定的所有生物标志物的表达。
在进一步的或者另外的实施方案中，不患有前列腺癌的个体(步骤(c))不患有任意其它的前列腺相关病症。优选的，所述不患有前列腺癌的个体不患有任意疾病或疾患。最优选的，所述不患有前列腺癌的个体是健康个体。
在进一步的或者另外的实施方案中，患有前列腺癌的个体(步骤(e))不患有任意其它的前列腺相关病症。优选的，所述患有前列腺癌的个体不患有任意其它的疾病或疾患。最优选的，所述患有前列腺癌的个体是其它方面健康的个体。在一个实施方案中，所述患有前列腺癌的个体患有组A，组B，组C，组C1，亚组C1，亚组C2或亚组D。优选的，步骤(e)包括提供来自每个这些组的一个或多个个体的对照样品，或其组合。
在进一步的或另外的实施方案中，步骤(b)，(d)和/或步骤(f)使用能够结合一种或多种生物标志物的第一结合试剂进行。
优选的所述第一结合试剂包含以下项，或由以下项组成：抗体或其抗原结合片段。
术语“抗体”包括任意的合成抗体，重组抗体或抗体杂合体，例如但不限于，通过噬菌体展示免疫球蛋白轻和/或重链可变区和/或恒定区产生的单链抗体分子，或本领域技术人员已知的其它能够在免疫试验形式中结合抗原的免疫相互作用分子。
我们也包括使用抗体样结合试剂，例如亲合体(affibodies)和适体(aptamers)。
在保留它们的特异性结合位点的抗体片段的合成中涉及的技术的一般性综述可以在Winter&Milstein(1991)Nature349,293-299中找到。
另外，或者可替换的，一种或多种第一结合分子可以是适体(见Collett等，2005,Methods37:4-15)。
分子文库，例如抗体文库(Clackson等，1991,Nature352,624-628；Marksetal,1991,JMolBiol222(3):581-97)，肽文库(Smith,1985,Science228(4705):1315-7)，表达的cDNA文库(Santi等，(2000)JMolBiol296(2):497-508)，除抗体框架外的其它支架例如亲和体的文库(Gunneriusson等，1999,ApplEnvironMicrobiol65(9):4134-40)或基于适体的文库(Kenan等，1999,MethodsMolBiol118,217-31)可以用作来源，从其选择对给定基序特异性的结合分子用于本发明的方法中。
所述分子文库可以体内表达于原核细胞(Clackson等，1991,op.cit.；Marksetal,1991,op.cit.)或真核细胞中(Kieke等，1999,ProcNatlAcadSciUSA,96(10):5651-6)或没有细胞的参与在体外表达(Hanes&Pluckthun,1997,ProcNatlAcadSciUSA94(10):4937-42；He&Taussig,1997,NucleicAcidsRes25(24):5132-4；Nemotoetal,1997,FEBSLett,414(2):405-8)。
当使用基于蛋白的文库的情况下，编码潜在结合分子的文库的基因通常包装在病毒中，且所述潜在结合分子展示在所述病毒的表面(Clackson等，1991，见上；Marks等，1991，见上；Smith，1985，见上)。
也许最常用的展示系统是丝状噬菌体，在它们的表面展示抗体片段，所述抗体片段作为融合到所述噬菌体的次要外壳蛋白表达(Clackson等，1991，见上；Marks等，1991，见上)。然而，其它的适合用于展示的系统包括使用其它病毒(EP39578)，细菌(Gunneriusson等，1999,见上；Daugherty等，1998,ProteinEng11(9):825-32；Daugherty等，1999,ProteinEng12(7):613-21)，以及酵母(Shusta等，1999,JMolBiol292(5):949-56)。
另外，利用多肽产物与其编码mRNA在称为核糖体展示系统中的连接(Hanes&Pluckthun,1997,见上；He&Taussig,1997,见上；Nemoto等，1997,见上)，或多肽产物与编码DNA的连接(见，美国专利号5,856,090和WO98/37186)发展了展示系统。
抗体的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)涉及抗原识别，这一事实通过早期的蛋白酶消化实验首次确认。通过对啮齿类抗体的“人类化”发现了进一步的确认。啮齿类来源的可变区可以融合到人源的恒定区，使得所得抗体保留了啮齿类亲本抗体的抗原特异性(Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6851-6855)。
从涉及均含有一个或多个可变域的抗体片段的细菌表达的实验知道了抗原特异性由可变域赋予而不依赖恒定域。这些分子包括Fab样分子(Better等，(1988)Science240,1041)；Fv分子(Skerra等，(1988)Science240,1038)；其中VH和VL伴侣域通过柔性寡肽连接的单链Fv(ScFv)分子(Bird等，(1988)Science242,423；Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,5879)以及包含分离的V结构域的单域抗体(dAbs)(Ward等，(1989)Nature341,544)。在保留它们的特异性结合位点的抗体片段的合成中涉及的技术的一般性综述可以在Winter&Milstein(1991)Nature349,293-299中找到。
所述抗体或抗原结合片段可以选自下组：完整的抗体，Fv片段(例如，单链Fv和二硫键连接的Fv)，Fab样片段(例如，Fab片段，Fab’片段和F(ab)2片段)，单可变结构域(例如，VH和VL结构域)和结构域抗体(dAbs，包括单和双形式[例如dAb-连接分子-dAb])。优选的，所述抗体或抗原结合片段是单链Fv(scFv)。
所述一种或多种结合部分可以可替换的包含以下项，或由以下项组成：抗体样结合试剂，例如亲合体或适体。
通过“scFv分子”我们表示其中VH和VL伴侣结构域通过柔性寡肽连接的分子。
使用抗体片段而不是完整抗体的优势是多方面的。所述片段较小的大小可能导致改善的药理学特性，例如对实体组织较好的穿透。移除了完整抗体的效应功能，例如补体结合。Fab，Fv，ScFv和dAb抗体都可以表达在大肠杆菌中并从其分泌，因此允许容易地产生大量的所述片段。
完整抗体，和F(ab')2片段是“二价的”。通过“二价”我们表示所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原联合位点。相反，Fab，Fv，ScFv和dAb片段是单价的，仅具有一个抗原联合位点。
所述抗体可以是单克隆或多克隆的。适合的单克隆抗体可以通过已知的技术制备，例如，那些公开于“MonoclonalAntibodies:Amanualoftechniques”,HZola(CRCPress,1988)和“MonoclonalHybridomaAntibodies:Techniquesandapplications”,JGRHurrell(CRCPress,1982)中的那些，两者通过提述并入本文。
当从文库中选择潜在的结合分子时，经常采用一种或多种具有确定基序的选择肽。在选择肽的基序设计中，可以使用提供结构、肽中降低的柔性或带电荷、极性或疏水性侧链从而允许与结合分子的相互作用的氨基酸残基。例如：
(i)脯氨酸可能稳定肽结构，因为其侧链结合到α碳以及氮两者；
(ii)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸具有芳香族侧链并是高度疏水的，而亮氨酸和异亮氨酸具有脂肪族侧链且也是疏水的；
(iii)赖氨酸，精氨酸和组氨酸具有碱性侧链并在中性pH将是带正电荷的，而天冬氨酸和谷氨酸具有酸性侧链并在中性pH将是带负电荷的；
(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性pH是中性的但含有酰胺基，其可能参与氢键；
(v)丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸侧链含有羟基，其可能参与氢键。
典型的，选择结合分子可能涉及使用阵列技术以及系统以分析对与结合分子类型对应的点的结合。
因此，第一结合试剂可以是，例如，重组抗体或其抗原结合片段。优选的，所述抗体或其抗原结合片段选自下组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合域。
所述第一结合试剂可以固定在表面上。
可选的，测试样品中的一种或多种生物标志物标记有可检测部分。一份或多份对照样品中的一种或多种生物标志物分子可以可替换的或另外标记有可检测部分。
