CN111896730A - 一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(hbp)检测试剂盒 - Google Patents
一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(hbp)检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,包括试剂条,所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫,所述吸水纸位于硝酸纤维素膜的一端,所述样品垫位于硝酸纤维素膜的另一端,所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控C线、检测T线和荧光抗体固相线;采用了新式荧光标记工艺、样品垫处理液及荧光标记物的固相化工艺,以快速、准确、高灵敏度的定量检测人血浆中的肝素结合蛋白HBP,解决了标记的荧光物质不稳定问题,不利于后期工艺控制的问题;同时将荧光抗体固相于硝酸纤维素膜,而不是设立专门荧光结合垫,在拓宽了试剂盒储存条件的基础上,并显著提高了精密度。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断免疫学测定分析领域,具体的说,涉及一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒。
背景技术
肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)也被称为azurocidin或者CAP37,是中性粒细胞来源的颗粒蛋白,HBP的趋化活性、杀菌能力以及肝素结合能力都与其自身带有较强的正电荷有关,HBP作为一种趋化物质,可以激活单核细胞和巨噬细胞,诱发血管渗漏和组织水肿,体外能诱导Ca2+依赖的细胞骨架重排以及单层内皮细胞间隙的形成。HBP能增加血管内皮细胞通透性是因为HBP带有较强的正电荷,与内皮细胞接触导致内皮细胞胞内Ca2+快速激活,形成肌动蛋白张力纤维,从而导致细胞旁通路渗漏。HBP的浓度过高会导致严重的血管渗漏,从而引起低血压甚至休克,除此之外,HBP还与软组织感染等多种感染有关,这表明HBP与严重的细菌感染有紧密的关系,极有可能成为临床诊断指标和药物治疗靶标。
脓毒症是一类严重威胁人类健康的疾病,是导致危重症患者死亡的主要原因,该类患者初期症状缺乏特异性,有20%-30%的重度脓毒症患者入院时并没有表现出器官功能障碍的症状,导致延迟诊断和治疗,如何及早地采取合理的应对措施是成功治愈脓毒症的关键。《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2014)》指出肝素结合蛋白(HBP)可作为脓毒症的早期诊断标志物。
HBP与其他传统炎症指标相比,除了具有灵敏度高、特异性强、阳性/阴性检出率高等优点,其还具有出现早,只在急性细菌感染时浓度极度升高,在病毒感染和非特异性炎症时却保持较低的水平等特点,因此HBP明显优于PCT、CRP、IL-6等传统炎症指标。
目前,市面出现的检测方法学主要有ELISA法、胶体金免疫层析法、免疫荧光层析法等方法。ELISA方法存在操作复杂、耗时长等缺点,并且不能进行床旁检测;胶体金免疫层析法具有准确性和稳定性不高的局限性,目前市面上的免疫荧光层析法主要应用荧光物质进行标记,并以液态形式存在于试剂盒中,具有储存条件苛刻,操作步骤复杂,试剂不稳定的风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足,提供一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,该试剂盒采用荧光物质进行标记,并且将抗体固相在硝酸纤维素膜上而不是固相于独立的结合垫上,降低了生产成本,同时避免了抗体缓冲液的不稳定性;同时,直接添加样本进行检测,使操作步骤更加简便,避免出现操作误差。
为了解决以上技术问题,本发明采用的技术方案如下:一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,包括试剂条,所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫,所述吸水纸位于硝酸纤维素膜的一端,所述样品垫位于硝酸纤维素膜的另一端,所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控C线、检测T线和荧光抗体固相线。
