CN102159953A - 作为心脏疾病标志物的嗜苯胺蓝颗粒蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测和/或测定来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的分析方法，用于患有心脏疾病或病症的患者的风险分层和/或预后和/或治疗控制和/或监测。

Description

作为心脏疾病标志物的嗜苯胺蓝颗粒蛋白酶
本发明涉及用于检测和/或测定来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的分析方法，用于患有心脏疾病或病症的患者的风险分层和/或预后和/或治疗控制和/或监测。
动脉粥样硬化与血管壁的炎性变化有关(Libby等，Circulation 2005，111，3481-3488)，包括巨噬细胞和淋巴细胞浸润。在嗜中性粒细胞计数与急性冠脉综合征的未来风险之间存在关联(Friedman等，N.Engl.J.Med.1974；290，1275-8)。最近的证据证实了急性冠脉综合征中嗜中性粒细胞活性的升高(Naruko等，Circulation 2002，106，2894-900；Buffon等，N.Engl.J.Med.2002，347，5-12)。
髓过氧化物酶(MPO)是存在于嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中的一种酶，其可以通过金属蛋白酶的活化刺激斑块的去稳定作用(Fu等，J Biol Chem 2001，276，41279-87)。在冠状动脉疾病中MPO的血浆水平升高(Zhang等，JAMA 2001，286，2136-42)，并预测患者出现胸痛(Brennan等，N Engl J Med 2003，349，1595-604)和急性冠脉综合征(Baldus等，Circulation 2003，108，1440-5)的结果。蛋白酶3(PR3)与其他丝氨酸蛋白酶例如弹性蛋白酶和组织蛋白酶G一起，是嗜中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒的另一种主要组分(Pham等，Nat Rev Immunol 2006，6，541-50)。嗜中性粒细胞对强烈刺激做出响应释放出嗜苯胺蓝颗粒，而刺激较弱时释放出分泌颗粒(其也含有PR3(Witko-Sarsat等，Blood 1999，94，2487-96))。PR3也可以表达在内皮细胞上(Mayet等，Blood 1993，82，1221-9)。嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶可以降解细胞外基质；此外PR3具有其他有害效应，其可能与在韦格纳(Wegener’s)肉芽肿中脉管炎的发病中的作用相关。这些包括通过内皮细胞上的胱天蛋白酶(caspase)样活性诱导凋亡(Pendergraft等，Kidney Int.2004，Jan，65(1)，75-84)，从TNF-α的初生膜结合前体形式释放活化的TNF-α(Robache-Gallea等，J Biol Chem.1995，270，23688-92；Coeshott等，PNAS 1999，96，6261-6)，活化前炎性介导物白介素-1β(Coeshott等，PNAS 1999，96，6261-6)和白介素-18(Sugawara等，J Immunol.2001 Dec 1，167(11)，6568-75)，以及从血管紧张肽原产生血管紧张肽I和II(Ramaha等，Arch Biochem Biophys.2002，397，77-83)。
PR3通过与α-1-抗胰蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂A1)的不可逆结合而快速失活(Baslund等，J Immunol Methods 1994，175，215-25；Duranton等，Am J Respir Cell Mol Biol.2003，29，57-61)，其中丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的反应性中心环反应，产生共价结合的中间体，导致蛋白酶的扭曲和失活(Stratikos等，PNAS，1997，94，453-8)。因此，血浆中基本上不存在游离PR3，它主要作为PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1复合物存在(Baslund等，J Immunol Methods 1994，175，215-25)。
循环中PR3的来源可能部分来自于脱颗粒的活化的嗜中性粒细胞，其存在于嗜苯胺蓝颗粒和分泌颗粒两者中。已知在梗塞形成后，嗜中性粒细胞浸润心肌。可选地或此外，PR3可以从内皮细胞(Mayet等，Blood 1993，82，1221-9)或肺实质细胞(Brockmann等，Arthritis Res.2002，4，220-5)分泌。已经证实，正常肺中的肺细胞表达PR3(Brockmann等，Arthritis Res.2002，4，220-5)，尽管在韦格纳肉芽肿中表达被极大上调。活性PR3在血浆中被丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和α2-巨球蛋白快速失活(Pham等，Nat Rev Immunol 2006，6，541-50)。
在AMI后的情况中，通过释放活性形式的TNF-α、白介素-1β、白介素-18(Robache-Gallea等，J Biol Chem.1995，270，23688-92；Coeshott等，PNAS 1999，96，6261-6；Sugawara等，J Immunol.2001 Dec 1，167(11)，6568-75)和血管紧张肽(Ramaha等，Arch Biochem Biophys.2002，397，77-83)，已经显示出PR3对细胞的破坏性作用，例如其前凋亡活性(Pendergraft等，2004 Jan，65(1)，75-84)及其前炎性效应。这些细胞因子可能与尽管使用了肾素-血管紧张肽系统的抑制剂的疗法但仍然发生的AMI后心力衰竭的发生特别相关。这种丝氨酸蛋白酶在心力衰竭的发生中的牵连正在讨论之中。例如，初步证据显示，一种丝氨酸蛋白酶抑制剂elafin能够在心脏移植的实验模型中减少血管和心肌损伤(Cowan等，J Clin Invest.1996，97，2452-68)。
