CN108715857A

CN108715857A - 一种牛冠状病毒vpn基因、编码的重组蛋白及应用

Info

Publication number: CN108715857A
Application number: CN201810582200.0A
Authority: CN
Inventors: 汤承; 岳华; 阿比克哈莫; 王远微
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2018-10-30

Abstract

本发明公开了一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用。应用该重组蛋白所建立的一种BCoV间接ELISA方法，本发明的牛冠状病毒VPN具有良好的抗原表位，能够在原核细胞中高效表达，构建原核表达载体，用所表达的重组蛋白包被抗原，成功的建立了BCoV间接ELISA诊断方法，并确定该方法的最佳条件，为免疫牛群抗体检测和进行流行病学调查提供了一种快速简便的血清学鉴别诊断方法，它解决了目前对犊牛冠状病毒腹泻的诊断方法存在着费时、费力又不能快速诊断的弊端，以及生物试剂和仪器设备昂贵的经费。

Description

一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用。

背景技术

牛冠状病毒(Bovne Corona virus，BCoV)属于套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属2a亚群的成员之一，是引起牛腹泻和呼吸道疾病的主要病原之一，临床上主要表现为新生犊牛腹泻，血样粪便，成年牛冬季严重水样腹泻(有时伴有血和黏液)以及各个年龄段牛的呼吸道感染等特征，在Mebsu等(Mebus C A,Stair E L,Rhodes M B,et al.Pathologyof neonatal calf diarrhea induced by a coronavirus-like agent[J].VeterinaryPathology,1973,10(1):45-64.)首次报道了美国的BCoV后，相继报道在日本、爱尔兰加拿大、阿根廷成年牛和犊牛的腹泻样本中普遍存在。俄克拉何马州收集的肉牛呼吸道样本中也检测到BCoV(Fulton R W,Ridpath J F,Burge L J.Bovine coronaviruses from therespiratory tract:antigenic and genetic diversity.[J].Vaccine,2013,31(6):886-92.)。我国由BCoV感染引发的牛冠状病毒病报道较晚，姚火春等(姚火春,杜念兴.牛冠状病毒的血清流行病学调查[J].南京农业大学学报,1990,13(2):117-121.)1990年报道BCo V阳性率为44.3～80.2％。迄今为止，北京、山东、天津、河南、河北规模化奶牛场腹泻粪便中检测出了这种病毒，感染率在33.33％～65.18％，一年四季均可发生，呈散发或地方流行性，它的发生和蔓延给全球肉牛和奶牛产业造成了巨大的经济损失。

目前检测血清中BCV抗体的方法主要有中和试验、HI试验和间接免疫试验等血清学诊断方法。尽管中和试验是一种快速、准确、灵敏度高而成本低的方法，但是在操作上比较复杂，容易出现错误，所以不宜用于临床快速诊断。HI试验存在主观性强，对判定结果的解释难以标化，不适合大批量检测等缺点；间接免疫荧光试验，对操作者技术要求高和需要昂贵设备，不利于推广；而且传统方法多以全病毒为抗原，存在很大的散毒危险。因此，临床上亟需一种简便、快速、特异、能同时大批量检测样品的血清学诊断方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用，该重组蛋白特异性高，易纯化制备、成本低，可作为诊断抗原能够简便、快速、准确的检测出待测血液样品中的冠状病毒。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种牛冠状病毒VPN基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种牛冠状病毒重组VPN蛋白，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明还公开了一种含有上述的SEQ ID NO:1所示核酸序列的原核表达载体。

进一步地，所述的原核表达载体为PET-28H-VPN。

本发明还公开了一种制备重组VPN蛋白的方法，其特征在于，包括：用原核表达载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；培养转化体，诱导重组VPN蛋白表达，回收并纯化所表达的重组VPN蛋白。

本发明还公开了一种检测或诊断牛冠状病毒的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以牛冠状病毒重组VPN蛋白为包被抗原，该牛冠状病毒重组VPN蛋白由重组质粒pET-28H转化的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达。

本发明还公开了一种检测或诊断牛冠状病毒的间接ELISA方法，包括以下步骤：

(1)包被抗原：将权利要求2所述的重组VPN蛋白作为抗原使用50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μL/孔，4℃过夜；抗原的包被浓度为0.2-3.5μg/ml；

