CN109085344A - 利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学检测领域，涉及一种血清外泌体PIGR，具体来说是血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断标记物及预测疗效的用途。本发明采用的技术方案是：一种利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中包括下述组分：pIgR标准品；pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗；样本稀释液；辅助试剂。试剂盒的应用方法技术方案，包括以下步骤：(1)制成样本稀释液；(2)用BSA‑PBS溶液稀释pIgR标准品为8个梯度；(3)在微孔板中加入标准品和样本稀释液；(4)每孔加入酶标二抗；(5)每孔加入显色液；(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，绘制标准曲线，换算出样本中pIgR浓度。通过采用上述方案实现新的试剂盒和应用。

Description

利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预 测的标志物的试剂盒及应用

技术领域

本发明属于医学检测领域，涉及一种血清外泌体PIGR，具体来说是血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断标记物及预测疗效的用途。

背景技术

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis ,PBC)，旧称原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)，是一种累及肝内胆管系统的慢性进展性自身免疫性疾病，主要表现为肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变，最终导致纤维化、肝硬化甚至肝癌。本病主要发生于中年以上女性，男性病例仅占10％。目前，血清中的抗线粒体抗体及其M2亚型是PBC最重要的辅助诊断指标，但该指标存在一定比例的漏诊和误诊，而且无法判断PBC的病情进展。而对于AMA及其M2亚型阴性的PBC患者，其诊断主要依赖于肝组织学检测，但这种损伤性检查许多患者不愿接受。熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是目前唯一被批准用于长期治疗PBC的药物，其2年生化应答率可预测长期生存率及并发症发生率，但高达40%的PBC患者对UDCA治疗应答不佳；应答不佳的PBC患者只能选择肝脏移植，却往往受限于短缺的肝源和昂贵的治疗费用。因此，对PBC患者进行早期诊断、治疗及疗效判断，具有重要的社会意义。

近年来，液体活检相关的研究越来越受到关注，而外泌体作为其中之一，其相关的生物标志物研究为PBC的诊断、预后预测开拓了新思路，有望进一步提高PBC诊断、预后的精确性，完善诊疗策略。

外泌体是一类直径约40-150nm的双层脂质膜包被的细胞外囊泡，由细胞膜包裹一些细胞因子、生物活性物质及膜表面受体内陷，在细胞内包装完成后再释放至细胞外基质中，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。外泌体广泛存在于血液、尿液、腹水等人体大多数体液中；含量也极为丰富，每毫升血浆中就含有10^8-13个；可携带多种生物活性物质，包括细胞特异蛋白、脂质体及核酸，并能作为信号分子向其他细胞传递信息；稳定性极高，在各种冷冻冷藏和解冻条件下都可保存长达数年。这些优点使外泌体具有成为新型生物标志物的潜能。

近年来的一些研究也证明了这点。已有研究表明通过检测尿液中外泌体RNA的PCA3、SPDEF及ERG指标，可以辅助判断被检者是否患有前列腺癌。另一项研究表明，通过血液/血浆中的外泌体RNA和循环肿瘤DNA，可以对肿瘤相关的170个基因、82000个突变类型进行检测，敏感度高达99.9%。而在外泌体蛋白研究方面，目前ExosomeDX研发的Shahky系统能够在包括血液、脑脊液、尿液、唾液、腹水等体液中检测某些疾病的特异性外泌体蛋白指标，其灵敏度高于传统的ELISA、WB技术。

聚免疫球蛋白受体pIgR是一类炎症调控子，目前已知的功能是把聚合免疫球蛋白从基底外侧转胞吞到上皮顶端，促进IgA和IgM的分泌，形成机体抵御炎症的第一道屏障。近年来，有文献报道pIgR作为肝癌的辅助诊断标志物具有较高的敏感性和特异性。此外，pIgR还参与乙型肝炎病毒感染、肝脏的慢性炎症、诱发内皮间充质转化、肝癌复发以及转移浸润。迄今为止，尚无文献报道pIgR对PBC的诊断和UDCA疗效预测价值，该指标亦尚未在临床上得到应用。

发明内容

本发明主要解决现有技术中对于诊断原发性胆汁性胆管炎或者预测熊去氧胆酸治疗原发性胆汁性胆管炎疗效的手段有限、效果不佳的问题，提供一种在于利用血清外泌体PIGR作为原发性胆汁性胆管炎的诊断及预测疗效的标记物的剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中包括下述组分：

pIgR标准品；

pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；

样本稀释液：质量浓度0 .1％的BSA-PBS溶液；

辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

本发明试剂盒进一步设置是：所述样本稀释液为牛血清白蛋白加入pH7 .4的0.01M磷酸盐缓冲溶液中充分溶解，每升磷酸盐缓冲溶液中加入1克牛血清白蛋白；

所述底物显色液为TMB/H2O2，所述反应终止液为：0 .5M硫酸，清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液。

本发明试剂盒再进一步设置是：所述底物显色液由底物显色液A和底物显色液B等体积混匀混合而成；

其中底物显色液A有四甲基联苯胺(TMB)、DMSO、EDTA-Na、柠檬酸、甘油，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液A中有甲基联苯(TMB)40mg、DMSO4ml、EDTA-Na40mg、柠檬酸190mg、甘油10ml；

