CN107075557A - 使用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3作为诊断生物标志物的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于评估哺乳动物受试者中自身免疫糖尿病的风险和进程的方法。所述方法包括测量受试者中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度，和将这些蛋白酶的测量水平与各自的参考水平比较。

Description

使用嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3作为诊断生物标志 物的方法和组合物

发明领域

本发明的方面通常涉及嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3其作为诊断生物标志物的用途，例如用于自身免疫糖尿病。

发明背景

糖尿病(特征在于由胰岛素分泌和/或作用缺陷所导致的高血糖症)的流行，在全球已经达到了流行病的水平(美国糖尿病协会（American Diabetes Association）, Diabetes care 36 Suppl 1:S67-74 (2013))。国际糖尿病联合会(International DiabetesFederation, IDF)估计目前全世界有3.82亿糖尿病患者，有~46%在他们发展出糖尿病并发症之前还未得到确诊。2013年在糖尿病医疗保健方面花费超过5480亿美元(国际糖尿病联合会，IDFDiabetes Atlas，第6版/2013 更新 (2013))。根据中国内地进行的最新的流行病学调查，目前有1.139亿成人患有糖尿病以及4.934亿成人患有前驱糖尿病 (Xu等人, JAMA310:948-959 (2013))。糖尿病病例的绝大部分落入两个广泛发病机理类别：1型糖尿病(T1D)，特征在于胰岛素缺乏(由于免疫介导的产胰岛素胰腺β细胞的破坏)的自身免疫疾病，和2型糖尿病 (T2D)，特征在于胰岛素抗性并且常常与肥胖症或较大年龄相关联的疾病(van Belle等人, Physiological reviews 91:79-118 (2011))。虽然T1D仅占总糖尿病病例的大约5-10%，但其是儿童和青少年中最常见的慢性疾病并且是最严重的糖尿病类型，其导致对每日胰岛素注射终生依赖和由于衰弱的微血管和大血管并发症而增加的发病率和死亡率 (Maahs等人, Endocrinology and metabolism clinics of North America 39:481-497 (2010))。另外，T1D的发生率在全世界每年3%的速率在持续升高(Gan等人,Current problems in pediatric and adolescent health care 42:269-291 (2012))。即使是诊断为T2D的那些，也证实了大约10%的患者对至少一种胰岛自身抗体是阳性的，并且该组通常被称为是“成人隐匿性自身免疫性糖尿病 (LADA)” (Naik等人, The Journal of clinical endocrinology and metabolism 94:4635-4644 (2009))。这些患者与T1D有许多遗传学和免疫学相似处但也具有T2D的特征 – 发作时成年以及对于口服降血糖剂的初始反应；然而，LADA患者趋向于变为胰岛素依赖并且对口服药物无反应(Guglielmi等人,Diabetes/metabolism research and reviews 28 Suppl 2:40-46 (2012))。

目前，对于针对胰腺β-细胞自身抗原的自身抗体(如胰岛素自身抗体 (IAA)，谷氨酸脱羧酶抗体 (GADA)、胰岛素瘤相关蛋白2 自身抗体 (IA-2A)和锌转运蛋白8抗体(ZnT8A))的检测，依然是用于区分自身免疫糖尿病和T2D以及检测那些高风险个体的仅有的生物标志物(Lebastchi和Herold，Cold Spring Harb Perspect Med 2:a007708(2012))。然而，这些自身抗体是通过常规的免疫荧光染色或者用特定的放射性免疫测定来进行测量(Knip等人, Diabetes 54 Suppl 2:S125-136 (2005))，这两者都单调冗长且耗时。放射性免疫测定具有由于使用放射性同位素而构成的健康风险以及处置问题的顾虑。另外，这些来自儿童的自身抗体在出生后6个月之前很少能检测到(Ziegler等人,Diabetes 48:460-468 (1999))。T1D患者中单一自身抗体测量的诊断灵敏性低至59%-67%(Lebastchi和Herold，2012)。其它免疫学测定，包括细胞免疫印迹、T-细胞增殖测定和ELISPOT测定，可以评估自身免疫糖尿病患者的细胞免疫应答；然而，这些测定的局限性在于需要相对较大数量的外周血单核细胞(PBMC)培养以及需要新鲜的细胞(Lebastchi和Herold，2012)。

发明概述

重要的是要开发出新的生物标志物，用于对具有发展T1D的高风险的个体进行早期检测，以及用于对自身免疫糖尿病(T1D和LADA)与T2D的区别性诊断，由此使得能够适应对疾病的最佳预防和治疗策略。因此，本发明的一个目标是鉴别能够受益于早期诊断和治疗的受试者，以降低发展出自身免疫糖尿病的风险。本发明的另一目标是提供用于评估发展出自身免疫糖尿病的倾向的组合物和方法。另一个目标是提供用于协助预测自身免疫糖尿病的组合物和方法。另一个目标是提供于协助诊断自身免疫糖尿病的组合物和方法。本发明还另一个目标是提供降低发展出自身免疫糖尿病的风险的方法。

提供了用于鉴别和治疗自身免疫糖尿病的组合物和方法。本发明的一个方面提供了用于在哺乳动物受试者中评估自身免疫糖尿病的风险和进展的方法。所述方法包括在受试者中测量血清嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和蛋白酶3 (PR3)中至少一种的酶活性和/或蛋白浓度，并将所测量的这些蛋白酶的水平与各自的参考水平进行比较。血清NE和PR3的酶活性和蛋白浓度比所述各自的参考水平高，表示发展出自身免疫糖尿病的风险或倾向增加。

还另一个方面提供了用于在受试者中对自身免疫糖尿病进行诊断或辅助诊断的方法。所述方法包括从所述受试者获得血液样品，并测量所述血液样品中含有的 NE和PR3中至少一种的酶活性和蛋白浓度。将所测量的酶活性和蛋白浓度与各自的参考水平进行比较。在优选的方面，如果NE和PR3中至少一种的酶活性和蛋白浓度高于各自的参考水平，则存在自身免疫糖尿病。在另一个优选的实施方案中，血液样品中NE和PR3中至少一种的酶活性和蛋白浓度是分别通过基于发色团的测定和酶联免疫吸附测定分析的。

本发明另外的方面提供了方法和组合物，其用于确定受试者有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一个实施方案中，本发明提供了用于确定受试者是否有发展出自身免疫糖尿病的风险的方法，其包括：

从所述受试者获得样品;

在所述样品中测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平;

将嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平，与酶活性和/或蛋白水平各自的参考水平进行比较，其中所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和/或蛋白酶3各自的参考水平得自不患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者；和

当所述样品中所含的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和/或蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的参考水平之上超过大约20%时，确定所述受试者有发展出自身免疫糖尿病的风险。

本发明另外的方面提供了方法和组合物，其用于确定显示出成人发作糖尿病迹象的受试者是否有发展出自身免疫糖尿病的风险。所述方法包括：

从所述受试者获得样品;

在所述样品中测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平;

将嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平，与酶活性和/或蛋白水平各自的参考水平进行比较，其中所述各自的参考水平得自不患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者；和

当样品中所含的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的参考水平之上超过大约20%时，确定所述受试者有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病是成人隐匿性自身免疫性糖尿病。在一些实施方案中，样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性可以通过基于发色团的测定来进行测量。在一些实施方案中，样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平可以通过免疫测定来进行测量。在一些实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪、组织以及以及其组合。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括对所述受试者发展出自身免疫糖尿病的风险进行沟通。

在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病是成人隐匿性自身免疫性糖尿病。在一些实施方案中，一个或多种胰岛特异性自身抗体，如GADA、IA2A和/或ZnT8A，在受试者中是不可检测的。在其它实施方案中，一个或多种胰岛特异性自身抗体，如GADA、IA2A和/或ZnT8A，在受试者中是可检测的。在一些实施方案中，所述受试者具有自身免疫糖尿病的一个或多个风险因素。在一些实施方案中，所述受试者是婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，所述受试者被诊断为有糖尿病。

在一些实施方案中，当样品中所含的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的参考水平之上超过大约20%时，所述方法还包括治疗受试者，以降低发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，所述受试者可以使用选自以下的进行治疗：胰岛素脱敏、GAD脱敏、热休克蛋白60 (HSP60)脱敏、拮抗Ly6G (GR1 嗜中性粒细胞标志物)、嗜中性粒细胞耗竭、拮抗B-细胞激活因子(BAFF)、糖尿病抗性MHC-II类分子促进表达、CD3激活、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)疗法、Treg疗法、避免环境风险因素、免疫系统调节、促进β-细胞再生、B-细胞抑制、CTLA-4抑制、肿瘤坏死因子-α、IL-1受体拮抗剂、聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子、人重组干扰素-α、自体肝细胞移植、NE/PR3化学抑制剂或肽抑制剂的使用以及以及其组合。

在一些实施方案中，所述样品中所含有的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在各自的参考水平之上超过40%。在一些实施方案中，所述治疗可以是：胰岛素脱敏、GAD脱敏 (Ludvigsson等人, New Engl J Med 359:1909-1920(2008)、热休克蛋白60 (HSP60)脱敏、拮抗Ly6G (GR1 嗜中性粒细胞标志物)、嗜中性粒细胞耗竭、拮抗B-细胞激活因子(BAFF) (Marino等人 Diabetes 61(11):2893-2905(2012))、糖尿病抗性MHC-II类分子促进表达 (Tian等人, J. Clin. Invest. 114(7):969-978 (2004))、CD3激活(Herold等人, Diabetes. 62(11):3766-3774 (2013)；Herold等人, New Engl J Med 346(22):1692-1698 (2002) (OKT3抗体))、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)疗法(Gitelman等人, The Lancet Diabetes & Endocrinology 1(4):306-316(2013)；Eisenbarth等人, Diabetes Res 2:271-276 (1985))、Treg疗法(Du等人, PLoSOne 8(2):e56209 (2013))、避免环境风险因素、免疫系统调节、促进β-细胞再生、B-细胞抑制、CTLA-4抑制、肿瘤坏死因子-α (Mastrandrea等人, Diabetes Care 32:1244-1249(2009))、IL-1受体拮抗剂、聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子、人重组干扰素-α (Rother等人, Diabetes Care 32:1250-1255 (2009))、自体肝细胞移植(Haller等人, Diabetes 58(Supp. 1):A7 (2009) (Abstract)；Voltarelli等人, Ann N Y Acad Sci 1150:220-229(2008)；Voltarelli等人, JAMA 297:1568-1576 (2007)；Couri等人, JAMA 301:1573-1579 (2009))、NE/PR3化学抑制剂或肽抑制剂的使用或其组合。

在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病选自1型糖尿病和成人隐匿性自身免疫性糖尿病。在一些实施方案中，所述样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性是通过基于发色团的测定来进行测量的。在一些实施方案中，所述样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平是通过免疫测定来进行测量的。在一些实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪、组织以及以及其组合。在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。在一些实施方案中，所述自身免疫糖尿病是成人隐匿性自身免疫性糖尿病。在一些实施方案中，所述受试者是小于一岁的人类受试者。

在一些实施方案中，所述方法可进一步包括对所述受试者发展出自身免疫糖尿病的风险进行沟通。

在一些实施方案中，本发明中所使用的参考水平，包括从一个或多个未患有自身免疫糖尿病参考受试者所获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平。

所公开的方法和组合物的另外的优势将部分地在下文的说明书中进行说明，以及将部分地从说明书中进行理解，或者可以通过实践公开的方法和组合物而习得。所公开的方法和组合物的优势，将通过所附权利要求中具体指出的要素和组合的方式而意识到和获取。应理解前文的概述和下文的详述都仅仅是示例性的和说明性的，并不是要限制所要求保护的发明。

