CN114397458A - 一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒 - Google Patents

一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，包括检测板、ID芯片、样本稀释液；所述检测板包括密封扣合的上盖和下盖，所述上盖上设有加样孔和检测窗，所述下盖上设有卡槽，所述卡槽内放置有试纸条，所述试纸条包括PVC板条，所述PVC板条上设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜远离所述加样孔的一端设有吸水纸，所述硝酸纤维素膜的另一端设有结合垫，所述结合垫的自由端设有加样垫，所述加样孔与所述加样垫的位置相对应；本发明采用了生物素‑亲和素放大系统、双抗体夹心法工艺，以快速、准确、高灵敏度的定量检测肺炎支原体抗原，解决肺炎支原体抗原定量检测免疫荧光层析法POCT试剂盒的空缺，使操作更加简便快速，适应用于门诊和急诊检测。

Description

一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒
技术领域
本发明涉及一种用于肺炎支原体抗原检测的检测装置。
具体地说，是涉及一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒。
背景技术
肺炎支原体（M.Pneumonia）属于柔膜体纲，支原体属，是能够进行自我复制的、有能力在体外不依靠活体细胞而生存的最小微生物，含DNA和RNA，无细胞壁，仅有细胞膜，革兰染色阴性。因无细胞壁，肺炎支原体呈多形性。肺炎支原体经飞沫传播，潜伏期及病程较长，主要的易感对象为儿童和婴幼儿。病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，临床症状有头疼、发热、咽喉疼痛，最典型的为阵发性刺激性咳嗽。
肺炎支原体的致病首先通过其顶端结构黏附细胞器粘附在宿主细胞表面，肺炎支原体的P1蛋白是MP的膜蛋白，肺炎支原体的主要黏附素。缺乏肺炎支原体的P1蛋白或肺炎支原体的P1蛋白不能密集在顶器细胞表面或非定居顶器表面的合适位置，肺炎支原体就不能粘附于呼吸道上皮，也无毒力。肺炎支原体的P1蛋白不仅在介导MP粘附于宿主细胞的过程中起作用，其本身也是一种免疫原，能刺激机体产生强烈的免疫应答，产生特异性的抗体。因此特异性检测肺炎支原体的肺炎支原体的P1蛋白可有效检测出肺炎支原体感染。本品即利用高特异性地识别肺炎支原体的肺炎支原体的P1蛋白单克隆抗体检测肺炎支原体抗原。
由于支原体培养的困难，临床上常用的肺炎支原体的检测主要是血清学检测。人在初次感染肺炎支原体时，会先后产生的IgM抗体和IgG抗体，由于抗体持续在体内存在，因此血清学检测不适用于早期诊断，可作为回顾性诊断。用分离培养和检测抗体的方法均不能达到早期诊断的目的。而抗原检测可做到早期快速诊断，即检测痰、咽拭子、支气管灌洗液中的肺炎支原体抗原。目前已使用的方法有ELISA、聚合酶链反应（PCR）法和胶体金法。由于条件所限，国内目前还未全面普及。尤其是PCR检测法由于存在试剂问题、污染问题，因此在结果判断上一定要慎重。肺炎支原体抗原仅存在于咽喉、痰液、支气管中，这些位置的样本干扰物质较多，且肺炎支原体含量较低，常规胶体金法很难检测到。
发明内容
本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒。
本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，包括检测板、ID芯片、样本稀释液；所述检测板包括密封扣合的上盖和下盖，所述上盖上设有加样孔和检测窗，所述下盖上设有卡槽，所述卡槽内放置有试纸条，其特征在于：所述试纸条包括PVC板条，所述PVC板条上设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的位置与所述检测窗的位置相对应，所述硝酸纤维素膜远离所述加样孔的一端设有吸水纸，所述硝酸纤维素膜的另一端设有结合垫，所述结合垫的自由端设有加样垫，所述加样孔与所述加样垫的位置相对应。
作为一种改进，所述硝酸纤维素膜上包被有抗原检测线、质控检测线；所述抗原检测线处喷涂有肺炎支原体单克隆抗体P2；所述质控检测线处喷涂有羊抗鼠抗体IgG。
作为进一步的改进，将肺炎支原体单克隆抗体P2用磷酸盐缓冲液PBS稀释到0.5mg/mL，以1.0 μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处；
用磷酸盐缓冲液PBS将羊抗鼠抗体IgG稀释到1.0 mg/mL，以1.0 μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。
作为进一步的改进，所述抗原检测线距离所述硝酸纤维素膜靠近所述吸水纸的一端13 mm，宽度0.5 mm；所述质控检测线距离所述硝酸纤维素膜靠近所述吸水纸的一端9mm，宽度0.5 mm。
作为进一步的改进，所述结合垫的包被方法如下：
将生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1和荧光标记的亲和素按照0.01：0.025的比例用结合垫抗体固相液稀释混匀，以9.0 μL/cm的喷量喷涂于用结合垫处理液处理好的结合垫上，放在37 ℃、湿度小于40%的环境下平衡2 h。
作为进一步的改进，所述结合垫处理液包括以下组分：