通过“可检测部分”我们包括其允许它的存在和/或相对量和/或位置(例如，在阵列上的位置)被直接或间接确定的部分。
适合的可检测部分在本领域中是公知的。
例如，所述可检测部分可以是荧光和/或发光和/或化学发光部分，其当暴露于特定环境时，可以被检测。这种荧光部分可能需要暴露于特定波长和强度的辐射(例如，光)以导致所述荧光部分的激发，从而使其能够发射可以被检测的特定波长的可检测荧光。
或者，所述可检测部分可以是酶，其能够将(优选不可检测的)底物转化为可检测产物，其能够被可视化和/或被检测。适合的酶的例子在下文例如关于ELISA试验中更详细的讨论。
优选的，所述可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。最优选的所述可检测部分是生物素。
显然，为了所述可检测部分是容易检测的，待检测的试剂(例如，本文所述的测试样品和/或对照样品中的一种或多种生物标志物和/或用于检测选择的蛋白的抗体分子)必须具有足够的适合的原子同位素(atomicisotope)。
在进一步或另外的实施方案中，步骤(b)，(d)和/或步骤(f)使用包含第二结合试剂的试验进行，所述第二结合试剂能够结合一种或多种生物标志物，所述第二结合试剂包含可检测部分。
放射性或其它标签可以以已知的方法整合到本发明的方法的样品中存在的生物标志物和/或本发明的结合部分中。例如，如果所述结合试剂是多肽，其可以是生物合成的，或可以使用适合的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，所述氨基酸前体包含，例如，氟-19代替氢。标签例如99mTc,123I,186Rh,188Rh和111In可以，例如，通过结合部分中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以通过赖氨酸残基附接。可以使用IODOGEN方法(Fraker等，(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)整合123I。参考文献(“MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy”,J-FChatal,CRCPress,1989)详细描述了其它方法。用于将其它可检测部分(例如，酶，荧光，发光，化学发光或放射部分)缀合到蛋白的方法是本领域公知的。
本领域的技术人员将理解样品中待检测的样品中的生物标志物可以使用部分标记，所述部分间接辅助确定所述蛋白的存在，量和/或位置。因此，所述部分可以组成多组分可检测部分的一个组分。例如，待检测的样品中的生物标志物可以是用生物素标记，其允许使用融合或其他方式连接到可检测标签的链霉亲合素对它们的后续检测亲合素。
优选的第二结合试剂包含以下项，或由以下项组成：抗体或其抗原结合片段，例如，重组抗体或其抗原结合片段。优选的，所述抗体或抗原结合片段选自下组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合域。
所述一种或多种第二结合试剂可以使用可检测部分标记，例如，所述可检测部分可以选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射部分；酶部分。优选的，所述可检测部分是荧光部分(例如，AlexaFluor染料，例如Alexa647)。
在本发明的第一个方面的一个实施方案中，所述方法包含ELISA，或由ELISA组成(酶联免疫吸附试验)。
用于检测血清和血浆蛋白的优选的试验包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫试验(RIA)，免疫放射测定试验(IRMA)和免疫酶试验(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心试验。示例性的夹心试验由David等描述于美国专利号4,376,110和4,486,530中，特此通过提述并入本文。细胞在载玻片上的抗体染色可以用于细胞学实验室诊断测试中公知的方法中，如本领域技术人员所公知的。
如此，在一个实施方案中该试验为ELISA(酶联免疫吸附试验)，其通常涉及使用产生有色的反应产物的酶，通常在固相试验中。酶诸如辣根过氧化物酶和磷酸酶已经被广泛使用。放大磷酸酶反应的方式是使用NADP作为底物产生NAD，其此时将作为用于第二酶系统的辅酶。来自大肠杆菌的焦磷酸酶提供了良好的缀合物，因为该酶不存在于组织中，其是稳定的并且提供良好的反应颜色。还可以使用基于酶诸如萤光素酶的化学发光系统。
通常使用与维生素生物素的缀合，因为生物素可以通过其与酶连接的亲合素或链霉亲合素的反应容易地被检测(生物素以极大的特异性和亲和性与其结合)。
在可替换的实施方案中，用于蛋白检测的试验是方便的荧光试验。因此，第二结合试剂的可检测部分可以是荧光部分，例如Alexa荧光团(例如Alexa-647)。
优选的，所述方法的预测准确性，如通过ROCAUC值确定，为至少0.50，例如，至少0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98或至少0.99。更优选的，所述方法的预测准确性，如通过ROCAUC值确定，为至少0.80(最优选的1)。
在本发明的第一个方面的方法中步骤(b)可以通过使用阵列例如基于珠的阵列或基于表面的阵列进行。优选的所述阵列选自下组：宏阵列；微阵列；纳米阵列。
用于确定前列腺癌相关的疾病状态的方法可以使用支持向量机(SVM)进行，例如那些可以从http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html得到的(例如e10711.5-24)。然而，也可以使用任意其它适合的方法。还可以使用SVM确定生物标志物签名的ROCAUCs，所述生物标志物签名包含以下项，或由以下项组成：一种或多种如本文确定的表1生物标志物。
支持向量机(SVM)是用于分类和回归的一组相关的经监督的学习方法。给定一组训练实例，每一个被标记为属于两类中的一类，SVM训练算法构建了用于预测新的实例是否落入一类或另一类的模型。直观地，SVM模型是将实例呈现为空间中的点，被绘制成使得不同分类的实例被尽量宽的明显的间隙分开。然后，新的实例被绘制到相同的空间中并基于它们落入间隙的那一侧来预测其属于哪一类。
更正式的是，支持向量机高维或无穷维空间构建超平面或一组超平面，其可被用于分类、回归或其他任务。直观地，良好的分离通过与任何类别的最近训练数据点具有最大距离(被称为功能边缘)的超平面来实现，因为通常边缘越大分类机的泛化错误越低。关于SVM的更多信息，可以参考例如Burges,1998,DataMiningandKnowledgeDiscovery,2:121–167。
在本发明的一个实施方式中，在进行本发明的方法之前，使用已知试剂(即已知组织学分级的前列腺癌细胞，或来自具有已知的无远端转移存活的前列腺癌患者的前列腺癌细胞)的生物标志物概况概况，对SVM进行‘训练’。通过运行这样的训练样品，SVM能够学习什么样的生物标志物概况概况与特定的特征相关。一旦完成训练过程，SVM就能够确认测试的生物标志物样品是否是来自特定的前列腺癌样品类型(例如，特定的前列腺癌相关疾病状态)。
然而，通过在SVM中用必须的训练参数进行预编程可以规避该训练步骤。例如，根据已知的SVM参数，使用表1和/或表2中所列的生物标志物的测量，使用在前述例子中详细描述的值和/或调控模式可以鉴定属于具体的前列腺癌相关的疾病状态的细胞。
本领域技术人员将理解通过利用适当选择的数据(即来自已知前列腺癌状态，前列腺癌亚型状态和/或已知前列腺癌风险组的细胞的生物标志物测量)来训练SVM机，可以针对表1和/或表2中列出的生物标志物的任何组合确定适当的SVM参数。
或者，表1和/或表2数据可以用于根据本领域已知的任意其他适宜的统计方法确定具体的前列腺癌相关的疾病状态。
优选的，本发明的方法具有至少65％的准确度，例如66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％准确度。
优选的，本发明的方法具有至少65％的灵敏度，例如66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％灵敏度。
优选的，本发明的方法具有至少65％的特异性，例如66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％特异性。
通过“准确度”我们表示方法的正确结果的比例，通过“灵敏度”我们表示被正确分类为阳性的所有阳性化学物的比例，以及通过“特异性”我们表示被正确分类为阴性的所有阴性化学物的比例。
可替换的或另外，步骤(b)，(d)和/或步骤(f)使用阵列进行。
