CN111337670A - 一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法 - Google Patents

一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物检测领域，特别是指一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法。利用纯化复性后的EbpA1亚单位蛋白初步建立了间接ELISA方法，采用棋盘法确定了最佳的包被浓度为2µg/mL；封闭液可以排除其他物质的非特异性吸附，我们选用1%的BSA进行封闭，达到了较好的效果；此外，对血清、酶标二抗的稀释比例和作用时间和底物的显色时间进行了摸索，均选择最佳的条件使建立的ELISA方法达到最优水平。ELISA结果的判定：在方法建立时采用P/N﹥2.1可视为阳性；而最终的结果采用阴性样品OD450值的平均数加3倍的标准差等于阳性的临界值。

Description

一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测 方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，特别是指一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法。
背景技术
粪肠球菌(E.faecalis)是重要的条件性致病菌，已成为重要的医院内感染的病原体，且可引起猪等多种动物发病。猪源粪肠球菌感染是一种新发现猪的传染病，可引起猪的败血症、脑炎和关节炎等，不仅对养猪业产生较大的危害，而且感染粪肠球菌后的猪肉质品下降，这对食品和兽医公共卫生学产生重要影响。粪肠球菌感染的评价主要依据其传统的培养特性和表型，常需要通过纯培养物的获取，费时费力，而且往往不易准确区分。而分子生物学方法虽然准确，但操作过程繁琐，所需设备价格昂贵，很难在基层临床诊断中应用。因此，研究一种方便、快速、特异性好而又准确的感染和免疫学评价方法应用于临床诊断十分必要。
酶联免疫吸附剂测定(ELISA)可用于测定抗原和抗体，其简单、快速、灵敏、特异、稳定且易于操作等特点而被广泛地应用于诊断细菌、病毒、寄生虫及抗体方面。本研究通过原核表达粪肠球菌菌毛亚单位蛋白EbpA1，将其纯化复性后作为抗原包被ELISA酶标板，通过条件优化，以建立有效粪肠球菌抗体的ELISA检测方法。本研究基于粪肠球菌ebp菌毛分布广泛、保守性好的特点，在前期研究的基础上选用EbpA1亚单位蛋白为包被抗原建立ELISA方法，并用建立的ELISA方法在临床进行初步的应用。
发明内容
本发明提出一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，解决了猪的粪肠球菌感染检测难和无免疫学评价的方法问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，步骤如下：
(1)用包被液将EbpA1重组蛋白稀释成浓度1-8μg/mL包被酶标板，100μL/孔，取出酶标板后，用PBST洗涤；
(2)用0.5-2％的BSA封闭经步骤(1)处理的酶标板，300μL/孔，然后用PBST洗涤，甩干孔内液体；
(3)一抗经待测血清样本稀释后得一抗血清，以100μL/孔加至经步骤(2)处理的酶标板孔内，37℃孵育0.5-1.5h，用PBST洗涤；
(4)酶标二抗经稀释后，再以100μL/孔加至经步骤(3)处理的酶标板孔内，37℃孵育15-60min，用PBST洗涤；
(5)加入TMB底物显色液，100μL/孔，37℃孵育5-20min，加入终止液，50μL/孔，用酶标仪读取OD450值进行判断。
所述步骤(1)中EbpA1重组蛋白为pET-32a-EbpA1载体表达纯化并复性的蛋白，pET-32a-EbpA1载体为EbpA1基因与pET-32a载体相连构建的重组载体，其中EbpA1基因序列如SEQ ID No.1所示。
所述步骤(1)包被的条件为4℃过夜、37℃作用2h或37℃作用2h，然后4℃过夜。
所述步骤(2)中孵育条件为37℃孵育0.5-2.5h。
