CN109470855A

CN109470855A - 肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒

Info

Publication number: CN109470855A
Application number: CN201710807813.5A
Authority: CN
Inventors: 林当; 胡海; 黄静; 赵晓龙; 周海鹰; 许勇; 黄璐; 潘敬东
Original assignee: Guangzhou Danlan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Danlan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2037-09-08
Also published as: CN109470855B

Abstract

本发明涉及一种肺癌早期诊断用的蛋白芯片及试剂盒。该蛋白芯片包括如下十种抗原片段：MAGE A3抗原片段、ANXA1抗原片段、CTAG1B抗原片段、CAGE1抗原片段、AP3D1抗原片段、CCT8抗原片段、CHK抗原片段、PRKACA抗原片段、EIF4G1抗原片段及MAGE A1抗原片段。该肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒创造性的选择出在肺癌早期发生过程中显著表达且能够引起免疫系统产生相关抗体的抗原，并筛选得到相应的抗原片段进行组合，利用蛋白芯片技术将抗原片段包被于固相支持物的表面，以检测人体血清中肿瘤相关的自身抗体，实现对肺癌的早期诊断，检测阳性率高，能大大提高早期肺癌诊断的敏感性和特异性。

Description

肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒

技术领域

本发明涉及癌症诊断和治疗领域，尤其是涉及一种肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高。目前对肺癌的诊断主要依靠影像学和细胞学，但早期肺癌无明显体征，目前的检测方法检测阳性率很低，往往只有10～15％的病人能够检测并诊断出。肺癌的早期诊断及治疗是提高患者生存率的关键，而目前的诊断方法检测出肺癌大多数已是中晚期，错过了最佳治疗时期。并且传统的ELISA检测血清抗体，速度慢、效率低，需要的血清样本量大，具体检测起来非常不便。

发明内容

基于此，有必要提供一种使用方便的能够用于肺癌早期诊断用的蛋白芯片及试剂盒。

一种肺癌早期诊断用蛋白芯片，包括固相支持物及包被于所述固相支持物表面的抗原；所述抗原包括如下十种抗原片段：MAGE A3抗原片段、ANXA1抗原片段、CTAG1B抗原片段、CAGE1抗原片段、AP3D1抗原片段、CCT8抗原片段、CHK抗原片段、PRKACA抗原片段、EIF4G1抗原片段及MAGE A1抗原片段。

在其中一个实施例中，所述MAGE A3抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的抗原特征氨基酸序列；

所述ANXA1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示的抗原特征氨基酸序列；

所述CTAG1B抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的抗原特征氨基酸序列；

所述CAGE1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示的抗原特征氨基酸序列；

所述AP3D1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的抗原特征氨基酸序列；

所述CCT8抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示的抗原特征氨基酸序列；

所述CHK抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示的抗原特征氨基酸序列；

所述PRKACA抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的抗原特征氨基酸序列；

所述EIF4G1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示的抗原特征氨基酸序列；

所述MAGE A1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.10所示的抗原特征氨基酸序列。

在其中一个实施例中，所述抗原片段为重组融合蛋白，还包括位于相应抗原特征氨基酸序列的N端的Myc-Histag以及C端的链霉亲和素。

在其中一个实施例中，所述固相支持物为玻片、免疫印迹膜、微孔板或磁性微珠。

在其中一个实施例中，所述固相支持物为磁性微珠，所述十种抗原片段分别包被于十种不同颜色的磁性微珠表面。

在其中一个实施例中，所述抗原片段为亲和素化的抗原片段，所述固相支持物的表面通过肽键连接生物素化的牛血清白蛋白，所述抗原片段与所述固相支持物之间通过亲和素与生物素化的牛血清白蛋白间接连接。

一种肺癌早期诊断用试剂盒，包括上述任一实施例所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片。

在其中一个实施例中，所述肺癌早期诊断用试剂盒还包括含有荧光物质标记的二抗试剂、标准品试剂和质控参比品试剂。

在其中一个实施例中，所述荧光物质标记的二抗试剂是抗人IgG Fc-PE抗体和抗人IgM Fc-PE抗体。

在其中一个实施例中，所述标准品试剂与所述质控参比品试剂均是Anti-Myc嵌合抗体。

上述肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒创造性的选择出在肺癌早期发生过程中显著表达且能够引起免疫系统产生相关抗体的抗原，并筛选得到相应的抗原片段进行组合，利用蛋白芯片技术将抗原片段包被于固相支持物的表面，以检测人体血清中肿瘤相关的自身抗体，实现对肺癌的早期诊断。通过十种抗原的抗原谱，检测血清中的自身抗体含量，来判断被检者是否患肺癌，比传统方法(如影像学和细胞学等)诊断肺癌，特别是早期肺癌，阳性率高，敏感性强，而且可以同时检测多个(大于100种)血清自身抗体含量，对样品需求少，能大大提高早期肺癌诊断的敏感性和特异性。

