CN109470849A - 一种副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌抗体的ELISA检测试剂盒，它是以YfeA蛋白作为抗原，检测待检样品中是否含有副猪嗜血杆菌抗体。本发明还公开了前述试剂盒的使用方法。本发明可以有效检测副猪嗜血杆菌抗体，具有特异性强、灵敏度高、简单、快速等特点，可用于临床检测猪是否携带副猪嗜血杆菌，应用前景良好。

Description

一种副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及抗体检测领域，特别涉及一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)作为一类呼吸道致病菌，能引起猪典型的“六炎四水”的病理表现，即肺炎、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、脑膜炎和关节炎以及胸腔积液、心包积液、腹腔积液和关节积液，严重阻碍其生长和育肥，也常导致猪的死亡，是保育舍和育肥舍最大的威胁之一。

目前对Hps的检测方法很多，例如：16s rRNA原位杂交、免疫组化、PCR法、环介导等温扩增技术等，但它们针对的对象是细菌本身，不能直接反映猪群对Hps的免疫状况。

猪群Hps的抗体水平能直接映射罹患副猪嗜血杆菌病的风险，有助于免疫程序的制定。目前，国内与计划免疫Hps的规模化养猪场较少，监测猪群的Hps抗体于辅助诊断有着积极意义。

目前最常见的针对Hps抗体水平的检测方法是间接ELISA法，它以Hps菌体为抗原，检测猪血清中Hps的抗体。对于临床待检血清，全菌抗原复杂的蛋白成分可能产生的非特异性结合会干扰检测的准确性，提高假阳性的概率，很多时候不能有效检出Hps抗体。

进口试剂盒能有效检测Hps抗体，但价格昂贵，所有试剂盒的包被抗原都属于商业机密，抗原的属性不明。

研究上倾向于使用Hps稳定表达的单一蛋白为抗原检测Hps抗体水平。朱晓明用MnSOD蛋白为抗原，检测了来自全国的1610份Hps阳性血清，最终检出了876份，阳性符合率为54.41％(副猪嗜血杆菌重组蛋白ELISA检测方法的建立及亚单位疫苗候选因子的筛选，南京农业大学硕士学位论文，2015)，不能满足实际需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种Hps抗体检测试剂盒。

本发明提供了一种检测副猪嗜血杆菌抗体的ELISA检测试剂盒，它是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的YfeA蛋白为抗原，检测待检样品中的副猪嗜血杆菌抗体。

前述的试剂盒，属于间接ELISA检测试剂盒，包括如下组分：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的YfeA蛋白；

(2)酶标版；

(3)抗原包被液；

(4)洗涤液；

(5)封闭液；

(6)样品稀释液；

(7)酶标二抗；

(8)底物反应显色体系；

(9)终止液。

进一步地，所述抗原包被液是碳酸盐缓冲液。

进一步地，所述洗涤液或样品稀释液为PBST溶液。

进一步地，所述封闭液是2％BSA的PBS。

进一步地，所述二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。

进一步地，所述底物反应显色体系为由A液和B液组成，临用前1∶1混合，每孔用量100μL；

所述A液配方为：每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL 30％的过氧化氢溶液；

所述B液配方为：每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油以及1mL含3％3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜。

进一步地，所述终止液是2mol/L的硫酸。

本发明还提供了前述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)包被：取氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的YfeA蛋白，用包被液稀释，加入酶标板中，使酶标板每孔含有0.25微克蛋白，37℃孵育2h后置4℃包被过夜后使用洗涤液洗涤；

(2)封闭：加入封闭液封闭，洗涤；

(3)加样：分别取待检样品、空白对照和阳性血清，用稀释液稀释40倍，加入酶标板中，37℃温浴2h，洗涤；所述空白对照为含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，所述阳性血清为副猪嗜血杆菌抗体阳性血清；

(4)二抗孵育：取酶标二抗，用稀释液稀释4000倍，加入酶标板中，37℃孵育30分钟，洗涤；

(5)显色：加入底物反应显色体系，37℃反应9-11min；

(6)终止反应：加入终止液，终止反应，测定其OD_450nm值。

(7)结果判读：当(待检样品OD_450nm值-空白对照OD_450nm值)/(阳性血清OD_450nm值-空白对照OD_450nm值)≥0.4时，判读为阳性，反之为阴性。