底物显色液B有取醋酸钠、柠檬酸、30％过氧化氢(H2O2)，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液B中含有醋酸钠2.72g、柠檬酸0.32g、30％过氧化氢(H2O2)60ul；

本发明试剂盒最后设置是：所述清洗缓冲液由吐温加入pH7 .4的0 .01M磷酸盐缓冲溶液1L中溶解制成，其中每1L磷酸盐缓冲溶液中加入20500ul的吐温。

通过采用上述方案实现试剂盒，是一种新型的利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒。

本发明试剂盒的应用的技术方案是：包括以下步骤：

(1)将获取的血清样本于2500-3500g常温离心10-20分钟，用微量移液器抽取上层清液至另一干净灭菌管中，加入外泌体提取试剂轻轻上下颠倒摇匀，每100μl血清样本中加入25μl的外泌体，3.8-4.2℃静置25-35分钟。1200-1700g常温离心25-35分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体，用0 .1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释形成样本稀释液；

(2)用0 .1％BSA-PBS溶液稀释pIgR标准品为8个梯度：pIgR含量分别为8RU/ml、4RU/ml、2RU/ml、1RU/ml、0 .5RU/ml、0 .25RU/ml、0 .125RU/ml、0RU/ml；第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接采用样本稀释液；

(3)在pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul的稀释好的标准品和样本稀释液，室温孵育25-35分钟；弃去微孔板孔中液体，每孔加等量配好清洗缓冲液，50-70秒后将微孔板孔中液体倒出，去除残留液体，清洗缓冲液重复清洗3次；

(4)每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育25-35分钟后，弃去孔中液体，用清洗缓冲液清洗3次；

(5)每孔加入100ul显色液，室温孵育13-17分钟，再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应；

(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中pIgR浓度。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

附图说明

图1 Western blot法检测到外泌体表面标志性蛋白CD63，TSG101的表达水平；

图2 ELISA试剂盒检测PBC组和对照组血清外泌体pIgR的表达水平；

图3 ELISA试剂盒检测UDCA治疗PBC生化应答佳组和应答不佳组血清外泌体pIgR的表达水平。

具体实施方式

一种利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，该试剂盒中包括下述组分：pIgR标准品；pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；样本稀释液：质量浓度0 .1％的BSA-PBS溶液；辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

在本实施例中，样本稀释液为牛血清白蛋白加入pH7 .4的0 .01M磷酸盐缓冲溶液中充分溶解，每升磷酸盐缓冲溶液中加入1克牛血清白蛋白；所述底物显色液为TMB/H2O2，所述反应终止液为：0 .5M硫酸，清洗缓冲液是质量浓度0 .05％的Tween20-PBS溶液。所述底物显色液由底物显色液A和底物显色液B等体积混匀混合而成；其中底物显色液A有四甲基联苯胺(TMB)、DMSO、EDTA-Na、柠檬酸、甘油，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液A中有甲基联(TMB)40mg、DMSO4ml、EDTA-Na40mg、柠檬酸190mg、甘油10ml；底物显色液B有取醋酸钠、柠檬酸、30％过氧化氢(H2O2)，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液B中含有醋酸钠2.72g、柠檬酸0.32g、30％过氧化氢(H2O2)60ul；所述清洗缓冲液由吐温加入pH7 .4的0 .01M磷酸盐缓冲溶液1L中溶解制成，其中每1L磷酸盐缓冲溶液中加入20500ul的吐温。

试剂盒应用的实施例：

一、研究对象

100例人血清标本均来自于温州医科大学附属第一医院。其中50例原发性胆汁性胆管炎患者均接受UDCA标准治疗满2年（13-15mg/kg ▪d），其中生化学应答佳组30例，生化学应答不佳组20例；50例健康对照者为体检中心筛查完成的健康志愿者。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一致。

二、研究方法

1 .原发性胆汁性胆管炎和正常血清外泌体蛋白的抽提，

各取血清200μl于3000g常温离心15分钟，用微量移液器抽取上层清液至另一干净灭菌管中，加入50μl外泌体提取试剂轻轻上下颠倒摇匀，4℃静置30分钟。1500g常温离心30分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体。-80℃保存。

2.Western blot法检测外泌体表面标志性蛋白：外泌体蛋白悬液用Bradford法进行蛋白浓度定量，经电泳、结膜封闭后分别与CD63、TSG101一抗4℃孵育过夜。次日将膜与HRP标记的二抗室温反应60min，加入化学发光底物显色观察。

3. ELISA法检测血清外泌体pIgR水平

试剂盒灵敏度考察：

A：将pIgR标准品用样本稀释液(0 .1％BSA-PBS溶液)倍比稀释(1∶2体积比)成8个梯度，使pIgR含量分别为8RU/ml、4RU/ml、2RU/ml、1RU/ml、0 .5RU/ml、0 .25RU/ml、0 .125RU/ml、0RU/ml；其中第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接为样本稀释液。

