CN106662586B - 改进的免疫测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一般性地涉及抗体检测领域,并且特别涉及用于检测包含患者体液之样品中的抗体的测定。本发明提供了检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法,其中使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触,检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量,并且基于所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量以及由所使用的每个抗原量特异性结合量相对于抗原量的曲线产生的二次曲线参数确定抗体的存在与否。
Description
技术领域
本发明一般性地涉及抗体检测领域,并且特别涉及用于检测包含患者体液之样品中的抗体的测定。
背景技术
许多诊断、预后和/或监测测定依赖于检测特定疾病状态或疾病易感性的生物标志物。这样的生物标志物通常是作为特定疾病的特征或与疾病易感性相关的蛋白质或多肽。
近年来显然抗体(特别是自身抗体)也可充当疾病或疾病易感性的生物标志物。自身抗体是天然存在的抗体,其针对被个体免疫系统识别为外源的抗原(尽管该抗原实际上来源于该个体)。它们可以作为循环的游离自身抗体或者以循环免疫复合物的形式存在于循环中,所述循环免疫复合物由与其靶蛋白结合的自身抗体组成。在一些情况下,由“正常”细胞表达的野生型蛋白质与由疾病细胞或在疾病过程中产生的变异形式的蛋白质之间的差异导致个体的免疫系统将所述变异蛋白质识别为“非自身的”,并因此在该个体中引发免疫应答。这可以是体液(即B细胞介导的)免疫应答,导致产生对于该变异蛋白质具有免疫特异性的自身抗体。
WO 99/58978描述了用于检测/诊断癌症的方法,所述方法基于评估个体对两种或更多种不同肿瘤标志物的免疫应答。这些方法通常涉及以下步骤:将取自个体的体液样品与一组两种或更多种不同的肿瘤标志物抗原接触,每种肿瘤标志物抗原来自不同的肿瘤标志物蛋白;并检测与对该肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的循环自身抗体结合的所述肿瘤标志物抗原复合物的形成。将这种循环自身抗体的存在作为癌症存在的指示。
根据自身抗体产生来测量个体对肿瘤标志物蛋白存在的免疫应答的测定为直接测量或检测体液中的肿瘤标志物蛋白提供了替代方案。这样的测定基本上构成了对肿瘤标志物蛋白存在的间接检测。免疫应答的性质意味着很可能自身抗体可被非常少量的循环肿瘤标志物蛋白引发,因而依赖于检测对肿瘤标志物的免疫应答的间接方法将比用于直接测量体液中肿瘤标志物的方法更加灵敏。因此,基于自身抗体检测的测定方法在疾病过程的早期可能特别有价值,并且还可能涉及筛选无症状患者,例如在筛选中在无症状个体群体中鉴定处于发生疾病“风险”的个体,在无症状个体群体中鉴定已经发生疾病的个体。此外,基于自身抗体检测的方法在疾病过程的早期可能特别有价值,并且还可以用于在有症状个体群体中鉴定已经发生疾病的个体。此外,它们可用于复发性疾病的早期检测。所述测定方法也可在选择或监测疾病的治疗中有价值。
除了指示癌症疾病状态,抗体和自身抗体还可以充当其他疾病状态或疾病易感性的生物标志物,其中类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematous,SLE)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)、自身免疫性甲状腺炎(例如,桥本甲状腺炎)、自身免疫性胃炎(例如,恶性贫血)、自身免疫性肾上腺炎(例如,艾迪生病,Addison’s disease)、自身免疫性甲状旁腺功能减退、自身免疫性糖尿病(例如,1型糖尿病)、重症肌无力、副肿瘤性神经障碍(paraneoplastic neurological disorder)例如兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、炎性肠病、结节病和自身免疫性肝炎只是所述疾病的一些实例。
先前认识到,当在诊断或预后中使用基于抗体检测的测定来评估个体在群体内的疾病状态、疾病进展或疾病易感性时,在设计适合于待筛选对象整个群体的标准化测定方法中可能出现困难,因为抗体存在的绝对量在个体之间显著变化。这可能产生高发生率的假阴性结果,例如在具有低抗体量的个体中。类似地,在对真阳性结果评分的方面存在困难,因为抗体的绝对量在个体之间的变化意味着难以为筛选的群体内所有个体的阳性测定结果设置合适的阈值。
在WO2006/126008中确定了可以通过包括抗原滴定步骤显著改善测定的性能,更尤其改善其临床效用和可靠性所述测定基于检测作为疾病生物标志物的抗体(特别是自身抗体)。通过测试怀疑含有针对一系列不同量抗原的抗体的样品并构建滴定曲线,可以不依赖于样品中所存在的抗体绝对量而可靠地鉴定真阳性筛选结果。这样的方法与之前的方法相反,之前的方法仅滴定抗原来构建校准曲线或以允许鉴定待用于检测实际患者样品中抗体的最合适的抗原浓度。在这些方法中,仅给出了单点测量以用于实际诊断。因此,这些方法不允许待检测抗体的量在个体之间的变化,这导致如上所述的假阳性和假阴性的发生。WO2006/126008的抗原滴定方法提供了比在单一抗原浓度下测量自身抗体反应性,或滴定血清样品而不是抗原之方法更高的特异性和灵敏度。
发明内容
已经确定WO2006/126008中描述的抗原滴定方法提供了对于检测肺癌约40%的灵敏度和约90%的特异性。因此,约10%的测试的健康患者具有阳性结果,但并不呈现疾病状态(假阳性)。由于群体中肺癌的低发生率,阳性预测值(Positive Predictive Value,PPV,是真阳性而不是假阳性之阳性结果的比例)主要由测定的特异性驱动。因此,提高特异性,即减少假阳性结果的数量是有利的。考虑到这一点,已经令人惊讶地确定,可以通过评估抗原/抗体结合的量和二次曲线参数(secondary curve parameter)来改善抗原滴定测试方法的特异性。该方法在本文中将被称为“双重截止方法(double cut-off method)”。该方法需要评估抗体与抗原之间的特异性结合水平,以及评估二次曲线参数,只有当测试结果与这两种测量值的截止点相比被分类为阳性时,测试结果才被认为是阳性。
根据本发明的第一方面,提供了检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触;
(b)检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量;
(c)对步骤(a)中使用的每个抗原量,绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的曲线;
(d)从在步骤(c)中绘制或计算的所述曲线计算二次曲线参数;以及
(e)基于以下组合确定所述抗体的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
根据本发明的第二方面,提供了在包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中检测两种或更多种抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述测试样品与包含两个或更多个抗原集的组接触,其中所述组中的每个所述抗原对所述两种或更多种抗体中的至少一种具有特异性;
(b)检测与存在于所述测试样品中的抗体结合的所述抗原的复合物;
(c)对于每种抗原,对步骤(a)中使用的每个抗原量,绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的各自的曲线;
(d)计算在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的二次曲线参数;以及
(e)对于在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线,基于以下组合确定所述两种或更多种抗体的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
在本发明的所有方面,所述哺乳动物对象优选是人。
在本发明的所有方面,优选对包含从哺乳动物对象获得或制备之体液的测试样品体外进行所述方法。
本发明在其所有方面的一个关键特征是二次曲线参数的确定和这样的发现:与仅基于测试样品中抗体之间的特异性结合的量的测定相比,将该二次曲线参数与测试样品中的抗体与抗原之间的特异性结合量相组合地使用提高了本发明方法的特异性,即减少了假阳性结果的数量。由于群体中肺癌的低发生率,阳性预测值(PPV)主要由测定的特异性驱动,并且这种特异性的提高进而提高了PPV。
在某些实施方案中,通过双重截止方法提供的特异性的提高允许将更多数目的抗原同时施加于测试样品,相对于现有技术方法提高了灵敏度,即减少了假阴性结果的数量。在某些实施方案中,由本发明的方法提供的特异性的提高允许将额外的抗原或多种抗原变体施加于测试样品,从而提高了测定方法的灵敏度。这种方法与在该领域中进行的先前研究相反,所述研究集中于试图鉴定表现出最高可能灵敏度的单个抗原。本发明方法提高了测定特异性,并因此提高了PPV,这允许通过测定多种抗原提高测定灵敏度,其中以双重截止法防止特异性的降低,所述特异性的降低预期会在使用现有技术方法测定多种抗原时出现。这避免了对鉴定表现出特别高灵敏度的单个抗原的需要。
附图简述
图1.展示二次曲线参数推导的图示:A=斜率,截距,曲线下面积(Area Under theCurve,AUC)和最大斜率(SlopeMax)。B=解离常数(Kd)。
图3.二次曲线参数。二次曲线参数相对于p53的抗体/抗原结合(以校准的参考单位(reference unit,RU)表示)的图。对于每个参数给出数据的线性(左图)和对数(右图)回归简化(regression reduction)两者。A=斜率,B=截距,C=AUC,D=最大斜率。仅使用商售(即EarlyCDT-Lung)的抗体/抗原结合的截止值获得的七抗原组结果代码如下:o=真阳性,x=假阳性,Δ=真阴性,□=假阴性。代表抗体/抗原结合的标准截止值。