(2)洗涤酶标板：次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔；

(3)封闭：加入2％牛血清白蛋白作为封闭液，100μL/孔，37℃1h；

(4)洗涤酶标板：弃去包被液，洗涤3次；

(5)孵育一抗：将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白分别按比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃2h；

(6)洗涤酶标板：弃去板中的液体，洗涤4次；

(7)酶标二抗：加入用1％牛血清白蛋白按一定稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔，37℃1h；HRP标记的羊抗牛IgG的稀释度为1:2500；

(8)洗涤酶标板：弃去板中的液体，洗涤5次；

(9)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色30min；

(10)终止：加入2mol/L H₂SO₄终止反应，100μL/孔；

(11)读数：在酶标仪上读取D_450nm值；试验设标准阳性、标准阴性血清对照。

进一步地，所述的标准阳性血清为牛冠状病毒阳性血清；所述的标准阴性血清为胎牛标准阴性血清；所述的酶标抗体结合物为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；所述的底物显色液为四甲基联苯胺。

进一步地，所述的抗原的包被浓度为0.2188μg/ml，血清的稀释度为1:200。

本发明还公开了一种上述的牛冠状病毒VPN基因或牛冠状病毒VPN重组蛋白在制备检测或诊断牛冠状病毒药物中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)大肠杆菌表达系统操作简便，成本低廉，可以大量生产目的蛋白。当目的蛋白与标签蛋白融合后，还可以方便蛋白的纯化，所以目前应用广泛。本发明通过对牛冠状病毒病毒VPN cDNA抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列(SEQ ID NO.l，构建了原核表达载体，采用大肠杆菌系统进行原核表达，用所表达的BCoV VPN重组蛋白作为包被抗原，成功地建立了BCoV间接ELISA诊断方法，经特异性、敏感性和重复性试验证实，该方法特异性强，敏感性高，重复性好，同时本发明确定了ELISA的最佳反应条件，为免疫牛群抗体检测和进行流行病学调查提供了一种快速简便的血清学鉴别诊断方法。

2)在兽医实际临床工作中大量的血清样品监测及现地未知疾病的爆发迫切需要一种反应快速、操作简捷、结果准确的诊断方法。ELISA试验(ELISA)诊断方法在以上提到的这些方面很符合临床的要求。ELISA诊断方法已经越来越普及的应用到各种疫病的诊断中。间接ELISA作为一种快速的诊断方法其敏感性就成为该诊断方法实用性的先决条件。

3)用本发明所表达的BCoV VPN重组蛋白作为包被抗原，具有全病毒无可比拟的安全性，不存在潜在的病毒逃逸和扩散的威胁，同时具有很高的特异性，并且能够作为现有技术中VPN亚单位疫苗的配套产品。

4)本发明牛冠状病间接ELISA试验用于牛冠状病毒抗体的血清学诊断、现地疫情监测、流行病学调查等。

5)本发明的间接ELISA检测方法具有很高的敏感性，间接ELISA方法可以很方便的进行大量样品的检测，并且整个实验操作过程所用时间短于琼扩诊断，相对更为快速。本发明试剂盒所用包被抗原是生物安全性很高的亚单位蛋白，不存在散毒危险。可以在实际临床工作中得到更为广泛的应用。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明重组表达质粒双酶切鉴定结果；

图2是本发明纯化蛋白SDS-PAGE电泳结果；

图3是本发明重组融合蛋白的Western blot检测结果；其中，1：蛋白质分子量标准2:阳性样本；3：阴性对照。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1牛冠状病毒重组VPN蛋白的制备

一、试验材料

1、牛冠状病毒(SWUN7901)由西南民族大学动物医学实验室提供。

2、菌株与质粒：大肠杆菌Rosetta(DE3)购自天根公司，表达载体BCoV VPN购自美国Invitrogen公司。

3、工具酶与主要试剂：Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI和XhoI、一步法反转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自大连生物工程公司；四甲基联苯胺购自Thermo公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)购自SIGMA公司、辣根过氧化物酶标记的山羊抗牛IgG购自美国KPL公司；其它试剂为从商业公司购买的分析纯产品。