根据本发明，令人吃惊地发现来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物，可以在心脏疾病或病症中用作生物标志物。
因此，本发明涉及检测和/或测定作为心脏疾病中的标志物的来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平的分析方法。通过该分析方法测量的被分析物水平，可以独立于已建立的常规风险因子以及其他生物标志物进行评估。但是，这样的常规风险因子和/或其他生物标志物可以与本发明的分析法或方法或应用组合使用。标志物提供了互补的、独立的预测，并且这种高风险患者的鉴定可以改进他们的后续管理。
这种分析方法为预测不利后果例如死亡和心力衰竭提供信息，这些信息可以独立地或与已建立的常规风险因子例如肾功能和临床人口统计信息组合应用。
这种来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的测量，单独地或与已承认的预后标志物例如B型利尿钠肽或其前体(N-末端B型利尿钠肽原或NTproBNP)、氨基末端ANP原、肾上腺髓质素原或其片段、内皮素原或其片段、血管加压素原或其片段一起使用，提供了关于AMI后心力衰竭和死亡的预后信息。
本发明的一个实施方案是对患有心脏疾病或病症的患者进行风险分层和/或预后和/或治疗控制和/或监测的方法，所述方法包含：
a)提供来自所述患有心脏疾病或病症的患者的样品，
b)测定所述样品中来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平，
c)将所述来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平，归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
在本发明的方法的优选实施方案中，在步骤b)中测定选自弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、蛋白酶3(Pr3)的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平，并在步骤c)中将其归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
在本发明的更优选实施方案中，在步骤b)中测定蛋白酶3或蛋白酶3/丝氨酸蛋白酶抑制剂A1复合物的水平，并在步骤c)中将其归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
在本发明的方法中，更优选情况下，在步骤b)中测定蛋白酶3/丝氨酸蛋白酶抑制剂A1复合物的水平，并在步骤c)中将其归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，心脏疾病或病症选自急性冠脉综合征，包括不稳定心绞痛(UA)、非ST段升高心肌梗塞(NSTEMI)或ST段升高心肌梗塞(STEMI)。
在本发明中，心脏疾病或病症优选为急性冠脉综合征。更优选情况下，心脏疾病或病症是急性心肌梗塞。
在本发明的上下文中使用的诊断分析方法可以是在诊断学领域中应用的任何类型的分析方法，包括但不限于基于酶反应、发光，特别是荧光或放射化学试剂的分析方法。优选的检测方法包括床旁检查(point-of-care-test)、放射免疫分析法、化学发光和荧光免疫分析法、免疫印迹分析法、酶联免疫分析法(ELISA)、基于luminex珠子的阵列和蛋白质微阵列分析法。分析方法的类型还可以是基于微量滴定板的、基于芯片的、基于珠子的，其中生物标志物蛋白可以附着于表面上或在溶液中。分析法可以是均相或非均相分析法、夹心分析法、竞争和非竞争分析法(《免疫分析法手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol 2006 Feb；10(1)：4-10.PMID：16376134)。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，在步骤b)中使用诊断分析法测定所述样品中所述蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，通过使用两种捕获分子检测来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物，其中两种捕获分子可以顺序或同时添加到样品中。
本发明的方法的非限制性的实例在步骤b)中，还包含步骤b1)，将所述样品加入到包含一种或多种针对所述蛋白酶或所述内源抑制剂或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的第一捕获分子的分析中，以及b2)向所述分析中加入一种或多种针对所述蛋白酶或所述内源抑制剂或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的第二捕获分子，其中第一捕获分子和第二捕获分子可以不都针对抑制剂，其中步骤b1)和b2)可以顺序或同时进行。
在特别优选实施方案中，分析包含作为分散相存在于液体反应混合物中的两种捕获分子，在更优选为抗体，其中第一标记组分附着于第一捕获分子上，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光-淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分附着于第二捕获分子上，使得当两种捕获分子与所述蛋白酶或所述内源抑制剂或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物结合后，产生可测量的信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。
更优选情况下，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青素类型的染料的组合。最优选情况下，所述标记系统是在BRAHMS AG的Kryptor
Figure BPA00001331340600061
技术中应用的系统。
在本发明的方法的另一个更优选实施方案中，步骤c)包含：
