CN103543081B - 用于肝癌早诊的便携式传感系统及其功能化修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于肝癌早诊的便携式传感系统及其功能化修饰方法,该系统包括:微悬臂梁阵列传感单元,其将悬臂梁的机械信号转化为电信号,并输出至数字化显示接口处理电路;表面修饰层,生长在微悬臂梁阵列传感单元表面,用于功能化微悬臂梁阵列传感单元表面,使其能够与肝癌标志物抗原特异性结合;封装外壳,用于保护微悬臂梁阵列传感单元,并提供生化反应进/出样口及反应腔室;驱动模块,用于向微悬臂梁阵列传感单元提供谐振激励信号;数字化显示接口处理电路,用于根据所述微悬臂梁的谐振频率变化量获得肝癌标志物质量并输出。本发明提出的上述系统及方法使普及肝癌早期筛查成为可能,对实现肝癌早诊早治、提高肝癌生存率有着重大意义。
Description
技术领域
本发明属于半导体、生物化学及电学领域,尤其涉及一种用于肝癌早诊的便携式传感系统及其功能化修饰方法。
背景技术
中国是肝癌第一大国,目前我国发病人数约占全球的55%,在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌,位居第二位。早期肝癌(小肝癌)常常无明显症状,绝大多数肝癌患者出现诸如肝区疼痛、腹胀、腹部包块、黄疸、腹水等症状时,就诊时已经到中晚期,失去了手术机会,目前肝癌的手术切除率仅为10%-30%,对于不能手术切除的病例,传统的放、化疗效果不佳,患者生存期一般不超过半年。因此肝癌早期诊断是提高疗效的一个关键问题。
我国在20世纪70年代肝癌普查基础上建立的“B超+AFP”诊断方法仍是目前肝癌早期诊断的主要依据,进一步确诊需要进行强化CT、对比剂增强的MRI及PET-CT等影像学检查。然而目前,AFP对小肝癌的敏感度仅为40%左右,CT、MRI等影像学检查在肿瘤生长到直径2cm以上才能做到诊断较明确,1-2cm的肿瘤诊断较难确定,而1cm以下的病灶更难检出。亟需研发一种新型高可靠性的检测手段来进行肝癌的早期检查。
悬臂梁作为MEMS器件中一种重要的结构近年来已经成为生化检测以及医学应用的研究热点。1997年,IBM实验室联合basel大学用电子束蒸发的方法在Si悬臂梁上生长一层30nm厚的Pt层(包含2nm厚的Ti粘附层),特异性吸附氢气分子,选用长500um,宽100um,厚0.8um的悬臂梁进行静态动态测量,测得最大的表面应力变化为0.4±0.1N/m,选用厚12um的悬臂梁涂覆一层几微米厚的聚合物,用来特异性吸附醇类分子,并用动 态测量方法测得频率变化50Hz。后来巴塞尔大学采用微机械悬臂阵列进行了选择性固定真菌和快速增长检测酵母菌和黑曲霉菌丝体等研究。2000年D.Kashanin等人利用微流体生物芯片进行细胞的指引和分离,研究了T细胞与单克隆抗体修饰后通道壁的相互作用,模拟自然细胞在毛细血管中受体与ligand相互作用,芯片的尺寸只有曲别针大小,流体管道宽60um,深40um。
但是,基于悬臂梁结构的器件在医学领域的实用化仍然存在一些技术困难,如:悬臂梁上非特异性吸附导致的测量误差;悬臂梁上大面积吸附抗体、抗原引起梁弹性常数变化,产生频率偏移而导致测量误差;以及在血清的液态生物环境中悬臂梁品质因子大幅降低,导致检测灵敏度降低。目前,医院使用的重大疾病血清学检测技术主要是大型设备,检测费用昂贵,而且耗时,对于早期癌症的确诊率很低。因此,迫切需求一种便携式、高灵敏、高可靠、易操作的肝癌早期诊断设备。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于肝癌早期诊断的快速、便携式、高灵敏的低成本检测系统及其制备方法。
为此,本发明提供了一种用于肝癌早诊的便携式传感系统,其包括:
微悬臂梁阵列传感单元,其在谐振激励信号的驱动下检测微悬臂梁的谐振频率,并将其输出至数字化显示接口处理电路;
表面修饰层,其生长在微悬臂梁阵列传感单元表面,用于功能化微悬臂梁阵列传感单元表面,使其能够与肝癌标志物抗原特异性结合;
封装外壳,其用于保护微悬臂梁阵列传感单元,并提供生化反应进样口、出样口以及反应腔室;
驱动模块,其用于向微悬臂梁阵列传感单元提供谐振激励信号:
数字化显示接口处理电路,其用于根据所述微悬臂梁的谐振频率在反应血样前后变化量获得肝癌标志物质量并输出。
本发明还公开了一种如上所述的用于肝癌早诊的便携式传感系统中生物表面修饰层生物功能化修饰方法,其具体包括:
步骤1:对所述微悬臂梁阵列传感单元进行等离子体处理或是用硫酸∶ 双氧水=3∶1的溶液处理,在器件硅表面形成带有羟基的亲水表面;
步骤2:将具有亲水表面的微悬臂梁阵列传感单元浸入到3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的乙醇溶液中,得到APTES单分子层;
步骤3:将覆盖有APTES单分子层的微悬臂梁阵列传感单元在室温下与戊二醛GA的稀释溶液反应,形成GA分子层;
步骤4:在室温恒湿条件下,将形成有GA分子层的微悬臂梁阵列传感单元在PBS缓冲液稀释的抗体溶液中充分反应,用PBS缓冲液清洗数遍,得到能够与肝癌标志物特异性反应的抗体层;将不同抗体用局域修饰法分别打印在微悬臂梁阵列传感单元的微悬臂梁前端,然后在恒温恒湿环境下培养,可实现在不同梁上局域修饰不同抗体;
步骤5:将微悬臂梁阵列传感单元浸入乙醇胺和NaBH3CN溶液中或是浸入到BSA的PBS缓冲液中反应,阻断未反应的活性醛基。
从上述技术方案可以看出,本发明的有益效果是:
本发明提供了一种用于肝癌早诊的便携式传感系统及其功能化修饰方法,该方法是利用MEMS微纳加工技术制作的微悬臂梁阵列结构为感应单元,在微悬臂前端表面修饰肝癌标志物相应抗体,特异性响应肝癌标志物,集成接口处理电路及驱动模块和数字化显示单元,实现多种肝癌标志物的同时检测以及便携化应用。具体包括:
1、本发明中在微悬臂梁前端设计了生化反应微区,通过局域打印抗体的方法降低了整梁吸附时引起的弹性常数变化,提高了检测精度,采用谐振原理实现了高灵敏检测(最小检测质量fg量级)。这使得肝癌诊断的敏感性和特异性大大提高。
2、本发明中提出的生物修饰方法可广泛用于硅表面的生物蛋白修饰,整个修饰过程简单、易操作、对器件的损伤小、成本低且可应用于大规模修饰,保证了器件的成品率。
3、本发明中选用不同肝癌标志物:AFP(甲胎蛋白)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HGF(肝细胞生长因子)、趋化因子CCLl5,其中AFP(甲胎蛋白)一直被用作肝癌诊断的生物标志物,但其最佳诊断临界浓度仍有争议,采用与GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HGF(肝细胞生长因子)、趋化因子CCLl5联合检测方法大大降低了假阴性和假阳性,为肝癌早期筛查提供可靠的依据。本发明选用阵列式悬臂梁结构,通过局域修饰方法在不同悬臂梁上打印不同抗体,实现了多种肝癌标志物的同时检测,并通过提取考梁与工作梁差分信号的方式,有效消除了非特异性吸附而导致的测量误差。
4、本发明中将微悬臂梁阵列器件与接口处理电路、驱动单元、数字化显示模块进行系统集成和封装,实现了用于肝癌早期诊断的高灵敏、低成本便携式试剂盒。低成本、高灵敏、便携式的肝癌检测系统使普及肝癌早期筛查成为可能,对实现肝癌早诊早治、提高肝癌生存率有着重大意义。
附图说明
图1为本发明中用于肝癌早诊的便携式生化传感系统结构示意图;
图2为本发明中微悬臂梁阵列传感单元的结构示意图;
图3为本发明中对微悬臂梁阵列传感单元进行表面抗体修饰过程示意图;
图4为本发明中微悬臂梁阵列中一根悬臂梁抗体功能化表面示意图;
图5为本发明中数字化显示接口处理电路的结构示意图;
图6为本发明中检测反应过程中悬臂梁的工作梁与参考梁的频移曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供了一种用于肝癌早诊的便携式传感系统及其功能化修饰方法。其利用微悬臂梁阵列传感单元1结构的频率响应来实时、高灵敏的检测血样中肝癌标志物。
图1示出了本发明提供的用于肝癌早诊的便携式传感系统的结构示意图。如图1所示,其主要包括:微悬臂梁阵列传感单元1、微悬臂梁前端生物表面修饰层、具有进样口、出样口11、12的PDMS封装外壳10、驱动模块13以及数字化显示接口处理电路14五部分。
微悬臂梁阵列传感单元1,其用于通过检测微悬臂梁的频率变化量, 获得吸附的肝癌标志物质量;
