CN1967246A - 酰化氨基酸水解酶1及其抗体检测肝癌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明根据酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达，将其用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记，然后利用酰化氨基酸水解酶1的抗体，可制备成试剂或试剂盒用于检测肝细胞癌。该方法检测准确率高，特异性强，操作简单，可广泛应用于临床诊断。

Description

酰化氨基酸水解酶1及其抗体检测肝癌的应用

技术领域

本发明涉及酰化氨基酸水解酶1及其抗体的一种应用，具体地说涉及酰化氨基酸及其抗体检测肝癌的应用。

背景技术

肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。

到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。现在肝癌的诊断和检测技术除了内科和手术诊断外，还有几种如甲胎蛋白之类的分子诊断。内外科诊断的问题在于难于在早期无创的进行诊断；分子诊断的问题是，所用的标志蛋白质分子种类少，对早期肝癌的灵敏度和特异性较差。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。

因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。

酰化氨基酸水解酶1亦简称酰基转移酶1(ACY 1，ACYLASE，L-amino acidacid amidohydrolase，N-acyl，N-acyl-L-amino-acid amidohydrolase，EC3.5.1.14)。它的Genebank登录号为gi|4501901|，NCBI的登录号为NP_000657，Swissprot登录号为Q03154，IPI号为：IPI00009268.1。酰化氨基酸水解酶1(ACYl)是一种同源二聚体的金属蛋白酶，它含有锌指结构，催化水解N酰化的氨基酸，它的催化活性可以如下表示：

An N-acyl-L-amino acid+H₂O＝a carboxylate+an L-amino acid( http：//www.expasy.org/uniprot/Q03154)。

酰化氨基酸水解酶1的单亚基分子量为40-45KDa之间，该酶基因位于基因图谱的3p21.1位点。经研究表明该基因在小细胞肺癌(SCLC)中显著的低表达甚至表达缺失。运用酶活力测定的方法学以及ELISA测定表明，在14％的小细胞肺癌的细胞系中完全检测不到酰化氨基酸水解酶1的表达，在48％的小细胞肺癌的细胞系中酰化氨基酸水解酶1表达显著降低(THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY Val.268，No.23，Issue of August 15，pp.17010-17017.199)。另有文献报道，在小细胞肺癌中酰化氨基酸水解酶1的表达缺失或低表达是因为该酶基因的缺失，但是具体的机制还未研究清楚。(The Journal of Clinical Investigation，Inc.Volume 83，June 1989，2120-2124)

但是到目前为止，现有技术中未见有关于酰化氨基酸水解酶1与肝细胞癌的相关性的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了酰化氨基酸水解酶1及其抗体诊断肝癌的应用，以解决现有技术中存在的缺陷。

本发明的原理为：通过筛选在肝细胞癌癌组织以及肝细胞癌癌旁组织中差异表达的蛋白质，发明人找到了一种在肝细胞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异表达的蛋白质，经质谱鉴定为酰化氨基酸水解酶1(见附图中的图1和图2，显示了蛋白质点SSP5401为经质谱鉴定的酰化氨基酸水解酶1，其在肝细胞癌患者的癌组织中的表达相比在癌旁组织中的表达明显下调)。进一步的免疫印迹实验证实，酰化氨基酸水解酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(见附图中的图3和图4，显示了蛋白质点SSP 1009，为经质谱鉴定的酰化氨基酸水解酶1，其在肝细胞癌患者的癌组织中的表达相比在癌旁组织中的表达明显下调)。基于酰化氨基酸水解酶1与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌。

本发明首先提供了酰化氨基酸水解酶1作为检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。其中所述用作检测肝癌的蛋白质分子标记是检测该蛋白在肝组织中的表达量。具体地说是检测该蛋白在肝组织中是否存在下调表达。该蛋白质在肝癌组织中较正常组织下调。

本发明还提供了抗酰化氨基酸水解酶1的抗体用于制备检测肝癌的制剂的应用，以及抗酰化氨基酸水解酶1的抗体用于制备检测肝癌的试剂盒的应用。其中抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还提供了一种体外检测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的表达量的方法，包括以下步骤：

A、用特异性抗酰化氨基酸水解酶1的抗体检测待测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的数量；

B、将步骤A测得的酰化氨基酸水解酶1的数量与正常肝组织中的酰化氨基酸水解酶1的数量进行比较，如测得的蛋白数量低于正常值，则表示被检测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的表达异常。

