CN105695555A - 一种基于微悬臂梁传感技术检测精子活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微悬臂梁传感技术检测精子活力的方法,在利用微悬臂梁检测精子时,吸附了精子的微悬臂梁的随机涨落会明显增强,而没有吸附精子的裸梁基本没有什么涨落,从而利用微悬臂梁涨落的结果来反应微悬臂梁表面精子的活力情况并定量检测。进一步地,利用这一特性还通过监测精子在不同药物作用下的实时活力变化情况,进而实现对增强精子活力药物的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及检测体外精子质量、体外辅助生殖领域,特别涉及一种基于力学效应的纳米微悬臂梁及其在精子活力检测中的应用。
背景技术
辅助生殖是治疗不孕不育的有效方法。第一代试管婴儿技术为体外受精联合胚胎移植技术(IVF),是从妇女卵巢中取出成熟卵子,并与精子在试管中受精生成受精卵,受精卵进一步发育成胚胎后,再将胚胎移植到未来母亲的子宫内,使胚胎在母体子宫内继续发育直至成为成熟胎儿。第二代试管婴儿技术为细胞浆内单精子注射(ICSI)技术,是通过显微操作技术,用微量注射器吸附固定住成熟卵细胞,然后用微量加样器取出经过去尾固定的单个精子,将微量加样器穿透卵膜到达卵细胞质中释放精子实现受精。宫腔内人工授精(IUI)将男性精液用人工方法注入女性子宫颈或宫腔内,以协助受孕。但是这些方法中精子的挑选是人为选择的,具有一定的随机性,因此存在一定的遗传风险。所选精子活力的大小将决定精子质量,精子活力低下严重者会直接导致不育,即便是女性成功受孕,受精卵的质量也会下降,直接导致胚胎发育不良,造成死胎、流产等。因此,需要提出一种能够定量表征精子活力大小的方法。
本世纪初,在原子力显微镜(AFM)和微机电系统(MEMS)基础上发展起来一种基于力学效应的高灵敏度微悬臂梁生化传感技术。当微悬臂梁单侧表面发生生物或化学反应时,其表面应力会发生改变,导致微悬臂梁弯曲变形。通过在微悬臂梁的单侧表面修饰探针分子就能实现对与探针分子发生生化反应的目标分子进行检测(图1)。这项技术无须荧光、放射性物质等作为反应示踪剂,消除标记的影响。另外,利用光杠杆原理等方法,它能够实时测量弯梁弯曲变形,原位再现探针分子和目标分子生化反应过程。微悬臂梁传感技术在分子检测方面已有了很多的研究[1-6]。但作为高灵敏的传感技术,微悬臂梁传感技术在精子方面的研究却极少。本发明提出利用微悬臂梁的涨落来检测精子活力的检测。
发明内容
本发明基于微悬臂梁,提出了一种对精子活力的检测方法,构建对精子活力实时在线定量监测的传感系统,结果可靠准确、快速便捷、成本低。
具体而言,本发明涉及以下方面:
在本发明的第一个方面,提供一种实时检测精子活力的方法,所述方法包括:1)将微悬臂梁进行预处理;2)将预处理后的微悬臂梁浸入含有精子的溶液中;3)实时检测微悬臂梁的涨落;4)根据所述涨落判断精子活力。
在优选的实施方案中,所述预处理是为了使精子结合于微悬臂梁,因此,只要能实现精子结合于微悬臂梁而不影响精子活力的任何预处理方法都可以用于处理微悬臂梁。
在优选的实施方案中,所述微悬臂梁涨落的检测通过监测从微悬臂梁表面反射到光电位置敏感器靶面上的光斑位置变化来进行。
在优选的实施方案中,所述预处理包括将微悬臂梁用APTES修饰和接着用透明质酸溶液处理。
在优选的实施方案中,所述微悬臂梁安装在传感装置的反应池中。对于此种传感装置的反应池,本领域技术人员根据微悬臂梁传感器的基本原理均可以设计和制造。
