KR20190088510A

KR20190088510A - 항체 에세이

Info

Publication number: KR20190088510A
Application number: KR1020197018129A
Authority: KR
Inventors: 자레드 앨런; 이사벨 맥도널드; 안드리아 머레이; 크리스토퍼 웰버리
Original assignee: 오엔씨이뮨리미티드
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2019-07-26
Also published as: AU2017365931A1; US20190376975A1; RU2019118625A3; CN108107218A; EP3545309A1; IL266857A; RU2769987C2; WO2018096351A1; JP2020515826A; GB201619954D0; RU2019118625A; BR112019010636A2; MX2019006098A; EP3545309B1; JP7249284B2; CN113655224A; CN108107218B; CA3044492A1

Abstract

본 발명은 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 포유류 대상에서 간암을 검출하는 방법과 관련되며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이의 방법은 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원과 접촉 시키고 및 테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무 측정하며 여기서 언급된 복합체가 존재하면 간암이 존재함을 제시하는 것을 포함한다. 또한 본 발명 내에는 포유류 대상에서 간암을 진단 및 치료하는 해당 방법들, 항-간암 치료에의 반응을 예측하는 해당 방법들, 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 해당 방법들 및 본 발명의 방법들을 수행하기에 적절한 키트들을 포함한다.

Description

항체 에세이

본 발명은 일반적으로 항체 검출 분야에 관련 한 것이며, 및 특히 환자의 체액을 포함하는 샘플에서 간암과 관련된 자가항체들 (autoantibodies)을 검출하는 에세이에 관련 된다.

많은 진단, 예후 및/또는 모니터링 에세이는 특정한 질병의 상태 또는 질병 감수성의 생물학적 마커 (biological marker)의 검출에 의존한다. 그러한 생물학적 마커들은 보통 특정한 질병의 특징을 나타내거나 또는 그 질병의 감수성과 연관된 특징을 나타내는 단백질들 또는 폴리펩티드들(polypeptides)이며 및 간암을 포함한 암의 검출에 자주 사용된다.

간암은, 특히 간세포성 암 (Hepatocellular carcinoma)(HCC), 전세계적으로 여섯 번째로 흔한 암 이지만, 그러나 암으로 인한 사망 원인의 두 번째로 흔한 암이다. 치사율이 높은 이유는, 자주 전이가 일어 난 후에 늦게 진단이 되고 및 기존에 존재 하는 다른 간 질환 때문이다. 진단이 늦은 이유는 초기 증상이 부족하고, 및 진단에 사용되는 이미징 기술 (imaging technology)이 최적이 아니기 때문이다.

초음파 스크리닝 및 혈액 알파-태아단백질 (alpha-fetoprotein) (AFP) 수준의 측정 이 현재 간암을 스크리닝하는 가장 널리 사용 되는 도구이다. 그러나 이들의 수행 능력이 매우 부족하다는 것이 간암의 개선된 조기 진단/스크리닝 테스트와는 거리가 멀다는 것이 주된 초점이다.

간암의 존재를 효과적으로 스크리닝 하는 임상적으로 유용한 테스트는 간암을 조기에 진단하도록 함으로써 환영 받을 만 하다는 것은 분명하다. 더 나아가, 예를 들어, 혈액 샘플과 같은, 체액을 대상으로 수행하는 진단 테스트는

빠르고 상대적으로 비-침윤성 이어서 다른 기술에 비해 스크리닝 참여율이 증가 된다. 초기 단계에서의 질병의 검출은 부작용이 덜 심각한 광범위한 치료 선택의 기회를 열어 준다. 중간 단계 (moderate stage)의 간암의 현재의 치료 경로는 전체적인 간이식이 관여되며, 초기 단계 (early stage)의 질병을 가진 환자들을 더 일찍 동정하는 것은 기관 공여자들의 등록의 부담을 적게 할 것이다.

세계적으로 간암의 비율이 증가하고 있으므로, 개선된 간암의 스크리닝 테스트는 전세계적으로 유용할 것이다. 현재는, 중국이 모든 HCC의 50% 정도를 차지하고 반면에 이집트도 또한 높은 HCC 비율을 가지고 있다. 이 나라들에서 높은 HCC 발생율은, 한편, 중국에서는 높은 B 형 간염 바이러스, 및 이집트에서는 높은 C형

간염 바이러스 발생율 때문 인 것으로 간주 되고 있다. B 형 및 C형

간염 바이러스는 간 경화, 비-알코올성 지방간 질병, 알코올성 지방간 질병, 윌스 씨병(Wilson's disease), 혈색소침착증(hemochromatosis), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 알려진 아프라톡신 노출(aflatoxin exposure), 주혈흡충병(schistosomiasis) 및 당뇨 (diabetes mellitus)에서 와 함께 간암에서의 알려진 위험 인자 이다. 이러한 컨디션들의 유병률이 전세계적으로 증가하는 것은 간암의 빠르고, 비-침윤성인 테스트를 고안해 내는 것을 필요로 하도록 한다.

최근에는, 항체, 및 특히 자가항체, 가 질병 또는 질병의 감수성의 바이오마커로서 역할을 할 수 있음이 분명해 지고 있다. 자가항체들은 실제로 각 개체로부터 기인한 항원이지만 그 개인의 면역체계에서는 외부 인자로 인식 되는 항원에 대해 자연적으로 일어나는 직접인 항체이다. 이들은 순환계에서 순환하는 자유 자가항체로서 존재하거나 또는 이들의 항원에 결합된 자가항체로 구성된 순환하는 면역 복합체의 형태로서 존재 할 수 있다. “정상” 세포에 의해 발현되는 야생형 단백질과 질병 세포에 의하거나 또는 질병 진행 과정에 생산 되는 변형된 형태의 단백질 사이에의 차이는, 어떤 경우에는, 개인의 면역 시스템에서 이 변형된 단백질을 “비-자가형(non-self)” 으로 인식 되도록 하여, 이로써 그 개체에서 면역 반응을 끌어내게 하는 것이다. 이는 변형된 단백질에 면역학적으로 특이한 자가항체를 생산하게 하는 체액 (즉, B-세포 매개) 면역 반응 (humoral immune response) 일 수 있다.

종양 마커 단백질의 존재에 대한 자가항체 생산이란 측면에서 개인의 면역 반응을 측정하는 에세이는 체액에서 종양 마커 단백질의 존재를 직접 측정 또는 검출하는 방법을 대체 할 수도 있다. 그러한 에세이는 결국 종양 마커 단백질의 존재를 간접적으로 검출하는 것으로 구성 된다. 이 면역 반응의 성질은 자가항체는 순환하는 아주 적은 양의 종양 마커 단백질에 의해 야기 될 수 있으며, 및 종양 마커 단백질에 대한 면역 반응의 검출에 의존하는 간접적인 방법들이 결과적으로 체액에 있는 종양 마커 단백질의 수준을 직접 측정하는 방법들보다 더 민감할 수 있음을 의미하는 것이다. 그러므로 자가항체를 검출하는 것에 근거한 에세이 방법은 질병 진행 과정의 초기에 특히 유효 할 수 있다.

본 발명가들은 놀랍게도 간암과는 연관이 있는 것으로 사전에는 알려지지 않았던 네 개의 종양 마커 항원을 측정 하였다. 이들 종양 마커 항원들 중 어느 한 개, 또는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가의 종양 마커 항원들과 조합한 항원에 대한 자가항체 검출을 통해, 본 발명자들은 효과적이고 및 비-침윤성인 간암 스크리닝 방법, 및 이에 해당하는 키트를 고안 해 냈다.

본 발명의 첫 번째 양태에 따르면, 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 방법이 제공 되며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이의 방법은 하기의 단계로 구성된다:

(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및

(b) 테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정 한다.

이러한 양태 내에서 개체는 바람직하게는 간암을 가진 것으로 의심되는 개체이다.

본 발명의 두 번째 양태에 따르면, 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 포유류 대상에서 간암을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및

(b) 테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하여;

이로서 상기 복합체가 존재하면 간암이 있음을 제시한다.

본 발명의 세 번째 양태에 따르면, 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 포유류 대상에서 간암을 진단하거나 치료하는 방법을 제공하며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법은 하기 단계로 구성 된다:

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하여;

(c) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체가 검출 되었을 때 그 개체는 간암이 있음으로 진단하며; 및

(d) 그 진단된 개체에게 간암 치료제를 투여 한다.

본 발명의 네 번째 양태에 따르면, 항-간암 치료제에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공하며, 이 방법은 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 방법을 포함하며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 그 방법은 하기의 단계들을 포함한다;

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하고;

(c) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들과 종양 마커 항원 사의의 특이적 결합의 양을 검출하고; 및

(d) 자가항체들과 종양 마커 항원 사의의 특이적 결합의 양을 기존에 확립된 결합된 양과 치료의 유효 결과와의 관계와 비교하여;

이로서 대조군과 비교하였을 때 특이적 결합 양의 변화로 환자가 항-간암 치료제에 반응을 할 것인지 또는 아닌지를 예측한다.

본 발명의 이 양태 내에서 항-간암 치료는 화학요법 (chemotherapy), 고주파절제 (radiofrequency ablation), 간 절제 (liver resection), 간 이식(liver transplant), 백신주사(vaccination), 항-성장인자 또는 신호 전달 치료 (anti-growth factor or signal transduction therapies), 내분비계 치료(endocrine therapy), 인간 항체 치료 (human antibody therapy), 케테터경유 동맥 화학색전술 (transcatheter arterial chemoembolization), 경피적 에탄올 주사(percutaneous ethanol injection), 마이크로웨이브 삭마 (microwave ablation), 소라훼닙 투여 (sorafenib administration) 및 방사성색전술 (radioembolisation)로 구성 된 그룹으로부터 선택 될 수 있다.

본 발명의 다섯 번째 양태에 따르면 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원을 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 MMP9, AIF1, EpCAM 또는 CDKN1B 에 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출하여 포유류의 개체에서 간암을 검출하는 방법에 사용하는 용도를 제공하며, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:

이로서 상기 복합체가 존재하면 간암이 있음을 제시한다.

본 발명의 여섯 번째 양태에 따르면 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 자가항체들을 검출하는 하기를 함유하는 키트 (kit)를 제공 한다:

(a) MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 마커 항원; 및

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체를 검출 할 수 있는 시약.

본 발명의 일곱 번째 양태에 따르면, 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 간암으로 고통을 받고 있는 개인의 항체 프로화일을 측정하는 실험관 내의 방법을 제공하며 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법에는 하기의 단계가 포함된다:

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하고, 상기 방법은 항체 생산 프로화일을 쌓기 위해 반복 된다.

본 발명의 모든 양태에서 포유류 대상은 바람직하게는 사람이다. 여기서 “포유류 대상 (mammalian subject)” 및 “대상(subject)”이라는 용어들은 포유류, 바람직하게는 사람인 대상을 의미하여 서로 바꿔서 사용 될 것이다.

본 발명의 모든 양태에서, 그 방법은 바람직하게는 포유류 대상으로부터 얻거나 제조된 체액을 함유하는 테스트 샘플에 대하여 실험관 내에서 수행된다.

MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 면역학적으로 특이적인 자가항체가 간암의 마커로 사용될 수 있다는 놀라운 발견은 발명자들로 하여금 그러한 자가 면역 항체들을 검출하는 방법을 고안하게 할 수 있게 하였으며, 이는 간암을 검출 및 진단 하는데 사용될 수 있다. 그러한 검출은 키트 (Kit)를 사용하여 수행 할 수 있으며, 및 이 방법들 및 키트는 본 발명의 핵심을 이룬다.

본 발명가들은 놀랍게도 매트릭스 메탈로펩티데이즈 (matrix metallopeptidase 9)(MMP9), 알로그래프트 염증인자 1 (allograft inflammatory factor 1)(AIF1), 싱피세포 부착 분자 (epithelial cell adhesion molecule) (EpCAM) 및 싸이클린-의존 키나제 억제제 1B(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B)(CDKN1B)의 종양 마커 단백질들 중 어느 하나에 대한 면역학적으로 특이한 자가항체들이 간암의 존재를 암시 한다는 사실을 확립하였다. 그러므로, 이들 중 어느 하나에 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출 하는 것은 간암을 진단 하는데 사용 될 수 있다.

도면 1. 두 번째 커브 매개변수(parameter)들의 유도를 보여주기 위한 도식적인 묘사: 도면 1A=기울기(slope), 절편(intercept), 커브아래면적(area under the Curve) 및 최대 기울기(SlopeMax); 도면 1B=해리 항수 (Kd).
도면 2. 자가항체 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plate) 배치:도면 2A=고속-대량 에세이(high-throughput assay)(HTPA) 배치; 도면2B= 적정(titration) 배치.

본 발명은, 일반적으로, MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출하는 면역학적에세이 방법을 제공한다. 이 면역학적에세이 방법은 간암을 검출하거나 또는 진단하는데 사용될 수 있다.

자가항체를 검출하는 방법 (Method of detecting autoantibody)

본 발명의 첫 번째 양태에 따르면 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 방법이 제공 되며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이의 방법은 하기의 단계로 구성된다:

여기서 사용된 “자가항체(autoantibody)”라는 용어는 그 항원이 실제로 그 개체에서 기원한 것이더라도 그 개체의 면역시스템에서 외부 인자라고 인식되는 항원에 대하여 자연적으로 일어나는 항체를 의미 한다. 일반적으로, 자가항체는 질병 세포에서나 또는 질병 진행 과정 동안에 생성 되는 자연적으로 존재하는 단백질의 변형된 형태에 대한 항체도 포함 된다. 변형된 형태의 단백질은 그 개체에서 기인 하지만, 그 개체의 면역 체계에 의해 “비-자가(non-self)로 여겨 질 수 있으며 그럼으로써 그 개체에서 그 변형된 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체의 형태로 면역 반응을 야기 시킨다. 그러한 변형된 형태의 단백질에는, 예를 들어, 변형된 아미노산 서열을 가져, 선택적으로 2차, 3차, 또는 4차 구조의 변화가 수반된, 짤려진 형태, 스플라이스 변이체 (splice varients), 변형된 당쇄 형태들을 가진 돌연 변이들이 포함 될 수 있다. 다른 실시 양태에서는 자가항체는 질병 상태에서 과발현 되거나, 또는 유전자 증폭 또는 비정상적인 전사 조절의 결과에 의해 과발현 되는 단백질에 대한 것 일 수도 있다. 면역 시스템에 있는 세포에서는 정상적으로는 일어나지 않는 많은 양의 단백질 과발현은 면역 반응을 야기 시킬 수 있어 자가항체의 생산을 초래 할 수 있다. 더 나아간 실시 양태들에서는 자가항체는 질병 상태에서 발현 되는 태아 형태 단백질에 대한 것일 수도 있다. 정상적으로는, 면역 시스템이 기능 하기 전인, 발생의 초기 단계에서만 발현 되는 태아 단백질이 만약 질병 상태에서 발현 된다면, 그 완전히 분화된 인간의 질병 상태에서 발현되는 태아 형태 단백질은 면역시스템에 의해 “외부인자(foreign)”로 인식 될 수 있어, 면역 반응을 야기시켜 자가항체가 생산 되게 할 수 있다. 또 다른 실시 양태들에서는 자가항체는 한 질병 상태에서 다른 부위에서 발현 되는 단백질에 대한 것일 수도 있다. 예를 들어, 건강한 개체에서는 단백질이 내부 위치에서 발현이 되나 질병 상태에서는 표면이 노출된 부위에서 발현 되어 건강한 개체에서는 아니지만 이 단백질이 질병 상태에서는 순환계에 노출 및 그럼으로써 면역시스템에 노출되게 된다. 여기서 자가항체가 생기는 이 단백질은 “종양 마커 단백질(tumor marker protein)” 이라고 할 것이다.