4、试验用血清：牛冠状病毒阳性血清由试剂盒(svanova公司)从临床样本中筛选，阴性血清为胎牛血清购自BI公司。

二、制备牛冠状病毒重组VPN蛋白：

1、VPN基因的合成：VPN基因的获得及合成：取适量牛源冠状病毒SWUN7901株病毒液，按常规方法提取总RNA并反转录合成cDNA，进行RT-PCR扩增，VPN扩增引物见文章(Molecular epidemiology of human coronavirus OC43reveals evolution ofdifferent genotypes over time and recent emergence of a novel genotype due tonatural recombination)，利用生物软件将两段基因片段拼接，得到大小为1347bp的完整VPN基因序列，其序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示,在其5’增加酶切位点BamH I，3’增加酶切位点Xho I，然后将序列送至引物合成公司合成，BamH1和Xho1位点序列为GGATCC和CTCGAG。

2、重组原核表达载体的构建：

将合成的序列作为模板BamH1和Xho1双酶切后，与同样经过BamH1和Xho1双酶切的pET-28H载体连接转化TOP10感受态。挑单克隆菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆送测序及提质粒进行双酶切鉴定。经鉴定为阳性的重组质粒命名为PET-28H-VPN，双酶切鉴定结果见图1，可见目的条带在1347bp左右，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，符合预期。

3、表达菌构建及其诱导表达：

pET-28H-VPN表达质粒转化Rosetta(DE3)，涂布LB固体(含卡那霉素50ug/ml，氯霉素50ug/ml)培养基，于恒温培养箱中37℃培养16h。次日，挑单克隆菌落接入4mL LB液体培养基中，37℃振摇培养16h，菌种以1：100接入200mL LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml，氯霉素50ug/ml)，37℃振摇培养至OD₆₀₀nm约为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，于25℃诱导表达16h，次日，离心收集菌体，沉淀用1×PBS重悬，取1mlbb8重悬菌液超声破碎，收集上清和沉淀于聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶上进行电泳分析。电泳显示，重组表达质粒产生了约60kDa的蛋白带，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4、重组VPN蛋白的纯化

剩余菌体在PBS(7.4)重悬液超声破碎，过高亲和力Ni柱(Ni-SMART，常州天地人和生物科技有限公司)纯化，收集流传样品及各梯度洗脱样品进行SDS-PAGE检测，N基因表达产物SDS-PAGE电泳后，60kDa处出现一条特别粗的蛋白带，大小与融合蛋白的理论值一致，随着诱导时间的增加，其表达量随之增加，在5h时达到最大值，而空载体质粒转化菌没有出现相同的条带，目的蛋白集中在60mM咪唑洗脱液中(图2)，并对该样品用20mM PBS(pH7.4)中进行透析换液，去除咪唑，测定蛋白浓度。

5、Western blot分析

重组蛋白的Western blot鉴定将纯化后的融合蛋白进行Western blot检测鉴定。将SDS-PAGE蛋白带转移至硝酸纤维素膜，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭，以牛BCoV抗体为一抗，羊抗牛IgG-HRP为二抗，ECL染色。结果显示，表达产物能被BCoV阳性血清所识别，证明表达产物具有良好的反应原性(见图3)。

实施例2应用本发明重组VPN蛋白在建立牛冠状病毒间接ELISA诊断方法中的应用

一、试验材料

1、包被抗原：实施例1所纯化的重组VPN蛋白。

2、试验用血清:牛冠状病毒阳性血清由试剂盒(svanova公司)从临床样本中筛选，阴性血清为胎牛血清购自BI公司。

二、试验方法

试验方法采用间接ELISA方法，检测牛冠状病毒VPN抗血清20份，以BCoV全病毒包被板进行间接ELISA试验对照。

按常规方法在酶标板上进行。将本发明重组VPN蛋白用50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔。加入2％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液，100μL/孔，7℃1h。弃去包被液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白(BSA)分别按比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤4次后加入用1％牛血清白蛋白(BSA)按一定(1:2500)稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色30min，然后加入2mol/L H₂SO₄终止反应，100μL/孔，在酶标仪上读取D_450nm值，试验设标准阳性、标准阴性血清对照。

本试验同时进行了摸索下述间接ELISA诊断方法的最佳条件的一系列试验：抗原最佳浓度和最佳包被液；最佳封闭剂和最佳封闭时间；血清最佳稀释度和一抗最佳作用时间；酶标抗体稀释度和最佳作用时间；底物最佳显色时间；经过了一系列的试验摸索，最终确立了上述试验条件的最佳值，具体如下：