附图简述

加入本说明书并构成了说明书一部分的附图，说明了所公开方法和组合物的若干实施方案，并且与说明书一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。

图1 所示出的图，其说明了在健康对照(n=77)和1型糖尿病 (T1D)患者(n=149)中，NE (A)和PR3 (B)的循环蛋白水平、NE/PR3 酶活性 (C)和A1AT 蛋白水平 (D)。每个框中间的水平线表示中值；框的顶部和底部边沿分别代表第75和第25个百分位数；小横线(whisker)代表第10和第90个百分位数，而点代表离群值(outlier)。** p<0.01，*** p<0.001，对比健康对照。

图2 所示出的图，其说明了在健康对照(n=77)、诊断一年内的T1D患者 (n=28)、患病期>1年且<5年的T1D患者 (n=59)和患病期>5年的T1D患者(n=62)中，NE (A)和PR3 (B)、NE和PR3的酶活性 (C)、嗜中性粒细胞计数(D)和A1AT (E)的循环蛋白水平 。每个框中间的水平线表示中值；框的顶部和底部边沿分别代表第75和第25个百分位数；小横线代表第10和第90个百分位数，而点代表离群值。** p<0.01，*** p<0.001，对比健康对照。

图3 所示出的图，其说明了在健康对照 (n=77)、诊断一年内的T1D患者 (n=28)、患病期>1年且<5年的T1D患者 (n=59)和患病期>5年的T1D患者(n=62)中MPO-DNA复合物的循环水平(A)。循环MPO-DNA复合物与循环NE (B)和PR3 (C)蛋白水平以及NE和PR3的酶活性(D)显著相关联。** p<0.01，*** p<0.001，对比健康对照。

图4 所示出的图，其说明了在健康对照 (n=77)、自身抗体阴性的T1D患者(n=54)、GADA、IA2A或ZnT8A中一种自身抗体阳性的T1D患者(n=61)、GADA、IA2A或ZnT8A中两种自身抗体阳性的T1D患者(n=24)或者GADA、IA2A和ZnT8A三种自身抗体阳性的T1D患者(n=10)中，NE (A)和PR3 (B)的循环蛋白水平、 NE和PR3的酶活性(C) 。NE (D)和PR3 (E)的循环蛋白水平以及和NE和PR3的酶活性(F)与GADA阳性的T1D患者(n=73)中的GADA效价显著相关联。*** p<0.0001，对比健康对照。

图5 所示出的图，其说明了NE (A)和PR3 (B)的循环蛋白水平以及NE和PR3的酶活性(C)，其与IA2A阳性的T1D患者(n=44)中的IA2A效价显著相关联。

图6所示的图，显示了在NOD小鼠(n=7)中，小鼠PR3的循环蛋白水平以及血糖在糖尿病发展期间的动态变化。

发明详述

对于1型糖尿病(T1D)发作的预防和延缓已经进行了长期的探索。已经并且持续在对实现此目标的策略和技术进行设计和研究，但是还没有成功达到需求。很可能许多这些策略都应用的太晚，都是在疾病已经发展太多以至于不能减缓或者停止之后。主要的问题是对于有风险的那些进行的鉴别都是基于标志物和症状，所述标志物和症状仅在已经造成许多损害之后才显现，使得减缓或停止疾病变得更加困难。本发明通过允许在1型糖尿病的发展中更早鉴别有风险的个体而解决这些问题。此种鉴别使得用于预防或延缓1型糖尿病发作的策略和技术成为可能并更加有效。

通过参考下文对具体实施方案的详述和其中所包括的实施例以及参考附图和其前后文的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。

定义

如本文所用，术语“自身免疫糖尿病”是指与自身免疫相关或者由自身免疫引起的疾病。代表性的自身免疫糖尿病疾病包括但不限于，1型糖尿病和成人隐匿性自身免疫性糖尿病。

如本文所用，术语“诊断”是指从一组风险值和/或患者症状中鉴别出疾病或状况的类型。这与疾病的预测不同，预测是指在发生之前预测疾病或状况的出现；与疾病风险确定不同，其是指在发生之前确定疾病或状况出现的风险；以及与术语“预后”不同，其是指在之前的时间点从一个或多个指示值来预测在未来时间点疾病的进展。

如本文所用，术语“样品”是指所获得的生物学样品，其用于诊断、预后或评估目的受试者如患者的目的。在某些实施方案中，获得此样品的目的可以是用于确定正在进行的病症的结果或者治疗方案对状况的效果。优选的样品包括但不限于，血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪或组织。此外，本领域技术人员会意识到一些样品在经过分级或纯化程序后会更易于分析，例如，将全血分为血清或血浆组分。

如本文所用，术语“生物标志物”是指用作靶标而用于筛选得自受试者的样品的物质，如蛋白酶或肽酶或蛋白质酶或蛋白质或多肽或其它生物学物质。

如本文所用，术语“底物”是指可以由酶进行作用的物质。例如，底物包括切割后被释放的缀合至发色或荧光基团的化合物。有用底物的实例包括缀合至染料基团的肽，包括但不限于p-硝基苯胺，并且可以在特定的位点被蛋白酶切割。

如本文所用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子的人或人源化的版本或者包括抗原结合位点的其片段。这些包括缺乏完整抗体Fc片段的Fab和F(ab’)₂片段。

如本文所用，术语“参考水平”是指目的生物标志物的归一化的活性和/或水平。例如，从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者的群体确定的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的归一化的酶活性和/或蛋白水平，分别是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的参考水平。

如本文所用，“阳性参考水平”是指目的生物标志物的归一化的活性和/或水平。例如，从患有自身免疫糖尿病的一个或多个受试者的群体确定的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3归一化的酶活性和/或蛋白水平，分别是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的阳性参考水平。

如本文所用，术语“水平”是指物质或事物的量以及是指物质和事物的浓度，如上下文所指示。

如本文所用，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于，鼠类、猿类、人类、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。术语“对照”当用于个体、宿主、受试者或患者的上下文时，是指来用作实验或比较的对照的哺乳动物，包括但不限于，鼠类、猿猴类、人类、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。

如本文所用，术语“指示值”是指参数如生物标志物的水平或量度，其与目的的状态或条件相关联或者对目的的状态或条件是指示性的。只要参数可有助于指示状态或条件，则并不需要单一参数的值对状态或条件是指示性的。

应理解所公开的方法和组合物并不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特别的试剂，除非有另外指明，且本身可有变化。还应理解本文所用的术语其目的仅仅是在于描述具体实施方案而不是要进行限制。

公开的有材料、组合物和组分，其可用于所公开的方法和组合物、可与所公开的方法和组合物结合使用、可用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些以及其它的材料，并且应理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等的时候，虽然可能并未有明确提到公开这些化合物的每个各种个体或集体的组合及排列，但是其每个都在本文中有明确设想和描述。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于，制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因而，如果可以执行许多额外的步骤，应理解这些额外的步骤的每一个都可以与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合一起执行，并且每个此类组合都明确考虑到且应认为是已经公开了。

用于自身免疫糖尿病的生物标志物

嗜中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE，EC编号: 3.4.21.37，由ELA2编码)和蛋白酶3 (PR3，EC编号: 3.4.21.76，由PRTN3编码)是胰凝乳蛋白酶家族的两种丝氨酸蛋白酶，其储存在嗜中性粒细胞(一种多形核白细胞)的初级(也称作嗜天青的)颗粒中(Korkmaz等人,Pharmacological Reviews 62:726-759 (2010)；Meyer-Hoffert和Wiedow，Current opinion in hematology 18:19-24 (2011))。嗜中性粒细胞是白细胞群体中最丰富的成员，在正常健康人中组成了循环白细胞的40-75%，并且是募集至感染或发炎部位的第一类白细胞，在所述部位嗜中性粒细胞可通过多种手段消除病原体(Kolaczkowska和Kubes,Nat Rev Immunol 13:159-175 (2013)；Mestas和Hughes, Journal of immunology 172:2731-2738 (2004))。传统上，嗜中性粒细胞已经被识别为针对感染性疾病通过氧化和非氧化机制提供第一线先天免疫防护的主要角色(Mantovani等人, Nat Rev Immunol 11:519-531 (2011))。然而，增加的证据表明嗜中性粒细胞不仅仅是专职杀手，在感染和炎性疾病的背景下还是免疫系统主要的调节者(Amulic等人, Annual review of immunology 30:459-489 (2012))。嗜中性粒细胞的激活和脱粒导致将丝氨酸蛋白酶释放至细胞外介质和循环中，其中它们不仅帮助消除入侵的病原体还在急性和慢性炎症期间用作免疫应答的体液调节剂，通过加工趋化因子和激活特定的细胞表面受体来调节细胞信号网络(Meyer-Hoffert和Wiedow，(2011)；Pham, Int J Biochem Cell Biol 40:1317-1333 (2008)；Wiedow和Meyer-Hoffert, Journal of Internal Medicine 257:319-328 (2005))。嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性的增加已经与若干炎性和自身免疫疾病的发病机理有牵连，包括慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、Wegener肉芽肿病、Papillion-Lefèvre综合征和小血管脉管炎(Korkmaz等人, 2010)。然而，尚未探索它们与自身免疫糖尿病的关联。

试剂盒

上文所述的材料，以及其他材料，可以以任何适合的组合包装在一起作为试剂盒，其可用于执行或辅助进行所公开的方法。将试剂盒构成进行设计和调适以用于所公开的方法是有用的。例如所公开的是用于测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白水平的试剂盒，所述试剂盒包含用于嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的底物。

试剂盒可包括针对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3或者两者的抗体。试剂盒还可以包括与NE和/或PR3抗体反应的抗体。这些二级二级抗体可以缀合至检测酶，如辣根过氧化物酶。所述试剂盒还可以包括发色底物。例如，可包括用于二级二级抗体的发色底物。试剂盒还可包括用于测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的发色底物。

混合物

所公开的是通过执行或准备进行所公开方法而形成的混合物。例如，所公开的是包含样品和底物的混合物。

每当所述方法涉及将组成或组分或试剂进行混合或进行接触时，则执行该方法就会创建许多不同的混合物。例如，如果方法包括3个混合步骤，如果所述步骤是分别执行的，那么在这些步骤的每一个之后形成独特的混合物。此外，在所有这些步骤完成时都会形成混合物，无论如何执行的所述步骤。本公开考虑到通过执行所公开的方法而获得的这些混合物，以及含有任何公开的试剂、组合物或组分(例如本文公开的)的混合物。

用于评估自身免疫糖尿病的倾向或对其进行诊断的方法

在本发明的一方面，提供了用于评估在受试者中对发展自身免疫糖尿病的风险或倾向和/或对其进展进行的方法。所述方法包括在受试者中确定嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白浓度，并将所测量的酶活性和/或蛋白浓度与其各自的参考水平进行比较。通常从受试者取得样品并测量酶活性和/或蛋白浓度。所述样品可以是，例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪、组织或其组合。如果所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白浓度高于相应的参考水平，那么该受试者(例如患者)发展出自身免疫糖尿病的风险或倾向比具有低于相应参考水平的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白浓度的人更高。

在某些实施方案中，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度的参考水平，可以得自未患有自身免疫糖尿病的一个或多个受试者。如果样品中所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度的水平在统计学可接受的范围内，例如参考水平加减大约10%，则表示该受试者中没有自身免疫糖尿病；然而，如果样品中所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度的水平在参考水平之上超过20%，那么这表示该受试者中有自身免疫糖尿病。

基于本文所描述的发明，当样品中所含有的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平高于从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者所获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平的参考水平时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。例如，当样品中所含有的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者所获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平各自的参考水平之上超过大约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