作为上述技术方案的进一步改进:所述质控C线包被有羊抗鼠抗体,浓度为0.1-3mg/ml,所述检测T线包被有鼠抗人HBP单克隆抗体,浓度为0.1-3mg/ml。
作为上述技术方案的进一步改进:所述荧光抗体固相线包被有固相液以及荧光物质标记的1-5mg/ml的鼠抗人肝素结合蛋白抗体。
作为上述技术方案的进一步改进:所述荧光物质标记工艺包括以下步骤:
(1)、抗体的准备:每50ul体系中,准备0.2mg鼠抗人肝素结合蛋白抗体,获取所需抗体量放于室温平衡20min;
(2)、荧光素的准备,荧光素用DMSO溶解至1umol/L备用;
(3)、标记,将每50ul体系中加入2ul荧光素的比列进行配比,加入到备好的的蛋白液中,搅拌混匀,剩余体积用pH9.5碳酸氢钠补足,反应2h;
(4)、透析,标记完成抗体,用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍,在PBS缓冲液中透析12小时以上既得标记好的荧光抗体。
作为上述技术方案的进一步改进:所述荧光抗体固相线为标记好的荧光抗体经固相液处理后固相于硝酸纤维素膜的末端,所述荧光抗体固相线位于硝酸纤维素膜与样品垫交接的2-4mm处。
作为上述技术方案的进一步改进:所述固相液中含有能有效保护荧光标记物抗体活性的蛋白、高浓度的增加标记抗体活性的糖类、便于标记物质在硝酸纤维素膜上释放的大分子聚合物和便于标记物质快速复溶的表面活性剂;所述蛋白为酪蛋白和BSA,所述糖类为海藻糖、蔗糖、葡聚糖,所述大分子聚合物为PVP、PVA,所述表面活性剂为曲拉通、吐温。
作为上述技术方案的进一步改进:所述蛋白浓度为0.05%-10%;所述糖类浓度为0.5%-10%;所述大分子聚合物浓度为0.1%-10%;所述表面活性剂浓度为0.01%-5%。
作为上述技术方案的进一步改进:所述荧光抗体固相工艺包括以下步骤:
(1)、将标记好的荧光抗体,用固相液稀释到20倍;
(2)、按照2.5ul/cm的量划膜于硝酸纤维素膜的末端与样品垫交接的2-4mm处即可,划完后烘箱烘30min。
作为上述技术方案的进一步改进:所述标记反应过程中增加碱性条件,所述标记透析过程中加入大分子物质PEG20000以及蛋白,所述的碱性条件为pH为8-10;所述的大分子物质PEG20000浓度为0.01%-5%;所述的蛋白为酪蛋白、BSA、明胶,浓度为0.1%-5%。
作为上述技术方案的进一步改进:所述样品垫需经处理液处理,所述处理液中含有非离子表面活性剂曲拉通、吐温和蛋白质明胶,所述处理液所选的缓冲系统为10-50mMPB;所述表面活性剂的浓度为0.01%-0.5%;所述蛋白质明胶的浓度为0.1%-1%,样品垫处方法为将玻纤放于10-50m MPB、0.01%-0.5%吐温、0.1%-1%明胶预处理液中,浸泡30min,烘箱烘4小时,存放备用。
本发明采取以上技术方案,具有以下优点:
1、本发明提供了一种快速、准确、干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,采用了新式荧光标记工艺、样品垫处理液及荧光标记物的固相化工艺,以快速、准确、高灵敏度的定量检测人血浆中的肝素结合蛋白HBP,解决了标记的荧光物质不稳定问题,不利于后期工艺控制的问题;同时将荧光抗体固相于硝酸纤维素膜,而不是设立专门荧光结合垫,在拓宽了试剂盒储存条件的基础上,并显著提高了精密度;特殊样品垫处理液让试剂盒可直接加入样本而无需经样本液稀释,使操作更加简便快速。
2、本发明的试剂盒成本低,直接加入样本即可进行检测,操作步骤简便,易于组装。
3、本发明提供了一种荧光标记工艺,解决标记的荧光物质不稳定问题,利于后期工艺控制。
4、本发明提供了一种荧光标记固相液,并把荧光标记物固相在硝酸纤维素膜极大提高了精密度;解决了荧光标记物和试剂盒储存条件不一致的困难,同时大大简化了组装工艺,降低了生产成本及时间。
5、本发明提供了一种样品垫处理液,样品垫经过处理液处理后可以让试剂盒可直接加入样本而无需经样本处理,使操作更加简便快速,做到了真正的POCT检测,很适应用于门诊和急诊检测。
下面结合实施例盒附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒的结构示意图。
图2为图1的俯视图。