본 발명의 범위 내에서 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 중 어느 하나에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체가 검출 될 수 있을 것이라고 고려된다. 본 발명은 또한 이들 종양 마커 단백질들 중에 하나에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체 및 이들 종양 마커 단백질들 중에 두 번째 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출하고, 선택적으로 이들 종양 마커 단백질들 중에 세 번째 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체 검출과 조합하고 및 더 나아가 선택적으로 이들 종양 마커 단백질들 중에 네 번째 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출하는 것을 또한 고려 하고 있다. 그러나, 본 발명은 이 관점에서만 제한 하지는 않는다. 동정된 종양 마커 단백질의 두 개 또는 세 개에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체들이 검출 이 되면, 두 개 또는 세 개의 종양 마커 단백질의 모든 조합도 고려 된다.

본 발명의 내용에서 “항원(antigen)” 이라는 용어는 테스트 샘플에 존재하는 항체들과 복합체를 형성하는 면역특이 시약을 의미하는데 사용된다. 항원은 적어도 검출하고자 하는 타겟 자가항체와 특이적으로 상호 작용할 수 있는 하나의 항원성 결정요소 또는 에피톱을 함유하는 물질이거나, 또는 언급된 자가항체의 변이 부위 (variable region) 또는 상호보완 결정 부위(complementary determinant region)와 특이적으로 상호 작용하는 어느 포획 제제(capture agents)를 포함하는 물질이다. 항원은 전형적으로, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드, 폴리삭카라이드(polysaccharide,다당류), 또는 핵산과 같은 자연적으로 존재하거나 또는 합성적인 생물학적 거대분자가 될 것이며 및 항-개별특이형 (anti-idiotype)항체들과 같은 이들의 항체 또는 조각들도 포함 될 수 있다. “종양 마커 항원 (tumor marker antigen)” 은 암을, 특히 간암과 연관된, 가지고 있는 개체에서 증가 되어 있는 항원이다. 여기서 “종양 마커 항원 (tumor marker antigen)” 및 “항원 (antigen)”은 서로 교환 될 수 있게 사용 될 것이다.

여기서 사용된 대로 “체액 (body fluide)” 이란 용어는, 본 발명의 방법을 사용하여 자가항체의 존재를 테스트 하기 위해 사용 될 재료를 의미 할 때는, 그 중에서도 혈장 (플라즈마, plasma), 혈청(serum), 전혈(whole blood), 뇨, 땀, 림프액, 대변(faeces), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복수(ascites fluid), 흉막삼출액(pleural effusion), 정액(seminal fluid), 가래(sputum), 유두액(nipple aspirate), 수술-후 혈청종 (post-operative seroma), 타액(saliva), 양수(amniotic fluid), 눈물(tears) 또는 상처 배액 (wound drainage fluid)를 포함 한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법들은 바람직하게는 테스트 대상으로부터 제거된 체액을 포함하는 테스트 샘플에 대해 실험관 내에서 수행 된다. 사용 되는 체액의 타입은 테스트 될 자가항체의 정체 및 에세이가 사용되는 임상적 환경에 따라 변화 될 수 있다. 일반적으로, 혈청 또는 혈장 샘플에 대한 에세이를 수행하는 것이 바람직하다. 테스트 샘플은 더 나아가 체액 이외에 예를 들어 희석제, 방부제, 안정제, 버퍼 등과 같은 성분들을 포함할 수 있다.

어느 특정한 실시 양태들에서는, 본 발명의 방법은 더 나아가, 다음의 단계를 포함 할 수 있다: (c) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들과 종양 마커 항원 사이의 특이적 결합의 양을 검출,

상기, 자가항체의 유무는 관찰된 특이적 결합의 양과 미리-측정된 절단 값 (cut-off) 사이의 비교에 근거 한다.

이 실시 양태 내에서 종양 마커 항원과 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들 사이의 특이적 결합의 양은 결합의 상대적인 양이거나 또는 결합의 절대적인 양일 수 있다.

여기서, 만약 종양 마커 항원과 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들 사이의 특이적 결합의 양이 미리-측정된 절단 값 보다 위이거나 또는 밑일 때 자가항체는 있다고 고려 될 수 있다. 그러나, 일반적으로 종양 마커 항원과 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들 사이의 특이적 결합의 양이 미리-측정된 절단 값 보다 위일 때 자가항체는 있다고 고려 된다. 미리-측정된 절단 값은 케이스-컨트롤 (case-control) 연구에서 알려진 음성 샘플 (예를 들어, 정상적인 개체)에 대한 대조군 에세이를 수행하여 결정 할 수 있다. “ 정상(normal)적인” 개체는 바람직하게는 임상적, 이미징 및/또는 생화학적 기준에 근거 하여 간암으로 진단 되지 않은 나이-일치 되는 (age-matched) 대조군이 될 것이다. 어느 특정 실시 양태에서는 알려진 음성 샘플들은 양성 간 질환을 가진 개체, 즉, 간암의 고 위험성에 있기는 하나 아직 간암의 징후를 보여주지 않는 개체, 로부터 유래 될 수 있다. 바람직하게는 정상적인 개체는 어느 암도 진단되지 않는다. 여기서 종양 마커 항원과 정상적인 환자로부터 온 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들 사이의 특이적 결합의 양은 검출 될 수 도 있으며 미리-측정된 절단 값을 제공 하기 위해 평균화 될 수 있다. 어느 특정 실시 양태들에서는 미리-측정된 절단 값은 90% 이상의 특이성을 유지하는 유댄 값(Youden's value)을 가장 크게 주는 절단 값을 선택 하여 결정 될 수 있다

본 발명가들은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 중 어느 하나에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체들이 간암과 연관 된다는 것을 놀랍게도 발견 했다. 그러므로, 어느 특정 실시 양태들에서는, 그 대상은 간암을 가진 것으로 의심 할 수 있다. 한 대상이 간암을 가졌을 수 있다고 의심 할 어떤 이유도 고려 될 수 있다.

본 발명의 모든 양태들 내에서, 간암은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)(HCC)일 수 있다.

어느 특정 실시 양태들에서는, 포유류 대상은 간암 스크린에서 이미 양성으로 조사 되었기 때문에 간암을 가졌다고 의심 할 수도 있다. 여기서 어느 간암 스크린도 고려된다. 어느 특정 실시 양태들에서는 그 대상은 이전에 알파-태아단백질 (alpha-feto protein)(AFP)에 양성으로 조사 되었을 수도 있다. 일반적으로, AFP 수준은 대상으로부터 채취한 혈액 샘플에서 검출 되며, 및 그러므로 그 대상은 이전에 혈액에서 AFP가 양성으로 조사 되었을 수 있다. 그러나 어느 AFP 검출 기술도 고려 된다. 다른 한편의 실시 양태들에서는, 그 대상은 이전에 데스-감마 카복시프로트롬빈 (des-gamma carboxyprothrombin) (DCP) 또는 랙틴-반응 알파-태아프로테인 (lectin-reactive alpha-fetoprotein)(AFP-L3)에 양성적인 검사로 보여진 것 일수 있다. 일반적으로, DCP 및 AFP-L3 수준은 그 대상으로부터 얻은 혈액 샘플에서 검출되며 그러므로 그 대상은 이전에 혈액 샘플에서 DCP 및 AFP-L3에 대해 양성으로 조사 되었을 수 있다. 그러나, 어느 DCP 또는 AFP-L3 검출 기술도 고려 된다.

다른 실시 양태들에서는 그 대상은 초음파 감시(ultrasound surveillance) 또는 다른 이미징 방법을 사용하여 간암에 양성으로 조사 될 수도 있다.

본 발명의 범위 내에서, 그 대상은 본 발명의 방법을 수행하기 이전 어느 시점에서 간암 스크린에서 양성으로 조사 되었을 수 있다. 예를 들어, 간암 스크린은 본 발명의 방법을 수행하기 전 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 한 달, 두 달, 세 달, 네 달, 다섯 달, 여섯 달, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 8 년, 9 년, 10 년, 또는 그 이상 전에 수행 되었을 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 간암 치료에 들어 있는 대상들 또는 이전에 이미 간암 치료에 들어 갔던 대상들도 아직 “간암을 지닌 의심자 (suspected of having liver cancer)” 라고 고려 될 수 있다. 여기서 간암의 치료는 어느 시점에서도 수행 되었을 수 있거나 또는 그 대상은 후속으로 간암의 존재를 조사 받거나 또는 아닐 수도 있다.

그 대상은 간암의 알려진 위험 인자를 가지고 있기 때문에 간암을 지니고 있다고 의심 될 수 있다. 어느 특정 실시 양태에서는 그 대상은 간 경변(liver cirrhosis), 비-알코올성 지방간 질병, 알코올성 간 질병, 윌슨씨병(Wilson's disease), 유전성 혈색소침착증 (hereditary hemochromatosis), 자가면역 간염 (autoimmune hepatitis), B형 간염, C형 간염, 문서로 기록된 아풀라톡신 노출 (documented aflatoxin exposure), 및 주혈흡충병 (schistosomiasis) 또는 당뇨를 가질 수 있다. 이러한 위험 인자들을 측정하는 어느 방법들도 고려 되며 및 그 대상은 이러한 위험 인자에 대한 치료를 받고 있거나 아니거나 또는 이미 치료를 받았을 수도 있다.

본 발명가들이 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체들이 간암과 연관된다는 것을 놀랍게도 측정 하였으므로, 테스트 샘플에서 이들 종양 마커 단백질들 중 어느 하나에 면역학적으로 특이적인 자가항체들을 검출하는 것은 간암을 검출하는 한 방법으로 사용 될 수 있다. 그러므로 한 실시 양태에서는 본 발명은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 한 포유류 대상에서 간암을 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법은 하기의 단계를 포함 한다:

이로서 언급된 복합체의 존재는 간암의 존재를 암시한다.

본 발명의 가장 넓은 양태에서, 본 발명은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B의 어느 하나에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체들 검출하는 방법들과 관련 되며, 및 간암의 진단 또는 어느 후속 치료에만 국한 되는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 한 양태에서는 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 한 포유류 대상에서 간암을 진단하거나 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법은 하기의 단계를 포함 한다:

(a)테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및

(c) 그 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합한 종양 마커 항원 복합체가 검출되면 그 대상은 간암을 지니고 있다고 진단하며, 및

(d) 간암이 진단된 대상에게 간암 치료제를 투여 한다.

이러한 양태 내에서, 상기 설명한 대로 테스트 샘플에서 종양 마커 항원과 자가항체 사이에 특이적인 결합의 양이 미리-결정된 절단 값 이상이거나 또는 이하 이면 자가항체가 존재 한다고 간주 된다.

본 발명의 범위 내에서, 간암 치료는 간암 진단된 후에 어느 시간에도 투여 될 수있다. 예를 들어, 간암 치료제는 간암 진단 후 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 한 달, 두 달, 세 달, 네 달, 다섯 달, 여섯 달, 1 년, 또는 더 이상 후에 투여 될 수 있다. 일련의 치료 사이에 어떤 간격을 두면서 간암 치료제의 다중 투여도 또한 고려 될 수 있다.

간암이 진단된 지리적인 지역과 다른 지리적 지역에서 간암 치료제를 투여 하는 것도 고려 된다. 더 나아가, 진단과 치료가 같은 지리적 지역 또는 다른 지리적 지역에서 수행 되었는지 아닌지에 상관없이 간암 치료제는 간암 진단을 수행한 사람과 다른 사람에 의해 투여 될 수도 있다.

한 양태에서, 본 발명의 자가항체 검출 방법은 치료 계층화 (treatment stratification)에도 사용될 수도 있다, 즉 특정한 환자 또는 환자 그룹이 특정한 항-간암 치료제에 반응을 보일지 아닐지를 결정하는데 사용 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 자가항체 검출 방법은 한 대상의 항-간암 치료제에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명은 항-간암 치료의 반응을 예측하는 방법을 제공하며, 그 방법은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 방법이며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법은 하기의 단계를 포함 한다:

(d) 종양 마커 항원과 자가항체들 사이의 특이적 결합의 양을 기존에 확립된 결합 양과 유사 치료 결과와의 관계와 비교한다;

이로써, 특이적 결합의 변화는, 대조군과 비교하였을 때, 환자가 항-간암 치료제에 반응할 것인지 아닌지를 예측 한다.

여기서, 대조군은 바람직하게는 간암을 지닌 것으로 알려진 대상이고 및 테스트하고자 하는 항-간암 치료제에 반응하지 않는 것으로, 즉 비-반응 대조군으로, 알려진 대상으로부터 유래한 체액의 샘플이다.

본 발명은 어느 특정 간암 치료에만 국한 하는 것은 아니라는 것을 주목하여야만 한다. 어느 특정 실시 양태에서는 간암 치료는 화학 요법 (chemotherapy), 고주파절제 (radiofrequency ablation), 간 절제 (liver resection), 간 이식(liver transplant), 백신주사(vaccination), 항-증식인자 또는 신호 전달 치료 (anti-growth factor or signal transduction therapies), 내분비계 치료(endocrine therapy), 인간 항체 치료 (human antibody therapy), 케테터경유동맥화학색전술 (transcatheter arterial chemoembolization), 경피적 에탄올 주사(percutaneous ethanol injection), 마이크로웨이브 삭마 (microwave ablation), 소라훼닙 투여 (sorafenib administration) 및 방사성색전술 (radioembolisation)로 구성 된 그룹으로부터 선택 될 수 있다.

상기 서술된 발명의 양태들은 보통 한번 수행 될 것이다. 그러나, 실험관 내 면역에세이들은 비-침윤성이며, “위험성 (at risk)”이 있는 개체를 스크리닝 할 때와 같이 간암이 발병되기 전 또는 질병의 진행 과정 동안 내내, 환자에서 자가항체 생산의 프로화일을 축적할 필요가 있다고 생각될 때마다 자주 반복 될 수 있다.

그러므로 본 발명은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 간암으로 고통을 받고 있는 개체의 항체 프로화일을 결정하는 실험관 내 방법을 제공하며, 여기서 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, 이 방법은 하기의 단계를 포함 한다:

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하고, 여기서 이 방법은 항체 생산 프로화일을 축적하기 위해 반복된다.

두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원의 판넬 (panels)

본 발명의 어느 특정 실시 양태에서 이 방법들은 두 개 또는 그 이상의 자가항체들을 검출 할 수 있다. 예를 들어, 이 방법들은 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 열 개, 열한 개, 열두 개, 열세 개, 열 네 개, 열다섯 개, 열여섯 개, 열일곱 개, 열여덟 개, 열아홉 개, 스무 개, 스물 한 개, 스물 두 개, 스물 세 개, 스물 네 개, 스물 다섯 개, 스물 여섯 개, 스물 일곱 개, 스물 여덟 개, 스물 아홉 개, 서른 개, 서른 한 개, 서른 두 개, 서른 세 개, 서른 네 개, 서른 다섯 개, 서른 여섯 개, 서른 일곱 개, 서른 여덟 개, 또는 그 이상의 자가항체들을 검출 할 수도 있다. 본 발명의 핵심에 따르면, 자가항체들 중의 하나는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 면역학적으로 특이하다.

이들의 실시 양태들 내에서 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원 및 언급한 자가항체들 중 적어도 한 개에 면역학적으로 특이적인 한 개 또는 그 이상의 더 나아간 종양 마커 항원들을 포함하는 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬과 테스트 샘플을 접촉 시킨다.

이들 방법들은 여기 이후부터는 “판넬 에세이 (panel assays)”로 언급될 수 있다. 그러한 에세이는 일반적으로 단일 종양 마커 항원에 대한 자기면역항체들의 검출 보다 더 민감하며 및 훨씬 낮은 빈도의 의음성 (false negative) 결과를 보여준다 (WO 99/58978, WO 2004/044590 및 WO2006/126008 참조, 이들의 내용이 참고 문헌으로 여기 병합되어 있음).

