BR112019010636A2 - ensaios com anticorpos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um método de detecção de câncer de fígado em um indivíduo mamífero detectando-se um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em mmp9, aif1, epcam e cdkn1b, método este que compreende colocar em contato a amostra de ensaio com um antígeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em mmp9, aif1, epcam e cdkn1b e determinar a presença ou a ausência de complexos do antígeno marcador tumoral ligado a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio, onde a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de fígado. também incluídos na invenção estão os métodos correspondentes para se diagnosticar e tratar o câncer de fígado em um indivíduo mamífero, métodos correspondentes de se predizer a resposta a um tratamento contra o câncer de fígado, um método correspondente de se detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamífero e kits adequados para executar os métodos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: ENSAIO COM ANTICORPOS

Campo da invenção [0001] A invenção refere-se, em geral, ao campo da detecção de anticorpos e, em particular, refere-se a ensaios para a detecção de autoanticorpos relacionados com câncer de fígado em uma amostra compreendendo fluido corporal de pacientes.

Antecedentes da invenção [0002] Muitos ensaios de diagnóstico, prognóstico e/ou monitoramento baseiam-se na detecção de um marcador biológico de um estado de doença particular ou suscetibilidade à doença. Tais marcadores biológicos comumente são proteínas ou polipeptídeo que são característicos de uma doença particular ou associados com uma suscetibilidade à doença e são frequentemente usados para a detecção de cânceres, incluindo o câncer de fígado.

[0003] O câncer de fígado e, especificamente, o carcinoma hepatocelular (HCC), é o sexto câncer mais comum em todo o mundo, mas é a segunda causa mais comum de morte por câncer. As altas taxas de mortalidade são causadas pelo diagnóstico tardio, frequentemente após metástases e doenças hepáticas pré-existentes. O diagnóstico tardio é devido aos poucos sintomas precoces e técnicas de imagem subótimas para uso no diagnóstico.

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2/97 [0004] O rastreamento ultrassonográfico e a avaliação dos níveis sanguíneos de alfafetoproteína (AFP) são atualmente as ferramentas de rastreamento mais usadas para o câncer de fígado. No entanto, seu fraco desempenho destaca uma lacuna importante para um exame de detecção/rastreamento precoce melhorado para o câncer de fígado.

[0005] É evidente que um exame clinicamente útil para se detectar eficazmente a presença de câncer de fígado seria bem-vindo, uma vez que permitiría o diagnóstico precoce do câncer de fígado. Além disso, um teste de diagnóstico realizado em uma amostra de fluido corporal, por exemplo, uma amostra de sangue, seria rápido e relativamente não invasivo, aumentando as taxas de participação no rastreamento em comparação com outras técnicas. A detecção da doença em estágio inicial abre uma gama mais ampla de opções de tratamento com efeitos colaterais menos graves. As atuais vias de tratamento para o câncer de fígado em estágio moderado envolvem um transplante hepático completo e a identificação precoce de pacientes com doença em estágio inicial facilitará a carga sobre o registro de doadores de órgãos.

[0006] Um teste para rastreamento melhorado para o câncer de fígado seria útil em todo o mundo, já que as taxas de câncer de fígado estão aumentando mundialmente.

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Atualmente, a China responde por cerca de 50% de todos os casos de HCC, enquanto o Egito também tem uma taxa muito alta de HCC. Considera-se que a alta prevalência de HCC nesses parses se deva, em parte, à alta incidência de hepatite B na China e à alta prevalência de hepatite C no Egito. A hepatite B e a hepatite C são fatores de risco conhecidos para câncer de figado, juntamente com cirrose hepática, doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica, doença de Wilson, hemocromatose hereditária, hepatite autoimune, exposição documentada à aflatoxina, esquistossomose e diabetes mellitus. A crescente prevalência dessas doenças em todo o mundo torna imperativo que seja desenvolvido um teste rápido e não invasivo para o câncer de figado.

[0007] Nos últimos anos, tornou-se evidente que os anticorpos e, em particular, os autoanticorpos, podem servir como marcadores biológicos da doença ou da suscetibilidade à doença. Os autoanticorpos são anticorpos que ocorrem naturalmente, direcionados contra um antigeno que o sistema imunológico de um indivíduo reconhece como estranho, embora esse antigeno, na verdade, tenha se originado no indivíduo. Eles podem estar presentes na circulação como autoanticorpos livres circulantes ou na forma de complexos imunes circulantes, consistindo em autoanticorpos ligados à sua proteína alvo. Diferenças entre uma proteína do tipo selvagem

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4/97 expressa por células normais e uma forma alterada da proteína produzida por uma célula doente ou durante um processo de doença podem, em alguns casos, levar a proteína alterada a ser reconhecida pelo sistema imune de um indivíduo como não próprias e, assim, provocar uma resposta imune nesse indivíduo. Esta pode ser uma resposta imune humoral (isto é, mediada por células B) que leva à produção de autoanticorpos imunologicamente específicos para a proteína alterada.

[0008] Os ensaios que medem a resposta imune de um indivíduo à presença de proteínas marcadoras tumorais em termos de produção de autoanticorpos fornecem uma alternativa à medição direta ou detecção de proteínas marcadoras tumorais em fluidos corporais. Tais ensaios constituem, essencialmente, detecção indireta da presença de uma proteína marcadora tumoral. A natureza da resposta imune significa que é provável que autoanticorpos possam ser induzidos por uma quantidade muito pequena de proteína marcadora tumoral circulante e que métodos indiretos, que dependem da detecção da resposta imune a proteínas marcadoras tumorais, serão consequentemente mais sensíveis do que métodos para a medição direta dos niveis da proteína marcadora tumoral nos fluidos corporais. Os métodos de ensaio baseados na detecção de autoanticorpos podem,

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5/97 portanto, ser de particular valor no inicio do processo da doença.

[0009] Surpreendentemente, os inventores determinaram quatro antigenos marcadores tumorais, o quais, anteriormente, não se sabia que estivessem associados ao câncer de figado. Através da detecção de autoanticorpos dirigidos contra qualquer um destes antigenos marcadores tumorais, opcionalmente em combinação com um ou mais antigenos marcadores tumorais adicionais, os inventores criaram um método de rastreio eficaz e não invasivo para o câncer de figado e um kit correspondente.

Sumário da invenção [0010] Surpreendentemente, os inventores estabeleceram que autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer uma das proteínas marcadoras tumorais metalopeptidase da matriz 9 (MMP9), fator inflamatório de aloenxerto 1 (AIF1), molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) e inibidor de quinase dependente de ciclina IB (CDKN1B), são indicativos da presença de câncer de figado. Portanto, a detecção de autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer uma destas proteínas marcadoras tumorais pode ser usada para o diagnóstico de câncer de figado.

[0011] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido método para detectar um anticorpo em

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6/97 uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9,

AIF1,	EpCAM e CDKN1B,	método	este que compreende as	etapas
de:	(a) colocar em	contato	a amostra de ensaio	com um

antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio.

[0012] Dentro deste aspecto, suspeita-se, preferencialmente, que o indivíduo tenha câncer de figado.

[0013] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um método para detectar câncer de figado em um indivíduo mamifero detectando-se um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e

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7/97 (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

por meio de que a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de figado.

[0014] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para diagnosticar e tratar câncer de figado em um indivíduo mamifero detectando-se um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B;

(b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

(b) diagnosticar câncer de figado no indivíduo quando forem detectados complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e (d) administrar um tratamento para câncer de figado ao indivíduo que recebeu o diagnóstico.

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8/97 [0015] De acordo com urn quarto aspecto da invenção, é fornecido um método para predizer a resposta a um tratamento contra o câncer de figado, compreendendo o método detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B;

(b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

(c) detectar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e (d) comparar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e o autoanticorpo com uma relação previamente estabelecida entre a quantidade de ligação e o resultado provável do tratamento;

por meio de que uma mudança na quantidade de ligação especifica, quando comparada aos controles, prediz se o

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paciente responderá ou	não ao	tratamento contra o câncer	de
figado.
[0016] Dentro	deste	aspecto da	invenção,	o
tratamento contra o câncer de	figado pode ser	selecionado	do
grupo que consiste	em	quimioterapia,	ablação ;	por

radiofrequência, ressecção hepática, transplante hepático, vacinação, terapias com fator anticrescimento ou transdução de sinal, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioembolização arterial com transcateter, injeção percutânea de etanol, ablação por micro-ondas, administração de sorafenibe e radioembolização.

[0017] De acordo com um quinto aspecto da invenção, é fornecido uso de um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9 AIF1, EpCAM e CDKN1B em um método para detectar câncer de figado em um individuo mamifero detectando-se um autoanticorpo imunologicamente especifico para MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do individuo mamifero, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

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10/97 por meio de que a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de figado.

[0018] De acordo com um sexto aspecto da invenção, é fornecido um kit para a detecção de autoanticorpos em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um mamífero que compreende:

(a) um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) um reagente que tem a capacidade de detectar complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio.

[0019] De acordo com um sétimo aspecto da invenção, é fornecido um método in vitro para determinar um perfil de anticorpos de um indivíduo que sofre de câncer de figado em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e

b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes

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11/97 na amostra de ensaio, em que se repete o método para se construir um perfil de produção de anticorpos.