图3为图1中试剂条的俯视图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:
如图1、图2和图3所示,一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,包括下盖上盖2和试剂条,下盖1和上盖2相互卡扣连接,下盖1和上盖2之间形成容纳腔,试剂条位于容纳腔内,上盖2上设置有加样孔9和检测窗口10,所述试剂条包括吸水纸5、硝酸纤维素膜4和样品垫3,所述吸水纸5位于硝酸纤维素膜4的一端,所述样品垫3位于硝酸纤维素膜4的另一端,所述硝酸纤维素膜4上依次包被有质控C线8、检测T线7和荧光抗体固相线6,加样孔9与样品垫3相对应,所述检测窗口10的位置对应检测T线7和质控C线8的位置,使检测T线7和质控C线8位于检测窗口10中。将待测样本直接加入到试剂条加样孔9后,在层析作用下迁移至检测T线7处时,被硝酸纤维素膜4上配对抗体所捕获形成复合物,复合物的荧光抗体信号与HBP浓度成正比,经荧光分析仪分析后可计算出样本中HBP抗原的浓度。
所述质控C线8包被有羊抗鼠抗体,浓度为0.5mg/ml,所述检测T线7包被有鼠抗人HBP单克隆抗体,浓度为1.5mg/ml。
将0.5mg/ml的羊抗鼠抗体和1.5mg/ml HBP单克隆抗体分别划于硝酸纤维素膜4上,37度烘30min备用。
所述荧光抗体固相线6包被有固相液以及荧光物质标记的1mg/ml的鼠抗人肝素结合蛋白抗体。
所述荧光物质标记工艺包括以下步骤:
(1)、抗体的准备:每50ul体系中,准备0.2mg鼠抗人肝素结合蛋白抗体,获取所需抗体量放于室温平衡20min。
(2)、荧光素的准备,荧光素用DMSO溶解至1umol/L备用。
(3)、标记,将每50ul体系中加入2ul荧光素的比列进行配比,加入到备好的的蛋白液中,搅拌混匀,剩余体积用pH9.5碳酸氢钠补足,反应2h。
(4)、透析,标记完成抗体,用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍,在PBS缓冲液中透析12小时以上既得标记好的荧光抗体。
所述荧光抗体固相工艺包括以下步骤:
(1)、将标记好的荧光抗体,用固相液稀释到20倍,固相液为50mMPB、0.3%酪蛋白、0.5%BSA、3%海藻糖、0.5%PVP、0.2%PVA、0.05%曲拉通。
(2)、按照2.5ul/cm的量划膜于硝酸纤维素膜的末端与样品垫交接的2mm处即可,划完后烘箱烘30min。
所述样品垫3需经处理液处理,所述处理液中含有非离子表面活性剂曲拉通、蛋白质明胶,所述处理液所选的缓冲系统为10mM PB;所述表面活性剂的浓度为0.5%;所述蛋白质明胶的浓度为0.5%,样品垫处理方法为将玻纤放于10mMPB、0.5%吐温、0.5%明胶预处理液中,浸泡30min,烘箱烘4小时,存放备用。
将样品垫、硝酸纤维素膜4、吸水纸依次粘贴于PVC板上,组装成试纸条,然后和卡扣板块壳组装成试剂检测卡。
试剂盒的使用方法,具体操作步骤为:
Ⅰ、仪器读取产品配套的芯片信息。
Ⅱ、取75ul样本直接加入到检测卡加样孔9中,反应18min后,插入到荧光免疫定量分析仪中读取结果。
实施例2:
如图1、图2和图3所示,一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,包括下盖上盖2和试剂条,下盖1和上盖2相互卡扣连接,下盖1和上盖2之间形成容纳腔,试剂条位于容纳腔内,上盖2上设置有加样孔9和检测窗口10,所述试剂条包括吸水纸5、硝酸纤维素膜4和样品垫3,所述吸水纸5位于硝酸纤维素膜4的一端,所述样品垫3位于硝酸纤维素膜4的另一端,所述硝酸纤维素膜4上依次包被有质控C线8、检测T线7和荧光抗体固相线6,加样孔9与样品垫3相对应,所述检测窗口10的位置对应检测T线7和质控C线8的位置,使检测T线7和质控C线8位于检测窗口10中。将待测样本直接加入到试剂条加样孔9后,在层析作用下迁移至检测T线7处时,被硝酸纤维素膜4上配对抗体所捕获形成复合物,复合物的荧光抗体信号与HBP浓度成正比,经荧光分析仪分析后可计算出样本中HBP抗原的浓度。
所述质控C线8包被有羊抗鼠抗体,浓度为1.5mg/ml,所述检测T线7包被有鼠抗人HBP单克隆抗体,浓度为3mg/ml。
将1.5mg/ml的羊抗鼠抗体和3mg/ml HBP单克隆抗体分别划于硝酸纤维素膜4上,37度烘30min备用。
所述荧光抗体固相线6包被有固相液以及荧光物质标记的2mg/ml的鼠抗人肝素结合蛋白抗体。