에세이의 민감도는 다중 자가항체들의 존재를 테스트 함으로서 증가 할 것이라는 것이 일반적으로 수용되고 있다. 그러므로, 어떤 실시 양태들에서는 본 발명의 방법들은 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 열 개, 열 한 개, 열두 개, 열 세 개, 열 네 개, 열 다섯 개, 열여섯 개, 열 일곱 개, 열 여덟 개, 열 아홉 개, 스무 개, 스물 한 개, 스물 두 개, 스물 세 개, 스물 네 개, 스물 다섯 개, 스물 여섯 개, 스물 일곱 개, 스물 여덟 개, 스물 아홉 개, 서른 개, 서른 한 개, 서른 두 개, 서른 세 개, 서른 네 개, 서른 다섯 개, 서른 여섯 개, 서른 일곱 개, 서른 여덟 개, 또는 그 이상의 종양 마커 항원들과 같은 다중 종양 마커 항원들을 포함하는 판넬을 사용하는 것을 고려 한다

판넬 실시 양태는, 자가항체 검출 방법들, 간암 검출 방법들, 간암의 진단 및 치료방법들, 항-간암치료에의 반응을 예측하는 방법들, 및 항원 프로파일을 결정하는 방법을 포함하는 본 발명의 모든 방법들에서 사용될 수 있다는 것을 주목 해야 한다.

어느 특정 실시 양태에서는, 판넬은 뚜렷이 다른 항원인 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들은 포함 할 수 있다. 여기서 “뚜렷이 다른 항원(distinct antigens)” 이란 용어는 다른 단백질들 또는 폴리펩티드들로 부터 유도된 항원 (다른 유전자로부터 암호화 되는 서로 관련이 없는 단백질들로부터 유도된 항원들과 같은)을 포함한다.

본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 뚜렷이 다른 항원들의 두 개 또는 그 이상의 항원 변이체를 포함하는 판넬을 사용하는 방법을 고려한다. “항원 변이체 (antigen varients)” 라는 용어는 여기서는 대립형질(allelic) 또는 위에서 정의 한 대로 단일 단백질 항원과 같은, 단일 항원의 다른 변이체들을 의미 한다. 항원 변이체들은 일반적으로 단일 유전자로부터 유래될 것이며, 및 다른 항원 변이체들은 그 인구집단의 다른 멤버들 또는 다른 질병 상태에서 발현이 될 수 있다. 항원 변이체들은 아마노산 서열이 다르거나 또는 당쇄화 (glycosylation), 인산화 (phosphorylation), 또는 아세틸화(acetylation)와 같은 번역 후 수식이 다를 수 있다. 그외에 추가하여, “항원 변이체” 라는 용어는 아미노산 대체, 삽입 또는 삭제와 같은 항원 돌연 변이들을 포함한다. 일반적으로 항원 변이체는 야생형 항원에 비해 다섯 개 이하의(예를 들어, 네 개 이하, 세 개 이하, 두 개 이하 또는 한 개) 돌연 변이를 포함 할 것이다.

판넬 실시 양태 내에서, “하나 또는 그 이상의 더 나아간 종양 마커 항원들(one or more further tumor marker antigens)”은, 하기에 더 논의 된 대로, 바람직하게는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 면역학적으로 특이한 자가항체가 아닌 다른 자가항체에 대한 면역학적으로 특이한 항원이다. 그러나, 본 발명이 이런 관점에서 제한을 두는 것은 아니라 할 지라도, 본 발명은 이들 네 가지 종양 마커 단백질들 중에 하나에 면역학적으로 특이한 자가항체 및 네 가지 종양 마커 단백질들 중에 두 번째에 면역학적으로 특이한 자가항체를 검출하고, 선택적으로는 네 가지 종양 마커 단백질들 중에 세 번째에 면역학적으로 특이한 자가항체 검출과 조합하고 및 더 나아가 선택적으로 네 가지 종양 마커 단백질들 중에 네 번째에 면역학적으로 특이한 자가항체 검출과 조합하여 검출하는 것을 고려 한다. 동정 된 종양 마커 단백질들의 두 개 또는 세 개에 대한 면역학적으로 특이한 자가항체들이 검출 되는 곳에서는, 두 개 또는 세 개의 종양 마커 단백질들의 모든 조합이 고려 된다. 종양 마커 항원들의 두 개 또는 그 이상의 판넬은 그러므로 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 두 개, 세 개, 또는 네 개의 종양 마커 항원들을 포함할 수 있다. 어느 특정 실시 양태에서는, 이 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함할 수 있다. 더 나아간 특정한 실시 양태에서는, 이 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B로 구성 될 수 있다.

한 실시 양태에서, 종양 마커 항원 두 개 또는 그 이상의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, Cyclin B1, AFP, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원들을 포함 할 수 있다. 이 실시 양태 내에서 이 판넬은 인용된 종양 마커 항원들의 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 열 개, 열한 개, 열두 개, 열세 개, 열 네 개, 열다섯 개, 열여섯 개, 열일곱 개, 열여덟 개, 열아홉 개, 스무 개, 스물 한 개, 스물 두 개, 스물 세 개, 스물 네 개, 스물 다섯 개, 스물 여섯 개, 스물 일곱 개, 스물 여덟 개, 스물 아홉 개, 서른 개, 서른 한 개, 서른 두 개, 서른 세 개, 또는 서른 네 개를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 이 판넬은 또한 MMP9, AIF1, EpCAM 또는 CDKN1B를 포함할 것이며 및 이들 종양 마커 항원들 한 개, 두 개 .세 개 또는 네 개를 포함 할 수 있다. 이들 종양 마커 항원들 두 개 또는 세 개가 판넬에 포함 되어 있는 실시 양태에서는, 이들 항원의 두 개 또는 세 개의 모든 조합이 고려 된다. 특별한 실시 양태들에서는 이 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서는 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성 될 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1로 구성 될 수 있다.

더 나아간 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서는 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L로 구성 될 수 있다.

아직도 더 나아간 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2 를 포함 할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2로 구성 될 수 있다.

아직도 더 나아간 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1를 포함 할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1로 구성 될 수 있다.

아직도 더 나아간 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin)을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성 될 수 있다.

어느 특정 실시 양태들에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 그 대상의 성별, 즉 그 대상이 남성 또는 여성 인지에 따라 다를 수 있다. 이 실시 양태 내에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 그 대상이 여성일 때 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1, 또는 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하거나 또는 이들로 구성 될 수 있다. 더 나아가 이 실시 양태 내에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 그 대상이 남성일 때 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L, 또는 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1를 포함하거나 또는 이들로서 구성 될 수 있다.

한 특정 실시 양태에서, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 판넬은 또한 MMP9, AIF1, EpCAM 또는 CDKN1B를 포함할 것이며, 및 이들 종양 마커 항원 한 개, 두 개, 세 개 또는 네 개를 포함할 수 있다. 종양 마커 항원 두 개 또는 세 개가 판넬에 포함된 실시 양태에서는, 이들 항원 두 개 또는 세 개의 모든 조합이 고려 된다.

특정 실시양태에서는 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함할 수 있다. 예를 들어, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentine), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactin, RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1를 포함 할 수 있다.

특정 실시양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentine), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactin, RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성 될 수 있다.

한 특정 실시양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1를 포함 할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1로 구성 될 수 있다.

한 특정 실시양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP 를 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP로 구성될 수 있다.

추가 스크리닝 단계

본 발명의 어떤 실시 양태에서는, 본 발명의 방법들은 더 나아가 간암과 연관된 추가 마커의 스크리닝을 포함할 수 있다. 이 실시 양태 내에서는 간암과 연관 되었다고 알려진 어떤 마커도 스크리닝 하는 어떤 방법도 고려 된다.

예를 들어, 이 방법은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 알파-태아 단백질(alpha-fetoprotein) (AFP), 데스-감마 카복시프로트롬빈 (des-gamma carboxyprothrombin) (DCP) 또는 렉틴-반응성 알파-태아 단백질(lectin-reactive alpha-fetoprotein) (AFP-L3)의 검출을 더 나아가 포함 할 수 있다. 바람직하게는 체액은 혈액이다. 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 알파-태아 단백질(alpha-fetoprotein) (AFP)을 더 나아가 검출하는 방법의 실시 양태에서, 체액은 바람직하게는 혈액이며 및 절단값(cut-off) 200ng/ml은 바람직하게는 양성으로의 평가가 적용된다.

항원 적정(antigen titration)

WO2006/126008 (이의 내용이 참고 문헌으로 병합 됨)에서, 질병의 생물학적 마커로서 자가항체를 검출하는 것에 근거한 에세이의 수행은, 및 좀 더 특별하게는 임상적인 유용성 및 신뢰성은, 항원 적정 단계 (antigen titration step)를 포함 함으로써 현저하게 개선 될 수 있다는 것이 결정 되었다. 자가항체를 함유하고 있다고 의심되는 샘플을 각각 다른 양의 항체를 가지고 있는 시리즈에 대해 테스트 하고 및 적정 곡선을 만들어서 샘플에 존재하는 자가항체의 절대 양과는 독립적으로 진정한 양성 스크리닝 결과를 신뢰 할 수 있게 동정하는 것이 가능하다. WO2006/126008의 항원 적정 방법은, 단일 항원 농도에 대한 자가항체의 활성도를 측정하거나, 또는 항원이 아니고 혈청 샘플이 적정 되는 것보다, 더 큰 특이성 및 민감성을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 그러므로 다른 양으로 종양 마커 항원이 복수로 제공 되는 방법을 고려 하며, 및 여기서 그 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 테스트 샘플을 다른 양의 종양 마커 항원으로 복수로 접촉시키고;

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합된 종양 마커 항원의 복합체의 유무를 측정하고;

(c) 종양 마커 항원과 자가항체 사이의 특이적인 결합의 양을 검출하고;

(d) 특이적인 결합의 양 대비 (a) 단계에서 사용된 종양 마커 항원 각 양에 대한 종양 마커 항원 양의 커브를 플럿팅 (plotting)하거나 계산 하고; 및

(e) 사용된 각 종양 마커 항원 양에서 자가항체와 종양 마커 항원 사이의 특이적인 결합의 양에 근거한 자가항체의 유무를 측정한다.

실제로 종양 마커 항원의 다른 양은 일반적으로 사용된 종양 마커 항원의 농도를 변경시켜 제공 된다. 그러므로, “다른 양(different amount)” 및 “다른 농도 (different concentration)”란 용어는 서로 바꿔서 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위 내에서, 종양 마커 항원의 양을 변경하는 어느 방법도 고려 된다. 숙련된 독자들은 본 발명의 방법에서 타겟 자가항체에 결합하는 항원결정성 또는 에피톱의 양은 적정 시리즈(즉, 다른 양으로 제공되는 항들의 셋트)를 확립하는 데 중요하다는 것을 알것이다. 많은 에세이 형태들에서 결합에 유효한 항원 결정성 또는 에피톱의 양은 존재하는 항원 분자의 양과 직접적으로 관련이 있다. 그러나, 어떤 고체 상 에세이 시스템과 같은 다른 실시양태들에서는, 노출된 항원 결정성 또는 에피톱의 양은 항원의 양과 직접적으로 관련이 있지 않을 수도 있으며 고체 표면에 부착 및 구조적인 표현(conformational presentation)과 같은 다른 인자들에 의존 할 수도 있다. 이러한 실시양태들에서는, 적정 시리즈에서 “다른 양의 항원(different amount of antgen)”의 참조는 여기서는 다른 양의 항원 결정성 또는 에피톱의 양을 의미하는 것으로 간주 할 수 있다. 특정한 실시 양태들에서, 항원의 양의 변화는 샘플이 테스트 되는 항원 또는 에피톱의 밀도를 변경하거나, 또는 항원 또는 에피톱의 밀도는 유지하지만 항원이 고정화되는 표면 면적을 증가 시키거나, 또는 양쪽 모두를 통해 달성 시킬 수 있다.

이 실시 양태 내에서, “항원 셋트 (set of antigens)”는 본 발명의 방법에서 테스트 될 한 가지 항원의 다른 양들을 의미 한다.

다중의 항원들이 고려되는 실시양태들에서는, “뚜렷이 다른 항원들의 셋트 (set of distinct antigens)”는 본 발명의 방법에서 다른 양으로 테스트 될 단일 항원을 의미하며, 여기서 각 항원은, 상기 서술된 대로, 다른 단백질들 또는 폴리펩티드들로 부터 유래된 (다른 유전자들에 의해 암호화 되는 서로 관련이 없는 단백질들로부터 유래된 항원과 같은) “뚜렷이 다른 항원(distinct antigen)”이다. 주어진 마이크로어레이(microarray)는 다른 단백질들 또는 폴리펩티드들로 부터 유래된 뚜렷이 다른 항원들의 셋트를 전적으로 포함하거나, 또는 단일 단백질 또는 폴리펩티드의 다른 펩티드 에피톱으로부터 유래된 뚜렷이 다른 항원들의 셋트를 전적으로 포함하거나, 또는 어느 비율로 이 두 가지의 혼합을 포함 할 수 있다. 본 발명의 어느 실시양태에서, 다른 양의 항원들의 각 개별적인 셋트는 일반적으로 하나의 항원만을 포함하며 이들의 혼합은 아닌 것임을 주목 하여야 한다.

항원 변이체 셋트는 본 발명의 방법에서 다른 양으로 테스트 될 단일 항원의 변이체를 의미한다.

어느 특정 실시양태에서는, 자가항체의 유무는 사용된 종양 마커 항원의 모든 양에 특이적으로 결합하는 양의 집합적인 값에 근거하여 결정 할 수 있다. 본 발명의 방법들 동안 자가항체와 항원 사이의 특이적 결합의 상대적 또는 절대적 양은 테스트 된 각 다른 양의 항원(항원 결정성 또는 에피톱)에 대하여 측정되며 및 테스트된 항원의 각 양에 대한 특이적 결합의 양 대비 항원의 양 (상대적 또는 절대적)의 커브를 플럿 하거나 또는 계산 하는데 사용된다. 에세이에서 사용된 항원에 반응하는 자가항체의 테스트 샘플에서의 존재는 각 항원의 양에서 특이적으로 결합하는 양에 근거하여 결정 되며 및 일반적으로 용량-반응 커브(dose-response curve), 전형적으로 S-모양 또는 시그모이달 커브(sigmoidal curve), 로 제시 된다. 그러므로, 어떤 실시 양태에서는 자가항체의 유무는 일반적으로 S-모양 또는 시그모이달 커브(sigmoidal curve)와 같은 용량 반응 커브의 존재에 대한 플럿을 스크리닝 하여 결정 된다. 만약 테스트 한 각 다른 양의 항원에 대하여 검출될 만한 양의 변화가 없으면 그 때는 검출 될 만한 양의 자가항체가 없는 것으로 점수 매길 수 있다.

한 실시양태에서, 자가항체의 유무는 자가항체와 항원 사이의 특이적인 결합의 양과 미리-결정된 절단 값과 비교하여 결정 된다. 여기서, 특이적인 결합의 양 대비 적정 시리즈에서 사용된 각 항원에 대한 항원의 양의 커브가 플럿 되며, 및 알려진 양성 샘플들(예를 들어, 질병을 지닌 환자들의 집단)에서의 결합 수준은 알려진 음성 샘플들 (예를 들어, 정상 개체)에서 관찰된 결합 수준과 케이스-대조군 (case-control) 연구에서 비교된다. 적정 곡선의 하나 또는 그 이상의 포인트에서 자가항체 결합에 대한 절단-값은 민감도를 최대로 하고(의음성이 거의 없음) 반면에 높은 특이성(의양성이 거의 없음)을 유지하도록 선택된다. 특이적 결합의 양 대비 적정시리즈에서 사용된 각 항원의 양에 대한 항원의 양이 용량-반응 커브일 때, 만약 적정 커브의 하나 또는 그 이상 포인트에서 결정한 특이적 결합의 양이 미리-결정된 절단지점 (cut-off point) 값 보다 위이면 그 측정은 양성으로 간주 된다. 어떤 실시양태에서는 미리-결정된 절단지점은 가장 큰 유덴값 (Youden's value)을 주며 특이성은 90% 이상으로 유지하는 절단값을 선택하여 결정 될 수 있다

항원 적정 실시 양태는 자가항체 검츨 방법들, 간암을 검출하는 방법들, 간암을 진단 및 치료하는 방법들, 항-간암치료에의 반응 예측 방법들 및 항체 프로화일 결정 방법을 포함하는 본 발명의 모든 방법들이 사용 될 수 있음을 주목하여야 한다. 추가로, 항원 적정은 단일 자가항체만 검출된 실시양태에서는 물론 다중 자가항원들을 검출하기 위하여 항원 판넬이 사용된 실시양태에서도 사용 될 수 있다.

