CN102175864A

CN102175864A - 一组早期肝癌分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN102175864A
Application number: CN2011100211850A
Authority: CN
Inventors: 金光植; 刘银坤; 王浙东
Original assignee: Jiangsu Etern Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Etern Co Ltd
Priority date: 2011-01-19
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明提供了早期肝癌分子标志物及其应用。所述的早期肝癌分子标志物包括氨基酰化酶-1（ACY1）、亚硫酸盐氧化酶（SUOX）和糖原磷酸化酶（PYGL）。本发明还提供了氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶作为早期肝癌分子标志物组合在制备肝癌临床诊断试剂中的应用。本发明还提供了一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含氨基酰化酶-1抗体、亚硫酸盐氧化酶抗体和糖原磷酸化酶抗体。本发明发现了新的早期肝癌分子标志物，具有较高的检测灵敏度和特异度。

Description

一组早期肝癌分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一组早期肝癌分子标志物及其应用。

背景技术

肝癌的形成是一个多因素、多步骤、多基因参加的复杂过程，一般经历肝炎，肝硬化，不典型增生结节，肝癌的进展过程。近年来，不典型增生结节（dysplastic nodule，DN）作为肝癌癌前病变日益受到重视。硬化肝中的DN广泛被公认为是肝癌癌前病变。而目前临床上鉴别诊断不典型增生结节和早期肝癌（根据BCLC规定，eHCC的定义为单个肿瘤或3个肿瘤大小之和<3cm，Child-Pugh A和B，不达到肝移植标准）主要依靠影像学诊断或病理学者的HE染色切片的镜下诊断，尚缺乏有效的免疫组织学诊断标志物。从肝癌治疗的角度来看，癌前期的早期治疗有效率可达90%，而进展期肿瘤的总体治愈率仅为5%。肝癌的 5年生存率，亚临床期（I 期）为53.2%，中期（II期）为28.2%，而晚期（III）几乎是0%。肝癌的早期诊断，早期治疗非常重要。

目前临床应用的HCC血清标志物有甲胎蛋白（AFP），AFP-L3，脱-γ-羧基凝血酶原（DCP）。实验室研究阶段的HCC标志物有硫酸肝素蛋白多糖3（GPC3），高尔基蛋白73（GP73），转化生长因子-β1（TGFβ1），胰岛素样生长因子（IGF-II），肝细胞生长因子（HGF）等等。具体说，当AFP界值为20 ng/ml时AFP诊断HCC的敏感性和特异性分别为41%-65%和80%-90%（Clin Chim Acta，395: 19-26，2008）。AFP-L3的百分比的诊断值界定为35%时，对HCC诊断的敏感性和特异性分别为33%和100%（Clin Gastroenterol Hepatol，9: 394-402，2007）。 DCP的界值为40 mAU/ml时，对HCC诊断的敏感性和特异性分别为58%和97%（Am J Gastroenterol，101: 2038-2043，2006）。

另外影像学诊断方法主要有超声波（US），CT扫描，磁共振成像（MRI）等。杨文德（临床消化病杂志，第17卷，第5期，222-223，2005年）等探讨3种非创伤性影像检查方法US，CT和MRI在肝癌诊断中的敏感性和准确性。他们回顾性地比较分析了79例肝癌的US、CT及MRI优缺点。其结果，肝癌确诊率为US: 73.08%、CT: 87.34%、MRI: 87.76%。US对eHCC的检出率较高，但确诊率较低。CT和MRI对中晚期肝癌确诊率较高。但任何一种单独的方法不足以满足临床的需要，需合理地综合利用，提高eHCC诊断的准确率。更重要的是，上述的方法无论是分子标志物还是影像学方法其灵敏度和特异度均有限，加之这些方法对于eHCC 的诊断效果不好，特别是eHCC和不典型增生结节的鉴别诊断。

因此，发现DN和eHCC的标志物将为临床提供强有力的鉴别诊断工具。另外，DN与eHCC差异性表达的分子可以预测肝癌的发生，也可以为阻断其发展成为肝癌提供线索和方案。因此，DN特异性标志物的发现及其应用将给临床提供区分DN和eHCC的有效分子标志物，并对阐明肝癌的分子发病机理和提高eHCC的诊断率具有非常重要的意义

ACY1蛋白是与N-酰化或N-乙酰化氨基酸（L-天冬氨酸除外）的水解相关的酶。ACY1基因的缺失引起ACY1酶的缺损，导致代谢功能紊乱，脑病，非特异性的神经性运动的迟缓，显著的肌肉张力减退等临床症候。SUOX是亚硫酸氧化酶，SUOX基因的缺失引起亚硫酸氧化酶的缺损（硫酸半胱氨酸尿症），导致合并脑萎缩的多灶性白质脑疾病（multicystic leukoencephalopathy），患者常伴癫痫，最终导致早期死亡。PYGL是重要的糖代谢异构酶，主要调节 1，4-α-D-葡萄糖的磷酸化。