本发明的第二个方面,提供一种筛选影响精子活力的药物的方法,所述方法包括:1)如本发明第一个方面所述的预处理微悬臂梁;2)将预处理后的微悬臂梁浸入含有精子的溶液中;3)实时检测微悬臂梁的涨落;4)加入候选药物;5)再次实时检测微悬臂梁的涨落,并根据涨落判断精子活力。通过比较步骤3)和步骤5)中微悬臂梁的涨落的差异,判断候选药物是否影响精子活力。
在优选的实施方案中,所述预处理是为了使精子结合于微悬臂梁,因此,只要能实现精子结合于微悬臂梁而不影响精子活力的任何预处理方法都可以用于处理微悬臂梁。
在优选的实施方案中,所述微悬臂梁涨落的检测通过监测从微悬臂梁表面反射到光电位置敏感器靶面上的光斑位置变化来进行。
在优选的实施方案中,所述预处理包括将微悬臂梁用APTES修饰和接着用透明质酸溶液处理。
在优选的实施方案中,所述微悬臂梁安装在传感装置的反应池中。对于此种传感装置的反应池,本领域技术人员根据微悬臂梁传感器的基本原理均可以设计和制造。
本发明的第三个方面涉及微悬臂梁在测量精子活力和/或筛选影响精子活力的药物中的用途。
本发明的第四个方面涉及微悬臂梁在制备测量精子活力和/或筛选影响精子活力的药物的试剂盒中的用途。
具体而言,本发明人在利用微悬臂梁检测精子时,发现吸附了精子的微悬臂梁的随机涨落会明显增强,而没有吸附精子的裸梁基本没有什么涨落。因而可以利用微悬臂梁涨落的结果来反应微悬臂梁表面精子的活力情况。当精子吸附在微悬臂梁表面时,其机械运动将引起微悬臂梁的涨落。涨落的幅度反应了精子活力的强弱,通过计算这种涨落的方差可以实现对精子活力的定量检测。进一步地,利用这一特性我们还能监测精子在不同药物作用下的实时活力变化情况,进而实现对增强精子活力药物的筛选。
本发明基于表面应力效应的微悬臂梁传感技术,通过检测精子引起的微悬臂梁涨落大小来实现对精子活力的检测,其优点包括:(1)通过计算由精子引起的涨落曲线的方差可以定量检测精子的活力大小;(2)微悬臂梁的涨落曲线是实时记录的,因而对精子活力的检测也是实时的;(3)精子吸附在微悬臂梁表面之后就可以直接对精子的活力进行检测,一步完成,操作简单;(4)通过化学物理方法可以除去微悬臂梁表面的精子,使微悬臂梁恢复到初始状态并重复使用,降低检测成本。
附图说明
图1.微悬臂梁传感系统原理示意图。
(a)微悬臂梁传感装置示意图;
(b)微悬臂梁修饰探针分子;
(c)微悬臂梁上的探针分子与样品中的目标分子结合后使得微悬臂梁发生弯曲。
1.反应池;2.激光器;3.光电位置敏感探测器;4.进样口;5.出样口。图2.微悬臂梁检测精子活力。
(a)当微悬臂梁上修饰了具有活力的精子时,微悬臂梁偏移量的涨落比较剧烈;
(b)当微悬臂梁上没有精子时,微悬臂梁偏移量的涨落比较微小;
(c)微悬臂梁传感装置示意图;
(d)微悬臂梁上修饰了精子时,微悬臂梁的运动使得微悬臂梁上下振荡比较剧烈,反映到微悬臂梁偏转曲线上就是涨落比较剧烈。
图3微悬臂梁检测精子的活力。
当微悬臂梁表面分别修饰了具有活力的精子、死亡的精子、无精子时所测得的的微悬臂梁涨落信号,以及当激光在打在基底时测得的涨落信号,其对应方差分别为1009,80.71,33.62,45.7nm2。
图4微悬臂梁检测酒精对精子活力的影响。
(a)修饰了精子的微悬臂梁在未用体积分数为10%酒精处理前的振荡方差为607.1nm2,而在用10%酒精处理前后微悬臂梁的方差降为79.71nm2,说明酒精对精子活力产生了抑制作用,且酒精处理后相对处理前的微悬臂梁振荡方差比例为0.1313(或13.13%);