[0020] Em todos os aspectos da invenção, o indivíduo mamífero é preferencialmente um humano. Aqui, os termos indivíduo mamífero e indivíduo serão usados intercambiavelmente para se referir a um indivíduo que é mamífero, preferencialmente humano.

[0021] Em todos os aspectos da invenção, o método é preferencialmente realizado in vitro em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal obtido ou preparado a partir do indivíduo mamífero.

[0022] A descoberta surpreendente de que os autoanticorpos imunologicamente específicos para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B podem ser usados como marcadores para o câncer de fígado permitiu que os inventores criassem métodos para a detecção de tais autoanticorpos, os quais podem ser usados para detectar e diagnosticar o câncer de fígado. Tal detecção pode ser realizada usando-se um kit e estes métodos e kits formam o núcleo da presente invenção.

Breve descrição das Figuras [0023] Figura 1 Representação diagramática para demonstrar a derivação dos parâmetros da curva secundária: Figura IA = Inclinação, Intercepto, Área sob a Curva (AUC) e InclinaçãoMáx; Figura 1B = constante de dissociação (Kd).

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12/97 [0024] Figura 2 Desenhos esquemáticos (layouts) de placas de microtitulação de autoanticorpos: Figura 2A = desenho esquemático (layout) do ensaio de alto rendimento (HTPA, do inglês high-throughput assay); Figura 2B = desenho esquemático (layout) de titulação.

Descrição Detalhada da Invenção [0025] A invenção fornece, em geral, um método de imunoensaio para detectar um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. Este método de imunoensaio pode ser usado para detectar ou diagnosticar câncer de figado.

Método de detecção de um autoanticorpo [0026] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido método para detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e

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13/97 (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio.

[0027] O termo autoanticorpo aqui usado refere-se a um anticorpo de ocorrência natural direcionado contra um antigeno que o sistema imune de um indivíduo reconhece como estranho, apesar de esse antigeno ser, na verdade, originado no próprio indivíduo. Em geral, os autoanticorpos incluem anticorpos direcionados contra formas alteradas de proteínas de ocorrência natural produzidas por uma célula doente ou durante um processo de doença. A forma alterada da proteína origina-se no indivíduo, mas pode ser vista pelo sistema imune do indivíduo como não própria e, assim, induzir uma resposta imune nesse indivíduo na forma de autoanticorpos imunologicamente específicos para a proteína alterada. Tais formas alteradas de uma proteína podem incluir, por exemplo, mutantes com uma sequência de aminoácidos alterada, opcionalmente acompanhada por alterações na estrutura secundária, terciária ou quaternária, formas truncadas, variantes de processamento (splice), glicoformas alteradas etc. Em outras modalidades, o autoanticorpo pode ser direcionado contra uma proteína que é superexpressa em um estado de doença ou como resultado de amplificação gênica ou regulação transcricional anormal. A superexpressão de uma proteína que não é normalmente encontrada pelas células do

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14/97 sistema imunológico em quantidades significativas pode desencadear uma resposta imune que leva à produção de autoanticorpos. Em modalidades adicionais, o autoanticorpo pode ser direcionado contra uma forma fetal de uma proteina que se torna expressa em um estado de doença. Se uma proteina fetal que normalmente é expressa apenas em estágios iniciais de desenvolvimento, antes que o sistema imune esteja funcional, for expressa em um estado de doença, a forma fetal expressa em um estado de doença no ser humano plenamente desenvolvido pode ser reconhecida pelo sistema imune como estranha, desencadeando uma resposta imune que leva à produção de autoanticorpos. Ainda em modalidades adicionais, o autoanticorpo pode ser direcionado contra uma proteina que é expressa em um local diferente em um estado de doença. Por exemplo, a proteina pode ser expressa em um local interno em indivíduos saudáveis, mas é expressa em uma local exposto na superfície em um estado de doença de tal modo que está exposta à circulação e, portanto, ao sistema imune no estado de doença, mas não no indivíduo saudável. Aqui, referir-se-á à proteina contra a qual o autoanticorpo é direcionado como uma proteina marcadora tumoral.

[0028] No escopo da invenção, contempla-se que possam ser detectados autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer uma dentre MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. A invenção também contempla a detecção de

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15/97 autoanticorpos que são imunologicamente específicos contra uma destas proteínas marcadoras tumorais e autoanticorpos que são imunologicamente específicos contra uma segunda destas proteínas marcadoras tumorais, opcionalmente em combinação com detecção de autoanticorpos que são imunologicamente específicos contra uma terceira destas proteínas marcadoras tumorais e, adicionalmente, para a detecção opcional de autoanticorpos que são imunologicamente específicos contra à quarta destas proteínas marcadoras tumorais. Contudo, a invenção não está, de modo algum, limitada a este respeito. Quando são detectados autoanticorpos imunologicamente específicos contra duas ou três das proteínas marcadoras tumorais identificadas, estão contempladas todas as combinações de duas ou três proteínas marcadoras tumorais.

[0029] No contexto da presente invenção, o termo antígeno é usado para se referir a um reagente imunoespecífico que se complexa com autoanticorpos presentes na amostra de ensaio. Um antígeno é uma substância compreendendo pelo menos um determinante antigênico ou epítopo que tem a capacidade de interagir especificamente com o autoanticorpo-alvo que se deseja detectar, ou qualquer agente de captura que interaja especificamente com a região variável ou regiões determinantes de complementaridade do referido autoanticorpo. O antígeno será tipicamente uma

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16/97 macromolécula biológica de ocorrência natural ou sintética, tal como, por exemplo, uma proteina ou peptideo, um polissacarideo ou um ácido nucleico e poderá incluir anticorpos ou fragmentos dos mesmos, tais como anticorpos anti-idiótipo. Um antigeno marcador tumoral é um antigeno elevado em indivíduos com câncer, especificamente no câncer de figado deste contexto. Aqui, os termos antigeno marcador tumoral e antigeno serão usados intercambiavelmente.

[0030] Como aqui usado, o termo fluido corporal, quando se refere ao material a ser testado quanto à presença de autoanticorpos usando-se o método da invenção, inclui, entre outros, plasma, soro, sangue total, urina, suor, linfa, fezes, liquido cerebrospinal, liquido ascitico, efusão pleural, liquido seminal, escarro, aspirado de mamilo, seroma pós-operatório, saliva, liquido amniótico, lágrimas e liquido de drenagem de feridas. Como acima mencionado, os métodos da invenção são preferencialmente realizados in vitro em uma amostra de ensaio que compreende fluido corporal removido do indivíduo de ensaio. O tipo de fluido corporal usado pode variar dependendo da identidade do autoanticorpo a ser testado e da situação clinica em que o ensaio é usado. Em geral, prefere-se realizar os ensaios em amostras de soro ou plasma. A amostra de ensaio pode incluir componentes adicionais além do fluido corporal, tais como, por exemplo,

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diluentes,	conservantes,	agentes	estabilizantes,	tampões
etc. [0031]	Em certas	modalidades, o método da	invenção

pode compreender, adicionalmente, a etapa de:

(c) detectar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e em que a presença ou ausência do autoanticorpo se baseia em uma comparação entre a quantidade de ligação especifica observada e um limite (cut-off) pré-determinado.

[0032] Nesta modalidade, a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio pode ser a quantidade relativa de ligação ou a quantidade absoluta de ligação.

[0033] Aqui, o autoanticorpo pode ser considerado como estando presente se a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio estiver quer acima quer abaixo de um limite (cut-off) pré-determinado. No entanto, considera-se geralmente que o autoanticorpo esteja presente se a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio estiver acima de um limite (cut-off) prédeterminado. O limite (cut-off) pré-determinado pode ser

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18/97 determinado realizando-se um ensaio controle em amostras sabidamente negativas (por exemplo, indivíduos normais) em estudos caso-controle. Os indivíduos normais serão, preferencialmente, controles pareados por idade, não tendo nenhum diagnóstico de câncer de figado com base em critérios clínicos, de imagem e/ou bioquímicos. Em certas modalidades, as amostras sabidamente negativas podem ser provenientes de indivíduos com doença hepática benigna, isto é, aqueles indivíduos que com alto risco de câncer de figado, mas que não mostraram qualquer evidência de câncer de figado. Preferencialmente, os indivíduos normais não têm diagnóstico de qualquer tipo de câncer. Aqui, a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e autoanticorpos presentes em amostras de ensaio provenientes de pacientes normais pode ser detectada e ter sua média calculada para fornecer um limite (cut-off) predeterminado. Em certas modalidades, o limite (cut-off) predeterminado pode ser determinado selecionando-se o valor de corte que resulta no maior valor de Youden que mantém a especificidade maior que 90%.

[0034] Surpreendentemente, os inventores descobriram que autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer uma dentre MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B estão associados a câncer de figado. Portanto, em certas modalidades, pode-se suspeitar que o indivíduo tenha câncer

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19/97 de figado. Está contemplado qualquer motivo para se suspeitar que um sujeito possa ter câncer de figado.

[0035] Em todos os aspectos da presente invenção, o câncer de figado pode ser carcinoma hepatocelular (HCC).