其中所述抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

到目前为止，还没有酰化氨基酸水解酶1与肝细胞癌的相关性的报道，因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。用酰化氨基酸水解酶1及其抗体用来检测肝癌，实验中其准确率为100％，较目前的检测技术有了质的突破，而且方法特异性强，稳定性好，利于在临床中推广应用。

附图说明

图1：酰化氨基酸水解酶1在癌组织中的2-DE质谱图

图2：酰化氨基酸水解酶1在癌旁组织中的2-DE质谱图

图3：酰化氨基酸水解酶1在癌组织中的分析型双向荧光差异凝胶电泳图

图4：酰化氨基酸水解酶1在癌旁组织的分析型双向荧光差异凝胶电泳图

图5：酰化氨基酸水解酶1单向凝胶电泳后的免疫印迹分析结果示意图(～43KDa)

图6：酰化氨基酸水解酶1单向凝胶电泳后的免疫印迹分析结果示意图(～70KDa)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic samplepreparation，NESP)制备的肝细胞癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以双向凝胶电泳(2-DE)技术筛选在癌组织与癌旁组织中差异表达的蛋白质点并质谱鉴定，结果发现酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌癌组织中下调表达，并进一步采用双向荧光差异凝胶电泳技术(two-dimensional fluorescencedifference gel electrophoresis，2D-DIGE)筛选在癌组织及癌旁组织中差异表达的蛋白质点并质谱鉴定，结果也发现酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌癌组织中下调表达。免疫印迹实验进一步证实酰化氨基酸水解酶1的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。

因此，以酰化氨基酸水解酶1作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝癌，也即酰化氨基酸水解酶1可以用作检测肝癌的蛋白质分子标记。

实施例1、肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备

本实施例中所使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Sigma公司。

本实施例以非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品，具体如下：

手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基(5％胎牛血清，0.2mMPMSF，1mM EDTA，苯甲异噁唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL，两性霉素B0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，细胞沉淀分别溶于适量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超声细胞破碎仪(Soniprep 150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min，15000r/min、4℃离心1h。取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量，制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的蛋白质样品分装，-80℃保存备用。

以上述方法制备16对肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品。16例肝细胞癌标本均来自东方肝胆外科医院，由2个病理科医生明确为肝细胞癌。均为男性，平均年龄49.4岁(31～65岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，16例(100％)属临床分级(TNM分级)III级。其中，甲胎蛋白(AFP)高于25μg/L的15例(93.75％)；14例肿瘤大于5cm。16例肝细胞癌标本的病理资料详见以下表1。

              表1、16例肝细胞癌标本的病理资料

No.	性别	年龄	HBV	HCV	等级	AFP	尺寸
								f31	男性	56	+	-	III	＞1000	7×6
f32	男性	51	+		III	＞1000	14×12×12
								f33	男性	50	+	-	III	＞1000	5×6
f39	男性	55	+	-	III	＞1000	5×5.5

327	男性	44	+	-	III	＞1000	8×8×7
								328	男性	45	+	-	III	＞1000	7.5×6
415	男性	40	+	-	III	＞1000	10×8×6
								418	男性	31	+	-	III	3.7	8×5×8
422	男性	57	+	-	III	＞1000	3.5×4
								429	男性	44	+	-	III	＞1000	7.2×6
317	男性	58	+	-	III	＞1000	5.2×6.4
								42	男性	45	+	-	III	＞1000	7.7×5.4
45	男性	51	+	-	III	＞1000	5.5×4.0
								48	男性	55	+	-	III	＞1000	4×3
49	男性	43	+	-	III	＞1000	12×12
								424	男性	65	+	-	III	＞1000	11.5×6.5

本实施例所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品，所有16例肝细胞癌病例有极相似的病例诊断指标：均为男性，平均年龄49.4岁(31～65岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，16例(100％)属TNM分级III级。其中，AFP高于25μg/L的15例(93.75％)；14例肿瘤大于5cm。这种取样方法有利于降低个体间差别对实验分析工作的影响。

实施例2、差异表达蛋白的筛选一

本实施例中使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司。

过硫酸胺(AP)、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest软件等为Bio-Rad产品。

Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱，购自Karlsruhe公司(德国)。

非线性固相pH梯度预制胶条(IPG干胶条，pH3-10NL，130×3×0.5mm)、IPG缓冲液、IPGphore等电聚焦系统(Amersham Pharmacia Biotech)、Amersham Pharmacia Ettan Dalt II systems等为Amersham Bioscience公司产品。