当样品中所含有的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者所获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平各自的参考水平之上超过至少大约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，当样品中所含的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性在从未患有自身免疫糖尿病的参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性各自的参考水平之上超过大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一些实施方案中，当样品中所含的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性各自的参考水平之上至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，当样品中所含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的蛋白水平各自的参考水平之上超过大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一些实施方案中，当样品中所含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的蛋白水平各自的参考水平之上至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，当样品中所含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水平的参考水平之上超过大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一些实施方案中，当样品中所含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水平的参考水平之上至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，当样品中所含蛋白酶3的蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的蛋白酶3蛋白水平的参考水平之上超过大约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一些实施方案中，当样品中所含蛋白酶3的蛋白水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的蛋白酶3蛋白水平的参考水平之上至少大约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，当样品中所含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的酶活性水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶酶活性的参考水平之上超过大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一些实施方案中，当样品中所含嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的酶活性水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶酶活性的参考水平之上至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

在一些实施方案中，当样品中所含蛋白酶3的酶活性水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的蛋白酶3酶活性的参考水平之上超过大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。在一些实施方案中，当样品中所含蛋白酶3的酶活性水平在从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的蛋白酶3酶活性的参考水平至少至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%时，受试者可以被鉴别为、诊断为、分类为等等具有发展出自身免疫糖尿病的风险。

从未患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者获得的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白水平的参考水平，可以与正在测试自身免疫糖尿病风险的受试者的评估一起来确定，或者优选地，通过建立要用于未来测定的此类参考水平来进行确定。如本文所公开的，此类参考水平的实例有400 ng/mL的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水平(或者262 ng/ml至469 ng/mL的范围)、100 ng/mL的蛋白酶3的蛋白水平(或者92ng/mL至165 ng/mL的范围)以及0.15 mU/mL的循环NE/PR3 酶活性(或者0.10 mU/mL至0.21mU/mL的范围)。

所公开的方法也可以用于鉴别受试者显示出成人发作糖尿病的迹象、诊断为有胰岛素抗性或诊断为有2型糖尿病、为具有发展出自身免疫糖尿病 (LADA)的风险。具有发展出2型糖尿病风险的或者患有2型糖尿病的那些中的一部分，将会发展出自身免疫糖尿病。对于这些受试者，用于2型糖尿病的传统治疗将会无效或者会无法防止自身免疫糖尿病的发展。所公开的方法可用于鉴别此类具有发展出自身免疫糖尿病风险的受试者。一旦经鉴别，此类受试者可基于其发展出自身免疫糖尿病的风险而接受治疗。

所公开的方法对于筛选具有已知自身免疫糖尿病风险因素的受试者是特别有用的。此类风险因素包括具有近亲成员被诊断为自身免疫糖尿病、具有自身免疫糖尿病的遗传学标志物以及具有一个或多种自身免疫糖尿病相关的自身抗体。所公开的方法可以提供表明受试者有风险或正在发展自身免疫抗体的最早的指示。此类早期鉴别允许更早的以及很可能更成功的介入。

嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性可以使用连续或非连续的测定，通过监测从底物或产物吸收、发射、释放或产生光、荧光或热的变化来进行测量。在优选的实施方案中，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性，可以使用连续的测定，通过监测从底物吸收或发射光的变化来进行测量，例如使用缀合至发色或荧光基团(在切割后释放)的合成肽底物。应理解可以使用在样品中测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的任何方法。代表性的技术包括但不限于，在反应过程中，通过监测从缀合至发色基团或荧光基团的合成肽底物所产生的颜色或荧光的连续测定，所述荧光激活细胞分选术如p-硝基苯胺，所述荧光基团如正-氨基苯甲酰。

嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白浓度可以使用常规方法来确定，如荧光激活细胞分选术 (FACS)、液相层析/串联质谱 (LC/MS/MS)、表面等离子共振(SPR)、电化学免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学或蛋白印迹。在优选的实施方案中，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白浓度可以使用免疫学测定来确定，例如 ELISA测定或夹心测定。应理解可以使用在样品中对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白浓度进行定量的任何技术。代表性的方法包括但不限于，免疫沉淀、质谱、电泳和层析包括亲和性层析。

本文提供的是这样的测定，其可以用于例如检测嗜中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE)和蛋白酶3(PR3)以用于本文公开的方法。各种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中描述，如例如Maggio等人, Enzyme-Immunoassay, (1987) 和Nakamura等人，EnzymeImmunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of ExperimentalImmunology, Vol. 1: Immunochemistry, 27.1-27.20 (1986)，其每个都以其整体通过引用并入本文并且特别是其对于免疫检测方法的教导。免疫测定，在其最简单和直接的意义上来说，是涉及抗体和抗原之间结合的结合测定法。已知许多类型和形式的免疫测定并且全都适合用于检测公开的生物标志物。免疫测定的实例有酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫珠捕获测定、蛋白印迹、斑点印迹、凝胶迁移测定、流式细胞术、蛋白阵列、多路微珠阵列、磁力捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)和光褪色后的荧光回收/定位(FRAP/ FLAP)。

一般而言，免疫测定涉及将怀疑含有目的分子的样品(如公开的癌症样品)与针对所述目的分子的抗体接触或者将针对目的分子的抗体(如针对NE和PR3的抗体)与可被所述抗体结合的分子接触(视情况)，其中是在有效允许免疫复合物形成的条件下。在有效条件下，将样品与针对目的分子的抗体或与可以结合针对目的分子的抗体的分子接触，并接触允许形成免疫复合物（初级免疫复合物）的充足的时间段一般是仅将分子或抗体与样品接触并温育所述混合物一段足以使抗体与抗体可以结合的存在的任何分子（例如，抗原）形成（即，与之结合）免疫复合物的时间段。在许多形式的免疫测定中，可继而洗涤样品-抗体组合物，如组织切片、ELISA平板、斑点印迹或蛋白印迹，以去除任何非特异性结合的抗体种类，仅允许检测初级免疫复合物中特异性结合的那些抗体。

免疫测定可包括用于对样品中目的分子(如所公开的NE和PR3或者其抗体)的量进行检测和定量的方法，所述方法一般涉及对结合过程期间形成的任何免疫复合物进行检测或定量。一般而言，对免疫复合物形成的检测是本领域熟知的，并且可以通过应用许多方法实现。这些方法一般是基于对标记或标志物的检测，如任何的放射性、荧光、生物学或酶标签或者任何其它已知的标记。参见例如，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，所述的每一个都以其整体通过引用并入本文并且特别用于针对免疫检测方法和标记的教导。

涉及对物质(如蛋白或针对具体蛋白的抗体)的检测的免疫测定，包括无标记测定法、蛋白分离方法(也即，电泳)、固体支持物捕获测定法或者体内检测。无标记测定法一般是对样品中特定的蛋白或针对特定蛋白的抗体的存在或缺失进行确定的诊断措施。蛋白分离方法另外可用于评估蛋白的物理性质，如大小或静电荷。捕获测定法一般对于样品中特定的蛋白或针对特定蛋白的抗体的浓度的定量评估更有用。最后，体内检测可用于评估该物质的空间表达模式，也即，在受试者、组织或细胞中的何处可以找到该物质。

条件是浓度足够，通过抗体-抗原相互作用而生成的分子复合物([Ab-Ag]n)是裸眼可见的，但是较小的量也是可以检测和测量的（由于其对光束的散射能力）。复合物的形成表明两种反应物都存在，而且在免疫沉淀测定中使用恒定浓度的试剂抗体；来测量特异性的抗原([Ab-Ag]n)，而试剂抗原则用于检测特异性的抗体 ([Ab-Ag]n)。如果试剂种类已经提前包被至细胞上(如在红血球凝聚测定中)或很小的颗粒上(如乳胶凝集测定中)，经包被颗粒的“簇集(clumping)”在低很多的浓度都是可见的。基于这些基本原理的许多测定法都是通常使用的，包括Ouchterlony免疫扩散测定、火箭免疫电泳和免疫比浊测定和浊度测定。此类测定法的主要限制是与利用标记的测定法相比有限的灵敏性(较低的检出限)，以及在一些情况下很高浓度的分析物实际上可以抑制复合物的形成，必需有防护措施从而使过程更复杂。这些组1测定法回溯至抗体的发现并且它们都不具有真正的“标记” (例如Ag-enz)。其它种类的无标记免疫测定依赖于免疫传感器，并且许多能够直接检测抗体-抗原相互作用的仪器为商业可获得的。大多数都依赖于在固定有配体的传感器表面生成倏逝波(evanescent wave) ，其使得可以持续监测对配体的结合。免疫传感器使得可以容易地对动力学相互作用进行研究，并且随着成本更低的专门仪器的出现，未来在免疫分析领域有着更广阔的应用。

使用免疫测定来检测特定蛋白可以涉及通过电泳分离蛋白。电泳是带电分子在溶液中响应电场而进行的迁移 。其迁移速率取决于场的强度，取决于分子的电荷、大小和形状，以及还取决于分子在其中移动的介质的离子强度、粘度和温度。作为分析工具，电泳简单、快速且高度灵敏。其分析性地用于研究单一带电种类的性质以及用作分离技术。

使用可以与所公开的方法一起进行的电泳的免疫测定是蛋白印迹分析。蛋白印迹或免疫印迹允许确定蛋白的分子量以及测量不同样品中存在的蛋白的相对量。检测方法包括化学发光和发色检测。用于蛋白印迹分析的标准方法可以例如在D.M. Bollag等人,Protein Methods (2d edition 1996)和E. Harlow & D. Lane. Antibodies, a Laboratory Manual (1988), 美国专利 4,452,901中找到，对于蛋白印迹方法的教导其各自以其整体通过引用并入本文。一般而言，蛋白通过凝胶电泳进行分离，常常是SDS-PAGE。将蛋白转移至一层特殊的印迹纸，例如硝化纤维素，但也可以使用其它类型的纸或膜。蛋白保持其在凝胶上同样的分离模式。将印迹与一般的蛋白(如乳蛋白)进行温育以将硝化纤维素上的余下的粘性位置都结合。继而将抗体添加至溶液，其能够结合至其特异性的蛋白。

可以通过间接的酶免疫测定技术容易地使特异性抗体附着至特异性固定的抗原可视化，其通常使用发色底物(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)或化学发光底物。探测的其它可能性包括使用荧光或者放射性同位素标记 (例如荧光素，¹²⁵I)。用于检测抗体结合的探针可以是缀合的抗-免疫球蛋白、缀合的葡萄球菌蛋白A (结合IgG)或者针对生物素化的初级抗体的探针(例如缀合的抗生物素蛋白/链酶亲和素)。

所述技术的效力在于同时通过其抗原性的措施以及其分子量来同时检测特定的蛋白。蛋白首先在SDS-PAGE中通过质量进行分离，继而在免疫测定步骤中特异性地进行检测。因而，可以同时运行蛋白标准品(梯度标准)以估算异质样品中目的蛋白的分子量。

放射免疫沉淀测定(RIPA)是使用放射标记的抗原来检测血清中特异性抗体的灵敏测定。使抗原与血清反应，并继而使用特殊的试剂来使其沉淀，如例如，蛋白A 琼脂糖珠。通常接着将结合的放射标记免疫沉淀物用凝胶电泳进行分析。放射免疫沉淀测定(RIPA)通常用作诊断HIV抗体存在的确认性测试。RIPA在本领域中也称作Farr测定、沉淀素测定、放射免疫沉淀素测定；放射免疫沉淀分析；放射免疫沉淀分析和放射免疫沉淀分析。