表1抗原最适包被浓度和血清的最佳稀释度的确定

1、最佳抗原浓度和最佳血清稀释度的确定：用不同浓度的本发明VPN重组蛋白包被酶标板后，用不同倍数稀释的阴/阳性血清与之作用，以方阵滴定法确定抗原浓度。由表1结果可见，抗原包被浓度为0.2-3.5μg/mll，血清1:200-1:1200稀释时，阳性血清OD值接近1.0，阴性血清OD值小于0.2。一般的，酶标仪在检测OD值为1.0左右时误差最小，反应最灵敏。此外，还要考虑节省纯化的VPN蛋白，根据P/N最大值确定0.2188μg/ml为抗原的最适包被浓度，1:200为血清最适稀释度。

2、最佳包被液和最佳包被时间的选择：本实验分别用50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液、50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液、50mM pH 7.6Tris-HCl缓冲液作为包被液，每孔加100μl，包被条件分别按4℃过夜、37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据P/N最大值确定50mM pH 7.6 Tris-HCl缓冲液作为最佳包被液，37℃1h作为最佳包被时间。

3、最佳封闭剂和最佳封闭时间的选择：本试验分别用0.5％牛血清白蛋白(BSA)加PBST，1％牛血清白蛋白(BSA)加PBST，4％PEG6000加PBS，PBS作为封闭剂，封闭时间分别按37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据P/N最大值确定4％PEG6000加PBS作为最佳封闭剂，37℃1h作为最佳封闭时间。

4、一抗最佳作用时间的选择：将标准阳性、阴性血清作1:200稀释，酶标抗体作1:2000稀释，分别作用37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据P/N最大值确定2h为一抗最适作用时间。

5、酶标抗体最佳作用时间试验：将标准阳性、阴性血清作1:200稀释，酶标抗体作1:2000稀释，分别作用37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据P/N最大值确定1h为酶标抗体最适作用时间。

6、底物最佳显色时间：底物显色时间：分别为5min、10min、15min、20min、25min，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据P/N最大值确定，底物最适作用时间为10min。

7、间接ELISA判定标准的确定

50份BCoV阴性血清样品中，在本试验确定的上述最佳条件下进行间接ELISA测定，血清数据经统计学分析，计算出OD_450nm值的平均值(X)为0.079，标准差(S)为0.034，则X+2S＝0.147，X+3S＝0.181因此，在酶标仪上测定的OD_450nm＞0.181者判为阳性，OD_450nm＜0.147者判为阴性。处于临界值中间的为可疑。

三、诊断结果

对于试验用的12份血清，使用商品化的试剂盒包被进行间接ELISA试验，测得的OD值根据已有标准判定均为阳性。使用重组VPN蛋白包被进行间接ELISA试验，测得的OD值则均为阳性(本次试验中标准阳性OD值为2.18，标准阴性OD值为0.095，根据建立的判定标准OD_450nm＞0.181为阳性，本次试验中样品的OD_450nm值均大于为0.181。

试验结果表明，将本发明重组VPN蛋白用作包被抗原，采用间接ELISA方法可以方便、快速、准确的诊断出血清样品中牛冠状病毒抗体；本试验所建立的间接ELISA诊断牛冠状病毒方法，具有敏感性强、特异性高、重复性好等优点，适合于临床检测的应用。

实施例3本发明间接ELISA诊断方法的特异性试验

一、试验材料

1、包被抗原:1)实施例1所纯化的重组VPN蛋白。

2、试验用血清：牛冠状病毒阳性血清由试剂盒svanova公司从临床样本中筛选，阴性血清为胎牛血清购自BI公司。

3、病毒：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；牛轮状病毒((BRV)；牛肠道病毒(BEV)；牛衣原体(CVM)；牛结核分枝杆菌(M.bovis)；Q-热(Q-Fever)。