[0036] Em certas modalidades, pode-se suspeitar que o indivíduo mamífero tenha câncer de fígado, porque seus exames tiveram resultados positivos em um rastreamento para câncer de fígado. Aqui, está contemplado qualquer rastreamento para câncer de fígado. Em certas modalidades, os exames do indivíduo podem previamente ter tido resultados positivos para alfafetoproteína (AFP). Em geral, os níveis de AFP são detectados em uma amostra de sangue retirada do indivíduo e, portanto, os exames do indivíduo podem previamente ter tido resultados positivos para AFP em uma amostra de sangue. No entanto, está contemplada qualquer técnica de detecção de AFP. Em modalidades alternativas, os exames do indivíduo podem ter tido resultados positivos para para des-gama-carboxiprotrombina (DCP) ou alfafetoproteína reativa à lectina (AFP-L3) . Em geral, os níveis de DCP e AFP-L3 são detectados em uma amostra de sangue retirada do indivíduo e, portanto, os exames do indivíduo podem previamente ter tido resultados positivos para DCP ou AFPL3 em uma amostra de sangue. No entanto, está contemplada qualquer técnica de detecção de DCP ou AFP-L3.

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20/97 [0037] Em outras modalidades, os exames do indivíduo podem ter tido resultados positivos para câncer de fígado usando-se vigilância por ultrassom ou qualquer outro método de imagem.

[0038] Dentro dos limites da presente invenção, os exames do indivíduo podem ter tido resultados positivos em um rastreamento para câncer de fígado em qualquer momento antes da realização do método da invenção. Por exemplo, o rastreamento para câncer de fígado pode ter sido realizado uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, vinte e quatro horas, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, um ano, dois anos, três anos, quatro anos, cinco anos, seis anos, sete anos, oito anos, nove anos, dez anos ou mais antes da execução do método da invenção.

[0039] Para os propósitos da invenção, indivíduos que estão em tratamento para câncer de fígado ou que tenham previamente sido submetidos a tratamento para câncer de fígado podem ainda ser considerados como suscitando suspeita de ter(em) câncer de fígado. Aqui, o tratamento para o câncer de fígado pode ter sido realizado em qualquer

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21/97 momento e o indivíduo pode ou não ter sido subsequentemente examinado quanto à presença de câncer de fígado.

[0040] Pode-se suspeitar que o indivíduo tenha câncer de fígado devido à presença de um fator de risco conhecido para câncer de fígado. Em certas modalidades, o indivíduo pode ter cirrose hepática, doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica, doença de Wilson, hemocromatose hereditária, hepatite autoimune, hepatite B, hepatite C, exposição documentada à aflatoxina, esquistossomose ou diabetes mellitus. Estão contemplados quaisquer métodos para determinar esses fatores de risco e o indivíduo pode ou não estar sendo submetido ou ter sido submetido a tratamento relevante para o fator de risco.

[0041] Uma vez que os inventores surpreendentemente tenham determinado que autoanticorpos imunologicamente específicos para MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B estão associados a câncer de fígado, a detecção em uma amostra de ensaio de autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer uma destas proteínas marcadoras tumorais pode ser usada em um método de detecção de câncer de fígado. Em um aspecto da invenção, é fornecido um método de detecção de câncer de fígado em um indivíduo mamífero detectando-se um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína

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22/97 marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

por meio de que a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de fígado.

[0042] Em seus aspectos mais amplos, a presente invenção refere-se a métodos para a detecção de autoanticorpos imunologicamente específicos para qualquer uma dentre MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, e não se limita ao diagnóstico de câncer de fígado ou qualquer tratamento subsequente. Contudo, em um aspecto, a invenção fornece um método para detectar e tratar de câncer de fígado em um indivíduo mamífero, detectando-se um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

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23/97 (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B;

(b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

(c) diagnosticar câncer de figado no individuo quando forem detectados complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e (d) administrar um tratamento para câncer de figado ao individuo que recebeu o diagnóstico.

[0043] Dentro deste aspecto, o autoanticorpo pode ser considerado como estando presente se a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio estiver quer acima quer abaixo de um limite (cut-off) pré-determinado, como explicado acima.

[0044] Dentro dos limites da invenção, o tratamento para câncer de figado pode ser administrado a qualquer momento após o diagnóstico do câncer de figado. Por exemplo, o tratamento para câncer de figado pode ser administrado uma

hora,	duas	horas,	três	horas, quatro horas, cinco	horas,
seis	horas,	sete	horas,	oito horas, nove	horas,	dez	horas,
onze	horas,	doze	horas,	vinte e quatro	horas,	dois	dias,
três	dias, quatro	dias,	cinco dias, seis	dias,	uma semana,

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2Μ2>Ί duas semanas, três semanas, quatro semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, um ano ou mais depois do diagnóstico de câncer de figado. Também estão contempladas múltiplas administrações do tratamento para câncer de figado com qualquer espaçamento entre as rodadas de tratamento.

[0045] Está contemplada a administração do tratamento para câncer de figado em uma localização geográfica diferente da localização geográfica na qual o foi realizado o diagnóstico de câncer de figado. Além disso, o tratamento de câncer de figado pode ser administrado por uma pessoa diferente da pessoa que realiza o diagnóstico, independentemente de o diagnóstico e o tratamento serem realizados nas mesmas localizações geográficas ou diferentes.

[0046] Em um aspecto, o método de detecção de autoanticorpos da invenção pode ser usado para a estratificação do tratamento, isto é, para determinar se um paciente particular ou grupo de pacientes particular tem mais ou menos probabilidade de responder a um tratamento particular contra o câncer de figado. Por exemplo, o método de detecção de autoanticorpos da invenção pode ser usado para predizer a resposta de um individuo a um tratamento contra câncer de figado.

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25/97 [0047] A invenção, portanto, fornece um método para predizer a resposta a um tratamento contra o câncer de figado, compreendendo o método detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um individuo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B;

(b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

(c) detectar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e (d) comparar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e o autoanticorpo com uma relação previamente estabelecida entre a quantidade de ligação e o resultado provável do tratamento;

por meio de que uma mudança na quantidade de ligação especifica, quando comparada aos controles, prediz se o

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26/97 paciente responderá ou não ao tratamento contra o câncer de figado.

[0048] Aqui, o controle é, preferencialmente, uma amostra de fluido corporal proveniente de um individuo que sabidamente tem câncer de figado e que sabidamente não responde ao tratamento contra câncer de figado sendo testado, isto é, que sabidamente é um controle não respondente.

[0049] Deve-se notar que a invenção não está, de modo algum, limitada a qualquer tratamento especifico para câncer de figado. Em certas modalidades, o tratamento para câncer de figado pode ser selecionado do grupo que consiste em quimioterapia, ablação por radiofrequência, ressecção hepática, transplante hepático, vacinação, terapias com fator anticrescimento ou transdução de sinal, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioembolização arterial com transcateter, injeção percutânea de etanol, ablação por micro-ondas, administração de sorafenibe e radioembolização.

[0050] Geralmente, os aspectos da invenção descritos acima serão realizados uma vez. Contudo, os imunoensaios in vitro não são invasivos e podem ser repetidos com a frequência considerada necessária para se construir um perfil de produção de anticorpos em um paciente, quer antes do surgimento do câncer de figado, como no rastreamento de

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27/97 indivíduos com risco, quer ao longo de todo o decurso da doença.

[0051] A invenção, portanto, fornece um método in vitro para determinar um perfil de anticorpos de um indivíduo que sofre de câncer de fígado em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e

b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio, em que se repete o método para se construir um perfil de produção de anticorpos.

Painéis de dois ou mais antígenos marcadores tumorais [0052] Em certas modalidades da invenção, os métodos podem detectar dois ou mais autoanticorpos. Por exemplo, os métodos podem detectar dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco, vinte e seis, vinte e sete, vinte e oito, vinte e nove,

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28/97 trinta, trinta e um, trinta e dois, trinta e três, trinta e quatro, trinta e cinco, trinta e seis, trinta e sete, trinta e oito ou mais autoanticorpos . De acordo com o núcleo da invenção, um dos autoanticorpos é imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.

[0053] Dentro destas modalidades, o método compreende a etapa de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com um painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais que compreendem um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B e um ou mais antigenos marcadores tumorais adicionais, imunologicamente específicos para pelo menos um dos referidos autoanticorpos.

[0054] Doravante, pode-se referir a estes métodos como ensaios em painel. Tais ensaios são geralmente mais sensíveis do que a detecção de autoanticorpos para um único antigeno marcador tumoral e têm uma frequência muito menor de resultados falso-negativos (vide documentos WO 99/58978, WO 2004/044590 e WC2006/126008, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência).

[0055] É geralmente aceito que a sensibilidade de um ensaio será aumentada quando se testa a presença de múltiplos autoanticorpos. Portanto, em algumas modalidades, os métodos da invenção contemplam o uso de um painel que compreende

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29/97 múltiplos antigenos marcadores tumorais, tais como dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco, vinte e seis, vinte e sete, vinte e oito, vinte e nove, trinta, trinta e um, trinta e dois, trinta e três trinta e quatro, trinta e cinco, trinta e seis, trinta e sete, trinta e oito ou mais antigenos marcadores tumorais.