10 mmol/L 磷酸盐缓冲液；2 g牛血清白蛋白；2 g聚乙烯吡咯烷酮；0.05 mL吐温；
所述结合垫处理液的处理方法如下：
结合垫用结合垫处理液浸泡30 min后，放在37 ℃、湿度小于40%的环境下烘干。
作为进一步的改进，所述结合垫抗体固相液包括以下组分：
10 mmol/L 磷酸盐缓冲液；0.9 g氯化钠；2 g牛血清白蛋白；0.3 g酪蛋白；3 g蔗糖；3 g海藻糖。
作为进一步的改进，所述生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1的标记方法如下：
用10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS将肺炎支原体单克隆抗体P1稀释到终浓度为5mg/mL；用纯水配制NaHCO3，浓度为1 mol/L，向稀释后的肺炎支原体单克隆抗体P1中加入终浓度为2 mol/L的NaHCO3，剩余体积用磷酸盐缓冲液PBS补齐，加入终浓度为为2 mmol/L的生物素，混匀，启动微量振荡器，避光、室温标记反应30 min，反应完成后在10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS中透析12 h以上，既得标记好的生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1。
作为进一步的改进，荧光标记的亲和素的标记方法如下：
用磷酸盐缓冲液PBS将亲和素稀释到终浓度为5 mg/mL；用纯水配制NaHCO3，浓度为1 mol/L，向稀释后的亲和素中加入终浓度为1 mol/L的NaHCO3，剩余体积用磷酸盐缓冲液PBS补齐，加入浓度为2 mmol/L的荧光素，混匀，启动微量振荡器，避光、室温标记反应60min，反应完成后在10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS中透析12 h以上，既得标记好的荧光标记的亲和素。
作为进一步的改进，样本稀释液的配制方法为：将60.5 mg Tris、0.9 g的氯化钠、3 g的酪蛋白溶于100 mL蒸馏水中，再加入0.1 mL吐温、0.1 mL PC300混匀，过滤后分装。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：
第一：本发明采用了生物素-亲和素放大系统、双抗体夹心法工艺，以快速、准确、高灵敏度的定量检测肺炎支原体抗原，解决肺炎支原体抗原定量检测免疫荧光层析法POCT试剂盒的空缺，使操作更加简便快速，适应用于门诊和急诊检测；
第二：本发明提供了一种生物素-亲和素放大系统荧光抗体标记工艺，解决微量抗原难检测问题，提升检测灵敏度；
第三：本发明提供了一种双抗体夹心法检测工艺，提升检测系统特异性，做到检测定量、准确；
第四：本发明提供了一种样本稀释液，排除咽拭子样本上的干扰物质，样本稀释液处理咽拭子样本后可直接加样，简化操作步骤，适用快速检测；
第五：本发明提供了一种结合垫处理和固相的方法，解决样本释放和检测重复性问题；
第六：本发明成本低，检测板易于组装，便于存储和运输。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
附图1是本发明所述上盖的结构示意图；
附图2是本发明所述下盖的结构示意图；
附图3是本发明所述试纸条结构示意图；
附图4是本发明所述试纸条爆炸结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
实施例：一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，包括检测板、ID芯片、样本稀释液。如附图1和附图2所示，所述检测板包括密封扣合的上盖1和下盖2，所述上盖1上设有加样孔11和检测窗12，所述下盖2上设有卡槽21，所述卡槽21内放置有试纸条3。
如附图3和附图4所示，所述试纸条3包括PVC板条31，所述PVC板条31上设有硝酸纤维素膜32，所述硝酸纤维素膜32上包被有抗原检测线36、质控检测线37，所述检测窗12的位置与所述硝酸纤维素膜32上所述抗原检测线36和所述质控检测线37的位置相对应，所述硝酸纤维素膜32远离所述加样孔11的一端设有吸水纸33，所述硝酸纤维素膜32的另一端设有结合垫34，所述结合垫34的自由端设有加样垫35，所述加样孔11与所述加样垫35的位置相对应；所述结合垫34需要避光，因此被所述上盖1所遮挡。所述硝酸纤维素膜32与所述吸水纸33重叠1 mm，所述硝酸纤维素膜32与所述结合垫34重叠1 mm，所述结合垫34与所述加样垫35重叠1 mm，所述抗原检测线36距离所述硝酸纤维素膜32靠近所述吸水纸33的一端13mm，宽度0.5 mm；所述质控检测线37距离所述硝酸纤维素膜32靠近所述吸水纸33的一端9mm，宽度0.5 mm。
所述抗原检测线36处喷涂有肺炎支原体单克隆抗体P2；将肺炎支原体单克隆抗体P2用磷酸盐缓冲液PBS稀释到0.5 mg/mL，以1.0 μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜32相应的抗原检测线36处。
所述质控检测线37处喷涂有羊抗鼠抗体IgG；用磷酸盐缓冲液PBS将羊抗鼠抗体IgG稀释到1.0 mg/mL，以1.0 μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜32相应的质控检测线37处。