取实施例1得到的16对肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品中的前10对(表1中f31、f32、f33、f39、327、328、415、418、422和317)，采用双向凝胶电泳法对其中的差异表达蛋白进行筛选，双向凝胶电泳主要按Sanchez等人的改进方法(Sanchez，J.C.et al.Electrophoresis 1997，18，324-327)进行，具体如下：

首先采用分析型双向凝胶电泳：将60μg蛋白质样品与重泡涨液(8mol/L尿素、2％CHAPS、0.5％IPG缓冲液、18mmol/L DTT和痕量溴酚蓝)混合，总体积250μl，使用130×3×0.5mm pH3-10NL胶条，在IPGphore等电聚焦系统上进行一向分离，总电压小时约为80000Vhrs。等电聚焦后胶条依次在平衡液I(6M尿素、30％甘油、2％SDS、1％DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％IAA代替)中平衡，每次15min。胶条转移至十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，胶浓度12％)上缘，电泳条件为15mA/胶30min，然后30mA/胶保持至溴酚蓝离胶下缘0.5cm。

然后，采用银染使胶条生成图像，并以GS-710图像扫描仪(Bio-Rad)透射模式扫描胶图像，分辨率为84.7μm/pixel。点的检测和匹配用PDQuest软件分析。蛋白质点的等电点pI和分子量Mr以2-DE标准蛋白质(Bio-Rad)的作为Marker，输入软件用于分析其它蛋白的pI和Mr。

本实施例以非酶解样品制备法中制备的10对肝细胞癌患者的癌组织与相应癌旁组织蛋白质样品，共得到2-DE图谱40余幅，其中5对样品重复3次PDQuest软件进行了癌组织与癌旁组织的蛋白质差别表达谱分析，分析结果见以下表2。

                表2、PDQuest软件分析结果(部分)

样品名称	匹配点	统计分析(t测试，p＜0.05)	定量分析		定性分析		相关系数
									在T中更多	在N中更多	仅在T中	仅在N中	T-T或N-N	T-N
			3    27	1283	230	35	54	16							22	r[0.82718-0.86666]	r[0.69826-0.76055]

3     28	1316	97	24	9	9	6	r[0.75556-0.84765]	r[0.63577-0.73870]
									4     15	1121	393	51	56	48	75	r[0.82165-0.85401]	r[0.66092-0.72361]
4     18	1125	362	41	74	46	57	r[0.827149-0.863555]	r[0.673221-0.729310]
									4     29	1213	264	67	46	44	95	r[0.79004-0.86468]	r[0.60064-0.68952]

注：在T中更多＝在肝癌组织中表达上调的蛋白质点；

    在N中更多＝在肝癌组织中表达下调的蛋白质点；

    仅在T中＝仅在肝癌组织中检测到的蛋白质点；

    仅在N中＝仅在非肝癌组织中检测到的蛋白质点；

    T-T＝肿瘤之间的相关系数；

    N-N＝成对的非肿瘤之间相关系数；

    T-N＝肿瘤组织和成对的非肿瘤组织之间的相关系数。

在pH3-10胶条上，银染条件下两类组织样品均显示约1200个银染点。癌组织间银染点匹配率为0.75～0.86，癌组织与癌旁组织间银染点匹配率为0.60～0.76，一定程度上说明两类组织样品取样方法的科学性。

图谱分析之后，本实施例又采用制备型双向凝胶电泳，上样量为1.5mg，总Vhrs约为90000，采用可与质谱兼容的考玛斯亮蓝法检测，其它与分析型双向凝胶电泳方法相同。

接下来的胶内酶解与质谱鉴定过程如下：蛋白质点由质谱兼容的考玛斯亮蓝染色的制备型电泳凝胶上手工切取，在100mM NH₄HCO₃、30％乙腈中脱色，真空冷冻干燥，5μl 50mmol/L NH₄HCO₃(pH8.3，蛋白质：胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入20μl 50mmol/L NH₄HCO₃(pH 8.3)，37℃酶解过夜。抽提蛋白(60％乙腈、0.1％三氟乙酸)，真空冷冻干燥。LCQ^TMDeca XP系统鉴定酶解好的样品，Bioworks软件(Thermo Finnigan)进行数据库搜索。

应用双向凝胶电泳技术、胶内酶解技术、质谱技术，本实施例鉴别出了116个差别点，对应102种差别表达的蛋白质。其中，肝细胞癌癌组织中高表达或仅在其中表达的为61个差别点，对应54种蛋白质；肝细胞癌癌旁组织中高表达或仅在其中表达的为55个差别点，对应48种蛋白质。