图4.次优的二次曲线参数的开发。最优二次曲线参数相对于七抗原组的抗体/抗原结合(以校准的参考单位(RU)表示)的图;(A=p53),(B=SOX2),(C=CAGE),(D=NY-ESO-1),(E=MAGE A4),(F=HuD)。仅使用商售(即EarlyCDT-Lung)的抗体/抗原结合的截止值获得的七抗原组结果代码如下:o=真阳性,x=假阳性,Δ=真阴性,□=假阴性。-.-.-.-代表抗体/抗原结合的标准截止值。---------代表二次曲线参数截止值。灰色阴影区代表阳性区域。
图5.对于独立样品集的确认。最优二次曲线参数相对于七抗原组的抗体/抗原结合(以校准的参考单位(RU)表示)的图;(A=p53),(B=SOX2),(C=CAGE),(D=NY-ESO-1),(E=MAGE A4),(F=HuD)。训练集(training set)数据显示在左侧,而确认集(confirmatory set)数据显示在右侧。仅使用商售(即EarlyCDT-Lung)的抗体/抗原结合的截止值获得的七抗原组结果代码如下:o=真阳性,x=假阳性,Δ=真阴性,□=假阴性。代表抗体/抗原结合的标准截止值。---------代表二次曲线参数截止值。灰色阴影区代表阳性区域。
图6.通过并入其他抗原改善组性能。最优二次曲线参数相对于四种其他抗原的抗体/抗原结合(以校准的参考单位(RU)表示)的图;(A=α烯醇化酶),(B=细胞角蛋白8),(C=细胞角蛋白20),(D=Lmyc2)。仅使用商售(即EarlyCDT-Lung)的抗体/抗原结合的截止值获得的七抗原组结果代码如下:o=真阳性,x=假阳性,Δ=真阴性,□=假阴性。代表抗体/抗原结合的标准截止值。---------代表二次曲线参数截止值。灰色阴影区代表阳性区域。
图7.通过并入变体和突变抗原改善组性能。最优二次曲线参数相对于经选择包含在最终组中的七种突变或变体之抗体/抗原结合(以吸光度单位(absorbance unit)表示)的图;(A=p53-C末端),(B=Kras G12C/Q61H),(C=p53 C-BirA),(D=Kras Q61H),(E=EGFR1-EP),(F=Kras G13C/Q61H)和(G=p53-95)。仅使用商售(即EarlyCDT-Lung)的抗体/抗原结合的截止值获得的七抗原组结果代码如下:o=真阳性,x=假阳性,Δ=真阴性,□=假阴性。代表抗体/抗原结合的标准截止值。---------代表二次曲线参数截止值。灰色阴影区代表阳性区域。
图8.合并了二次曲线参数的HCC诊断组的产生。二次曲线参数相对于在两个抗原浓度下的初始六抗原组的抗体/抗原结合(以光密度(optical density,OD)单位表示)的图;(A=p53),(B=SOX2),(C=CAGE),(D=NY-ESO-1),(E=MAGE A4),(F=CK8),(i=50nM浓度的抗原,ii=160nM浓度的抗原)。组群(cohort)疾病类别代码如下:o=HCC,x=良性肝病,□=所匹配的健康情况正常。---------代表相对截止值。水平的截止值代表标准抗体/抗原结合截止值,且垂直的截止值代表二次曲线参数截止值。深灰色阴影区代表阳性区域。
图9.向合并了二次曲线参数的HCC诊断组加入抗原。二次曲线参数相对于在两个抗原浓度下的其他六种抗原的抗体/抗原结合(以光密度单位(OD)表示)的图;(A=AFP),(B=p62),(C=SSX1),(D=HDGF),(E=VTN10),(F=IMP1),(i=50nM浓度的抗原,ii=160nM浓度的抗原)。组群疾病类别代码如下:o=HCC,x=良性肝病,□=所匹配的健康情况正常。---------代表相对截止值。水平的截止值代表标准抗体/抗原结合截止值,且垂直的截止值代表二次曲线参数截止值。深灰色阴影区代表阳性区域。
发明详述
本发明一般性地提供了用于检测抗体的免疫测定方法,其特征在于,测试存在抗体之待测试的样品针对对所述抗体具有特异性的不同量之抗原的特异性结合,并且产生抗体/抗原结合相对于所测试抗原量的滴定曲线。然后由该曲线计算二次曲线参数,并且基于抗体和抗原之间的特异性结合量和二次曲线参数两者确定抗体的存在。
本发明人已经确定,先前分类为假阳性的阴性样品(例如来自正常患者的样品)中的抗原/抗体结合示出相比于阳性样品中的特异性结合的不同曲线特征。因此使用双重截止方法(其考虑抗原/抗体结合的量以及二次曲线参数两者)减少了假阳性结果的数量,从而提高了特异性。由于群体中肺癌的低发病率,阳性预测值(PPV)主要由测定的特异性驱动,因此本发明的方法相对于仅基于测试样品中抗体之间的特异性结合的量的测定也提高了PPV。
因此,在一个非限制性实施方案中,本发明提供了检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触;
(b)检测所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;
(c)对步骤(a)中使用的每个抗原量,绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的曲线;
(d)计算在步骤(c)中绘制或计算的所述曲线的二次曲线参数;以及
(e)基于以下组合确定所述抗体的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
免疫测定(例如ELISA、放射免疫测定等)的一般特征是本领域技术人员公知的(参见Immunoassay,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996)。用于检测具有特定免疫特异性的抗体的免疫测定通常需要使用表现出与相关抗体具有特异性免疫反应性的试剂(抗原)。根据测定的形式,该抗原可以固定在固体支持物上。使存在抗体的待测试样品与抗原接触,并且如果所需的免疫特异性的抗体存在于样品中,则它们将与抗原免疫性地反应以形成抗体-抗原复合物,然后可以对其检测或定量测量。
本发明方法的特征在于针对多个不同量的抗原(本文也称为抗原集(其代表一个滴定系列))测试待测试标准化样品中抗体的存在。针对至少两种,优选至少三种、四种、五种、六种或七种不同量的抗原来测试样品。通常的测定还可以包括不含任何抗原的阴性对照。
在本发明的上下文中,术语“抗原”用于指与存在于测试样品中的抗体复合的免疫特异性试剂。抗原是包含至少一种能够与所期望检测的靶抗体特异性相互作用的抗原决定簇或表位的物质,或者与所述抗体的可变区或互补决定区特异性相互作用的任何捕获剂。抗原通常是天然存在的或合成的生物大分子,例如蛋白质或肽、多糖或核酸,并且可以包括抗体或其片段例如抗独特型抗体。
具有本领域相关技术的读者将理解,在本发明方法中,可用于结合靶抗体的抗原决定簇或表位的量对于建立滴定系列是重要的。在许多测定形式中,可用于结合的抗原决定簇或表位的量与所存在的抗原分子的量直接相关。然而,在另一些实施方案中,例如某些固相测定系统中,暴露的抗原决定簇或表位的量可能与抗原的量不直接相关,而可能取决于其他因素,例如与固体表面的连接。在这些实施方案中,本文提及的滴定系列中的“不同量的抗原”可以用于指不同量的抗原决定簇或表位。
在本发明方法中,针对测试的每种不同量的抗原(抗原决定簇或表位),确定抗体与抗原之间的特异性结合的相对或绝对量,并用于对每个测试抗原量绘制或计算特异性结合的(相对或绝对)量相对于抗原量的曲线。基于在每个抗原量下观察到的特异性结合的量,确定测试样品中与测定中使用的抗原反应的抗体的存在,并且一般由剂量-响应曲线指示,其通常为S形或S形曲线。如果针对不同量的测试抗原没有可检测的结合变化,则可将其评分为不存在可检测量的抗体。
在一个实施方案中,通过比较抗体与抗原之间的特异性结合的量和具有预定截止值的二次曲线参数确定抗体的存在与否。这里,绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线,并且在病例对照研究中将已知阳性样品(例如患有疾病的患者群体)中的结合水平与在已知阴性样品(例如正常个体)中观察到的结合水平进行比较。选择在滴定曲线上的一个或更多个点处的抗体结合截止值,以使其在保持高特异性(几乎没有假阳性)的同时使灵敏度最大化(几乎没有假阴性)。假如在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线是剂量响应曲线,则如果对滴定曲线上的一个或更多个点所确定的特异性结合的量高于确定的截止点,那么测量即被认为是阳性的。
如果需要,特定样品中存在的抗体绝对量的测量可以从抗原滴定测定的结果中得到。
二次曲线参数
在滴定系列中所使用的每个抗原量下检测抗原/抗体结合的量,并绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线之后,计算二次曲线参数。可以由线性或对数回归曲线计算所述二次曲线参数。本文中,二次曲线参数是提供曲线性质之指示的任何计算值。例如,二次曲线参数可以是斜率、截距、曲线下面积(AUC)、最大斜率或解离常数(Kd)。这些二次曲线参数如图1所示。
使用以下等式计算斜率:
其中b是斜率,x指抗原浓度(nM),y指吸光度单位(AU)中的OD值。
可以从线性或对数回归曲线,或从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的斜率。
回归线的截距是当x=0时该线在y轴上的值。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的截距。
可以使用总和梯形规则(summed trapezoid rule)计算曲线下面积(AUC),其可以通过根据下式估计每组抗原浓度之间的定积分来完成:
对每对连续的抗原浓度重复该计算,并将所得值相加以获得曲线下面积(AUC)的总值。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的曲线下面积(AUC)。
可以使用与上述斜率相同的公式计算最大斜率。然而,为了确定每个样品斜率的最大可能值,获得每对连续的抗原浓度的斜率值,其最大幅度的斜率值表示最大斜率。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的最大斜率。
可以通过对每组滴定点拟合四参数逻辑斯蒂曲线(logistic curve)计算解离常数(Kd),并且使用迭代求解方法,使用公式F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D来给出最小渐近线(A)、斜率因子(B)、拐点(C)和最大渐近线(D)参数的值,由此使残差平方和(the sumof the squared residuals)最小化。该求解数据的拐点对应于抗原-抗体结合的Kd。