附图说明

图1为本发明一实施方式的肺癌早期诊断用蛋白芯片检测原理示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请结合图1，一实施方式的肺癌早期诊断用蛋白芯片，包括固相支持物及包被于固相支持物表面的抗原。在本实施方式中，所述抗原包括至少如下十种抗原片段：MAGE A3抗原片段、ANXA1抗原片段、CTAG1B抗原片段、CAGE1抗原片段、AP3D1抗原片段、CCT8抗原片段、CHK抗原片段、PRKACA抗原片段、EIF4G1抗原片段及MAGE A1抗原片段。其中，MAGE A3抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的抗原特征氨基酸序列；ANXA1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示的抗原特征氨基酸序列；CTAG1B抗原片段的氨基酸序列包括SEQID No.3所示的抗原特征氨基酸序列；CAGE1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示的抗原特征氨基酸序列；AP3D1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的抗原特征氨基酸序列；CCT8抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示的抗原特征氨基酸序列；CHK抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示的抗原特征氨基酸序列；PRKACA抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的抗原特征氨基酸序列；EIF4G1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示的抗原特征氨基酸序列；MAGE A1抗原片段的氨基酸序列包括SEQ IDNo.10所示的抗原特征氨基酸序列。

各抗原片段可以是含有相应抗原特征氨基酸序列的提纯的天然蛋白、或是重组表达的蛋白，或者重组表达的含有相应抗原特征氨基酸序列的重组融合蛋白，或者是直接合成的含相应抗原特征氨基酸序列的多肽等。优选的，在本实施方式中，抗原片段为含有相应抗原特征氨基酸序列的重组融合蛋白，包括在相应的氨基酸序列的N端连接的Myc-Histag片段和在C端连接的链霉亲和素(SA)片段，整个抗原片段的结构为Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA。整个抗原片段的DNA片段的密码子为细菌的密码子，以适合于在细菌中表达。其中，Myc的氨基酸序列为EQKLISEEDL，具体如SEQ ID No.11所示；Myc-Histag的DNA序列为GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGCATCACCATCACCATCAC，具体如SEQ ID No.12所示，其中，Histag的DNA序列为CATCACCATCACCATCAC。

本实施方式所述的各抗原片段可采用但不限于下述方法制备得到：

步骤一：合成肺癌特征抗原的DNA片段，并在5’端连接Myc和Histag对应的DNA片段，得到Myc-Histag-肺癌特征抗原的重组融合DNA片段；

步骤二：合成链霉亲和素对应的DNA片段，并将所述链霉亲和素对应的DNA片段连接在Myc-Histag-肺癌特征抗原的重组融合DNA片段的3’端，得到Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的目的重组融合DNA片段；

步骤三：将所述目的重组融合DNA片段克隆入重组表达载体中，转化细菌；

步骤四：挑取阳性转化克隆进行目的重组融合DNA片段的诱导表达；

步骤五：破碎菌体，离心收集含重组融合蛋白的包涵体沉淀，纯化后得到Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的重组融合蛋白。

在本实施方式中，所述将链霉亲和素对应的DNA片段连接在Myc-Histag-肺癌特征抗原的融合DNA片段的3’端是但不限于通过overlap PCR(overlap polymerase chainreaction)方法将相应的DNA片段连接。进一步，在overlap PCR连接DNA片段时，还可以在外侧的引物两端加上限制性内切酶的酶切位点，如两端分别加上Nde I和Xho I酶切位点。

在本实施方式中，重组表达载体可以是但不限于pET30b(+)。细菌可以是但不限于BL21大肠杆菌。

在本实施方式中，所述挑取阳性转化克隆进行重组融合DNA片段的诱导表达包括如下步骤：挑取阳性转化克隆，在LB培养基中培养至OD 600至0.6，加入终浓度为2mM的IPTG诱导表达，4小时后离心收集菌体。

在本实施方式中，所述破碎菌体，离心收集含重组融合蛋白的包涵体沉淀，纯化后得到Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的重组融合蛋白包括如下步骤：

超声波震荡破碎菌体，离心收集沉淀，沉淀为含有目的重组融合蛋白的包涵体；

使用浓度为8M的尿素溶解沉淀，在4℃下放置12小时以上，离心去除不溶物，与Ni亲和层析柱混合结合1小时；

结合后装柱，采用pH6.5的8M尿素洗涤层析柱20倍柱体积，然后采用pH5.9的8M尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集，最后采用pH4.5的8M尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集；

洗脱各组分分别上样进行SDS-PAGE分析，选择目的重组融合蛋白所在的组分进行复性；

将重组融合蛋白所在的组分合并后调整蛋白浓度至0.25mg/ml，对含2M尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时，再对含0.2M尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时，再对含0.02M尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时，再对不含尿素的缓冲液透析，4℃透析12小时；