在差异表达谱中，点SSP5401(图1)在癌组织中表达明显下调，经切点、胶内酶解，点SSP5401用1D-LC-MS/MS质谱鉴定和数据库搜索得19个非重复肽段(共鉴定到38个肽段)与酰化氨基酸水解酶1相符并满足打分条件(DeltaCn值≥0.1，并且Xcorr值：若为1个电荷≥1.9，若为2个电荷≥2.2，若为3个电荷≥3.75)，氨基酸覆盖率为53.43％，具体结果详见以下表3：

                       表3、点SSP5401的质谱鉴定结果

肽段序列	质量数(MH+)	电荷数	X Corr值	Delta Cn值
					K.ALASYVAACQAAGVVIEDWR.A	2151.39	2	3.34	0.29
K.ALASYVAACQAAGVVIEDWR.A	2151.39	2	2.91	0.22
					K.CVSIQYLEAVR.R	1338.51	2	2.36	0.19
K.DMNLTLEPEIMPAATDNR.Y	2032.29	2	3.68	0.48
					K.DMNLTLEPEIMPAATDNR.Y	2032.29	2	3.71	0.53
K.DTEEEDFHVDQVTTVK.V	1892.97	2	4.04	0.44
					K.DTEEEDFHVDQVTTVK.V	1892.97	2	4.11	0.42
K.DTEEEDFHVDQVTTVK.V	1892.97	2	2.84	0.40
					K.EDLQGAYSQLKVVLEKLSK.D	2149.49	2	2.26	0.3 1
K.EGSVTSVNLTK.L	1135.26	2	2.22	0.37
					K.EGSVTSVNLTK.L	1135.26	2	2.42	0.43
K.FYLDTGDASNFAR.W	1477.57	2	2.34	0.44
					K.GPEEEHPSVTLFR.Q	1498.64	2	2.80	0.48
K.GPEEEHPSVTLFR.Q	1498.64	2	2.86	0.52
					K.GPEEEHPSVTLFR.Q	1498.64	2	2.76	0.50
K.VVNSILAFR.E	1019.23	2	2.87	0.39
					K.VVNSILAFR.E	1019.23	2	2.57	0.39
R.AGFALDEGIANPTDAFTVFYSER.S	2492.70	2	3.40	0.46
					R.AGFALDEGIANPTDAFTVFYSER.S	2492.70	2	4.30	0.49
R.AGFALDEGIANPTDAFTVFYSER.S	2492.70	2	4.29	0.55
					R.AVGVPALGFSPMNR.T	1416.68	2	2.75	0.51
R.AVGVPALGFSPMNR.T	1416.68	2	2.94	0.48
					R.AVGVPALGFSPMNR.T	1416.68	2	2.66	0.50
R.DGGANNTNETFRPGGGNIKDNWR.S	2491.60	2	2.21	0.50
					R.EGPWVNIFMELLEGGSLGQLVK.E	2417.83	2	2.24	0.46
R.LLPALASVPALPSDS.-	1451.70	2	2.49	0.47

R.LLPALASVPALPSDS.-	1451.70	1	2.07	0.42
					R.LLPALASVPALPSDS.-	1451.70	2	2.26	0.53
R.LQSNPHLK.E	937	2	2.23	0.2
					R.TLFLDNHQAHRVFPLVIK.R	2149.55	2	2.37	0.36
R.TPVLLHDHDER.L	1332.46	2	2.29	0.49
					R.TPVLLHDHDER.L	1332.46	2	2.26	0.52
R.TPVLLHDHDER.L	1332.46	2	2.33	0.47
					R.TVQPKPDYGAAVAFFEETAR.Q	2198.44	2	2.92	0.64
R.TVQPKPDYGAAVAFFEETAR.Q	2198.44	2	3.55	0.62
					R.TVQPKPDYGAAVAFFEETAR.Q	2198.44	2	2.66	0.41
R.VCKDMNLTLEPEIMPAATDNR.Y	2419.74	2	3.54	0.37
					R.VCKDMNLTLEPEIMPAATDNR.Y	2419.74	2	3.22	0.52

并且，根据PDQuest软件对已有2-DE图谱的分析，通过比较点SSP5401在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2-DE图谱中的表达情况，发现SSP 5401在6例不同病例中的都是在癌组织中低表达：平均比例(癌旁/癌)±STDEV为3.2±0.6。