[0056] Deve-se notar que a modalidade do painel pode ser usada com todos os métodos da invenção, incluindo métodos de detecção de um autoanticorpo, métodos de detecção de câncer de figado, métodos de diagnóstico e tratamento de câncer de figado, métodos de predição da resposta a um tratamento contra câncer de figado e métodos de determinação de um perfil de anticorpos.

[0057] Em certas modalidades, o painel pode compreender dois ou mais antigenos marcadores tumorais que são antigenos distintos. Aqui, o termo antigenos distintos engloba antigenos originados de diferentes proteinas ou polipeptideos (tais como antigenos originados de proteinas não relacionadas codificadas por genes diferentes) .

[0058] A invenção também contempla métodos que utilizam um painel que compreende duas ou mais variantes de antigenos de um ou mais dos antigenos distintos. O termo

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30/97 variante de antigenos é aqui usado para se referir a variantes alélicas ou outras variantes de um único antigeno, tal como um antigeno de uma única proteina como definido acima. Variantes de antigeno geralmente originam-se de um único gene e diferentes variantes de antigenos podem ser expressas em diferentes membros da população ou em diferentes estados de doença. As variantes de antigenos podem diferir pela sequência de aminoácidos ou por uma modificação póstraducional, tal como glicosilação, fosforilação ou acetilação. Além disso, o termo variante de antigenos engloba mutações de antigenos, como substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Geralmente, uma variante de antigeno conterá menos de cinco (por exemplo, menos de quatro, menos de três, menos de duas ou uma) mutações em comparação com o antigeno de tipo selvagem.

[0059] Na modalidade do painel, o um ou mais antigenos marcadores tumorais é preferencial e imunologicamente especifico para um autoanticorpo que não o autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, conforme discutido adicionalmente abaixo. Contudo, embora a invenção não seja, de modo algum, limitada a este respeito, a invenção contempla a detecção de autoanticorpos que são imunologicamente específicos para uma destas quatro proteínas marcadoras tumorais e autoanticorpos

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31/97 que são imunologicamente específicos para uma segunda destas quatro proteínas marcadoras tumorais, opcionalmente em combinação com a detecção de autoanticorpos que são imunologicamente específicos para uma terceira destas quatro proteínas marcadoras tumorais e ainda opcionalmente em combinação com a detecção de autoanticorpos que são imunologicamente específicos para a quarta destas quatro proteínas marcadoras tumorais. Quando são detectados autoanticorpos imunologicamente específicos contra duas ou três das proteínas marcadoras tumorais identificadas, estão contempladas todas as combinações de duas ou três proteínas marcadoras tumorais. 0 painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais podem, portanto, compreender dois, três ou quatro antígenos marcadores tumorais selecionados do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. Em uma certa modalidade específica, o painel pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. Em uma modalidade específica adicional, o painel pode consistir em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.

[0060] Em uma modalidade, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode compreender um ou mais antígenos marcadores tumorais selecionados do grupo que consiste em NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNPL, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, Ciclina Bl, AFP, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2,

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PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1. Nesta modalidade, o painel pode compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco, vinte e seis, vinte e sete, vinte e oito, vinte e nove, trinta, trinta e um, trinta e dois, trinta e três ou trinta e quatro dos antigenos marcadores tumorais enumerados. De acordo com a invenção, o painel também compreenderá MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B e poderá compreender um, dois, três ou quatro destes antigenos marcadores tumorais. Em modalidades em que dois ou três destes antigenos marcadores tumorais estão incluídos no painel, estão contempladas todas as combinações de dois ou três destes antigenos. Em modalidades específicas, o painel pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.

[0061] Em uma modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em MMP9, AIF1, EpCAM, NYESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.

[0062] Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1. Em uma modalidade, o painel de dois ou

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33/97 mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.

[0063] Em uma modalidade adicional, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.

[0064] Ainda em uma modalidade adicional, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NYESO-1, CAGE, RalA e SOX2. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir

em	MMP9, AIF1,	EpCAM,	DDX3X,	SALL4, MAGE	A4,	NY-ESO-1,	CAGE,
RalA e SOX2.
	[0065]	Ainda	em uma	modalidade	adicional, o	painel
de	dois ou	mais	antigenos marcadores	tumorais	pode

compreender EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NYESO-1. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.

[0066] Ainda em uma modalidade adicional, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transíerrina. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou

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34/97 mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transíerrina.

[0067] Em certas modalidades especificas, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode diferir dependendo do gênero do indivíduo, isto é, se o indivíduo for do sexo masculino ou do sexo feminino. Nesta modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender ou consistir em AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1, ou AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 quando o indivíduo for do sexo feminino. Ainda dentro desta modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender ou consistir em EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L, ou EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NYESO-1 quando o indivíduo for do sexo masculino.

[0068] Em uma modalidade específica, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transíerrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1. De acordo com a invenção, o painel também compreenderá MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B e poderá compreender um, dois, três ou quatro destes antigenos marcadores tumorais. Em modalidades em que dois ou três destes antigenos marcadores tumorais estão incluídos no

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35/97 painel, estão contempladas todas as combinações de dois ou três destes antígenos.

[0069] Em modalidades específicas, o painel pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. Por exemplo, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Cyclin Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU45, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.

[0070] Em uma modalidade específica o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode consistir em MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.

[0071] Em uma modalidade específica, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode compreender CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X e AIF1. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode consistir em CAGE, NY-ESO-1, MMP9,

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36/97 transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X e AIF1.

[0072] Em uma modalidade especifica, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1 SOX2 e AFP.

Etapas de rastreamento adicionais [0073] Em certas modalidades da presente invenção, os métodos da invenção podem, adicionalmente, compreender o rastreamento de um marcador adicional associado ao câncer de figado. Dentro desta modalidade, está contemplado qualquer método de rastreamento para qualquer marcador que sabidamente esteja associado a câncer de figado.

[0074] Por exemplo, o método pode compreender adicionalmente a detecção de alfafetoproteína (AFP), desgama-carboxiprotrombina (DCP) ou alfafetoproteína reativa à lectina (AFP-L3) em uma amostra de teste que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamífero. Preferencialmente, o fluido corporal é sangue. Em modalidades em que o método adicionalmente compreende a detecção de alfafetoproteína (AFP) em uma amostra de teste

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37/97 que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamifero, o fluido corporal é preferencialmente sangue e o limite (cut-off) de 200ng/ml é preferencialmente aplicado para se avaliar a positividade.

Titulação de antígenos [0075] No documento W02006/126008 (cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), determinou-se que o desempenho e, mais especificamente, a utilidade clinica e a confiabilidade de ensaios baseados na detecção de autoanticorpos como marcadores biológicos de doenças podem ser melhorados dramaticamente pela inclusão de uma etapa de titulação de antigenos. Testando-se a amostra suspeita de conter autoanticorpos contra uma série de diferentes quantidades de antigeno e construindo-se uma curva de titulação, é possivel identificar de uma maneira confiável resultados de triagem verdadeiro-positivos, independentemente da quantidade absoluta de autoanticorpo presente na amostra. O método de titulação de antigenos do documento W02006 / 126008 fornece maior especificidade e sensibilidade do que a medição da reatividade de autoanticorpos a uma concentração única de antigenos ou do que métodos em que se titula a amostra de soro em vez do antigeno.

[0076] Em certas modalidades, a invenção contempla, portanto, métodos em que o antigeno marcador tumoral é

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38/97 fornecido em uma pluralidade de quantidades diferentes e em que o método compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a amostra de ensaio com uma pluralidade de quantidades diferentes do antigeno marcador tumoral;

(b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

(c) detectar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos;

(d) representar graficamente ou calcular uma curva da quantidade da ligação especifica versus a quantidade de antigeno marcador tumoral para cada quantidade de antigeno marcador tumoral usada na etapa (a); e (e) determinar a presença ou a ausência do autoanticorpo com base na quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e o autoanticorpo em cada quantidade diferente de antigeno marcador tumoral usada.

[0077] Na prática, as diferentes quantidades do antigeno marcador tumoral serão geralmente fornecidas alterando-se a concentração do antigeno marcador tumoral utilizado. Portanto, os termos quantidade diferente e concentração diferente podem ser usados intercambiavelmente. No entanto, dentro do escopo da invenção, está contemplado qualquer método de se alterar a

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39/97 quantidade de antigeno marcador tumoral. Os leitores especialistas na técnica entenderão que, no método da invenção, a quantidade de determinantes antigênicos ou epitopos disponíveis para ligação ao autoanticorpo-alvo é importante para se estabelecer uma série de titulação (isto é, um conjunto de antigenos fornecidos em quantidades diferentes). Em muitos formatos de ensaio, a quantidade de determinantes antigênicos ou epitopos disponíveis para ligação está diretamente correlacionada com a quantidade de moléculas de antigeno presentes. No entanto, em outras modalidades, tais como certos sistemas de ensaio em fase sólida, a quantidade de determinantes antigênicos ou epitopos expostos pode não estar diretamente correlacionada com a quantidade de antigeno, mas pode depender de outros fatores, tais como ligação à superfície sólida e apresentação conformacional. Nestas modalidades, as referências aqui feitas a diferentes quantidades de antigeno em uma série de titulação podem ser consideradas como se referindo a quantidades diferentes do determinante antigênico ou epitopo. Em modalidades particulares, a variação na quantidade de antigeno pode ser alcançada mudando-se a densidade do antigeno ou do epitopo contra a qual a amostra é testada ou mantendo-se a densidade do antigeno ou do epitopo, mas aumentando-se a área superficial sobre a qual o antigeno é imobilizado, ou ambos.