采用PEG20000吸水浓缩的方法浓缩，离心去沉淀，获得目的重组融合蛋白。

进一步，在本实施方式中，还包括将得到的Myc-Histag-肺癌特征抗原的重组融合DNA片段克隆入pBluescript SK(+/-)原核克隆载体中以进行保存的步骤。

本实施方式的固相支持物可以为玻片、免疫印迹膜、微孔板或磁性微珠。当固相支持物为玻片、免疫印迹膜或微孔板时，抗原片段在固相支持物表面呈阵列分布，多种抗原片段可以是在同一固相支持物表面呈阵列分布或者分布于不同的固相支持物表面；当固相支持物为磁性微珠时，上述十种抗原片段分别包被于十种不同颜色的磁性微珠表面。抗原片段可采用吸附或共价交联等方式固定在固相支持物的表面。

在本实施方式中，抗原片段为亲和素化的抗原片段，如含链霉亲和素(streptavidin)标签的抗原片段；固相支持物表面通过肽键连接生物素化的牛血清白蛋白(biotin-BSA)，如在固相支持物的表面修饰有-COOH，通过氨基偶联试剂将biotin-BSA连接在固相支持物表面。抗原片段与固相支持物之间通过亲和素与生物素化的牛血清白蛋白间接连接。抗原片段与固相支持物之间间接连接，较之吸附等直接连接，可以提高蛋白芯片的检测灵敏度。

以磁性微珠为例，磁性微珠表面包被抗原片段的过程可以但不限于如下：

步骤一：在避光震荡条件下，在羧基化的磁性微珠表面通过氨基偶联试剂连接上生物素化的牛血清白蛋白，得到磁性微珠-BSA-Biotin；

步骤二：在避光震荡条件下，将磁性微珠-BSA-Biotin与Myc-Histag-肺癌特征抗原-SA的重组融合蛋白混合，混合后链霉亲和素与生物素连接，即得包被有肺癌特征抗原的液相蛋白芯片。

通过将肺癌特征抗原通过重组融合蛋白的形式，带上链霉亲和素、Myc和Histag标签、并在细菌中大量表达并纯化，极大的方便了相关抗原的生产以及后续与磁性微珠的偶联过程，便于液相蛋白芯片的制作，从而为肺癌的早期诊断提供了新的技术支持。

在羧基化的磁性微珠表面通过氨基偶联试剂连接上生物素化的牛血清白蛋白可使用但不限于下述方法：

1.1磁性微珠氨基试剂及仪器：旋涡振荡仪、旋转混合仪、超声清洗机、磁性分离器、Luminex磁性微珠氨基偶联试剂盒及BSA-biotin；

1.2磁性微珠氨基偶联步骤：

1)将偶联试剂盒从冰箱取出，放置20～30min以恢复室温；

2)重悬磁性微珠：如果使用1mL小瓶保存的磁性微珠，涡旋小瓶10s，超声10s；如果使用4mL小瓶保存的磁性微珠，15～30rpm旋转混合小瓶15min；

3)根据期望偶联的磁性微珠数量，吸取适量的磁性微珠体积(原始浓度12.5×10⁶个/mL)于偶联反应管，以5×10⁶个磁性微珠为例，吸取400μl磁性微珠用于后续偶联反应；

注：一个反应管最大反应量为12.5×10⁶个磁性微珠；

4)将反应管置于磁性分离器1～2min(或置于离心机，>8000g、1～2min)，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

5)往反应管中加入500μl Activation buffer，涡旋反应管10s，超声10s；

6)重复步骤5～6一次；

7)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

8)如果磁性微珠数量大于5×10⁶个，往反应管内加入400μl Activation buffer；如果磁性微珠数量小于等于5×10⁶个，加入480μl Activation buffer；

9)将反应管涡旋10s，超声10s；

10)将Sμlfo-NHS用最低转速涡旋10s；

11)如果磁性微珠数大于5×10⁶个，往反应管中加入50μl的Sμlfo-NHS；如果磁性微珠数小于等于5×10⁶个，往反应管加入10μl的Sμlfo-NHS；

12)用250μl Activation buffer溶解10mg EDC于一离心管，上下颠倒离心管数次，涡旋离心管10～12s以确保EDC完全溶解均匀；

注：EDC溶解后应尽快使用，一次性使用；

13)如果磁性微珠数大于5×10⁶个，往反应管中加入50μl的EDC；如果磁性微珠数小于等于5×10⁶个，往反应管加入10μl的EDC；

14)最低转速涡旋反应管10s，铝箔包住反应管避光，置于旋转混合仪，15～30rpm、20min；

15)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

16)往管内加入500μl Activation buffer，涡旋10s，超声10s；

17)重复15～16步骤两次；

18)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

19)加入待偶联的BSA-biotin：8ug/1×10*6个磁性微珠；计算反应总体积：如果磁性微珠数大于5×10⁶个，往反应管中加入Activation buffer至总体积为1000μl；如果磁性微珠数不大于5×10⁶个，往反应管加入Activation buffer至总体积为500μl；