发明内容

本发明的目的是提出一组新的早期肝癌的分子标志物，并提供该早期肝癌的分子标志物在制备早期肝癌诊断试剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一组新的高分化早期肝癌的分子标志物，包含氨基酰化酶-1（ACY1）、亚硫酸盐氧化酶（SUOX）和糖原磷酸化酶（PYGL）。氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶在早期肝癌组织中的表达水平比肝硬化，不典型结节中的表达显著降低，可以成为区别肝硬化和早期肝癌以及不典型结节和早期肝癌的标志物。

本发明还提供了氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶作为早期肝癌分子标志物组合在制备肝癌临床诊断试剂中的应用。氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶的组合可应用于临床肝癌病理切片的检查和鉴别诊断。在临床的实验室应用中，可按照常规方法制备抗氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶的抗体，建立检测氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶的定性或定量方法以及配套试剂盒，以用于判断肝癌的进程和发病机制的研究。

本发明还提供了一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含氨基酰化酶-1抗体、亚硫酸盐氧化酶抗体和糖原磷酸化酶抗体。

本发明发现了新的早期肝癌分子标志物，具有较高的检测灵敏度和特异度。本发明所述的早期肝癌标志物ACY1，SUOX，PYGL在早期肝癌中有特异降低的发现对早期肝癌的临床诊断试剂有着非常重要的意义。同时，研究这3种分子在肝癌，不典型增生，早期肝癌中的表达变化对研究肝癌的发病机制的研究有着重要的意义；同时，对发现肝癌癌前病变并进行早期干预具有指导意义。

附图说明

图1为Western Blot法验证氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶在肝硬化、不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。

图2为免疫组织化学法证明氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶在肝硬化、不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。

图3为用IOD表示的免疫组化分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1：样本的收集及蛋白提取：

1、取人的硬化肝、不典型增生结节病灶和早期肝癌病灶经2位病理科专家的HE切片的镜下诊断后，将对应的蜡块切成厚度为7μm的白片。在温度为60℃的条件下烘干直至切片组织与载玻片之间无气泡（大概30-60 分）。

2、甲醛固定/石蜡包埋（FFPE）组织蛋白的提取和蛋白浓度测定：

2.1、将上述的肝组织切片置于二甲苯中进行脱蜡2次，每次10 min。风烘干后精确画出其病灶范围。用手术刀片（11号刀片）对病灶部分进行精确切割，并放入低吸附管。

2.2、在每个低吸附管中加入适量石蜡包埋组织蛋白提取缓冲液（Tris-HCl缓冲液），该缓冲液含有质量浓度为2%的十二烷基磺酸钠（SDS）和20mM三羟甲基氨基甲烷（Tris），pH=9，每50-400mm²组织加入100-400μl缓冲液。

2.3、将上述低吸附管在100℃、转速为750rpm的条件下震荡20 min，再在80℃、转速为750 rpm的条件下震荡120 min，置于4℃条件下静置5 min后，加入罗氏（Roche）蛋白酶抑制剂（不含EDTA ）2-8 μl。

2.4、将样本转移至Ultrafree-MC离心超滤管（Millipore，Durapore PVDF 0.45μm，0.5 ml），在4℃、离心力为12000 g的条件下离心3 min（时间适当延长直至离心结束）得到蛋白样本。采用常规方法用BCA蛋白定量试剂（碧云天）进行蛋白定量。

实施例2：免疫印迹法证明3种蛋白在肝硬化、不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异：

1、将实施例1提取得到的蛋白样本（每组各18例样本混合），采用常规方法进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移至PVDF膜（Millipore）上。

2、将脱脂奶粉溶解在pH=7.4的TBS-T缓冲液（0.05%（v/v）Tween 20/Tris-缓冲液）中得到无脂肪牛奶溶液，脱脂奶粉的浓度为5%（w/v），将上述无脂肪牛奶溶液加入到上述蛋白样本中，1h后，加入一抗，4℃孵育过夜，用TBS-T洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，常温孵育1h。其中，一抗的公司和稀释倍率如下：小鼠抗-ACY1（ab54960，Abcam，1:150），兔抗-PYGL（HPA000962，Sigma-Aldrich，1:400），小鼠抗-SUOX（ab88346，Abcam，1:200），兔抗-α-Tubulin（ab15246，Abcam，1:200）。山羊抗兔IgG抗体-HRP标记（Goat Anti-Rabbit IgG-HRP，货号：170-6515，Bio-Rad，1:20000），山羊抗小鼠IgG抗体-HRP标记（Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP，货号：170-6516，Bio-Rad，1:20000）。