c1)测量对应于结合的蛋白酶或结合的其与内源抑制剂的复合物的量的信号，
c2)将步骤c1)的所述信号强度与预先记录的数据进行比较，其中所述预先记录的数据将蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平与疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险相关联。
在本发明的方法的另一个更优选实施方案中，通过选自下列的方法将蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平与疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险相关联：根据整套预定样品中蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平的中值进行关联；根据整套预定样品中蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平的分位数(例如四分位数或百分位数)进行关联；或使用包含蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物的水平的数学模型、优选为Cox回归进行关联。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述样品是血浆样品、血清样品、血液样品或其级份、淋巴液样品、尿液样品或任何上面提到的样品的提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，所述信号由与所述第二捕获分子结合的标记物产生。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述信号由与第三捕获分子结合的标记物产生，其中所述第三捕获分子特异性针对所述第二捕获分子，并且其中所述第三捕获分子在步骤c1)之前添加到所述分析中。在本发明的方法中，第三捕获分子可以在第二捕获分子之后或与第二捕获分子同时添加。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，还附加地测定与患有心脏疾病或病症的患者的风险分层和/或预后和/或治疗控制和/或监测相关或有用的一种或多种其他标志物或临床参数的水平。
在本发明的方法的另一个更优选实施方案中，临床参数是选自下列的参数：年龄，性别，既往病史，特别是心肌梗塞、心绞痛、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、ST上升AMI，体重指数，遗传易感性/家族史，种族背景，影响所述倾向的习惯，例如吸烟、饮酒、饮食，或住院治疗后的参数，例如Killip分级高于1或住院后的溶血栓药物治疗。
在本发明的方法的另一个更优选实施方案中，其他标志物选自proBNP或其包括BNP和NT-proBNP的至少12个氨基酸的片段、proANP或其包括NT-proANP和MR-proANP的至少12个氨基酸的片段、肾上腺髓质素原或其包括肾上腺髓质素、PAMP和MR-proADM的至少12个氨基酸的片段、内皮素原或其包括内皮素-1、大内皮素-1、CT-proET-1和NT-proET-1的至少12个氨基酸的片段、血管加压素原或其包括血管加压素、和肽素和神经垂体素2的至少8个氨基酸的片段、髓过氧化物酶、肌钙蛋白、FABP、C反应蛋白、降钙素原、白介素-6、ST-2、GDF-15、缺血修饰性白蛋白，或其片段。
在本发明的方法的另一个更优选实施方案中，其他标志物是NT-proBNP或其至少12个氨基酸的片段。
本发明的另一个实施方案是使用包含至少一种针对来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶和/或其与内源抑制剂的复合物的捕获分子的试剂盒，检测和/或测定所述样品中所述来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶和/或其与内源抑制剂的复合物的水平，用于患有心脏疾病或病症的患者的风险分层和/或治疗控制和/或监测和/或预后。
优选情况下，本发明的试剂盒包含一种或多种针对来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或针对所述蛋白酶的内源抑制剂或针对所述蛋白酶与所述内源抑制剂的复合物的第一捕获分子，并包含一种或多种针对来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或针对所述蛋白酶的内源抑制剂或针对所述蛋白酶与所述内源抑制剂的复合物的第二捕获分子。
更优选情况下，所述第一捕获分子和所述第二捕获分子可以不都针对所述内源抑制剂。
更优选情况下，本发明的试剂盒包含分别针对选自弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、蛋白酶3(Pr3)的蛋白酶和针对所述蛋白酶的内源抑制剂第一和第二捕获分子。
更优选情况下，本发明的试剂盒包含分别针对蛋白酶3和丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的捕获分子。
更优选情况下，本发明的试剂盒包含针对蛋白酶3与丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的复合物的捕获分子。
在本发明的试剂盒的应用的另一个具体的优选实施方案中，确定疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
在本发明的方法或试剂盒的应用的具体优选实施方案中，所述不利后果是死亡或心力衰竭。
优选情况下，本发明的试剂盒的应用按照上面本发明方法的实施方案中所述进行。
在本发明的上下文中，捕获分子可以选自核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白、抗体、肽或糖蛋白。优选情况下，捕获分子是抗体，包括其对靶具有足够特异性的片段，并包括重组抗体以及所述抗体的化学和/或生物化学修饰的衍生物或其源自于变体链的具有至少12个氨基酸长度的片段。