微悬臂梁前端生物表面修饰层,用于对微悬臂梁阵列传感单元1的表面功能化,使其与肝癌标志物抗原9特异性结合;
封装外壳10,其用于保护微悬臂梁阵列传感单元1,并提供生化反应进样口、出样口11,12以及反应腔室;该封装外壳集成了血样和清洗液进样口、出样口以及血样反应腔。
驱动模块13,其用于提供微悬臂梁阵列传感单元1的谐振激励,使得微悬臂梁阵列传感单元l中的多个微悬臂梁产生相应的谐振频率信号:所述驱动模块的驱动方式可以是压电、静电、电磁、热电或光驱动中的任一种或多种。
数字化显示接口处理电路14,其用于实现悬臂梁的自激励以及悬臂梁谐振信号的自检测、处理与数字化显示。悬臂梁自激励自检测的闭环工作方式大大提高了悬臂梁谐振信号的稳定性以及检测的便携性。
本发明提供的用于肝癌早诊的便携式生化传感系统的具体集成方法是将微悬臂梁阵列传感单元1经过生物化学方法修饰之后得到微悬臂梁前端具有生物表面修饰层,再将具有表面修饰层的微悬臂梁阵列传感单元1的前半部分用具有进样口、出样口11、12的PDMS封装壳密封,其中所述前半部分上具有微悬臂梁阵列。露出的微悬臂梁阵列传感单元1的后半部分下表面固定到PZT驱动模块13上。最后将微悬臂梁阵列传感单元1的压焊金属电极4压焊到数字化显示接口处理电路14的PCB板上。
图2示出了本发明中微悬臂梁阵列传感单元的结构示意图。如图2所示,所述微悬臂梁阵列传感单元1包含五根微悬臂梁和外部压焊金属电极4,所述微悬臂梁的前端设置有微型结构2,且所述微悬臂梁根部设置具有压阻结构的惠斯通桥电路3,所述压阻结构用于测量微悬臂梁的谐振频率信号,所述惠斯通桥用于将所检测到的谐振频率输出;所述微型结构2包括微柱、微沟道结构,其可以提高肝癌标志物的吸附面积:所述具有压阻结构的惠斯通桥电路3和所述外部压焊金属电极4利用离子注入和电子束蒸发制作,以用于检测和输出微悬臂梁谐振信号,数字化显示接口处理电路可以根据所述惠斯通桥电路输出的信号获得各个微悬臂梁的谐振频率,进而通过反应血样前后频率变化量获得吸附在各个微悬臂梁上的物质质 量。
图3示出了本发明中对微悬臂梁阵列传感单元进行表面抗体修饰过程示意图。如图3所示,对传感器进行表面抗体修饰的方法依次包括以下步骤:
步骤1:对制作完成的微悬臂梁阵列传感单元1进行等离子体处理或是用硫酸∶双氧水=3∶1的溶液处理,使微悬臂梁阵列传感单元1的硅表面成为带有羟基的亲水表面;
步骤2:将具有亲水表面的器件浸入到浓度为10%的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)乙醇溶液中,得到由APTES单分子层5覆盖的微悬臂梁阵列传感单元1表面,然后将具有APTES单分子层表面的微悬臂梁阵列传感单元1用乙醇、水各清洗数遍,并在烘箱中去除水汽;
步骤3:将覆盖有APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)表面的微悬臂梁阵列传感单元浸入GA(戊二醛)的稀释溶液(浓度5%)中,室温下反应得到GA分子层6修饰的微悬臂梁表面;超纯水清洗数遍,氮气流中自然干燥;
步骤4:室温恒湿条件下,将步骤3的微悬臂梁阵列在PBS缓冲液稀释的抗体溶液中充分反应,用PBS缓冲液清洗数遍,得到能够与肝癌标志物特异性反应的抗体层7;在不同悬臂梁上分别修饰不同种肝癌标志物相应抗体时,将用PBS缓冲液稀释的不同抗体用微喷墨打印装置依次打印在各个微悬臂梁前端,然后在恒温恒湿环境下培养:
步骤5:将完成步骤4的微悬臂梁阵列传感单元1浸入BSA(牛血清蛋白)的PBS缓冲液中反应,阻断未反应的活性醛基,形成部分具有BSA(牛血清蛋白)层8的表面。
图4示出了本发明中微悬臂梁阵列中一根悬臂梁抗体功能化表面示意图。如图4所示,在微悬臂梁表面向上依次为APTES单分子层5、GA分子层6、抗体层7、BSA(牛血清蛋白)层8。
在上述微悬臂梁阵列生物功能化过程中,步骤4采用局域修饰的方法,在微悬臂梁阵列中四个梁前端分别打印不同的肝癌标志物相应抗体:AFP(甲胎蛋白)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HGF(肝细胞生长因子)、趋化因子CCLl5,第五个根梁不经过步骤4的抗体修饰,作为参考梁。