所述步骤(3)中一抗血清的稀释比例为1:(100-400)，一抗为粪肠球菌灭活的全菌疫苗免疫后分离的血清。
所述步骤(4)中酶标二抗血清的稀释比例为1:(5000-10000)，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG。
所述步骤(5)中OD450值的判断标准为若血清OD450值≥0.41判为阳性；若OD450值≤0.41判为阴性。
本技术方案能产生的有益效果：
本发明通过对30份阴性血清OD450值测定并根据统计学方法计算出阴阳性血清的临界值为0.41。最后对该方法进行了特异性、重复性试验。特异性试验结果表明，该方法与猪的链球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的阳性血清均不发生反应，具有良好的特异性；重复性试验表明，批内变异系数与批间变异系数分别1.9％-7％和4.1％-9.3％，变异系数均小于15％，可重复性高。
本发明通过确立的间接ELISA方法对粪肠球菌在河南省部分地区猪的感染情况进行了初步的血清学调查，共检测了702份近两年来自河南省14个地区送检的临床猪血清样品。检测结果显示，702份血清样品中204份为粪肠球菌抗体阳性，总的阳性检出率为29.1％；血清学调查结果表明本次调查的河南省大部分地区的猪群中均有粪肠球菌感染，其中濮阳、信阳、济源、开封、南阳等地区的粪肠球菌血清抗体检出率较高，分别为47.9％、36.2％、52.3％、57.6％、35.7％；不同生长阶段的猪群血清检测的结果表明，仔猪阳性率31.8％，保育猪阳性率17.3％，育肥猪阳性率16.6％，成年种猪的阳性率为46.6％，仔猪与成年猪的检出抗体阳性率明显高于其他阶段猪。此外，检测结果表明四个季度均有粪肠球菌感染的情况，秋季和冬季的感染率相对较高，分别为33.9％和38.2％，而春季和夏季的感染率相对较低，分别为14.9％和23.6％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为确定抗原最佳包被时间的柱形图。
图2为确定最佳封闭液的柱形图。
图3为确定封闭时间的柱形图。
图4为确定一抗免疫血清最佳反应时间的折线图。
图5为确定HRP标记的羊抗猪二抗最适稀释度的柱形图。
图6为确定二抗最佳反应时间的柱形图。
图7为确定底物最佳反应时间的折线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、材料
1、菌株及质粒
重组质粒pET32a-ebpA1由本实验室前期构建并保存；原核表达载体pET32a，大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞均为本实验室保存；新西兰大白兔购于河南省实验动物中心。
2、溶液配制
(1)脑心浸出液肉汤(BHI)：粉状BHI培养基38.5g，加热使溶解，高温高压灭菌30min，4℃保存备用。
(2)0.9％NaCl溶液：氯化钠9g溶解于1000mL的蒸馏水中，高压灭菌，4℃保存备用。
(3)PBS缓冲液：在精密天平上依次称取16.0NaCl、0.4g KCl、0.4g KH2PO4和5.792gNa2HPO4 12H2O，加入ddH2O，搅拌溶解，调节PH值(PH＝7.4)，定容，121℃高温高压灭菌30min，室温冷却后4℃保存。
(4)PBST Buffer：在500mL高压过的PBS中加入250μL的Tween-20，颠倒混匀后4℃保存。
(5)5％脱脂奶：5g脱脂奶，加入100mL PBST Buffer，溶解充分，4℃储存。
(6)包被液：1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3加入去离子水中，搅拌溶解，并调节PH(PH＝9.6)，定容，4℃保存。
(7)封闭液(1％BSA的PBST溶液)：称取0.1g BSA，溶解于10mL PBST中，充分混匀后备用，需现用现配。
(8)底物液:底物A液与底物B液以1:1比例混合均匀，避光并现配现用。
(9)终止液：吸取22mL的浓硫酸缓慢滴加至178mLddH2O中，搅拌混匀后4℃保存备用。
二、方法
2.1猪粪肠球菌阳性血清的制备
2.1.1菌种的活化
