CN104965069A - 细胞活性在线检测和药物筛选方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测细胞活性的方法，所述方法包括：使所述细胞与微悬臂梁结合；和测量并计算结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差，从而确定所述细胞的相对活性。本发明还提供用于筛选抗癌药物的方法，所述方法包括：使所述癌细胞与微悬臂梁结合；用待检测的药物处理结合有所述癌细胞的微悬臂梁；和测量并计算用所述药物处理的和未用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差，其中，与未用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁相比，用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差减小指示所述药物能够减弱所述癌细胞的活性。本发明还涉及使用上述方法的活性检测和药物筛选系统。

Description

细胞活性在线检测和药物筛选方法及装置
技术领域
本发明涉及检测细胞活性的在线监测、抗癌药物筛选领域。特别是涉及一种基于力学效应的纳米微悬臂梁及其在检测细胞活性和对抗癌药物进行快速筛选中的应用。
背景技术
化疗目前还是肿瘤的一项有效的治疗措施。但用于临床的抗肿瘤药物普遍存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题，因此继续寻找选择性高、毒副作用小的抗癌药是抗肿瘤新药研究的重点。每年都有大量的植物提取物以及化合物出现，如何进行药物初筛仍是工作的一个重要环节。
细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标，如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。它是从事相关方面的科学研究的常用手段，更是体外筛选抗肿瘤药物和临床肿瘤药敏试验的重要方法之一。目前常用的方法有很多，如流式细胞仪、直接染色法、克隆形成试验、比色法等。然而这些传统方法都比较贵或无法量化细胞的活性而只能区分活细胞和死细胞。另外，这些方法当中有些需要荧光或放射性物质标记。而标记过程本身就很繁琐，标记往往会对细胞生理功能造成破坏从而影响对细胞重要的生物学信息的检测。因此，发展非标记、非侵入、经济、高效的方法来定量检测细胞的活性及其在药物作用下的变化情况对药物筛选尤其是对杀灭癌细胞的抗癌药物的筛选有着重要的意义。
本世纪初，在原子力显微镜(AFM)和微机电系统(MEMS)基础上发展起来一种基于力学效应的高灵敏度微悬臂梁生化传感技术，当其表面发生生物或化学反应时表面应力会发生改变，当这种反应控制在微悬臂梁的单侧表面时，其上下表面会产生一个应力差从而导致微梁的弯曲变形。通过预先在微梁的单侧表面上修饰一层探针分子就可以实现对能与探针分子 发生生物或化学反应的分子进行检测(图1)。这项技术无需使用任何荧光物质、放射性和酶作为反应示踪剂，消除了标记过程的影响，可以实时原位再现生化反应和生物活性变化的反应过程。利用光杠杆原理可以高灵敏度检测出微梁的这种弯曲变形，获得实时原位的探针分子与靶标分子反应过程信息。也可以用微梁共振的动态模式测量靶标分子与探针分子结合后微梁的质量增量引起的共振频率的漂移。传统的微梁传感方法都是利用以上应力模式或者共振模式来实现传感的。
作为一项高灵敏的传感技术，微梁传感虽然在分子检测方面有了很多的研究，但在细胞尺度的研究报道却几乎没有，而细胞对周围基质的作用(力)情况往往能反应细胞内在的一些信息。我们在本发明中提出将这项技术用于细胞的研究。我们在将此方法用于检测细胞是否存在时，发现微梁表面吸附细胞后，除了如预测的会产生应力所引起的静态弯曲和质量增加导致共振频率变化外，还发现了新的实验现象，即微梁的随机涨落会明显增强，而没有吸附细胞的裸梁基本没有什么涨落。因此本发明提出利用微悬臂梁涨落的结果来反应其表面细胞的活性情况。当具有活性的细胞在微梁表面时，其新陈代谢过程释放的能量会引起微悬臂梁的涨落，微梁涨落的幅度反应了细胞的新陈代谢的强弱，而新陈代谢的强弱反应了细胞的活性情况。从而实现对细胞活性的实时在线监测。涨落的幅度反应了细胞活性的大小，通过计算这种涨落的方差或振幅从而可以实现对细胞活性的定量检测。利用这一特性我们就能监测细胞在药物作用下的实时活性变化情况。当在同一个阵列上的不同梁上吸附上不同细胞时，在加入同一种药物时，还可以监测同一种药物对不同细胞活性的影响，从而可以实现高通量的药物筛选。