3、采用常规方法显色，条带用ECL^TM 蛋白印迹检测试剂（Pierce Chemical公司生产）发光5min后，曝光到x-光胶片（Kodak公司生产）。最后用QUANTITY ONE 软件（Bio-Rad公司提供）进行定量。如图1所示，为Western Blot法验证氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶在肝硬化、不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。以α-微管蛋白（Tubulin）作为内参。本发明利用免疫印迹证明了这3种蛋白在早期肝癌中的表达与肝硬化，不典型增生结节相比有显著的降低。

实施例3：免疫组织化学法证明3种蛋白的表达差异：

1、取人的硬化肝、不典型增生结节病灶和早期肝癌病灶经2位病理科专家的HE切片的镜下诊断后，将对应的蜡块用常规方法制成组织芯片，切成4μm 厚度切片，放到3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane）涂抹的载玻片上。

2、将载有组织切片的载玻片按照常规方法进行二甲苯脱蜡，水化（100%乙醇，95%乙醇，85%乙醇各处理5min），将载有组织切片的载玻片置于0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中在100℃进行抗原修复处理3min，取出放置冷却，置于含有质量浓度为3%的H₂O₂的磷酸盐（PBS，pH=7.4）缓冲液中进行内源性过氧化物酶封闭处理30min，取出后，置于山羊血清中60min，取出，加入一抗，4℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液冲洗后，用EnVision 检测试剂盒显色。其中，抗体的生产公司和稀释倍数为：抗-ACY1 (ab54960, Abcam，1:250)；抗-PYGL (HPA000962, Sigma-Aldrich，1:400)；抗-SUOX (ab88346, Abcam，1:200)。

3、采用常规方法进行蛋白表达水平定量：连接Leica CCD 相机的DFC420 Leica DM IRE2 显微镜（Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd，Cambridge，United Kingdom）上在×200视野拍代表性的区域。应用软件为Leica QWin Plus v3 软件。积分光密度值（Integrated Optical Density，IOD）利用Image-Pro Plus v6.0 软件（Media Cybernetics Inc，Bethesda，MD）计算得出。统计学软件为SPSS13.0，制图软件主要为GraphPad Prism 5。

3种蛋白在利用组织芯片的免疫组织化学实验中也得到了验证，如图2所示，为免疫组织化学法证明氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶在肝硬化、不典型增生结节和早期肝癌中的表达差异图。氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶这3种蛋白在早期肝癌组织中的表达水平比肝硬化，不典型结节中的表达显著降低，可以成为区别肝硬化和早期肝癌以及不典型结节和早期肝癌的标志物。如图3所示，为用IOD表示的免疫组化分析结果图。各个蛋白的表达水平用IOD表示，并绘制成箱须图。表达水平用Mann-Whitney U 检验进行了统计学分析（LC=65例，DN=46例，eHCC=52例，* * *: p<0.0001，LC vs eHCC; # # # : p<0.0001，DN vs eHCC）。

实施例4：肝癌诊断试剂盒及其应用：

1、一种肝癌诊断试剂盒，其包含以下试剂：

小鼠抗-ACY1（ab54960，由Abcam公司提供）；

兔抗-PYGL（HPA000962，由Sigma-Aldrich公司提供）；

小鼠抗-SUOX（ab88346，由Abcam公司提供）；

抗原修复液（0.01M柠檬酸盐缓冲液，pH6.0）；

过氧化氢溶液（含有3wt% H₂O₂的PBS缓冲溶液）；

山羊血清；

EnVision 检测试剂盒（兔/鼠通用）（DAKO公司提供）。

2、使用上述试剂盒诊断肝癌的步骤如下：

2.1、采用常规方法对免疫组化结果进行蛋白表达水平定量：连接Leica CCD 相机的DFC420 Leica DM IRE2 显微镜（Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd，Cambridge，United Kingdom）上在×200视野拍代表性的区域。应用软件为Leica QWin Plus v3 软件。积分光密度值（Integrated Optical Density，IOD）利用Image-Pro Plus v6.0 软件（Media Cybernetics Inc，Bethesda，MD）计算得出。统计学软件为SPSS13.0，制图软件主要为GraphPad Prism 5。

2.2、另外，病理科医生或者研究人员可通过显微镜下的观察对免疫组织化学的结果进行评估。其方法为，综合考虑染色强度和阳性细胞数的比率。染色强度：无黄色为0，阳性强度淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞数：阳性细胞数<15%为0分，15%-25%为1分，25%-50%为2分，>50为3分。将每种蛋白的染色强度分数和阳性细胞数分数相乘，得出该蛋白的阴性或阳性结果，既0分为阴性（-），1-2分为弱阳性（-），3-4分为中等阳性（++），6-9分为强阳性（+++）。至少1种蛋白为阴性可判断为早期肝癌。

Claims

1.氨基酰化酶-1、亚硫酸盐氧化酶和糖原磷酸化酶作为早期肝癌分子标志物组合在制备肝癌临床诊断试剂中的应用。

2.一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包含氨基酰化酶-1抗体、亚硫酸盐氧化酶抗体和糖原磷酸化酶抗体。