(b)修饰了精子的微悬臂梁在0.5%,1%,5%,10%体积分数的酒精处理后,其方差相对于处理前的比例分别为0.6910,0.4655,0.3019,0.1313(或69.10%,46.55%,30.19%,13.13%),说明酒精对精子活力的抑制作用随酒精浓度的增加而增强。
图5:微悬臂梁检测精子伟哥对精子活力的影响。对于修饰了精子的微悬臂梁,其初始偏移量的方差为505.7nm2,而在加入含1%精子伟哥的受精培养液后,微悬臂梁偏移量的方差增加到965.6nm2,说明精子伟哥对精子活力起到增强作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例子对本发明在精子活力检测上做进一步说明,但不限制本发明。
要实现对精子活力的实时检测和精子活力增强药物的筛选,本发明的主要技术方案为:
1)精子吸附到微悬臂梁表面
首先对微悬臂梁进行预处理,经过APTES修饰的微悬臂梁放入透明质酸溶液中进行包被。然后将处理过的微悬臂梁安装在传感装置的反应池中,将待检测的精子溶液流入反应池,并排除气泡,使得微悬臂梁浸泡在精子溶液中。等待直至精子在重力作用下落在微悬臂梁上并保持稳定不脱落(如图2a中的插图所示)。
2)精子活力的实时检测
精子吸附在微悬臂梁表面后,调好检测光路。通过监测从微悬臂梁表面反射到光电位置敏感器(PSD)靶面上的光斑位置变化来对微悬臂梁的涨落进行实时检测(图2c),从而得到微悬臂梁表面精子活力情况。
3)药物对精子活力的影响
首先得到加入药物之前微悬臂梁的涨落曲线,然后加入一定浓度的药物,监测在药物作用之后微悬臂梁的涨落曲线,得到相应的精子活力情况。
实施例1实时检测精子的活力和药物对精力活力的影响
试验1制备贴附精子的微悬臂梁。
本过程中微悬臂梁都是放置在孔板(购自美国corning公司)中,并且在每一步后替换新的孔板。
1)清洗:将单侧镀金的微悬臂梁(购自美国Veeco公司)取出放入酶标板的小孔中,加入“Piranhadip”(V(H2O2):V(H2SO4)=1:3,购自北京化学试剂公司)溶液中浸泡10分钟,后用去离子水浸泡2分钟清洗(重复3遍),氮气吹干备用。
2)APTES结合到微悬臂梁表面:将清洗过的微悬臂梁放入板孔中,加入200μL用甲醇(购自北京化学试剂公司)稀释的10%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)(购自美国Sigma公司)溶液,常温下培育1小时,得到修饰有APTES的微悬臂梁;吸去液体,用去离子水浸泡2分钟并清洗3遍,氮气吹干备用。
3)透明质酸结合到微悬臂梁表面:将结合了APTES的微悬臂梁放入新板孔中,加入200μL透明质酸溶液(购自美国阿拉丁工业公司)。
4)微悬臂梁安装在反应池中:分别用无水乙醇、丙酮和PBS(购自北京化学试剂公司)先后流经微悬臂梁传感系统(该系统在参考文献[1]中详细描述,在此通过引用结合于此)以清洗,然后将结合了透明质酸的微悬臂梁安装在传感装置的反应池中。
5)精子吸附到微悬臂梁表面:将溶于受精培养液(购自爱尔兰cookireland公司)中的待检测精子溶液(得自安徽医科大学生殖医学中心)流入反应池,并排除气泡,使得微悬臂梁浸泡在精子溶液中。精子在重力作用下落在微悬臂梁上,等待1小时后微悬臂梁表面吸附的精子保持稳定不脱落。
试验2精子活力的实时检测