本发明以YfeA蛋白为抗原，通过间接ELISA方法，能够有效检测血清中副猪嗜血杆菌抗体；与Biovet公司的Hps抗体ELISA检测试剂盒(进口试剂盒)检测的吻合率较高，阳性吻合率为79.2％，阴性吻合率为77.5％。

本发明还具有较高的灵敏度。对比阳性血清和阴性血清检测得到的OD450mm比值(P/N值)，本发明从整体上要高出全菌抗原的检测方法，表明本发明的灵敏度高于全菌抗原的检测方法。

本发明具有良好的特异性，与猪场常见病原病毒，如猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)、猪链球菌(Streptococcus.suis，Ss)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)、猪瘟(Hog cholera virus，HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)等，均无非特异性反应。

通过批内重复实验和批间重复实验，证明本发明还具有良好的重复性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是YB1502株攻毒后剖检病变图：A：胸腔积液；B：关节积液；C：“绒毛心”并心包积液；

图2是YfeA蛋白表达与纯化图：1：蛋白Marker III(MP204)；2：含pET-28a空载的BL21(DE3)；3：含pET-28a-yfeA质粒的阳性重组菌诱导后破碎的上清；4：纯化后的YfeA蛋白。

具体实施方式

本部分所涉及重组菌、血清和主要试剂信息如下：

阳性重组菌：为大肠杆菌，它含有搭载yfeA基因的pET-28a质粒。

Hps阴性猪血清采自SPF(Specific pathogen Free，无特定病原体)猪。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)阳性血清是由对猪腹腔注射APP菌液制备得到。猪瘟(Hog cholera virus，HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)阳性血清取自康百德试剂盒。

待检血清来自2015～2017年在四川省部分地区的规模化猪场。

Hps阳性猪血清按如下方法制备：选取23日龄健康保育猪，腹腔注射2.75×10⁸CFU/mL的血清五型强毒株YB1502菌液2mL，140h即饮欲废绝，对刺激无反应，颈动脉放血，离心后分装血清。(剖检病变见图1)

硫酸卡那霉素溶液(K1030-5mL)购于索莱宝，蛋白纯化柱(Bio-Scale Mini NuviaIMAC Ni-Charged Cartridges，1×5mL columns)购于Bio-Rad，牛血清白蛋白(BSA，10g/瓶)、HRP(辣根过氧化物酶)-兔抗猪IgG(200μL)购自生工，BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S，200次)购自碧云天，酶标板(FEP 101296，96孔)购自JET BIOFIL，商品化Hps抗体ELISA检测试剂盒(Haemophilus Parasuis Antibody Test Kit(ELISA))购自加拿大Biovet公司。

yfeA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

YfeA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

实施例1 YfeA蛋白的表达纯化与浓度测定

1.方法

阳性重组菌在300mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃、200r/min培养至OD600nm约0.5，加入终浓度4mmol/L的IPTG后继续于上述条件下诱导5h，同时设置pET-28a空载作为阴性对照。诱导后的培养液10000×g离心10min，弃掉上清，底部菌体以50mL破菌缓冲液重悬后超声破碎，完全破碎后10000×g离心10min，收获上清并过滤。按照蛋白纯化柱的说明书进行纯化，随后进行SDS-PAGE，并按照试剂盒说明书对蛋白浓度进行测定。

2.结果

经诱导、破碎、纯化后，得到大小为36kDa的目的蛋白(图2)。经测定，纯化后的YfeA蛋白浓度为0.698mg/mL。

实施例2抗原包被浓度与最佳二抗稀释度的确定

1.方法

按照酶标板的布局设计方阵滴定试验。用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将YfeA蛋白分别稀释至1、2、2.5、5μg/mL，每孔加入100μL，37℃孵育2h后置4℃包被过夜。包被后的板子用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次，之后用含2％BSA的PBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h后洗涤、拍干。Hps阴、阳性血清分别在对应孔加入100μL，37℃孵育30min。洗涤，拍干。HRP-兔抗猪IgG以含2％BSA的PBS分别稀释至1∶2000、1∶3000、1∶4000和1∶5000倍，对应的反应孔每孔加入100μL，37℃孵育30min。洗涤，拍干。底物反应显色体系为终浓度0.3mg/mL的TMB(TMB干粉溶于DMSO配成10mg/mL的TMB原液，临用前用柠檬酸-磷酸盐缓冲液稀释至0.3mg/mL的工作液，同时每mL工作液加入6μL 1％的H₂O₂，混匀)，每孔加入100μL，37℃避光反应10±1min后，每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止液，随即用酶标仪在OD450nm处读数。比较阳、阴性血清的P/N值，筛出最适抗原包被浓度和二抗稀释度。