发明内容
本发明的目的是：提供一种微纳米微悬臂梁，其可用于检测细胞的活性并能模拟人体内部环境实现对能杀灭癌细胞的抗癌药物进行筛选，构建对细胞活性进行实时在线定量监测和对抗癌药物进行高效筛选的传感系统，结果准确可靠、快速便捷、成本低。
当具有活性的细胞在微梁表面时，由于其新陈代谢过程释放的能量会 引起微梁的涨落(图2a)。我们发现，通过检测这种涨落的幅度可以实现对细胞活性的实时检测。我们在利用单梁系统对乳腺癌细胞MCF7的研究中发现：没有细胞的裸梁引起的涨落很小(图2b)，而吸附有活细胞的微梁所产生的涨落明显较大(图2a，图4a)，当细胞由于长时间缺乏营养物质而死亡时，其涨落又明显降低(图4b)。而当细胞由于短时间缺乏营养物质活性有所损失但未死亡时，其引起的涨落比活细胞有所减小，但大于死亡细胞所引起的(图4c)。为了进一步量化细胞活性，我们对涨落曲线的方差进行了分析(图3)。活细胞引起的微梁涨落曲线的方差远远大于没有细胞的裸梁和死亡细胞所引起的，活性有所降低的细胞引起的微梁涨落曲线的方差正好介于活细胞和死亡的细胞之间。利用这一特性可以对细胞的活性进行实时检测，并且可以实现对杀灭癌细胞的药物进行筛选。利用具有多根梁的阵列可以实现对多种细胞活性的检测以及检测不同的细胞在同种药物作用下的情况，从而实现对杀灭癌细胞药物的高通量筛选。
要实现对细胞活性的实时检测和抗癌药物的筛选，本发明的主要技术方案为：
1)细胞在微梁表面的吸附及贴壁
首先对微梁进行预处理，利用APTES或胶原蛋白等增强细胞吸附和贴壁的试剂对微梁进行包被。然后将处理过的微梁浸泡在要检测的细胞悬浮液中，待细胞在重力作用下落在微梁上后再将微梁放在细胞培养箱中培养直至细胞在微梁表面贴壁(如图2a中所示)。
2)细胞活性的实时监测
微梁表面的细胞贴壁后，将微梁固定在微梁传感装置的池子里。加入缓冲液，排除池子里的气泡使其里面充满液体。通过检测微梁尖端反射的激光在光电位置敏感器(PSD)靶面上的位移实现对微梁的涨落进行实时检测(图2c)，从而反应出其上面的细胞活性的变化情况。
3)药物的筛选 
加入不同的药物，监测在不同的药物作用下微悬臂梁涨落的变化情况，实现癌细胞在不同药物作用下的活性变化情况的检测，从而实现对杀灭癌细胞药物的筛选。检测癌变细胞和正常细胞(如乳腺癌细胞MFC7和正常的乳腺细胞)在同一种药物作用下的活性变化情况，筛选出能杀灭癌细胞而对正常细胞杀伤力小的药物。
本发明基于表面应力效应的微悬臂梁传感技术，通过检测细胞引起的微梁涨落大小来实现对细胞活性的检测，其优点有：(1)通过计算细胞引起的涨落曲线的方差可以对细胞的活性进行定量检测；(2)细胞在梁上贴壁后就可以对细胞的活性进行检测，一步完成，操作简单；(3)基于微梁涨落模式检测细胞的活性是基于活细胞对微梁的作用力来实现的，不需要对细胞内部进行颜色标记；(4)微梁的涨落被PSD实时记录下来，从而对细胞活性的检测也是实时的；(5)通过化学物理方法可以除去微梁表面的细胞从而微梁可以恢复到开始使用前的状态，这样微梁可以重复使用，检测的成本和药物筛选的成本低。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.微悬臂梁用于制备用于通过以下方法检测细胞活性的系统的用途：
使所述细胞与微悬臂梁结合；和
测量并计算结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅，从而确定所述细胞的相对活性。
2.根据1所述的方法，其中所述细胞通过以下方式与微悬臂梁结合：用增强细胞吸附和贴壁的试剂包被所述微悬臂梁；将所述包被的微悬臂梁浸泡在所述细胞的悬浮液中；待所述细胞在重力作用下落在所述包被的微悬臂梁上后，再将落有所述细胞的所述微悬臂梁放在细胞培养箱中培养直至所述细胞在所述微悬臂梁表面贴壁。
3.根据1所述的方法，其中通过以下方式测量结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落：将结合有所述细胞的微悬臂梁置于包括激光器和光电位置敏感器的微悬臂梁传感系统中；以及，测量所述微悬臂梁的尖端反射的由所述激光器发出的激光在所述光电位置敏感器靶面上的位移。
4.根据1所述的用途，其中所述增强细胞吸附和贴壁的试剂是3-氨丙基三乙氧基硅烷或胶原蛋白，所述微悬臂梁优选是单侧镀金的氮化硅微悬臂梁。
5.利用微悬臂梁筛选能够减弱癌细胞活性的药物的方法，所述方法包括：
使所述癌细胞与微悬臂梁结合；
用待检测的药物处理结合有所述癌细胞的微悬臂梁；和
