CN106153893B - 唾液抗线粒体抗体m2型的酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术和医学检测领域,旨在提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒中包括下述组分:AMA‑M2标准品;M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板;酶标二抗:辣根过氧化物酶标记的抗人IgG;样本稀释液:质量浓度0.1%的BSA‑PBS溶液;辅助试剂:底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。本发明所用试剂盒使用更为简便,能够直接检测体检者唾液中的AMA‑M2表达水平,是一种无创的检测手段,解决了血液途径检测存在的不足。本发明能够更加安全、方便、快捷地应用于PBC的筛查,辅助PBC的诊断,为后期疾病的治疗和改善患者预后提供数据支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学检测领域,具体为唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒,旨在建立一种快速、无创检测人体内AMA-M2水平的技术。
背景技术
酶联免疫吸附实验法(ELISA)是分析化学领域中较为成熟的技术之一,是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种免疫测定技术。该技术采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用酶标仪加以测定。其方法简单,方便迅速,特异性强,敏感度高,易于推广。
PBC是一种自身免疫性肝病,主要表现为肝内小胆管的进行性破坏,最终导致肝硬化,甚至肝衰竭,严重危害人类健康。因PBC发病隐匿,疾病的早期筛查、早期发现和早期处理,对PBC的治疗和病人的预后十分重要。抗线粒体抗体(AMA),特别是抗线粒体抗体M2型(AMA-M2),是PBC的特异性血清学标志,其特异度和灵敏度都高达95%以上,是目前临床用于诊断PBC的重要指标。现有的血液检测技术虽十分成熟,但其自身有一定的局限性:1、首先血液的获取是一种有创的手段,样本的获取需要有专业的技术;2、血液获取过程中,受试者易产生不适感和一定感染风险;3、血液样本的获取和处理成本较高。正因为这些缺陷的存在,血液检测并不利于原发性胆汁性肝硬化的大规模筛查,寻找一种无创便捷的介质进行AMA-M2检测是十分必要的。
唾液是一种无色且稀薄的液体,唾液中含有电解质,蛋白质,酶,细胞因子等成分。唾液主要由唾液腺分泌,而外周血中的成分可以通过被动扩散,主动运输,超滤等方式进入唾液。因此,唾液可以在一定程度上反映外周血的情况,而且唾液的获取具有无创,易获得,技术要求低,成本低等诸多优势,是一种理想的血清替代品。目前,用于检测AMA-M2局限于血液途径,利用唾液进行AMA-M2检测的试剂盒和方法还没出现。本发明主要是利用改良的AMA-M2检测试剂盒进行唾液中AMA-M2检测的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术中的不足,提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。
为解决技术问题,本发明的解决方案是:
提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒,该试剂盒中包括下述组分:
AMA-M2标准品;
M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板;
酶标二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG;
样本稀释液:质量浓度0.1%的BSA-PBS溶液;
辅助试剂:底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。
本发明中,所述样本稀释液的配制方法为:取牛血清白蛋白1g,加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L,充分溶解。
本发明中,所述底物显色液为TMB/H2O2,是通过下述方法配制获得:
(1)配制底物显色液A:
取四甲基联苯胺(TMB)20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml,以ddH2O定容至50ml后混匀,避光保存;
(2)配制底物显色液B:
取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30%过氧化氢(H2O2)30ul,以ddH2O定容至50ml后混匀;
(3)使用前,将底物显色液A、B液等体积混匀,即得底物显色液TMB/H2O2。
本发明中,所述反应终止液为:0.5M硫酸。
本发明中,所述清洗缓冲液是质量浓度0.05%的Tween20-PBS溶液;其配制方法为:取吐温20500ul,加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L,充分溶解。
本发明进一步提供了所述试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)将获取的唾液样本离心后吸取上清,用0.1%BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释;
(2)用0.1%BSA-PBS溶液稀释AMA-M2标准品为8个梯度:AMA-M2含量分别为:1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml;第8个(0RU/ml)设为空白对照孔,直接采用样本稀释液;
(3)在M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品和样本,室温孵育30分钟;弃去孔中液体,每孔加300ul配好洗液,60秒后将微孔板中液体倒出,并在吸水纸上拍打去除残留液体,重复清洗3次;
(4)每孔加入100ul酶标二抗,室温孵育30分钟后,弃去孔中液体,清洗3次;
(5)每孔加入100ul显色液,室温孵育15分钟,再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应;
(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值,以450nm平均吸光值为横坐标,各标准品浓度为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。
与现有技术相比,本发明的技术效果在于:
本发明所用试剂盒使用更为简便,能够直接检测体检者唾液中的AMA-M2表达水平,是一种无创的检测手段,解决了血液途径检测存在的不足。本发明能够更加安全、方便、快捷地应用于PBC的筛查,辅助PBC的诊断,为后期疾病的治疗和改善患者预后提供数据支持。
附图说明
图1为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平标准曲线图;
图2为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平图;
图3为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施进一步阐述本发明,应理解,以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
本发明实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
统计学方法:采用SPSS19.0统计分析软件分析,各样本均数的比较采用t检验分析,样本之间相关性分析采用pearson相关分析。