二、交叉试验方法

试验方法采用间接ELISA方法，检测牛其他6种疫病，以BCoV商品化试剂盒包被板进行间接ELISA试验对照。

将本发明重组VPN蛋白用50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μL/孔，37℃1h。弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔。加入2％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液，100μL/孔，7℃1h。弃去包被液，洗涤3次后将阴性和阳性血清(牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛结核分枝杆菌、牛衣原体、牛肠道病毒、Q-热)用1％牛血清白蛋白(BSA)分别按比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤4次后加入用1％牛血清白蛋白(BSA)按一定(1:2500)稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色30min，然后加入2mol/LH₂SO₄终止反应，100μL/孔，在酶标仪上读取D_450nm值，试验设标准阳性、标准阴性血清对照。

试验结果见表2。

表2批内重复性试验

试验结果表明，将木发明重组VPN蛋白用作包被抗原，采用间接ELISA方法，本次试验中样品的OD值均小于为0.181，说明重组VPN蛋白用作包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性。

实施例4本发明间接ELISA诊断方法批间和批内的重复性研究试验

为考察利用本发明重组蛋白制备的间接ELISA诊断方法在使用过程中检测效果的稳定性和可重复性，特进行以下试验。

一、材料和方法

1、牦牛冠状病毒VPN蛋白间接ELISA诊断方法分别按照本发明实施例1的方法制备成4批。

2、牦牛冠状病毒阳性血清共5份，由西南民族大学第二实验楼保存，1份阴性血清为犊牛血清。

3、批内重复性试验：用同一批制备的重组抗原包被板子，取6份不同抗体水平的BCoV阳性血清，在同一时间，同一条件，同一批试验中按间接ELISA程序测定，每份血样平行做4孔，结果进行统计学分析(见表3)。

表3批间重复性试验

4批间重复性试验取4批不同批次制备的本发明重组抗原包被板子，在相同条件下检测5份不同抗体水平的阳性血清和1份阴性血清，每份血样重复4孔，结果进行统计学分析(见表4)。

表4交叉试验结果

血清	BVDV	BRV	BEV	CVM)	M.bovis	Q-Fever
							OD值	0.101	0.092	0.121	0.080	0.093	0.013

实施例5本发明间接ELISA诊断方法符合率试验

本试验主要是考察牛冠状病毒重组VPN蛋白间接ELISA诊断方法与牛冠状病毒间接ELISA诊断试剂盒和琼脂扩散试验的检测差异性。

一、试验材料和试验方法

1、牛冠状病毒阳性血清以及阴性血清由西南民族大学第二实验楼保存。

2、牛其他疫病标准阳性血清如牛轮状病毒等6种疾病标准阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科公司，共计12份(每种疫病血清两份)。

3、待检临床血清一共75份，分别采自于红原地区15份、若尔盖25份、重庆15份、马尔康20份)。

4、牛冠状病毒间接ELISA诊断和琼脂扩散试验均按常规方法进行。

二、试验结果

1、琼脂扩散试验检测结果用琼脂扩散试验检测所有的血清样品，其中阴性血清为阴性，阳性血清检测为阳性，其他6种疫病阳性血清检测结果为阴性，检测阳性的分别是14份、24份、14份和17份。

2、用间接ELISA商品化的试剂盒检测所有血清样品，其中所有阴性血清均为阴性结果；标准阳性血清为阳性结果；6种其他疫病阳性血清的检测结果也全为阴性；临床样本血清中检出72份血清阳性，3份血清阴性。

3、重组蛋白间接ELISA诊断方法检测所有的血清样品，其中阴性血清均为阴性，阳性血清检测为阳性，其他6种疫病阳性血清检测结果全为阴性，临床样本血清中检出74份血清阳性，1份血清阴性。

对总共75份临床血清样品进行检测，用琼脂扩散实验检出69份血清样品阳性，用ELISA试剂盒检出72份血清样品为阳性；用重组蛋白间接ELISA方法检出74份血清样品为阳性。其中与琼扩方法的符合率为100％(69/69)，与ELISA试剂盒的符合率为100％(72/72)，(具体结果见表5)，并且有两个临床血清用试剂盒检测出来为阴性，而用本试验建立的间接ELISA诊断方法为阳性，从上面的实验结果可以看出，用重组蛋白间接ELISA方法比ELISA试剂盒敏感性较高，琼扩试验次之。但是对于群体的大量样品检测来说，重组抗原间接ELISA诊断方法更为适宜。