测量并计算用所述药物处理的和未用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅，
其中，与未用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁相比，用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅减小指示所述药物能够减弱所述癌细胞的活性。
6.根据5所述的方法，其中所述癌细胞通过以下方式与微悬臂梁结合：用增强细胞吸附和贴壁的试剂包被所述微悬臂梁；将所述包被的微悬臂梁浸泡在所述癌细胞的悬浮液中；待所述癌细胞在重力作用下落在所述包被的微悬臂梁上后，再将落有所述癌细胞的所述微悬臂梁放在细胞培养箱中培养直至所述癌细胞在所述微悬臂梁表面贴壁。
7.根据5所述的方法，其中通过以下方式测量结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落：将结合有所述细胞的微悬臂梁置于包括激光器和光电位置敏感器的微悬臂梁传感系统中；以及，测量所述微悬臂梁的尖端反射的由所述激光器发出的激光在所述光电位置敏感器靶面上的位移。
8.根据5所述的方法，其中所述增强细胞吸附和贴壁的试剂是3-氨丙基三乙氧基硅烷或胶原蛋白，所述微悬臂梁优选是单侧镀金的微悬臂梁，所述癌细胞优选是乳腺癌细胞。
9.细胞活性检测系统，所述系统包括：微悬臂梁，用于包被所述微悬臂梁的增强细胞吸附和贴壁的试剂，和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。
10.抗癌细胞药物筛选系统，所述系统包括：微悬臂梁，用于包被所述微悬臂梁的增强细胞吸附和贴壁的试剂，和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。
11.利用微悬臂梁检测细胞活性的方法，所述方法包括：
使所述细胞与微悬臂梁结合；和
测量并计算结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅，从而确定所述细胞的相对活性。
附图说明
图1.现有技术微悬臂梁传感系统和原理示意图。
图2.基于微梁涨落模式检测细胞活性原理示意图和初步试验结果。(a)：微梁表面细胞贴壁显微照片与微梁涨落曲线；(b)：裸梁照片与其涨落曲线；(c)：微梁传感装置示意图；(d)：微梁表面细胞引起微梁涨落的示意图。
图3.没有吸附细胞、吸附有活细胞、吸附有死亡细胞和吸附有部分活性损失的细胞时微梁涨落曲线的方差。
图4.吸附有活细胞(a)、死亡细胞(b)和有部分活性损失的细胞(c)所引起的微梁涨落曲线。
图5.检测过程中加入不同浓度紫杉醇后微梁的涨落曲线。
图6.检测过程中加入不同浓度紫杉醇后微梁涨落曲线的方差。
图7.细胞培养过程中加入不同浓度紫杉醇后微梁的涨落曲线。
图8.细胞培养过程中加入不同浓度紫杉醇后微梁涨落曲线的方差。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
微悬臂梁(微梁)：典型的微悬臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微悬臂梁(Veeco Instruments)(尺寸：长200um，腿宽20um，厚0.6um)，单侧镀有60nm的金。符合本发明的微悬臂梁包括但不限于：长度：几十微米到几毫米；宽几十微米到几百微米；厚：几十纳米到几十微米。制备微悬臂梁的材料可以是氮化硅、氧化硅等，单面或双面镀有可以反光的材料(如金)。微悬臂梁的形状不限于三角梁以及单梁，还包括矩形以及多根梁构成的阵列梁。
基于表面应力检测的微悬臂梁免疫传感系统：微悬臂梁传感系统主要由激光器、微悬臂梁、光电位置敏感器(PSD)、温度控制装置、蠕动泵、以及数据分析处理装置组成。典型的微悬臂梁检测方法的步骤如下：将微悬臂梁固定到反应池中，以蠕动泵控制流动缓冲液通过反应池，待反应池中气泡排净后以0.1mL/min的速度流动缓冲液通过反应池。反应池的温度控制在37±0.01℃，室温控制在27±0.01℃。激光器发出一束激光照射在微悬臂梁的尖端，经微悬臂梁反射后照在PSD的靶面上。PSD实时记录微悬臂梁的尖端位移。
实施例
实施例1.实时检测细胞的活性和抗癌药物的筛选
试验1.制备具有细胞贴壁的微悬臂梁。
1)清洗：将未经使用的单侧镀金的微悬臂梁(购自美国Veeco公司)取出放入酶标孔板中，加入“Piranha dip”(V(H2O2):V(H2SO4)＝1:3)溶液中浸泡4分钟，后用去离子水浸泡2分钟并清洗3遍，氮气吹干备用；