因而，2-DE图谱分析显示：点SSP5401在癌组织中的低调表达在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2-DE图谱中得到良好的重复(60％)

实施例3、差异表达蛋白的筛选二

本实施例中使用的尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司。

过硫酸胺(AP)、TEMED、Tri-n-butylphosphat(TBP)、Sypro Ruby荧光染料等为Bio-Rad产品。

LCQTM Deca XP system和ProteomeXTM Workstation购自ThermoFinnigan公司。

Cy2、Cy3、Cy5荧光染料，非线性固相pH梯度预制胶条(IPG干胶条，pH3-10NL，130×3×0.5mm)、IPG缓冲液、IPGphore等电聚焦系统、AmershamPharmacia Ettan Dalt II系统，Typhoon扫描仪，自动切胶仪，DeCyder^TM分析软件等均为Amersham Bioscience公司产品。

取实施例1得到的16对肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品中的10对(表1中f31、f32、f33、f39、327、328、415、418、422和317)，采用双向荧光差异凝胶电泳法对其中的差异表达蛋白进行筛选，双向荧光差异凝胶电泳主要按Tonge R.等人的改进方法(Tonge R.et al.Proteomics2001，1，377-3396)进行，具体如下：

首先采用分析型双向荧光差异凝胶电泳：参照产品说明书，将50μg蛋白质样品先分别用400pmol的Cy2或Cy3或Cy5荧光染料进行蛋白质标记反应，其中Cy2标记内标样品(癌组织和癌旁组织等量混合样品)，癌组织各一半分别用Cy3、Cy5标记，癌旁组织也各一半分别用Cy3、Cy5标记，而后Cy2标记的内标样品与Cy3或Cy5标记的癌组织或癌旁组织样品混合后，再与重泡涨液(8mol/L尿素、2％CHAPS、0.5％IPG缓冲液、18mmol/L DTT和痕量溴酚蓝)混合，总体积250μl，使用130×3×0.5mm pH3-10NL胶条，在IPGphore等电聚焦系统上进行一向分离，总电压小时约为80000Vhrs。等电聚焦后胶条依次在平衡液I(6M尿素、30％甘油、2％SDS、1％DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％IAA代替)中平衡，每次15min。胶条转移至十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，胶浓度12％)上缘，电泳条件为15mA/胶30min，然后30mA/胶保持至溴酚蓝离胶下缘0.5cm。

然后，采用Typhoon扫描仪扫描生成图像，分辨率为100μm/pixel。点的检测和匹配用DeCyder^TM分析软件(Amersham Pharmacia Biotech)分析。

本实施例对以非酶解样品制备法制备的10对肝细胞癌患者的癌组织与相应癌旁组织的蛋白质样品进行了分析，共得到2D-DIGE图谱30幅，DeCyder^TM分析软件进行了癌组织与癌旁组织的蛋白质差别表达谱分析，在pH3-10非线性胶条上，荧光染色条件下两类组织样品均显示约1300个点，经过DeCyder^TM软件的成对t-test(paired t-test)和方差(one-way ANOVA)的严谨统计分析，以p＜0.05，1.5倍变化做为筛选标准，共筛选到249个有统计学意义的肝细胞癌组织与癌旁组织的表达差异点。

图谱分析之后，本实施例又采用制备型双向荧光差异凝胶电泳，上样量为0.5mg，总Vhrs约为90000，采用可与质谱兼容的Sypro Ruby荧光染料染色，Typhoon扫描仪检测，其它与分析型双向荧光差异凝胶电泳方法相同。

接下来的胶内酶解与质谱鉴定过程如下：蛋白质点由质谱兼容的SyproRuby荧光染料染色的制备型电泳凝胶上用自动切胶仪切取，在100mMNH₄HCO₃、30％乙腈中脱色，真空冷冻干燥，5μl 50mmol/L NH₄HCO₃(pH8.3，蛋白质∶胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入20μl 50mmol/L NH₄HCO₃(pH8.3)，37℃酶解过夜。抽提蛋白(60％乙腈、0.1％三氟乙酸)，真空冷冻干燥。LCQ^TM Deca XP系统(Thermo Finnigan公司)鉴定酶解好的样品，Bioworks软件(Thermo finnigan公司)进行数据库搜索。