还考虑到这样的免疫测定，其中将蛋白或特异于蛋白的抗体结合至固体支持物(例如管、孔、珠或细胞)来分别从样品中捕获目的的抗体或蛋白，与用于检测支持物上蛋白或特异于该蛋白的抗体的方法进行组合。此类免疫测定的实例包括放射免疫测定 (RIA)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、流式细胞术、蛋白阵列、多路微珠测定和磁力捕获。

放射免疫测定(RIA)是用于检测抗原-抗体反应的经典定量测定，其直接或间接地使用放射性标记的物质(放射性配体)，以测量未标记物质对于特异性抗体或其它受体体系的结合。放射免疫测定用于例如测试血液中的激素水平，而无需使用生物测定。非免疫原性物质(例如半抗原)如果偶合至能够诱导抗体形成的较大的载体蛋白(例如牛γ-球蛋白或人血清白蛋白)则也可以进行测量。RIA涉及将放射性抗原(因为将碘原子引入至蛋白中酪氨酸的简便性，所以经常使用放射性同位素 ¹²⁵I或¹³¹I )与针对该抗原的抗体进行混合。所述抗体一般被连接至固体支持物，如管或珠。继而以已知的量来添加未标记的或者“冷”抗原并测量被替换的标记抗原的量。初始，放射性抗原结合至抗体。当添加冷抗原时，二者竞争抗体结合位点 - 而较高浓度的冷抗原更多的结合至抗体，替换掉放射性变体。将结合的抗原与溶液中未结合的那些分离，并将每个的放射性用于结合曲线作图。该技术是极为灵敏和特异的。

酶联免疫吸附测定 (ELISA)，或者更常见地称作EIA (酶免疫测定)，是能够对特异于蛋白的抗体进行检测的免疫测定。在此种测定中，结合至抗体结合试剂或抗原结合试剂的可检测标记是酶。当暴露于其底物时，此酶以产生可检测(例如通过分光光度计、荧光计或可视的措施)化学部分的方式进行反应。可用于检测的能用于可检测地标记试剂的酶包括但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。对于ELISA程序的描述，参见Voller, A.等人, J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978);Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), EnzymeImmunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1980; Butler, J. E., In: Structure ofAntigens, Vol. 1 (Van Regenmortel, M., CRC Press, Boca Raton, 1992, pp. 209-259; Butler, J. E., In: van Oss, C. J.等人, (eds), Immunochemistry, MarcelDekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803; Butler, J. E. (ed.),Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991);Crowther, “ELISA: Theory and Practice,” In: Methods in Molecule Biology, Vol.42, Humana Press; New Jersey, 1995; 美国专利4,376,110，其各自都以其整体通过引用并入本文及特别用于对ELISA方法的教导。

ELISA技术的变化是本领域技术人员已知的。在一种变化中，可将能结合蛋白的抗体固定至展示蛋白亲和性的选定表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。随后，可以将怀疑含有标志物抗原的测试组合物添加至所述孔。在结合以及洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，可以检测到结合的抗原。可以通过添加对靶蛋白特异的二级二级抗体（其连接至可检测标记）来实现检测。此种类型的ELISA是简单的“夹心 ELISA”。也可以通过添加二级二级抗体、随后添加对二级二级抗体有结合亲和力的三级抗体(其中三级抗体连接至可检测标记)来实现检测。

另一种变化是竞争性ELISA。在竞争性ELISA中，测试样品竞争结合已知量的经标记抗原或抗体。可以通过在与经包被的孔温育之前或期间将样品与已知的经标记种类混合，来确定所述样品中反应性种类的量。样品中反应性种类的存在会发挥作用以减少可用于结合至孔的经标记种类的量，并因而减少最终的信号。

无论使用的是何种形式，ELISA都有一些共通的特征，如包被、温育或结合、洗涤以去除非特异性结合的种类以及检测结合的免疫复合物。抗原或抗体可以连接至固体支持物，如以平板、珠、量油计(dipstick)、膜或柱基质的形式，以及将待分析样品应用于固定的抗原或抗体。在用抗原或抗体包被平板时，一般会将平板的孔与抗原或抗体的溶液温育(过夜或者指定的小时时间段)。继而可以洗涤平板的孔，以去除非完全吸附的材料。所述孔的任何剩余可用表面可以继而用非特异性蛋白(其对于测试抗血清而言在抗原地为中性)“包被”。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白以及奶粉溶液。该包被使得将固定表面上的非特异性吸附位点封闭，并因而减少了由抗血清非特异性结合至表面上而引起的背景。

在ELISA中，也可以使用二级甚至是三级的检测措施而不是直接的程序。因而，在蛋白或抗体结合至少是孔之后，用非反应性的材料包被来减少背景，以及洗涤来去除未结合的材料，在使免疫复合物(抗原/抗体)有效形成的条件下将固定表面与待测对照临床或生物学样品进行接触。免疫复合物的检测随后需要经标记的二级结合剂或者缀合了经标记的三级结合物质的二级结合物质。

使免疫复合物(抗原/抗体)有效形成的条件是指这样的条件，其包括，例如，用诸如BSA、牛γ-球蛋白 (BGG)和磷酸盐缓冲盐水 (PBS)/Tween来稀释抗原和抗体，以便减少非特异性结合以及促进合理的信噪比。

有效或适合的条件一般还包括在足以使得可以有效结合的温度和时间段来进行温育。温育步骤可通常为大约1分钟至12小时，温度为大约20º至30º C，或者可以在大约0ºC至大约10ºC温育过夜。

在ELISA中所有的温育步骤之后，可以洗涤接触表面，以便去除未复合的材料。洗涤程序可包括用诸如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液的溶液来进行的洗涤。在测试样品与最初结合的材料形成特异性的免疫复合物，并随后洗涤之后，可以确定免疫复合物即使是分钟量的出现。

为了提供检测措施，二级二级或三级抗体可以具有相关标记以允许检测，如上文所述。这可以是酶，所述酶在与适合的发色底物温育后能够产生颜色显影物。因而，例如，可以在有利于进一步免疫复合物显影的条件下，将初级和二级免疫复合物与经标记的抗体接触和温育一段时间(例如在室温下于含PBS的溶液如PBS-Tween中温育2小时)。

在与标记的抗体温育以及随后洗涤以去除未结合的材料之后，可以将标记的量进行定量，例如在过氧化物酶作为酶标记的情况下，通过与发色底物如尿素和溴甲酚紫或2,2’-叠氮-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸 [ABTS]和H₂O₂温育。继而可以通过测量颜色生成的程度来实现定量，例如使用可见光分光光度计。

蛋白阵列是固相配体结合测定系统，其使用在表面上固定的蛋白，所述表面包括玻璃、膜、微滴定孔、质谱平板以及珠或其它颗粒。该测定是高度并行的(多路的)并且常常是微型化的(微阵列、蛋白芯片)。它们的优势包括快速且可自动化、能够高度灵敏、试剂经济、并且在单一实验中给出丰富的数据。生物信息学支持是重要的；数据处理需要精密的软件和数据比较分析。然而，软件可以从用于DNA阵列的软件调整过来，许多硬件和检测系统也是如此。

一种主要的形式是捕获阵列，其中配体结合试剂(其通常为抗体但也可以是可选的蛋白支架、肽或核酸适体)可用于在混合物如血浆或组织提取物中检测靶标分子。在诊断学中，捕获阵列可用于并行实施多路免疫测定，都例如在个体血清中测试若干分析物以及同时测试许多血清样品。在蛋白质组学中，捕获阵列可用于定量和比较健康和疾病的不同样品中蛋白的水平，也即蛋白表达谱。蛋白之外的特异性配体结合剂可以以阵列的形式用于体外功能性相互作用筛选如蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-药物、受体-配体、酶-底物等。捕获试剂本身可以经过选择并针对多种蛋白进行筛选，这也可以在多路阵列形式中针对多个蛋白靶标来完成。

用于构建阵列的蛋白来源包括基于细胞的用于重组蛋白的表达系统、从天然来源纯化、通过无细胞翻译系统体外产生以及肽的合成方法。这些方法中的很多可以进行自动化以用于高通量生产。对于捕获阵列和蛋白功能分析，重要的是蛋白需要正确地折叠并发挥功能；这并不总是如此，例如在变性条件下从细菌提取重组蛋白。但是，变性蛋白的阵列可用于筛选交叉反应性的抗体、鉴别自身抗体和选择配体结合蛋白。

蛋白阵列已经被设计为熟悉的免疫测定方法如ELISA和斑点印迹的微型化，常用荧光读数，并且由机器人和高通量检测系统辅助，来使得多个测定并行实施。通常使用的物理支持物包括载玻片、硅、微孔、硝化纤维素或PVDF膜以及磁力和其他微珠。虽然递送至平面上的蛋白微滴是最熟悉的形式，但可选的结构包括在微流体的开发基础上的CD离心装置(Gyros，Monmouth Junction，NJ)和专门的芯片设计，如平板中经工程改造的微通道(例如The Living Chip™，Biotrove，Woburn，MA)和硅表面上的微小3D支柱(Zyomyx，HaywardCA)。悬液中的颗粒也可以用作阵列的基础，条件是它们经编码而用于鉴别；系统包括对微珠(Luminex，Austin，TX；Bio-Rad Laboratories)和半导体纳米晶体(例如QDots™，Quantum Dot，Hayward，CA)的颜色编码，以及对珠的(UltraPlex™，SmartBeadTechnologies Ltd，Babraham，Cambridge，UK)和多金属微棒(例如Nanobarcodes™particles，Nanoplex Technologies，Mountain View，CA)条形编码。也可以将珠组装至半导体芯片上的平整阵列中(LEAPS technology，BioArray Solutions，Warren，NJ)。

荧光标记和检测方法被广泛使用，并且可以用于所公开的方法。用于读取DNA微阵列的相同仪器设施也适用于蛋白阵列。为了区分展示，可以用来自两种不同的细胞状态的荧光标记的蛋白探测捕获(例如抗体)阵列，其中细胞裂解物直接与不同的荧光团(例如Cy-3、Cy-5)缀合并混合，使得颜色作用为靶标丰度变化的读数。可以通过酪胺信号放大(TSA)将荧光读数灵敏性放大10-100倍(PerkinElmer Lifesciences)。平面波导技术(Zeptosens)能够进行超灵敏荧光检测，具有无介入的洗涤程序的优势。高灵敏性也可以用悬浮珠和颗粒来实现，使用藻红蛋白作为标记(Luminex)，或者通过半导体纳米晶体的性质来实现(Quantum Dot)。已经开发出许多新的可选读数，特别是在商业生物技术领域。这些包括对以下的适应：表面等离子共振(HTS Biosystems，Intrinsic Bioprobes，Tempe，AZ)、滚环DNA扩增(Molecular Staging，New Haven CT)、质谱(Intrinsic Bioprobes；Ciphergen，Fremont，CA)、共振光散射(Genicon Sciences，San Diego，CA)和原子力显微法[BioForce Laboratories]。

捕获阵列形成了用于表达谱的诊断芯片和阵列的基础。它们利用高亲和性捕获试剂，如常规抗体、单一结构域、工程化的支架、肽或核酸适体，来以高通量的方式结合并检测特异性的靶标配体。

抗体阵列具有所需的特异性的性质以及可接受的背景，并且有些也是商业可获得的(BD Biosciences, San Jose, CA; Clontech, Mountain View, CA; BioRad; Sigma,St. Louis, MO)。用于捕获阵列的抗体是通过常规的免疫来制备(多克隆血清和杂交瘤)，或作为重组片段制备，通常在大肠杆菌（E. Coli）中表达(在从噬菌体或核糖体展示文库中选择之后) (Cambridge Antibody Technology, Cambridge, UK; BioInvent, Lund,Sweden; Affitech, Walnut Creek, CA; Biosite, San Diego, CA)。在常规抗体之外，Fab和scFv片段、来自骆驼的单一V-结构域或者工程改造的人类等价物(Domantis，Waltham，MA)也可用于阵列。