在本发明的情况中，花青素类型的染料、也称为花青染料，可以是通用化学结构为R2N+＝CH(CH＝CH)n-NR2的也称为开链花青素的链花青素(streptocyanine)、通用化学结构为芳基＝N+＝CH(CH＝CH)n-NR2的半花青素(hemicyanine)或通用化学结构为芳基＝N+＝CH(CH＝CH)n-N＝芳基的闭链花青素，其中R独立地表示可以被一个或多个取代基取代的烷基，并且其中芳基独立地表示可以被一个或多个取代基取代的芳基或杂芳基。因为这样的花青染料是公知的，并且许多衍生物可以商购，因此本领域技术人员了解对于给定目的选择何种公知的染料。因此，在本说明书中将不给出这些染料的详细描述；更详细的描述，包括花青染料的实例，可以在http://en.wikipedia.org/wiki/Cyanine和Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant主编，John Wiley & Sons，1993，vol.7，782-809页中发现。在本发明中使用的花青染料的具体实例是Cy 3和Cy 5。
在本发明的上下文中，信号是位于用来检测响应的装置的灵敏度范围内的可检测响应的存在或不存在，其具体来说可归因于被分析物与捕获探针或探针之间的复合物的存在。所述信号可归因于在被分析物检测方法中常用的各种类型的效应，例如电磁辐射的吸收、发射或淬灭，其中电磁辐射可以是荧光、发光、可见光、UV和IR，或归因于放射活性、磁性或核或电子自旋。在本发明中，上面提到的被分析物是来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或其与内源抑制剂的复合物。
在本发明中，术语风险分层是指为个体经历某些不利事件的概率赋值。
在本发明中，术语预后是指预测对象(例如患者)的医学状况将如何发展。这可以包括为所述对象估计恢复的机会或不利后果的机会。
在本发明中，术语监测是指通过在各个不同时间点测量对象的医学状况的某个诊断标志物或多种标志物的水平，来观察所述对象的医学状况的状态或发展。
在本发明中，术语治疗控制是指通过在各个不同时间点、优选为治疗之前和之后测量对象的医学状况的某个诊断标志物或多种标志物的水平，将某种形式的治疗例如药物给药归因于所述对象医学状况的状态或发展。通过这种方式，可以确定所述治疗是否足以治疗所述医学状况，或者疗法是否需要做出调整，例如改变药物的剂量，或是否需要用另一种形式的治疗，例如另一种药物或另一种类型的治疗作用来代替。
附图说明
图1：显示了在通过PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1分层的患者中时间对不利事件(死亡或心力衰竭)的Kaplan-Meier分析。
图2：显示了在根据是否PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和NTproBNP两者都低于它们相应的中值、任一标志物高于中值或两种标志物都高于中值进行分层的患者中，时间对不利事件(死亡或心力衰竭)的Kaplan-Meier分析。
图3到7显示了患者数据的逻辑回归分析的结果：
图3a：第4天时NTproBNP和PR3作为死亡的预测因子
图3b：第4天时NTproBNP和PR3作为死亡和心力衰竭的预测因子
图4a：MRproANP与PR3预测死亡终点
图4b：MRproANP与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图5a：MRproADM与PR3预测死亡终点
图5b：MRproADM与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图6a：C-末端proET与PR3预测死亡终点
图6b：C-末端proET与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图7a：和肽素与PR3预测死亡终点
图7b：和肽素与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图8到12显示了患者数据的Cox比例风险分析的结果
图8a：第4天时NTproBNP和PR3作为死亡的预测因子
图8b：第4天时NTproBNP和PR3作为死亡和心力衰竭的预测因子
图9a：MRproANP与PR3预测死亡终点
图9b：MRproANP与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图10a：MRproADM与PR3预测死亡终点
图10b：MRproADM与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图11a：C-末端proET与PR3预测死亡终点
图11b：C-末端proET与PR3预测死亡和心力衰竭终点
图12a：和肽素与PR3预测死亡终点
图12b：和肽素与PR3预测死亡和心力衰竭终点
实施例
募集了900位患有急性心肌梗塞的连续患者。从患者获得了书面正式知情同意书，研究遵照《赫尔辛基宣言》(Declaration of Helsinki)并得到当地伦理委员会的批准。AMI被定义为出现三个标准判据中的至少两个，即适当的症状、梗塞的急性ECG变化(ST上升或下降，新的左束分支阻塞)以及肌钙蛋白T升高到超过我们人群的99百分位数。排除标准判据包括恶性肿瘤或最近的外科手术(在一个月内)。
表1：研究中患者的特征。值是平均值(SD)或数量(％)
  患者   患者
  数量(男性)   900(681)？   梗塞区域
  年龄(岁)   64.6±12.4   前部   369(41.0)
  既往病史   下部   373(41.4)
  心肌梗塞   165(18.3)   其他/未确定   158(17.6)
  心绞痛   195(21.7)   承认的Killip等级
  高血压   391(43.4)   I   457(50.7)
  糖尿病   192(21.3)   II   357(39.7)
  高胆固醇血症   221(24.6)   III   77(8.6)
  目前/以前吸烟者   560(62.2)   IV   9(1.0)
  ST-上升AMI   777(86.3)   峰值CK(IU/L)   1157±1263
  溶血栓药物   529(58.8)   肌酸酐(μmol/L)   103.9±35.4
血浆样品：