阵列本身是本领域所熟知的。通常它们是由具有分开的间距(即离散的)区域(“点”)的线性的或二维结构形成的，每个区域均具有有限的面积并形成在固体支持物的表面上。阵列还可以是珠结构的，其中每个珠可以通过分子密码或颜色密码识别，或在连续流体中被识别。当样品通过一系列点(每个点从溶液中吸附分子类型)时，顺序地进行分析。固体支持物通常为玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以为管、珠子、盘、硅芯片、微板、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝基纤维素膜、尼龙膜、其他多孔膜、非多孔膜(例如，塑料、聚合物、有机玻璃(perspex)、硅等)、多个聚合物针(polymericpin)、或多个微滴定孔、或适合用于固定蛋白质、多核苷酸和其他合适的分子和/或进行免疫试验的任何其他表面。结合方法是本领域所熟知的并且通常包括交联共价结合或物理吸附蛋白质分子、多核苷酸等至固体支持物。或者，可以经由亲和标签或类似构建体来亲和偶联探针。通过使用熟知的技术，例如接触式或非接触式印刷、掩膜或光刻，可以确定每个点的位置。其综述参见Jenkins,R.E.,Pennington,S.R.(2001,Proteomics,2,13-29)和Lal等人(2002,DrugDiscovToday15；7(18Suppl):S143-9)。
典型的，所述阵列为微阵列。通过“微阵列”我们包括以下含义：具有至少约100/cm2，优选至少约1000/cm2离散区域密度的区域的阵列。微阵列中的区域具有典型的维度，例如直径在约10～250μm之间的范围，并通过大致相同的距离与阵列中的其他区域分开。所述阵列还可以是宏阵列或纳米阵列。
一旦适合的结合分子(如上所述)被鉴定和分离，本领域技术人员可以使用分子生物学领域中熟知的方法来制造阵列，见下文实施例。
所述阵列可以是基于珠的阵列但优选基于表面的阵列，例如阵列选自下组：宏阵列、微阵列和纳米阵列。
然而，所述方法可以包含：
(i)利用生物素标记样品中存在的生物标志物；
(ii)使生物素标记的蛋白与阵列接触，所述阵列包括固定在其表面上的离散区域的多个scFv，所述scFv对于表1中的一种或多种蛋白质具有特异性；
(iii)使已固定的scFv与包括荧光染料的链霉亲合素缀合物接触；以及
(iv)检测在所述阵列表面上的离散区域的染料存在，
其中所述阵列表面上的染料的显现指示样品中来自表1的生物标志物的表达。
本发明的第一个方面的方法可以包含在步骤(b)、(d)和/或(f)中测量编码所述一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。
优选的，所述核酸分子为cDNA分子或mRNA分子(最优选为mRNA分子)。
在步骤(b)、(d)和/或(f)中检测一种或多种生物标志物的表达可使用选自下组的方法进行：Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交。优选地，使用DNA微阵列确定步骤(b)中一种或多种生物标志物的表达。
因此，在步骤(b)、(d)和/或(f)中测量一种或多种生物标志物的表达通过使用一种或多种结合部分进行，每个结合部分各自能够选择性地结合编码在表1中鉴定的一种生物标志物的核酸分子。所述一种或多种结合部分各自包括核酸分子或由核酸分子组成。
所述一种或多种结合部分可以各自包含以下述项，或由下述物质组成：DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO(优选DNA)。优选的所述一种或多种结合部分长度为5至100个核苷酸(例如，15至35个核苷酸)。
在一个实施方案中，所述结合部分包含可检测部分，例如，选自下组的可检测部分：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如放射性原子)；或酶部分。优选地，所述可检测部分包括放射性原子或由放射性原子构成，例如，所述放射性原子可选自下组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。
然而，所述部分可以是荧光部分。
在一个实施方式中，步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品选自下组：未分级的血、血浆、血清、组织液、前列腺组织、前列腺汁(prostatejuice)、胆汁和尿液且优选地，选自下组：未分级的血、血浆和血清。最优选地，步骤(b)、(d)和/或(f)中提供的样品为血浆。
本发明的第二个方面提供用于确定个体中前列腺癌的存在的阵列，包含一种或多种如本发明的第一个方面或其任意实施方案或实施方案的组合确定的结合试剂。
优选的，所述阵列包含针对表1中确定的每种蛋白的一种或多种结合试剂。
本发明的第三个方面提供一种或多种选自如本发明的第一个方面或其任意实施方案或实施方案的组合确定的生物标志物作为预后和/或诊断标志物的用途。
优选的表1中确定的所有生物标志物用作预后和/或诊断标志物。
本发明的第四个方面提供如本发明的第一个方面或其任意实施方案或实施方案的组合确定的分离的结合试剂，用作如本发明的第一个方面确定的预后和/或诊断标志物。
本发明的第五个方面提供用于确定前列腺癌的存在的试剂盒，包含：
A)一种或多种如本文的第一个方面或其任意的实施方案或实施方案的组合确定的第一结合试剂，或根据本发明的第二个方面或其任意实施方案或实施方案的组合的阵列；和
B)用于进行如本发明的第一个方面或其任意实施方案或实施方案的组合确定的方法的说明。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含如本文的第一个方面或其任意实施方案或实施方案的组合的第二结合试剂。
本发明的第六个方面提供实质上如本文所述的用于确定个体中前列腺癌相关的疾病状态的存在的方法或用途。
实质上如本文所述的用于确定个体中前列腺癌相关的疾病状态的存在的阵列或试剂盒。
现在将根据以下图和表格描述实施本发明的特定方面的优选的，非限制性实施例：
图1.对重组scFv抗体微阵列的评价。A)对含有1440个数据点(包括对照的180种探针×8个重复)的代表性微阵列的扫描图像。在80％的激光功率和80％的PMT增益扫描该图像。B)试验内重复性，即点对点变化。数据基于162种不同的抗体和8个点重复。C)试验间重复性，例如，试验对试验变化。数据基于一个样品在两个独立的试验上分析，每一个包括162种不同的抗体。
图2.具有增加的患PC风险的患者组的蛋白表达概况概况。四个风险组，表示为A(最低风险)至D(最高风险)，基于tOSA和％游离PSA先验定义。A)使用威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon’ssigned-ranktest)鉴定了显著差异表达的分析物(p<0.05)并呈现于热图中；绿色-下调，红色-上调，和黑色-同等水平。B)每个患者群分为训练集(75％的样品)和测试集(25％的样品)。C)使用基于SVM的方法使用全部162种抗体，即未过滤数据将患者群分类为A至D。所述SVM模式在训练集上训练，并在独立的测试集上测试，并表示为ROCAUC值。
图3.风险组C的分层(中等tPSA和低％游离PSA)。A)基于所有162种抗体，即使用未过滤数据的无监督分层聚类，导致分为两个亚组，表示为C1(黄色)和C2(蓝色)。B)基于未过滤数据的主成分分析(PCA)，确定了分层为亚组C1(黄色)和C2(蓝色)。C)使用威尔科克森符号秩检验鉴定了显著差异表达的分析物(p<0.05)并呈现于热图中；绿色-下调，红色-上调，和黑色-同等水平。D-E)对选定分子的抗体微阵列数据的验证，使用10-plex的细胞因子夹心抗体测定(MSD)。仅示出了两种分析物TNF-a(D)和IL-8(E)的数据，对于其大多数观察到的信号均高于MSD测定的检测下限。在其中这两种分析物指示为差异性表达的情况下(C1对C2)，将MSD数据与对应的微阵列数据比较。
图4.亚组C1和C2对原始风险组A，B和D的蛋白表达概况。所述样品使用SVM-LOO交叉验证分类，并确定ROCAUC值。使用威尔科克森符号秩检验鉴定了显著差异表达的生物标志物(p<0.05)并呈现于热图中；绿色-下调，红色-上调，和黑色-同等水平。A)C1分别相对A，B和D的SVM-LOO交叉验证。B)对于C1分别相对A，B和D，显示显著差异表达的分析物(p<0.05)的热图。C)C2分别相对A，B和D的SVM-LOO交叉验证。D)对于C2分别相对A，B和D，显示显著差异表达的分析物(p<0.05)的热图。E)区别A相对D的恶性签名与C1vs.C2,C1vs.D,Avs.C2,和Bvs.C2的对应标志物的表达水平的比较。
表3-本研究中包括的患者样品的临床实验室参数
a)n/a＝未应用
表4-通过微阵列分析的血浆生物标志物总结
*通过MSD确定的抗体特异性
**通过ELISA，MSD，蛋白阵列，封闭/强化实验，和/或质谱分析预先验证的抗体特异性
实施例
介绍