术语“支架”是指蛋白质的配体结合结构域，其经工程改造为能够结合多样的靶标分子的多个变体(具有抗体样性能的特异性和亲和性)。所述变体可以以遗传文库的形式来产生，并通过噬菌体、细菌或核糖体展示来针对单独的靶标进行选择。此类配体结合支架或框架包括基于金黄色葡萄球菌(Staph. aureus)蛋白A的‘亲和体(Affibodies)’(Affibody, Bromma, Sweden)、基于纤连蛋白的‘三活菌素(Trinectins)’ (Phylos,Lexington, MA)和基于脂质运载蛋白结构的‘Anticalins’ (Pieris Proteolab,Freising-Weihenstephan, Germany)。这些可以以类似于抗体的方式用于捕获阵列，并且可具有稳健性和易于生产的优势。

非蛋白捕获分子，尤其是以高特异性和亲和性结合蛋白配体的单链核酸适体，也可以用于阵列(SomaLogic, Boulder, CO)。适体通过 Selex™程序而选自寡核苷酸文库，并且其与蛋白的相互作用可以通过以下来增强：供价附着、通过掺入溴化脱氧尿苷和UV-激活的交联(光适体)。对配体的光交联由于特定空间要求而降低了适体交叉反应性。适体具有这样的优势：通过自动化的寡核苷酸合成而易于生产，和DNA的稳定性和稳健性；在光适体 阵列上，可以使用通用荧光蛋白染色对结合进行检测。

结合至抗体阵列的蛋白分析物可以直接或者经二级二级抗体在夹心测定中检测。直接标记用于比较具有不同颜色的不同样品。当有针对相同蛋白配体的抗体对可用时，夹心免疫测定可提供高特异性和灵敏性并且因此是对于低丰度蛋白如细胞因子所选择的方法；它们还提供了检测蛋白修饰的可能性。

无标记检测方法，包括质谱、表面等离子共振和原子力显微法，避免了配体的变更。任何方法所需要的是最佳的灵敏性和特异性，具有低背景以给出高信噪比。由于分析物浓度涵盖了广泛地范围，灵敏性必需经过适当的调适；样品的系列稀释或不同亲和性的抗体的使用是此问题的解决方案。目的蛋白经常是体液和提取物中低浓度的那些，需要在pg范围或者更低进行检测，如细胞因子或者细胞中的低表达产物。

捕获分子阵列的替代是通过‘分子印迹’技术制备的，其中肽(例如从蛋白的C-末端区域)被用作模板来在可聚合基质中生成结构上互补的、序列特异的腔室；所述腔室继而可以特异性的捕获(使之变性)具有适合的初级氨基酸序列的蛋白(ProteinPrint™，Aspira Biosystems，Burlingame，CA)。

还描述了用于确定嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的测定。优选发色测定。发色酶测定使用所要测定的酶的发色底物。此类发色底物经过切割或者通过酶反应来产生可检测的产物。所述可检测产物可以是带颜色的，可具有特异性的吸收或发射光谱，可以是荧光的、发光的，又或者产生可检测的电磁信号。NE/PR3活性测量的可用发色底物的实例有MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (从该底物切割p-硝基苯胺 (pNA)提高了405nm处的吸光度)。

本发明用于在受试者中诊断或辅助诊断自身免疫糖尿病的诊断的另一个方法方面包括从所述受试者获得样品(优选血液样品)，和确定样品中所含的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度。将确定的水平与参考水平进行比较。在优选的实施方案中，如果嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度高于参考水平，则存在自身免疫糖尿病。在另一个优选的实施方案中，使用连续测定测量血液样品中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性，其通过在反应过程期间监测颜色或荧光的生成，优选在反应过程期间监测合成肽底物(缀合至p-硝基苯胺)的颜色生成。血液样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白浓度使用免疫测定优选夹心免疫测定确定。这些方法的结果可用于与其它测试组合以在受试者中诊断自身免疫糖尿病。例如，可以测量血糖、糖化血红蛋白、C-肽的水平或者胰岛特异性自身抗体的而存在。所述数据与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性和/或蛋白浓度的确定组合，可用于评估发展出自身免疫糖尿病或者诊断出其存在的风险。

治疗以降低发展出自身免疫糖尿病的风险

在本发明的各方面，降低自身免疫糖尿病的风险或者预防其出现，可以通过设计用于治疗或预防1型糖尿病的任何策略和技术来实现。大多数策略涉及影响免疫系统以减少或者预防1型糖尿病的进一步发展。例如，可以避免胰岛自身免疫的环境诱发剂如牛奶或者麸质。乳糜泻病提供了可以通过此方式预防自身免疫疾病的令人鼓舞的实例。可选地，食物可以补充有营养物(其缺乏据推测会促进胰岛自身免疫)，例如n-3脂肪酸或维生素D。使用胰岛自身抗原(例如完整胰岛素)进行的抗原特异性的“疫苗接种”，改变了胰岛素或胰岛素原肽，GAD₆₅，或者热休克蛋白60 (HSP60)肽。(Ludvigsson等人, New Engl J Med 359:1909-1920 (2008)。目的是通过调节性T-细胞(其下调对特异性自身抗原的免疫性以及促进对另外的自身抗原的耐受)的诱导而诱导自身抗原特异性的耐受。也可以非抗原特异性的全身疗法，其范围从口服烟酰胺或者卡介苗(BCG)疫苗接种的温和调节到免疫阻抑和细胞疗法。另一个可使用的策略是刺激β-细胞再生连同对凋亡(在胰岛自身免疫中有提高)的阻抑，以克服糖尿病前期的复发-缓和进程。代谢的改变，如体重减轻和保持、提高的物理活性和β-细胞休息(rest)是其它的实例。

其它的实例包括拮抗B-细胞激活因子(BAFF) (Marino等人 Diabetes 61(11):2893-2905 (2012))，促进糖尿病抗性MHC-II类分子的表达 (Tian等人, J. Clin.Invest. 114(7):969-978 (2004))，CD3激活(Herold等人, Diabetes. 62(11):3766-3774(2013)；Herold等人, New Engl J Med 346(22):1692-1698 (2002) (OKT3抗体))，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)疗法(Gitelman等人, The Lancet Diabetes & Endocrinology 1(4):306-316 (2013)；Eisenbarth等人, Diabetes Res 2:271-276 (1985))，Treg疗法(Du等人, PLoS One 8(2):e56209 (2013))，CTLA-4抑制，肿瘤坏死因子-α (Mastrandrea等人,Diabetes Care 32:1244-1249 (2009))，IL-1受体拮抗剂，聚乙二醇化的粒细胞集落刺激因子，人重组干扰素-α (Rother等人, Diabetes Care 32:1250-1255 (2009))，自体肝细胞移植 (Haller等人, Diabetes 58(Supp. 1):A7 (2009) (Abstract)；Voltarelli等人,Ann N Y Acad Sci 1150:220-229 (2008)；Voltarelli等人, JAMA 297:1568-1576(2007)；Couri等人, JAMA 301:1573-1579 (2009))。因为嗜中性粒细胞在对β-细胞的攻击中发挥作用，因而可以使用嗜中性粒细胞耗竭和/或抑制。可以通过使用Ly6G-特异性抗体来耗竭嗜中性粒细胞。Daley等人, J. Leukocyte Biol. 83:64-69 (2008)。可以通过阻断或拮抗Ly6G来降低嗜中性粒细胞活性。Wang等人, Blood 120(7):1489-1498 (2012)。

用于降低自身免疫糖尿病风险或预防其发作的这些和其它技术在以下中有描述：美国专利申请公开号2014/0045923、2013/0345257、2013/0338039、2013/0280208、2013/0164302、2013/0109107、2012/0225131、2012/0003240、2012/0003239、2012/0003238、2011/0236370、2011/0200610、2011/0124609、 2011/0111023、2010/0166669、2010/0143374、2010/0047273、2010/0028450、2009/0305340、2009/0252753、2009/0226440、2009/0092637、2008/0248055、2008/0187522、2006/0240032、2006/0115899和2005/0271641。

由本发明的方面提供的，用于预防或降低自身免疫糖尿病风险的另外的方法，包括使用NE和/或PR3的化学或肽抑制剂，用于阻断酶活性 (Groutas等人, Expert Opinionon Therapeutic Patents 21(3):339-354 (2011)；Crocetti等人, J. Med. Chem. 56(15):6259-6272 (2013))，或者使用任何能够阻断嗜中性粒细胞激活的化合物。实例包括α1-蛋白酶抑制剂、3,4-二氯异香豆素、大豆胰蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、N-(甲基琥珀酰基)-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮、西维来司他、SSR 69071、AZD9668、ONO-6818、抑弹性蛋白酶蛋白、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)、针对NE的抗体和针对 PR3的抗体。

基于鉴别的行动

本发明方法的实施方案包括基于测量、检测、比较、分析、测定、筛选等，而对于受试者、疾病、状况、状态等进行确定、鉴别、指示、关联、诊断、预后等(其可以统称为“鉴别”)。例如，受试者可以被鉴别为有 发展出自身免疫糖尿病的风险。此类鉴别由于许多原因而有用。例如，且特别是，此类鉴别使得可以基于所进行的具体的鉴别(或与之相关)，而采取特定的行动。例如，在具体受试者中对于具体疾病或状况的诊断(以及其它受试者中缺乏对于该疾病和状况的诊断)，具有非常有用的作用，基于诊断鉴别出将会受益于治疗、行动、行为等的受试者。例如，在经鉴别的受试者中对于具体疾病或状况的治疗与未经此种鉴别(或未留意此鉴别)的所有受试者的治疗有显著不同。需要所述治疗(或者会受益于所述治疗)的受试者，将会接受该治疗，而不需要所述治疗(或不会收益于所述治疗)的受试者，将不会接受该治疗。

因此，所提供的方法的实施方案包括在所公开的鉴别之后(并在其基础上)，而采取特定的行动。例如，所提供的是包括创建鉴别记录的方法(例如以物理的形式—如纸面的、电子的或其它形式)。因而，例如，基于所提供方法而创建鉴别的记录，与仅仅进行测量、检测、比较、分析、测定、筛选等有着物理上的、有形的差别。此种记录特别重要且有意义是在于，其允许将鉴别固定为有形的形式，其例如可以与他人进行沟通(如基于该鉴别而可能对所述受试者进行治疗、监测、随访、建议等等的那些人)；保留用于日后使用或参阅；用作数据来评估成组的受试者、治疗效力、基于不同测量的鉴别的准确性、检测、比较、分析、测定、筛选等。例如，鉴别记录的此类用途，可以例如由与制定该鉴别记录的个体或实体相同的个体或实体来进行、由与之不同的个体或实体来进行或者由与之相同的个体或实体和与之不同的个体或实体的组合来进行。创建记录的方法可以与提供的任何一个或多个其它方法进行组合，并且特别是与鉴别方法的任何一个或多个步骤组合。

