CN106153893A - 唾液抗线粒体抗体m2型的酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和医学检测领域，旨在提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒中包括下述组分：AMA‑M2标准品；M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG；样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA‑PBS溶液；辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。本发明所用试剂盒使用更为简便，能够直接检测体检者唾液中的AMA‑M2表达水平，是一种无创的检测手段，解决了血液途径检测存在的不足。本发明能够更加安全、方便、快捷地应用于PBC的筛查，辅助PBC的诊断，为后期疾病的治疗和改善患者预后提供数据支持。

Description

唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术和医学检测领域，具体为唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，旨在建立一种快速、无创检测人体内AMA-M2水平的技术。

背景技术

酶联免疫吸附实验法(ELISA)是分析化学领域中较为成熟的技术之一，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种免疫测定技术。该技术采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用酶标仪加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强，敏感度高，易于推广。

PBC是一种自身免疫性肝病，主要表现为肝内小胆管的进行性破坏，最终导致肝硬化，甚至肝衰竭，严重危害人类健康。因PBC发病隐匿，疾病的早期筛查、早期发现和早期处理，对PBC的治疗和病人的预后十分重要。抗线粒体抗体(AMA)，特别是抗线粒体抗体M2型(AMA-M2)，是PBC的特异性血清学标志，其特异度和灵敏度都高达95％以上，是目前临床用于诊断PBC的重要指标。现有的血液检测技术虽十分成熟，但其自身有一定的局限性：1、首先血液的获取是一种有创的手段，样本的获取需要有专业的技术；2、血液获取过程中，受试者易产生不适感和一定感染风险；3、血液样本的获取和处理成本较高。正因为这些缺陷的存在，血液检测并不利于原发性胆汁性肝硬化的大规模筛查，寻找一种无创便捷的介质进行AMA-M2检测是十分必要的。

唾液是一种无色且稀薄的液体，唾液中含有电解质，蛋白质，酶，细胞因子等成分。唾液主要由唾液腺分泌，而外周血中的成分可以通过被动扩散，主动运输，超滤等方式进入唾液。因此，唾液可以在一定程度上反映外周血的情况，而且唾液的获取具有无创，易获得，技术要求低，成本低等诸多优势，是一种理想的血清替代品。目前，用于检测AMA-M2局限于血液途径，利用唾液进行AMA-M2检测的试剂盒和方法还没出现。本发明主要是利用改良的AMA-M2检测试剂盒进行唾液中AMA-M2检测的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒中包括下述组分：

AMA-M2标准品；

M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；

样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA-PBS溶液；

辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

本发明中，所述样本稀释液的配制方法为：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。

本发明中，所述底物显色液为TMB/H₂O₂，是通过下述方法配制获得：

(1)配制底物显色液A：

取四甲基联苯胺(TMB)20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml，以ddH₂O定容至50ml后混匀，避光保存；

(2)配制底物显色液B：

取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30％过氧化氢(H₂O₂)30ul，以ddH₂O定容至50ml后混匀；

(3)使用前，将底物显色液A、B液等体积混匀，即得底物显色液TMB/H₂O₂。

本发明中，所述反应终止液为：0.5M硫酸。

本发明中，所述清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法为：取吐温20500ul，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。

本发明进一步提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将获取的唾液样本离心后吸取上清，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释；

(2)用0.1％BSA-PBS溶液稀释AMA-M2标准品为8个梯度：AMA-M2含量分别为：1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml；第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接采用样本稀释液；

(3)在M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品和样本，室温孵育30分钟；弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体倒出，并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次；

(4)每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次；

(5)每孔加入100ul显色液，室温孵育15分钟，再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应；

(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。

与现有技术相比，本发明的技术效果在于：

本发明所用试剂盒使用更为简便，能够直接检测体检者唾液中的AMA-M2表达水平，是一种无创的检测手段，解决了血液途径检测存在的不足。本发明能够更加安全、方便、快捷地应用于PBC的筛查，辅助PBC的诊断，为后期疾病的治疗和改善患者预后提供数据支持。

附图说明

图1为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平标准曲线图；

图2为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平图；

图3为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

统计学方法：采用SPSS19.0统计分析软件分析，各样本均数的比较采用t检验分析，样本之间相关性分析采用pearson相关分析。

唾液样本采集管均购自BD公司，离心管和离心机购自Thermo公司，牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司，酶标仪购自Bio-Rad公司。AMA-M2标准品、M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板和酶标二抗均可通过正常的商业渠道获得。