在胸痛发作后2-5天抽取血样用于测定血浆PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和NTproBNP。使用第4天的样品用于测量MR-proANP、MR-proADM、CT-proET-1与和肽素。在15分钟卧床休息后，将20mL血液收集到含有EDTA和抑蛋白酶肽的试管中。所有血浆储存在-80℃下直到进行分析，在单一批次中对临床详情不告知。
超声波心动描记术：
使用Sonos 5500仪器(Philips Medical Systems，Reigate，UK)对患者进行经胸廓超声波心动描记术。通过对每个LV段打分(1＝正常，2＝运动机能减退，3＝运动失能，4＝运动障碍(运动反常))并将总数除以打分的段数，得到基于美国超声波心动描记术学会方式的16-段左心室壁运动指数(LVWMI)。左心室射血分数(LVEF)使用手动描记圆盘法公式计算(Schiller等，J Am Soc Echocardiogr 1989，2，358-67)。LV收缩功能受损被定义为EF＜40％或LVWMI＞1.8。
NTproBNP分析：
使用以前发表的非竞争性免疫发光分析测量血浆NTproBNP分析(Omland等，Circulation 2002，106，2913-8)。将样品或NTproBNP标准品(10μL)在包被有针对NTproBNP的C-末端的小鼠单克隆IgG的ELISA板的孔中温育。使用生物素酰化的兔N-末端抗体、然后使用甲基吖啶酯(MAE)标记的链亲和素，在MLX微孔板照度计(Dynex Technologies Ltd.，Worthing，UK)上进行检测。检测下限是0.3pmoI/L。该高度特异性的分析没有显示出与心房利尿钠肽、BNP或C型利尿钠肽的交叉反应性。
PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1分析：
使用从以前发表的方法修改的非竞争性免疫发光分析法测量血浆的PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1(Baslund等，J Immunol Methods 1994，175，215-25)。将ELISA板的孔用200ng针对PR3的小鼠单克隆抗体(克隆1B10、IgG2a，HyTest Ltd.，Turku，Finland)进行包被。通过将PR3与20倍摩尔过量的丝氨酸蛋白酶抑制剂A1温育(二者都来自Sigma Aldrich Co.Ltd.，Gillingham，UK)产生标准品。将样品或标准品(10μL)与分析缓冲液(100μL)在包被的孔中在4℃下温育24小时。在清洗后，将特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂A1兔抗体(Dako UK Ltd.，Ely，UK)分加到孔中(20ng/100μL)，在室温下以250Hz振摇温育3小时。在清洗后，将1∶100000稀释的生物素酰化的山羊抗兔IgG抗体(Rockland Immunochemicals Inc.，Gilbertsville，PA，USA，之前预先吸附有人类、兔、小鼠血清蛋白)在孔中温育1小时，然后与MAE-标记的链亲和素继续温育1.5小时。按照描述，通过顺序注射H2O2的硝酸溶液、然后是含有十六烷基三甲基溴化铵的氢氧化钠来引发化学发光(Omland等，Circulation 2002，106，2913-8)。发现测定内和测定间变异系数小于10％。
比较性髓过氧化物酶(MPO)分析：
正如以前所述(Ng等，Am Heart J.2006，152，94-101)，髓过氧化物酶(MPO)分析基于两点非竞争性免疫发光分析，并使用了固定化有单克隆MPO抗体(100ng/100μL，Research Diagnostics Inc.，New Jersey，USA)和兔多克隆抗体(50ng/100μL，Merck BioSciences，Nottingham，UK)的ELISA板。将标准品和10μL血浆在板中温育过夜，然后清洗，并使用生物素酰化的山羊抗兔IgG抗体和链亲和素-MAE，按照对PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的分析所述进行检测。MPO分析的分析间和分析内变异系数＜10％，检测下限为0.3ng/ml。
MR-proANP分析：
MR-proANP的检测使用新的商业化夹心免疫分析法，以化学发光/包被管的格式(BRAHMS AG)按照描述(Morgenthaler等，Clin.Chem.2004 Jan，50(1)，234-6)进行。简单来说，将一式两份患者样品(5μl血浆在温育缓冲液中的1∶40稀释液)或标准品添加到抗体包被的管中(亲和纯化的针对proANP肽73-90的绵羊多克隆抗体)，并在室温下温育30分钟。在用1ml清洗缓冲液清洗5次后，加入200μl含有吖啶酯标记的抗proANP抗体(亲和纯化的针对proANP肽53-72的绵羊多克隆抗体)的示踪剂，然后在室温下温育30分钟。将管用1ml清洗缓冲液洗三次，并在LB952T照度计(Berthold，德国；每个样品1秒检测时间)中进行检测。化学发光分析的相对光单位表示成pmol/LMR-proANP，正如从包含在每次分析运行中的标准曲线(4-1800pmol/l)所计算的。分析的检测下限是4.3pmol/l，分析的功能灵敏度(测定间变异系数＜20％)是11pmol/L MR-proANP。
MR-proADM分析：
MR-proADM的检测使用新的商业化分析法，以化学发光/包被管的格式(BRAHMS AG)按照描述(Morgenthaler等，Clin Chem.2005 Oct，51(10)，1823-9)进行。简单来说，将管用纯化的针对代表pre-pro-ADM的83-94位氨基酸的肽产生的绵羊多克隆抗体进行包被。将纯化的针对代表pre-pro-ADM的68-86位氨基酸的肽产生的绵羊多克隆抗体用MACN-吖啶-NHS-酯(InVent GmbH，德国)标记，并用作示踪剂。使用代表pre-pro-ADM的45-92位氨基酸的肽在标准马血清中的稀释液作为标准品。通过将10μl样品/标准品与200μl示踪剂在包被的管中在室温下温育2小时，进行免疫分析。将管用1ml LIA清洗溶液(BRAHMS AG)清洗四次，结合的化学发光使用LB952T照度计(Berthold，德国)进行测量。
CT-proET-1分析：