硝酸纤维素膜32的干燥处理：喷涂完抗原检测线36和质控检测线37后，将硝酸纤维素膜32放在37℃、湿度小于40%的环境下平衡2 h。
所述结合垫34的包被方法如下：
将生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1和荧光标记的亲和素按照0.01：0.025的比例用结合垫34抗体固相液稀释混匀，以9.0 μL/cm的喷量喷涂于用结合垫34处理液处理好的结合垫34上，放在37 ℃、湿度小于40%的环境下平衡2 h。
所述结合垫处理液的配制：10 mmol/L PBS、2 g的牛血清白蛋白（BSA）、2 g的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于100 mL蒸馏水中，再加入0.05 mL的吐温混匀，过滤，装入广口瓶备用。
结合垫处理液的处理方法：结合垫34用结合垫处理液浸泡30 min后，放在37 ℃、湿度小于40%的环境下烘干。
所述结合垫固相液的配制：10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS（PH 7.4）、0.9 g氯化钠；2 g牛血清白蛋白；0.3 g酪蛋白；3 g蔗糖；3 g海藻糖溶于100 mL蒸馏水中，混匀，装入广口瓶备用。
所述生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1的标记方法如下：
用10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS将肺炎支原体单克隆抗体P1稀释到终浓度为5mg/mL；用纯水配制NaHCO3，浓度为1 mol/L，向稀释后的肺炎支原体单克隆抗体P1中加入浓度为2 mol/L的NaHCO3，剩余体积用磷酸盐缓冲液PBS补齐，加入浓度为2 mmol/L的生物素，混匀，启动微量振荡器，避光、室温标记反应30 min，反应完成后在10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS中透析12 h以上，既得标记好的生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1。
荧光标记的亲和素的标记方法如下：
用磷酸盐缓冲液PBS将亲和素稀释到浓度为5 mg/mL；用纯水配制NaHCO3，浓度为1mol/L，向稀释后的亲和素种加入浓度为1 mol/L的NaHCO3，剩余体积用磷酸盐缓冲液PBS补齐，加入浓度为2 mmol/L的荧光素，混匀，启动微量振荡器，避光、室温标记反应60 min，反应完成后在10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS中透析12 h以上，既得标记好的荧光标记的亲和素。
样本稀释液的配制方法为：将60.5 mg Tris、0.9 g的氯化钠、3 g的酪蛋白溶于100 mL蒸馏水中，再加入0.1 mL吐温、0.1 mL PC300混匀，过滤后分装。
本发明的检测方法为：
在实际操作检测过程中，咽拭子加入到含样本稀释液的提取管中，可得到待测样本液，吸取100 μL待测样本液加入到加样孔11中，待检样本中的肺炎支原体（MP）抗原与生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1和荧光标记的亲和素复合物结合，经过所述结合垫34的层析作用下，与抗原检测线36处包被的肺炎支原体单克隆抗体P2结合，形成荧光复合物。亲和素-荧光和生物素-抗体形成的复合物继续迁移至质控检测线37处时，与羊抗鼠抗体结合，形成荧光复合物；通过荧光免疫分析仪分析，l0 min 仪器检测结果，检测肺炎支原体（MP）抗原的相对含量，根据仪器显示的数值直接判断结果。
本发明的稳定性考察：
本发明的储存温度及有效期：本发明于2~30℃保存，有效期24个月。
室温20～30℃条件下，湿度60%及以下，开封1小时内使用，湿度60%以上开封即用。
将本发明所述检测板37℃进行破坏性试验，考察周期6个月，所需测试时间：1天、3天、7天、14天、21天、1个月、2个月、4个月、6个月。
（1）外观
检测板无破损、完整、无毛刺，材料附着牢固。
（2）性能指标
阴性质控品符合率：用10份阴性质控品检测，检测结果如表1所示，全部呈阴性，且试剂盒的准确度均满足要求。
阳性质控品符合率：用10份阳性（包括强、中、弱阳性）质控品检测，检测结果如表2所示，全部呈阳性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（3）重复性
阴性参考品、阳性参考品检测时间6个月结果变异系数应均不大15.0%。
本发明稳定性考察结果如下：
表1 检测板37℃破坏后阴性质控品检测结果
Figure 243160DEST_PATH_IMAGE002
表2 检测板37℃破坏后阳性质控品检测结果
Figure 488197DEST_PATH_IMAGE004