作为另一实例，本发明的方法包括基于一个或多个其它的鉴别而进行一个或多个额外的鉴别。例如，可以基于其它鉴别来鉴别具体的治疗、监测、随访、建议等。例如，将受试者鉴别为患有疾病或者状况(具有高水平的具体组分或特征)，可以进一步将该受试者鉴别为可以或者应当使用基于或针对所述高水平的组分或特征的疗法进行的治疗。可以创建此种进一步鉴别的记录(例如如上文所述)，并且可以以任何适合的方式使用。此类进一步的额鉴别可以直接基于，例如其它的鉴别、此类其它鉴别的记录或者组合。此类进一步鉴别，可以例如由与制定所述另外的鉴别的个体或实体相同的个体或实体来进行、由与之不同的个体或实体来进行或者由与之相同的个体或实体和与之不同的个体或实体的组合来进行。进行进一步鉴别的方法可以与本文所公开的任何一个或多个其它方法进行组合，并且特别是与鉴别方法的任何一个或多个步骤组合。

作为另一实例，提供了用于治疗、监测、随访、建议等本发明所提供的任何方法中鉴别的受试者的方法，。还提供了包括治疗、监测、随访、建议等已经从任何提供的方法中制定了鉴别记录的受试者的方法。例如，可以基于鉴别和/或基于鉴别的记录，来使用具体的治疗、监测、随访、建议等。例如，可以用基于或针对于所述高水平组分或特征的疗法治疗经鉴别患有疾病或状况(具有高水平的具体组分和特征)的受试者(和/或已经对此种鉴别进行了记录的受试者)。此类治疗、监测、随访、建议等可以直接基于例如鉴别、此类鉴别的记录或者组合。此类治疗、监测、随访、建议等，可以例如由与制定所述鉴别和/或鉴别记录的个体或实体相同的个体或实体来进行、由与之不同的个体或实体来进行或者由与之相同的个体或实体和与之不同的个体或实体的组合来进行。治疗、监测、随访、建议等的方法可以与本文提供的任何一个或多个其它方法进行组合，并且特别地与鉴别方法的任何一个或多个步骤组合。

所述测量、检测、比较、分析、测定、筛选等可以用于与本文所提供的那些不同的方式或者不同的目的。例如，对于患有糖尿病的受试者鉴别出其不具有高水平的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3，可用于通过排除该受试者可发展出成人隐匿性自身免疫性糖尿病的可能性，从而确信地治疗该受试者的 2型糖尿病。因而，所提供的测量、检测、比较、分析、测定、筛选等，并未涵盖此类测量、检测、比较、分析、测定、筛选等的所有用途。

术语“命中(hit)”是指测试化合物在测定中显示出期望的性质。术语“测试化合物”是指要作为假定的调节剂通过一个或多种筛选方法进行测试的化学品。测试化学品可以是任何化学品，如无机化学品、有机化学品、蛋白、肽、碳水化合物、脂质或其组合。通常，使用各种预先确定的浓度的测试化学品进行筛选，如0.01 微摩尔、1 微摩尔和10 微摩尔。测试化合物对照可包括在不存在所述测试化合物时测量信号，或者与已知调节靶标的化合物进行比较。

术语“高”、“较高”、“增加”、“升高”或“增高”是指在基础水平之上提高，例如与对照比较。术语“低”、“较低”、“降低”或“下降”是指在基础水平指向减少，例如与对照比较。

如本文所用的术语“调节” 是指与适当对照相比化合物以某些可测量的的方式改变活性的能力。作为测定中存在化合物的结果，活性可以在不存在这些化合物下，相较于对照增加或者降低。优选地，与不存在所述化合物的活性水平相比，活性增加至少25%、更优选至少50%、最优选至少100%。类似地，与不存在所述化合物的活性水平相比，活性优选降低至少25%、更优选至少50%、最优选至少100%。增加已知活性的化合物是“激动剂”。降低或者防止已知活性的化合物是“拮抗剂”。

如本文所用术语“抑制”意指减少或降低活性或者表达。这可以是对活性或表达的完全抑制，或者部分抑制。抑制可以与对照或者与标准水平进行比较。抑制可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64,65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。

如本文所用术语“监测”是指可以测量活性的本领域的任何方法。

如本文所用术语“提供”是指向本领域抑制的某事物添加化合物或分子。提供的实例可以包括例如，使用移液管、移液器(pipettemen)、注射器、针、管、枪等。这可以是手动的或自动的。其可以包括通过任何措施的转染或者向皿、细胞、组织、无细胞系统提供核酸的任何其它措施并且可以是体外的或体内的。

如本文所用术语“预防”是指在疾病或状况的临床症状发作之前施用化合物，以便防止与所述疾病或状况相关的偏差的物理表现。

如本文所用术语“需要治疗”是指由护理者(例如对于人类的情况医师、护士、护理师或个体；对于动物的情况兽医，包括非人哺乳动物)进行的判断，其中受试者需要治疗或者会从中受益。此判断是基于许多种因素(在护理提供者的专业领域之内)而做出的，但是其中包括知晓所述受试者患病或将会患病(作为可用本发明化合物治疗的状况的结果)。

对于"治疗"，是指意图治愈、缓解、稳定或防止疾病、病理状况或病症对受试者进行的医学管理。此术语包括积极治疗，即特别针对疾病、病理状况或病症的改善的治疗，以及也包括病因疗法，即目的在于去除与疾病、病理状况或病症相关的起因的疗法。此外，此术语包括姑息疗法，即设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症；预防性治疗，即目的在于使疾病、病理状况或病症的发展最小化或者部分地或完全地抑制其发展的治疗；和支持性治疗，即利用治疗来作为另一具体疗法的补充，目的在于改善相关的疾病、病理状况或病症。应理解当治疗是意图治愈、缓解、稳定或防止疾病、病理状况或病症时，并不必需要实际上导致治愈、缓解、稳定或防止。治疗的效果可以如本文所描述进行测量或评估(并且如本领域中所知适合用于所涉及的疾病、病理状况或病症)。此种测量和评估可以定性的和/或定量的术语来进行。因而，例如，疾病、病理状况或病症和/或疾病、病理状况或病症的症状的特征和特性可以降低到任何效果或者降低至任何量。

对于如本文所提供的化合物的术语“有效量”，是指该化合物提供期望的结果的非毒性但足够的量。如下文所指出的，所需的确切量在受试者与受试者之间会有变化，这取决于受试者的种类、年龄和整体状况，所治疗疾病的严重性，所使用的额特定化合物，其施用模式，等等。因而，不可能明确给出确切的“有效量”。然而，本领域技术人员可以仅施用常规的实验来确定适合的有效量。

对于术语“婴儿”，是指年幼的婴孩，年龄为出生至12个月。对于术语“儿童”是指还未到青春期的人。对于术语“青少年”是指在青春期开始与成年之间的人。 对于术语“成人”是指达到完全成熟的人(一般认为是年龄18岁)。

本文所述化合物的剂量或者量足够大，以在递送发生的方法中产生期望的效果。剂量不应当大到引起不良的副作用，如不期望的交叉反应、过敏反应等等。一般而言，剂量会随着年龄、状况、性别和受试者中疾病的程度而变化，并且可以由本领域技术人员来确定。剂量可由个体医师根据所涉及受试者的临床状况来进行调整。剂量、给药时间表和施用途径可以变化。

根据本文所述方法施用具体剂量的化合物或组合物的效力，可以通过已知的病历、体征、症状和客观实验室测试的具体方面进行评估来确定，其中已知所述病历、迹象、症状和客观实验室测试可用于评估需要针对自身免疫糖尿病或其他疾病和/或状况进行治疗的受试者的状态。这些迹象、症状以及客观实验室测试，会根据所治疗或预防的特定疾病或状况而变化，这将会是治疗这样的患者的临床医生或者在此领域内进行实验的研究者所知晓的。例如，如果基于与适合对照组的比较和/或基于该疾病在一般群体或特定个体中正常进展的知识：(1) 受试者的身体状况显示改善(例如肿瘤部分或完全消退)，(2) 疾病或状况的进展显示为稳定或减慢或逆转，或者(3) 对于治疗疾病或状况的其它药物的需求得以减少或避免，则具体的治疗方案被认为是有效的。

对于“药物可接受的”是指不是生物学地或者其它方面不期望的材料，即该材料可以与选定的化合物一起施用至受试者，而不会引起任何不期望的生物学效应或者不会以有害的方式与包含其的药物组合物中任何其它成分相互作用。

用于治疗受试者的化合物可以方便地配制为药物组合物，其由一个或多种化合物与药物可接受的载体结合构成。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，latestedition, by E.W. Martin Mack Pub. Co., Easton, PA，其公开了通常的载体以及制备药物组合物的常规方法，其可连同本文所述化合物制剂的制备来使用，并且其通过引用并入本文。这些是用于将组合物施用给人类或非人类的最通常的标准载体，其包括溶液如生理pH下的无菌水、盐水和缓冲溶液。其它化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序来施用。

无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员能够使用前文的描述，在完全的程度上利用本发明。以下的实施例是以解释说明的方式来提供的，而并不是要进行限制。虽然提供了具体的实施例，但是上文的描述是说明性的而不是限定性的。前文所述实施方案的任何一个或多个特征可以以任何方式与本发明中任何其它实施方案的一个或多个特征进行组合。另外，在看到本说明书之后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。

本申请中引用的所有出版物和专利文献通过引用并入相关部分以用于所有的目的，其程度就如同每个出版物或专利文献都是单独标注。在此文中通过引用各种参考文献，申请人并非承认任何具体的文献相对于本发明而言是"现有技术"。

实施例

本文所描述的方法、化合物和组合物在以下实施例中进行进一步的说明，其是以说明的方式提供的而并不是要进行限制。应理解所示组分比例的改变和要素的替换对于本领域技术人员是明显的，并且在本发明实施方案之内。理论方面的提供应理解为申请人不是要被现有理论所束缚。所有的部分或量，都是重量计，除非另有说明。

实施例1: 抗体的产生以及用于确定人和鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平的夹心 ELISA的开发

针对重组人和鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的多克隆抗体在New Zealand雌性兔中产生，如此前所述(Xu等人, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102:6086-6091 (2005))。使用蛋白A/G珠从经免疫的兔血清中纯化针对人和鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的抗体，随后使用其各自抗原作为配体的亲和层析。用来自Pierce的试剂盒将亲和纯化的针对人和鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的抗体生物素化，并用作检测抗体。未经标记的抗人和抗-鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3被用于在4ºC包被96-孔微滴定平板过夜。

人或鼠血清被稀释(1:100)至1 x 测定稀释液(1% BSA在 1 x PBS中)中，且将100µl的经稀释样品或重组标准品施用于每个孔，并在37ºC温育1小时。将平板洗涤三次并随后与100 µl的所述检测抗体在37ºC温育1小时。在使用1 x PBST (1 x PBS，含有0.5% Tween-20)再洗涤三次之后，将孔与链酶亲和素-缀合的辣根过氧化物酶一起温育20分钟，并随后与四甲基联苯胺试剂反应15分钟。将总共100 µl的2 M H₂SO₄添加至每个孔以停止反应。

对于人和鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶 ELISA以及人蛋白酶3 ELISA，检出限为0.156 ng/ml，由0标准(添加有其三个标准偏差)的20个重复的平均O.D值所确定。这些测定分别高度特异于人和鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3，与其它人和鼠蛋白没有可检测的交叉反应性。测定内和测定间的变异系数分别为3.9-4.5%和4.3-5.1%，这是通过在总共6个独立测定中以一式两份的测定测量5个血清样品来确定的。

实施例2: 用于测量人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性的基于发色团的测定的开发

使用了合成发色底物甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-p-硝基苯胺 (Km = 0.28mM，Kcat/Km = 33915 M^-1s^-1，对于人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶；Km = 1.2 mM，Kcat/Km =499 M^-1s^-1，对于人蛋白酶3)，如此前所述(Wiesner等人, FEBS Lett 579:5305-5312(2005))。将所述底物溶于N,N-二甲基甲酰胺以制备10 mmol/L原液(10x)，并用100 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0，含有500 mmol/L NaCl)稀释，当使用时作为底物工作溶液。将P-硝基苯胺标准品溶解于N,N-二甲基甲酰胺以制备100 mmol/L原液，并用100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，含有500 mmol/L NaCl)稀释，以制备0、100、200、300、400和500 µmol/L用于在使用时生成标准曲线。