将保存于-80℃冰箱内的甘油菌N41菌株无菌条件划线BHI固体平板，37℃温箱培养24h；无菌挑取BHI生长状态良好的单个菌落接种液体BHI，37℃摇床过夜培养；过夜培养的菌液置于4℃保存备用。
2.1.2菌液的制备
吸取2.1.1活化的粪肠球菌N41菌液2mL接种至200mL BHI培养液，37℃摇床培养12h；扩大培养菌液4℃条件，8000r/min离心5min；弃上清，生理盐水洗涤，重悬，以4℃，8000r/min离心5min，重复2次；弃上清，用20-30mL生理盐水重悬，混匀充分；用细菌浊度仪测定菌液浓度，经计算后调整菌液的浓度至1×109CFU/mL的菌液备用。
2.1.3细菌灭活条件的选择
取16支试管，向每支试管中加入2.1.2制备好的菌液10mL，分别按细菌悬液的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％将甲醛加入试管中的菌悬液中，每个浓度设1个重复，混匀后置于37℃灭活，每个甲醛浓度分别灭活24h和36h，灭活过程中摇晃数次。
2.1.4细菌灭活的检验
(1)无菌检验：分别取不同灭活浓度与灭活时间的菌液0.2mL均匀涂布于BHI固体培养板上，置于37℃培养24h，观察有无细菌等微生物，无细菌生长的最低甲醛浓度与灭活时间判为甲醛灭活细菌所需的最低浓度与灭活时间。
(2)安全检验：取SPF级约30g小鼠，随机分为2组，5只/组。对第1组小鼠腹腔注射1mL无菌生理盐水作为对照；将经无菌检验合格的最低甲醛浓度与灭活时间的菌液取1mL腹腔注射小鼠，注射后观察小鼠一周的状态，每日观察小鼠是否有针对该菌液的副反应及发病情况。
2.1.5抗原的乳化
本试验中抗原的乳化参照经典的注射器推注法。取1mL检验合格的菌液与等量佐剂分别加入两个5mL的无菌注射器内，用三通阀紧密连接两注射器，乳化步骤同试验一2.4.1。
2.1.6免疫程序
用自制的粪肠球菌灭活的全菌疫苗对6头40-50d保育猪免疫，颈部肌肉分两点深部注射，2mL/次。第一次免疫后，14d进行加强免疫，加强免疫后14d进行第三次加强免疫，三免后7d再次加强免疫，共免疫四次。并分别在免疫前及加强免疫后14d、21d、28d、35d少量采血，检测抗体效价。
表1猪的免疫程序
Figure BDA0002425413150000051
2.1.7阳性血清的收获
免疫血清效价测定采用全菌包被间接ELISA法进行检测，按徐步等介绍的全细胞抗原包被方法作稍加改进：
(1)首先对酶标板进行预处理：用0.1mol/L NaHCO3溶液配制2.5％的戊二醛溶液，酶标板150μL/孔，37℃作用1h；洗涤4次。
(2)全菌抗原的制备：将粪肠球菌N41菌株培养116h，4000r/min离心20min，收集沉淀，PBS洗涤，调整菌数为109CFU/mL，4℃保存。
(3)在经戊二醛预处理的96孔酶标板中加入制备好的全菌抗原悬液进行抗原干燥包被，100μL/孔，37℃干燥箱作用干燥，加入1％BSA 300μL/孔，于37℃封闭2h；PBST洗涤。
(4)加稀释免疫血清(按1:160、1:320、1:640、1:1280稀释)，100μL/每孔，37℃作用1h，洗涤。
(5)加入1:5000的羊抗猪IgG的HRP结合物，37℃反应1h。
(6)加入底物液，100μL/孔，37℃作用15min；终止反应；测OD450值，计算P/N值。
待免疫血清的效价达到1:1280后，对免疫后的猪禁食12h，禁食期间猪自由饮水，12h后，对免疫猪前腔静脉无菌采血，采集的血清处理后保存于-20℃备用，以作为标准阳性血清。
2.1.8阴性猪血清的制备
制备阳性血清前，在河南省原阳县某养殖场随机挑选30头健康保育猪，对健康猪禁食12h，前腔静脉无菌采取30只猪的血液，分离血清于-20℃保存，以此作为标准阴性血清。
2.1.9重组蛋白EbpA1的制备
EbpA1重组蛋白为pET-32a-EbpA1载体表达纯化并复性的蛋白，pET-32a-EbpA1载体为EbpA1基因与pET-32a载体相连构建的重组载体，其中EbpA1基因序列如SEQ ID No.1所示。本申请将重组质粒pET32a-ebpA1经诱导表达制备EbpA1蛋白，利用尿素法纯化制备的EbpA1蛋白，纯化后的EbpA1蛋白经透析和包涵体蛋白的复性处理，得可溶性的重组蛋白EbpA1溶液。
2.2其它细菌阳性血清的制备