将经过步骤5具有抗体表面的微悬臂梁阵列传感单元1与具有进样 口、出样口11、12的封装外壳10、驱动模块13以及数字化显示接口电路14集成,即可构成用于肝癌标志物检测的便携式试剂盒。
在试剂盒通入血样之前先用数字化显示接口处理电路14进行反应前微悬臂梁阵列谐振信号的检测输出,记录得到反应前五个梁各自的响应频率。然后进行血样测量,首先将待反应的血样通过封装外壳10上的进样口11通入到封装外壳内的生化反应腔内,使具有肝癌标志物相应抗体修饰层的微悬臂梁阵列传感单元1与血样充分反应,再用Tween-20的PBS溶液依次通过封装外壳10的进样口11、出样口12进行非特异性吸附物质的清洗,干燥后即可用数字化显示接口处理电路14进行测量反应后五个梁各自的响应频率。
图5示出了本发明中数字化显示接口处理电路的结构示意图。如图5所示,该数字化显示接口处理电路包括低通滤波器、仪表放大器、带通滤波器、移相器、具有低通滤波以及电流电压转换功能的锁相环、计数器、数字化显示屏,其与驱动模块联合作用实现了悬臂梁的自激励自检测,并用单片机将检测频率信号实现数字化显示。微悬臂梁阵列传感单元1谐振的机械信号经微悬臂梁后端的压阻结构转化为电学信号,并利用惠斯通桥电路3经金属电极4输出后,先用低通滤波器将低频噪声信号滤除,再经仪表放大器进行放大后带通滤波器处理,得到较纯净的信号后由移相器对其进行相位调整,移相后的信号通过PLL锁相环电路进行锁相跟踪,之后反馈至微悬臂梁阵列传感器上的驱动模块13,作为悬臂梁激励信号而构成闭环电路,完成自激励和自检测功能。同时经移相器相位调整后的信号通过整流电路将模拟信号转换为数字信号,并通过单片机计数器后用LCD显示屏数字化显示测量结果。
肝癌标志物的检测依据悬臂梁频率响应原理,其一阶频率响应可表示为:
其中,k为梁的劲度系数,m*为梁的有效质量。
图6示出了本发明检测反应过程中悬臂梁的工作梁与参考梁的频移曲线图。如图6所示,工作梁因为具有功能化的抗体表面,可以特异性吸附血样中的相应抗原而使得微悬臂梁有效质量增加,导致谐振频率发生变 化:
因此,依据频率变化量即可得到工作梁在反应过程中的吸附质量。参考梁由于没有进行抗体修饰而不能特异性吸附待测血样中的肝癌标志物,响应频率不会发生明显变化。利用参考梁与工作梁响应的差值排除了测试过程中非特异性吸附的影响,最终得到待测肝癌标志物的吸附质量,通过测得该吸附质量是否超过界定值来诊断是否患有肝癌。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种用于肝癌早诊的便携式传感系统中生物表面修饰层生物功能化修饰方法,所述的便携式传感系统包括:
微悬臂梁阵列传感单元,其在谐振激励信号的驱动下检测微悬臂梁的谐振频率,并将其输出至数字化显示接口处理电路;
表面修饰层,其生长在微悬臂梁阵列传感单元表面,用于功能化微悬臂梁阵列传感单元表面,使其能够与不同肝癌标志物抗原特异性结合;
封装外壳,其用于保护微悬臂梁阵列传感单元,并提供生化反应进样口、出样口以及反应腔室;
驱动模块,其用于向微悬臂梁阵列传感单元提供谐振激励信号;
数字化显示接口处理电路,其用于根据所述微悬臂梁的谐振频率在反应血样前后变化量获得肝癌标志物质量并输出;其特征在于,所述的修饰方法,
其具体包括:
步骤1:对所述微悬臂梁阵列传感单元进行等离子体处理或是用硫酸∶双氧水=3∶1的溶液处理,在器件硅表面形成带有羟基的亲水表面;
步骤2:将具有亲水表面的微悬臂梁阵列传感单元浸入到3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的乙醇溶液中,得到APTES单分子层;
步骤3:将覆盖有APTES单分子层的微悬臂梁阵列传感单元在室温下与戊二醛GA的稀释溶液反应,形成GA分子层:
步骤4:在室温恒湿条件下,将形成有GA分子层的微悬臂梁阵列传感单元在PBS缓冲液稀释的抗体溶液中充分反应,用PBS缓冲液清洗数遍,得到能够与肝癌标志物特异性反应的抗体层;将不同抗体用局域修饰法分别打印在微悬臂梁阵列传感单元的微悬臂梁前端,然后在恒温恒湿环境下培养,可实现在不同梁上局域修饰不同抗体;
步骤5:将微悬臂梁阵列传感单元浸入乙醇胺和NaBH3CN溶液中或是浸入到BSA的PBS缓冲液中反应,阻断未反应的活性醛基。
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