使用血液中的前列腺特异性抗原(PSA)对前列腺癌(PC)的早期检测减少了未筛过的人中的PC死亡。然而，由于通常使用的临界值PSA的中度特异性，对有助于在具有中度升高的PSA的人中增强风险分类的另外的生物标志物有迫切的需求。在本研究中，应用了重组抗体微阵列用于来自常规PSA测量的80个血浆样品的蛋白表达概况分析，所述样品基于总PSA和％游离PSA的水平，先验分为四个风险组。结果表明，可以鉴定准确指出PC(恶性生物标志物签名)的血浆蛋白概况并且最重要的是，其表现出与生化确定的PC风险组中度到高度的相关性。值得注意的是，这些数据也暗示具有中等范围PSA和低％游离PSA的风险组(其先验已知是异质性的)可以进一步分层为两个亚组，分别更像最低和最高风险组。总之，在这一概念验证研究中，因此我们已经表明与PC风险组相关的血浆蛋白生物标志物签名可以使用亲和蛋白组学从粗制血浆样品中鉴定。这一方法从长远的角度来看可以提供改进PC患者的风险分类的新的机会。
材料和方法
临床样品
我们使用来自80个年龄50-70岁的人的去鉴定的EDTA抗凝血液样品，这些人指引进行在UniversityHospital,Sweden的临床化学科室(Dept.ofClinicalChemistry)常规进行的PSA测试。对于这些样品没有保留临床信息或患者标识，且样品使用前储存于-80℃(表3)。使用双重标记的DELFIA总/游离PSA测定(Perkin-Elmer,Turku,Finland,其针对WHO96/670(PSA-WHO)和WHO68/668(游离PSA-WHO)校准)校准器测定游离和tPSA的水平。对于tPSA，可检测范围为从0.10至250ng/ml，和游离PSA为从0.04至250ng/ml。对于测量tPSA的变异系数为≤10.6％，和游离PSA≤7.3％。基于％游离和总PSA的水平，所述样品分为四个组：A(n＝20)具有tPSA≤0.70ng/ml；B(n＝20)具有tPSA为2.1-8.0ng/ml和％fPSA≥27.9％；C(n＝20)具有tPSA为5.0-10-3ng/ml和％fPSA≤12.6％；以及D(n＝20)具有tPSA为24.6-724ng/ml。这四个去鉴定的样品组反映了高度不同类别的PC诊断风险或结果，其中组A具有非常低的显著PC的长期风险，组B具有中度增加的前列腺疾病风险，但临床上有意义PC的较低可能性，组C具有大量增加的PC风险，以及组D具有非常高的临床上有意义或晚期PC的风险[38-41]。遵循的方案与1975年的赫尔辛基宣言(HelsinkiDeclaration)一致。
血浆样品的标记
根据以前优化的用于血清蛋白组的步骤[28，29]并进行一个稍微调整，标记EDTA抗凝血浆样品。为了防止血浆样品凝结，将EDTA添加到在整个方案中使用的PBS缓冲液至终浓度为4mM。简单的说，所述样品在4℃，16000xg离心20分钟，接着将5μl样品稀释45倍到4mMEDTAPBS中，得到总蛋白浓度为约2mg/ml。稀释的样品与0.6mMEZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL,USA)在冰上孵育2小时，之后通过相对4mMEDTA-PBS在4℃透析72小时，移除未反应的生物素。最终，分装样品并在用于微阵列实验前储存于-20℃。
ScFv的生产和纯化
从n-CoDeR库[42]选择针对62种不同的分析物(主要涉及免疫调节)的一百六十二种人重组scFv抗体片段，，并由BioinventInternationalAB(157种scFv克隆；Lund,Sweden)和Prof.M.Ohlin(5种Mucine-1特异性克隆，Dept.ofImmunotechnology,LundUniversity,Lund,Sweden)友情提供(支持信息表3)。通过使用(i)严格噬菌体展示选择方案[42]，(ii)每种目标分析物多个克隆(≤4)和(iii)适用于微阵列应用的分子设计[26，27]确保这些噬菌体展示衍生的scFv抗体的特异性，亲和力(在1-10nM范围内)，以及芯片上的功能。另外，几种抗体的特异性/反应性模式以前已经使用良好表征的血清样品以及正交方法验证，所述方法例如ELISA，MesoScaleDiscovery(MSD)，细胞计数珠阵列(CBA)和质谱法(MS)，以及使用强化和阻断实验(spikingandblockingexperiments)(支持信息表3)[31,33,34,36]。所有的scFv在100ml大肠杆菌培养物中产生，并使用亲和层析在Ni2+-NTA琼脂糖(Qiagen,Hilden,Germany)上从表达上清中纯化。使用250ml咪唑(SaveenWerner,Sweden)洗脱结合的分子，相对PBS透析，然后在用于微阵列实验中之前储存在4℃。通过10％SDS-PAGE(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)评价scFvs的完整性和纯度。通过测量280nm处的吸光度确定蛋白浓度。
抗体微阵列的生产和处理
简单的说，使用非接触式分配器(SciFlexarrayerS11,Scienion,Berlin,Germany)产生scFv微阵列并根据以前优化的配置处理[28，29]。将总共180种scFv和对照以8个重复排列到BlankPolymerMaxisorp载玻片上(NUNCA/S,Roskilde,Denmark)，每个位置一滴(300pL)，scFv浓度为0.05-0.4mg/ml。所述180种探针排列为三列，每一列包含60行(图1A)。AlexaFlour-647标记的链霉亲合素(10ug/ml)印制(print)为阳性对照，并包括印制缓冲液(PBS)作为阴性对照。印制后，允许所述载玻片干燥并在溶于PBSo/n的5％(w/v)脱脂牛奶(SemperAB,Sundbyberg,Sweden)中封闭。然后将所述载玻片置于蛋白阵列工作站(PerkinElmerLife&AnalyticalSciences,Wellesley,MA,USA)上并使用溶于PBS的0.5％(w/v)Tween-20(PBS-T)洗涤四分钟。接着，注入以1:2稀释于溶于PBS的1％(w/v)的脱脂牛奶粉末以及1％(v/v)Tween-20中(PBS-MT)的70μl的标记的样品，并随搅拌孵育60分钟。第二次洗涤后，将所述阵列与350μl溶于PBS-MT的1μg/mlAlexa-647缀合的链霉亲合素温育60分钟。洗涤后，所述阵列在氮气流下干燥，并使用共聚焦微阵列扫描仪(ScanArrayExpress,PerkinElmerLife&AnalyticalSciences)以5μm的分辨率扫描，使用五种不同的扫描仪设置(50％PMT增益和70％激光功率(50/70),70/70,80/80,80/90,和90/90)。使用ScanArrayExpress软件版本4.0(PerkinElmerLife&AnalyticalSciences)量化信号强度。减去局部背景，并为了补偿任意可能的局部缺陷，自动排除两个最高的和最低的重复。呈现的信号强度代表剩下的四个重复点的均值。仅考虑未饱和的点用于分析。
微阵列数据标准化
使用半全局标准化方法[32,33]进行了数据组的芯片对芯片标准化，其与对DNA微阵列开发的标准化相似。首先对于每个分析物计算变异系数(CV)并排名。鉴定了在所有样品中展现出最低CV值的百分之十五的分析物，对应24种分析物，并用于计算每个样品的芯片对芯片标准化系数。通过公式Ni＝Si/μ计算标准化系数Ni，其中Si是对于每份样品的所述24种分析物的信号强度的和，而ì是对所有样品平均的24种分析物的信号强度的和。从一个样品生成的每个数据集除以标准化系数Ni。将信号强度的Log2值用于进一步的分析。
数据分析
基于tPSA和％fPSA的值将80个患者样品分为四组(n＝20)。对于初始分类分析，四个风险组的每一个分为训练集(n＝15)和测试集(n＝5)。为了将样品分类，我们使用了支持向量机(SVM)，一种R中的监督学习方法。使用线性核函数进行监督分类，将约束成本(costofconstraint)设置为1，其为R函数SVM的默认值，且没有为了避免过度拟合进行尝试来调整它。使用训练集训练SVM模型接着冻结，接着应用到测试集。在训练SVM之前没有进行数据的过滤，即来自阵列上的所有抗体的数据都纳入分析中。此外，使用SVM判定值，构建了接受者工作特征(ROC)曲线，并计算了所述曲线下的面积(AUC)。使用Cluster和Treeview[44]中的无监督层次聚类，可以将C组分为两个亚组，表示为C1(n＝10)和C2(n＝10)。由于较小的样品数量，在这种情况下不可能分为训练和测试集，因此使用留一法交叉验证方案训练SVM。基于相对蛋白水平限定并使用威尔科克森符号秩检验鉴定了显著上或下调的血浆蛋白(p<0.05)。使用主成分分析(PC)软件程序(QlucoreOmicsExplorer,Lund,Sweden)和/或ClusterandTreeview使样品可视化。