阴性质控品、阳性质控品检测结果变异系数均小于15%，稳定性符合标准。根据阿伦尼乌斯公式，化学反应速率常数( k )对温度( T )的依赖关系经验公式：E a ：表观活化能，约等于19.5 Kcal/mol；R：摩尔气体常量。变化趋势：T增大，一般k也增大。根据公式计算出对应的温度与老化天数关系。 37℃破坏6个月无问题，相当于常温下可保存2年，符合试剂盒要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，包括检测板、ID芯片、样本稀释液；所述检测板包括密封扣合的上盖和下盖，所述上盖上设有加样孔和检测窗，所述下盖上设有卡槽，所述卡槽内放置有试纸条，其特征在于：所述试纸条包括PVC板条，所述PVC板条上设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的位置与所述检测窗的位置相对应，所述硝酸纤维素膜远离所述加样孔的一端设有吸水纸，所述硝酸纤维素膜的另一端设有结合垫，所述结合垫的自由端设有加样垫，所述加样孔与所述加样垫的位置相对应。
2.如权利要求1所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被有抗原检测线、质控检测线；所述抗原检测线处喷涂有肺炎支原体单克隆抗体P2；所述质控检测线处喷涂有羊抗鼠抗体IgG。
3.如权利要求2所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：
将肺炎支原体单克隆抗体P2用磷酸盐缓冲液PBS稀释到0.5 mg/mL，以1.0 μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处；
用磷酸盐缓冲液PBS将羊抗鼠抗体IgG稀释到1.0 mg/mL，以1.0 μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。
4.如权利要求2所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：所述抗原检测线距离所述硝酸纤维素膜靠近所述吸水纸的一端13 mm，宽度0.5 mm；所述质控检测线距离所述硝酸纤维素膜靠近所述吸水纸的一端9 mm，宽度0.5 mm。
5.如权利要求1所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：所述结合垫的包被方法如下：
将生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1和荧光标记的亲和素按照0.01：0.025的比例用结合垫抗体固相液稀释混匀，以9.0 μL/cm的喷量喷涂于用结合垫处理液处理好的结合垫上，放在37 ℃、湿度小于40%的环境下平衡2 h。
6.如权利要求5所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：
所述结合垫处理液包括以下组分：
10 mmol/L 磷酸盐缓冲液；2 g牛血清白蛋白；2 g聚乙烯吡咯烷酮；0.05 mL吐温；
所述结合垫处理液的处理方法如下：
结合垫用结合垫处理液浸泡30 min后，放在37 ℃、湿度小于40%的环境下烘干。
7.如权利要求5所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：
所述结合垫抗体固相液包括以下组分：
10 mmol/L 磷酸盐缓冲液；0.9 g氯化钠；2 g牛血清白蛋白；0.3 g酪蛋白；3 g蔗糖；3g海藻糖。
8.如权利要求5所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：
所述生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1的标记方法如下：
用10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS将肺炎支原体单克隆抗体P1稀释到终浓度为5 mg/mL；用纯水配制NaHCO3，浓度为1 mol/L，向稀释后的肺炎支原体单克隆抗体P1中加入终浓度为2 mol/L的NaHCO3，剩余体积用磷酸盐缓冲液PBS补齐，加入终浓度为为2 mmol/L的生物素，混匀，启动微量振荡器，避光、室温标记反应30 min，反应完成后在10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS中透析12 h以上，既得标记好的生物素标记的肺炎支原体单克隆抗体P1。
9.如权利要求5所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：
荧光标记的亲和素的标记方法如下：
用磷酸盐缓冲液PBS将亲和素稀释到终浓度为5 mg/mL；用纯水配制NaHCO3，浓度为1mol/L，向稀释后的亲和素中加入终浓度为1 mol/L的NaHCO3，剩余体积用磷酸盐缓冲液PBS补齐，加入浓度为2 mmol/L的荧光素，混匀，启动微量振荡器，避光、室温标记反应60 min，反应完成后在10 mmol/L 磷酸盐缓冲液PBS中透析12 h以上，既得标记好的荧光标记的亲和素。
10.如权利要求1所述的一种用于肺炎支原体抗原检测的检测盒，其特征在于：样本稀释液的配制方法为：将60.5 mg的 Tris、0.9 g的氯化钠、3 g的酪蛋白溶于100 mL蒸馏水中，再加入0.1 mL吐温、0.1 mL PC300混匀，过滤后分装。
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CN116068207A (zh) * 2023-03-24 2023-05-05 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种用于检测nk细胞活性的试剂盒

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