이중 절단 (double cut-off)

에세이의 민감도는 다중 항원에 대한 자가항체를 측정하면 증가 할 것이라는 것이 일반적으로 받아 들여지고 있다. 그러나, 이 증가된 민감도는 보통 특이성의 비례적 감소와 연관이 있으며, 그러므로 에세이 방법들은 사용될 수 있는 항원들의 수가 제한 될 수 있다. 어느 특정 실시 양태에서 본 발명은 자가항체와 항원 사이의 특이적 결합의 수준을 결정하고 및 계량적 분석의 절단 값에 비교하여 이들 수치 두 개 모두가 양성으로 분류 될 때만 테스트 결과가 양성이라고 제 2차 곡선 매개변수(parameter)를 평가 하는 항원 적정 방법을 사용함으로서 특이성 감소의 원인이 될 수 있다. 이 방법은 여기서는 '이중 절단 (doublecut-off)” 방법 이라고 언급 할 것이며 및 WO2015/193678 에 완전히 서술 되어 있다 (그 내용이 참고 문헌에 병합 되어 있음).

어떤 실시 양태에서는 본 발명의 방법들은 하기 단계들을 더 포함한다:

(d1) (c) 단계에서 플럿 되거나 또는 계산된 곡선 (curve)으로부터 제 2차 곡선 매개변수(parameter)를 계산하고; 및

(e)하기의 조합에 근거하여 자가항체의 유무를 결정한다:

(i) 단계 (b)에서 결정한 자가항체와 종양 마커 항원 (d1) 사이의 특이적 결합의 양; 및

(ii) (d1) 단계에서 결정한 제 2차 곡선 매개변수(parameter).

이중 절단 방법은 상기 서술된 항원 적정 방법을 사용한다. 적정 시리즈에서 사용된 항원의 각 양에서 항원/자가항체의 결합의 양을 검출하고, 및 적정 시리즈에서 사용된 항원의 각 양에서 특이적 결합의 양 대비 항원의 양에 대한 곡선을 플럿팅 한 후에, 제 2차 곡선 매개변수가 계산된다. 제 2차 곡선 매개변수는 직선 또는 로그 회귀곡선 (regression curve)으로 부터 결정 된다. 여기서 제 2차 곡선 매개변수는 어느 계산 된 값이며 이는 곡선의 성질을 가리킨다. 예를 들어, 제 2차 곡선 매개변수는 기울기, 절편(intercept), AUC, 최대기울기(SlopeMax), 또는 해리항수(kd) 일 수 있다. 이러한 제 2차 곡선 매개변수가 도표 1 에 보여 주고 있다.

기울기는 다음 방정식을 사용하여 계산된다:

상기 b 는 기울기(slope), X는 항원 농도 (nM), 및 y 는 흡수 단위(absorbance units)의 OD 값을 의미 한다.

기울기는 각 샘플에 대하여 직선 또는 로그 회귀 곡선으로부터 계산 될 수 있거나, 또는 직선 및 로그 회귀 곡선 둘 다 로부터 계산 될 수 있다.

회기 선의 절편은 x=0 일 때 y-축에서의 선 값이다.

절편은 각 샘플에 대하여, 직선 또는 로그 회귀 곡선 (regression curve)으로 부터 계산 되거나, 또는 직선 및 로그 회귀 곡선 둘 다 로부터 계산 될 수 있다.

AUC 는 합친 부등변사각형 법칙 (trapezoid rule)을 사용하여 계산 될 수 있으며, 하기의 공식에 따라 각 항원 농도 셋트 사이에 정적분 (definite integral)을 추정하여 달성 할 수 있다:

이 계산은 각 연속적인 항원 농도의 쌍에 대해 반복하고 및 결과의 값은 합쳐서 AUC의 총 값을 얻는다.

AUC 는 각 샘플에 대하여, 직선 또는 로그 회귀곡선 (regression curve)으로부터 계산 되거나, 또는 직선 및 로그 회귀곡선 둘 다 로부터 계산 될 수 있다.

최대 기울기 (SlopeMax)는, 상기 논의된, 기울기(Slope)와 같은 공식을 사용하여 계산 될 수 있다. 그러나 각 샘플에 대한 기울기의 가능한 최대 값을 결정하기 위하여, 기울기 값은 각 연속적인 항원 농도의 쌍에 대해 얻으며, 가장 큰 정도의 기울기 값은 최대 기울기 (SlopeMax)를 나타낸다.

최대 기울기는 각 샘플에 대하여, 직선 또는 로그 회귀 곡선 (regression curve)으로부터 계산 되거나, 또는 직선 및 로그 회귀 곡선 둘 다 로부터 계산 될 수 있다.

해리 항수 (Dissociation constant) (Kd)는 4 가지 매개변수(parameter) 지수함수 (logistic curve)를 각 적정 점의 셋트에 맞추어 계산할 수 있으며 및 F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D 공식을 사용하여 반복적 해결 방법을 사용하여 최소 점근선 (minimal asymptote)(A), 기울기 인자(slope factor) (B), 변곡점 (inflection point) (C) 최대 점근선(maximum asymptote)(D) 매개변수(parameter) 값을 얻으며, 여기서 잔차제곱(squared residual) 합은 최소화 된다. 이 해결된 데이터의 변곡점이 항원/항체 결합의 Kd 에 해당한다.

어떤 실시양태들에서는 제2차 곡선 매개변수는, 4 매개변수 지수 곡선과 같은, 지수 곡선을 적정 시리즈에서 사용된 각 항원에 대한 특이적 결합 대비 항원 양의 곡선에 맞추어 결정 할 수 있다. 이 실시 양태에서는 제2차 곡선 매개변수는 최대 점근선, 최소 점근선, 힐 기울기 (Hill slope) (또는 기울기 인자), 또는 변곡점 이 될 수 있다.

4 가지 매개변수 지수(4PL) 곡선은 하기 공식으로 정의 된다:

F(x) = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D,

여기서 A=최소 점근선, B=힐 기울기 (또는 기울기 인자), C=변곡점 및 D=최대 점근선.

이 실시양태에서 제 2차 곡선 매개변수(parameter)를 결정하기 위해 4PL 곡선이 각 샘플 및 항원에 대해 반복적 해결 기능을 사용하여 계산 된다. 여기서 4 매개변수(parameter)들은 각 각 다음의 제한을 가지면서 예상된 값에 가까운 값으로 셋트 된다: .최소 점근선은 0에 고정 시키고, 힐 기울기(Hill slope) 값은 양성 값으로 제한하고, 및 변곡점은 최대값 1000으로 제한 한다.

적정 곡선의 각 포인트 및 4PL 곡선 상의 해당하는 포인트 사이의 차이 (F(x) = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D 공식으로 되돌아옴))는 그 후 계산 될 수 있으며, 차를 제곱하고 및 차이 제곱의 모든 값은 합친다.

4 가지 2 차 곡선 매개변수들에 사용된 값들은 그 후 조정되고 및 제곱 평균의 합이 반복적인 방식으로 제곱의 평균이 가능한 0 에 가까울 때까지 반복적으로 계산 된다. 반복적 해결은 마이크로소프트 엑셀의 솔버 기능 (Microsoft Excel’s SOLVER function)을 사용하여 수행 될 수 있다.

일단 제 2 차 곡선 매개변수가 얻어진 후 자가항체의 유무를 결정하기 위하여 항원/자가항체 결합 데이터와 병합될 것이다. 여기서, 자가항체와 항원 사이의 특이적 결합은 상기 서술된 것과 같은 미리 결정된 절단 값과 비교 될 것이다.

제 2 차 곡선 매개변수의 절단 값은 알려진 양성 샘플 ((예를 들어, 질병을 가지고 있는 환자 코호트로 구성된 케이스-대조군(case-control) 샘플 셋트의 셋트)) 및 알려진 음성 샘플 (예를 들어, 케이스-대조군 연구에서 정상 개인들의 코호트)을 사용하여 결정된다. 각 샘플에 대하여 적정 시리즈에 사용된 각 항원의 양에 대한 특이적 결합 대비 항원 양의 곡선이 플럿 되고, 및 알려진 양성 샘플 (예를 들어 질병을 지닌 환자)에서 관찰된 제 2 차 곡선 매개변수를 알려진 음성 샘플 (예를 들어 정상 개인)에서 관찰된 제 2 차 곡선 매개변수와 비교 한다. 제 2 차 곡선 매개변수의 절단 값은 상기 논의 된 항원/자가항체 결합에 대한 절단 값과 병합하여 사용 될 때 특이성이 최대화 되게 (의양성이 거의 없게) 선택된다.

제 2 차 곡선 매개변수의 절단 값을 계산할 때, 양성적 읽기 (positive reading)가 요구되는 방향성(directionality)이, 즉 절단 값 위 또는 아래의 값이 양성으로 간주 되든 아니든, 또한 결정된다. 양성적 읽기가 요구되는 방향성은 항원 및 제 2 차 곡선 매개변수에 의존할 것이다.

만약 항원/자가항체 결합이 절단 값 위이며 제 2 차 곡선 매개변수에 대한 절단 값과 비교하여 양성적 읽기에 요구되는 방향성을 모두 보이면 측정은 궁극적으로 양성으로 간주 된다, 즉 테스트 샘플에 자가항체의 존재를 제시한다.

더 나아가 WO2015/193678 (그 내용이 참고문헌에 병합되어 있음)에 서술된 대로, 에세이 방법에서 제 2 차 곡선 매개변수의 포함은 면역 에세이의 특이성을 증가시켜, 테스트 샘플에 있는 자가항체 사이의 특이적 결합의 양 만에 근거하는 다른 방법과 비교 하여, 양성 예측 값(Positive Predictive Value)을 증가 시킨다 (PPV).

여기 포함된 이중 절단 방법의 서술이 항원/자가항체 결합 양의 측정과 조합하여 단일 제 2차 곡선 매개변수를 사용하는데 초점을 두었다 하더라도, 다중의 제 2차 곡선 매개변수도 고려 된다는 것이 이해 되어야 한다. 그러므로, 어느 실시 양태에서는 본 발명의 방법들은 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 또는 그 이상의 제2차 곡선 매개변수를 사용한다.

이중 절단 방법 (double cut-off method)은 존재하는 타겟 자가항체의 절대적인 양 및 타겟 자가항체가 없는 데서 관찰 된 결합의 수준이 환자 대 환자 마다 매우 크게 다를 수 있는 곳에서 임상적 진단, 예후적, 예측 및/또는 모니터링 에세이에 사용 데 유리하다. 만약 그러한 에세이가 단일 양/농도의 테스트 항원을 사용하여 자가항체의 결합을 검출하는데 근거한다면, 인구 집단 중에서 정상적인 생리학적인 범위의 자가항체의 양의 아주 낮거나 또는 아주 높은 끝 쪽에 있는 자가항체를 함유하고 있는 환자 샘플들은 에세이 방법의 한계 때문에 놓칠 수 있다; 낮은 양의 자가항체를 가진 샘플은 의음성의 결과로 스코어 될 수 있으며, 반면에 아주 높은 수준의 자가항체를 가진 샘플은 선택된 에세이 방법 내에서 정확한 검출의 범위 밖 일수 있다. 제 2차 곡선 매개변수의 계산과 조합하여 적정 방법을 사용하는 것이 자가항체 수준의 차이 및 관찰된 결합 수준의 차이를 가져 오게 할수 있다.

이중 절단 실시 양태는 자가항체 검출 방법들, 간암 검출 방법들, 간암의 진단 및 치료 방법들, 항-간암 치료에의 반응을 예측하는 방법들 및 항체 프로화일을 결정하는 방법들을 포함하는 본 발명의 모든 방법들과 사용될 수 있다는 것을 주목해야 한다. 추가로, 이중 절단 방법은 단지 단일 자가항체가 검출된 실시 양태는 물론 다중 자가항체를 검출하기 위해 항원 판넬이 사용된 실시 양태에서도 사용될 수 있다. 판넬 실시양태에서 판넬 내의 각 항원에 대하여 계산된 제2차 곡선 매개변수는 똑 같을 필요가 없다는 것을 주목 해야 한다. 그러나, 어떤 실시 양태에서는 판넬 내의 각 항원에 대하여 계산된 제2차 곡선 매개변수는 같을 수 있다.

에세이 포멧 (Assay formats)

면역에세이(immunoassays)들, 예를 들어 ELISA, 방사성면역에세이 (radioimmunoassay) 및 이와 비슷한 것들의 일반적인 양상은 이 분야 통상 전문가들에게는 잘 알려져 있다 (Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996, 참조, 이의 내용이 여기 참고문헌에 병합 되어 있음).

특정한 면역학적인 특이성을 가지는 자가항체의 검출에 대한 면역에세이는 해당하는 자가항체와 특이적인 면역학적 반응을 보이는 시약 (항원)의 사용을 필요로 한다. 에세이 포멧(format)에 따라 이 항원은 고체 지지대(solid support) 에 고정 시킬 수 있다. 테스트 샘플을 항원에 접촉하도록 하고 및 만약 요구되는 면역학적 특이성을 가진 자가항체가 샘플에 존재 한다면 이들은 항원과 면역학적으로 반응하여 항원/자가항체 복합체를 형성 할 것이며 이는 그 후 검출 되거나 또는 정량적으로 측정 될 수 있다.

본 발명의 방법들은 자가항체를 함유한다고 의심되는 테스트 샘플과 항원 사이에 접촉을 가능하게 하는 어떠한 적절한 포멧 (format)으로도 수행될 수 있다. 편리하게는, 테스트 샘플과 항원 사이의 접촉은 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plate)의 웰 (well)과 같은 분리된 반응 챔버(reaction chambers)에서, 다른 항원들 또는 필요하다면 에세이 할 다른 양의 항원을 평행하게 접촉하게 하여, 일어 나게 할 수 있다. 여러 다른 양의 항원이 요구되는 실시 양태들에서, 이들은 항원 스톡 용액 (stock solution)으로부터 마이크로타이터 플레이트의 웰에 걸쳐 연속적인 희석(serial dilution)액으로 제조하여 마이크로타이터 플레이트의 웰에 코팅 시킬 수 있다. 항원의 스톡 용액은 알려진 또는 알려지지 않은 농도 일 수 있다. 그 후 테스트 샘플의 일정량(aliquot)을, 각 웰의 부피 및 테스트 샘플의 희석을 일정하게 하면서, 플레이트의 웰에 첨가 시킨다. 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가 되는 항원의 절대적인 양은, 이 분야 통산 전문가들에 의해 인지될 것인 것처럼, 타겟 자가항체의 성질, 테스트 샘플의 성질, 테스트 샘플의 희석 등등과 같은 인자들에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 항원의 양 및 테스트 샘플의 희석은 그 방법에서 항원/자가항체 결합을 검출하는데 선택된 수용 가능한 검출 범위의 판독 내에 있는 신호 강도 범위를 생산하도록 선택된다. 편리하게는 항원의 테스트 된 양은1.6nM 에서 160mM 의 범위로 다를 수 있다.