金黄色葡萄球菌、链球菌、屎肠球菌与大肠杆菌阳性血清的制备方法均与2.1相同。
2.3间接ELISA方法的建立及优化
2.3.1抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定
采用棋盘法进行确定EbpA1蛋白的包被浓度及血清的最佳稀释度：
①用包被液将步骤2.1.9重组蛋白EbpA1的浓度稀释为8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，每孔100μL包被酶标板(每个稀释度做一个重复孔)，将包被好的酶标板4℃孵育过夜；用PBST洗涤3遍，每次3min。
②每孔加入300μL的1％的BSA，37℃封闭2h，弃封闭液，用PBST洗涤3次，拍干。
③将粪肠球菌阳性、阴性血清分别按1:50、1:100、1:200、1:400、1:800的比例倍比稀释，取100μL稀释后的粪肠球菌阳性、阴性血清依次加入酶标孔，于37℃孵育1h。
④用血清稀释液将Goat Anti-pig IgG/HRP二抗按1:5000的比例稀释，每个酶标孔中加入100μL稀释的二抗，37℃湿盒孵育1h。
⑤每个酶标孔中加入100μL配制好的TMB显色液，37℃避光显色15min。
⑥加入终止液(2M浓H2SO4)，50μL/孔，终止反应。酶标仪读取OD450值，记录，分析结果。
2.3.2抗原最佳包被时间的确定
按方法2.3.1确定的抗原最佳包被浓度包被酶标板，包被好的酶标板放在37℃2h、4℃过夜、37℃2h+4℃过夜包被，粪肠球菌阳性、阴性血清分别设置三个重复孔，其它具体试验步骤同2.3.1，结束后进行进行ELISA测定，比较各组阴阳性孔的OD450值及P/N值，从而确定抗原的最佳包被时间。
2.3.3选择最佳封闭液
封闭液分别选择0.5％BSA、1％BSA、2％BSA和5％的脱脂奶进行封闭，300μL/每孔，37℃封闭2h。其它具体试验步骤同上进行，粪肠球菌的阳性、阴性血清分别设置3个重复空，分析结果，以阴阳性OD450值及P/N值确定最佳的封闭液。
2.3.4封闭时间的优化
选择确定的最佳包被浓度、包被时间与最适封闭液，分别选用不同的封闭时间：37℃湿盒分别封闭30min、1h、2h和2.5h，其余试验步骤同上进行进行ELISA测定，粪肠球菌阳性、阴性血清，设置3个重复孔，最佳封闭时间以阴阳性孔OD450值与P/N值确定。
2.3.5一抗作用时间确定
一抗反应时间设定为37℃条件30min、45min、60min、90min，其余步骤同上，进行ELISA测定，最佳一抗作用时间以阴阳性孔的OD450值与P/N值确定。
2.3.6最佳酶标二抗的稀释度的选择
二抗的浓度分别为1:5000、1:6000、1:8000、1:10000，其余步骤同2.3.5进行，最佳酶标二抗稀释度以阳性孔的OD450值与P/N值确定。
2.3.7最佳酶标二抗作用时间的选择
酶标二抗选择条件：37℃湿盒分别孵育15min，30min，45min，60min，重复3孔，步骤同上进行，最佳酶标二抗作用时间以阴阳性孔的OD450值与P/N值确定。
2.3.8最佳底物TMB显色时间的选择
加入100μL的TMB显色液，于37℃湿盒分别进行孵育5min，10min，15min，20min，重复3孔，其余步骤同上。最后50μL/每孔加入的终止液，读取OD450值，以P/N值确定底物TMB的最适显色时间。
2.3.9临界值的确定
选择30份粪肠球菌阴性血清，用确定的间接ELISA方法测定，根据OD450值统计分析，计算30份阴性血清OD450值的平均值(X)与标准差(SD)，据统计学原理，若OD450值X+3SD，可99.9％地判为阳性。X+3SD为阴阳性血清临界值，若血清OD450值>X+3SD，判为阳性；若OD450值<X+3SD，判为阴性。
2.4间接ELISA检测方法评价
2.4.1特异性试验
以建立的间接ELISA方法同时检测链球菌、屎肠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌阳性血清，设置猪粪肠球菌阴、阳性血清对照，验证方法特异性。
2.4.2重复性试验
批内重复试验