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40/97 [0078] Dentro desta modalidade, um conjunto de antigenos refere-se a um único antigeno a ser testado em diferentes quantidades no método da invenção.

[0079] Em modalidades onde estão contemplados antigenos múltiplos, um conjunto de antigenos distintos refere-se a um único antigeno a ser testado em diferentes quantidades no método da invenção, em que cada antigeno é um antigeno distinto originado de diferentes proteínas ou polipeptideos (tais como antigenos originados de proteínas não relacionadas codificadas por genes diferentes), como definido acima. Um dado microarranjo (microarray) pode incluir exclusivamente conjuntos de antigenos distintos originados de diferentes proteínas ou polipeptideos, ou exclusivamente conjuntos de antigenos distintos originados de diferentes epitopos peptidicos de uma única proteína ou polipeptideo, ou uma mistura dos dois em qualquer proporção. Deve-se notar que cada conjunto individual de antigenos em diferentes quantidades em qualquer modalidade da invenção compreenderá, geralmente, apenas um antigeno e não misturas do mesmo.

[0080] Um conjunto de variantes de antigenos referese a uma única variante de antigeno a ser testada em diferentes quantidades no método da invenção.

[0081] Em certas modalidades, a presença ou a ausência do autoanticorpo pode ser determinada com base nos

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41/97 valores coletivos da quantidade de ligação específica para todas as quantidades de antígeno marcador tumoral usadas. Durante os métodos da invenção, a quantidade relativa ou absoluta de ligação específica entre o autoanticorpo e o antígeno é determinada para cada quantidade diferente de antígeno (determinante antigênico ou epítopo) testada e usada para se representar graficamente ou calcular uma curva da quantidade (relativa ou absoluta) de ligação específica versus a quantidade de antígeno para cada quantidade de antígeno testada. A presença na amostra de teste de autoanticorpo reativo com o antígeno usado no ensaio é determinada com base na quantidade de ligação específica observada para cada quantidade de antígeno e é geralmente indicada por uma curva dose-resposta, que é tipicamente em forma de S ou sigmoidal. Portanto, em certas modalidades, a presença ou ausência do autoanticorpo é determinada rastreando-se o gráfico em busca da presença de uma curva dose-resposta, tal como uma curva que, geralmente, tem forma de S ou sigmoidal. Se não houver variação na ligação detectável com as diferentes quantidades de antígeno testadas, então isso poderá ser classificado como ausência de uma quantidade detectável do autoanticorpo.

[0082] Em uma modalidade, a presença ou ausência de autoanticorpo é determinada por comparação da quantidade de ligação específica entre o autoanticorpo e o antígeno com

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42/97 valores de corte (cut-off) pré-determinados. Aqui, uma curva da quantidade de ligação especifica versus a quantidade de antigeno para cada quantidade de antigeno usado na série de titulação é representada graficamente e o nivel de ligação em amostras sabidamente positivas (por exemplo, uma população de pacientes com doença) é comparado com o nivel de ligação observado em amostras sabidamente negativas (por exemplo, indivíduos normais) em estudos caso-controle. Os valores de corte (cut-off) para a ligação de autoanticorpos em um ou mais pontos da curva de titulação são escolhidos para se maximizar a sensibilidade (poucos falso-negativos), enquanto se mantém uma alta especificidade (poucos falsopositivos). Contanto que a curva da quantidade de ligação especifica versus a quantidade de antigeno para cada quantidade de antigeno usada na série de titulação seja uma curva dose-resposta, uma medida será considerada como sendo positiva se a quantidade de ligação especifica determinada para um ou mais pontos na curva de titulação estiver acima do valor do ponto de corte (cut-off) predeterminado. Em certas modalidades, o limite (cut-off) predeterminado pode ser determinado selecionando-se o valor de corte (cut-off) que resulta no maior valor de Youden, enquanto se mantém a especificidade maior que 90%.

[0083] Deve-se notar que a modalidade da titulação de antigenos pode ser usada com todos os métodos da invenção,

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43/97 incluindo métodos de detecção de um autoanticorpo, métodos de detecção de câncer de figado, métodos de diagnóstico e tratamento de câncer de figado, métodos de predição da resposta a um tratamento contra câncer de figado e métodos de determinação de um perfil de anticorpos. Além disso, a titulação de antigenos pode ser usada em modalidades em que apenas um único autoanticorpo é detectado, assim como em modalidades em que é usado um painel de antigenos para se detectarem múltiplos autoanticorpos.

Duplo corte (cut-off) [0084] É geralmente aceito que a sensibilidade de um ensaio será aumentada quando se medem autoanticorpos contra múltiplos antigenos. No entanto, esta sensibilidade aumentada está geralmente associada a uma diminuição proporcional na especificidade e os métodos de ensaio podem, portanto, estar limitados ao número de antigenos que podem ser usados. Em certas modalidades, o presente método pode explicar a diminuição da especificidade usando-se um método de titulação de antigenos que determina o nivel de ligação especifica entre o autoanticorpo e o antigeno e a avaliação de um parâmetro de curva secundária, apenas com resultados de testes considerados positivos quando comparados com pontos de corte (cut-off) para ambas estas métricas sendo classificadas como positivas. Referir-se-á aqui a este método como o método de duplo corte (cut-off), que está

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44/97 totalmente descrito no documento WO2015/193678 (cujo conteúdo é aqui incorporado por referência).

[0085] Em certas modalidades, os métodos da invenção compreendem adicionalmente as etapas de:

(dl) calcular um parâmetro de curva secundária a partir da curva traçada ou calculada na etapa (c); e (e) determinar a presença ou a ausência do autoanticorpo com base em uma combinação:

(i) da quantidade de ligação especifica entre o autoanticorpo e o antigeno marcador tumoral determinada na etapa (b); e (ii) do parâmetro da curva secundária determinado na etapa (dl).

[0086] O método de duplo corte (cut-off) utiliza a metodologia de titulação de antigenos descrita acima. Após a detecção da quantidade de ligação antigeno/autoanticorpo em cada quantidade de antigeno usada na série de titulação e a representação gráfica de uma curva da quantidade de ligação especifica versus a quantidade de antigeno para cada quantidade de antigeno usada na série de titulação, o parâmetro da curva secundária é calculado. O parâmetro da curva secundária pode ser calculado a partir de uma curva de regressão linear ou logaritmica. Aqui, um parâmetro de curva secundária é qualquer valor calculado que forneça uma indicação da natureza da curva. Por exemplo, o parâmetro da

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45/97 curva secundária pode ser Inclinação, Intercepto, AUC, InclinaçãoMáx ou constante de dissociação (Kd) . Esses parâmetros da curva secundária estão ilustrados na Figura 1.

[0087]

A inclinação é calculada usando-se a equação:

7,(x - - y) onde b é a Inclinação, x refere-se à concentração de antigeno (nM), e y refere-se ao valor de DO em unidades de absorbância (UA) .

[0088]

A Inclinação pode ser calculada quer a partir da curva de regressão linear quer a partir da curva de regressão logaritmica, ou tanto a partir da curva de regressão linear como a partir da curva de regressão logaritmica, para cada amostra.

[0089]

O Intercepto da linha de regressão é o valor da linha no eixo y quando x=0.

[0090]

O Intercepto pode ser calculado quer a partir da curva de regressão linear quer a partir da curva de regressão logaritmica, ou tanto a partir da curva de regressão linear como a partir da curva de regressão logaritmica, para cada amostra.

[0091]

A AUC pode ser calculada usando-se a regra dos trapézios somados, que pode ser realizada estimando-se a integral definida entre cada conjunto de concentrações de antigeno seguindo-se a fórmula:

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46/97

[0092] Este cálculo é repetido para cada par de concentrações de antigeno consecutivas e os valores resultantes são somados para dar um valor total para a AUC.

[0093] A AUC pode ser calculada quer a partir da curva de regressão linear quer a partir da curva de regressão logaritmica, ou tanto a partir da curva de regressão linear como a partir da curva de regressão logaritmica, para cada amostra.

[0094] A InclinaçãoMáx pode ser calculada usando-se a mesma fórmula da Inclinação, discutida acima. No entanto, para se determinar o maior valor possivel da Inclinação para cada amostra, um valor de Inclinação é obtido para cada par de concentrações de antigeno consecutivas, com o valor de Inclinação de maior magnitude representando a InclinaçãoMáx.

[0095] A InclinaçãoMáx pode ser calculada quer a partir da curva de regressão linear quer a partir da curva de regressão logaritmica, ou tanto a partir da curva de regressão linear como a partir da curva de regressão logaritmica, para cada amostra.

[0096] A constante de dissociação (Kd) pode ser calculada ajustando-se uma curva logística de quatro parâmetros para cada conjunto de pontos de titulação e um método de solução iterative é usado para fornecer valores

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47/97 para os parâmetros assintota minima (A), fator de inclinação (B), ponto de inflexão (C) e assintota máxima (D) usando-se a fórmula F(x)=((A-D)/(1+((x/C)^ΛΒ)))+D, por meio de que a soma dos resíduos quadrados é minimizada. 0 ponto de inflexão para esses dados resolvidos corresponde à Kd da ligação antígeno/autoanticorpo.