2)APTES结合到微悬臂梁金表面：将清洗过的微悬臂梁放入酶标板的小孔中，加入200μL用甲醇稀释的10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)(购自美国Sigma公司)溶液，在5到50℃的温度下温育30分钟到3小时，得到修饰有APTES的微悬臂梁；
3)清洗：吸去液体，用镊子小心取出微梁，用去离子水浸泡2分钟并清洗3遍，氮气吹干备用；
4)细胞在梁上的吸附和贴壁：将微悬臂梁放入细胞板中，加入400μL浓度为1×106/ml的乳腺癌MCF-7细胞(购自深圳市百恩维生物科技有限公司)悬浮液，细胞在重力的作用下落在微悬臂梁的表面，将落有细胞的微悬臂梁放入培养箱(37℃，5％CO2)中培养4.5个小时，使细胞在微梁表面充分贴壁。得到修饰有乳腺癌MCF-7细胞的微悬臂梁。
试验2.细胞活性的实时检测
1)清洗微悬臂梁传感系统：用无水乙醇、丙酮和PBS分别先后流经微悬臂梁传感系统，流速0.5mL/min；
2)固定微梁：将经清洗的修饰有细胞的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感系统的反应池中，流动PBS通过反应池子。排除反应池中的气泡后以0.1mL/min流动PBS。
3)调节微梁传感检测光路：调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。通过PSD实时记录微梁尖端涨落信息。通过计算该涨落曲线的方差对细胞的活性进行量化。检测了活性最佳的细胞、缺乏培养基处于饥饿状态以及死亡细胞所引起的微梁涨落曲线(图4)，其中活性最佳细胞：刚从培养箱中取出的细胞，在培养箱中细胞在DMEM的培养基中培养；处于饥饿状态的细胞：是指活性最佳细胞由于在PBS中短时间(6到9小时)培养，由于缺乏营养 物质活性有所损失但未死亡的细胞；死亡细胞：是指长时间(20小时以上)没有培养基情况下而死亡的细胞。计算图4中每条曲线所对应的方差(图3)。方差是各个数据与平均数之差的平方的和的平均数。此处，图4中每个曲线的方差为：微梁的偏移量与微梁偏移量平均值之差的平方和的平均数。处于饥饿状态但未死亡的细胞引起的微梁涨落曲线的方差正好介于活细胞和死亡的细胞之间，说明微梁的涨落这一特征能实现对细胞活性的检测。
试验3.抗癌药物的筛选
在试验2中，当微梁的涨落开始记录30分钟后，加入2mL PBS稀释的抗癌药物紫杉醇(购自美国Sigma公司)。通过PSD实时记录微梁涨落的信息。先后检测细胞在四个浓度(0、1.5、7.5和20μg/mL)的紫杉醇作用下微梁涨落情况(图5)，计算四个涨落曲线的方差(图6)。在不同浓度的紫杉醇作用下，细胞产生不同幅度的涨落，随着紫杉醇浓度的升高，微梁的涨落幅度有所降低，说明紫杉醇对细胞的活性有所影响，并且对细胞的活性有所抑制甚至杀灭细胞。以上结果表明，微梁的涨落可以用来定量检测细胞的活性并可以对抗癌药物进行筛选。
实施例2.检测细胞在药物处理后的活性变化及筛选抗癌药物
试验1.制备吸附有药物处理过的细胞的微悬臂梁
1)清洗：将未经使用的单侧镀金的微悬臂梁(购自美国Veeco公司)取出放入酶标孔板中，加入“Piranha dip”(V(H2O2):V(H2SO4)＝1:3)溶液中浸泡4分钟，后用去离子水浸泡2分钟并清洗3遍，氮气吹干备用；
2)APTES结合到微悬臂梁金表面：将清洗过的微悬臂梁放入酶标板的小孔中，加入200μL用甲醇稀释的10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)(购自美国Sigma公司)溶液，常温下温育1小时，得到修饰有APTES的微悬臂梁；
3)清洗：吸去液体，用镊子小心取出微梁，用去离子水浸泡2分钟并清洗3遍，氮气吹干备用；
4)细胞在梁上的吸附和贴壁：将微悬臂梁放入细胞板中，加入400μL浓度为1×106/ml的乳腺癌MCF-7细胞悬浮液，细胞在重力作用下落在 微悬臂梁的表面。将落有细胞的微悬臂梁放入培养箱(37℃，5％CO2)中培养4.5个小时，使细胞在微梁表面充分贴壁。得到修饰有癌细胞的微悬臂梁。加入PBS稀释的抗癌药物紫杉醇继续培养4小时。
试验2.细胞活性的检测及抗癌药物的筛选
1)清洗微悬臂梁传感系统：用无水乙醇、丙酮和PBS分别先后流经微悬臂梁传感系统，流速0.5mL/min；
2)固定微梁：将经紫杉醇处理过的修饰有细胞的微悬臂梁固定到微悬臂梁传感系统的反应池中，流动PBS通过反应池子。排除反应池中的气泡后以0.1mL/min流动PBS。