본 발명의 더 나아간 실시 양태에서 항원은 고체 지지대의 분리된 부위 또는 반응 부위에 고정 시킬 수 있다. 다른 양의 항원이 요구 되는 실시 양태에서는, 이들은 각 각 고체 지지대의 분리된 부위 또는 반응 부위에 고정 시킬 수 있다. 그 후 전체 지지대를 테스트 샘플과 접촉 되도록 하고 자가항체의 항원에 결합은 각 분리된 부위 또는 반응 부위에서 분리하여 검출 또는 측정 될 수 있다. 적절한 고체 지지대에는 마이크로어레이(microarray)를 포함한다. 여러 다른 양의 항원이 요구되는 곳에서는, 마이크로어레이(microarray)는 한 특별한 항원의 다른 양들을 마이크로에레이 상에 분명히 다른, 분석 가능한 반응 부위에 고정시켜 제조 될 수 있다. 다른 실시 양태들에서는 고정시킨 항원 분자의 실제 양은 상당히 일정하게 유지 시킬 수 있으나, 에레이 상의 부위 또는 스폿 (spot)의 크기는 가능한 결합 에피톱의 양을 변경시켜, 다른 양의 가능한 결합 에피톱을 가진 부위나 스폿의 적정 시리즈를 제공하게 하기 위하여 다양 할 수 있다. 그러한 실시 양태들에서 항원의 절대적인 양 보다는, 결합 에피톱(들)의 2차원적인 표면 농도가 적정 시리즈를 제조하는데 중요하다. 단백질/펩티드 마이크로어레이의 제조 및 질문(interrogation) 기술은 이 분야에서 일반적으로 알려져 있다.

마이크로어레이는 단일 샘플에 대하여 다른 특이성을 가진 자가항체의 다중 에세이를 평행하게 수행하는데 사용될 수 있다. 이는 다중 항원 또는 항원 셋트로 구성된 어레이를 사용하여 할 수 있다.

어떤 항원들은 이것에만 국한 하지는 않으나, 환자 조직들 또는 체액 ((예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈 (whole blood), 뇨, 땀, 림프액, 대변(faeces), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복수(ascites fluid), 흉막삼출액(pleural effusion), 정액(seminal fluid), 가래(sputum), 유두액(nipple aspirate), 수술-후 혈청종 (post-operative seroma) 및 상처 배액 (wound drainage fluid)) 으로 부터 분리된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는, 자연적인 소스로부터 분리 된 단백질 또는 폴리펩티드로 구성되거나 또는 유래를 될 수 있다. 그러한 실시 양태들에서 항원은 상당히 자연적으로 일어나는 모든 단백질, 즉, 자연적인 소스로부터 분리된 형태 대체로의 단백질을 포함하거나, 또는 자연적으로 일어나는 단백질의 조각을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 항원으로서 효과적이기 위해 어떤 그러한 조각은 테스트에 사용될 자가항체와 면역학적인 반응성을 유지하여야만 한다. 적절한 조각들은, 예를 들어, 분리된 단백질을 화학적인 또는 효소적인 분열로 제조 될 수 있다.

어떤 실시양태들에서, 및 이것이 사용될 에세이의 정확한 성질에 따라, 항원은 자연적으로 일어나는 단백질을 포함하거나, 또는 단백질에는 자연적으로 존재 하지 않는 어떤 바람직한 성질을 주는 하나 또는 그 이상의 더 나아간 분자들에 연결된 이의 조각을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 조각은, 예를 들어 형광 라벨, 색소 라벨, 발광 라벨, 방사성 라벨과 같은 보여주는 라벨, 또는 콜로이드성 금과 같은 중금속에 결합시킬 수 있다. 다른 실시 양태들에서는 단백질 또는 조각은 재조합적으로 생산되는 융합 단백질로 발현 되게 할 수 있다. 예로서, 융합 단백질들은 재조합적으로 발현 되는 항원의 정제를 도와 주기 위해 N-말단 또는 C-말단에 표지 펩티드(tag peptide)를 포함 할 수 있다.

항원이 사용되는 에세이 포멧에 따라 항원은, 예를 들어, 칩(chip), 슬라이드(slide), 마이크로타이터 웰, 비드(bead), 멤브레인(membrane), 또는 나노입자(nanoparticle)와 같은 고체 지지대에 고정 시킬 수 있다. 고정화는 비-공유적 흡착, 공유적 부착 또는 표지(tag)를 통해 효과적일 수 있다.

이 수단이 항원이 면역학적으로 타겟 자가항체와 반응하는 능력에 부정적인 영향을 주지 않는 한 적절한 부착 수단이 사용될 수 있다.

본 발명은 고체 상 에세이에만 국한 하지는 않고, 전체 또는 부분적으로, 액체상에서, 예를 들어, 용액 상 비드 에세이(bead assay) 또는 경쟁 에세이 (competition assay)에서, 수행되는 에세이도 또한 포함 된다.

한 실시 양태에서, 항원들은 바이오틴(biotin)과 같은 고정을 촉진 시키는 리간드(ligand)로 라벨 될 수 있다. 항원은 그 후 적절한 적정 범위로 희석 시킬 수 있으며 및 용액에서 환자 샘플에 있는 자가항체와 반응하도록 할 수 있다. 결과로 얻어지는 면역 복합체는 그 후 리간드-수용체 상호작용(예를 들어 바이오틴(biotin)-스트랩타비딘(streptavidin)을 통하여 고체 지지대에 고정시킬 수 있으며 및 에세이 나머지 부분은 하기 서술된 대로 수행 될 수 있다.

본 발명의 에세이 방법에 사용된 바이오틴화된 항원의 생산을 촉진 하기 위하여, 전장 항원을 암호화하는 cDNA, 이의 절단된 형태 또는 이의 항원성 조각은, 예를 들어 효소 반응을 통하여, 바이오틴 보조 인자가 부착 될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드 지표로 라벨 된 융합 단백질로서 발현 될 수 있다.

재조합 바이오틴화된 항원의 생산을 위한 벡터들은 여러 소스로부터 상업적으로 구할 수 있다. 다른 한편으로는, 바이오틴화된 항원들은 발현 및 정제 후에 항원 분자에 바이오틴을 공유결합으로 연결시켜 생산 할 수 있다.

앞에서 언급된 대로, 본 발명에 따른 자가항체 검출에 사용되는 면역에세이는 이 분야에서 알려진 표준 기술에 근거 할 수 있다. 가장 바람직한 실시 양태에서 면역에세이는 ELISA 일 수 있다. ELISA는 이 분야에서 일반적으로 잘 알려져 있다. 전형적인 간접적인 ELISA에서 테스트 하에 있는 자기면역항체에 특이성을 갖는 항원은 고체 표면 (예를 들어, 표준 마이크로타이터 에세이 플레이트의 웰, 또는 마이크로비드 또는 마이크로에레이의 표면)에 고정 시키며 및 자가항체의 존재를 테스트 할 체액을 포함하는 샘플이 고정된 항원과 접촉 되도록 한다. 샘플에 존재하는 바람직한 특이성의 어느 자가항체들은 고정된 항원에 결합할 것이다. 결합된 항원/자가항체 복합체는 그 후 적절한 어느 방법을 사용하여 검출 될 수 있다. 한 바람직한 실시 양태에서, 인간 면역글로빈의 하나 또는 그 이상의 부류에 공통인 에피톱을 특이적으로 인식하는, 라벨 된 2 차 항-인간 면역글로빈 항체가 항원/자가항체 복합체들을 검출하는데 사용된다. 전형적으로 제 2차 항체는 항-IgG 또는 항-IgM 일 것이다. 제 2차 항체는 보통 검출 가능한 마커, 전형적으로 예를 들어, 퍼옥시데이즈(peroxidase) 또는 알카라인 포스파테이즈 (alkaline phosphatase)와 같은 효소 마커로 라벨 되며, 예를 들어 색이 있거나, 화학적 발광, 또는 형광 생산물과 같은 검출 가능한 생산물을 생성시키는 효소에 대한 기질을 첨가시켜 정량적으로 검출이 되도록 한다. 이 분야에서 알려진 다른 타입의 검출 가능한 라벨도 같은 효과를 가지며 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 적용(Applications of the method of the invention)

본 발명은 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커로 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출하여 포유류 대상에서 간암을 검출하는 방법의 용도로 제공하며, 이의 방법은 하기의 단계로 구성된다:

(b) 테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정 한다;

이로서 언급된 복합체의 존재는 간암이 있음을 제시한다.

본 발명의 이 실시 양태 내에서 본 발명의 여러 가지 방법들과 관련되어 상기 논의 된 모든 제한들은 이의 용도와 관련하여 고려 된다.

본 발명에 따른 에세이 방법들은 여러 다른 임상적 경우에 적용될 수 있다. 특히, 본 방법은 간암의 검출 또는 진단, 간암으로 진단된 환자의 진행을 평가하고, 치료에 대한 반응을 예측하고, 환자에서 간암의 진행을 모니터 하고, 간암의 존재를 진단하기 위해 증상이 없는 사람 대상 집단을 스크리닝 하고, 항-간암 치료 ((예를 들어, 화학요법치료, 고주파절제 (radiofrequency ablation), 간 절제 (liver resection), 간 이식(liver transplant), 백신주사(vaccination), 항-성장인자 또는 신호 전달 치료 (anti-growth factor or signal transduction therapies), 내분비계 치료(endocrine therapy), 인간 항체 치료 (human antibody therapy), 케테터경유 동맥 화학색전술 (transcatheter arterial chemoembolization), 경피적 에탄올 주사(percutaneous ethanol injection), 마이크로웨이브 삭마 (microwave ablation), 소라훼닙 투여 (sorafenib administration) 및 방사성색전술 (radioembolisation)) 에 대한 간암 환자의 반응을 예측하고, 항-간암 치료 (예를 들어 화학요법치료, 고주파절제, 간 절제 간 이식, 백신주사, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 내분비계 치료, 인간 항체, 케테터경유 동맥 화학색전술, 경피적 에탄올 주사, 마이크로웨이브 삭마, 소라훼닙 투여, 및 방사성색전술)에 대한 간암 환자의 반응을 모니터링 하고, 전에 간암을 지닌 것으로 진단 되어 존재 하는 간암을 줄이기 위해 항-간암 치료를 거친 환자에서 질병의 재발을 검출하고, 특별한 환자에 사용 하기 위해 항-간암 치료 (예를 들어, 화학요법치료, 고주파절제, 간 절제 간 이식, 백신주사, 항-성장인자 또는 신호 전달 치료, 내분비계 치료, 인간 항체, 케테터경유 동맥 화학색전술, 경피적 에탄올 주사, 마이크로웨이브 삭마, 소라훼닙 투여, 및 방사성색전술) 를 선택하거나 또는 간암을 지녔거나 또는 지닌 것으로 의심되는 환자의 항체 프로화일을 측정하는데 사용된다.

키트(Kits)

본 발명은 본 발명의 어느 한 가지 방법을 수행하는 데 적절한 키트를 포함하며, 상기 키트는 하기를 포함한다:

(a) 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원; 및

(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합하는 종양 마커 항원 복합체를 검출할 수 있는 시약.

이 발명은 또한 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 하기를 함유하는 자가항체를 검출하는 키트를 포함한다:

(a) MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원; 및

어떤 실시 양태들에서는 키트는 더 나아가 하기를 포함한다:

(c) 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플과 종양 마커 항원이 접촉하는 수단.

종양 마커 항원이 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플과 접촉하는 수단의 예시들에는 종양 마커 항원을 칩, 슬라이드, 마이크로타이터 플레이트의 웰, 비드, 멤브레인 또는 나노입자에 고정시키는 것이 포함된다.

어느 실시 양태에서는 키트 내의 종양 마커 항원은 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬 내에 존재 할 수 있다. 이 실시 양태 내에서 키트는 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 열 개, 열한 개, 열두 개, 열세 개, 열 네 개, 열다섯 개, 열여섯 개, 열일곱 개, 열여덟 개, 열아홉 개, 스무 개, 스물 한 개, 스물 두 개, 스물 세 개, 스물 네 개, 스물 다섯 개, 스물 여섯 개, 스물 일곱 개, 스물 여덟 개, 스물 아홉 개, 서른 개, 서른 한 개, 서른 두 개, 서른 세 개, 서른 네 개, 서른 다섯 개, 서른 여섯 개, 서른 일곱 개, 서른 여덟 개, 또는 그 이상의 항원들을 포함 할 수 있다. 이들 항원들은 뚜렷이 별개인 항원일 수 있으며, 상기 뚜렷이 별개의 항원은 다른 단백질들 또는 다른 폴리펩티드들로부터 유래 된 것 (다른 유전자들에 의해 암호화 되는 서로 관련 없는 단백질들로부터 유래한 항원과 같은) 또는 상기 정의 된 대로, 단일 단백질 또는 폴리펩티드의 다른 펩티드 에피톱으로 부터 유래한 항원들이다.

한 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 포함 할 수 있다. 어느 특정 실시 양태에서는, 그 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B로 구성 될 수 있다.

한 실시 양태에서, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원들 포함할 수 있다. 이 실시 양태 내에서 이 판넬은 인용된 종양 마커 항원들의 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개, 열 개, 열 한 개, 열두 개, 열세 개, 열 네 개, 열 다섯 개, 열여섯 개, 열 일곱 개, 열 여덟 개, 열 아홉 개, 스무 개, 스물 한 개, 스물 두 개, 스물 세 개, 스물 네 개, 스물 다섯 개, 스물 여섯 개, 스물 일곱 개, 스물 여덟 개, 스물 아홉 개, 서른 개, 서른 한 개, 서른 두 개, 서른 세 개, 또는 서른 네 개를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 이 판넬은 또한 MMP9, AIF1, EpCAM 또는 CDKN1B를 포함 할 것이며 및 이들 종양 마커 항원들 한 개, 두 개 .세 개 또는 네 개를 포함 할 수 있다. 이들 종양 마커 항원들 두 개 또는 세 개가 판넬에 포함 되어 있는 실시 양태에서는, 이들 항원의 두 개 또는 세 개의 모든 조합이 고려 된다. 특별한 실시 양태들에서는 이 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린 (transferrin)을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서는 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린 (transferrin)으로 구성 될 수 있다.

아직도 더 나아간 실시 양태에서는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린 (transferrin)을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린 (transferrin)으로 구성 될 수 있다.

한 특정 실시 양태에서, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린 (transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서, 판넬은 또한 MMP9, AIF1, EpCAM 또는 CDKN1B를 포함할 것이며, 및 이들 종양 마커 항원 한 개, 두 개, 세 개 또는 네 개를 포함할 수 있다. 종양 마커 항원 두 개 또는 세 개가 판넬에 포함된 실시 양태에서는, 이들 항원 두 개 또는 세 개의 모든 조합이 고려 된다. 특정 실시양태에서는 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함할 수 있다. 예를 들어, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentine), HSPA4, 트랜스페린 (transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactin, RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1를 포함 할 수 있다.

다른 한편으로는, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentine), HSPA4, 트랜스페린 (transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성 될 수 있다.

한 특정 실시양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린 (transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1를 포함 할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1로 구성 될 수 있다.

한 특정 실시양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린 (transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP 를 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린 (transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP로 구성될 수 있다.

본 발명의 키트는 간암을 검출하는데 적절할 수 있다.

어느 특정 실시 양태들에서는 키트는 간암을 검출하기 위해서 이다.

본 발명의 키트 내에서, 체액은 혈장 (plasma), 혈청(serum), 전혈(whole blood), 뇨, 땀, 림프액, 대변(faeces), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복수(ascites fluid), 흉막삼출액(pleural effusion), 정액(seminal fluid), 가래(sputum), 유두액(nipple aspirate), 수술-후 혈청종 (post-operative seroma), 타액(saliva), 양수(amniotic fluid), 눈물(tears) 또는 상처 배액 (wound drainage fluid)으로 구성된 그룹으로부터 선택 될 수 있다.

본 발명은 다음의 제한적이지 않은 실험적 실시예들을 참조하여 이해 될 것이다.

실시예 (Examples)

실시예 1-종양-연관된 단백질들에 대한 자가항체들의 측정을 위한 일반적인 프로토콜

종양 마커 항원들의 샘플들은, WO 99/58978 (그 내용이 여기 참고문헌에 병합 되어 있음)에 서술 된 방법들과 비슷한 방법에 따라 제조 될 수 있다. 간략하게, 발현 되는 단백질의 정제를 돕도록 바이오틴 표지 및 6x히스티딘 표지 (6x histidine tag)를 암호화 되게 수정 된 pET21 벡터(Invitrogen)에 관심있는 마커 항원을 암호화 하는 cDNA를 클론 한다. 결과로 얻어진 클론들은 BL21(DE3) 대장균 (E. coli) 에서 기르며, 이 박테리아는 이어서 용해시킨다. 발현된 항원들은 제조사의 프로토콜에 따라, 닉켈 키레이트 친화 컬럼 (nickel chelate affinity columns )(HiTrap, GE Healthcare에서 상업적으로 구할 수 있음)으로 회수 한다. 발현된 단백질의 순도, 특이성 및 수율은 저장하기 전에 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 (Western blot) 및 단백질 에세이로 평가 한다.