CT-proET-1的检测使用新的商业化分析法，以化学发光/包被管的格式(BRAHMS AG)按照描述进行(Papassotiriou等，Clin.Chem.2006 Jun，52(6)，1144-51)。简单来说，将管用纯化的针对代表pre-proET-1的168-181位氨基酸的肽产生的绵羊多克隆抗体进行包被。将纯化的针对代表pre-proET-1的200-212位氨基酸的肽产生的绵羊多克隆抗体用MACN-吖啶-NHS-酯(In Vent GmbH，德国)标记，并用作示踪剂。使用代表pre-proET-1的169-212位氨基酸的肽在标准马血清中的稀释液作为标准品。通过将50μl样品/标准品与200μl示踪剂在包被的管中在室温下温育2小时，进行免疫分析。将管用1ml LIA清洗溶液(BRAHMS AG)清洗四次，结合的化学发光使用LB952T照度计(Berthold，德国)进行测量。
和肽素分析：
和肽素(C-末端血管加压素原)的测定以化学发光/包被管的格式按照描述进行(Morgenthaler等，Clin Chem.2006 Jan，52(1)，112-9)。简单来说，将管用纯化的针对代表前血管加压素原的132-147位的肽产生的绵羊多克隆抗体进行包被。将纯化的针对代表前血管加压素原的149-164位的肽产生的绵羊多克隆抗体用MACN-吖啶-N-羟基琥珀酰亚胺酯标记，并用作示踪剂。使用代表pre-pro-AVP的132-164位的肽在标准马血清中的稀释液作为标准品。通过将50μl样品/标准品与200μl示踪剂在包被的管中在室温下温育2小时，进行免疫分析。将管用1mlLUMItest清洗溶液(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德国)清洗四次，结合的化学发光使用LB952T照度计(Berthold，Bad Wildbach，德国)进行测量。
终点：
主要终点是所有原因的死亡和因心力衰竭而住院治疗的组合。次级终点包括进一步心肌梗塞的发生。因心力衰竭而住院被定义为医院承认心力衰竭是住院的主要原因。所有存活的患者进行了最少60天的随访。
统计分析：
统计分析在SPSS 14.0版(SPSS Inc，Chicago，Illinois)上进行。连续变量使用Mann Whitney U检验进行比较。当对两个以上的组进行比较时，使用带有用于多重比较的Bonferroni校正的ANOVA。关联性分析使用Spearman′s rho，并且使用二元逻辑回归和Cox比例风险分析开发模型，以便测试因子和变量的独立预测能力。通过对数变换将NTproBNP、MPO和PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的血浆水平归一化。因此，机会比率和风险比率是指这些标志物的水平的10倍的升高。使用Kaplan-Meier存活率分析评估NTproBNP和PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的二分值。产生受试者工作特性(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)以评估预测因子的准确性。低于0.05的p值被视为统计学显著。
患者特征：
患者群体的人口统计特征显示在表1中。随访的中值长度是347天，范围为0-764天。没有患者失去随访。在777位患者中指数AMI被分类为ST升高MI(STEMI)，其中529位(68.1％)接受了溶血栓治疗。在指数认可过程中，662位(69.1％)患者的超声波心动描记数据可用。在随访期间，900位患者中的92位(10.2％)死亡，66位(7.3％)因心力衰竭经历了再入院，143位(15.9％)患者经历了任一个终点，62位(6.9％)因AMI复发经历入院治疗。
血浆PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1、NTproBNP和MPO水平：
在患有AMI的患者中PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的血浆水平在29.3-4035.5ng/ml的范围内，中值为504.6ng/ml，与已建立的正常范围(中值[范围]350[110-580]ng/ml)相比升高。在死亡(666.2[226.8-4035.5]ng/ml，使用Bonferroni′s校正P＜0.001)或因心力衰竭重新入院(598[231.6-1803.9]ng/ml，P＜0.004)的患者中，与无事件存活者(486.9[29.3-3118.2]ng/ml)相比，PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1明显更高。相比之下，在因AMI复发而再入院的患者中PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的水平(482.5[168.9-1753.9]ng/ml)与无事件存活者近似。在男性和女性中、在具有或不具有高血压、心绞痛、AMI或心力衰竭既往病史的患者中，PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1水平近似，但是在患有糖尿病的患者中(547.0[76.9-4035.5]ng/ml)与无糖尿病患者(495.1[29.3-3118.2]ng/ml，P＜0.018)相比略微升高。
血浆PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1水平与血浆葡萄糖(rs＝0.08，p＜0.03)、肌酸酐的对数(rs＝0.13，p＜0.001)、Killip级别(rs＝0.10，p＜0.002)、NTproBNP(rs＝0.25，p＜0.001)和肌酸激酶(rs＝0.13，p＜0.001)适度相关，但是与年龄、梗塞位点、ST升高存在或不存在以及是否给药溶血栓药物没有关联性。
证实了以前工作的是，在死亡(5955.4[9.02-14057.2]pmol/L)或因心力衰竭重新入院(3106.6[2.4-12282.9]pmol/L)的患者中，与无事件存活者(806.8[0.3-28886]pmol/L；二者均为p＜0.001)相比血浆NTproBNP较高。在女性中(1951.7[22.9-15732]pmol/L)与男性(871.6[0.3-28886]pmol/ml；p＜0.001)相比，NTproBNP水平较高，并与年龄(rs＝0.46，p＜0.001)、血浆葡萄糖(rs＝0.15，p＜0.001)、肌酸酐的对数(rs＝0.27，p＜0.001)、Killip级别(rs＝0.29，p＜0.001)和肌酸激酶(rs＝0.13，p＜0.001)相关。