2.结果

由表1可得，抗原最佳包被浓度为0.25μg/孔，二抗最佳稀释度为1∶4000。

表1 抗原包被浓度和二抗稀释度的确定

^a：P/N为阳性血清比上阴性血清的值。

实施例3血清最佳稀释度的确定

1.方法

以实施例2筛出的抗原包被浓度进行包被，阴、阳性血清以含2％BSA的PBS分别稀释至1∶25、1∶40、1∶100、1∶200，分别加入对应孔孵育，二抗采用3筛出的稀释度，其余操作同实施例3。比较阳、阴性血清的P/N值，筛出最适血清稀释度。

由表2可知，血清的最佳稀释度为1∶40。

表2 血清稀释度的确定

实施例4包被与封闭条件的优化

1.方法

1.1包被条件的优化

将目的蛋白分别用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至目的浓度，加入孔中，分别直接4℃包被过夜、37℃孵育2h后置4℃过夜，其余操作步骤按实施例2和3的最佳条件进行。

1.2封闭液和稀释液的优化

将目的蛋白分别用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至目的浓度，加入孔中，37℃孵育2h后置4℃过夜，洗涤，分别用含5％BSA、2％BSA、1％BSA、0.5％BSA的PBS封闭，其余操作步骤按实施例2和3的最佳条件进行。

2.结果

由表3可知，最佳的包被方法为YfeA蛋白以碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释加入后37℃孵育2h再4℃过夜。

表3 抗原包被方法的优化

由表3可知，封闭液最适为含2％BSA的PBS，血清及二抗稀释液最适为含0.5％BSA的PBS。

表4 封闭液、血清及二抗稀释液的优化

实施例5显色组分的优化

1.方法

将10mg/mL的TMB原液以柠檬酸缓冲液稀释成0.6mg/mL的显色A₁液避光4℃储存，在每mL的磷酸盐缓冲液中加入12μL 1％的H₂O₂，混匀后为显色B₁液，4℃储存；将10mg/mL的TMB原液以磷酸盐缓冲液稀释成0.6mg/mL的显色A₂液避光4℃储存，在每mL的柠檬酸缓冲液中加入12μL 1％的H₂O₂，混匀后为显色B₂液，4℃储存；配制每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL 30％的过氧化氢的显色液A₃，4℃储存，配制每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油以及1mL含3％TMB的DMSO的显色液B₃，避光4℃储存。临用前均1∶1混匀，每孔加100μL。以之前实施例所筛各项最佳条件(组分)操作，筛出最佳显色组分。

2.结果

经测定，确定最适的显色组分为：A₃液(每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL 30％的过氧化氢)，4℃储存；B₃液(每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油以及1mL含3％TMB的DMSO)，避光4℃储存，临用前1∶1混匀，每孔加100μL。

表5 显色组分的确定

实施例6间接ELISA阴阳性临界值的确定

1.方法

选取临床采集的20份Hps阴性猪的血清、一抗稀释液(作为空白对照，不加二抗)、阳性血清按照实施例1-5所筛条件进行测定，以[阳性血清的OD_450nm-(20份Hps阴性猪的血清平均OD_450nm+2×20份Hps阴性猪血清OD_450nm标准差)]所得值为试验成立前提，以[(Hps阴性猪血清的平均OD_450nm+2×20份Hps阴性猪血清OD_450nm标准差-空白对照OD_450nm)比上(阳性血清的OD_450nm-空白对照OD_450nm)]，得到判定阈。借助此判定阈，规定判定方法为：(样品OD_450nm-空白对照平均值)/(阳性对照平均值-空白对照平均值)≥判定阈时，判为阳性，反之为阴性。

2.结果

20份无Hps感染的猪血清经Hps检测得到的OD450nm值如表6所示，其平均OD_450nm N为0.389，标准差为0.045。通过前述方法，计算得到判定阈为0.4。那么判定结果为阳性或者阴性的方法为：(样品OD_450nm-空白对照平均值)/(阳性对照平均值-空白对照平均值)≥0.4，判为阳性，反之为阴性。