음성 대조군 단백질, VOL, 은 빈 벡터 pET21 (즉, 종양 연관된 항원을 암호화 하는 cDNA가 없는) 를 BL21(DE3) E. coli 에 형질전환 시켜 생산되게 한다. 발현 되고 정제된 단백질은 재조합 종양 연관된 항원에서 발견된 똑 같은 His 및 바이오틴 표지 서열들을 포함하며 잔여 박테리아 오염물질들에 결합하는 비-특이적인 자가항체에 대한 보정을 하게 한다.

몇가지 마커 cDNA의 유전자은행 (GenBank) 접속 번호는 다음과 같다:

AFP: NM_001134.1

AIF1: NM_001623.3

AKR1B10: NM_020299.4.

APOA1: NM_000039.1.

BCL2: NM_000633.2

CAGE: NM_182699

CALR: NM_004343.3

CD44: NM_001001389

CDKN1B: NM_004064.4　

CK18: NM_000224

CPS1: NM_001875.4

CCNB1: NM_031966.2

CYCLIN B1: NM_031966.2

DDX3X: NM_001356.3

EpCAM: NM_002354

FUCA1: NM_000147.4

GLUL: NM_001033044.2

HNRNP-A2: NM_002137.3

HNRNP-L: NM_001533.2

HSPA2: NM_021979.3.

HSPA4: NM_002154.3

HSPD1: NM_002156.4

IL8: NM_000584.3

MAGE A4: NM_001011548.1

MDM2: NM_002392.5

MMP9: 　NM_004994.2.　

NPM1: NM_002520.6

NY-ESO-1: NM 001327

PEBP1: NM_002567.2

P62: NM_001007225.1

Prolactin: NM_000948.5

RalA: NM_005402.2

RGN: NM_004683.5

SALL4: NM_020436.3.

SOX2: NM_003106

SPP1: NM_001040058.1

SSX2: NM_175698.1

TGFB1: NM_000660.5

Transferrin: NM_001063.3

Vimentin: NM_003380.3

YWHAZ: NM_001135699.1

항원들 및 VOL (음성 대조군)은 고농도 인산 결합 버퍼 (high phosphate buffer)에 적절한 농도로 희석 시키고 그 후 고속 대량 에세이 (high throughput assay) (HTPA) 포멧 (도표 2A) 에서와 같이 두 개의 서로 다른 단백질 농도로, 또는 적정 에세이 포멧 (도표 2B)에서와 같이 반-로그 적정 범위 (semi-log titration range)로 제공하기 위해 희석 시킨다. 항원 희석액들은 플레이트 배치에 (도표 2A 및 2B) 따라 자동화된 액체 취급 시스템 (automated liquid handling system)을 사용하여 50 μl/웰로 활콘 (Falcon) 마이크로타이터 플레이트의 줄에 분주 시켰다. 플레이트는 뚜껑을 덮고 18-22^oC에서 18-24 시간 동안 저장 시켰다.

플레이트는 돼지 피부 젤라틴 결합 버퍼 (pig skin gelatin buffer) ((PSGBB, PBS +0.1% 돼지 피부 젤라틴 +0.05%소듐 아자이드(sodium azide)) 200 μl/웰로 한 시간 동안 차단 시켰다. 혈청 샘플들은 녹이고, 볼텍스 (vortex) 시키고 및 1/110으로 PSGBB로 18-22^oC에서 희석 시켰다. 플레이트는 빨아내고 (aspirated) 티슈 페이퍼 (tissue paper) 위에서 두드려 건조 시켰다. 각 희석된 혈청 샘플은 자동화된 액체 취급 기기를 사용하여 마이크로타이터 플레이트의 모든 웰에 50 μl/웰로 분주 시켰다. 플레이트는 뚜껑을 덮고 실온에서 진탕 시키면서 1.5 시간 동안 배양시켰다.

세척 단계: 플레이트는 자동 플레이트 세척기를 사용하여 PBS +0.1% 투윈 20(tween 20)으로 세번 세척 시키고, 그후 티슈 페이퍼 위 에서 두드려 건조 시켰다.

호스레디쉬 퍼옥시데이즈 (Horseradish peroxidase) 접합된 토끼 항-인간 면역글로불린 (Dako, 1/5,000 PSGBB에)을 마이크로타이터 플레이트의 모든 웰에 50 μl/웰로 분주 시켰다. 플레이트들은 상기 서술 된 대로 세척 시켰다.

미리-제조된 TMB 기질을 각 플레이트에 50 μl/웰로 첨가 시키고 벤치에서 15 분 동안 배양시켰다. 플레이트는 부드럽게 두드려 섞었다. 각 웰의 광학적 밀도는 650 nm 에서 표준 스펙트로포토메터 플레이트 판독기 (spectrophotometric plate reader)를 사용하여 측정 되었다.

실시예2 - HTPA에 의한 간세포 암종(hepatocellular carcinoma) 에서 자가항체 검출

다음의 데이터는 HTPA 포멧을 사용하여 HCC의 검출에서 자가항체 에세이 판넬의 민감도 및 특이성을 평가하기 위해 예비 연구(pilot study)로부터 얻었다. 개체의 임상적 및 인구통계학적 상태가 표 1-4에 보여준다.

실시예 2에 서술된 연구에 포함된 환자들의 인구통계학 (데모그래픽 Demograpic status) 상태

인구통계학적 인자 (Demographic factor)	HCC 환자 (HCC patients)	양성 간 질병 환자 (Benign liver disease patients)	악성 증후가 없는 개인 (Individuals with no evidence of malignancy)
수 (Number)	99	99	99
평균 나이 (Mean age)	62.3	58.1	62.2
나이 범위 (Age range)	30-91	30-89	30-87
% 남성 (% Male)	69	69	69

HCC 환자들에 존재하는 1차 종양 (primary tumor)의 크기

	가능한 환자의 수 Number of patients available	평균 (Mean)	최소-최대 (Min-Max)
1차 종양 의 크기 (cm) (Primary tumour size)	88	5.9	0.4-19

TNM 스테이징(TNM staging)을 사용한 HCC 환자의 종양 단계

TNM 스테이지 (TNM stage)	수 (Number)
1	35
2	21
3	21
4	2
N/A	20

TNM = 악성 종양의 단계 분류 시스템인 TNM 분류; N/A = 가능하지 않음(not available)

양성 간 질환 환자들에 존재하는 간 질환

양성 배경(Benign background)	수 (Number)
간염 바이러스 C 감염 (Hepatitis C viral infection)	67
간염바이러스B 감염 (Hepatitis B viral infection)	22
알코올성 긴 질환 (Alcoholic Liver Disease)	6
자가면역 간염 (Autoimmune Hepatitis)	2
혈색소증 (Haemochromatosis)	1
1 차 담 쓸개즙 간경변 (Primary Biliary Cirrhosis)	1
합계(Total)	99

에세이는 표 5에 목록화 되어 있는 항원들을 사용하여 실시예 1에서 보여준 프로토콜에 따라 수행 되었다. 에세이 절단 값(cut-dff)은 각 마커의 특이성은 90% 보다 크게 유지 시키면서 가장 큰 유덴 값(Youden’s value)을 주는 절단 값을 선택하여 결정 하였다. 그 결과는 표 5에 보여 주며 및 이들 자가항체 마커들의 수가 HCC를 지닌 환자들에서 양성 간 질환 또는 건강한 대조군 보다 좀 더 높은 수준의 양성도를 보여 주는 것이 분명하며, 그러므로 이들은 HCC 환자를 악성의 징후가 없는 환자와 식별하는 능력을 가질 수 있다.

더 나아가, AAb들의 판넬을 측정 하는 것이 단일 AAb 혼자에 비해 HCC 환자를 비-종양성 간 질병을 가진 사람과 식별하는 능력을 증가 시키는 것이 분명하다. 판넬 1 및 2 (표들 6 및 10)는 어떻게 다른 셋트의 AAb들을 조합하여 여러 가지 다른 임상적 요구에 맞게 특정 성질들을 최적화 시키면서 비슷한 수행능력을 보이는 것이 가능 한가를 보여주고 있다. 판넬 1 (표 6)은 모든 환자에게 유용한 마커를 포함한다. 민감도가 약간 줄어든 판넬 1 에 비해 판넬 2 (표 10) 에서와 같이, 판넬에 포함된 마커들을 성별로 최적화하는 것은 특이성을 증가시킨다. 이는 여러 다른 임상적 요구에 맞추기 위하여 다른 판넬을 만드는 능력을 보여 준다. 표 7 및 11 은 각 판넬들이 1단계 및 2 단계 암을 지닌 환자들을 검출할 수 있음을 보여 주며, 이는 조기 진단에 결정적이며 효과적인 HCC 치료를 인도 한다.

각 그룹에서 각 AAb 마커들의 양성도

	HCC		양성(Benign)		정상Normal)
	양성 (Positives)	%	양성 (Positives)	%	양성 (Positives)	%
AIF1	2	2.0	0	0	0	0
AKR1B10	1	1.0	0	0	0	0
ApoA1	1	1.0	0	0	0	0
BCL2	3	3.0	1	1.0	1	1.0
CD44	1	1.0	0	0	0	0
CDKN1B	2	2.0	0	0	1	1.0
CK18	1	1.0	0	0	0	0
CPS1	2	2.0	1	1.0	0	0
DDX3X	3	3.0	1	1.0	2	2.0
EpCAM	5	5.1	1	1.0	6	6.1
FUCA1	1	1.0	0	0	0	0
GLUL	1	1.0	0	0	0	0
HNRNP-A2	1	1.0	0	0	0	0
HNRNP-L	3	3.0	2	2.0	0	0
HSPA2	1	1.0	0	0	0	0
HSPA4	5	5.1	1	1.0	0	0
HSPD1	2	2.0	2	2.0	0	0
IL-8	5	5.1	4	4.0	4	4.0
MDM2	2	2.0	1	1.0	0	0
MMP9	3	3.0	1	1.0	1	1.0
NPM1	2	2.0	1	1.0	0	0
NY-ESO-1	7	7.1	0	0	1	1.0
PEBP1	1	1.0	0	0	0	0
Prolactin	2	2.0	1	1.0	1	1.0
RGN	1	1.0	0	0	0	0
SALL4	1	1.0	0	0	0	0
SPP1	1	1.0	1	1.0	0	0
SSX2	3	3.0	1	1.0	1	1.0
TF	2	2.0	0	0	0	0
TGFB1	1	1.0	0	0	0	0
Vimentin	7	7.1	3	3.0	6	6.1
YWHAZ	2	2.0	1	1.0	2	2.0

판넬 1-일반적인 판넬

판넬 1은 NRI (Net Reclassification Improvement, 총 재 분류 개선)을 사용하여 형성 시켰으며 NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린 (transferring) 과 함께 종양 마커 항원 EpCAM, AIF1 및MMP9를 포함하며 상기 주어진 AAbs의 어느 것의 수준이 실시예 2 에서 서술된 대로 만들어진 이의 절단 값 이상 이면 양성이다. 표들 6 및 7은 실시예 2 에서 서술된 샘플 셋트 에서 판넬의 수행능력을 보여 준다.

판넬 1 의 수행 능력 및 구성

판넬1 (Panel 1)	민감도 (Sensitivity) (%)	양성 특이성 (Specificity benign) (%)	정상 특이성 (Specificity normal) (%)
NY-ESO-1, EpCAM, HSPA4, vimentin, HNRNP-L, transferrin, AIF1, MMP9	28.3	94	87.9

TNM 스테이지 (TNM stage)에 의한 판넬 1의 수행 능력

스테이지(Stage)	양성(Positive)	음성(Negative)	민감도(Sensitivity)
1	8	27	23
2	4	17	19
3	8	13	38
4	0	2	0

판넬 2-남성 및 여성을 위한 각각의 판넬

판넬 2는 실시예 2 에서 서술된 샘플 셋트를 각기 다른 성별 그룹으로 나누어 형성 시켰으며 각 그룹에 대해 별개의 NRI를 수행하였다. 판넬 2 는 HSPA4, CPS1, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2 및 HNRNP-L 와 함께 종양 마커 항원 EpCAM, AIF1 및MMP9 를 포함한다. 환자가 여성이고 및 HSPA4, AIF1, EpCAM 또는 CPS1 중 어느 것이 실시예 2 에서 서술된 대로 만들어진 절단 값 이상 이거나, 또는 환자가 남성이고 및 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), EpCAM, HSPA2, HSPA4 또는 HNRNP-L 중 어느 것이 실시예 2 에서 서술된 대로 만들어진 절단 값 이상 이면 그 결과는 양성이다. 표 10 및 11은 실시예 2 에서 서술된 대로 샘플 셋트에서 판넬 2의 수행능력을 보여 준다.

판넬 2a-여성의 수행 능력 및 구성

판넬 2a (Panel 2a)	민감도 (%) (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign)(%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%))
HSPA4, AIF1 EpCAM, CPS1	22.6	100	100

판넬 2b-남성의 수행 능력 및 구성

판넬 2b (Panel 2b)	민감도 (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign) (%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%)
NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), EpCAM, HSPA2, HSPA4, HNRNP-L	25	97.1	92.6

판넬 2-혼합의 수행 능력 및 구성

판넬 2 Panel 2	민감도 (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign) (%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%)
2a + 2b	24.2	98	94.9

스테이지 (Stage)	스테이지 (Stage)	음성 (Negative)	민감도(%) (Sensitivity )(%)
1	6	29	17.1
2	4	17	19
3	6	15	28.6
4	0	2	0

실시예 3- HTPA에 의한 측정으로 자가항체와 조합하여 추가로 측정한 AFP

상업적으로 구할 수 있는 ELISA(Aviva Systems Biology)를 사용하여 실시예 2 에서 서술 된 샘플 셋트에서 혈청 샘플에서 순환되고 있는 알파-태아 단백질(AFP)을 측정 하였다. 보통-사용 되는 절단 값 (cut-off value) 200 ng/ml이 양성으로 평가 하기 위해 적용 되었다. 표 12는 실시예 2에서 보여준 판넬 1 및 2 에 AFP를 첨가 한 결과를 보여준다. 이 결과들로부터 AFP를 AAb 판넬들과 조합하여 수행하는 것이 AFP 혼자 또는, AAb 판넬 혼자 수행 하는 것보다 더 크다는 것이 명백하다.

AFP 단독 및 실시 예 2 에 서술된 판넬들에 첨가 되었을 때의 수행능력

마커 조합 (Marker combination)	민감도 (Sensitivity)	양성 특이성 (Specificity benig)	정상 특이성 (Specificity normal)
AFP	35.4	100	100
Panel 1 + AFP	52.5	93.9	87.9
Panel 2 (조합된) + AFP	49.5	97.9	94.9

실시예 4-적정 에세이에 의한 간세포암종(hepatocellular carcinoma)(HCC)에서 자가항체 검출

적정 플레이트 포멧(titration plate format) (도표2B)을 사용하여 HCC의 검출에서 자가항체 에세이 판넬의 민감도 및 특이성을 평가하는 연구로부터 다음의 데이터가 얻어졌다. 이 연구에서 포함 된 대상의 임상적 및 인구통계학적 상태가 표 13-16 에서 보여준다.