[0097] Em certas modalidades, o parâmetro da curva secundária pode ser determinado ajustando-se uma curva logística, tal como uma curva logística de 4 parâmetros, à curva da quantidade de ligação específica versus a quantidade de antigeno para cada quantidade de antigeno usada na série de titulação. Nesta modalidade, o parâmetro da curva secundária pode ser Assintota Máxima, Assintota Mínima, Inclinação de Colina (ou Fator de Inclinação) ou Ponto de Inflexão.

[0098] Uma Curva Logística de 4 Parâmetros (4PL) é uma curva definida pela fórmula:

F(x) = ((A-D)/(1+((x/C)^ΛΒ))) + D, onde A = Assintota Mínima, B = Inclinação de Colina (ou Fator de Inclinação), C = Ponto de Inflexão e D = Assintota Máxima.

[0099] Para determinar os parâmetros da curva secundária, nesta modalidade, calcula-se uma curva 4PL para cada amostra e antigeno, usando-se uma função de solução iterativa. Aqui, os 4 parâmetros são definidos como valores

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48/97 próximos ao valor esperado para cada um, com as seguintes restrições: o valor da Assíntota Mínima é fixado em 0, o valor da Inclinação de Colina é limitado a valores positivos e o Ponto de Inflexão é limitado a um valor máximo de 1000.

[0100] A diferença entre cada ponto da curva de titulação e o ponto correspondente na curva 4PL (retornado pela fórmula F(x) = ( (A-D)/(1+((x/C)^ΛΒ) ) ) + D) pode, então, ser calculado; as diferenças, elevadas ao quadrado; e os valores de todas as diferenças quadráticas, somadas.

[0101] Os valores usados para os 4 parâmetros da curva secundária são, então, ajustados e a soma das médias quadráticas, calculada repetidamente de uma maneira iterativa até que a soma das médias quadráticas seja tão próxima de zero quanto possível. A solução iterativa pode ser executada usando-se a função SOLVER do Microsoft Excel.

[0102] Uma vez que um parâmetro de curva secundária tenha sido obtido, ele será combinado com os dados de ligação antígeno/autoanticorpo para se determinar a presença ou ausência do autoanticorpo. Aqui, a quantidade de ligação específica entre o autoanticorpo e o antígeno será comparada com um valor de corte (cut-off) predeterminado, como descrito acima.

[0103] O ponto de corte (cut-off) para o parâmetro da curva secundária é determinado usando-se amostras sabidamente positivas (por exemplo, um conjunto de conjuntos

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49/97 de amostras caso-controle consistindo em uma coorte de pacientes com doença) e amostras sabidamente negativas (por exemplo, uma coorte de indivíduos normais em estudos casocontrole) . Para cada amostra é representada uma curva da quantidade de ligação especifica versus a quantidade de antigeno para cada quantidade de antigeno usada nas séries de titulação e o parâmetro da curva secundária observado na amostra sabidamente positiva (por exemplo, pacientes com doença) é comparado com a parâmetro da curva secundária observado na amostra sabidamente negativa (por exemplo, indivíduos normais). São escolhidos valores de corte (cutoff) para os parâmetros da curva secundária que maximizam a especificidade (poucos falso-positivos) quando usados em combinação com o corte (cut-off) de ligação ao antigeno/autoanticorpo discutido acima.

[0104] Uma vez calculado o valor de corte (cutoff) para o parâmetro da curva secundária, também é determinada a direcionalidade necessária para uma leitura positiva, isto é, se um valor acima ou abaixo do limite (cut-off) é considerado positivo. A direcionalidade necessária para uma leitura positiva dependerá do antigeno e do parâmetro da curva secundária.

[0105] Considera-se que uma medida é, em última análise, positiva, isto é, indicativa da presença de autoanticorpo na amostra de ensaio, se ela estiver tanto

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50/97 acima do limite para a ligação antigeno/autoanticorpo como demonstrar a direcionalidade necessária para uma leitura positiva em comparação com o limite (cut-off) para o parâmetro da curva secundária.

[0106] Como descrito no documento WO2015/193678 (cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), incluir um parâmetro de curva secundária na metodologia do ensaio aumenta a especificidade do imunoensaio, aumentando-se o Valor Preditivo Positivo (VPP), quando comparado com métodos alternativos baseados apenas na quantidade de ligação especifica entre um autoanticorpo na amostra de ensaio.

[0107] Deve-se entender que, que embora a descrição do método de duplo corte (cut-off) aqui incluida seja focada no uso de um único parâmetro de curva secundária em combinação com a medição da quantidade de ligação antigeno/autoanticorpo, está contemplado o uso de múltiplos parâmetros de curva secundária. Portanto, em certas modalidades, os métodos da invenção utilizam dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais parâmetros de curva secundária.

[0108] O método de duplo corte (Cut-off) é vantajoso para uso em ensaios clinicos diagnósticos, prognósticos, preditivos e/ou de monitoramento onde as quantidades absolutas de autoanticorpos-alvo presentes e o nivel de ligação observado na ausência do autoanticorpo-alvo

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51/97 podem variar enormemente de paciente para paciente. Se tais ensaios forem baseados na detecção da ligação de autoanticorpos usando-se uma única quantidade/concentração de antígeno de ensaio, amostras de pacientes contendo uma quantidade de autoanticorpo que esteja no extremo muito baixo ou muito alto da faixa fisiológica normal de quantidade de autoanticorpo na população pode não ser detectada devido a limitações da metodologia do ensaio; amostras com baixa quantidade de autoanticorpos podem ser classificadas como resultados falso-negativos, ao passo que aquelas com níveis muito altos de autoanticorpos podem estar fora da escala para uma detecção acurada dentro da metodologia de ensaio escolhida. 0 uso do método de titulação em combinação com o cálculo de um parâmetro de curva secundária pode explicar essas diferenças nos níveis de autoanticorpos e diferenças no nível de ligação observado.

[0109] Deve-se notar que a modalidade de duplo corte (cut-off) pode ser usada com todos os métodos da invenção, incluindo métodos de detecção de um autoanticorpo, métodos de detecção de câncer de fígado, métodos de diagnóstico e tratamento de câncer de fígado, métodos de predição da resposta a um tratamento contra câncer de fígado e métodos de determinação de um perfil de anticorpos. Adicionalmente, o método de duplo corte (cut-off) pode ser usado em modalidades em que apenas um único autoanticorpo é detectado,

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52/97 assim como em modalidades em que um painel de antigenos é usado para detectar múltiplos autoanticorpos. Na modalidade do painel, deve-se notar que o parâmetro da curva secundária calculado para cada antigeno dentro do painel não necessita ser necessariamente o mesmo. No entanto, em algumas modalidades, o parâmetro da curva secundária calculado para cada antigeno dentro do painel pode ser o mesmo.

Formatos de ensaios [0110] As características gerais de imunoensaios, por exemplo ELISA, radioimunoensaios e semelhantes, são bem conhecidas dos especialistas na técnica (vide Immunoassay, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência).

[0111] Imunoensaios para a detecção de autoanticorpos tendo uma especificidade imunológica particular geralmente requerem o uso de um reagente (antigeno) que exibe uma reatividade imunológica especifica com um autoanticorpo relevante. Dependendo do formato do ensaio, este antigeno pode ser imobilizado sobre um suporte sólido. Uma amostra de ensaio é colocada em contato com o antigeno e, se autoanticorpos com a especificidade imunológica necessária estiverem presentes na amostra, eles reagirão imunologicamente com o antigeno para formarem

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53/97 complexos antigeno / autoanticorpo que podem, então, ser detectados ou medidos quantitativamente.

[0112] Os métodos da invenção podem ser realizados em qualquer formato adequado que permita o contato entre uma amostra de ensaio que se suspeite contenha o autoanticorpo e o antigeno. Convenientemente, o contato entre a amostra de ensaio e o antigeno pode ocorrer em câmaras de reação separadas, tais como os poços de uma placa de microtitulação, permitindo que diferentes antigenos ou diferentes quantidades de antigeno sejam ensaiados em paralelo, caso necessário. Em modalidades nas quais são necessárias quantidades variáveis do antigeno, estas podem ser usadas para revestir os poços da placa de microtitulação preparandose diluições seriadas a partir de um estoque de antigeno nos poços da placa de microtitulação. O estoque de antigeno pode ser de concentração conhecida ou desconhecida. Alíquotas da amostra de ensaio podem, então, ser adicionadas aos poços da placa, com o volume e a diluição da amostra de ensaio mantidos constantes em cada poço. As quantidades absolutas de antigeno adicionadas aos poços da placa de microtitulação podem variar dependendo de fatores tais como a natureza do autoanticorpo-alvo, a natureza da amostra de ensaio, a diluição da amostra de ensaio etc., como será entendido pelos especialistas na técnica. Geralmente, as quantidades de antigeno e a diluição da amostra de ensaio

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54/97 serão selecionadas de modo a produzir um intervalo de intensidades de sinal que caia dentro do intervalo de detecção aceitável de leitura escolhido para detecção de ligação antigeno / autoanticorpo no método. Convenientemente, as quantidades testadas de antigeno podem variar no intervalo de 1,6 nM a 160 mM.