随机取5份待检血清用建立的间接ELISA方法检测，用同一批次纯化的EbpA1蛋白包被酶标板，同时设置阳性、阴性与空白对照，每份血清3个重复；重复3次，比较OD450值，并计算变异系数。
批间重复试验
随机取5份待检血清用建立的间接ELISA方法检测，用3个批次纯化的EbpA1蛋白包被酶标板，同时设置阳性、阴性与空白对照，每份血清重复3孔；重复3次，比较OD450值的变化并计算变异系数。
三、结果
3.1细菌灭活条件的选择
(1)甲醛浓度与灭活时间的确定
向菌液中加入甲醛终浓度分别为0.1％、0.2％、0.3％和0.4％，37℃分别灭活24h与36h后各取200μL均匀涂布于BHI固体琼脂平板培养24-36h。结果发现，当加入的甲醛终浓度为0.4％且灭活时间为24h和36h时无细菌等微生物生长。因此，可选择甲醛灭活的终浓度为0.4％，灭活时间为24h。
表2灭活后细菌在固体培养板的无菌检验
Figure BDA0002425413150000081
(2)安全性试验
选取甲醛终浓度为0.4％且灭活时间为24h的菌液(粪肠球菌N41株、屎肠球菌、链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)分别注射5只SPF级约30g的健康昆明鼠，1mL/只；并设置对照组，注射同等剂量生理盐水；注射后，每天观察小鼠的状态，连续观察7d。从表3可知，30只小鼠经过注射1mL灭活菌液与生理盐水后，小鼠的精神、食欲均正常，无小鼠死亡现象，且无任何临床症状。因此，以灭活后的菌液作为免疫原与弗氏佐剂混合乳化，制备灭活疫苗获取阳性血清抗体。
表3灭活菌对小鼠的安全试验
Figure BDA0002425413150000082
3.2制备粪肠球菌阳性血清的结果
将免疫后采集的少量猪血清用全菌包被间接ELISA法进行检测，结果显示免疫后的血清效价达1:1280，说明阳性血清制备成功。
3.3抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定
根据棋盘法确定抗原最佳包被量与血清最佳稀倍数。OD450值为1时，酶标仪最为敏感，误差最小。所以，当阳性OD450值在1左右，阴性OD450值较小，并且P/N值最大时(P:阳性平均值-空白平均值；N：阴性平均值-空白平均值)，抗原包被浓度最佳和抗体稀释度最佳。将EbpA1蛋白用包被液稀释后包被酶标板，进行ELISA测定，确定抗原的包被浓度及血清的稀释度，结果如表4所示：当抗原包被浓度为2μg/mL，血清的稀释度为1:200时P/N值最高，且阳性的OD450值在1.0左右。因此，确定抗原的最适包被浓度为2μg/mL，血清的最适稀释度为1:200。
表4抗原最佳包被量和血清最佳稀释度的确定
Figure BDA0002425413150000091
3.4抗原最佳包被时间的确定
将EbpA1蛋白用最适包被浓度包被，一抗稀释度按3.3确定的最佳稀释度稀释，包被条件分别为4℃包被过夜，37℃2h、37℃2h包被后4℃包被过夜，见图1和表5，在包被条件为37℃2h再4℃过夜包被时，阳性血清OD450值最接近1.0，P/N值最大，最终，选择的包被条件为：37℃2h包被后再4℃包被过夜。
表5抗原最佳包被时间的确定
Figure BDA0002425413150000092
Figure BDA0002425413150000101
3.5最适封闭液的选择
由表6知，当选用1％的BSA作为封闭液时，P/N值最大，结合图2，因此将1％的BSA作为最佳封闭液。
表6不同佳封闭液的OD值
Figure BDA0002425413150000102
3.6封闭时间的优化
用最适的包被条件包被酶标板，用1％BSA进行封闭，37℃分别封闭30min，1h，2h，2.5h。从表7和图3知当封闭2h时P/N值最高，故选用2h作为最适的封闭时间。
表7封闭时间的确定
Figure BDA0002425413150000103
3.7待检血清的作用时间的优化
用已确定的最佳一抗稀释度稀释血清，由表8结合图4知，当一抗血清在37℃作用60min时P/N值最大。因此确定待检血清的最佳作用时间为60min。
表8血清不同作用时间的OD值
Figure BDA0002425413150000104
Figure BDA0002425413150000111
3.8酶标二抗最适稀释度的选择