表6 20份无Hps感染的猪的血清中Hps抗体的测定。

实施例7特异性与重复性试验

1.方法

1.1特异性

应用本发明检测APP、Ss、Pm、HCV、PRRSV、PCV-2阳性血清。

1.2重复性

随机选取5份待检血清，检测同批次包被的批内重复性和不同批次包被的批间重复性。

2.结果

2.1特异性

由表7可知，本发明具有良好的特异性，与猪场常见病毒病原和呼吸道病原菌无交叉反应。

表7 特异性对照试验结果

2.2重复性

由表8和表9可知，本发明具有良好的批内重复性和批间重复性。

表8 批内重复性试验

表9 批间重复性试验

对比例1全菌抗原包被测定

1.方法

将Hps血清5型标准株于10mL TSB中扩大至1×10⁹CPU/mL，加入终浓度为0.15％的甲醛溶液，置37℃灭活12h。灭活后的菌液8000r/min离心10min，弃上清，沉淀用5mL PBS(pH7.4)重悬混匀后8000r/min离心5min，弃上清，反复清洗3次以去除甲醛。最后用PBS(pH＝7.4)将菌体定容至3mL，分装后-20℃保存备用。全菌抗原分别做1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500稀释后包被，阴、阳性血清分别做1∶25、1∶40、1∶100、1∶200倍稀释后进行间接ELISA，其余试验条件应用实施例1-5筛出的最佳条件，根据阳、阴性血清的OD_450nm计算P/N值，并与YfeA蛋白作为包被抗原的间接ELISA结果做对比。

2.结果

由表10可以看出，全菌作为包被抗原时，其P/N值普遍较低，表明其非特异结合现象明显。

表10 全菌抗原的测定

对比例2间接ELISA临床应用

1.方法

随机选取保育阶段猪血清48份，哺乳仔猪血清10份，育肥阶段猪血清14份，母猪血清16份，共计88份血清，分别以本发明试剂盒和商品化的Hps抗体ELISA检测试剂盒(Haemophilus Parasuis Antibody Test Kit(ELISA)和某国产商品化试剂盒)检测，比对符合率。

2.结果

针对88份临床血清的检测显示，Haemophilus Parasuis Antibody Test Kit(ELISA)得到48份阳性，40份阴性，本发明测得47份阳性，41份阴性，其中有38份阳性血清和31份阴性血清分别与Haemophilus Parasuis Antibody Test Kit(ELISA)所测得的阳性血清和阴性血清吻合，阳性吻合率为79.2％，阴性吻合率为77.5％。某国产商品化试剂盒的检测结果显示66份阳性和22份阴性，其中有43份阳性血清和17份阴性血清分别与Haemophilus Parasuis Antibody Test Kit(ELISA)吻合，阳性吻合率为89.5％，阴性吻合率为42.5％。

可见，相比某国产商品化试剂盒，本发明对Hps的检测结果与进口商品化试剂盒Haemophilus Parasuis Antibody Test Kit(ELISA)更加吻合。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种副猪嗜血杆菌抗体检测试剂盒及其使用方法

<130> GY151-18P1537

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> Haemophilus parasuis

<400> 1

cagcagttta aagtggtcac cacattcact gtgattcaag acattgctca aaatgtcgca 60

ggggataagg cggtggtcga atcgatcacc aaaccaggtg cggaaatcca cgattatcaa 120

ccaacgccac aggatattgt gaaagcacaa tctgcggatt tggtgttgtg gaatggtatg 180

aaccttgaaa gttggtttga gcgtttcttt gctcaggtga aagataagcc tgcggttgtg 240

gtaacggaag gcattgagcc aatttcaatc tacgaaggac cttacaaaga taagccaaac 300

ccacacgctt ggatgtctac gaaaaatgcc ttgatttata ttgagaacat tcgtcaagcc 360

ttagtgaaat acgatccagc aaatgcagaa gcctataatg cgaatgcaaa ggcctatgcc 420

gataagatcg ttgccttaga tcagccgttg cgtgagcgtt tggcaaaagt gcctgaagca 480

caacgttggt tagtgacaag cgaaggggcg tttagctatc ttgctagaga ttatggcttc 540

aaagagttat atctttgggc gattaaccaa gatgaacaag gcacgccaaa acagatccgc 600

aaagtgatcg accaagtgcg taaacatcaa attccagtgg tatttagtga aagtaccatt 660

tcagataaac cggctaaaca agtggcgaaa gagagtaaag cacgctatgg cggtgtgtta 720

tatgtggact ctctctcaac caaagatggc aaagtaccaa cctatattga tttactcaat 780

gtcactgtaa gtactattgt tgctggattt gaaaaataa 819

<210> 2

<211> 272

<212> PRT

<213> Haemophilus parasuis

<400> 2

Gln Gln Phe Lys Val Val Thr Thr Phe Thr Val Ile Gln Asp Ile Ala

1 5 10 15

Gln Asn Val Ala Gly Asp Lys Ala Val Val Glu Ser Ile Thr Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Glu Ile His Asp Tyr Gln Pro Thr Pro Gln Asp Ile Val Lys