在另一个实施方案中,可以通过将逻辑斯蒂曲线(例如4参数逻辑斯蒂曲线)拟合为在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线来确定二次曲线参数。在该实施例中,所述二次曲线参数可以是最大渐近线、最小渐近线、Hill斜率(或斜率因子)或拐点。
4参数逻辑斯蒂(4PL)曲线是由以下公式定义的曲线:
F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D,
其中A=最小渐近线,B=Hill斜率(或斜率因子),C=拐点且D=最大渐近线。
为了确定该实施方案中的二次曲线参数,使用迭代求解函数对每个样品和抗原计算4PL曲线。这里,4个参数被设置为接近各自的期望值的值,具有以下限制:最小渐近线的值固定为0,Hill斜率的值限制为正值,且限制拐点为最大值1000。
然后可以计算滴定曲线的每个点与4PL曲线上的对应点(由公式F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D)返回)之间的差,将差值平方,并且将所有平方差的值相加。
然后调整用于4个二次曲线参数的值,并以迭代方式重复计算平方均值的和,直到平方均值的和尽可能接近零。迭代求解可以使用Microsoft Excel的SOLVER函数来执行。
一旦获得二次曲线参数,其将与抗原/抗体结合数据组合以确定抗体的存在与否。这里,将抗体与抗原之间的特异性结合量与上述截止值进行比较。
使用已知的阳性样品(例如,由一群患有疾病的患者组成的一组病例-对照样品组)和已知的阴性样品(例如,一群在病例-对照研究中的正常个体)确定二次曲线参数的截止值。对于每个样品,绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线,并将在已知阳性样品(例如患有疾病的患者)中观察到的二次曲线参数与在已知阴性样品(例如正常个体)中观察到的二次曲线参数进行比较。选择二次曲线参数的截止值,使得当其与上文讨论的抗体/抗原结合的截止值组合使用时最大化特异性(几乎没有假阳性)。
在计算二次曲线参数的截止值后,还确定阳性读数所需的方向性,即是高于还是低于截止值的值被认为是阳性的。阳性读数所需的方向性将取决于抗原和二次曲线参数。
如果测量值既高于抗体/抗原结合的截止值,并且也表现出与二次曲线参数的截止值相比的阳性读数所需的方向性,则该测量值被认为是最终阳性的,即指示测试样品中存在抗体。
发明人已经确定,与仅基于测试样品中抗体之间的特异性结合的量的现有技术方法相比,在测定方法中包括二次曲线参数提高了免疫测定的特异性,并提高了阳性预测值(PPV)。
应当理解,尽管本文包括的本发明的描述集中于使用单个曲线参数与抗原/抗体结合量的测量的组合,但是设想使用多个二次曲线参数。因此,在某些实施方案中,本发明方法利用两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个二次曲线参数。
本发明的方法有利于在临床诊断、预后、预测和/或监测测定中使用,其中所存在的靶抗体的绝对量和在不存在靶抗体时所观察到的结合水平在患者之间可以有巨大差异。本发明人已经观察到,如果这种测定基于使用单一量/浓度的测试抗原检测抗体结合,则由于测定方法的限制,可能错过患者样品,其含有在整个群体中抗体量的正常生理范围的极低或极高端的抗体量;具有低量抗体的样品可能被评分为假阴性结果,而具有极高抗体水平的那些可能超出所选择的测定方法内之精确检测的标度。滴定方法与二次曲线参数的计算组合使用允许本发明人考虑到抗体水平的这些差异和所观察到的结合水平的差异。
本发明的双重截止抗原滴定测定方法还特别适合于检测作为疾病状态或易感性的生物标志物的抗体,其中在抗体对靶抗原的特异性和亲和力方面存在相当多的患者间差异。根据其性质的抗体应答可以在患者之间显著不同,其中所存在抗体的绝对量以及抗体的特异性和/或亲和力两者均出现变化。本发明的方法可以考虑这种患者间的变化,因此使得能够为任何给定的抗体开发标准测定形式。
因此,在一个非限制性实施方案中,本发明提供了检测哺乳动物对象的疾病状态或疾病易感性的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使包含来自所述哺乳动物对象之体液的测试样品与多个不同量的对与所述疾病状态或疾病易感性相关的抗体具有特异性的抗原接触;
(b)检测所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;
(c)对于步骤(a)中使用的每个抗原量,绘制或计算所述特异性结合的量相对于抗原量的曲线;
(d)由在步骤(c)中绘制或计算的曲线计算二次曲线参数;以及
(e)基于以下组合确定所述疾病状态或疾病易感性的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
在本发明每个方面的一个优选实施方案中,所述抗体是自身抗体。由于正常患者中的非特异性抗体结合(其可以表现为假阳性结果),因此自身抗体与其靶抗原之间相互作用的测量具有挑战性。本发明的方法特别有利于检测自身抗体结合,因为其允许将这种低亲和力非特异性结合区别于抗原(例如肿瘤抗原)与其自身抗体之间的特异性结合。
本发明的方法还提供了针对用于检测自身抗体/抗体之免疫测定性能的逐日变化的防护,以用于诊断、预后和/或监测(疾病状态或治疗)目的。经常观察到,当进行用于检测包含患者体液的样品中之抗体的免疫测定时,信号强度可能存在相当大的逐日变化。这种变化可能是由于例如在测试之前获得和存储样品的方式的差异。这些因素使得难以确定地对临床测定的结果(例如基于抗体/抗原结合的简单阈值)进行评分。本发明使这种逐日变化的影响最小化,因为与对绝对信号水平的测量相比,二次曲线参数逐日变化的可能性较小。
相对于仅使用单一抗原浓度的方法,本发明方法另外的优点是与使用单一抗原浓度的方法相比,其允许更宽的测定动态范围。这意味着很少需要进一步稀释患者样品以使结果处于动态范围内,并且通常使用来自单一个体中不同来源的体液(例如血液或血清相对于腹水或胸腔积液)会产生相同的定性筛选结果(阳性/阴性),即使在不同流体中抗体的绝对浓度可能不同。这也意味着应改善对具有低抗体丰度的低样品的分析灵敏度。
测定形式
本发明的方法可以以使得怀疑含有抗体的样品与多个不同量的抗原之间接触的任何合适的形式进行。方便地,样品和不同量的抗原之间的接触可以在分开但平行的反应室(例如微量滴定板的孔)中进行。可以通过从微量滴定板的孔的抗原储备液制备系列稀释液,将不同量的抗原包被在微量滴定板的孔上。抗原储备液可以为已知或未知的浓度。然后将测试样品的等分试样添加至所述板的孔,测试样品的体积和稀释度在每个孔中保持恒定。添加至微量滴定板的孔的抗原的绝对量可以根据诸如靶抗体的性质、受试样品的性质、测试样品的稀释度等因素而变化,如本领域技术人员将理解的。一般来说,将这样选择抗原的量和测试样品的稀释度,以产生一定范围的信号强度,其落在为了在该方法中检测抗体/抗原结合而选择的读出的可接受检测范围内。方便地,测试的抗原量可以在1.6nM至160mM的范围内变化。
如上所述,即使当储备液中抗原的绝对浓度未知时,也可以用单一抗原储备液开始构建滴定曲线。假设使用相同的单一储备溶液并以相同方式连续稀释,则可以比较不同起始测试样品上运行的该抗原的各滴定测定的结果。本申请的双重截止方法在这种情况下是特别有利的,因为二次曲线参数将是一致的,而与绝对抗原稀释是否已知无关。
在本发明的另一个实施方案中,不同量的抗原(抗原决定簇或表位)可以固定在固体支持物上的离散位置或反应位点处。然后可以使整个支持物与测试样品接触,并且在每个离散位置或反应位点处分别检测或测量抗体与抗原的结合。合适的固体支持物还包括微阵列,例如其中阵列上的离散位点或斑点包含不同量之抗原的阵列。微阵列可以通过将不同量的特定抗原固定在阵列上的离散的、可分辨的反应位点处来制备。在另一些实施方案中,固定的抗原分子的实际量可以保持基本上恒定,但是阵列上的位点或斑点的大小可以变化,以改变可用的结合表位的量,从而提供具有不同量的可用结合表位的位点或斑点的滴定系列。在这些实施方案中,在制备滴定系列中重要的是抗原上结合表位的二维表面浓度,而不是抗原的绝对量。用于制备和探询(interrogation)蛋白质/肽微阵列的技术是本领域中通常已知的。
从上述讨论可以理解,在本发明的所有实施方案中,抗原量的变化可以通过改变测试样品所针对的抗原或表位密度,或通过维持抗原或表位密度但增加固定抗原的表面积,或两者来实现。微阵列可以用于对单个样品上不同特异性的抗体并行地进行多重测定。这可以使用包含多组抗原的阵列来进行,每组包含多个不同量或浓度的特定抗原。
在本文中使用的术语“抗原”在广义上指与待检测的靶抗体显示特异性免疫反应性的任何物质。合适的抗原可以包括但不限于天然存在的蛋白质、重组或合成的蛋白质或多肽、合成肽、肽模拟物、多糖和核酸。具体地,在本文中使用“抗原”时,其旨在涵盖能够与待检测抗体的可变或互补决定区特异性免疫相互作用的任何捕获剂,无论其是人源、哺乳动物来源或其他。例如,可以认为抗独特型抗体是用于该目的的抗原,如通过噬菌体展示产生的抗原。一组抗原(或抗原集)是指在本发明方法中将以不同量/浓度测试的单一抗原。
本文中,术语“不同抗原”涵盖来自不同蛋白质或多肽的抗原(例如来自不同基因编码的不相关蛋白质的抗原),以及来自单一蛋白质或多肽的不同肽表位的抗原。一组不同的抗原指将在本发明方法中以不同量/浓度测试的单一抗原。给定的微阵列可以仅包含来源于不同蛋白质或多肽的不同抗原集,或者仅包含来自单一蛋白质或多肽的不同肽表位的不同抗原集,或者包含任何比例的所述两种的混合物。应当注意,在本发明的任何实施方案中,不同量或浓度的每个单独组的抗原通常将仅包含一种抗原,而不是其混合物。
在本文中使用的术语“抗原变体”指单个抗原的等位基因或其他变体,如上文定义的单一蛋白质抗原。抗原变体通常来源于单个基因,并且不同的抗原变体可以在群体的不同成员中或在不同的疾病状态中表达。抗原变体可以因氨基酸序列或由翻译后修饰(如糖基化、磷酸化或乙酰化)而不同。另外,术语“抗原变体”涵盖抗原突变,例如氨基酸替换、添加或缺失。通常,相对于野生型抗原,抗原变体将包含少于5个(例如少于4个、少于3个、少于2个或1个)突变。一组抗原变体是指将在本发明方法中以不同量/浓度测试的单一抗原变体。
可用于本发明方法的阵列可以包含多组不同抗原、多组抗原变体、或多组不同抗原和抗原变体两者,每组包含多个不同量或浓度的特定抗原。具体地,阵列可包含一组、两组、三组、四组、五组、六组、七组、八组、九组、十组、十一组、十二组、十三组、十四组、十五组、十六组、十七组、十八组、十九组、二十组或更多组的抗原。