当HRP标记的羊抗猪的二抗的稀释度为1:6000时，其P/N值最大，因此确定酶标二抗的最适稀释度为1:6000(表9和图5)。
表9 HRP标记的羊抗猪二抗最适稀释度的确定
Figure BDA0002425413150000112
3.9选择最适酶标二抗的作用时间
当HRP标记的羊抗猪的二抗的反应时间为45min时，其P/N值最大，因此确定酶标二抗的最佳反应时间为45min(表10和图6)。
表10二抗最佳反应时间的确定Table 10 Determination of the reaction timeof Anti-antibody
Figure BDA0002425413150000113
3.10最适底物TMB显色时间的确定
加入底物TMB显色液后，37℃分别避光显色5min，10min，15min，20min，终止反应，进行ELISA检测，确定底物最佳反应时间。由表11结合图7知，37℃反应15min时，OD450值接近1且P/N最大。因此，选择37℃条件，避光作用15min为最佳显色反应时间。
表11底物最佳反应时间的确定
Figure BDA0002425413150000114
3.11间接ELISA试验程序的确定
(1)用包被液将EbpA1蛋白稀释成2μg/mL包被酶标板，100μL/孔，先放置于37℃作用2h，然后4℃过夜；取出酶标板；用PBST洗涤。
(2)用1％的BSA封闭酶标板，300μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤，甩干孔内液体。
(3)一抗用血清稀释液以1:200的比例稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，用PBST洗涤。
(4)酶标二抗以1:6000的比例进行稀释，100μL/孔，37℃孵育45min，用PBST洗涤。
(5)加入TMB底物显色液，100/孔，37℃孵育15min，加入终止液(2M H2SO4)，50μL/孔，用酶标仪读取OD450值。
3.12 cut-off值的确定
利用已经确立的间接ELISA方法对30份粪肠球菌阴性血清检测，记录OD450值，结果如表12所示，根据统计学的方法，计算30份阴性血清OD450值的平均值X与标准偏差SD，经计算得出平均值X为0.263，标准偏差SD为0.049。依据OD450≧X+3SD判定为阳性，反之为阴性。计算得出该ELISA的cut-off值为0.41，即OD450≧0.41判为阳性，反之则判阴性。
表12 30份E.faecalis阴性猪血清的ELISA检测结果
Figure BDA0002425413150000121
3.13特异性试验
用确立的间接ELISA方法同时检测已知粪肠球菌、链球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌阳性血清，记录OD450值。结果如表13所示，仅粪肠球菌阳性血清为阳性，其余细菌阳性血清为阴性，说明建立的间接ELISA检测方法具有较好的特异性，不和其它细菌的抗体产生交叉反应。
表13特异性试验结果
Figure BDA0002425413150000122
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。
3.13重复性试验
对5份随机选取的待检血清用确立的间接ELISA方法进行批内重复性检验，结果见表14，OD450值的变异系数在0.019-0.07之间；同时用3种不同批次的蛋白包被酶标板，对5份随机抽取的待检血清进行批间重复性检验，结果见表15，OD450值的变异系数在0.041-0.093之间。这表明建立的间接ELISA方法具有较好的可重复性和稳定性。
表14批内重复性检验
Figure BDA0002425413150000131
表15批间重复性检验
Figure BDA0002425413150000132
四、讨论