35 40 45

Ala Gln Ser Ala Asp Leu Val Leu Trp Asn Gly Met Asn Leu Glu Ser

50 55 60

Trp Phe Glu Arg Phe Phe Ala Gln Val Lys Asp Lys Pro Ala Val Val

65 70 75 80

Val Thr Glu Gly Ile Glu Pro Ile Ser Ile Tyr Glu Gly Pro Tyr Lys

85 90 95

Asp Lys Pro Asn Pro His Ala Trp Met Ser Thr Lys Asn Ala Leu Ile

100 105 110

Tyr Ile Glu Asn Ile Arg Gln Ala Leu Val Lys Tyr Asp Pro Ala Asn

115 120 125

Ala Glu Ala Tyr Asn Ala Asn Ala Lys Ala Tyr Ala Asp Lys Ile Val

130 135 140

Ala Leu Asp Gln Pro Leu Arg Glu Arg Leu Ala Lys Val Pro Glu Ala

145 150 155 160

Gln Arg Trp Leu Val Thr Ser Glu Gly Ala Phe Ser Tyr Leu Ala Arg

165 170 175

Asp Tyr Gly Phe Lys Glu Leu Tyr Leu Trp Ala Ile Asn Gln Asp Glu

180 185 190

Gln Gly Thr Pro Lys Gln Ile Arg Lys Val Ile Asp Gln Val Arg Lys

195 200 205

His Gln Ile Pro Val Val Phe Ser Glu Ser Thr Ile Ser Asp Lys Pro

210 215 220

Ala Lys Gln Val Ala Lys Glu Ser Lys Ala Arg Tyr Gly Gly Val Leu

225 230 235 240

Tyr Val Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gly Lys Val Pro Thr Tyr Ile

245 250 255

Asp Leu Leu Asn Val Thr Val Ser Thr Ile Val Ala Gly Phe Glu Lys

260 265 270

Claims (9)

1.一种检测副猪嗜血杆菌抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于：它是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的YfeA蛋白为抗原，检测待检样品中的副猪嗜血杆菌抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它属于间接ELISA检测试剂盒，包括如下组分：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的YfeA蛋白；

(2)酶标版；

(3)抗原包被液；

(4)洗涤液；

(5)封闭液；

(6)样品稀释液；

(7)酶标二抗；

(8)底物反应显色体系；

(9)终止液。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原包被液是碳酸盐缓冲液。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液或样品稀释液为PBST溶液。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液是2％BSA的PBS。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。

7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述底物反应显色体系为由A液和B液组成，临用前1∶1混合，每孔用量100μL；

所述A液配方为：每100mL含2.72g醋酸钠、0.32g柠檬酸和60μL30％的过氧化氢溶液；

所述B液配方为：每100mL含0.04g EDTA-2Na、0.19g柠檬酸、10mL甘油以及1mL含3％3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的二甲基亚砜。

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述终止液是2mol/L的硫酸。

9.权利要求1-8任意一项检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)包被：取氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的YfeA蛋白，用包被液稀释，加入酶标板中，使酶标板每孔含有0.25微克蛋白，37℃孵育2h后置4℃包被过夜后使用洗涤液洗涤；

(2)封闭：加入封闭液封闭，洗涤；

(3)加样：分别取待检样品、空白对照和阳性血清，用稀释液稀释40倍，加入酶标板中，37℃温浴2h，洗涤；所述空白对照为含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，所述阳性血清为副猪嗜血杆菌抗体阳性血清；

(4)二抗孵育：取酶标二抗，用稀释液稀释4000倍，加入酶标板中，37℃孵育30分钟，洗涤；

(5)显色：加入底物反应显色体系，37℃反应9-11min；

(6)终止反应：加入终止液，终止反应，测定其OD_450nm值。

(7)结果判读：当(待检样品OD_450nm值-空白对照OD_450nm值)/(阳性血清OD_450nm值-空白对照OD_450nm值)≥0.4时，判读为阳性，反之为阴性。