1)调节微悬臂梁传感检测光路:调节激光器与PSD(光电位置敏感器)的位置使的激光器发出的激光照在微悬臂梁的尖端并被PSD接收,如图2c所示。通过PSD实时记录微悬臂梁尖端涨落信息。
2)通过计算该涨落曲线的方差对精子的活力进行量化。检测了具有活力的精子、死亡的精子、无精子引起的微悬臂梁涨落曲线,以及激光打在基底上的涨落信号,计算得到涨落曲线对应的方差分别为1009,80.71,33.62,45.7nm2(图3)。活力最佳的精子引起的涨落远远高于其它死亡的精子、无精子引起微悬臂梁涨落,说明微悬臂梁能够用于检测精子活力。
试验3药物(酒精)对精子活力的影响
在试验2中,当微悬臂梁的涨落开始记录1小时后,加入2mL由受精培养液(购自爱尔兰CookIreland公司)稀释的酒精(购自北京化学试剂公司)溶液。通过PSD实时记录微悬臂梁涨落的信息。先后检测精子在四个不同体积浓度(v/v=0.5%,1%,5%,10%的酒精作用下微悬臂梁涨落情况,计算四个涨落曲线的方差,并得到加入酒精后相对初始的方差比例,分别为69.10%,46.55%,30.19%,13.13%(图4)。在加入酒精后,微悬臂梁涨落信号的方差都有所降低。随着酒精浓度的升高,微悬臂梁涨落的幅度降低幅度越大,说明酒精对精子的活力有所影响,并且对精子的活力有所抑制甚至杀灭精子。
试验4药物(精子伟哥)对精子活力的影响
同样地,在试验2中,当微悬臂梁的涨落开始记录1小时后,加入2mL由受精培养液稀释的精子伟哥溶液(购自爱尔兰CookIreland公司)。通过PSD实时记录微悬臂梁涨落的信息。检测精子在1%体积浓度的精子伟哥作用下微悬臂梁涨落情况,计算涨落曲线的方差(图5)。在精子伟哥下,微悬臂梁的涨落幅度相对未加入伟哥前有所升高,说明精子伟哥对精子的活力有所影响,并且对精子的活力能够明显增强。
参考文献:
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Claims (10)
1.一种实时检测精子活力的方法,所述方法包括:1)将微悬臂梁进行预处理;2)将预处理后的微悬臂梁浸入含有精子的溶液中;3)实时检测微悬臂梁的涨落;4)根据所述涨落判断精子活力。
2.根据权利要求1所述的方法,所述预处理包括将微悬臂梁用APTES修饰和接着用透明质酸溶液处理。
3.根据权利要求1所述的方法,步骤3)中对微悬臂梁涨落的检测通过监测从微悬臂梁表面反射到光电位置敏感器靶面上的光斑位置变化来进行。
4.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括物理化学处理以除去微悬臂梁表面的精子,使微悬臂梁恢复到初始状态的步骤。
5.一种筛选影响精子活力的药物的方法,所述方法包括:1)预处理微悬臂梁;2)将预处理后的微悬臂梁浸入含有精子的溶液中,3)检测微悬臂梁的涨落;4)加入候选药物;5)再次实时检测微悬臂梁的涨落;并根据涨落判断精子活力。
6.根据权利要求4所述的方法,所述预处理包括将微悬臂梁用APTES修饰和接着用透明质酸溶液处理。
7.根据权利要求4所述的方法,所述药物增加或减小精子活力。
8.根据权利要求4所述的方法,所述方法还包括物理化学处理以除去微悬臂梁表面的精子,使微悬臂梁恢复到初始状态的步骤。
9.微悬臂梁在测量精子活力和/或筛选影响精子活力的药物中的用途。
10.微悬臂梁在制备测量精子活力和/或筛选影响精子活力的药物的试剂盒中的用途。
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