将人血清(20 µl)与180 µl的底物工作溶液在37°C温育24 小时。将释放的p-硝基苯胺和稀释的p-硝基苯胺标准物经分光光度计在405 nm处进行了测量。嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性，在与底物温育之前和之后24小时根据 ΔOD值进行计算，并表示为mU/ml血清，其中一个单位定义为在 37°C水解底物每分钟产生1.0 µmol的p-硝基苯胺的嗜中性粒细胞和蛋白酶3的量。

实施例3:在患有1型糖尿病的受试者中的人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的循环蛋白水平和酶活性的评估

人类受试者 - 征集了149个患有1型糖尿病的受试者 (平均年龄，14.2 ± 4.8岁；中位年龄，14.0岁；年龄范围，4 – 29岁；61.7%女性)用于研究。T1D患者根据美国糖尿病协会标准诊断(美国糖尿病协会，2013)如下：空腹血糖 ≥ 7.0 mmol/L和/或HbA1C ≥ 6.5%，空腹C-肽水平< 200 pmol/L，酮症或酮酸中毒发作或者存在至少一种胰岛特异性自身抗体(GADA、IA2A或ZnT8A)。所有患者在进行胰岛素治疗。8人患有甲状腺自身免疫病症。T1D的病程为4.2 (1.7-7.1) [中位(四分位差)]。

包括了77位年龄和性别匹配的健康受试者的对照组(平均年龄，13.2 ± 5.4岁；中位年龄，15.0岁；年龄范围，2 – 21岁；44.2%女性)使用以下包含标准：(1) 空腹血糖低于5.6 mmol/L以及2-h血糖低于7.8 mmol/L；(2) 无糖尿病家族史、及其它自身免疫或慢性疾病。

临床和生物化学评估 - 在过夜禁食之后，在早上(大约0800 am) 收集静脉血样本，以用于分析各种生化参数。在Hitachi 7170分析仪(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)上对血糖进行了酶测量。通过自动化的液相层析 (Bio-Rad VARIANT IIHemoglobin Testing System，Hercules，CA，USA)对HbA1c进行测量。分别使用化学发光免疫测定在Bayer 180SE自动化的化学发光系统(BayerAG Leverkusen，Germany)上，以及疫比浊测定(Orion Diagnostica，Espoo，Finland)，对C-肽和C-反应蛋白的血清水平进行定量。GADA、IA2A和ZnT8A的效价通过之前描述过的测定进行确定(Xiao等人, The Journal of clinical endocrinology and metabolism 97:E54-58 (2012)；Yang等人, Diabetes/ metabolism research and reviews 26:579-584 (2010))。

通过对循环MPO-DNA复合物(得到确认的NET形成的标志物)的量进行定量，测量嗜中性粒细胞 NETosis的水平(Kessenbrock等人, Nat Med 15:623-625 (2009))。简言之，将5 μg/ml的小鼠抗-MPO单克隆抗体 (ABD Serotec，Germany)包被至96-孔微滴定平板在4°C过夜。在用1% BSA封闭后，将血清样品与过氧化物酶标记的抗-DNA单克隆抗体 (CellDeath Detection ELISA PLUS试剂盒的组分No. 2, Roche Diagnostics, USA)根据厂商说明组合添加至每个孔。在室温下在摇动装置(300 rpm)温育两小时后，添加样品和过氧化物酶底物。在405 nm使用μQuant酶标仪(BioTek，USA)测量吸光度。

统计学分析 - 所有分析都是使用社会科学统计软件包版本16.0 (SPSS,Chicago. IL)执行。使用Kolmogorov-Smirnov检验测试正态性。非正态分布的数据在分析之前进行了对数变换。通过χ ² 或未配对t检验评估了组之间的差异。使用单因素ANOVA和独立t-检验进行了组之间的比较。适当地用Pearson相关或部分相关分析相关性。数据适当地表示为平均值 ± SD或者中位数(四分位差)。在所有的统计学比较中，使用了 p 值 <0.05 来表示统计学显著差异。

结果 - T1D患者和其健康对照的临床特征在表1中描述。与健康受试者相比，T1D患者具有较高的空腹葡萄糖和HbA1c，但是具有较低的空腹C-肽水平。在两组之间没有发现C-反应蛋白的显著差异(表1)。与此前的报道一致(Harsunen等人, Hormone and metabolic research = Hormon- und Stoffwechselforschung = Hormones et metabolisme 45:467-470 (2013)；Valle等人, Diabetes 62:2072-2077 (2013))，循环嗜中性粒细胞在T1D患者中相较于健康对照有适度降低 [中位数(四分位差) (x 10⁶/ml)，3.26 (2.54-4.13) vs 3.63 (3.02-4.15)，p<0.05] (表1)。

对来自这些受试者的血清样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平和酶活性进行了测量，其如实施例1提供的使用内部开发的基于发色团的测定，，以及如实施例2提供的夹心 ELISA 试剂盒。与外周嗜中性粒细胞的轻微降低不同，结果显示NE和PR3的循环蛋白水平在T1D患者中相比健康对照有显著增加[NE: 1594.7 (988.4-2284.6) vs397.0 (262.2-468.8) ng/ml，p<0.001；PR3: 295.3 (206.0-430.4) vs 107.4 (92.5-165.0) ng/ml，p<0.001] (图1 (A和B))。T1D患者中的循环NE/PR3 酶活性也基本上比健康个体中高[0.69 (0.41-1.03) vs 0.14 (0.10-0.21) mU/ml，p<0.001] (图1(C))。NE/PR3酶活性和循环蛋白水平之间的相关系数为NE是0.915 (p<0.001)和PR3是0.874 (p<0.001)。在患者或对照中，男人和女人之间的NE和PR3的循环蛋白水平和酶活性没有差异。

表1. 本研究征集的健康对照和T1D患者的特征

数据适合地表示为均值 ± SD 或者中位数(四分位差)

*P < 0.05 与健康对照相比

^§分析前进行对数变换。

为了进一步分析循环NE和PR3在自身免疫糖尿病进展期间的变化，根据其病程将T1D患者分为三组，包括诊断一年内的患者(n=28)、病程>1年的患者且<5年的患者(n=59)和病程>5年的患者(n=62)。值得注意的的是，NE和PR3的蛋白水平和酶活性提高的幅度，在诊断一年内的T1D患者中与另外两组病程更长患者相比要显著更高(图2 (A-C))。另一方面，仅在诊断一年内的T1D患者中观察到循环嗜中性粒细胞的显著降低，而另外两组中的减退并未达到统计学的显著性(图2 (D))。

血浆NE和PR3的活性受到与其相关的内源抑制物的紧密控制，特别是A1AT，丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)超家族的原型成员。与提升的NE和PR3 水平不同，T1D患者中A1AT的循环浓度与健康受试者相比显著降低[1.61 (1.37-1.93) 相比 1.80 (1.57-2.07) mg/ml，p<0.01] (图1 (D))。进一步分析显示A1AT 水平在诊断一年内的患者中的减退要分别大于病程1-5年和 >5年的那些(图2 (E))。

为了探索造成显著提升的循环NE和PR3 水平的基础机制，通过对循环MPO-DNA复合物(得到确认的NET形成的标志物)的量进行定量，测量嗜中性粒细胞 NETosis的水平(Kessenbrock等人, 2009)。与提升的NE和PR3 水平一致，相较于健康个体在T1D患者中观测到循环MPO-DNA复合物的显著提升，特别是在病程少于一年的T1D患者中[0.197 (0.049-0.412) 相比 0.026 (0.011-0.058) (平均OD405)，p<0.001] (图3 (A))。另外，血清中MPO-DNA复合物的量与NE(r=0.554，p<0.001)和PR3 (r=0.575，p<0.001)的循环蛋白水平，以及与NE/PR3 酶活性(r=0.527，p<0.001)显著相关，(图3 (B-D))，表明T1D患者中增加的循环NE和PR3 蛋白水平至少部分归因于增强的嗜中性粒细胞 NETosis。

另外，在研究组中研究了T1D患者中循环嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶与三种与β-细胞自身免疫相关的自身抗体(包括GADA、IA2A和ZnT8A)之间的关系。在149位T1D患者中，54位 (36%)为自身抗体-阴性，61位(41%)、24位(16%)和10位 (7%) 分别具有一个、两个和三个自身抗体阳性。值得注意的是，NE和PR3蛋白的循环水平以及其酶活性随着这些患者中检测到的自身抗体的数目的增加而有进行性地增加(图4 (A-C))。即使是对于自身抗体-阴性的T1D患者，NE和PR3的循环蛋白水平和酶活性也要比健康对照高很多[蛋白水平: NE:1154.90 (770.8-1749.5) 相比 397.0 (262.2-468.8) ng/ml，p<0·0001；PR3: 237.4(154.3-307.1) 相比107.4 (92.5-165.0) ng/ml，p<0·0001；酶活性: 0.53 (0.37-0.79)相比0.14 (0.10-0.21) mU/ml，p<0.001] (图4 (A-C))。另外，在GADA阳性 T1D患者(n=73)中，检测到了GADA的效价与 NE (r=0.296，p=0.011)和PR3 (r=0.270，p=0.021)的循环蛋白水平以及NE/PR3的酶活性(r=0.275，p=0.019)之间有强关联(图4 (D-F))。同样的，T1D患者中的IA2A效价也与NE、PR3的蛋白水平以及其酶活性正相关(图5 (A-C))。相反，在本研究组中，没有观察到空腹血糖与NE (r=-0.103，p=0.211)或PR3 (r=-0.097，p=0.237)的循环蛋白水平或者NE/PR3 酶活性 (r=-0.078，p=0.342)有显著关联。综合考虑，这些数据表明提升的NE和PR3可与 β-细胞自身免疫之间有因果关联，但是T1D患者中的血糖状态却并非如此。

实施例4:在非肥胖糖尿病 (NOD)小鼠中对鼠蛋白酶3的循环蛋白水平的评估

动物研究 - 非肥胖糖尿病 (NOD)小鼠(The Jackson Laboratory)，一种得到确认的T1D动物模型，其易于自发发展自身免疫胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，其被用于嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3和T1D发展之间相互关系的动态的、一致的和慢性研究。NOD小鼠中T1D的发作特征在于非空腹血糖水平高于13.9 mmol/L。由于雌性 NOD小鼠展现出比雄性(20-30%)更高的T1D发生率(60%-80%)，本研究主要聚焦于雌性个体。从3周龄时起，每周监测雌性NOD小鼠(n=7)的体重、血糖测量和血清收集。将小鼠在22-24°C保持在12小时光-暗周期下，可随意获得水和标准饲料(PicoLab Rodent Diet 20，LabDiet)。所有动物实验程序都得到了香港大学Committee on the Use of Live Animals for Teaching andResearch的许可，并且根据Guide for the Care and Use of Laboratory Animals来进行。

结果 - 使用内部开发的如实施例2所示的夹心 ELISA 试剂盒测量循环小鼠蛋白酶3 蛋白水平。显示直到NOD小鼠16周龄之前没有观测到明显得高血糖症，而循环中蛋白酶3 的蛋白水平在很早期就开始增加(3-周：6.71 (5.70-7.19) ng/ml对比4-周: 14.309(7.28-25.75) ng/ml，p<0.05) 以及在大约6-周达到峰值(3-周: 6.71 (5.70，7.19) ng/ml对比6-周: 22.61 (15.15-31.174) ng/ml，p<0.001，(图6))，表明循环PR3可以用作用于T1D发展的灵敏的预测性生物标志物。