某些抗原可以包含或来自从天然来源分离的蛋白质或多肽,包括但不限于从患者组织或体液分离的蛋白质或多肽(例如血浆、血清、全血、尿、汗、淋巴、粪便、脑脊液、腹水、胸腔积液、精液、痰、乳头抽吸物、术后血清肿和伤口引流液)。在这样的一些实施方案中,抗原可以基本上包含所有天然存在的蛋白质,即基本上为其从天然来源所分离之形式的蛋白质,或其可以包含天然存在的蛋白质的片段。为了在本发明的方法中有效作为抗原,任何这种“片段”必须保持与其将用于测试的抗体的免疫反应性。合适的片段可以例如通过化学或酶促切割所分离的蛋白质来制备。
如本文所用,当提及使用本发明的方法测试抗体存在的材料时,术语“体液”尤其包括血浆、血清、全血、尿、汗、淋巴、粪便、脑脊液、腹水、胸腔积液、精液、痰、乳头抽吸物、术后血清肿、唾液、羊水、泪液或伤口引流液。如上所述,优选在体外对包含从测试对象取出的体液的测试样品进行本发明的方法。所使用的体液的类型可以根据待测试的抗体的特性和使用测定的临床情况而变化。通常,优选对血清或血浆样品进行测定。除了体液之外,测试样品还可以包含其他组分,例如稀释剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂等。
根据将在其中使用抗原之测定的确切性质,所述抗原可以包含与一个或更多个其他分子连接的天然存在的蛋白质或其片段,其赋予蛋白质中非天然存在的一些所需特征。例如,蛋白质或片段可以与显示标记(例如荧光标记、有色标记、发光标记、放射性标记或重金属例如胶体金)缀合。在另一些实施方案中,蛋白质或片段可以表达为融合蛋白。例如,融合蛋白可以在N末端或C末端包含标签肽以帮助纯化重组表达的抗原。
取决于其中待使用抗原之测定的形式,所述抗原可以固定在固体支持物上,例如微量滴定板的孔、微阵列珠或芯片或磁珠。固定可以通过非共价吸附、共价连接或通过标签实现。
可以使用任何合适的连接方式,只要这不会在显著程度上不利地影响抗原与靶抗体免疫反应的能力。
本发明不限于固相测定,而且还涵盖全部或部分在液相中进行的测定,例如溶液相珠测定或竞争测定。
在一个实施方案中,抗原可以用有助于固定的配体(如生物素)标记。然后可将抗原稀释至合适的滴定范围,并使其与溶液中患者样品的抗体反应。然后可以通过配体-受体相互作用(例如生物素-链霉亲和素)将所得的免疫复合物固定在固体支持物上,并且如下所述进行测定的剩余部分。
为了促进产生用于本发明测定方法的生物素化抗原,可以将编码全长抗原、其截短形式或其抗原性片段的eDNA表达为用蛋白质或多肽标签标记的融合蛋白,可以将生物素辅因子例如通过酶促反应连接至所述蛋白质或多肽标签。
用于产生重组生物素化抗原的载体可从许多来源商购获得。或者,生物素化抗原可以通过在表达和纯化后将生物素与抗原分子共价连接而产生。
如上所述,除了使用多种量的抗原来产生滴定曲线并且随后分析该曲线以计算二次曲线参数,用于检测根据本发明抗体的“免疫测定”可以基于本领域已知的标准技术。在一个最优选的实施方案中,免疫测定可以是ELISA。ELISA是本领域通常公知的。在典型的“间接”ELISA中,将对测试中的抗体具有特异性的抗原固定在固体表面(例如标准微量滴定测定板的孔,或者微珠或微阵列的表面)上,并且使包含体液之待测试抗体存在的样品与固定的抗原接触。样品中所存在的任何所需特异性的抗体将结合固定的抗原。然后可以使用任何合适的方法检测所结合的抗体/抗原复合物。在一个优选的实施方案中,将特异性识别一类或更多类人免疫球蛋白共有表位的经标记第二抗人免疫球蛋白抗体用于检测抗体/抗原复合物。通常该第二抗体是抗IgG或抗IgM。通常用可检测标志物标记第二抗体,通常是酶标志物,例如过氧化物酶或碱性磷酸酶,这允许通过添加产生可检测产物(例如有色、化学发光或荧光产物)的该酶的底物进行定量检测。可以使用具有等同效果的本领域已知的其他类型可检测标记。
抗体的特性
在一些实施方案中,通过本发明方法检测的抗体可以与疾病或疾病易感性相关。也就是说,该抗体可以是疾病状态或疾病易感性的生物标志物。在该实施方案中,本发明的方法可用于检测疾病状态或疾病易感性。
在本发明的某些实施方案中,抗体可以是自身抗体。术语“自身抗体”是指天然存在的抗体,其针对被个体免疫系统识别为外源的抗原(尽管该抗原实际上来源于所述个体)。自身抗体包括针对由疾病细胞产生或在疾病过程中产生的变异形式的天然存在蛋白质的抗体。所述变异形式的蛋白质来源于个体,但可能被所述个体的免疫系统认为是“非自身的”,从而以对变异蛋白质具有免疫特异性的自身抗体的形式在该个体中引发免疫应答。这种变异形式的蛋白质可以包括例如具有改变的氨基酸序列并任选地伴随有二级、三级或四级结构改变的突变体、截短形式、剪接变体、改变的糖形等。在另一些实施方案中,自身抗体可针对在疾病状态中过表达或作为基因扩增或异常转录调节之结果的蛋白质。通常不会遭遇免疫系统细胞的蛋白质以显著量过量表达可以触发导致自身抗体产生的免疫应答。在另一些实施方案中,自身抗体可以针对在疾病状态下开始表达的胎儿形式的蛋白质。如果通常仅在早期发育阶段在免疫系统发挥功能之前表达的胎儿蛋白质在疾病状态下开始表达,则在发育完全的人中在疾病状态下表达的胎儿形式可以被免疫系统识别为“外来的”,从而触发导致产生自身抗体的免疫应答。
在一个实施方案中,抗体可以是对肿瘤标志物蛋白具有特异性的自身抗体,更具体地是“癌症相关的”抗肿瘤自身抗体。术语“癌症相关的抗肿瘤自身抗体”是指针对存在于在癌症疾病状态下优先表达的肿瘤标志物蛋白形式上的表位的自身抗体。这种自身抗体的存在是癌症疾病状态或无症状患者中癌症倾向的特征。
在优选的应用中,本发明的方法将用于检测人对象或患者中癌症相关的抗肿瘤自身抗体的存在,并且最优选采取体外免疫测定的形式,在对包含取自对象/患者的体液之样品的测试样品上进行。体液样品可以在合适的缓冲液中稀释,或者可以在测试之前处理以长期储存或进行其他处理。
体外免疫测定是非侵入性的,并且在疾病发作之前(如在“有风险”个体的筛选中)或在整个疾病进程中,可以如认为所需要的那样频繁地重复进行,以在患者中建立自身抗体产生的谱(下文关于方法的优选应用进一步进行讨论)。
组测定
如上所述,在本发明的方法中使用双重截止提高了特异性,即减少假阳性结果的数量。这种特异性的提高允许更多数量的抗原同时施加于测试样品,从而提高了灵敏度,即与使用仅基于测试样品中抗体之间的特异性结合的量的现有技术方法将额外的抗原施加于测试样品时所预期的假阴性相比,其具有更少的假阴性。在某些实施方案中,可以将多种抗原以组的形式施加于测试样品。
因此,在一个特定的但非限制性的实施方案中,本发明涉及检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中两种或更多种抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述测试样品与包含两个或更多个抗原集的组接触,其中所述组中每个所述抗原对所述两种或更多种抗体中的至少一种具有特异性;
(b)检测与存在于所述测试样品中的抗体结合的所述抗原的复合物;
(c)对于每种抗原,对步骤(a)中使用的每个抗原量绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的各自的曲线;
(d)计算在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的二次曲线参数;以及
(e)对于在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线,基于以下组合确定所述两种或更多种抗体的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
这些方法(以下可以称为“组测定”)利用一组两个或更多个抗原集来监测个体的总体免疫应答。因此,这些方法检测给定个体中免疫应答的“谱”。在一个实施方案中,“组测定”利用一组两个或更多个抗原集来监测个体对肿瘤或其他致癌/赘生性变化的总体免疫应答。因此这些方法检测给定个体中免疫应答的“谱”,指示哪些肿瘤标志物引起导致自身抗体产生的免疫应答。
使用一组两种或更多种抗原来监测抗体的产生一般比检测针对单个标志物的抗体更灵敏,并且提供低得多的假阴性结果的频率(参见WO 99/58978、WO 2004/044590和WO2006/126008,其内容通过引用以其整体并入本文)。
一般接受的是,通过测试多种抗原将提高测定的灵敏度。然而,这种提高的灵敏度通常与特异性的成比例降低有关,因此现有技术方法限制了它们可以使用的抗原的数量。本发明的方法并未如此限制,因为由双重截止方法提供的提高的特异性允许当测定多种抗原时相对于特异性的丧失,灵敏度不成比例的提高。因此,在一些实施方案中,本发明的方法考虑使用包含多种抗原的组,例如约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20或更多种抗原。
在某些实施方案中,组中的两种或更多种抗原可以是不同抗原,如之前定义地涵盖来自不同蛋白质或多肽的抗原(例如来自由不同基因编码的不相关蛋白质的抗原),以及来自单一蛋白质或多肽的不同肽表位的抗原。
在另一些实施方案中,组中的两种或更多种抗原可以是抗原变体,如之前所定义地包括单个抗原的等位基因或其他变体,其通常来自于单个基因。多个抗原变体的使用确保由所考虑的患者和/或肿瘤表达的特异性抗原变体将被测定。这提高了测定方法的灵敏度,其中本发明的双重截止方法确保这种灵敏度的增加不伴随特异性的成比例降低。本发明人已经观察到(实施例4)个体患者可产生针对具有不同特异性的单一抗原(例如p53)的抗体。因此,似乎并非所有患者在其疾病进程中产生相同变异形式的肿瘤相关抗原。因此,本发明考虑使用单一抗原的不同变体形式或突变,以改善本发明方法的性能。
在另一些实施方案中,该组可以包含不同的抗原和抗原变体两者。在该实施方案中,该组可以包括免疫测定以(同时)检测一种或更多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)不同抗原的一种或更多种抗原变体(例如约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20或更多种)。
对于组测定的每个实施方案,显然该组包含每种抗原的集(即每种不同抗原和每种抗原变体的集),其中抗原集指在本发明方法中以不同量/浓度测试的单一抗原。
使用本发明的组测定法,使用双重截止方法针对使用组测定产生的至少一个曲线来确定每种靶抗体的存在与否。具体而言,基于(i)抗体与抗原之间的特异性结合的量和(ii)一个或更多个所绘制或计算的曲线(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个所计算的曲线)的二次曲线参数的组合来确定每种靶抗体的存在与否。