3)调节微梁传感检测光路：调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。通过PSD实时记录微梁尖端涨落信息。通过计算该涨落曲线的方差对细胞的活性进行量化。
改变试验1中的紫杉醇浓度，分别为0、0.75、1.5、3.0、4.5和6μg/mL。先后检测细胞在六个浓度的紫杉醇作用下微梁涨落情况(图7)，计算六个涨落曲线的方差(图8)。在不同浓度的紫杉醇作用下，细胞产生不同幅度的涨落，随着紫杉醇浓度的升高，微梁的涨落幅度有所降低，说明紫杉醇对细胞的活性有所影响，并且对细胞的活性有所抑制甚至杀灭细胞。以上结果表明，微梁的涨落可以用来定量检测细胞的活性并可以对抗癌药物进行筛选。
参考文献
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Claims (10)

1.微悬臂梁用于制备用于通过以下方法检测细胞活性的系统的用途：
使所述细胞与微悬臂梁结合；和
测量并计算结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅，从而确定所述细胞的相对活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞通过以下方式与微悬臂梁结合：用增强细胞吸附和贴壁的试剂包被所述微悬臂梁；将所述包被的微悬臂梁浸泡在所述细胞的悬浮液中；待所述细胞在重力作用下落在所述包被的微悬臂梁上后，再将落有所述细胞的所述微悬臂梁放在细胞培养箱中培养直至所述细胞在所述微悬臂梁表面贴壁。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下方式测量结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落：将结合有所述细胞的微悬臂梁置于包括激光器和光电位置敏感器的微悬臂梁传感系统中；以及，测量所述微悬臂梁的尖端反射的由所述激光器发出的激光在所述光电位置敏感器靶面上的位移。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述增强细胞吸附和贴壁的试剂是3-氨丙基三乙氧基硅烷或胶原蛋白，所述微悬臂梁优选是单侧镀金的氮化硅微悬臂梁。
5.利用微悬臂梁筛选能够减弱癌细胞活性的药物的方法，所述方法包括：
使所述癌细胞与微悬臂梁结合；
用待检测的药物处理结合有所述癌细胞的微悬臂梁；和
测量并计算用所述药物处理的和未用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅，
其中，与未用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁相比，用所述药物处理的结合有所述癌细胞的微悬臂梁的涨落曲线的方差或振幅减小指示所述药物能够减弱所述癌细胞的活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌细胞通过以下方式与微悬臂梁结合：用增强细胞吸附和贴壁的试剂包被所述微悬臂梁；将所述包被的微悬臂梁浸泡在所述癌细胞的悬浮液中；待所述癌细胞在重力作用下落在所述包被的微悬臂梁上后，再将落有所述癌细胞的所述微悬臂梁放在细胞培养箱中培养直至所述癌细胞在所述微悬臂梁表面贴壁。
7.根据权利要求5所述的方法，其中通过以下方式测量结合有所述细胞的微悬臂梁的涨落：将结合有所述细胞的微悬臂梁置于包括激光器和光电位置敏感器的微悬臂梁传感系统中；以及，测量所述微悬臂梁的尖端反射的由所述激光器发出的激光在所述光电位置敏感器靶面上的位移。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述增强细胞吸附和贴壁的试剂是3-氨丙基三乙氧基硅烷或胶原蛋白，所述微悬臂梁优选是单侧镀金的微悬臂梁，所述癌细胞优选是乳腺癌细胞。
9.细胞活性检测系统，所述系统包括：微悬臂梁，用于包被所述微悬臂梁的增强细胞吸附和贴壁的试剂，和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。
10.抗癌细胞药物筛选系统，所述系统包括：微悬臂梁，用于包被所述微悬臂梁的增强细胞吸附和贴壁的试剂，和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。
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