近年来，由于抗生素的大量使用，尤其是第三代头孢菌素的广泛应用，肠球菌感染愈来愈严重。猪源粪肠球菌感染是一种新发现的猪的传染病，可引起猪的败血症、脑炎和关节炎等，对养猪业产生较大的危害。肠球菌感染的诊断常采用细菌分离培养法，但是这种方法耗时长，不利于临床上的广泛应用,所以建立粪肠球菌抗体快速准确的检测方法就显得尤为重要。然而，ELISA方法使酶促反应高度专一性有机结合起来，能够对生物体内的各种微量有机物含量进行定性和定量测定，已被广泛地应用于多种传染病的诊断、流行病学调查以及疫苗免疫后抗体水平的监测，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。以菌毛亚单位蛋白EbpA1为检测抗原建立的间接ELISA方法可为粪肠球菌的流行病学调查提供一种有效的手段。
建立ELISA方法需要标准的阳性血清，因此我们用甲醛灭活的菌液作为免疫原制备阳性血清。首先摸索了细菌的灭活条件，即甲醛的终浓度为0.4％，灭活时间为24h，最终使菌体完全灭活。对灭活后的菌液进行小鼠安全试验，观察一周后，结果小鼠的生长状态均良好，表明灭活的菌体抗原安全可靠，可用于制备猪阳性抗体的免疫原。在猪阳性血清的制备过程探索免疫程序时，第一次免疫可能因为所用的菌液浓度较低，从而导致后期效价升高不明显。经分析后，可能是抗原被猪体内巨噬细胞或白细胞吞噬，以至于不能有效地诱导淋巴细胞活化，导致抗体水平不高。经参照Morozumi和徐引弟等的方法改进后，用灭活的菌液作为免疫原，三次免疫后再加强免疫取得较为满意的结果。
本试验利用纯化复性后的EbpA1亚单位蛋白初步建立了间接ELISA方法，对各种条件进行了优化。抗原的包被浓度对ELISA方法有很大影响，既不能太大也不能太小，本试验采用棋盘法确定了最佳的包被浓度为2μg/mL；封闭液可以排除其他物质的非特异性吸附，我们选用1％的BSA进行封闭，达到了较好的效果；此外，对血清、酶标二抗的稀释比例和作用时间和底物的显色时间进行了摸索，均选择最佳的条件使建立的ELISA方法达到最优水平。通常判定ELISA结果的方法有两种，一是P/N>2.1可视为阳性；二是阴性样品的OD450值的平均数加3倍的标准差等于阳性的临界值。本试验检测了30份阴性血清，并根据统计学计算出阴阳性的临界值，但还需要临床上大量样品反复验证进一步地确定。批内变异系数与批间变异系数分别1.9-7％和4.1-9.3％，均小于15％，表明该实验的稳定性和可重复性高；此外，用该方法与猪的链球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的阳性血清均不发生反应，从而说明了该方法具有良好的特异性，可用于批量检测粪肠球菌的抗体水平，为监测粪肠球菌的流行状况提供一种实用有效的方法。但由于目前还尚未有检测粪肠球菌感染动物血清的金标准，因此无法与其他方法进行比较，对于符合性检验还更有待于进一步深入的研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 河南农业大学
<120> 一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1013
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<220>
<221> gene
<222> （1）…（1013）
<400> 1
gggttaaggg tacatttccc tctagaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc 60
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 120
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat gataacagat 180
gagaatgata aaacgaatat taatatcgag ttaaatcttc tcaaccaaac agagcagcca 240
ttacaacgag aaattcaatt gaaaaatgca cagttcatgg atactgctgt aattgaaaaa 300
gacggatatt cttaccaagt gactaatggt acgctttatc tgactttgga cgcacaagta 360
aaaaagccgg tacagctttc gttagctgtt gagcaaagtt cgcttcaaac agctcagcca 420