所述荧光物质标记工艺包括以下步骤:
(1)、抗体的准备:每50ul体系中,准备0.2mg鼠抗人肝素结合蛋白抗体,获取所需抗体量放于室温平衡20min。
(2)、荧光素的准备,荧光素用DMSO溶解至1umol/L备用。
(3)、标记,将每50ul体系中加入2ul荧光素的比列进行配比,加入到备好的的蛋白液中,搅拌混匀,剩余体积用pH9.5碳酸氢钠补足,反应2h。
(4)、透析,标记完成抗体,用透析液PBS、5%BSA、0.1%PEG、8%海藻糖稀释十倍,在PBS缓冲液中透析12小时以上既得标记好的荧光抗体。
所述荧光抗体固相工艺包括以下步骤:
(1)、将标记好的荧光抗体,用固相液稀释到10倍,固相液为50mMPB、0.2%酪蛋白、0. 5%BSA、5%海藻糖、0.1%PVP、0.5%PVA、0.5%曲拉通。
(2)、按照2.5ul/cm的量划膜于硝酸纤维素膜的末端与样品垫交接的3mm处即可,划完后烘箱烘30min。
所述样品垫3需经处理液处理,所述处理液中含有非离子表面活性剂曲拉通、蛋白质明胶,所述处理液所选的缓冲系统为50mM PB;所述表面活性剂的浓度为0.5%;所述蛋白质明胶的浓度为0.1%,样品垫处方法为将玻纤放于50mMPB、0.5%吐温、0.1%明胶预处理液中,浸泡30min,烘箱烘4小时,存放备用。
将样品垫、硝酸纤维素膜4、吸水纸依次粘贴于PVC板上,组装成试纸条,然后和卡扣板块壳组装成试剂检测卡。
试剂盒的使用方法,具体操作步骤为:
Ⅰ、仪器读取产品配套的芯片信息。
Ⅱ、取75ul样本直接加入到检测卡加样孔9中,反应18min后,插入到荧光免疫定量分析仪中读取结果。
实施例3:如图1、图2和图3所示,一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,包括下盖上盖2和试剂条,下盖1和上盖2相互卡扣连接,下盖1和上盖2之间形成容纳腔,试剂条位于容纳腔内,上盖2上设置有加样孔9和检测窗口10,所述试剂条包括吸水纸5、硝酸纤维素膜4和样品垫3,所述吸水纸5位于硝酸纤维素膜4的一端,所述样品垫3位于硝酸纤维素膜4的另一端,所述硝酸纤维素膜4上依次包被有质控C线8、检测T线7和荧光抗体固相线6,加样孔9与样品垫3相对应,所述检测窗口10的位置对应检测T线7和质控C线8的位置,使检测T线7和质控C线8位于检测窗口10中。将待测样本直接加入到试剂条加样孔9后,在层析作用下迁移至检测T线7处时,被硝酸纤维素膜4上配对抗体所捕获形成复合物,复合物的荧光抗体信号与HBP浓度成正比,经荧光分析仪分析后可计算出样本中HBP抗原的浓度。
所述质控C线8包被有羊抗鼠抗体,浓度为0.2mg/ml,所述检测T线7包被有鼠抗人HBP单克隆抗体,浓度为1mg/ml。
将1.5mg/ml的羊抗鼠抗体和3mg/ml HBP单克隆抗体分别划于硝酸纤维素膜4上,37度烘30min备用。
所述荧光物质标记工艺包括以下步骤:
(1)、抗体的准备:每50ul体系中,准备0.2mg鼠抗人肝素结合蛋白抗体,获取所需抗体量放于室温平衡20min。
(2)、荧光素的准备,荧光素用DMSO溶解至1umol/L备用。
(3)、标记,将每50ul体系中加入2ul荧光素的比列进行配比,加入到备好的的蛋白液中,搅拌混匀,剩余体积用pH9.5碳酸氢钠补足,反应2h。
(4)、透析,标记完成抗体,用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍,在PBS缓冲液中透析12小时以上既得标记好的荧光抗体。
所述荧光抗体固相线6包被有固相液以及荧光物质标记的4mg/ml的鼠抗人肝素结合蛋白抗体。
所述荧光抗体固相工艺包括以下步骤:
(1)、将标记好的荧光抗体,用固相液稀释到5倍,固相液为50mMPB、0.8%酪蛋白、1.5%BSA、10%海藻糖、0.5%PVP、2%PVA、0.5%曲拉通。
(2)、按照2.5ul/cm的量划膜于硝酸纤维素膜的末端与样品垫交接的2mm处即可,划完后烘箱烘30min。
所述样品垫3需经处理液处理,所述处理液中含有非离子表面活性剂曲拉通、蛋白质明胶,所述处理液所选的缓冲系统为50mM PB;所述表面活性剂的浓度为0.25%;所述蛋白质明胶的浓度为1 %,样品垫处方法为将玻纤放于50mMPB、0.25%吐温、1%明胶预处理液中,浸泡30min,烘箱烘4小时,存放备用。
将样品垫、硝酸纤维素膜4、吸水纸依次粘贴于PVC板上,组装成试纸条,然后和卡扣板块壳组装成试剂检测卡。
试剂盒的使用方法,具体操作步骤为:
Ⅰ、仪器读取产品配套的芯片信息。
Ⅱ、取75ul样本直接加入到检测卡加样孔9中,反应18min后,插入到荧光免疫定量分析仪中读取结果。
本发明提供一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,试剂盒采用了新式荧光标记工艺,解决了标记的荧光物质不稳定问题,不利于后期工艺控制的问题;本试剂盒荧光标记物的固相化工艺,在拓宽了试剂盒储存条件的基础上,大大降低了生产成本,并显著提高了精密度;本发明提供的特殊样品垫处理液让板条可直接加入样本而无需经样本液稀释,使操作更加简便快速;一般只需要加入75ul患者样本,通过POCT仪器定量检测HBP的含量,即可得到准确实验结果,且可重复性强。
实施例4
1、将组装好的试剂盒进行稳定性考察
将本发明所述试剂盒置37℃进行破坏性试验,每天考察试剂盒稳定性检测标准如下:
(1)阴性质控品符合率:用10份阴性质控品检测,检测结果如表1所示,全部呈阴性,且试剂盒的准确度均满足要求。
(2)阳性质控品符合率:用10份阳性(包括强、中、弱阳性)质控品检测,检测结果如表2所示,全部呈阳性,且试剂盒的准确度均满足要求。
试剂盒稳定性考察结果如下:
表1 试剂盒 37℃加速破坏后阴性质控品检测结果
表2 试剂盒 37℃加速破坏后阳性质控品检测结果
经试验在37℃可稳定至少15天,根据稳定性实验原理,阿伦尼乌斯公式:d(In k)/dT=Ea/RT2 Ea,常温保存10个月,相当于37度破坏15天,可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求,也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。
、取上述实施例所获得肝素结合蛋白检测试剂盒,采用行业通用的方式进行性能评价,结果如下:
(1)、最低检测限
检测方法:取不同浓度梯度的低浓度值样本进行检测,每份样本检测5次,对检测结果按照大小进行排序,符合如下条件,即可得到空白限和检出限的范围;低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。
检测结果:HBP的最低检测限≤6ng/ml。
(2)、准确度
检测方法:根据线性区间,用HBP抗原配置制成已知3个浓度企业参考品作为样本进行检测,每个样本重复测定10次,计算10次检测结果的均值(),按式(1)计算相对偏差,结果应符合2.5的要求。
式中:
——相对偏差;
——检测浓度的均值;
——检测样本的靶值。
检测结果:用HBP抗原配置成已知浓度作为样本进行检测,测定值与理论值的相对偏差不超过±15%。
(3)、线性
检测方法:用HBP抗原配制成已知5个浓度企业参考品作为样本进行检测。对每一个浓度的样本至少重复测定3次,计算其平均值,将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性拟合,得到线性回归方程,并计算线性相关系数r。检测结果:HBP在[6,300]ng/mL线性区间内,拟合曲线的线性相关系数(r)应不小于0.9900。
(4)、精密度
(1)批内精密度
HBP:平行检测90ng/ml的参考品10次,检测结果的变异系数应不大于15%。
(2)批间精密度
HBP:取连续三个批号试剂盒,重复检测90ng/ml的参考品10次,检测结果的变异系数应不大于20%。
、样本测试:
本试剂盒与上市试剂盒进行样本测试,表3为本发明试剂盒测定结果与上市试剂盒阴性样本比对,测定结果相关系数≥0.99;表4为本发明试剂盒测定结果与上市试剂盒阳性样本比对,测定结果相关系数≥0.9977,相关性良好,可用于临床诊断使用。
表3 HBP阴性样本比对结果
表4 HBP阳性样本比对结果
本发明提供的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,试剂盒采用了新式荧光标记工艺,解决了标记的荧光物质不稳定问题,不利于后期工艺控制的问题;本试剂盒荧光标记物的固相化工艺,在拓宽了试剂盒储存条件的基础上,大大降低了生产成本,并显著提高了精密度;本发明提供的特殊样品垫处理液让板条可直接加入样本而无需经样本液稀释,使操作更加简便快速;一般只需要加入75ul患者样本,通过POCT仪器定量检测HBP的含量,即可得到准确实验结果,且可重复性强。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,实施方式的举例,其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,包括试剂条,其特征在于:所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫,所述吸水纸位于硝酸纤维素膜的一端,所述样品垫位于硝酸纤维素膜的另一端,所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控C线、检测T线和荧光抗体固相线。