如上文关于非组测定法所述,通过比较抗体与抗原之间的特异性结合的量和二次曲线参数与每个所计算曲线的预定截止值来确定抗体的存在与否。这里,对于组中的每种抗原,绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线,并且对于组中的每种抗原,在病例对照研究中将已知阳性样品(例如患有疾病的患者群体)中的结合水平与在已知阴性样品(例如正常个体)中观察到的结合水平进行比较。对于每种抗原,这样选择在滴定曲线上的一个或更多个点处抗体结合的截止值,以使其灵敏度最大化(几乎没有假阴性),同时保持高特异性(几乎没有假阳性)。假设在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线是剂量响应曲线,则如果对滴定曲线上的一个或更多个点所确定的特异性结合的量高于确定的截止点,那么认为测量是阳性的。
一旦已经获得每种抗原的二次曲线参数,则其将与抗原/抗体结合数据组合以确定抗体的存在与否。这里,将抗体与抗原之间的特异性结合量与上述截止值进行比较。
这里应当注意,对于组内的每种抗原计算的二次曲线参数不一定相同。然而,在一些实施方案中,对于组内的每种抗原计算的二次曲线参数可以相同。
对于每种抗原,使用已知的阳性样品(例如,由一群患有疾病的患者组成的病例-对照样品组)和已知阴性样品(例如,在病例-对照研究中的一群正常个体)来确定二次曲线参数的截止值。对于每种抗原,绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线,并将在已知阳性样品(例如患有疾病的患者)中观察到的二次曲线参数与在已知阴性样品(例如正常个体)中观察到的相同抗原的二次曲线参数进行比较。这样选择二次曲线参数的截止值,使其当与上文讨论的抗体/抗原结合的截止值组合使用时,使特异性最大化(几乎没有假阳性)。
在计算二次曲线参数的截止值后,还确定阳性读数所需的方向性,即是高于还是低于截止值的值被认为是阳性的。阳性读数所需的方向性将取决于抗原和二次曲线参数。
如果测量值既高于抗体/抗原结合的截止值,并且也表现出与二次曲线参数的截止值相比的阳性读数所需的方向性,则该测量值被认为是最终阳性的,即指示测试样品中存在抗体。
在一个实施方案中,组测定可用于检测疾病状态或疾病易感性的存在与否。因此,在一个实施方案中,本发明包括检测哺乳动物对象的疾病状态或疾病易感性的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使包含来自所述哺乳动物对象之体液的测试样品与包含对与疾病状态或疾病易感性相关的抗体具有特异性的一组两个或更多个抗原集接触;
(b)检测与存在于所述测试样品中的抗体结合的所述抗原的复合物;
(c)对于每种抗原,对步骤(a)中所使用的每个抗原量绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的各自的曲线;
(d)计算在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的二次曲线参数;以及
(e)对于在步骤(c)中绘制或计算的一个或更多个曲线,基于以下组合确定所述疾病状态或疾病易感性的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
在该实施方案中,基于以下组合确定疾病状态或疾病易感性的存在与否:(i)抗体与抗原之间的特异性结合的量和(ii)在步骤(c)中绘制或计算的一个或更多个曲线的二次曲线参数,其中如上所述地确定截止值。
肿瘤标志物蛋白
本发明的方法不限于检测具有任何特定特异性的抗体。然而,在一个实施方案中,本发明的方法可适用于检测肿瘤标志物蛋白的自身抗体。本文中,所述方法可涉及作为单一标志物测定或作为组测定的组成部分检测针对基本上任何肿瘤标志物蛋白的自身抗体,可以针对所述肿瘤标志物蛋白制备合适的抗原。
具体地,所述方法可以适于检测/测量针对以下的自身抗体:表皮生长因子受体蛋白EGFR(epidermal growth factor receptor)(Downward 等(1984)Nature.307:521-527;Robertson等(2001)Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126;177-81)、糖蛋白MUC1(Batra,S.K.等(1992)Int.J.Pancreatology.12:271-283)、信号转导/细胞周期调节蛋白Myc(Blackwood,E.M.等(1994)Molecular Biology of the Cell 5:597-609)、c-myc、L-myc2(Nau等,Nature,318(6041),69-73)、p53(Matlashewski,G.等(1984)EMBO J.3:3257-3262;Wolf,D.等(1985)Mol.Cell.Biol.5:1887-1893)和ras(或Ras)(Capella,G.等(1991)Environ Health Perspectives.93:125-131)以及BRCA1(Scully,R.等(1997)PNAS94:5605-10)、BRCA2(Sharan,S.K.等(1997)Nature.386:804-810)、APC(Su,L.K.等(1993)Cancer Res.53:2728-2731;Munemitsu,S.等(1995)PNAS 92:3046-50)、CA125(Nouwen,E.J.等(1990)Differentiation.45:192-8)、PSA(Rosenberg,R.S.等(1998)BiochemBiophys Res Commun.248:935-939)、癌胚抗原CEA(Duffy,M.J.(2001)Clin Chem,Apr 47(4):624-30)、CA19.9(Haga,Y.等(1989)Clin Biochem(1989)Oct 22(5):363-8)、NY-ESO-1(癌/睾丸抗原;Chen,Y-T.等,Proc.Nat.Acad.Sci.94:1914-1918,1997)、PSMA(前列腺特异性膜抗原prostate specific membrane antigen;Israeli,R.S.等,Cancer Res.53:227-230,1993)、PSCA(前列腺干细胞抗原prostate stem cell antigen;Reiter,R.E.等,Proc.Nat.Acad.Sci.95:1735-1740,1998)和EpCam(上皮细胞粘附分子epithelialcellular adhesion molecule;Szala,S.等,Proc.Nat.Acad.Sci.87:3542-3546,1990)、HER2(也称为c-erbB2,Coussens,L.等,Science 230:1132-1139,1985)、CAGE(Jager D,等,Cancer Res.1999 Dec 15;59(24):6197-204;Mashino K,等,Br J Cancer.2001 Sep l;85(5):713-20)、CAGE1、CAGE2、细胞角蛋白(Moll R,等,Cell.1982 Nov;31(1):ll-24;BraunS,等,N Engl J Med.2000;342:525-533)、恢复蛋白(recoverin,Maeda A,等,CancerRes.2000Apr 1;60(7):1914-20)、激肽释放酶(kallikrein,Kim H,等,Br J Cancer 2001;84:643-650;Yousef GM,等,Tumor Biol 2002;23:185-192);膜联蛋白(Hudelist G,等,Breast Cancer Res Treat.2004 Aug;86(3):281-91)、甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP;Stiller D,等,Acta Histochem Suppl.1986;33:225-31)、GRP78(Block TM,等,Proc NatlAcad Sci USA.2005 Jan 18;102(3):779-84;Hsu WM,等,Int J Cancer.2005 Mar 1;113(6):920-7)、乳腺珠蛋白(mammoglobin,Zehentner BK,等,Clin Chem.2004 Nov;50(11):2069-76;Zehentner BK,Carter D.Clin Biochem.2004 Apr;37(4):249-57)、raf(CallansLS.等,Ann Surg Oncol.1995 Jan;2(1):38-42;Pratt MA,等,Mol CellBiochem.1998Dec;189(l-2):119-25)、β-人绒毛膜促性腺激素b-HCG(beta-humanchorionic gonadotropin)(Ayala AR,等,Am J Reprod Immunol.1983 Apr-May;3(3):149-51;Gregory JJ Jr,等,Drugs.1999 Apr;57(4):463-7)、或4-5抗原(Krause P,等,JImmunol Methods.2003 Dec;283(l-2):261-7)、SOX2(Stevanovic等,Mammalian genome:offficial journal of the International Mammalian Genome Society,1994,5(10),640-2)、GBU4-5(Krause等,J Immunol Methods 2003;283:261-7)、MAGE(Serrano,等,International journal of cancer.Journal international du cancer,1999,83(5),664-9)、HuD(Szabo等,Cell,1991,67(2),325-33)、HE4、SALL4(Al-Baradie等,Americanjournal of human genetics,2002,71(5),1195-9)、α烯醇化酶(alpha enolase,Lee等,Arthritis and rheumatism,2003,48(7),2025-35)、p62(Zhang等,The Journal ofexperimental