실시예 4 에서 서술된 연구에서 포함된 환자의 인구통계학적 상태

인구통계학적 인자 (Demographic factor)	HCC 환자 (HCC patients)	양성 간 질병 환자 (Benign liver disease patients)	악성 증후가 없는 개인 (Individuals with no evidence of malignancy)
수 (Number)	98	99	95
평균나이(Mean age)	62.6	50.7	62.7
나이 범위 (Age range)	30-91	30-82	30-84
% 남성 (% Male)	69	69	68

HCC 환자들에서 존재하는 1차 종양의 크기

	가능한 환자 수 (Number of patients available)	평균 (Mean)	최소-최대 (Min-Max)
1차 종양 크기 (cm) (primary tumour size) (cm)	86	6.02	04-19

TNM 스테이징을 사용한 HCC의 종양 단계

TNM 스테이지 (TNM stage)	수(Number)
1	35
2	20
3	21
4	2
N/A	20

N/A = 해당 없음

양성 간 질환 환자들에 존재하는 간암 질병

양성 배경(Benign background)	수 (Number)
간염 바이러스 C 감염 (Hepatitis C viral infection)	58
간염 바이러스 B 감염 (Hepatitis B viral infection)	31
알코올성 간 질환 (Alcoholic Liver Disease)	6
자가면역 간염 (Autoimmune Hepatitis)	2
혈색소증 (Haemochromatosis)	1
1 차 담 쓸개즙 간경변 (Primary Biliary Cirrhosis)	1
합계 (Total)	99

에세이는 표 17에 목록화 되어 있는 항원들을 사용하여 실시예 1에 주어진 프로토콜에 따라 수행 되었다. 에세이 절단 값은 각 마커의 특이성은 90% 보다 크게 유지 시키면서 가장 큰 유덴 값(Youden’s value)을 주는 절단 값을 선택하여 결정 하였다. 그 결과가 표 17에 보여주며 및 이들 자가항체 마커들 중 몇 가지는HCC를 지닌 환자들에서 양성 간 질환 또는 건강한 대조군 보다 좀 더 높은 수준의 양성도를 보여 주는 것이 분명하며, 그러므로 이들은 HCC 환자를 악성 질병의 징후가 없는 환자와 식별하는 능력을 가질 수 있다. 실시예 2에서 보여준 연구에서 암/정상을 구별할 수 있다고 발견된 AAb들은 HCC 환자를 비-종양성 간 질환(양성, benign) 및 건강 대조군 (normal)로부터 HCC 환자를 식별하는 능력을 계속적으로 보여 준다. 더 나아가, 판넬의 측정은 다시 한번 어느 단일 마커 혼자 에 비해 HCC 환자를 구별하는 능력을 증가 시키는 것이 분명하다.

판넬 3(표 18) 및 판넬 4 (표 22)는 어떻게 다른 셋트의 마커들을 조합하여 여러 가지 다른 임상적 요구에 맞게 특정 성질들을 최적화 시키면서 비슷한 수행능력을 달성 하는 것이 가능 한가를 보여주고 있다. 판넬 3는 모든 환자에게 사용 가능 한 마커들을 포함하며, 반면에 판넬 4는 민감도는 (표20 및 21)는 유지 시키면서 특이성은 증가시키는 성별 다른 마커들로 구체화 한다. 이는 여러 다른 임상적 요구에 맞추기 위해 다른 판넬을 만들 수 있는 능력을 보여준다. 각 예시적인 판넬들은 조기 진단 및 그러므로 HCC의 효과적인 치료 에 아주 중요한 스테이지 1 및 2 를 지닌 환자들을 검출 할 수 있다 (표 19 및 23).

각 그룹에서 각 AAb 마커들의 양성도(Positivity)

	HCC		양성(Benign)		정상(Normal)
	양성(Positives)	%	양성(Positiv es)	%	양성(Positives)	%
AIF1	1	1.0	0	0	0	0
CAGE	12	12.2	3	3.0	9	9.5
CDKN1B	14	14.3	13	13.0	21	22.1
DDX3X	5	5.1	2	2.0	2	2.1
EpCAM	3	3.1	0	0	3	3.2
HNRNP-A2	6	6.1	4	4.0	6	6.3
HSPA4	4	4.1	1	1.0	0	0
HSPD1	7	7.1	5	5.0	3	3.2
MAGE A4	3	3.1	0	0	0	0
MMP9	2	2.0	1	1.0	0	0
NY-ESO-1	8	8.2	0	0	4	4.2
p62	9	9.2	5	5.0	2	2.1
RalA	4	4.1	1	1.0	4	4.2
SALL4	6	6.1	3	3.0	1	1.1
SOX2	3	3.1	0	0	1	1.1
트랜스페린 (Transferrin)	7	7.1	5	5.0	1	1.1
YWHAZ	6	(6.1)	4	(4.0)	5	(5.3)

판넬 3

판넬 3은 NRI를 사용하여 형성 시켰으며 및 DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2 와 함께, EpCAM, AIF1 및 MMP9 종양 마커 항원을 포함하며, 상기 주어진 AAbs중 어느 것의 수준이 실시예 4 에서 서술된 것과 같이 생긴 절대 값 이상이면 그 결과는 양성이다. 표 18 및 19는 실시예 4 에서 서술된 샘플 셋트에서 판넬의 수행 능력을 보여준다.

판넬 3의 수행능력 및 구성

	민감도(%) (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign)(%)	정성 특이성(%) (Specificity normals) (%)
DDX3X, SALL4, MAGE A4, MMP9, AIF1, NY-ESO-1, CAGE, RalA, EpCAM, SOX2	36.7	89.9	84.2

TNM 스테이지 (TNM stage)에 의한 판넬 3 의 수행능력

스테이지 (Stage)	양성 (Positive)	음성 (Negative)	민감도 (%) (Sensitivity) (%)
1	10	25	28.6
2	8	12	40
3	8	13	38
4	1	1	100

판넬 4-남성 및 여성을 위한 각 개별 판넬

판넬 4 는 실시예 2 에서 서술된 샘플 셋트를 별개의 성별 그룹으로 나누어 각 그룹에 대하여 별개의 NRI를 수행하여 형성 시켰다. 판넬 4 는 CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1, HSPD1, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린 (transferrin) 과 함께 종양 마커 항원들EpCAM 및 AIF1를 포함한다. 만약 환자가 여자이고 CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, AIF1, HSPA4 또는 트랜스페린 (transferrin )중 어느 것도 실시예 4 에서 서술된 대로 생긴 절단 값보다 위이거나 또는 환자가 남성이고 CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1 또는 EpCAM 중 어느 것도 실시예 4 에서 서술된 대로 생긴 절단 값보다 위이면 결과는 양성이다. 표들 10 및 11은 실시예 4 에서 서술 된 샘플 셋트에서 판넬 4의 수행 능력을 보여준다.

판넬 4a-남성의 수행 능력 및 구성

	민감도(%) (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign) (%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%)
CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1, EpCAM	32.4	95.6	86.2

판넬 4b-여성의 수행 능력 및 구성

	민감도(%) (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign) (%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%)
CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, AIF1, HSPA4, 트랜스페린(transferrin)	50	90.3	90

판넬 4-혼합의 수행 능력 및 구성

	민감도(%) (Sensitivity) (%)	양성 특이성(%) (Specificity benign) (%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%)
4a + 4b	37	93.8	87.4

TNM 스테이지(stage)에 의한 판넬 4의 수행 능력

스테이지 (Stage)	양성 (Positive)	음성 (Negative)	민감도(%) (Sensitivity) (%)
1	12	23	34.3
2	7	13	35
3	7	14	30
4	1	1	50

실시예 5-적정 에세이로 측정한 자가항체와 조합하여 AFP 추가 측정

상업적으로 구할 수 있는 ELISA(Aviva Systems Biology)를 사용하여 실시예 4에서 서술 된 샘플 셋트에서 혈청 샘플에서 순환되고 있는 알파-태아 단백질(AFP)을 측정 하였다. 보통-사용 되는 절단 값 (cut-off value) 200 ng/ml이 양성으로 평가 하기 위해 적용 되었다. 표 24는 실시예 4에서 보여준 판넬 3 및 4 에 AFP를 첨가 한 결과를 보여준다. 이 결과들로부터 AFP를 AAb 판넬들과 조합하여 수행하는 것이 AFP 단독 또는, AAb 판넬 단독 수행 하는 것보다 더 크다는 것이 명백하다.

	민감도(%) (Sensitivity)(%)	양성 특이성(%) (Specificity benign) (%)	정상 특이성(%) (Specificity normal) (%)
AFP	31.6	100	100
Panel 3 + AFP	55.1	89.9	84.2
Panel 4 (combined) + AFP	55.1	93.8	87.4

실시예 6-조기CDT-간 LDT 디자인 및 개발 훈련 연구

다음의 데이터는 적정 플레이트 포멧 (도표 2B)을 사용하여 HCC 검출에서 자가항체 에세이 판넬의 민감도 및 특이성을 평가하는 연구로부터 얻었다. 대상들의 인구통계학적 상태 및 양성 코호트의 간경병 상태는 이전 샘플에서 사용된 것과는 다른 코호트로서, 표 25-26에 주어진다.

실시예 6에서 사용된 환자 코호트의 인구통계학적 상태(Demographic status)

인구통계학적 인자 Demographic factor	HCC 환자 HCC patients (HCC)	양성 간 질병 환자(양성) Benign liver disease patients (Benign)	악성 증상이 없는 개인 (정상) Individuals with no evidence of malignancy (Normal)
수 (Number)	169	184	191
평균 나이(나이 범위) (Mean age) (age range)	59.8 (32-81)	54.7 (20-76)	59.9 (31-81)
평균 나이(나이 범위) (Mean age) (age range)	85.2	70.1	84.3

양성 코호트 환자의 간경변 상태

간경변 상태 (Cirrhotic Status)	수(Number)
간경변성(Cirrhotic)	87
비-간경변성 간 질환 (Non-Cirrhotic liver disease)	81
미지 (Unknown)	16
Total	184

에세이는 표 27에 목록화 된 항원들을 사용하여 실시예 1에 주어진 프로토콜에 따라 수행 되었다. 각 마커의 절단 값은 특이성을 >85% 이상으로 제한하는 몬테 칼로 직접 찾기 방법(Monte Carlo direct search method)을 적용하여 측정 되었다. 그 결과들은 표 27에 보여지며 및 이들 자가항체 마커들중 어떤 것들은 양성 또는 정상 코호트의 환자에서보다 HCC 환자에서 더 높은 수준의 양성도를 보여주며, 그러므로 이들은 악성 질병의 징후가 없는 환자로부터 HCC 환자를 구별하는 능력을 가졌다. 실시예 2 에서 보여준 연구에서 암/정상 구별을 보여주는 것으로 발견된 AAb 들은 계속적으로 HCC 환자들을 비-암적인 간 질환(양성) 및 건강 대조군(정상)과 구별할 수 있는 능력을 보여준다. 다 나아가, 판넬의 측정은 다시 한번 어느 단일 마커 혼자 에 비교하여 HCC를 구별하는 능력이 증가 된다는 것이 명백하다. 판넬은 스테이지 1 및 2 를 지닌 환자를 민감도 40-45%로 검출할 수 있으며, 이는 조기 진단 및 따라서 효과적인 HCC 치료에 아주 중요하다 (표 28).

각 그룹에서 각 개별 AAb 마커들의 양성도

자가항체 (Autoantibody)	HCC		양성 (Benign)		정상 (Normal)
자가항체 (Autoantibody)	양성(Positives)	(%)	양성(Positives)	(%)	양성(Positives)	(%)
AIF1	2	1.2	0	0.0	0	0.0
CAGE	33	19.5	7	3.8	5	2.6
CYCLIN B1	8	4.7	8	4.3	2	1.0
DDX3X	3	1.8	0	0.0	0	0.0
EpCAM	5	3.0	2	1.1	1	0.5
HSPA4	12	7.1	6	3.3	2	1.0
MAGE A4	14	8.3	6	3.3	3	1.6
MMP9	17	10.1	5	2.7	6	3.1
NY-ESO-1	21	12.4	11	6.0	4	2.1
RalA	12	7.1	7	3.8	6	3.1
SALL4	11	6.5	7	3.8	4	2.1
Transferrin	15	8.9	5	2.7	10	5.2
판넬 (Panel)	78	46.2	24	87	26	86.4

HCC 코호트에 대한 스테이지별 AAb 판넬의 수행능력:스테이지별 환자수 (n) 및 결과적 민감도

스테이지 (Stage)	n	양성 (Positive)	민감도(%) (Sensitivity) (%)
BCLC 0	1	0	0.0
BCLC A	30	12	40.0
BCLC B	71	32	45.1
BCLC C	28	19	67.9
BCLC D	8	5	62.5
미지(Unknown)	31	10	32.3

BCLC = 바로셀로나 임상적 간암 스테이지 시스템((Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) staging system))

상업적으로 구할 수 있는 ELISA(Monobind)를 사용하여 실시예 6 에서 서술 된 샘플 셋트에서 혈청 샘플에서 순환되고 있는 알파-태아 단백질(AFP)을 측정 하였다. 보통-사용 되는 절단 값 (cut-off value) 200 ng/ml 이 표 29에서 스테이지 별로 나뉘어 있는 양성도를 평가 하기 위해 적용 되었다. 질병의 조기 스테이지의 민감도는 질병의 후기 스테이지의 민감도 보다 매우 낮으며, AFP 항원 민감도는 이 코호트의 스테이지에 따라 증가한다. 이 실시예에서 AAb 판넬과 비교하여 질병의 조기 스테이지의 민감도는 AFP 항원에 대하여 매우 낮으며 반면에 후기 스테이지에는 수행 능력은 비슷하다.

HCC 코호트에 대한 스테이지별 AFP의 수행능력:스테이지별 환자수 (n) 및 결과적 민감도

스테이지 (Stage)	n	양성 (Positive)	민감도 (%) (Sensitivity) (%)
BCLC 0	1	0	0.0
BCLC A	30	3	10.0
BCLC B	71	25	35.2
BCLC C	28	16	57.1
BCLC D	8	5	62.5
미지(Unknown)	31	3	9.7

실시예 6에서 HCC 코호트에 대한 양성도 및 민감도는 AFP 항원을 AAb 판넬 결과들(표 30)과 조합하여, 질병의 조기 및 후기 스테이지 둘 다의 민감도를 개선시켜, 증가 시킬 수 있다. 이들 결과들로부터 AFP를 AAb 판넬과 조합하여 수행하는 것이 AFP 단독 또는, AAb 판넬 단독 수행 하는 것보다 더 크다는 것이 명백하다 (표 31). AAb 판넬과 AFP와의 조합은 특이성에는 최소의 효과를 가진다.