[0113] Em uma outra modalidade da invenção, o antigeno pode ser imobilizado em uma localização discreta ou local de reação sobre um suporte sólido. Em modalidades onde são necessárias quantidades diferentes do antigeno, estas podem ser imobilizadas em localizações discretas ou locais de reação sobre um suporte sólido. Todo o suporte pode, então, ser colocado em contato com a amostra de teste e a ligação do autoanticorpo ao antigeno, detectada ou medida separadamente em cada uma das localizações discretas ou locais de reação. Suportes sólidos adequados incluem microarranjos (microarrays). Quando são necessárias quantidades diferentes de antigeno, os microarranjos (microarrays) podem ser preparados imobilizando-se diferentes quantidades de um antigeno particular em locais de reação separados e resolviveis no arranjo (array). Em outras modalidades, a quantidade real de moléculas de antigeno imobilizadas pode ser mantida substancialmente constante, mas o tamanho dos locais ou pontos (spots) no arranjo (array), variado de modo a se alterar a quantidade

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55/97 de epitopo de ligação disponível, fornecendo-se uma série de titulação de locais ou pontos (spots) com diferentes quantidades de epítopo de ligação disponível. Em tais modalidades, a concentração de superfície bidimensional do(s) epítopo (s) de ligação sobre o antígeno é importante na preparação da série de titulação, e não a quantidade absoluta de antígeno. Técnicas para a preparação e interrogação de microarranjos (microarrays) de proteínas/peptídeos são geralmente conhecidas na técnica.

[0114] Microarrays podem ser usados para realizar múltiplos ensaios para autoanticorpos de especificidades diferentes com uma única amostra em paralelo. Isto pode ser feito usando-se arranjos (arrays) que compreendem múltiplos antígenos ou conjuntos de antígenos.

[0115] Certos antígenos podem compreender ou ser originados de proteínas ou polipeptídeos isolados a partir de fontes naturais, incluindo mas não limitados a proteínas ou polipeptídeos isolados de tecidos provenientes de pacientes ou fluidos corporais (por exemplo, plasma, soro, sangue total, urina, suor, linfa, fezes, líquido cerebrospinal, líquido ascítico, efusão pleural, líquido seminal, escarro, aspirado de mamilo, seroma pós-operatório e líquido de drenagem de feridas). Em tais modalidades, o antígeno pode compreender substancialmente toda a proteína de ocorrência natural, isto é, proteína substancialmente na

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56/97 forma em que é isolada a partir da fonte natural, ou pode compreender um fragmento da proteina de ocorrência natural. Para ser eficaz como um antigeno no método da invenção, qualquer fragmento deste tipo deve manter a reatividade imunológica com os autoanticorpos em cujos testes será usado. Fragmentos adequados podem, por exemplo, ser preparados por divagem quimica ou enzimática da proteina isolada.

[0116] Em certas modalidades, e dependendo da natureza precisa do ensaio em que será usado, o antigeno pode compreender uma proteina de ocorrência natural, ou um fragmento da mesma, ligada a uma ou mais moléculas adicionais que lhe confiram alguma característica desejável que não esteja naturalmente presente na proteina. Por exemplo, a proteina ou fragmento podem ser conjugados a um marcador revelador, tal como, por exemplo, um marcador fluorescente, marcador colorido, marcador luminescente, marcador radioativo ou metal pesado, tal como ouro coloidal. Em outras modalidades, a proteina ou fragmento podem ser expressos como uma proteina de fusão produzida de forma recombinante. A titulo de exemplo, as proteínas de fusão podem incluir um peptideo marcador (tag) na extremidade Nou C- terminal para auxiliar na purificação do antigeno expresso de forma recombinante.

[0117] Dependendo do formato do ensaio em que será usado, o antigeno pode ser imobilizado sobre um suporte

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57/97 sólido, tal como, por exemplo, um chip, lâmina, poços de uma placa de microtitulação, conta (bead), membrana ou nanopartícuia. A imobilização pode ser efetuada através de adsorção não covalente, ligação covalente ou através de marcadores (tags).

[0118] Quaisquer meios de ligação adequados podem ser usados contanto que isto não afete adversamente a capacidade de o antigeno reagir imunologicamente com o autoanticorpo-alvo em um grau significativo.

[0119] A invenção não se limita a ensaios de fase sólida, mas também abrange ensaios que, no todo ou em parte, são conduzidos em fase liquida, por exemplo ensaios com contas (beads) em fase de solução ou ensaios de competição.

[0120] Em uma modalidade, os antigenos podem ser marcados com um ligante que facilitaria a imobilização, tal como a biotina. O antigeno pode, então, ser diluido para um intervalo de titulação adequado e reagir em solução com autoanticorpos em amostras provenientes de pacientes. Os complexos imunes resultantes podem, então, ser imobilizados sobre um suporte sólido através de uma interação ligantereceptor (por exemplo, biotina-estreptavidina) e o restante do ensaio, realizado como descrito abaixo.

[0121] Para facilitar a produção de antigenos biotinilados para uso nos métodos de ensaio da invenção, os cDNAs que codificam um antigeno completo, uma versão truncada

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58/97 dos mesmos ou um fragmento antigênico dos mesmos podem ser expressos como uma proteína de fusão marcada com uma marcação (tag) de proteína ou polipeptídeo à qual pode ser ligado

o cofator de	biotina, por	exemplo, através	de uma reação
enzimática.
[0122]	Os vetores	para a produção	de antigenos
recombinantes	biotinilados	estão disponíveis	comercialmente

a partir de diversas fontes. Alternativamente, os antigenos biotinilados podem ser produzidos por ligação covalente de biotina à molécula de antígeno após expressão e purificação.

[0123] Como dito anteriormente, o imunoensaio usado para detectar autoanticorpos de acordo com a invenção pode ser baseado em técnicas padrão conhecidas na técnica. Em uma modalidade mais preferida, o imunoensaio pode ser um ELISA. Em geral, os ELISAs são bem conhecidos na técnica. Em um ELISA indireto típico, imobiliza-se um antígeno com especificidade para os autoanticorpos em ensaio sobre uma superfície sólida (por exemplo, os poços de uma placa de ensaio de microtitulação padrão ou a superfície de uma microconta (microbead) ou de um microarranjo (microarray)) e uma amostra compreendendo fluido corporal a ser testado quanto à presença de autoanticorpos é colocada em contato com o antígeno imobilizado. Quaisquer autoanticorpos com a especificidade desejada presentes na amostra se ligarão ao antígeno imobilizado. Os complexos

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59/97 antigeno / autoanticorpo ligados podem, então, ser detectados usando-se qualquer método adequado. Em uma modalidade preferida, um anticorpo secundário antiimunoglobulina humana marcado, que reconhece especificamente um epitopo comum a uma ou mais classes de imunoglobulinas humanas, é usado para detectar os complexos antigeno / autoanticorpo. Tipicamente, o anticorpo secundário será anti-IgG ou anti-IgM. 0 anticorpo secundário normalmente é marcado com um marcador detectável, tipicamente um marcador enzimático, tal como, por exemplo, peroxidase ou fosfatase alcalina, permitindo a detecção quantitativa pela adição de um substrato para a enzima que gera um produto detectável, por exemplo, um produto quimioluminescente, colorido ou fluorescente. Outros tipos de marcadores detectáveis conhecidos na técnica podem ser usados com efeito equivalente.

Aplicações do método da invenção [0124] A presente invenção fornece o uso de um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9 AIF1, EpCAM e CDKN1B em um método para detectar câncer de figado em um individuo mamifero detectando-se um autoanticorpo imunologicamente especifico para MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do individuo mamifero, método este que compreende as etapas de:

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60/97 (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

por meio de que a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de figado.

[0125] Dentro desta modalidade da invenção, todas as limitações discutidas acima em relação aos vários métodos da invenção estão contempladas em relação a este uso.

[0126] Os métodos de ensaio de acordo com a invenção podem ser usados em uma variedade de situações clinicas diferentes. Em particular, o método pode ser usado na detecção ou diagnóstico de câncer de figado, na avaliação do prognóstico de um paciente que recebeu diagnóstico de câncer de figado, na predição da resposta à terapia, no monitoramento da evolução do câncer de figado em um paciente, na triagem de uma população de indivíduos humanos assintomáticos para diagnosticar a presença de câncer de figado, na predição da resposta de um paciente com câncer de figado a um tratamento contra câncer de figado (por exemplo, quimioterapia, ablação por radiofrequência, ressecção hepática, transplante hepático, vacinação, terapias com fator anticrescimento ou transdução de sinal, terapia

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61/97 endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioembolização arterial com transcateter, injeção percutânea de etanol, ablação por micro-ondas, administração de sorafenibe e radioembolização), no monitoramento da resposta de um paciente com câncer de fígado ao tratamento contra câncer de fígado (por exemplo, quimioterapia, ablação por radiofrequência, ressecção hepática, transplante hepático, vacinação, terapias com fator anticrescimento ou transdução de sinal, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioembolização arterial com transcateter, injeção percutânea de etanol, ablação por micro-ondas, administração de sorafenibe e radioembolização), na detecção de doença recorrente em um paciente que tenha previamente recebido diagnóstico de câncer de fígado e que tenha sido submetido a tratamento contra câncer de fígado para reduzir a quantidade de câncer de fígado presente, na seleção de uma terapia contra câncer de fígado (por exemplo, quimioterapia, ablação por radiofrequência, ressecção hepática, transplante hepático, vacinação, terapias com fator anticrescimento ou transdução de sinal, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioembolização arterial com transcateter, injeção percutânea de etanol, ablação por micro-ondas, administração de sorafenibe e radioembolização) para uso em um paciente em particular ou na determinação de

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62/97 um perfil de anticorpos em um paciente com suspeita de ter câncer de figado ou que tem câncer de figado.