B：抗原-抗体反应，在所述pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列，各设1复空) ，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体倒出，并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次。

C：每孔加入100ul所述酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次，方法同上。

D：显色反应：每孔加入100ul底物显色液，室温孵育约15分钟，再以加底物显色液相同顺序加入反应终止液(0 .5M硫酸)结束反应。

E：比色：酶标仪450nm波长读取OD值并记录。

F：制作标准曲线：以450nm平均OD值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线。计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0 .99时本次测定有效。

计算pIgR标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的pIgR的标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下（表一）：

	0.0125RU/mLpIgR标准品	空白对照	OD比值
				450nmOD值	0.0289	0.007	4.13

根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为： y = 4.429x -0.003，R2＝0.998。结果如表1所示。

通过酶联免疫吸附实验法检测血清外泌体pIgR水平

该步骤具体包括：

将离心后的唾液样本用0 .1％BSA-PBS溶液稀释(1∶40)；

血清外泌体pIgR试剂盒标准品用0 .1％BSA-PBS溶液倍比稀释(1∶2)成8个梯度，其中第8个设为空白孔，稀释成血清外泌体pIgR含量分别为8RU/ml、4RU/ml、2RU/ml、1RU/ml、0.5RU/ml、0 .25RU/ml、0 .125RU/ml、0RU/ml的标准品。

在预先包被有血清外泌体pIgR抗原的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列，各设1复空)和样本。室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体到处并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次。

每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次，方法同上。

每孔加入100ul底物显色液，室温孵育约15分钟，再以加底物显色液相同顺序加入100ul终止液终止反应。

酶标仪450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中血清外泌体pIgR浓度。

三、研究结果

如图1所示，检测到外泌体表面标志性蛋白CD63，TSG101的表达。以上结果表明本发明成功提取了血清中的外泌体。

如表1所示，本ELISA试剂盒在0.0125RU/ml浓度下，灵敏度良好。

如图2所示，通过ELISA技术对50例PBC患者及50例对照组的血清外泌体pIgR进行了检测，结果显示PBC患者血清外泌体pIgR的表达水平明显高于对照组(P<0 .05)。

如图3所示，对于接受UDCA治疗的PBC患者，生化学应答佳者相比应答不佳者pIgR含量显著下降（P<0 .05）。

Claims (6)

1.一种利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中包括下述组分：

pIgR标准品；

pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；

样本稀释液：质量浓度0 .1％的BSA-PBS溶液；

辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

2.根据权利要求1所述的利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为牛血清白蛋白加入pH7 .4的0 .01M磷酸盐缓冲溶液中充分溶解，每升磷酸盐缓冲溶液中加入1克牛血清白蛋白；

所述底物显色液为TMB/H2O2，所述反应终止液为：0 .5M硫酸，清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液。

3.根据权利要求2所述的利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，其特征在于：所述底物显色液由底物显色液A和底物显色液B等体积混匀混合而成；

其中底物显色液A有四甲基联苯胺(TMB)、DMSO、EDTA-Na、柠檬酸、甘油，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液A中有甲基联苯(TMB)40mg、DMSO4ml、EDTA-Na40mg、柠檬酸190mg、甘油10ml；

底物显色液B有取醋酸钠、柠檬酸、30％过氧化氢(H2O2)，以ddH2O定容后混匀，其中每100ml底物显色液B中含有醋酸钠2.72g、柠檬酸0.32g、30％过氧化氢(H2O2)60ul。

4.根据权利要求2所述的利用血清外泌体pIgR作为原发性胆汁性胆管炎诊断及疗效预测的标志物的试剂盒，其特征在于：所述清洗缓冲液由吐温加入pH7 .4的0 .01M磷酸盐缓冲溶液1L中溶解制成，其中每1L磷酸盐缓冲溶液中加入20500ul的吐温。

5.权利要求1所述的试剂盒的应用方法，其特征在于：

包括以下步骤：

(1)将获取的血清样本于2500-3500g常温离心10-20分钟，用微量移液器抽取上层清液至另一干净灭菌管中，加入外泌体提取试剂轻轻上下颠倒摇匀，每100μl血清样本中加入25μl的外泌体，3.8-4.2℃静置25-35分钟。

6.1200-1700g常温离心25-35分钟，弃掉上清液，所得沉淀即为血清中的外泌体，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释形成样本稀释液；

(2)用0 .1％BSA-PBS溶液稀释pIgR标准品为8个梯度：pIgR含量分别为8RU/ml、4RU/ml、2RU/ml、1RU/ml、0 .5RU/ml、0 .25RU/ml、0 .125RU/ml、0RU/ml；第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接采用样本稀释液；

(3)在pIgR抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul的稀释好的标准品和样本稀释液，室温孵育25-35分钟；弃去微孔板孔中液体，每孔加等量配好清洗缓冲液，50-70秒后将微孔板孔中液体倒出，去除残留液体，清洗缓冲液重复清洗3次；

(4)每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育25-35分钟后，弃去孔中液体，用清洗缓冲液清洗3次；

(5)每孔加入100ul显色液，室温孵育13-17分钟，再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应；

(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中pIgR浓度。