验证实验
为了验证抗体微阵列结果，在所有80个EDTA-血浆样品上运行人Th1/Th210-plexMSD(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD,USA)测定。MSD96-板的每个孔在空间上不同的电极点已经使用针对IL-2,IL-4,IL-5,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13的抗体预功能化。根据制造商提供的方法运行所述测定，并在MSD仪器中进行基于电化学发光的读出。检测限定义为标准曲线中标准偏差超过零点的2.5倍的信号。
结果
在本研究中，我们进行了来自80个不同水平的患PC风险的患者的未分级的，生物素化的EDTA-血浆样品的蛋白表达概况分析，使用我们内部研发的重组抗体微阵列。所述样品已经基于tPSA和％fPSA先验分为四个组，反应不同种类的PC诊断或结果风险(表3)。
scFv微阵列评价
代表性的微阵列图像示于图1A中，证明得到了均质的点形态，高信噪比，以及动态信号强度。所有的80个样品都成功的进行了概况分析；因此，来自所有80个样品的阵列数据可以用于后续的统计分析。通过分析点对点变化评估了测定内重复性，得到了平均判定系数(R2)为0.95(图1B)。分析间重复性，即阵列对阵列变化，通过在独立的阵列上分析单个样品评价，得到R2值为0.96(图1C)。
风险组分类
首先，我们确定了四个前列腺癌风险组的聚焦的(62种分析物)血浆蛋白组概况，所述四个组表示为A-D(表3)，其中组A显示出最低的风险而组D显示出最高的风险。使用威尔科克森符号秩检验，鉴定了3至44种差异表达(p<0.05)的血浆分析物，其示于图2A中的热图中。该数据表明，仅3种分析物在两个最低风险的组，A和B之间差异表达。因此，如可以从临床观点预期的，该数据暗示在两个最低风险的组之间只有很小的差异。相反，在组A，B或C相对最高风险组D，观察到了37，44和30种失调的分析物，表明大(较大)的差异。更具体的，发现几种补体蛋白(例如C3,C4,C1q,因子B和备解素)在高风险组D中下调，而上调的分析物表现出TH1(例如，IL-2,IL-3和INF-a)和TH2(例如，IL-4,IL-10)细胞因子两者的复杂模式。最重要的，区分组A(非常低的PC风险)相对组D(非常高的临床上有意义或后期PC的风险)的生物标志物签名可以视为准确确定PC的恶性生物标志物签名。
接着我们评价了阵列平台基于观察到的蛋白表达概况将所述四个风险组(A至D)分类的能力。为此，每个患者组分为训练集(75％的样品)和测试集(25％的样品)(图2B)。因此，在训练集上训练SVM模型并接着应用到独立的测试集上。结果表明，风险组可以使用不同的准确度来区分，其中组B和组D表现出AUC为0.68，组A和BAUC为0.84(仅基于三种分析物)，和组A和DAUC为0.72(图2C)。因此，该数据表明，恶性签名可以用于很好的区分组A(非常低的风险)和组D(非常高的临床上有意义或后期PC风险)(见图2A和2C)。相反，不能将组C从任意的其它三个风险组区分(在所有情况下AUC＝0.5)。在此背景中，应当注意C组代表了异质的患者组(中等范围tPSA，低％游离PSA)，其中仅25-50％事实上患有PC，虽然所有的都选择进行活组织检查测试。因此，对这一异质患者组的分层可能是用于鉴定较高或较低风险形成PC的患者的潜在关键工具。
风险组C的分层
为了研究风险组C是否能够进一步分层，我们基于未过滤的数据进行了无监督层次聚类，即使用来自阵列上包括的所有抗体的数据。结果表明，C风险组确实可以分为两个不同的亚组，表示为C1和C2(图3A)。相似的，使用主成分分析(PCA)也观察到了C群的明确细分(图3B)。此外，对于C1相对C2观察到了49种显著差异(p<0.05)表达的血浆分析物(图3C)。更详细的，三种补体蛋白在C1中上调(C1q、因子B和C4)，而剩下的差异表达蛋白在C1中下调。后一组分析物包括一些细胞因子(例如，IL-6和IL-4)，补体蛋白(例如，C1-INH和C1s)，以及细胞表面蛋白(例如，ICAM,HLA-DR,Mucine-1和CD-40)。总的来说，该数据表明异质风险组C可以使用大量失调的分析物分层为两个不同的亚组，C1和C2。
为了验证阵列数据，应用了独立的10-plex细胞因子夹心抗体微阵列(MSD)(图3D和3E)。在C1相对C2中观察到的TNF-α(图3D)和IL-8(IL-8)(图3E)的下调可以通过MSD数据验证。
亚组C1和C2的风险分类
为了评估对风险组C的分层细分的生物学影响，将亚组C1和C2的蛋白表达概况与其它三个原始风险组A，B和D的那些比较。在C1的情况下，结果表明C1可以很好的从风险组D区分(AUC＝0.82)，但不能从风险组A和B区分(在两种情况下AUC＝0.5)(图4A)。此外，对于C1相对D，观察到了47种差异表达的分析物，但对于C1相对A和B，分别仅观察到了16和15种(图4B)。在前一种情况下，在C1相对D中观察到了上调的补体蛋白(例如，C1q,C3,和因子B)以及下调的细胞因子(例如，TGF-a1,IL-1ra,IL-6和MCP-1)以及细胞表面标志物(例如，ICAM,CD40和LewisX)的模式。
相反的，结果表明C2可以很好的从风险组A(AUC＝0.72)和B(AUC＝0.75)两者区分，但不能从风险组D区分(AUC＝0.57)(图4C)。在这种情况下，对于C2相对A和B，分别观察到了22种和28种失调的分析物，但对于C2相对D仅5种(图4D)。虽然在C2相对A中仅观察到了两种下调的分析物(C1q和IL-4)，在C2相对A和B两者中都观察到了上调的细胞因子(例如，IL-1ra,MCP-1,和IL-6)和细胞表面标志物(CD40,LewisX和唾液酸化的LewisX)的模式。综上所述，结果表明，C1与最低风险组A和B更相似，而C2表现出与最高风险组D较高的相似性，表明C1组代表低风险患者而C2组代表高风险患者。
最后，为了进一步突出生物学相关性，我们比较了区分风险组A(非常低的风险)相对风险组D(非常高的临床上有意义或后期PC风险)的恶性签名(33种生物标志物)(图2A)与以上签名的对应标志物的表达水平的重叠(图4E)。数据表明，恶性生物标志物签名中一个显著的部分也在C1相对C2(33种生物标志物的27种)和C1相对D(33种生物标志物的29种)的情况下差异表达，而与区分A相对C2和B相对C2的签名的重叠明显较小。因此，该数据进一步表明了准确确定PC的恶性生物标志物签名的生物学相关性。
讨论
血浆是一种微创且临床公认的样品形式，其可以是用于PC的早期检测和风险分类的生物标志物的理想来源。因此，为了这一目的它也在大量的大规模的蛋白组工作中评估[19，20]。然而，由于血浆样品关于蛋白数量和动态范围的固有复杂性，已有争论对未分级样品的经典蛋白组学分析对于分类PC将不太可能有用[21]。虽然预分级降低样品的复杂性，但其相应地与关于曲解的蛋白产量/恢复，以及重复性和灵敏度的严重问题相关[22，23]。在这种情况下，我们最近显示由重组抗体微阵列代表的亲和蛋白组学可以用于在粗制的蛋白组中概况分析高以及低丰度的分析物[26，27]。之前，单个血清标志物血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)，被证明能够使用抗体微阵列区分良性和恶性的前列腺疾病[45]。在这一概念验证研究中，我们使用了亲和蛋白组学靶向粗制血浆样品，为了破译第一个与PC风险组相关的多重(multiplexed)候选血浆蛋白生物标志物签名。因此，基于微阵列的重组抗体PC分析证明是朝向确定下一代PC相关生物标志物的潜在路线。
血浆蛋白组由经典的血浆蛋白以及组织泄露蛋白两者组成。人免疫系统感知机体内稳态中甚至微小变化(从细菌感染到生长肿瘤)的固有的能力提供了使用免疫系统作为疾病的遥控器和早期的传感器的独特机会[46]。实际上，免疫签名已经获得了显著地兴趣[47]，特别是由于最近的研究表明免疫监控作为肿瘤发展的一个重要因素[48]。为此，我们已经设计并应用了主要靶向免疫调节分析物的重组抗体微阵列[26，27]。以前我们已经证明了我们的阵列设计用于癌症诊断[32，33]，基于证据的治疗选择[35]以及预测乳腺癌复发风险[37]的潜力。在本发现研究中，我们已经延伸了应用的范围，并表明了其用于PC中风险组封层的潜在用途，其清晰的区分了两个最低相对最高风险组。
对潜在PC患者的风险分类现在可以在临床中使用血清PSA测定(tPSA和％游离PSA)[49]进行，其为几种用于风险分类模型的一种[3,50,51]。虽然这一方法使得能够检测许多肿瘤，对于恶性疾病的低特异性导致几个患者经受不必要的活组织检查测试[3]。如果临床医生能够获得更胜任的风险分类工具，这一数量可以显著减少。特别是，具有中等tPSA(4-10ng/ml)和低％fPSA的患者群体已知是异质的，包括PC和良性前列腺增生的混合[7,49]。在我们将四个预确定的风险组分类的尝试中，结果表明实际上所述具有中等tPSA和低％fPSA的患者群体(组C)不能从任意的其它三个风险组区分。因此，我们的数据进一步支持目前的观点，即组C是非常异质的患者组。