应用双向荧光差异凝胶电泳技术、胶内酶解技术、质谱技术，本实施例共鉴别出了75个差别点，对应69种差别表达的蛋白质。

在差异表达谱中，点1009(图2)在癌组织中表达明显下调，经切点、胶内酶解，点1009用1D-LC-MS/MS质谱鉴定和数据库搜索得1个非重复肽段(共鉴定到1个肽段)与酰化氨基酸水解酶1相符并满足打分条件(Delta Cn值≥0.1，并且X corr值：若为1个电荷≥1.9，若为2个电荷≥2.2，若为3个电荷≥3.75)，氨基酸覆盖率为2.701％，具体结果详见以下表4：

                    表4、点1009的质谱鉴定结果

肽段序列	质量数(MH+)	电荷数	X Corr值	Delta Cn值
					K.EGSVTSVNLTK.L	1135.25	2	2.525	0.3416

并且，根据DeCyder^TM软件对已有2D-DIGE图谱的分析，发现点1009的低表达符合严格的统计学分析(表5)：

表5、点1009在癌组织中的下调表达在10例病例中的统计分析情况

编号	成对T-test比值	平均比值(癌旁/癌)	方差值(one-way ANOVA)
				1009	0.04256	1.7147	0.04256

因而，2D-DIGE图谱分析显示：点1009在癌组织中的下调表达在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2D-DIGE图谱中得到良好的重复，具有显著的统计学意义。

实施例4、酰化氨基酸水解酶1差异表达的免疫印迹验证

为确认酰化氨基酸水解酶1的差异表达，取10位肝细胞癌患者的癌组织及相应癌旁组织蛋白质样品(表1中317、327、42、45、48、49、415、418、422和424)，用购买的抗酰化氨基酸水解酶1抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下：

每个样品取20μg蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用鸡抗人酰化氨基酸水解酶1多克隆抗体(购自GenWay公司，1500)，4℃孵育过夜，用TBST(每升含Tris2.42g，氯化钠8g，Tween 20ml，用HCl调节pH到7.6)洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗鸡抗体(购自Santa Cruz公司，1∶10000)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后用ECL plus试剂(AmershamBiosciences)反应5分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图3所示。

图3的免疫印迹结果显示，10对癌组织与癌旁组织除一对(418)不甚明显外，其余各对均呈现这样的现象：癌组织中酰化氨基酸水解酶1的杂交条带的浓度都明显低于相应的癌旁组织，可见酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌的癌组织中存在低表达，该结果与双向凝胶电泳及分析型双向荧光差异凝胶电泳结果一致。

同时在分子量为70KDa左右的PVDF膜处，用购买的抗酰化氨基酸水解酶1抗体进行免疫印迹分析(具体过程同上)，检测结果如图4所示，发现酰化氨基酸水解酶1的不同的翻译后修饰形式在癌组织中却是上调表达(图4中除317，422，424外)，进一步提示酰化氨基酸水解酶1不同的翻译后修饰形式也是重要的变化指标。

综上所述，酰化氨基酸水解酶1在肝细胞癌的癌组织及癌旁组织中存在差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此，以酰化氨基酸水解酶1作为一个蛋白质分子标记对其表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗酰化氨基酸水解酶1的抗体，包括各种抗酰化氨基酸水解酶1的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测酰化氨基酸水解酶1的表达量，因而可以用于检测肝癌，或者用于制备检测肝癌的制剂或试剂盒等。

虽然有关酰化氨基酸水解酶1动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将其作为检测肝癌的标记物却是肯定的。酰化氨基酸水解酶1可作为肝细胞癌的潜在标志，而其在胞内的生物学功能提示酰化氨基酸水解酶1可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。

Claims (9)

1、酰化氨基酸水解酶1作为检测肝癌的蛋白质分子标记的应用。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝癌的蛋白质分子标记是检测该蛋白在肝组织中的表达量。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测该蛋白在肝组织中的表达量是检测该蛋白在肝组织中是否存在下调表达。

4、抗酰化氨基酸水解酶1的抗体用于制备检测肝癌的制剂的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

6、抗酰化氨基酸水解酶1的抗体用于制备检测肝癌的试剂盒的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

8、一种体外检测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的表达量的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、用特异性抗酰化氨基酸水解酶1的抗体检测待测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的数量；

B、将步骤A测得的酰化氨基酸水解酶1的数量与正常肝组织中的酰化氨基酸水解酶1的数量进行比较，如测得的蛋白数量低于正常值，则表示被检测肝细胞组织中酰化氨基酸水解酶1的表达异常。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗酰化氨基酸水解酶1的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

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