medicine,1999,189(7),1101-10)、RalA(Bhullar等,FEBS Letters,1990,260(1),48-52)、细胞周期蛋白B1(Pines等,The Journal of cell biology,1991,115(1),1-17)、钙网蛋白R(calreticulin R,Opas等,Journal of cellular physiology,1991,149(1),160-71)、IMP1(Nielsen等,Molecular and cellular biology,1999,19(2),1262-70)、玻连蛋白(例如VTN10;Hayman等,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,1983,80(13),4003-7)、SSX1(Crew等,TheEMBO journal,1995,14(10),2333-40)、TMP21(Blum等,Journal of BiologicalChemistry,1996,271(29),17183-17189)、NPC1L1C(Davies等,Genomics,2000,65(2),137-45)、TMOD1(Sung等,The Journal ofbiological chemistry,1992,267(4),2616-21)、CAMK1(Haribabu等,The EMBO journal,1995,14(15),3679-86)、RGS1(Watson等,Nature,1996,383(6596),172-5)、PACSIN1(Qualmann等,Molecular biology of the cell,1999,10(2),501-13)、RCV1(Investigative ophthalmology&visual science,34(1),81-90)、MAPKAPK3(Sithanandam等,Molecular and cellular biology,1996,16(3),868-76)、细胞周期蛋白E2(Lauper等,Oncogene,1998,17(20),2637-43)、细胞角蛋白8(CK8)、18(CK18)、19(CK19)、20(CK20)、SCC(Kato等,Cancer,1977,40(4),1621-1628)、proGRP、血清淀粉样蛋白A(Rosenthal等,Journal of immunology(Baltimore,Md.:1950),1976,116(5),1415-8)、α-1-抗胰蛋白酶(Laurell等,Scandinavian Journal of Clinical&LaboratoryInvestigation,1963,15(2),132-140)、载脂蛋白CIII(Ginsberg等,1986)、胸腺素β4(thymoβin β4,Dalakas等,1986)、HDJ1(Ohtsuka,Biochemical and biophysicalresearch communications,1993,197(1),235-40)和HDGF(Zhou等(2010).“OverexpressedHDGF as an independent prognostic factor is involved in poor prognosis inChinese patients with liver cancer.”Diagn Pathol 5:58)。然而,本发明不旨在限于检测针对这些特定肿瘤标志物的自身抗体。
本发明方法的应用
根据本发明的测定方法,特别是检测针对肿瘤标志物蛋白的自身抗体的方法(以单一标志物或组测定形式)可用于多种不同的临床情况。具体地,所述方法可以用于癌症的检测或诊断、评估已诊断患有癌症的患者的预后、预测对治疗的响应、监测患者中癌症或其他赘生性疾病的进展、检测无症状的人对象中的早期赘生性变化或早期致癌变化、筛选无症状的人对象群体以鉴定那些具有提高的发生癌症风险的对象或诊断癌症的存在、预测癌症患者对于抗癌治疗(例如手术切除、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学治疗)的响应、监测癌症患者对于抗癌治疗(例如手术切除、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学治疗)的响应、检测先前诊断为患有癌症且已经历抗癌治疗以减少存在的癌症的量之患者中的复发性疾病,或者选择抗癌疗法(例如手术切除、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学治疗),以用于特定患者。
本发明人一般性地观察到癌症相关的自身抗体的水平示出与疾病状态正相关(也参见WO 99/58979,其内容通过引用并入本文)。此外,本发明人现已观察到,某些二次曲线参数与疾病状态相关。因此,当本发明的方法用于临床应用时,与合适的对照相比,一般将抗肿瘤标志物自身抗体水平提高或二次曲线参数改变作为癌症疾病状态的指示。
例如,当免疫测定用于癌症的诊断时,与“正常”对照个体相比,存在自身抗体水平升高或示出所需方向性的二次曲线参数改变作为个体患有癌症的指示。“正常”对照个体优选是基于临床、成像和/或生化标准没有任何癌症诊断的年龄匹配的对照。
当该免疫测定用于预测癌症患者对于抗癌治疗(例如手术切除、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学治疗)的响应时,与“正常”对照个体相比,存在自身抗体水平升高或示出所需方向性的二次曲线参数改变可作为个体是否可能响应所述抗癌治疗的指示。“正常”对照个体将优选是基于临床、成像和/或生化标准没有任何癌症诊断的年龄匹配的对照。与对照相比,自身抗体水平或二次曲线参数之间的关系,以及治疗的成功可能性可以通过观察对患者的这种治疗的结果来建立,其中在整个治疗中监测患者的自身抗体状态和二次曲线参数。然后可以将之前建立的关系用于基于自身抗体状态和二次曲线参数的评估来预测给定患者中每种治疗的成功可能性。
当该免疫测定用于监测患者中癌症或其他赘生性疾病的进展时,与“正常对照”相比,存在自身抗体水平升高或示出所需方向性的二次曲线参数改变作为患者中癌症存在的指示。“正常对照”可以是存在于对照个体中的自身抗体水平和二次曲线参数,所述对照个体优选年龄匹配,基于临床、成像和/或生化标准没有任何癌症诊断。或者,“正常对照”可以是为特定受试患者建立的“基线”水平。该“基线”水平可以是例如当进行癌症的第一次诊断或复发性癌症的诊断时存在的自身抗体水平和二次曲线参数。高于自身抗体基线水平的任何提高或示出所需方向性的二次曲线参数的任何改变将作为患者中存在的癌症的量已提高的指示,而低于自身抗体基线水平的任何降低或示出阳性读数所需方向性的反向的二次曲线参数的任何改变将作为患者中存在的癌症量已经降低的指示。“基线”值也可以是例如开始新治疗之前的所述水平。自身抗体水平的变化或示出所需方向性的二次曲线参数的变化将作为治疗有效性的指示。对于任何给定的治疗,在计算截止值时将确定指示阳性结果的自身抗体水平或二次曲线参数的“变化”的方向(即,高于还是低于截止值的值被认为是阳性)。阳性读数所需的方向性将取决于抗原和二次曲线参数。
当该免疫测定用于筛选无症状人对象群体时,其可以鉴定那些具有提高的发生癌症风险的对象。与“正常”对照个体相比,自身抗体水平升高或二次曲线参数改变的个体被鉴定为具有发生癌症的“风险”。“正常”对照个体将优选是未鉴定为具有任何发生癌症的倾向或任何显著升高的发生癌症风险的年龄匹配的对照。其例外可能是当年龄本身是主要的风险因素的情况。
当该免疫测定用于筛选无症状人对象群体时,这可以诊断已经发生癌症的那些对象的癌症。与“正常”对照个体相比,自身抗体水平升高或二次曲线参数改变的个体被评分为患有癌症或某种形式的赘生性变化。“正常”对照个体将优选是未鉴定为具有发生癌症的任何倾向的年龄匹配的对照。其例外可能是当年龄本身是主要的风险因素的情况。或者,“正常对照”可以是为特定受试患者建立的“基线”水平。该“基线”水平可以是例如当患者首次测试时存在的自身抗体水平和二次曲线参数,并且发现水平没有升高到高于“正常对照”群体。此后对该基线测量值的任何提高将作为该个体中癌症存在的指示。因此,个体可以通过这样的基线测试,成为他们自己对未来自身抗体测量的对照。
当该免疫测定用于监测癌症患者对于抗癌治疗(例如手术切除、疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学治疗)的响应时,治疗后存在改变的自身抗体水平或改变的二次曲线参数作为患者对所述治疗已经有积极响应的指示。开始治疗之前获得的自身抗体基线水平和基线二次曲线参数可用于比较目的,以确定治疗是否导致自身抗体水平的“提高或降低”。示出所需方向性的二次曲线参数或自身抗体水平的变化将作为治疗有效性的指示。对于任何给定的治疗,在计算截止值时将确定指示阳性结果的自身抗体水平或二次曲线参数的“变化”的方向(即,高于还是低于截止值的值被认为是阳性)。阳性读数所需的方向性将取决于抗原和二次曲线参数。
本发明的方法可用于预测和/或监测个体对基本上任何已知的抗癌治疗的响应。这包括例如其中将单克隆或多克隆抗体输注到患者中的人抗体治疗,非限制性的具体实例是用抗生长因子抗体HerceptinTM治疗(Baselga,J.,D.Tripathy等,J Clin Oncol.,14(3),737-744,1996)。天然自身抗体应答的存在可以增强或抑制用人工输注的治疗性抗体治疗的有效性。使用本发明的方法,可以使任何抗癌治疗(包括抗体治疗)的响应与任何患者或患者组中的治疗进程之前和进程中的自身抗体天然水平和二次曲线参数相关联。然后,该知识又可以进而用于预测其他患者(或在重复治疗的情况下的相同患者)将如何对相同的治疗做出响应。
当该免疫测定用于检测复发性疾病时,与“正常对照”相比,患者中存在自身抗体水平提高或示出所需方向性的二次曲线参数改变作为疾病已复发的指示。“正常对照”可以是存在于对照个体中的自身抗体水平和二次曲线参数,所述对照个体优选为年龄匹配,且基于临床、成像和/或生化标准没有任何癌症诊断。或者,“正常对照”可以是为特定的受试患者建立的“基线”水平。“基线”水平可以是例如基于临床、成像和/或生化标准在疾病缓解期间存在的自身抗体水平和二次曲线参数。
在本发明方法的多种应用中,已经表明存在改变的自身抗体水平或示出所需方向性的改变的二次曲线参数指示了阳性结果。为了避免疑问,应当理解,在一些情况下,对于阳性结果可能需要存在改变的自身抗体水平和示出所需方向性的改变的二次曲线参数。