然而，我们的数据更确切的表明C组可分为两个不同的亚组，C1和C2，其正如目前的文献预期的[2,3,5,49]，分别更像两个最低和最高的原始风险组。当旨在癌症患者的个性化治疗时，将异质的患者组分层为更准确的较高或较低风险患(形成)特定癌症的亚组的能力将是有帮助的。从长远来看，这可以提供管理PC癌症患者的新的机会。然而，这一发现研究部分受限于纳入的患者的完整临床资料并不在手的事实，而观察到的候选生物标志物签名将在靶向更大的、独立的良好表征的患者群的后续研究中适当地验证。值得注意的是，可以使用用于初始验证的正交方法(MSD)检测的两种细胞因子IL-6和TNF-á支持我们对C1相对C2的区分。
当更详细的检查生物标志物签名时，观察到了新的以及一些已知反映高和低PC风险的生物学相关分析物。简单的说，已经表明TGF-a1与PC相关，例如在PC模型中促进细胞进展，较高的肿瘤分级，以及转移，并随后已经提出作为一个暂定的生物标志物[3,4,52]。相应的，我们发现TGF-a1在两个最低风险组，A和B中相对于最高风险组，D下调。另外，它也在A和B相对C2(高风险)，C1(低风险)相对D，以及在C1相对C2中下调。对于IL-6，这一细胞因子也被建议作为潜在的PC生物标志物[3,4]。我们的数据表明IL-6在低风险组(A，B或C1)分别相对高风险组(D或C2)的多个比较中下调。此外，其它已知在低风险组中下调的细胞因子，例如IL-1ra和MCP-1[53,54]，也发现在低风险组(A，B或C1)相对高风险组(D或C2)的不同比较中下调，进一步支持我们报道的观察。另外，LewisX在低风险组中下调的观察与以前的结果一致，表明LewisX是前列腺癌中的预后参数[55]。应当注意这些观察也支持观察到的候选恶性生物标志物签名准确确定PC。迄今，补体蛋白没有在PC的背景中显著地报道。我们的数据表明几种补体蛋白例如C1q、C3、C4、备解素和/或C1-INH的不同组合，在多个低风险组分别相对高风险组中上调。虽然以前没有在临床研究中报道，已经证明C1q在前列腺癌细胞系中显示出保护作用[56]。
综上所述，使用亲和蛋白组学，我们已经描绘了与PC风险组以及PC相关的候选血浆生物标志物签名。靶向独立的患者群，该结果表明基于临床参数先验确定的传统的风险组可以分层，甚至进一步亚分层，从而潜在的描述了新的、优化的PC风险组。
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Claims (112)

1.一种用于确定个体中前列腺癌相关的疾病状态的方法，包含以下步骤，或由以下步骤组成：
a)提供来自所述个体的待测试样品；
b)通过测量所述测试样品中选自表1中限定的组的一种或多种生物标志物的表达，确定所述测试样品的生物标志物签名(signature)；
其中所述测试样品中选自表1中限定的组的一种或多种生物标志物的表达指示所述个体中一种或多种前列腺癌相关的疾病状态。
2.根据权利要求1的方法，进一步包含以下步骤或由以下步骤组成：
c)提供来自未患前列腺癌的个体的一份或多份对照样品；
d)通过测量在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在所述对照样品中的表达确定所述对照样品的生物标志物签名；
其中在以下事件中鉴定一种或多种前列腺癌相关的疾病状态：在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在所述测试样品中的表达与在步骤(d)中测量的一种或多种生物标志物在所述对照样品中的表达不同。
3.根据权利要求1或2的方法，进一步包含以下步骤或由以下步骤组成：
e)提供来自患有前列腺癌的个体的对照样品；
f)通过测量在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在所述对照样品中的表达确定所述对照样品的生物标志物签名；
其中在以下事件中鉴定一种或多种前列腺癌相关的疾病状态：在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在所述测试样品中的表达与在步骤(f)中测量的一种或多种生物标志物在所述对照样品中的表达对应。
4.根据权利要求1，2或3的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(A)中所列的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(A)中所列的至少2，3或4种生物标志物的表达。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(A)中所列的每种生物标志物的表达。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(B)中所列的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(B)中列出的至少2，3，4，5或6种生物标志物的表达。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(B)中所列的所有生物标志物的表达。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(C)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(C)中所列的至少2，3，4，5，6，7或8种生物标志物的表达。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(C)中所列的所有生物标志物的表达。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(D)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(D)中所列的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或11种生物标志物的表达。
11.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(D)中所列的所有生物标志物的表达。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(E)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(E)中所列的至少2，3，4，5，6，7或8种生物标志物的表达。
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(E)中所列的所有生物标志物的表达。
14.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(F)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(F)中所列的至少2，3，4，5，6，7或8种生物标志物的表达。
15.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(F)中所列的所有生物标志物的表达。
16.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(G)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(G)中所列的至少2，3，4，5，6，7或8种生物标志物的表达。
17.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(G)中所列的所有生物标志物的表达。
18.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(H)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(H)中所列的至少2，3，4或5种生物标志物的表达。
19.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(H)中所列的所有生物标志物的表达。
20.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表1(I)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表1(I)中所列的至少2，3，4，5，6，7，8或9种生物标志物的表达。