20)最低转速涡旋反应管10s，铝箔包住反应管避光，置于旋转混合仪，15～30rpm、2h；

21)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

22)往管内加入500μl Wash buffer，涡旋10s，超声10s；

23)重复21～22步骤两次；

24)将反应管置于磁性分离器1～2min，保持反应管置于磁性分离器，用滴管小心移除上清；

25)往反应管中加入1mL Wash buffer，涡旋10s，超声10s，2～8℃避光保存待用。

本实施方式还提供了一种肺癌早期诊断用试剂盒，其包括上述肺癌早期诊断用蛋白芯片。

进一步，在本实施方式中，该肺癌早期诊断用试剂盒还包括含有荧光物质标记的二抗试剂。所述荧光物质标记的二抗试剂可以但不限于是抗人IgG Fc-PE抗体和抗人IgMFc-PE抗体。

更进一步，在本实施方式中，该肺癌早期诊断用试剂盒还包括标准品试剂和质控参比品试剂。标准品试剂与质控参比品试剂均可以但不限于是Anti-Myc嵌合抗体，其中，标准品为系列梯度浓度的抗体试剂以用于绘制标准曲线，质控参比品试剂为特定浓度的抗体试剂。

各种稳定液(如PBS)、稀释液(如PBS)、洗涤液(如PBS或者PBST)：在液体配制室和工作液配制室完成配制，在液体分装室除菌、分装，在包装、贴签室贴签，在试剂盒包装室包装入试剂盒的完整包装。其中，PBS及PBST的配方可采用但不限于如下：

Phosphate-buffered saline(PBS)：NaCl 137mM；KCl 2.7mM；Na₂HPO₄ 10mM；KH₂PO₄1.8mM；

Phosphate-buffered saline Tween 20(PBST)：NaCl 137mM；KCl 2.7mM；Na₂HPO₄10mM；KH₂PO₄ 1.8mM；0.1％(v/v)Tween 20。

以磁性微珠为例，在检测过程中，当磁性微珠包被完成后，加入被检血样品与磁性微珠混合孵育，使得被检血样品中的这十种抗原的相应抗体与磁性微珠表面的抗原结合，从而间接地吸附于磁性微珠表面。再经通常免疫学技术采用的各种洗涤剂洗去非特异吸附的杂蛋白，在磁性微珠表面留下相应的人抗体。最后，将磁性微珠分别与含有荧光物质标记的二抗(抗人IgG Fc-PE和抗人IgM Fc-PE)混合孵育，使得荧光物质标记的二抗与磁性微珠表面的抗体结合。可采用流式分选的方法探测与上述不同抗原反应的血清抗体，流式分选仪红色光源(如635nm光源)测量包被不同抗原的磁性微珠，绿色光源(如532nm光源)探测与抗原结合的血清抗体，结合抗原的血清抗体可通过二抗的荧光强度来定量。单个抗原结合的血清抗体是否为阳性，根据荧光定量的读数，血清抗体稀释倍数和标准品绘制的曲线加以判断。确定单个抗原是否为阳性后，联合分析10种抗原的11种自身抗体(CTT8对应结合两种血清抗体IgG和IgM)的结果，计算总的抗原阳性的个数，再与相应的判断标准进行比较，凡大于规定标准值者即可判断为肺癌患者。

上述肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒创造性的选择出在肺癌早期发生过程中显著表达且能够引起免疫系统产生相关抗体的抗原，并筛选得到相应的抗原片段进行组合，利用蛋白芯片技术将抗原片段包被于固相支持物的表面，以检测人体血清中肿瘤相关的自身抗体，实现对肺癌的早期诊断。通过十种抗原的抗原谱，检测血清中的自身抗体含量，来判断被检者是否患肺癌，比传统方法(影像学和细胞学)诊断肺癌，特别是早期肺癌，阳性率高，敏感性强，而且可以同时检测多个(大于100种)血清自身抗体含量，对样品需求少，能大大提高早期肺癌的诊断的敏感性和特异性。

以下为具体实施例部分。

实施例1含肺癌早期诊断的蛋白芯片的试剂盒的制备(液态蛋白芯片诊断试剂盒)

抗原蛋白芯片的制备(液态芯片)：购买Luminex公司商品化的磁性微珠，首先将biotin-BSA通过氨基偶联试剂偶联到磁性微珠-COOH上，采用上述制备的10种抗原的纯化重组蛋白(含有Streptavidin标签)，通过磁性微珠表面的biotin与抗原含的Streptavidin标签的结合，将10种抗原分别结合到不同颜色的磁性微珠表面。然后在磁性微珠表面加上一层含20％胎牛血清的PBS，室温保湿放置1小时后4℃放置过夜，以充分封闭磁性微珠上的非特异蛋白交联或结合位点，最后分装，置于4℃下保存。以上过程制备成功液态蛋白芯片。