在死亡(36.7[6.44-132.1]ng/ml，使用Bonferroni′s校正P＜0.035)的患者中，与无事件存活者(24.6[0.3-405.2]ng/ml)相比，血浆MPO明显更高。相比之下，因心力衰竭(27.6[6.5-210.8]ng/ml)或AMI复发((23.9[5.3-189.9]ng/ml)重新入院的患者与无事件存活者具有近似的MPO值。在女性中(30.3[0.3-405.2]ng/ml)与男性(23.9[3.6-215.1]ng/ml；p＜0.001)相比，以及在患有糖尿病的患者中(30.4[5.1-238.7]ng/ml)与无糖尿病患者(24.0[0.3-405.2]ng/ml；p＜0.001)相比，MPO水平较高，并与年龄(rs＝0.12，p＜0.001)、血浆葡萄糖(rs＝0.10，p＜0.009)、肌酸酐的对数(rs＝0.11，p＜0.001)和Killip级别(rs＝0.11，p＜0.002)相关。
在血浆PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1与LV收缩功能受损之间存在适度关联性(rs＝0.16，p＝0.001)，这种受损表现在入院指标方面(由EF＜40％或超声波心动描记图上LVWMI＞1.8所定义)，其被证明与NTproBNP具有更强的关联性(rs＝0.35，p＝0.001)。血浆MPO与PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和NTproBNP弱相关(分别为rs＝0.11和0.12，p＝0.002)，但是与LV收缩功能无关联。
主要终点：PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和NTproBNP作为死亡和心力衰竭的预测因子
使用下列临床和人口统计变量开发二元逻辑模型用于预测死亡或心力衰竭：年龄，性别，AMI、高血压或糖尿病的既往病史，Killip级别＞1，溶血栓药物使用，肌酸酐的对数，NTproBNP，MPO和PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1。独立的预测因子报道在表2中，并包括NTproBNP和PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1作为显著预测因子变量。Nagelkerke r2是0.35，表明模型的良好拟合。
PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1对主要终点的预测价值的受试者工作特征曲线，得到的曲线下面积(AUC)为0.65(95％CI：0.60-0.70，p＜0.001)；对于NTproBNP来说AUC为0.78(95％CI：0.74-0.83，p＜0.001)。组合两个标记物的逻辑模型得到的AUC为0.84(95％CI：0.80-0.88，p＜0.001)，其超过单独的任一种肽(通过Hanley和McNeil的方法p＜0.003；Radiology 1983，148，839-43)。
Cox比例风险模拟证实了这些发现，鉴定到除了性别之外死亡或心力衰竭的相同的独立预测因子(表3)。在逻辑和Cox模型二者中，血浆MPO都不是死亡和心力衰竭的独立预测因子。
Kaplan-Meier存活率分析证实，在PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1低于中值(504.6ng/ml)的患者中，与PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1高于中值的患者相比具有明显更好的临床后果(对数秩28.15，p＜0.0001，图1)。无事件存活曲线在早期发散，并甚至在2年后继续发散。对于NTproBNP来说也是如此(对数秩64.72，p＜0.0001)。当通过血浆NTproBNP(中值1023pmol/L)对患者进行分层时，在NTproBNP水平高于中值(趋势线的对数秩为12.54，p＜0.0004)和NTproBNP水平低于中值(趋势线的对数秩为3.83，p＜0.05)的患者二者中，PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1为死亡和心力衰竭提供了附加的预测价值。两种标志物都高于它们相应中值的患者，与任一种标志物高于中值的患者相比具有较高的事件发生率，而后者与两种标志物都低于它们相应中值的患者相比，具有较高的事件发生率(对于所有比较来说p＜0.001，图2)。
次级终点：PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和NTproBNP作为心肌梗塞的预测因子
与无终点的存活者相比，在随访过程中因再一次AMI重新入院的患者具有近似的NTproBNP(中值[范围]1480.7[2.6-10645.9]对806.8[0.3-28886]pmol/L；p＝NS)、PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1水平(中值[范围]482.5[168.9-1753.9]对486.9[29.3-3118.2]ng/ml；p＝NS)和MPO水平(23.9[5.3-189.9]对24.6[0.3-405.2]ng/ml；P＝NS)。
附加标志物：
构建了用于预测死亡或组合终点死亡或心力衰竭的逻辑回归模型和Cox比例风险模型，以评估其他标志物(MR-proANP、CT-proET-1、MR-proADM、和肽素、NT-proBNP)是否为PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1复合物添加了预后信息(对第4天抽取的血液进行评估)。在所有分析中，所有被评估的标志物(MR-proANP、CT-proET-1、MR-proADM、和肽素、NT-proBNP)都为PR3-丝氨酸蛋白酶抑制剂A1添加了统计学显著的预后信息。
表2：用于预测死亡和心力衰竭的二元逻辑回归模型
Figure BPA00001331340600201