讨论

T1D的当前诊断严重依赖于检测针对若干β-细胞-特异性抗原的自身抗体。然而，在儿童中很少能在6月龄前检测到这些自身抗体(Ziegler等人, 1999)。另外，在T1D患者中单一自身抗体测量的诊断灵敏度低至59%-67% (Lebastchi和Herold，2012)。为了把握对于此疾病的治疗窗口，非常重要的是要鉴别用于影响胰岛的早期免疫学事件的检测的新的生物标志物。

已经发现在T1D患者中嗜中性粒细胞计数的适度降低，伴随有两种主要嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶 NE和PR3的蛋白水平和酶活性的显著提升。另外，T1D患者中的这些改变与嗜中性粒细胞 NETosis的增加紧密相关，如通过循环中MPO-DNA复合物的定量确定的。这些发现表明，T1D患者中嗜中性粒细胞计数的减少部分是由于增加的NETosis，其继而导致增加的NET形成以及NE和PR3释放至血流中。

在病程低于一年的患者中，循环NE/PR3 酶活性和NET形成的提升幅度基本上比病程超过一年的那些患者高。仅仅在病程低于一年的T1D患者中，观察到嗜中性粒细胞计数的显著降低。与我们的发现一致，此前在意大利的研究也发现，在具有发展出T1D最高风险的个体中，嗜中性粒细胞的减少是最大的(Valle等人, 2013)。在疾病发作之后，轻微嗜中性粒细胞减少症持续几年并在诊断后5年得以解决(由纵向分析确定)。在具有自发发展的自身免疫糖尿病的NOD小鼠中，早在出生后两周就检测到了胰岛中嗜中性粒细胞浸润和NET形成，比明显得糖尿病发作要早得多(Diana等人, Nat Med 19:65-73 (2013))。另外，在早期的嗜中性粒细胞耗竭防止了NOD小鼠中糖尿病的进一步发展(Diana等人, 2013)。综合考虑，这些数据支持嗜中性粒细胞 NETosis、NET形成和增加的嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶释放在T1D中β-细胞自身免疫发作中的成因作用。实际上，增加的嗜中性粒细胞 NETosis和NET形成已经与许多的自身免疫疾病有牵连，包括小血管脉管炎(SVV)、全身性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化 (Kessenbrock等人, 2009；Naegele等人, Journal of neuroimmunology 242:60-71 (2012)；Villanueva等人, Journal of immunology 187:538-552 (2011))。

另外，增加的NE和PR3与T1D患者中检测到的自身抗体的阳性数目和效价显著相关。即使在那些自身抗体阴性患者中，NE和PR3的循环酶活性依然要比健康对照高得多，表明血清NE和PR3可用作用于具有发展出T1D的高风险的那些个体的早期检测的灵敏的生物标志物。另一方面，我们发现在T1D患者中NE和PR3增加的血清水平与高血糖症的严重性之间没有显著关联 。实际上，虽然高血糖症随着T1D的进展而变得更加严重，但是NE和PR3的血清水平展现出相反的变化，表明增加的嗜中性粒细胞NETosis以及NE和PR3增加的释放并不是受损的血糖控制的结果，而与β-细胞自身免疫有关联。与此概念一致，在具有T1D的患者的非糖尿病一级亲属中，已经观察到降低的嗜中性粒细胞计数(Valle等人, 2013)。

除了其针对感染的宿主防御的典型作用之外，嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶是炎症和先天免疫的重要调节剂(Meyer-Hoffert，Front Biosci (Landmark Ed) 14:3409-3418(2009)；Meyer-Hoffert和Wiedow, 2011；Pham, Nat Rev Immunol 6:541-550 (2006)；Wiedow和Meyer-Hoffert, 2005)。NE和PR3二者都参与促炎性细胞因子如TNFα、IL-1β和IL-18的成熟和释放，并且还诱导Toll样受体的表达和激活(Coeshott等人, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96:6261-6266(1999)；Devaney等人, FEBS Lett 544:129-132 (2003)；Devaney等人, FEBS Lett 544:129-132 (2003)；Walsh等人, J Biol Chem 276:35494-35499 (2001))，其全都是胰岛炎和β-细胞破坏的重要调节物(Grieco等人, Semin Immunopathol 33:57-66 (2011)；Padgett等人, Annals of the New York Academy of Sciences 1281:16-35 (2013))。另外，NE和PR3在将嗜中性粒细胞募集至炎症位点中发挥了不可缺少的作用。值得注意的是，嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶近来在小鼠中已经与高脂肪饮食诱导的肥胖、炎症和脂肪组织中的巨噬细胞浸润产生了牵连(Talukdar等人, Nat Med 18:1407-1412 (2012))。仅单独注射重组PR3就足以在小鼠中诱导高血糖症(Bae等人, Endocr Res 37:35-45 (2012))。相比之下，用A1AT(主要的NE和PR3内源抑制物)治疗，在T1D的啮齿动物模型中，降低了胰岛中淋巴细胞的浸润，并防止了β-细胞损失和糖尿病(Lu等人, Human gene therapy 17:625-634 (2006)；Song等人, Gene therapy 11:181-186 (2004))。这些动物研究，与本临床发现相结合，表明提升的NE和PR3可以是自身免疫糖尿病发病机理的直接贡献者，通过在胰岛中起始和/或保持自身免疫炎症反应。

A1AT(从肝细胞分泌的最丰富的循环丝氨酸蛋白酶抑制剂)，通过供价结合至酶抑制嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶 (Janciauskiene等人, Respiratory medicine 105:1129-1139 (2011))。A1AT的缺陷已经与许多炎性状况如慢性阻塞性肺病产生了牵连(Stoller和Aboussouan，Lancet 365:2225-2236 (2005))。本研究观察到了T1D患者中循环A1AT适度但是却显著的降低，表明增加的循环NE和PR3活性可缘于这两种酶从嗜中性粒细胞NETosis的释放提高以及与其内源抑制剂A1AT生产的降低的组合。

综上，本文提供的数据已经提供了第一个证据，其支持增加的循环NE和PR3活性可缘于在T1D中这两种酶从嗜中性粒细胞NETosis的释放提高和它们的内源抑制物A1AT降低的产生的组合，并且提升的NE和PR3可以是自身免疫糖尿病发病机理的直接贡献者(其通过在胰岛中起始和/或使自身免疫炎症反应)。这些结果共同证明，NE和PR3是用于T1D预测和早期诊断以及用于区分诊断T1D 和其它类型糖尿病的潜在生物标志物。

应理解所公开的方法和组合物并不局限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文所用的术语仅仅是用于描述具体实施方案的目的，限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求来限定。

必需要注意的是，如本文所用以及在所附的权利要求中，单数形式的"一个/种"和"所述"包括了复数的提及，除非上下文另有明确的指示。因而，例如，提及"底物"包括了多种这样的底物；提到"所述底物"是指一种或多种底物及本领域技术人员已知的其等价物等等。

在遍及本说明书的说明和权利要求中，词语“包含”以及该词语的变体，意指“包括但不限于”，并且并意图排除，例如其它添加物、组分、整数或步骤。

“任选的”或“任选地”意指其所描述的事件、情况或材料可以出现或不出现或者可以存在或不存在，并且说明书中包括了所述事件、情况或材料出此案或存在的情形，也包括了所述事件、情况或材料不出现或不存在的情形。

范围在本文中可以表示为从"大约"一个特别的值，和/或至"大约"另一个特别的值。当表示此种范围时，也明确设想并认为是公开了从所述一个特定值和/或至另一个特定值的范围，除非上下文另有明确指示。类似地，当数值表示为大约时，通过在之前使用“大约”，应理解为特别的的值形成了另一个，明确设想的实施方案，其应理解为已公开，除非上下文另有明确指示。还应理解的是每个范围的终末点既相对于另一终末点而产生意义，且独立于另一终末点，除非上下文另有明确指示。最后，应理解明确公开的范围之内的所有的单独的值和值的子范围也明确地经过设想并且应理解为已经公开，除非上下文另有明确指示。无论在特定的情况中一些或者全部的这些实施方案是否已经明确公开，前述表述都适用。

除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语都具有所公开的方法和组合物所属领域技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述那些的方法和材料也可以用于实践或者测试本方法和组合物，但是特别有用的方法、装置和材料是如所述的。本文所引用的出版物以及它们所引用的材料明确地通过引用并入本文。本文任何内容都不应理解为承认本发明不能够作为在先发明而早于此类公开。并未承认任何参考文献构成现有技术。对于参考文献的讨论描述了其作者所声称的内容，而申请人保留对所引用文献的准确性和针对性进行质疑的权利。应当清楚地理解，虽然本文提到了许多出版物，但此类参考并不导致承认任何这些文献形成了一部分的本领域一般常识。

虽然对于材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可包括许多选择和替代，但是这不应理解为(并且也并非是承认)，此类选择和替代彼此等价，或者具体而言是显而易见的替代。因而，例如，不同的糖尿病预防治疗的列表并不表明所列出的糖尿病预防疗法彼此是显而易见的，这也并不是承认其等价性或显而易见性。

本领域技术人员使用不超过常规实验就会认识到或者能够确定，本文所述的方法和组合物具体实施方案的许多等同物。此类等同物意图由以下权利要求涵盖。

Claims (16)

1.用于确定受试者是否有发展出自身免疫糖尿病的风险的方法，包括：

从所述受试者获得样品;

在所述样品中测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平;

将嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平，与酶活性和/或蛋白水平各自的参考水平进行比较，其中所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3各自的参考水平得自不患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者；和

当样品中所含的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和/或蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的参考水平之上超过大约20%时，确定所述受试者有发展出自身免疫糖尿病的风险。

2.权利要求1的方法，其中所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病。

3.权利要求1的方法，其中所述样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的酶活性是通过基于发色团的测定来进行测量的。

4.权利要求1的方法，其中所述样品中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的蛋白水平是通过免疫测定来进行测量的。

5.权利要求1的方法，其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪、组织以及以及其组合。

6.权利要求1的方法，进一步包括对所述受试者发展出自身免疫糖尿病的风险进行沟通。

7.权利要求1的方法，其中所述自身免疫糖尿病是1型糖尿病。

8.权利要求1的方法，其中所述自身免疫糖尿病是成人隐匿性自身免疫性糖尿病。

9.权利要求1的方法，其中一个或多种胰岛特异性自身抗体GADA、IA2A或ZnT8A在所述受试者中是不可检测的。

10.权利要求1的方法，其中一个或多种胰岛特异性自身抗体GADA、IA2A或ZnT8A在所述受试者中是可检测的。

11.权利要求1的方法，其中所述受试者具有自身免疫糖尿病的一个或多个风险因素。

12.权利要求1的方法，其中所述受试者是儿童或者青少年。

13.权利要求1的方法，其中所述受试者是成人。

14.权利要求1的方法，其中所述受试者被诊断为有糖尿病。

15.用于确定显示出成人发作糖尿病迹象的受试者，具有发展出自身免疫糖尿病的风险的方法，包括：

从所述受试者获得样品;

在所述样品中测量嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平;

将嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平，与酶活性和/或蛋白水平各自的参考水平进行比较，其中所述各自的参考水平得自不患有自身免疫糖尿病的一个或多个参考受试者；和

当样品中所含的所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3中至少一种的酶活性和/或蛋白水平在所述各自的参考水平之上超过大约20%时，确定所述受试者有发展出自身免疫糖尿病的风险。

16.权利要求15的方法，其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、眼泪、组织以及以及其组合。