各种稳定、稀释、洗涤液、用于绘制标准曲线的各标准品溶液、质控参比品、荧光物质标记的二抗等均直接配制、分装。其中，标准品溶液采用特定稀释液，配制指定系列梯度浓度的Anti-Myc嵌合抗体，分装；质控参比品采用特定稀释液，配制指定浓度的Anti-Myc嵌合抗体，分装；荧光物质标记的二抗采用特定稳定液，配制指定浓度的抗人IgG Fc-PE和抗人IgM Fc-PE抗体，分装。

实施例2采用实施例1的试剂盒诊断普查筛检肺癌疑似患者以及健康人群

采用实施例2所述的试剂盒，采用蛋白芯片加免疫荧光法检测肺癌患者200例、正常人对照200例、肺癌高危人群2000例、普通社区人群1000例。采用正常人对照200例划定肺癌诊断标准进行结果判断。结果如表1所示。

表1采用实施例1的试剂盒诊断普查筛检肺癌疑似患者以及健康人群

肺癌患者200例、正常人对照200例中，试剂盒检测出肺癌患者阳性的158例、正常人阳性的20例，因此该试剂盒诊断肺癌的敏感性为79.0％，特异性为90.0％，说明该试剂盒诊断肺癌的敏感性特异性均较高。

肺癌患者200例中，I期肺癌患者有50例，其中42例试剂盒检测结果为阳性，早期肺癌(I期)的敏感性为84.0％，说明该试剂盒早期诊断肺癌的敏感性特异性均较高。

肺癌高危人群2000例中282例被判断为肺癌，高危人群检测阳性率大约为14.1％。2000例高危人群经随访，其中46人在此后被临床确诊为肺癌，而这46人中28人试剂盒检测阳性，说明该试剂盒可以以较高的灵敏度将肺癌患者从被检人群中筛检出来，敏感性约60.87％，从而可以用于肺癌高危人群的筛查。

被检测的普通社区人群(健康人群)1000例中103例被判断为肺癌。1000例普通社区人群经随访，其中2人在此后被临床确诊为肺癌，而这2人中全部为试剂盒检测阳性，说明该试剂盒可以以较高的灵敏度将肺癌患者从健康人群中筛检出来，从而可以用于普通社区人群的筛查。

实施例3联合使用其他检测试剂盒，以提高肺癌早期诊断的特异性和敏感性。

申请号201610007369.4，名称为蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法的专利申请中的蛋白芯片及试剂盒通过检测6种肺癌相关的自身抗原对应的自身抗体(IgG和IgM)的相对含量，来判定被检人是否患有肺癌。这6种抗原分别是(1)P53抗原片段；(2)SOX2抗原片段；(3)COPB1抗原片段；(4)EFHD2抗原片段；(5)EIF4G3抗原片段；(6)PCNA抗原片段。该试剂盒诊断肺癌的敏感性较高，特别是对早期(I期)敏感性为82.0％，特异性为88.0％。

联合使用实施例1所述的试剂盒和上述6种肺癌抗原自身抗体检测试剂盒，采用蛋白芯片加免疫荧光法检测肺癌患者200例、正常人对照200例、用正常人对照200例划定肺癌诊断标准进行结果判断。结果如表2所示。

表2

肺癌患者200例、正常人对照200例中，联合使用两种试剂盒检测出肺癌患者阳性的186、正常人阳性的18，因此联合使用两种试剂盒诊断肺癌的敏感性为93.0％，特异性为91.0％，说明该试剂盒诊断肺癌的敏感性，特异性均较高。

肺癌患者200例中，I期肺癌患者有82例，其中76例联合使用试剂盒检测结果为阳性，早期肺癌(I期)的敏感性为92.6％，并未发生显著下降，说明该试剂盒早期诊断肺癌的敏感性特异性均较高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市丹蓝生物科技有限公司

<120> 肺癌早期诊断用蛋白芯片及试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu

1 5 10 15

Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val

35 40 45

Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser

50 55 60

Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp

65 70 75 80

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser

85 90 95

Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys

100 105 110

Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu

115 120 125

Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln

130 135 140

Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu

145 150 155 160

Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr

165 170 175

Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp

180 185 190

Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile

195 200 205

Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu

210 215 220

Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly

225 230 235 240

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Gln Ile Ala Pro Lys Arg Glu Arg Lys Thr Ile Arg Ile Arg Asp Pro