2.如权利要求1所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述质控C线包被有羊抗鼠抗体,浓度为0.1-3mg/ml,所述检测T线包被有鼠抗人HBP单克隆抗体,浓度为0.1-3mg/ml。
3.如权利要求1所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述荧光抗体固相线包被有固相液以及荧光物质标记的1-5mg/ml的鼠抗人肝素结合蛋白抗体。
4.如权利要求3所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述荧光物质标记工艺包括以下步骤:
(1)、抗体的准备:每50ul体系中,准备0.2mg鼠抗人肝素结合蛋白抗体,获取所需抗体量放于室温平衡20min;
(2)、荧光素的准备,荧光素用DMSO溶解至1umol/L备用;
(3)、标记,将每50ul体系中加入2ul荧光素的比列进行配比,加入到备好的的蛋白液中,搅拌混匀,剩余体积用pH9.5碳酸氢钠补足,反应2h;
(4)、透析,标记完成抗体,用透析液PBS、1%BSA、0.5%PEG、5%海藻糖稀释十倍,在PBS缓冲液中透析12小时以上既得标记好的荧光抗体。
5.如权利要求1所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述荧光抗体固相线为标记好的荧光抗体经固相液处理后固相于硝酸纤维素膜的末端,所述荧光抗体固相线位于硝酸纤维素膜与样品垫交接的2-4mm处。
6.如权利要求3或5所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述固相液中含有能有效保护荧光标记物抗体活性的蛋白、高浓度的增加标记抗体活性的糖类、便于标记物质在硝酸纤维素膜上释放的大分子聚合物和便于标记物质快速复溶的表面活性剂;所述蛋白为酪蛋白和BSA,所述糖类为海藻糖、蔗糖、葡聚糖,所述大分子聚合物为PVP、PVA,所述表面活性剂为曲拉通、吐温。
7.如权利要求6所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述蛋白浓度为0.05%-10%;所述糖类浓度为0.5%-10%;所述大分子聚合物浓度为0.1%-10%;所述表面活性剂浓度为0.01%-5%。
8.如权利要求5所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述荧光抗体固相工艺包括以下步骤:
(1)、将标记好的荧光抗体,用固相液稀释到20倍;
(2)、按照2.5ul/cm的量划膜于硝酸纤维素膜的末端与样品垫交接的2-4mm处即可,划完后烘箱烘30min。
9.如权利要求3或4所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述标记反应过程中增加碱性条件,所述标记透析过程中加入大分子物质PEG20000以及蛋白,所述的碱性条件为pH为8-10;所述的大分子物质PEG20000浓度为0.01%-5%;所述的蛋白为酪蛋白、BSA、明胶,浓度为0.1%-5%。
10.如权利要求1所述的一种干式免疫荧光定量法肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒,其特征在于:所述样品垫需经处理液处理,所述处理液中含有非离子表面活性剂曲拉通、吐温和蛋白质明胶,所述处理液所选的缓冲系统为10-50mMPB;所述表面活性剂的浓度为0.01%-0.5%;所述蛋白质明胶的浓度为0.1%-1%,样品垫处理方法为将玻纤放于10-50m MPB、0.01%-0.5%吐温、0.1%-1%明胶预处理液中,浸泡30min,烘箱烘4小时,存放备用。
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