HCC 코호트에 대한 스테이지별 AAb 판넬+AFP의 수행능력:스테이지별 환자수 (n) 및 결과적 민감도

스테이지 (Stage)	n	양성 (Positive)	민감도 (Sensitivity) (%)
BCLC 0	1	0	0.0
BCLC A	30	13	43.0
BCLC B	71	42	59.2
BCLC C	28	25	89.3
BCLC D	8	6	75.0
Unknown	31	11	35.5

AFP 단독 및 실시예 6에서 서술된 AAb 판넬에 첨가 되었을 때의 수행능력

마커 조합 (Marker combination)	민감도 (Sensitivity)	특이성 (양성) (Specificity) (Benign)	특이성(정상) (Specificity) (Normal)
AAb panel	46.2	87.0	86.4
AFP antigen	30.8	99.5	100.0
AAb panel + AFP antigen	57.4	86.4	86.4

Claims

포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 포유류 대상에서 간암을 검출하는 방법으로서, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며,
(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및
(b) 테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정 하여,
상기 복합체의 존재는 간암의 존재를 나타내는 단계들을 포함하는 방법.
포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 방법으로서, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며,
(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및
테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정 하는 단계들을 포함하는 방법.
제2항에 방법에 있어서, 포유류 대상은 간암을 지닌 것으로 의심 되는 대상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항의 방법에 있어서, 상기 포유류 대상은 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)(AFP), 데스-감마카복시프로트롬빈 (des-gamma carboxyprothrombin) (DCP) 또는 랙틴-반응 알파-태아프로테인 (lectin-reactive alpha-fetoprotein)(AFP-L3)에 대하여 양성(positive)반응을 보이는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제3항의 방법에 있어서, 상기 포유류 대상은 초음파 감시를 사용한 테스트에서 간암 양성(positive)반응을 보이는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제3항의 방법에 있어서, 상기 포유류 대상은 간 경변(liver cirrhosis), 비-알코올성 지방간 질병, 알코올성 간 질병, 윌슨씨 병(Wilson's disease), 유전성 혈색소침착증 (hereditary hemochromatosis), 자가면역 간염 (autoimmune hepatitis), B형 간염, C형 간염, 문서로 기록된 아풀라톡신 노출 (documented aflatoxin exposure), 및 주혈흡충병 (schistosomiasis) 또는 당뇨를 가진 대상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 자가항체들이 검출되며, 및 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 방법:
(a) MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원을 포함하는 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬 및 더 나아가 언급한 자가항체들 중 적어도 한 개에 면역학적으로 특이적인 한 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들과 테스트 샘플을 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항의 방법에 있어서, 상기 판넬은 두 개 또는 그 이상의 서로 뚜렷이 다른 항원인 종양 마커 항원들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제8항의 방법에 있어서, 상기 판넬은 하나 또는 그 이상의 서로 뚜렷이 다른 항원들의 두 개 또는 그 이상의 항원 변이체 (antigen variants)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항 또는 제8항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린 (transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및TGFB1으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제12항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP 로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제16항의 방법 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제18항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제18항 또는 제19항의 방법에 있어서, 상기 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제21항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제21항 또는 제22항의 방법에 있어서, 상기 대상이 남성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제24항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및NY-ESO-1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제26항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및NY-ESO-1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제26항 또는 제27항의 방법에 있어서, 상기 대상이 남성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린 (transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제29항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin)로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제29항 또는 제30항의 방법에 있어서, 상기 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제32항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제33항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
상기 청구항들 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 더 나아가, 하기 단계를 포함하는 방법:
(c) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체와 종양 마커 항원과의 사이에 특이적인 결합의 양을 검출하고,
상기 자가항체의 유무는 관찰된 특이적 결합의 양과 미리-결정된 절단 값 사이의 비교에 근거한다.
상기 청구항들 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 마커 항원은 다른 양의 복수로 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 테스트 샘플을 다른 양의 복수의 종양 마커 항원과 접촉 시키고;
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합하는 종양 마커 항원의 복합체의 유무를 결정하고;
(c) 종양 마커 항원과 자가항체사이의 특이적 결합의 양을 검출하고;
(d) 특이적 결합의 양 대비 (a) 단계에서 사용 된 각 종양 마커 항원 양에 대한 종양 마커 항원의 곡선을 플럿팅 하거나 계산하고; 및
(e) 사용된 각 다른 양의 종양 마커 항원에서 종양 마커 항원과 자가항체 사이의 특이적 결합의 양에 근거하여 자가항체의 유무를 결정한다.
제36항의 방법에 있어서, 상기 자가항체의 유무는 사용된 종양 마커 항원의 모든 양에 특이적으로 결합하는 양의 집합적인 값에 근거하여 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제36항의 방법에 있어서, 상기 자가항체의 유무는 용량-반응 곡선의 존재에대한 단계 (d)의 플럿을 스크리닝하여 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제38항의 방법에 있어서, 상기 용량-반응 곡선은 일반적으로 S-형 또는 시그모이달(sigmoidal) 곡선이 특징인, 방법.
제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 더 나아가 하기의 단계를 포함하는 방법:
(d1) (c) 단계에서 플럿 되거나 또는 계산된 곡선 (curve)으로부터 제 2차 곡선 매개변수를 계산하고; 및
(e) 하기의 조합에 근거하여 자가항체의 유무를 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법:
(i) 단계 (b)에서 결정한 자가항체와 종양 마커 항원 사이의 특이적 결합의 양; 및
(ii) 단계 (d1) 에서 결정한 제 2차 곡선 매개변수.
제40항의 방법에 있어서, 상기 제 2차 곡선 매개변수는 기울기(slop), 절편(intercept), AUC, 최대기울기(SlopeMax), 및 해리항수(kd)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제41항의 방법에 있어서, 상기 제 2차 곡선 매개변수는 직선 또는 로그 회귀곡선(regression cueve)으로 부터 계산 되는 것을 특징을 하는, 방법.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 제 2차 곡선 매개변수는 단계 (c) 에서 플럿 되거나 또는 계산 된 각 곡선에 맞춘 지수 함수의 최대 점근선 (Maximum Asymptote), 최소 점근선 (Minimum Asymptote), 힐 기울기 (Hill slope) (또는 기울기 인자, slop factor), 또는 변곡점 (Inflection Point) 인 것을 특징으로 하는, 방법.
포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 간암으로 고통을 받고 있는 개체의 항체 프로화일을 결정하는 실험관 내 방법으로서, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며,
(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하는 단계들을 포함하고, 상기 이 방법은 항체 생산 프로화일을 축적하기 위해 반복되는 것을 특징으로 하는, 방법.
포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하여 한 포유류 대상에서 간암을 진단하거나 치료하는 방법으로서, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며, (a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하여;
(c) 그 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합한 종양 마커 항원 복합체가 검출되면 그 대상은 간암을 지니고 있다고 진단하며, 및
(d) 간암이 진단된 대상에게 간암 치료제를 투여 하는 단계들을 포함하는, 방법.
항-간암 치료의 반응을 예측하는 한 방법으로서, 이 방법은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 항체를 검출하는 방법을 포함하며, 상기 항체는 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 단백질에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체이며,
(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정하고;
(c) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체들과 종양 마커 항원 사의의 특이적 결합의 양을 검출하고; 및
(d) 종양 마커 항원과 자가항체들과 사이의 특이적 결합의 양을 기존에 확립된 결합 양과 비슷한 치료 결과와의 관계와 비교하여;
이로써, 특이적 결합의 변화는, 대조군과 비교하였을 때, 환자가 항-간암 치료제에 반응할 것인지 아닌지를 예측 하는 단계들을 포함하는, 방법.
제45항 또는 제46항의 방법에 있어서, 상기 간암 치료는 화학요법 (chemotherapy), 고주파절제 (radiofrequency ablation), 간 절제 (liver resection), 간 이식(liver transplant), 백신주사(vaccination), 항-성장인자 또는 신호 전달 치료 (anti-growth factor or signal transduction therapies), 내분비계 치료(endocrine therapy), 인간 항체 치료 (human antibody therapy), 케테터경유 동맥 화학색전술 (transcatheter arterial chemoembolization), 경피적 에탄올 주사(percutaneous ethanol injection), 마이크로웨이브 삭마 (microwave ablation), 소라훼닙 투여 (sorafenib administration) 및 방사성색전술 (radioembolisation)로 구성 된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 자가항체가 검출되고, 및 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법:
(a) MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원 및 언급한 자가항체들 중 적어도 한 개에 면역학적으로 특이적인 한 개 또는 그 이상의 더 나아간 종양 마커 항원들을 포함하는 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬과 테스트 샘플을 접촉시키는, 방법.
제48항의 방법에 있어서, 상기 판넬은 뚜렷이 다른 항원들인 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제49항의 방법에 있어서, 상기 판넬은 한 개 또는 그 이상의 뚜렷이 다른 항원들의 변이체들 두개 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제49항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴 (prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 53항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 55항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
.
제52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제57항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제59항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제59항 또는 제60항의 방법에 있어서, 상기 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제62항에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제62항 또는 제 63항의 방법에 있어서, 상기 그 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및SOX2를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제65항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제67항의 방법에 있어서, 상기, 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제67항 또는 제68항의 방법에 있어서, 상기 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제70항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제70항 또는 제71항의 방법에 있어서, 상기 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 방법.
제52항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제73항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제74항의 방법에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제48항 내지 제75항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 마커 항원은 다른 양의 복수로 제공되며
(a) 테스트 샘플을 다른 양의 종양 마커 항원으로 복수로 접촉시키고;
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합된 종양 마커 항원의 복합체의 유무를 측정하고;
(c ) 종양 마커 항원과 자가항체 사이의 특이적인 결합의 양을 검출하고;
(d) 특이적인 결합의 양 대비 (a) 단계에서 사용된 종양 마커 항원 각 양에 대한 종양 마커 항원 양의 커브를 플럿팅 (plotting)하거나 계산 하고;
(e)사용된 각 종양 마커 항원 양에서 자가항체와 종양 마커 항원 사이의 특이적인 결합의 양에 근거하여 항체 생산 프로화일을 축척 하거나 또는 간암을 지닌 대상에 대하여 진단하고; 및 선택적으로
(f) 진단된 대상에게 간암 치료제를 투여하는 단계들을 포함하는 방법.
제76항의 방법에 있어서, 상기 간암의 존재의 유무는 사용된 종양 마커 항원의 모든 양에 특이적으로 결합하는 양의 집합적인 값에 근거하여 결정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제77항의 방법에 있어서, 상기 용량-반응 곡선의 존재에 대한 단계 (d)의 플럿을 스크리닝 하여 그 대상이 간암을 지닌 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제78항의 방법에 있어서, 상기 용량-반응 곡선은 일반적으로 S-형 또는 시그모이달(sigmoidal) 곡선인 것을 특징으로 하는, 방법.
제76항 내지 제79항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 방법은 더 나아가 하기의 단계를 포함하는, 방법:
(d1) (d) 단계에서 플럿 되거나 또는 계산된 곡선 (curve)으로부터 제 2차 곡선 매개변수를 계산하고; 및
(e) 하기의 조합에 근거하여 간암을 진단 하는 것을 특징으로 하는, 방법:
(i) 단계 (c)에서 결정한 자가항체와 종양 마커 항원 사이의 특이적 결합의 양; 및
(ii) 단계 (d1) 에서 결정한 제 2차 곡선 매개변수.
제80항의 방법에 있어서, 제 2차 곡선 매개변수는 기울기(slop), 절편(intercept), AUC, 최대기울기(SlopeMax), 및 해리항수(kd)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제81항의 방법에 있어서 상기 제 2차 곡선 매개변수는 직선 또는 로그 회귀곡선(regression cueve)으로 부터 계산 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2차 곡선 매개변수는 단계 (c) 에서 플럿 되거나 또는 계산 된 각 곡선에 맞춘 지수 함수의 최대 점근선 (Maximum Asymptote), 최소 점근선 (Minimum Asymptote), 힐 기울기 (Hill slope) (또는 기울기 인자, slop factor), 또는 변곡점 (Inflection Point) 인 것을 특징으로 하는, 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 종양 마커 항원은 자연적으로 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드, 합성된 단백질 또는 폴리펩티드, 합성된 폴리펩티드, 펩티드유사체(peptide mimetic), 다당류(polysaccharide), 또는 핵산인, 방법.
제1항 및 제3항 내지 제75항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 간암은 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma)인, 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 체액은 혈장 (플라즈마, plasma), 혈청(serum), 전혈(whole blood), 뇨, 땀, 림프액, 대변(faeces), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복수(ascites fluid), 흉막삼출액(pleural effusion), 정액(seminal fluid), 가래(sputum), 유두액(nipple aspirate), 수술-후 혈청종 (post-operative seroma), 타액(saliva), 양수(amniotic fluid), 눈물(tears) 또는 상처 배액 (wound drainage fluid)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 그 방법은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)(AFP), 데스-감마 카복시프로트롬빈 (des-gamma carboxyprothrombin) (DCP) 또는 랙틴-반응 알파-태아단백질 (lectin-reactive alpha-fetoprotein)(AFP-L3)을 검출하는 것을 더 나아가 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제87항의 방법에 있어서, 상기 그 방법은 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)(AFP)을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제88항의 방법에 있어서, 상기 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서, 종양 마커 단백질들 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린 (transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1에 면역학적으로 특이적인 자가항체들이 검출 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제88항의 방법에 있어서, 상기 포유류 대상으로부터 얻은 체액을 포함하는 테스트 샘플에서, 종양 마커 단백질들 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린 (transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP 에 면역학적으로 특이적인 자가항체들이 검출 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제87항 내지 제90항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 체액은 혈액인 것을 특징으로 하는, 방법.
포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서, MMP9, AIF1, EpCAM 또는 CDKN1B에 대한 면역학적으로 특이적인 자가항체를 검출하여 간암을 검출하는 방법에 의한, MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원의 용도로서, 상기 방법은,
(a) 테스트 샘플을 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원과 접촉 시키고; 및
(b)테스트 샘플에 있는 자가항체들에 결합된 종양 마커 항원의 복합체 (complex)의 유무를 측정 하고;
언급된 복합체의 존재는 간암이 있음을 나타내는 방법.
상기 청구항 중 어느 한 항의 방법을 수행 하는데 적절한 키트로서, 상기 키트는 하기로 구성 되는, 키트:
(a) 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원; 및
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합하는 종양 마커 항원 복합체를 검출할 수 있는 시약.
포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플에서 하기를 함유하는 자가항체를 검출하는 키트:
(a) MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 종양 마커 항원; 및
(b) 테스트 샘플에 존재하는 자가항체에 결합하는 종양 마커 항원 복합체를 검출할 수 있는 시약.
제93항 또는 제 94항의 키트에 있어서, 더 나아가 하기를 포함하는 키트:
(c ) 종양 마커 항원이 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플과 접촉하는 수단.
제95항의 키트에 있어서, 상기 종양 마커 항원을 포유류 대상에서 얻은 체액을 함유하는 테스트 샘플과 접촉시키는 수단에는 종양 마커 항원을 칩, 슬라이드, 마이크로타이터 플레이트의 웰, 비드, 멤브레인 또는 나노입자에 고정시키는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
.
제93항 내지 제96항 중 어느 한 항의 키트에 있어서, 상기 종양 마커 항원은 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬 내에 존재하는 특징을 가진, 키트.
제97항의 키트에 있어서, 상기 판넬은 뚜렷이 다른 항원인 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제97항 또는 제98항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들은 MMP9, AIF1, EpCAM 및 CDKN1B를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제97항 내지 제99항 중 어느 한 항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1,프로락틴( prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 종양 마커 항원들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제101항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, 및 AIF1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferrin), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제103항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 CAGE, NY-ESO-1, MMP9, 트랜스페린(transferring), MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclin B1, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 및 AFP으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제105항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, 비멘틴(vimentin), HNRNP-L 및 트랜스페린(transferrin)으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제107항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, EpCAM, HSPA4 및 CPS1로 구성되는 것을 특징으로 하는 키트.
제107항 또는 제108항의 키트에 있어서, 상기 대상이 여성인 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제110항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA2, HSPA4 및 HNRNP-L으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제110항 또는 제111항의 키트에 있어서, 상기 대상은 남성인 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제113항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA 및 SOX2로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제115항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X 및 NY-ESO-1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제115항 또는 제116항의 키트에 있어서, 상기 대상은 남성인 것을 특징으로 하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin) 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제118항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 및 트랜스페린(transferrin) 으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제118항 또는 제119항의 키트에 있어서, 상기 대상은 여성인 것을 특징으로하는, 키트.
제100항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제121항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제122항의 키트에 있어서, 상기 두 개 또는 그 이상의 종양 마커 항원들의 판넬은 MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, 비멘틴(vimentin), HSPA4, 트랜스페린(transferrin), HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin B1, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoA1, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, 프로락틴(prolactin), RGN, SPP1, SSX2 및 TGFB1로 구성되는 것을 특징으로 하는, 키트.
제93항 내지 제123항 중 어느 한 항의 키트에 있어서, 간암을 검출하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제93항 내지 제124항 중 어느 한 항의 키트에 있어서, 체액은 혈장 (플라즈마, plasma), 혈청(serum), 전혈(whole blood), 뇨, 땀, 림프액, 대변(faeces), 뇌척수액(cerebrospinal fluid), 복수(ascites fluid), 흉막삼출액(pleural effusion), 정액(seminal fluid), 가래(sputum), 유두액(nipple aspirate), 수술-후 혈청종 (post-operative seroma), 타액(saliva), 양수(amniotic fluid), 눈물(tears) 또는 상처 배액 (wound drainage fluid)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트.