180 185 190

Asn Gln Gly Gly Lys Asp Ile Thr Glu Glu Ile Met Ser Gly Ala Arg

195 200 205

Thr Ala Ser Thr Pro Thr Pro Pro Gln Thr Gly Gly Gly Leu Glu Pro

210 215 220

Gln Ala Asn Gly Glu Thr Pro Gln Val Ala Val Ile Val Arg Pro Asp

225 230 235 240

Asp Arg Ser Gln Gly Ala Ile Ile Ala Asp Arg Pro Gly Leu Pro Gly

245 250 255

Pro Glu His Ser Pro Ser Glu Ser Gln Pro Ser Ser Pro Ser Pro Thr

260 265 270

Pro Ser Pro Ser Pro Val Leu Glu Pro Gly Ser Glu Pro Asn Leu Ala

275 280 285

Val Leu Ser Ile Pro Gly Asp Thr Met Thr Thr Ile Gln Met Ser Val

290 295 300

Glu Glu Ser Thr Pro Ile Ser Arg Glu Thr Gly Glu Pro Tyr Arg Leu

305 310 315 320

Ser Pro Glu Pro Thr Pro Leu Ala Glu Pro Ile Leu Glu Val Glu Val

325 330 335

Thr Leu Ser Lys Pro Val Pro Glu Ser Glu Phe Ser Ser Ser Pro Leu

340 345 350

Gln Ala Pro Thr Pro Leu Ala Ser His Thr Val Glu Ile His Glu Pro

355 360 365

Asn Gly Met Val Pro Ser Glu Asp Leu Glu Pro Glu Val Glu Ser Ser

370 375 380

Pro Glu Leu Ala Pro Pro Pro Ala Cys Pro Ser Glu Ser Pro Val Pro

385 390 395 400

Ile Ala Pro Thr Ala Gln Pro Glu Glu Leu Leu Asn Gly Ala Pro Ser

405 410 415

Pro Pro Ala Val Asp Leu Ser Pro Val Ser Glu Pro Glu Glu Gln Ala

420 425 430

Lys Glu Val Thr Ala Ser Met Ala Pro Pro Thr Ile Pro Ser Ala Thr

435 440 445

Pro Ala Thr Ala Pro Ser Ala Thr Ser Pro Ala Gln Glu Glu Glu Met

450 455 460

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Ala Gly Glu Ala Gly Glu

465 470 475 480

Ala Glu Ser Glu Lys Gly Gly Glu Glu Leu Leu Pro Pro Glu Ser Thr

485 490 495

Pro Ile Pro Ala Asn Leu Ser Gln Asn Leu Glu Ala Ala Ala Ala Thr

500 505 510

Gln Val Ala Val Ser Val Pro Lys Arg Arg Arg Lys Ile Lys Glu Leu

515 520 525

Asn Lys Lys Glu Ala Val Gly Asp Leu Leu Asp Ala Phe Lys Glu Ala

530 535 540

Asn Pro Ala Val Pro Glu Val Glu Asn Gln Pro Pro Ala Gly Ser Asn

545 550 555 560

Pro Gly Pro Glu Ser Glu Gly Ser Gly Val Pro Pro Arg Pro Glu Glu

565 570 575

Ala Asp Glu Thr Trp Asp Ser Lys Glu Asp Lys Ile His Asn Ala Glu

580 585 590

Asn Ile Gln Pro Gly Glu Gln Lys Tyr Glu Tyr Lys Ser Asp Gln Trp

595 600 605

Lys Pro Leu Asn Leu Glu Glu Lys Lys Arg Tyr Asp Arg Glu Phe Leu

610 615 620

Leu Gly Phe Gln Phe Ile Phe Ala Ser Met Gln Lys Pro Glu Gly Leu

625 630 635 640

Pro His Ile Ser Asp Val Val Leu Asp Lys Ala Asn Lys Thr Pro Leu

645 650 655

Arg Pro Leu Asp Pro Thr Arg Leu Gln Gly Ile Asn Cys Gly Pro Asp

660 665 670

Phe Thr Pro Ser Phe Ala Asn Leu Gly Arg Thr Thr Leu Ser Thr Arg

675 680 685

Gly Pro Pro Arg Gly Gly Pro Gly Gly Glu Leu Pro Arg Gly Pro Ala

690 695 700

Gly Leu Gly Pro Arg Arg Ser Gln Gln Gly Pro Arg Lys Glu Pro Arg

705 710 715 720

Lys Ile Ile Ala Thr Val Leu Met Thr Glu Asp Ile Lys Leu Asn Lys