本发明的间接ELISA检测方法具有很高的敏感性，间接ELISA方法可以很方便的进行大量样品的检测，并且整个实验操作过程所用时间短于琼扩诊断，相对更为快速。琼扩试验耗时较长不太适合紧急诊断的需要。因此本发明重组抗原间接ELISA诊断方法将是牛冠状病毒血清学监测的主要手段之一。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西南民族大学

<120> 一种牛冠状病毒VPN基因、编码的重组蛋白及应用

<130> 2018

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> 牛冠状病毒(Bovne Corona virus ，BCoV)

<400> 1

atgagcttta ccccgggcaa acagagcagc agtcgcgcaa gcagcgtgaa ccgtagcggc 60

aacggcattc tgaaatgggc ggaccaaagc gatcagagcc gtaacgtgca gacccgtggc 120

cgtcgtgcgc agccgaagca aacggcaacc agccagcagc cgagcggcgg taacgtggtg 180

ccgtattata gctggtttag cggcattacc cagtttcaga aaggcaaaga atttgaattt 240

gcggaaggcc agggtgttcc aattgcgccg ggcgtgccgg cgaccgaagc gaaaggctat 300

tggtatcgtc ataaccgtcg tagctttaaa accgcggatg gcaatcagcg tcagctgctg 360

ccgcgttggt atttttatta tctgggcacc ggcccgcatg cgaaagatca gtatggcacc 420

gatattgatg gcgtgttttg ggtggcgagc aaccaggcgg atgtgaacac cccggcggat 480

attctggatc gtgatccgag cagcgatgaa gcgattccga cccgttttcc gccgggcacc 540

gtgctgccgc agggctatta tattgaaggc agcggccgta gcgcgccgaa ctctcgcagc 600

acctcccgtg ccagctctcg cgcgagcagc gcgggttctc gcagccgtgc aaactccggt 660

aatcgtaccc cgaccagcgg cgtgaccccg gatatggcgg atcagattgc gagcctggtg 720

ctggcgaagt taggtaaaga tgcgaccaaa ccgcagcagg tgaccaaaca gaccgcgaaa 780

gaaattcgtc agaaaattct gaacaaaccg cgtcagaaac gtagcccgaa caaacagtgc 840

accgtgcagc agtgctttgg caaacgtggc ccgaaccaga actttggcgg cggcgaaatg 900

ctgaaactgg gcaccagcga tccgcagttt ccgattctgg cggagttggc gccgaccgcg 960

ggcgcgtttt tttttggcag ccgtctggaa ctggccaaag tgcagaacct gagcggcaac 1020

ctggacgagc cgcagaaaga tgtgtatgaa ctgcgttata acggcgcgat tcgttttgat 1080

agcaccttat ctggttttga aaccattatg aaagtgctga acgaaaacct gaacgcgtat 1140

cagcagcagg atggcaccat taacatgagc ccgaaaccgc aacgccaacg tggccagaaa 1200

aacggccagg gcgaaaacga taacattagc gtggcggcgc cgaaaagccg tgtgcagcag 1260

aacaaaattc gtgaactgac cgcggaagat attagcctgc tgaaaaaaat ggatgaaccg 1320

tttaccgaag ataccagcga aatttaa 1347

<210> 2

<211> 448

<212> PRT

<213> 牛冠状病毒(Bovne Corona virus，BCoV)

<400> 2

Met Ser Phe Thr Pro Gly Lys Gln Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Val

1 5 10 15

Asn Arg Ser Gly Asn Gly Ile Leu Lys Trp Ala Asp Gln Ser Asp Gln

20 25 30

Ser Arg Asn Val Gln Thr Arg Gly Arg Arg Ala Gln Pro Lys Gln Thr

35 40 45

Ala Thr Ser Gln Gln Pro Ser Gly Gly Asn Val Val Pro Tyr Tyr Ser

50 55 60

Trp Phe Ser Gly Ile Thr Gln Phe Gln Lys Gly Lys Glu Phe Glu Phe

65 70 75 80

Ala Glu Gly Gln Gly Val Pro Ile Ala Pro Gly Val Pro Ala Thr Glu

85 90 95

Ala Lys Gly Tyr Trp Tyr Arg His Asn Arg Arg Ser Phe Lys Thr Ala

100 105 110

Asp Gly Asn Gln Arg Gln Leu Leu Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu

115 120 125

Gly Thr Gly Pro His Ala Lys Asp Gln Tyr Gly Thr Asp Ile Asp Gly

130 135 140

Val Phe Trp Val Ala Ser Asn Gln Ala Asp Val Asn Thr Pro Ala Asp

145 150 155 160

Ile Leu Asp Arg Asp Pro Ser Ser Asp Glu Ala Ile Pro Thr Arg Phe

165 170 175

Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Gln Gly Tyr Tyr Ile Glu Gly Ser Gly

180 185 190

Arg Ser Ala Pro Asn Ser Arg Ser Thr Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala

195 200 205

Ser Ser Ala Gly Ser Arg Ser Arg Ala Asn Ser Gly Asn Arg Thr Pro

210 215 220

Thr Ser Gly Val Thr Pro Asp Met Ala Asp Gln Ile Ala Ser Leu Val

225 230 235 240

Leu Ala Lys Leu Gly Lys Asp Ala Thr Lys Pro Gln Gln Val Thr Lys

245 250 255

Gln Thr Ala Lys Glu Ile Arg Gln Lys Ile Leu Asn Lys Pro Arg Gln

260 265 270

Lys Arg Ser Pro Asn Lys Gln Cys Thr Val Gln Gln Cys Phe Gly Lys

275 280 285

Arg Gly Pro Asn Gln Asn Phe Gly Gly Gly Glu Met Leu Lys Leu Gly

290 295 300

Thr Ser Asp Pro Gln Phe Pro Ile Leu Ala Glu Leu Ala Pro Thr Ala

305 310 315 320

Gly Ala Phe Phe Phe Gly Ser Arg Leu Glu Leu Ala Lys Val Gln Asn

325 330 335

Leu Ser Gly Asn Leu Asp Glu Pro Gln Lys Asp Val Tyr Glu Leu Arg

340 345 350

Tyr Asn Gly Ala Ile Arg Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Phe Glu Thr

355 360 365

Ile Met Lys Val Leu Asn Glu Asn Leu Asn Ala Tyr Gln Gln Gln Asp

370 375 380

Gly Thr Ile Asn Met Ser Pro Lys Pro Gln Arg Gln Arg Gly Gln Lys

385 390 395 400

Asn Gly Gln Gly Glu Asn Asp Asn Ile Ser Val Ala Ala Pro Lys Ser

405 410 415

Arg Val Gln Gln Asn Lys Ile Arg Glu Leu Thr Ala Glu Asp Ile Ser

420 425 430

Leu Leu Lys Lys Met Asp Glu Pro Phe Thr Glu Asp Thr Ser Glu Ile

435 440 445

Claims

1.一种牛冠状病毒VPN基因，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种牛冠状病毒重组VPN蛋白，其特征在于，含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述的SEQ ID NO:1所示核酸序列的原核表达载体。

4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为pET-28H-VPN。

5.一种制备权利要求2的重组VPN蛋白的方法，其特征在于，包括：用权利要求3的原核表达载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；培养转化体，诱导重组VPN蛋白表达，回收并纯化所表达的重组VPN蛋白。

6.一种检测或诊断牛冠状病毒的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以牛冠状病毒重组VPN蛋白为包被抗原，该牛冠状病毒重组VPN蛋白由重组质粒pET-28H转化的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达。

7.一种检测或诊断牛冠状病毒的间接ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)洗涤酶标板：次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔；

(4)洗涤酶标板：弃去包被液，洗涤3次；

(6)洗涤酶标板：弃去板中的液体，洗涤4次；

(8)洗涤酶标板：弃去板中的液体，洗涤5次；

(9)显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色30min；

(10)终止：加入2mol/L H₂SO₄终止反应，100μL/孔；

8.根据权利要求7所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述的标准阳性血清为牛冠状病毒阳性血清；所述的标准阴性血清为胎牛标准阴性血清；所述的酶标抗体结合物为辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；所述的底物显色液为四甲基联苯胺。

9.根据权利要求7所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述的抗原的包被浓度为0.2188μg/ml，血清的稀释度为1:200。

10.权利要求1的牛冠状病毒VPN基因或权利要求2的牛冠状病毒VPN重组蛋白在制备检测或诊断牛冠状病毒药物中的应用。