实施例1

试剂盒灵敏度考察：

A：将AMA-M2标准品用样本稀释液(0.1％BSA-PBS溶液)倍比稀释(1∶2体积比)成8个梯度，使AMA-M2含量分别为：

1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的标准品；其中第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接为样本稀释液。

B：抗原-抗体反应，在所述M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列，各设1复空)，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体倒出，并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次。

C：每孔加入100ul所述酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次，方法同上。

D：显色反应：每孔加入100ul底物显色液，室温孵育约15分钟，再以加底物显色液相同顺序加入反应终止液(0.5M硫酸)结束反应。

E：比色：酶标仪450nm波长读取OD值并记录。

F：制作标准曲线：以450nm平均OD值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线。计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效。

计算AMA-M2标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的AMA-M2的标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：

根据不同浓度标准品获得吸光度数据进行回归，得回归方程为：

y＝0.5241x^1.1382，R²＝0.9984

上述数据表明，本试剂盒在0.015625RU/ml浓度下，灵敏度良好。

实施例2

一、利用本发明所述试剂盒检测唾液中AMA-M2水平的方法，包括以下步骤：

从参加体检的人群中获取唾液样本。

该步骤具体包括：

A：唾液收集前嘱受试者大量清水漱口，漱口完成5分钟后开始唾液收集。B：嘱受试者平躺张嘴，开口器固定，使唾液自然流出并于口底聚集。约60s后用吸引器吸取口中唾液于15ml离心管。重复多次，得唾液1-3ml。

C：唾液离心，4℃，500g，10min，离心后吸取上清分装于1.5ml离心管备用。

二、通过酶联免疫吸附实验法检测唾液中AMA-M2水平

该步骤具体包括：

将离心后的唾液样本用0.1％BSA-PBS溶液稀释(1∶40)；

AMA-M2试剂盒标准品用0.1％BSA-PBS溶液倍比稀释(1∶2)成8个梯度，其中第8个设为空白孔，稀释成AMA-M2含量分别为1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/Ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的标准品。

在预先包被有M2抗原的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列，各设1复空)和样本。室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体到处并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次。

每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次，方法同上。

每孔加入100ul底物显色液，室温孵育约15分钟，再以加底物显色液相同顺序加入100ul终止液终止反应。

酶标仪450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。

该实例中，据以判断的数据来源是：从2014年9月至2015年12月共收集健康人、PBC患者(临床已确诊)唾液共40例，两组群体年龄、性别大致匹配，符合PBC的流行病学特征。实验证明我们改良后的试剂盒和方法能够用于检测唾液中的AMA-M2，实验比较两组间唾液中AMA-M2表达水平后，通过ROC曲线分析，发现该方法还可应用于诊断PBC，并得出其诊断PBC的唾液AMA-M2水平临界值为0.3965(AUC＝0.8283，95％可信区间0.6937～0.9628，敏感度83.33％，特异度77.27％)，高于临界值则视为患原发性胆汁性肝硬化可能。

应用实例

该实施采用具体实例1的操作步骤，收集浙江大学附属第一医院感染科原发性胆汁性肝硬化患者10例、国际体检中心健康体检者10例的唾液样本。经检测，PBC患者唾液中AMA-M2均高于临界值0.3965。而健康体检者唾液中AMA-M2均低于临界值0.3965。

基于该分析结果，本发明的试剂盒可用于检测唾液AMA-M2，可以对体检病人是否患有原发性胆汁性肝硬化进行初步筛查，为后续检测提供依据。

Claims (6)

1.一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括下述组分：

AMA-M2标准品；

M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG；

样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA-PBS溶液；

辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的配制方法为：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为TMB/H₂O₂，是通过下述方法配制获得：

(1)配制底物显色液A：

取四甲基联苯胺20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml，以ddH₂O定容至50ml后混匀，避光保存；

(2)配制底物显色液B：

取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30％过氧化氢30ul，以ddH₂O定容至50ml后混匀；

(3)使用前，将底物显色液A、B液等体积混匀，即得底物显色液TMB/H₂O₂。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应终止液为：0.5M硫酸。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法为：取吐温20500ul，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。

6.权利要求1所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将获取的唾液样本离心后吸取上清，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释；

(2)用样本稀释液稀释AMA-M2标准品为8个梯度：AMA-M2含量分别为1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml；第8个0RU/ml设为空白对照孔，直接采用样本稀释液；

(3)在M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品和样本，室温孵育30分钟；弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体倒出，并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次；

(4)每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次；

(5)每孔加入100ul显色液，室温孵育15分钟，再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应；

(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。