725 730 735

Ala Glu Lys Ala Trp Lys Pro Ser Ser Lys Arg Thr Ala Ala Asp Lys

740 745 750

Asp Arg Gly Glu Glu Asp Ala Asp Gly Ser Lys Thr Gln Asp Leu Phe

755 760 765

Arg Arg Val Arg Ser Ile Leu Asn Lys Leu Thr Pro Gln Met Phe Gln

770 775 780

Gln Leu Met Lys Gln Val Thr Gln Leu Ala Ile Asp Thr Glu Glu Arg

785 790 795 800

Leu Lys Gly Val Ile Asp Leu Ile Phe Glu Lys Ala Ile Ser Glu Pro

805 810 815

Asn Phe Ser Val Ala Tyr Ala Asn Met Cys Arg Cys Leu Met Ala Leu

820 825 830

Lys Val Pro Thr Thr Glu Lys Pro Thr Val Thr Val Asn Phe Arg Lys

835 840 845

Leu Leu Leu Asn Arg Cys Gln Lys Glu Phe Glu Lys Asp Lys Asp Asp

850 855 860

Asp Glu Val Phe Glu Lys Lys Gln Lys Glu Met Asp Glu Ala Ala Thr

865 870 875 880

Ala Glu Glu Arg Gly Arg Leu Lys Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Asp

885 890 895

Ile Ala Arg Arg Arg Ser Leu Gly Asn Ile Lys Phe Ile Gly Glu Leu

900 905 910

Phe Lys Leu Lys Met Leu Thr Glu Ala Ile Met His Asp Cys Val Val

915 920 925

Lys Leu Leu Lys Asn His Asp Glu Glu Ser Leu Glu Cys Leu Cys Arg

930 935 940

Leu Leu Thr Thr Ile Gly Lys Asp Leu Asp Phe Glu Lys Ala Lys Pro

945 950 955 960

Arg Met Asp Gln Tyr Phe Asn Gln Met Glu Lys Ile Ile Lys Glu Lys

965 970 975

Lys Thr Ser Ser Arg Ile Arg Phe Met Leu Gln Asp Val Leu Asp Leu

980 985 990

Arg Gly Ser Asn Trp Val Pro Arg Arg Gly Asp Gln Gly Pro Lys Thr

995 1000 1005

Ile Asp Gln Ile His Lys Glu Ala Glu Met Glu Glu His Arg Glu His

1010 1015 1020

Ile Lys Val Gln Gln Leu Met Ala Lys Gly Ser Asp Lys Arg Arg Gly

1025 1030 1035 1040

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ile Ser Arg Gly Leu Pro Leu Val Asp Asp

1045 1050 1055

Gly Gly Trp Asn Thr Val Pro Ile Ser Lys Gly Ser Arg Pro Ile Asp

1060 1065 1070

Thr Ser Arg Leu Thr Lys Ile Thr Lys Pro Gly Ser Ile Asp Ser Asn

1075 1080 1085

Asn Gln Leu Phe Ala Pro Gly Gly Arg Leu Ser Trp Gly Lys Gly Ser

1090 1095 1100

Ser Gly Gly Ser Gly Ala Lys Pro Ser Asp Ala Ala Ser Glu Ala Ala

1105 1110 1115 1120

Arg Pro Ala Thr Ser Thr Leu Asn Arg Phe Ser Ala Leu Gln Gln Ala

1125 1130 1135

Val Pro Thr Glu Ser Thr Asp Asn Arg Arg Val Val Gln Arg Ser Ser

1140 1145 1150

Leu Ser Arg Glu Arg Gly Glu Lys Ala Gly Asp Arg Gly Asp Arg Leu

1155 1160 1165

Glu Arg Ser Glu Arg Gly Gly Asp Arg Gly Asp Arg Leu Asp Arg Ala

1170 1175 1180

Arg Thr Pro Ala Thr Lys Arg Ser Phe Ser Lys Glu Val Glu Glu Arg

1185 1190 1195 1200

Ser Arg Glu Arg Pro Ser Gln Pro Glu Gly Leu Arg Lys Ala Ala Ser

1205 1210 1215

Leu Thr Glu Asp Arg Asp Arg Gly Arg Asp Ala Val Lys Arg Glu Ala

1220 1225 1230

Ala Leu Pro Pro Val Ser Pro Leu Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Glu