21.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表1(I)中所列的所有生物标志物的表达。
22.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(A)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(A)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37或38种生物标志物的表达。
23.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(A)中所列的所有生物标志物的表达。
24.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(B)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(B)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41或42种生物标志物的表达。
25.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(B)中所列的所有生物标志物的表达。
26.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(C)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(C)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28或29种生物标志物的表达。
27.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(C)中所列的所有生物标志物的表达。
28.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(D)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(D)中所列的至少2或3种生物标志物的表达。
29.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(D)中所列的所有生物标志物的表达。
30.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(E)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(E)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51或52种生物标志物的表达。
31.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(E)中所列的所有生物标志物的表达。
32.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(F)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(F)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或16种生物标志物的表达。
33.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(F)中所列的所有生物标志物的表达。
34.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(G)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(G)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13或14种生物标志物的表达。
35.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(G)中所列的所有生物标志物的表达。
36.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(H)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(H)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45或46种生物标志物的表达。
37.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(H)中所列的所有生物标志物的表达。
38.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(I)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(I)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23种生物标志物的表达。
39.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(I)中所列的所有生物标志物的表达。
40.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(J)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(J)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28或29种生物标志物的表达。
41.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(J)中所列的所有生物标志物的表达。
42.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量来自表2(K)中所列生物标志物的一种或多种生物标志物的表达，例如，表2(K)中所列的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或13种生物标志物的表达。
43.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量表2(K)中所列的所有生物标志物的表达。
44.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是或包括确定临床上有意义的前列腺癌发生的可能性(即前列腺癌的预后)。
45.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法用于区分风险组A(低风险)，风险组B(中度风险)，风险组C(增加的风险)，风险亚组C1(中度增加的风险)，风险亚组C2(大量增加的风险)以及风险组D(高风险)。
46.根据权利要求22，23或44任一项的方法，其中所述方法用于区分风险组A(低风险)和风险组D(高风险)。
47.根据权利要求24，25，44或46任一项的方法，其中所述方法用于区分风险组B(中度风险)和风险组D(高风险)。
48.根据权利要求26，27或44至47任一项的方法，其中所述方法用于区分风险组C(增加的风险)和风险组D(高风险)。
49.根据权利要求28，29或44至48任一项的方法，其中所述方法用于区分风险组A(低风险)和风险组B(中度风险)。
50.根据权利要求30，31或44至49任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险亚组C2(大量增加的风险)。
51.根据权利要求32，33或44至50任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险组A(中度风险)。
52.根据权利要求34，35或44至51任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险组B(中度风险)。
53.根据权利要求36，37或44至52任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C1(中度增加的风险)和风险组D(高风险)。
54.根据权利要求38，39或44至53任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C2(大量增加的风险)和风险组A(低风险)。