本发明的测定方法可以用于检测许多不同类型的癌症,其实例是乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、胃肠道癌和黑素瘤。该测定可补充现有的筛选和监督方法。例如,在原发性乳腺癌的情况下,自身抗体的免疫测定可以用于警告临床医生对乳房X线照片上的小病变(其在放射学上不显示可疑)进行活组织检查,或者执行乳腺成像或者比计划更早进行重复成像。在临床中,与当前成像技术(即乳房X线摄影和超声)相比,预期本发明的测定方法更客观和可再现,其成功可以依赖于操作者。
可以考虑具体的临床应用来定制“组测定”。一组用于检测针对至少p53和c-erbB2的自身抗体的抗原特别可用于许多类型的癌症,并且可以任选地补充与特定癌症或特定癌症的阶段具有已知关联的其他标志物补充,进而被检测。例如对于乳腺癌,所述组可以包括MUC1和/或c-myc和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA,而对于膀胱癌该组可以任选地包括MUC1和/或c-myc,对于结肠直肠癌为ras和/或APC,对于前列腺癌为PSA和/或BRCA1和/或BRCA2,或者对于卵巢癌为BRCA1和/或BRCA2和/或CA125,对于肺癌为SOX2和/或CAGE,对于肝细胞癌为甲胎蛋白。还有其他一些优选的实施方案,其中p53或c-erbB2不一定是必需的。
本发明的方法的使用不限于检测抗肿瘤自身抗体,尽管该测定对于该目的特别有用。癌症只是疾病的一个实例,其中抗体水平和二次曲线参数的检测可用作疾病状态/疾病易感性的生物标志物。本发明人已经示出,通过使用滴定方法来检测患者样品中的抗体,并且随后计算二次曲线参数以进行双重截止方法,获得了显著的优势。因此,可以合理地得出结论,通过使用这种方法来检测作为癌症以外的疾病之生物标志物的自身抗体将获得类似的优势。因此,该方法适用于在已经显示(或可以显示)与自身抗体产生相关的任何疾病中检测充当疾病状态或疾病易感性之生物标志物的任何自身抗体。
本发明方法的其他应用包括但不限于检测作为自身免疫病的生物标志物的自身抗体以用于筛选导致器官的功能不全或衰竭的肾脏病或肝病的患者样品,并且用于筛选移植后的患者样品以检测针对患病组织(其在移植后已留在原位)或针对移植组织的抗体的存在,所述自身免疫病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲状腺炎(例如桥本甲状腺炎)、自身免疫性胃炎(例如恶性贫血)、自身免疫性肾上腺炎(例如艾迪生病)、自身免疫性甲状旁腺功能减退、自身免疫性糖尿病(例如1型糖尿病)或重症肌无力、副肿瘤性神经障碍(例如兰伯特-伊顿肌无力综合征)、炎性肠病、结节病和自身免疫性肝炎。
用于进行本发明方法的试剂盒
本发明包括适合于进行本发明的任何一种方法的试剂盒,其中所述试剂盒包含一种或更多种抗原和这样的试剂,所述试剂能够检测与包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中存在的抗体结合的抗原的复合物。
在某些实施方案中,试剂盒可以包含两种或更多种抗原变体,例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种抗原变体。
在另一些实施方案中,试剂盒可以包含用于使所述一种或更多种抗原与体液样品接触的装置。
参考以下非限制性实验实施例将进一步理解本发明。
实施例
实施例1-开发二次曲线参数度量
样品集
为了开发二次曲线参数度量,训练集包括来自在诊断和治疗前取得的原发性肺癌患者(癌症)的337个血清或血浆样品。将这些与来自没有恶性肿瘤证据的个体(正常)的415个血清或血浆样品匹配(针对年龄、性别和吸烟史)。
抗体/抗原结合的标准截止值
如别处所述通过ELISA测量抗体/抗原结合(WO06/126008以及Murray等,AnnOncol.2010Aug 21(8):1687-93)。获得与一定范围浓度的一组七种肿瘤相关抗原(p53,SOX2,CAGE,NY-ESO-1,GBU4-5,MAGE A4和HuD)加上1.6至160nM的对照(VOL)相结合的数据,以提供自身抗体结合的滴定曲线(图2)。对于组中的每种抗原,通过绘制特定结合量相对于滴定系列中使用的抗原量的曲线,从匹配的病例对照研究中确定抗体/抗原结合的截止值。如在WO09/081165中所述,校准160和50nM的每种抗原的结合量,并将其转化为参考单位(RU)。选择滴定曲线上一个或更多个点处抗体结合的截止值以使灵敏度(阳性癌症患者样品的比例)最大化,同时保持高特异性(来自阴性正常个体的样品的比例)。如果其产生了由样品中抗体与抗原滴定系列的反应所绘制的S形曲线,并且如果对滴定曲线上的一个或更多个点测定的值高于预定的截止值,则测量值被认为是阳性的。
二次曲线参数
在滴定系列中检测所使用的每个抗原量的抗原/抗体结合的量,并绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线之后,计算二次曲线参数。二次曲线参数可以由线性或对数回归曲线计算。这里,二次曲线参数是提供曲线性质之指示的任何计算值。例如,二次曲线参数可以是斜率、截距、曲线下面积(AUC)、最大斜率或解离常数(Kd)。
使用以下等式计算斜率:
其中b是斜率,x指抗原浓度(nM),y指吸光度单位(AU)中的OD值。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的斜率。
回归线的截距是当x=0时该线在y轴上的值。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的截距。
可以使用总和梯形规则计算曲线下面积(AUC),其可以通过根据下式估计每组抗原浓度之间的定积分来完成:
对每对连续的抗原浓度重复该计算,并将所得值相加以获得曲线下面积(AUC)的总值。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的曲线下面积(AUC)。
可以使用与上述斜率相同的公式计算最大斜率。然而,为了确定每个样品斜率的最大可能值,获得每对连续的抗原浓度的斜率值,其最大幅度的斜率值表示最大斜率。
可以从线性或对数回归曲线,或者从线性和对数回归曲线两者计算每个样品的最大斜率。
可以通过对每组滴定点拟合四参数逻辑斯蒂曲线计算解离常数(Kd),并且使用迭代求解方法,使用公式F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^B)))+D来给出最小渐近线(A)、斜率因子(B)、拐点(C)和最大渐近线(D)参数的值,由此使残差平方和最小化。该求解数据的拐点对应于抗原-抗体结合的Kd。
一旦获得二次曲线参数,就将其与抗原/抗体结合数据组合以确定抗体的存在与否。
通过绘制在滴定系列中所使用的每个抗原量的特异性结合量相对于抗原量的曲线,确定二次曲线参数的阈值或截止值。使用针对抗体/抗原结合的定量导出的相同测量对癌症和正常两者进行上述过程。这样选择二次曲线参数的截止值,使其当与抗体/抗原结合的截止值组合使用时,最大化特异性(来自阴性正常个体的样品的比例)。在计算二次曲线参数的截止值后,还确定阳性读数所需的方向性,即高于还是低于截止值的值被认为是阳性的。阳性读数所需的方向性将取决于抗原和二次曲线参数。
如果测量值既高于抗体/抗原结合的截止值,并且示出与截止值相比具有所需方向性的改变的二次曲线参数,则认为该测量值最终是阳性的。
结果
图3A至D示出了样品在训练样品集中根据它们的抗体/抗原结合水平相对于每个单独的二次曲线参数的分布。根据通过仅应用标准抗体/抗原结合截止值获得的结果对各个样品进行编码。虽然该数据是对于组中所有7种抗原进行计算的,但是将p53作为实例示出以证明不同参数的效果。可以看出,样品的分布在线性回归数据与对数回归数据简化之间不同,因此这两者都可用于鉴定假阳性样品,从而改进整个测试的性能。
针对将假阳性向真阴性的重新分类优化二次曲线参数截止值(表1),并将其同时应用于抗体/抗原结合水平和二次曲线参数两者。
表1:开发二次曲线参数
根据其抗体/抗原结合相对于最优二次曲线参数的样品分布示于图4A至F中。水平截止值表示标准抗体/抗原结合截止值,而垂直截止值表示二次曲线参数截止值。对于这两个截止值为阳性的象限被称为阳性区,并且很清楚,在该区内存在真阳性的富集;而之前为假阳性的样品主要通过应用二次曲线参数截止值排除并重新分类为真阴性。
应用和不应用二次曲线参数截止值的自身抗体组的性能示于表2中。
表2:应用单截止和双重截止的自身抗体测试的性能特征
虽然通过将几个真阳性样品重新分类为假阴性降低了灵敏度,但是特异性从90%提高到98%。这表示阳性预测值(PPV)从5.8%(每17.2个测试阳性的患者中有1个患有癌症)到19.1%(每5.2个测试阳性的患者中有1个患有癌症)的提高。在诸如肺癌的疾病中,在高风险群体中的流行率为约2%(即50分之1),特异性增加8%将导致每1000名测试者中约少于78名没有癌症的人具有阳性测试结果。这些患者将免除焦虑和随访测试如CT成像和活组织检查的风险。然而,在相同群体中,7%的灵敏度丧失将导致仅有多于1.5个癌症患者被错误诊断(表2)。为了验证这种方法,需要在第二大数据集中确认这些结果。
实施例2-在独立样品集中确认开发的结果
样品集
为了确认通过应用双重截止方法提供的测定性能的改进,样品集包含来自在诊断时和治疗前从原发性肺癌患者(癌症)取得的235个血清或血浆样品。这些与没有恶性肿瘤证据的个体(正常)的266个血清或血浆样品匹配(针对年龄、性别和吸烟史)。在训练和确认样品集中的样品之间没有交叉。
二次曲线参数和截止值确定
如实施例1所述通过ELISA测量抗体/抗原结合。二次曲线参数和阳性读数所需的方向性也如实施例1中所述。标准抗体/抗原结合和二次曲线参数两者截止值如实施例1所述,对这两个样品集之间的优化进行细微调整。
结果
训练集与确认集的比较示于图5A至F中,其描述了根据其抗体/抗原结合相对于最优二次曲线参数的样品信号分布。水平截止值表示标准抗体/抗原结合截止值,而垂直截止值表示二次曲线参数截止值。在阳性区内存在真阳性的富集,而之前假阳性的样品主要在这两个样品集中被排除并重新分类为真阴性。表3示出了在应用和不应用二次曲线参数截止值的情况下,在开发和确认样品集中自身抗体组的性能。
表3:在两个独立样品集中应用单截止和双重截止的自身抗体测试之性能特征的比较
虽然确认性样品集提供比使用标准抗体/抗原结合截止方法的训练集更好的性能数据,但仍维持了通过应用二次曲线参数截止值所提供的特异性的改善以及因此改善的PPV。这证明该方法在两个完全独立的病例对照样品集中是可重复的。
实施例3-通过并入额外抗原来改善组性能