1235 1240 1245

Leu Glu Lys Lys Ser Lys Ala Ile Ile Glu Glu Tyr Leu His Leu Asn

1250 1255 1260

Asp Met Lys Glu Ala Val Gln Cys Val Gln Glu Leu Ala Ser Pro Ser

1265 1270 1275 1280

Leu Leu Phe Ile Phe Val Arg His Gly Val Glu Ser Thr Leu Glu Arg

1285 1290 1295

Ser Ala Ile Ala Arg Glu His Met Gly Gln Leu Leu His Gln Leu Leu

1300 1305 1310

Cys Ala Gly His Leu Ser Thr Ala Gln Tyr Tyr Gln Gly Leu Tyr Glu

1315 1320 1325

Ile Leu Glu Leu Ala Glu Asp Met Glu Ile Asp Ile Pro His Val Trp

1330 1335 1340

Leu Tyr Leu Ala Glu Leu Val Thr Pro Ile Leu Gln Glu Gly Gly Val

1345 1350 1355 1360

Pro Met Gly Glu Leu Phe Arg Glu Ile Thr Lys Pro Leu Arg Pro Leu

1365 1370 1375

Gly Lys Ala Ala Ser Leu Leu Leu Glu Ile Leu Gly Leu Leu Cys Lys

1380 1385 1390

Ser Met Gly Pro Lys Lys Val Gly Thr Leu Trp Arg Glu Ala Gly Leu

1395 1400 1405

Ser Trp Lys Glu Phe Leu Pro Glu Gly Gln Asp Ile Gly Ala Phe Val

1410 1415 1420

Ala Glu Gln Lys Val Glu Tyr Thr Leu Gly Glu Glu Ser Glu Ala Pro

1425 1430 1435 1440

Gly Gln Arg Ala Leu Pro Ser Glu Glu Leu Asn Arg Gln Leu Glu Lys

1445 1450 1455

Leu Leu Lys Glu Gly Ser Ser Asn Gln Arg Val Phe Asp Trp Ile Glu

1460 1465 1470

Ala Asn Leu Ser Glu Gln Gln Ile Val Ser Asn Thr Leu Val Arg Ala

1475 1480 1485

Leu Met Thr Ala Val Cys Tyr Ser Ala Ile Ile Phe Glu Thr Pro Leu

1490 1495 1500

Arg Val Asp Val Ala Val Leu Lys Ala Arg Ala Lys Leu Leu Gln Lys

1505 1510 1515 1520

Tyr Leu Cys Asp Glu Gln Lys Glu Leu Gln Ala Leu Tyr Ala Leu Gln

1525 1530 1535

Ala Leu Val Val Thr Leu Glu Gln Pro Pro Asn Leu Leu Arg Met Phe

1540 1545 1550

Phe Asp Ala Leu Tyr Asp Glu Asp Val Val Lys Glu Asp Ala Phe Tyr

1555 1560 1565

Ser Trp Glu Ser Ser Lys Asp Pro Ala Glu Gln Gln Gly Lys Gly Val

1570 1575 1580

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1585 1590 1595 1600

Glu Glu Ser Asp His Asn

1605

<210> 10

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr

35 40 45

Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe

50 55 60

Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser

65 70 75 80

Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser

85 90 95

Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe

100 105 110

Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met

115 120 125

Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe

130 135 140

Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys

145 150 155 160

Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly

165 170 175

Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr

180 185 190

Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His

195 200 205

Ala Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr

210 215 220

Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr

225 230 235 240

Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp

245 250 255

Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala

260 265 270

Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala

275 280 285

Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu

290 295 300

Glu Glu Glu Gly Val

305

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagcagaaac tcatctctga agaggatctg catcaccatc accatcac 48

Claims

1.一种肺癌早期诊断用蛋白芯片，其特征在于，包括固相支持物及包被于所述固相支持物表面的抗原；所述抗原包括如下十种抗原片段：MAGE A3抗原片段、ANXA1抗原片段、CTAG1B抗原片段、CAGE1抗原片段、AP3D1抗原片段、CCT8抗原片段、CHK抗原片段、PRKACA抗原片段、EIF4G1抗原片段及MAGE A1抗原片段。

2.如权利要求1所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片，其特征在于，所述MAGE A3抗原片段的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的抗原特征氨基酸序列；

3.如权利要求2所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片，其特征在于，所述抗原片段为重组融合蛋白，还包括位于相应抗原特征氨基酸序列的N端的Myc-Histag以及C端的链霉亲和素。

4.如权利要求2或3所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片，其特征在于，所述固相支持物为玻片、免疫印迹膜、微孔板或磁性微珠。

5.如权利要求4所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片，其特征在于，所述固相支持物为磁性微珠，所述十种抗原片段分别包被于十种不同颜色的磁性微珠表面。

6.如权利要求4所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片，其特征在于，所述抗原片段为亲和素化的抗原片段，所述固相支持物的表面通过肽键连接生物素化的牛血清白蛋白，所述抗原片段与所述固相支持物之间通过亲和素与生物素化的牛血清白蛋白间接连接。

7.一种肺癌早期诊断用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6中任一项所述的肺癌早期诊断用蛋白芯片。

8.如权利要求7所述肺癌早期诊断用试剂盒，其特征在于，还包括含有荧光物质标记的二抗试剂、标准品试剂和质控参比品试剂。

9.如权利要求8所述的肺癌早期诊断用试剂盒，其特征在于，所述荧光物质标记的二抗试剂是抗人IgG Fc-PE抗体和抗人IgM Fc-PE抗体。

10.如权利要求8所述的肺癌早期诊断用试剂盒，其特征在于，所述标准品试剂与所述质控参比品试剂均是Anti-Myc嵌合抗体。