唾液样本采集管均购自BD公司,离心管和离心机购自Thermo公司,牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司,酶标仪购自Bio-Rad公司。AMA-M2标准品、M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板和酶标二抗均可通过正常的商业渠道获得。
实施例1
试剂盒灵敏度考察:
A:将AMA-M2标准品用样本稀释液(0.1%BSA-PBS溶液)倍比稀释(1∶2体积比)成8个梯度,使AMA-M2含量分别为:
1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的标准品;其中第8个(0RU/ml)设为空白对照孔,直接为样本稀释液。
B:抗原-抗体反应,在所述M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列,各设1复空),室温孵育30分钟后,弃去孔中液体,每孔加300ul配好洗液,60秒后将微孔板中液体倒出,并在吸水纸上拍打去除残留液体,重复清洗3次。
C:每孔加入100ul所述酶标二抗,室温孵育30分钟后,弃去孔中液体,清洗3次,方法同上。
D:显色反应:每孔加入100ul底物显色液,室温孵育约15分钟,再以加底物显色液相同顺序加入反应终止液(0.5M硫酸)结束反应。
E:比色:酶标仪450nm波长读取OD值并记录。
F:制作标准曲线:以450nm平均OD值为横坐标,各标准品浓度为纵坐标,绘制标准曲线。计算标准曲线回归系数R2,当R2>0.99时本次测定有效。
计算AMA-M2标准品与空白对照的比值,当比值大于2时,说明试剂盒可以测定该浓度的AMA-M2的标准品,最低浓度即为试剂盒的灵敏度,平行试验五次取平均值,具体结果如下:
根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归,得回归方程为:
y=0.5241x1.1382,R2=0.9984
上述数据表明,本试剂盒在0.015625RU/ml浓度下,灵敏度良好。
实施例2
一、利用本发明所述试剂盒检测唾液中AMA-M2水平的方法,包括以下步骤:
从参加体检的人群中获取唾液样本。
该步骤具体包括:
A:唾液收集前嘱受试者大量清水漱口,漱口完成5分钟后开始唾液收集。B:嘱受试者平躺张嘴,开口器固定,使唾液自然流出并于口底聚集。约60s后用吸引器吸取口中唾液于15ml离心管。重复多次,得唾液1-3ml。
C:唾液离心,4℃,500g,10min,离心后吸取上清分装于1.5ml离心管备用。
二、通过酶联免疫吸附实验法检测唾液中AMA-M2水平
该步骤具体包括:
将离心后的唾液样本用0.1%BSA-PBS溶液稀释(1∶40);
AMA-M2试剂盒标准品用0.1%BSA-PBS溶液倍比稀释(1∶2)成8个梯度,其中第8个设为空白孔,稀释成AMA-M2含量分别为1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/Ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的标准品。
在预先包被有M2抗原的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列,各设1复空)和样本。室温孵育30分钟后,弃去孔中液体,每孔加300ul配好洗液,60秒后将微孔板中液体到处并在吸水纸上拍打去除残留液体,重复清洗3次。
每孔加入100ul酶标二抗,室温孵育30分钟后,弃去孔中液体,清洗3次,方法同上。
每孔加入100ul底物显色液,室温孵育约15分钟,再以加底物显色液相同顺序加入100ul终止液终止反应。
酶标仪450nm波长读取OD值,以450nm平均吸光值为横坐标,各标准品浓度为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。
该实例中,据以判断的数据来源是:从2014年9月至2015年12月共收集健康人、PBC患者(临床已确诊)唾液共40例,两组群体年龄、性别大致匹配,符合PBC的流行病学特征。实验证明我们改良后的试剂盒和方法能够用于检测唾液中的AMA-M2,实验比较两组间唾液中AMA-M2表达水平后,通过ROC曲线分析,发现该方法还可应用于诊断PBC,并得出其诊断PBC的唾液AMA-M2水平临界值为0.3965(AUC=0.8283,95%可信区间0.6937~0.9628,敏感度83.33%,特异度77.27%),高于临界值则视为患原发性胆汁性肝硬化可能。
应用实例
该实施采用具体实例1的操作步骤,收集浙江大学附属第一医院感染科原发性胆汁性肝硬化患者10例、国际体检中心健康体检者10例的唾液样本。经检测,PBC患者唾液中AMA-M2均高于临界值0.3965。而健康体检者唾液中AMA-M2均低于临界值0.3965。
基于该分析结果,本发明的试剂盒可用于检测唾液AMA-M2,可以对体检病人是否患有原发性胆汁性肝硬化进行初步筛查,为后续检测提供依据。
Claims (2)
1.一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒中包括下述组分:
AMA-M2标准品;
M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板;
酶标二抗:辣根过氧化物酶标记的抗人IgG;
样本稀释液:质量浓度0.1%的BSA-PBS溶液;
辅助试剂:底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液;
所述样本稀释液的配制方法为:取牛血清白蛋白1g,加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L,充分溶解;
所述底物显色液为TMB/H2O2,是通过下述方法配制获得:
(1)配制底物显色液A:
取四甲基联苯胺20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml,以ddH2O定容至50ml后混匀,避光保存;
(2)配制底物显色液B:
取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30%过氧化氢30ul,以ddH2O定容至50ml后混匀;
(3)使用前,将底物显色液A、B液等体积混匀,即得底物显色液TMB/H2O2;
所述反应终止液为:0.5M硫酸;
所述清洗缓冲液是质量浓度0.05%的Tween20-PBS溶液;其配制方法为:取吐温20500ul,加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L,充分溶解。
2.权利要求1所述试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将获取的唾液样本离心后吸取上清,用0.1%BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释;
(2)用样本稀释液稀释AMA-M2标准品为8个梯度:AMA-M2含量分别为1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml;第8个0RU/ml设为空白对照孔,直接采用样本稀释液;
(3)在M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品和样本,室温孵育30分钟;弃去孔中液体,每孔加300ul配好洗液,60秒后将微孔板中液体倒出,并在吸水纸上拍打去除残留液体,重复清洗3次;
(4)每孔加入100ul酶标二抗,室温孵育30分钟后,弃去孔中液体,清洗3次;
(5)每孔加入100ul显色液,室温孵育15分钟,再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应;
(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值,以450nm平均吸光值为横坐标,各标准品浓度为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。
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