cctaagttat tgtatgaaga caacgaatat gatgtttcag ttacttctga aaaaataaca 480
gtagaggatt ctgctaaaga atcaactgaa ccagaaaaaa taactgtacc agaaaatacg 540
aaagaaacta acaaaaatga ttcggctcca gaaaaaacag aacagccgac cgcaacagaa 600
gaggtaacca atccatttgc agaagcaaga atggcgccag ctactttgag agcgaatctg 660
gcactgcctt taattgcacc acaatacacg acggataatt ctgggactta tccgacagct 720
aattggcagc ccacaggcaa tcaaaatgtg ttaaaccatc aagggaataa agacggtagt 780
gcacaatggg acggccaaac gagttggaat ggggacccta ctaatcgcac aattcttata 840
ttgagtatgg cggtacagga gaccaagccg attatgccat ccgaaaatat gctagagaaa 900
caacaacacc agggcttttt gatgtatatc ttaatgtgcg tgggaatgtt cagaaagaaa 960
tcacgccatt ggatttggtc ttagtcgttg actgggtccc ggtagtatga atg 1013

Claims (7)

1.一种菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）用包被液将EbpA1重组蛋白稀释成浓度1-8µg/mL包被酶标板，100µL/孔，取出酶标板后，用PBST洗涤；
（2）用0.5-2%的BSA封闭经步骤（1）处理的酶标板，300µL/孔，然后用PBST洗涤，甩干孔内液体；
（3）一抗经待测血清样本稀释后得一抗血清，以100µL/孔加至经步骤（2）处理的酶标板孔内，37℃孵育0.5-1.5h，用PBST洗涤；
（4）酶标二抗血清稀释后，以100µL/孔加至经步骤（3）处理的酶标板孔内，37℃孵育15-60min，用PBST洗涤；
（5）加入TMB底物显色液，100µL /孔，37℃孵育5-20min，加入终止液，50µL/孔，用酶标仪读取OD450值进行判断。
2.根据权利要求1所述的菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中EbpA1重组蛋白为pET-32a-EbpA1载体表达纯化并复性的蛋白，pET-32a-EbpA1载体为EbpA1基因与pET-32a载体相连构建的重组载体，其中EbpA1基因序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（1）包被的条件为4℃过夜、37℃作用2h或37℃作用2h，然后4℃过夜。
4.根据权利要求1所述的菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中孵育条件为37℃孵育0.5-2.5h。
5.根据权利要求1所述的菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中一抗血清的稀释比例为1:（100-400），一抗为粪肠球菌灭活的全菌疫苗免疫后分离的血清。
6.根据权利要求1所述的菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中酶标二抗血清的稀释比例为1:（5000-10000），二抗为HRP标记的羊抗兔IgG。
7.根据权利要求1所述的菌毛亚单位蛋白EbpA1猪源粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中OD450值的判断标准为若血清OD450值≥0.41判为阳性；若OD450值≤0.41判为阴性。
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