样品集
为了研究通过并入额外抗原可以实现的组性能的改善,使用实施例1中所述的训练集的子集。该集包括来自在诊断和治疗前取得的原发性肺癌患者(癌症)的166个血清或血浆样品。这些与没有恶性肿瘤证据的个体(正常)的147个血清或血浆样品匹配(针对年龄、性别和吸烟史)。
额外抗原
研究了另外四种抗原:α-烯醇化酶、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白20(CK20)和L-myc2在应用双重截止方法时改善自身抗体组的性能的能力。如实施例1所述,通过ELISA测量抗体/抗原结合。二次曲线参数也如实施例1所述。针对新抗原的最大测定性能,优化了抗体/抗原结合和二次曲线参数两者的截止值(表4)。
表4:额外抗原的并入。给出了具有截止值的最优二次曲线参数
结果
对于四种新抗原,根据其抗体/抗原结合相对于最优二次曲线参数的样品分布示于图6A至D中。根据对七抗原组获得的结果对单独样品进行编码。当这四种抗原之前仅以涉及抗体/抗原结合截止值之应用的测定形式进行研究时,其导致灵敏度稍微提高,但是提高的组的特异性为82.3%,因此太低而不能用于临床(表5)。
表5:额外抗原对自身抗体组性能的作用
然而,当应用二次曲线参数截止值并且这些抗原集的两个截止值均使当前七抗原组的性能最大化时,PPV从5.8%(每17个阳性测试中的1个是癌症)提高到19.1%(每5个阳性测试中的1个是癌症)。通过添加四种额外的抗原,组的灵敏度也从29.7%提高到40.4%(表4),而特异性的损失最小。这提供了原理证明:向应用双重截止方法的组添加新抗原可以提高测试灵敏度,而对特异性几乎不产生有害影响,而这在使用单个抗体/抗原结合截止值的情况下是不可能的。
实施例4-通过并入抗原性变体和突变体改善组性能
当在一组癌症患者中测量对相同抗原(例如p53)的几种不同变体形式具有特异性的自身抗体时,在个体患者之间会观察到其产生的自身抗体的特异性的差异(表6)。
表6:100个肺癌患者中p53的几种不同变体的自身抗体阳性。Pos=样品为自身抗体结合阳性,n.d.=无数据。仅示出了对一种或更多种自身抗体呈阳性的样品。
这似乎表明并非所有患者在其疾病进程中均产生相同改变形式的肿瘤相关抗原,并且使用不同的变体形式或突变以改善自身抗体测定的性能是可能的。然而,正常个体也示出针对不同变体形式的肿瘤相关抗原产生自身抗体的证据(表7),推测是由于这样的事实,即他们已经建立了针对恶性转化过程的成功的免疫应答,其在癌症有机会建立自身之前已经根除了癌症。
表7:100个无恶性肿瘤证据的个体中p53的几种不同变体的自身抗体阳性。Pos=样品为自身抗体结合阳性,n.d.=无数据。仅示出了对一种或更多种自身抗体呈阳性的样品。
在表观正常的个体中自身抗体产生的背景水平使得这些生物标志物在早期癌症检测中的使用具有挑战性,除非可以找到一种方法来区分其恶性攻击已被免疫应答根除的那些情况(假阳性)和具有活性肿瘤的那些情况(真阳性)。以下实施例描述了为了研究双重截止方法对包括肿瘤相关抗原的变体或突变形式之自身抗体组的应用而进行的研究。
样品
用于本研究的样品集是训练集的子集,并且包括来自在诊断和治疗前取得的原发性肺癌患者(癌症)的151个血清或血浆样品。这些与没有恶性肿瘤证据的个体(正常)的104个血清或血浆样品匹配(针对年龄、性别和吸烟史)。
抗原性变体和突变
所使用的抗原性变体和突变的列表在表8中给出。
表8:抗原性变体和突变
如实施例1所述通过ELISA测量抗体/抗原结合。二次曲线参数和阳性读数所需的方向性的确定也如实施例1所述。使用净重新分类指数(Net Reclassification Index,NRI)从所有测试中选择最佳抗原以用于添加至最终组,所有测试的包括实施例1至3中描述的所有抗原以及所有变体和突变。
结果
对于选择包括在最终组中的变体和突变,根据其抗体/抗原结合相对于最优二次曲线参数的样品分布示于图7A-G中。根据对七抗原组获得的结果对单独样品进行编码。使用NRI对抗原的性能进行排位并选择用于该组的最佳抗原(表9)。
表9:净重新分类指数的结果。灵敏度和特异性表示为%。Conc=计算标准抗体/抗原结合结果的抗原浓度
最终的组由18种抗原组成,该组的性能示于表10中。
表10:额外抗原、变体和突变对自身抗体组性能的作用
在本实施例中,通过添加测量自身抗体时针对的任何其他抗原,不能获得性能的进一步改善。
实施例5-双重截止方法在肝细胞癌中的应用
肝细胞癌(HCC)是肝脏的恶性疾病。80至90%的病例发生在易患肝病(例如乙型或丙型感染肝炎或酒精性肝硬化)的个体中。在恶性病变仍然小到足以通过手术移除或当肝移植仍然可以治愈时进行早期检测是改善死亡率的关键。在诊断为早期(0期和A期)疾病的患者中HCC具有40至70%的5年存活率,而在诊断为晚期疾病的患者中为5%。目前的监督方法涉及腹部超声和血清甲胎蛋白(AFP)水平的测量。腹部超声的准确性相对较低(特别是对于小的病变)并且取决于操作者技能。患者顺从性也很差,因此迫切需要一种简单的血液测试,其可以增加AFP在高风险组中HCC早期检测的性能。
样品集
为了研究通过将双重截止方法应用于检测HCC的AAb组所提供的测定性能的改善,样品集包括来自在诊断时和癌症治疗之前获取的原发性HCC患者的193个血清或血浆样品。这些与没有恶性肿瘤证据的个体(正常)的190个血清或血浆样品尽可能接近地匹配(针对年龄和性别)。第二对照组由来自良性肝病(例如乙型肝炎、丙型肝炎或肝硬化)的患者的176个样品组成。
二次曲线参数和截止值确定
如实施例1所述通过ELISA测量抗体/抗原结合。二次曲线参数和阳性读数所需的方向性也如实施例1所述。标准抗体/抗原结合和二次曲线参数两者的截止值均如实施例1所述确定。测量的自身抗体和在用于HCC早期检测的测定中所应用的二次曲线参数示于表11中。抗体/抗原结合和二次曲线参数截止值都针对最大测定性能进行了优化。
表11:开发用于HCC早期检测之测定的二次曲线参数。
结果
对于初始HCC组抗原,根据其抗体/抗原结合相对于最优二次曲线参数的样品分布示于图8A至F中,且六种额外抗原的分布示于图9A至F中。水平截止值表示标准抗体/抗原结合截止值,而垂直截止值表示二次曲线参数截止值。在阳性区内存在真阳性的富集,而在这两个样品集中之前为假阳性的样品主要被排除并重新分类为真阴性。表12示出应用和不应用二次曲线参数截止值的自身抗体的性能,以及通过并入额外六种抗原以用于测量自身抗体所提供的改善。可以看出,双重截止值的应用能够将良性组群中的特异性提高至100%,而灵敏度仅有小的降低,并且添加另外6种抗原能够产生与初始6抗原组相比具有改善的特异性和灵敏度的扩展组。这产生一种测定,其中每1000名测试的患者仅给出6个假阳性调用(false positive call)。
表12:应用二次参数截止值且包括额外抗原对用于检测HCC的自身抗体组性能的作用。
*使用良性患者组群测量特异性,因为其是使用这样的测试进行监督的高风险组。
Claims (8)
1.检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触;
(b)检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量;
(c)对步骤(a)中使用的每个抗原量,绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的曲线;
(d)从在步骤(c)中绘制或计算的所述曲线计算二次曲线参数,
其中所述二次曲线参数选自斜率、截距、曲线下面积(AUC)、最大斜率或解离常数(Kd),或者
其中所述二次曲线参数是拟合到在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的逻辑斯蒂曲线的最大渐近线、最小渐近线、Hill斜率或拐点;以及
(e)基于以下组合确定所述抗体的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
2.检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的两种或更多种抗体的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使所述测试样品与包含两个或更多个抗原集的组接触,其中所述组中的每种所述抗原对所述两种或更多种抗体中的至少一种具有特异性;
(b)检测与存在于所述测试样品中的抗体结合的所述抗原的复合物;
(c)对于每种抗原,对步骤(a)中使用的每个抗原量绘制或计算所述特异性结合量相对于所述抗原量的各自的曲线;
(d)计算步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的二次曲线参数,
其中所述二次曲线参数选自斜率、截距、曲线下面积(AUC)、最大斜率或解离常数(Kd),或者
其中所述二次曲线参数是拟合到在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的逻辑斯蒂曲线的最大渐近线、最小渐近线、Hill斜率或拐点;以及
(e)对于在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线,基于以下组合确定所述两种或更多种抗体的存在与否:
(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量;和
(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。
3.权利要求2所述的方法,其中所述组的所述两种或更多种抗原是不同的抗原。
4.权利要求3所述的方法,其中所述组包含一种或更多种所述不同抗原的两种或更多种抗原变体。
5.权利要求2所述的方法,其中所述组的所述两种或更多种抗原是抗原变体。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述抗原是天然存在的蛋白质或多肽、重组蛋白质或多核苷酸、合成的蛋白质或多肽、合成肽、肽模拟物、多糖或核酸。
7.权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述抗体是自身抗体。
8.权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述二次曲线参数选自斜率、截距、曲线下面积(AUC)、最大斜率或解离常数(Kd),并且所述二次曲线参数由线性或对数回归曲线计算。
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