表3：死亡或心力衰竭的显著预测因子的多变量Cox比例风险回归模型

Claims (17)

1.一种对患有心脏疾病或病症的患者进行风险分层和/或预后和/或治疗控制和/或监测的方法，所述方法包含：
a)提供来自所述患有心脏疾病或病症的患者的样品，
b)测定所述样品中来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平，
c)将所述来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平，归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
2.权利要求1的方法，其中在步骤b)中测定选自弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、蛋白酶3(Pr3)的蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平，并在步骤c)中将其归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
3.权利要求1的方法，其中在步骤b)中测定蛋白酶3或蛋白酶3/丝氨酸蛋白酶抑制剂A1复合物的水平，并在步骤c)中将其归因于所述患者的疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
4.前述权利要求任一项的方法，其中心脏疾病或病症选自急性冠脉综合征，所述急性冠脉综合征包括不稳定心绞痛(UA)、非ST段升高心肌梗塞(NSTEMI)或ST段升高心肌梗塞(STEMI)。
5.前述权利要求任一项的方法，其中在步骤b)中使用诊断分析法测定所述样品中所述蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平。
6.前述权利要求任一项的方法，其中通过使用两种捕获分子检测来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物，其中两种捕获分子可以顺序或同时添加到样品中。
7.前述权利要求任一项的方法，其中步骤c)包含：
c1)测量对应于结合的蛋白酶或结合的蛋白酶与内源抑制剂的复合物的量的信号，
c2)将步骤c1)的所述信号强度与预先记录的数据进行比较，其中所述预先记录的数据将蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平与疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险相关联。
8.权利要求7的方法，其中通过选自下列的方法将蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平与疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险相关联：根据整套预定样品中蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平的中值进行关联；根据整套预定样品中蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平的分位数(例如四分位数或百分位数)进行关联；或使用包含蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平的数学模型、优选为Cox回归进行关联。
9.前述权利要求任一项的方法，其中所述样品是血浆样品、血清样品、血液样品或其级份、淋巴液样品、尿液样品或任何上面提到的样品的提取物。
10.前述权利要求任一项的方法，其中附加地测定与患有心脏疾病或病症的患者的风险分层和/或预后和/或治疗控制和/或监测相关或有用的一种或多种其他标志物或临床参数的水平。
11.权利要求10的方法，其中临床参数是选自下列的参数：年龄，性别，既往病史特别是心肌梗塞、心绞痛、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、ST上升AMI的病史，体重指数，遗传易感性/家族史，种族背景，影响所述倾向的习惯例如吸烟、饮酒、饮食，或住院治疗后的参数例如Killip分级＞1或住院后的溶血栓药物治疗。
12.权利要求10或11的方法，其中其他标志物选自proBNP或其包括BNP和NT-proBNP的至少12个氨基酸的片段、proANP或其包括NT-proANP和MR-proANP的至少12个氨基酸的片段、肾上腺髓质素原或其包括肾上腺髓质素、PAMP和MR-proADM的至少12个氨基酸的片段、内皮素原或其包括内皮素-1、大内皮素-1、CT-proET-1和NT-proET-1的至少12个氨基酸的片段、血管加压素原或其包括血管加压素、和肽素和神经垂体素2的至少8个氨基酸的片段、髓过氧化物酶、肌钙蛋白、FABP、C反应蛋白、降钙素原、白介素-6、ST-2、GDF-15、缺血修饰性白蛋白，或其片段。
13.权利要求12的方法，其中其他标志物是NT-proBNP或其至少12个氨基酸的片段。
14.试剂盒在患有心脏疾病或病症的患者的风险分层和/或治疗控制和/或监测和/或预后中的应用，所述试剂盒包含至少一种针对来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶和/或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的捕获分子，用于检测和/或测定所述样品中所述来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶和/或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物的水平。
15.权利要求14的试剂盒的应用，其中确定疾病或病症的预后或严重程度或不利后果的风险。
16.权利要求15的试剂盒的应用或权利要求1到11任一项的方法，其中所述不利后果是死亡或心力衰竭。
17.来自多形核嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒的蛋白酶或所述蛋白酶与内源抑制剂的复合物作为心脏疾病或病症的生物标志物的应用。
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