55.根据权利要求40，41或44至54任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C2(大量增加的风险)和风险组B(中度风险)。
56.根据权利要求42，43或44至55任一项的方法，其中所述方法用于区分风险亚组C2(大量增加的风险)和风险组D(高风险)。
57.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是或包括确定前列腺癌的存在或不存在(即前列腺癌的诊断)。
58.根据权利要求22或23的方法，其中所述一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是或包括确定前列腺癌的存在或不存在(即前列腺癌的诊断)。
59.根据前述权利要求任一项的方法，其中步骤(b)包含以下项，或由以下项组成：测量所述测试样品中表1和/或表2中限定的所有生物标志物的表达。
60.根据权利要求2的方法，其中所述不患有前列腺癌的个体不患有任意其它的前列腺相关病症。
61.根据权利要求60的方法，其中所述不患有前列腺癌的个体不患有任意其它疾病或疾患。
62.根据权利要求2，60或61的方法，其中所述不患有前列腺癌的个体是健康个体。
63.根据前述权利要求任一项的方法，其中使用能够结合所述一种或多种生物标志物的第一结合试剂进行步骤(b)，(d)和/或步骤(f)。
64.根据权利要求63的方法，其中所述第一结合试剂包含以下项或由以下项组成：抗体或其抗原结合片段。
65.根据权利要求64的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。
66.根据权利要求63或64的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自下组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合域。
67.根据权利要求63至66任一项的方法，其中所述第一结合试剂固定在表面上。
68.根据权利要求1至67任一项的方法，其中所述测试样品中的一种或多种生物标志物用可检测部分标记。
69.根据权利要求2至68任一项的方法，其中所述一份或多份对照样品中的一种或多种生物标志物用可检测部分标记。
70.根据权利要求68或69的方法，其中所述可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。
71.根据权利要求68，69或70的方法，其中所述可检测部分是生物素。
72.根据权利要求63至71任一项的方法，其中使用包含能够结合所述一种或多种生物标志物的第二结合试剂的测定进行步骤(b)，(d)和/或步骤(f)，其中所述第二结合试剂包含可检测部分。
73.根据权利要求72的方法，其中所述第二结合试剂包含以下项或由以下项组成：抗体或其抗原结合片段。
74.根据权利要求73的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。
75.根据权利要求72或73的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自下组：scFv；Fab；免疫球蛋白分子的结合域。
76.根据权利要求72至75任一项的方法，其中一种或多种所述第二结合试剂用可检测部分标记。
77.根据权利要求76的方法，其中所述可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶部分。
78.根据权利要求77的方法，其中所述可检测部分是荧光部分(例如，AlexaFluor染料，例如Alexa647)。
79.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法包含ELISA(酶联免疫吸附测定)或由ELISA组成。
80.根据前述权利要求任一项的方法，其中使用阵列进行步骤(b)，(d)和/或步骤(f)。
81.根据权利要求80的方法，其中所述阵列是基于珠的阵列。
82.根据权利要求80的方法，其中所述阵列是基于表面的阵列。
83.根据权利要求80至82任一项的方法，其中所述阵列选自下组：宏阵列；微阵列；纳米阵列。
84.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法包含：
(v)使用生物素标记存在于所述样品中的生物标志物；
(vi)将用生物素标记的蛋白与包含多个scFv的阵列接触，所述scFv固定在该阵列表面上离散的位置处，所述scFv对于表1中的一种或多种蛋白具有特异性；
(vii)使所述固定的scFv与包含荧光染料的链霉亲合素缀合物接触；和
(viii)在所述阵列表面上的离散位置处检测所述染料的存在
其中所述阵列表面上所述染料的表现指示所述样品中来自表1的生物标志物的表达。
85.根据权利要求1至63任一项的方法，其中步骤(b)，(d)和/或(f)包含测量编码所述一种或多种生物标志物的核酸分子的表达。
86.根据权利要求85的方法，其中所述核酸分子是cDNA分子或mRNA分子。
87.根据权利要求86的方法，其中所述核酸分子是mRNA分子。
88.根据权利要求85，86或87的方法，其中使用选自下组的方法进行在步骤(b)，(d)和/或(f)中测量所述一种或多种生物标志物的表达：Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交。
89.根据权利要求85至88任一项的方法，其中使用DNA微阵列确定在步骤(b)中测量所述一种或多种生物标志物的表达。
90.根据权利要求85至89任一项的方法，其中使用一种或多种结合部分进行在步骤(b)，(d)和/或(f)中测量所述一种或多种生物标志物的表达，其中所述一种或多种结合部分各自分别能够选择性结合编码表1中鉴定的一种生物标志物的核酸分子。
91.根据权利要求90的方法，其中所述一种或多种结合部分各自包含核酸分子或由核酸分子组成。
92.根据权利要求91的方法，其中所述一种或多种结合部分各自包含以下项或由以下项组成：DNA,RNA,PNA,LNA,GNA,TNA或PMO。
93.根据权利要求91或92的方法，其中所述一种或多种结合部分各自包含DNA或由DNA组成。
94.根据权利要求91至93任一项的方法，其中所述一种或多种结合部分长度为5至100个核苷酸。
95.根据权利要求91至94任一项的方法，其中所述一种或多种核酸分子长度为15至35个核苷酸。
96.根据权利要求91至95任一项的方法，其中所述结合部分包含可检测部分。
97.根据权利要求96的方法，其中所述可检测部分选自下组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。
98.根据权利要求97的方法，其中所述可检测部分包含放射性原子，或由放射性原子组成。
99.根据权利要求98的方法，其中所述放射性原子选自下组：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。
100.根据权利要求97的方法，其中所述结合部分的可检测部分是荧光部分。
101.根据前述权利要求任一项的方法，其中在步骤(b)，(d)和/或(f)提供的样品选自下组：未分级的血，血浆，血清，组织液，前列腺组织，前列腺汁，胆汁和尿。
102.根据权利要求101的方法，其中在步骤(b)，(d)和/或(f)提供的样品选自下组：未分级的血，血浆和血清。
103.根据权利要求101或102的方法，其中在步骤(b)，(d)和/或(f)提供的样品是血浆。
104.一种用于确定个体中前列腺癌的存在的阵列，其包含如权利要求63至78或91至100中任一项定义的一种或多种结合试剂。
105.根据权利要求104的阵列，其中所述一种或多种结合试剂能够结合表1中限定的所有蛋白。
106.选自权利要求1至103任一项限定的组的一种或多种生物标志物作为如权利要求1至103任一项限定的预后和/或诊断标志物的用途。
107.根据权利要求106的用途，其中表1中限定的所有生物标志物用作预后和/或诊断标志物。
108.一种如权利要求63至78或91至100任一项中限定的分离的试剂，用作如权利要求1至103任一项中限定的预后和/或诊断标志物。
109.一种用于确定前列腺癌的存在的试剂盒，包含：
A)如权利要求63至78任一项限定的一种或多种第一结合试剂或根据权利要求80至83或权利要求104或105的阵列；
B)用于进行如权利要求1至103任一项限定的方法的说明书。
110.根据权利要求109的试剂盒，进一步包含如权利要求91至100任一项限定的第二结合试剂。
111.一种实质上如本文所述的用于确定个体中前列腺癌的存在的方法或用途。
112.一种实质上如本文所述的用于确定个体中前列腺癌的存在的阵列或试剂盒。
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