Kits [0127] A presente invenção abrange um kit adequado para se realizar qualquer um dos métodos da invenção, em que o kit compreende:

(a) um ou mais antigenos marcadores tumorais; e

(b) um	reagente que	tem a	capacidade	de detectar
complexos do antigeno autoanticorpos presentes na	marcador tumoral amostra de ensaio.	ligados	a
[0128]	A invenção	também	abrange um	kit para	a
detecção de	autoanticorpos	em uma	amostra de	ensaio que

compreende um fluido corporal proveniente de um individuo mamifero que compreende:

(a) um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) um reagente que tem a capacidade de detectar complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio.

[0129] Em certas modalidades, o kit pode compreender adicionalmente:

(c) meios para se colocar em contato o antigeno marcador tumoral com uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um individuo mamifero.

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63/97 [0130] Exemplos de meios para se colocar em contato o antigeno marcador tumoral com uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamifero incluem a imobilização do antigeno marcador tumoral sobre um chip, lâmina, poços de uma placa de microtitulação, conta (bead), membrana ou nanoparticula.

[0131] Em algumas formas de realização, o antigeno marcador tumoral dentro do kit pode estar presente dentro de um painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais. Dentro desta modalidade, o kit pode compreender dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco, vinte e seis, vinte e sete, vinte e oito, vinte e nove, trinta, trinta e um, trinta e dois, trinta e três, trinta e quatro, trinta e cinco, trinta e seis, trinta e sete, trinta e oito ou mais antigenos. Estes antigenos podem ser antigenos distintos, em que antigenos distintos são antigenos originados de diferentes proteínas ou polipeptideos (tais como antigenos originados de proteínas não relacionadas codificadas por genes diferentes) ou antigenos que são originados de diferentes epitopos peptidicos de uma única proteína ou polipeptideo, como definido acima.

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64/97 [0132] Em uma modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. Em uma certa modalidade especifica, o painel pode consistir em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.

[0133] Em uma modalidade especifica, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender um ou mais antigenos marcadores tumorais selecionados do grupo que consiste em NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1. Dentro desta modalidade, o painel pode compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco, vinte e seis, vinte e sete, vinte e oito, vinte e nove, trinta, trinta e um, trinta e dois, trinta e três ou trinta e quatro dos antigenos marcadores enumerados. De acordo com a invenção, o painel também compreenderá MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B e poderá compreender um, dois, três ou quatro destes antigenos marcadores tumorais. Em modalidades em que dois ou três destes antigenos marcadores tumorais estão incluidos no painel, estão contempladas todas as combinações de dois ou

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65/97 três destes antigenos. Em modalidades especificas, o painel pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.

[0134] Em uma modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em MMP9, AIF1, EpCAM, NYESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.

[0135] Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1. Em uma modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.

[0136] Em uma modalidade adicional, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.

[0137] Ainda em uma modalidade adicional, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NYESO-1, CAGE, RalA e SOX2. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir

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em	MMP9, AIF1,	EpCAM,	DDX3X,	SALL4, MAGE	A4,	NY-ESO-1,	CAGE,
RalA e SOX2.
	[0138]	Ainda	em uma	modalidade	adicional, o	painel
de	dois ou	mais	antígenos marcadores	tumorais	pode

compreender EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NYESO-1. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode consistir em EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.

[0139] Ainda em uma modalidade adicional, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode compreender AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transíerrina. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode consistir em AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transíerrina.

[0140] Em uma modalidade específica, o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais pode compreender NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1. De acordo com a invenção, o painel também compreenderá MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B e poderá compreender um, dois, três ou quatro destes antígenos marcadores tumorais. Em modalidades em que dois ou três destes antígenos marcadores tumorais estão incluídos no

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67/97 painel, estão contempladas todas as combinações de dois ou três destes antigenos. Em modalidades especificas, o painel pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B. Por exemplo, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1. Alternativamente, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.

[0141] Em uma modalidade especifica, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X e AIF1. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X e AIF1.

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68/97 [0142] Em uma modalidade especifica, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode compreender CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP. Em uma outra modalidade, o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais pode consistir em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1 SOX2 e AFP.

[0143] O kit da invenção pode ser adequado para a detecção de câncer de figado.

[0144] Em certas modalidades, o kit pode ser para a detecção de câncer de figado.

[0145] Dentro dos kits da invenção, o fluido corporal pode ser selecionado do grupo que consiste em plasma, soro, sangue total, urina, suor, linfa, fezes, liquido cerebrospinal, liquido ascitico, efusão pleural, liquido seminal, escarro, aspirado de mamilo, seroma pósoperatório, saliva, liquido amniótico, lágrimas e liquido de drenagem de feridas.

[0146] A invenção será adicionalmente compreendida com referência aos seguintes exemplos experimentais não limitantes.

Exemplos

Exemplo 1 - protocolo geral para a medição de autoanticorpos contra proteínas associadas a tumores

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69/97 [0147] Amostras de antigenos marcadores tumorais podem ser preparadas por expressão recombinante, seguindose métodos análogos aos descritos no documento WO 99/58978 (cujo conteúdo é aqui incorporado por referência). Resumidamente, os cDNAs codificando os antigenos marcadores de interesse foram clonados no vetor pET21 (Invitrogen) modificado de modo a codificar um marcador (tag) de biotina e uma cauda (tag) de 6xhistidina para auxiliar na purificação da proteina expressa. Os clones resultantes foram cultivados em E. coli BL21 (DE3), sendo as bactérias subsequentemente lisadas. Os antigenos expressos foram recuperados através de colunas de afinidade de quelato de niquel (HiTrap, comercialmente disponível da GE Healthcare), seguindo-se o protocolo do fabricante. A pureza, especificidade e rendimento da proteina expressa foram avaliados por SDS-PAGE, Western blot e ensaio de proteina antes do armazenamento.

[0148] Uma proteina de controle negativo, VOL, foi produzida pela transformação de E. coli BL21 (DE3) com o vetor pET21 vazio (ou seja, sem cDNA codificando o antigeno associado a tumores). A proteina expressa e purificada inclui as mesmas sequências marcadoras (sequências tag) de His e biotina encontradas nos antigenos recombinantes associados a tumores e permite a correção da ligação não

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70/97 especifica de autoanticorpos a contaminantes bacterianos residuais.

[0149] Os números de acesso do GenBank para diversos cDNAs de marcadores são os seguintes:

AFP: NM_001134.1

AIF1: NM_001623.3

AKR1B10: NM_020299.4.

APOA1: NM_000039.1.

BCL2: NM_000633.2

CAGE: NM_182699

CALR: NM_004343.3

CD44: NM_001001389

CDKN1B: NM_004064.4

CK18: NM_000224

CPS1: NM_001875.4

CCNB1: NM_031966.2

CYCLIN Bl: NM_031966.2

DDX3X: NM_001356.3

EpCAM: NM_002354

FUCA1: NM_000147.4

GLUL: NM_001033044.2

HNRNP-A2: NM_002137.3

HNRNP-L: NM_001533.2

HSPA2: NM_021979.3.

HSPA4: NM 002154.3

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71/97

HSPD1: NM_002156.4

IL8: NM_000584.3

MAGE A4: NM_001011548.1

MDM2: NM_002392.5

MMP9: NM_004994.2.

NPM1: NM_002520.6

NY-ESO-1: NM 001327

PEBP1: NM_002567.2

P62: NM_001007225.1

Prolactina: NM_000948.5

RalA: NM_005402.2

RGN: NM_004683.5

SALL4: NM_020436.3.

SOX2: NM_003106

SPP1: NM_001040058.1

SSX2: NM_175698.1

TGFB1: NM_000660.5

Transferrina: NM_001063.3

Vimentina: NM_003380.3

YWHAZ: NM_001135699.1 [0150] Os antigenos e VOL (controle negativo) foram diluídos para concentrações apropriadas em tampão de ligação com alta concentração de fosfato e, então, diluídos para fornecer quer duas concentrações de proteína separadas, como no formato de ensaio de alto

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72/97 rendimento (HTPA, do inglês high-throughput assay) (Figura 2A) , quer um intervalo de titulação semilogaritmica, como no formato do ensaio de titulação (Figura 2B). As diluições de antigenos foram dispensadas a 50 μΐ/poço nas fileiras de uma placa de microtitulação Falcon, de acordo com a disposição (layout) da placa (Figuras 2A e 2B), usando-se um sistema automatizado de manipulação de liquidos. As placas foram cobertas e armazenadas a 18-22°C durante 18-24 h.

[0151] As placas foram bloqueadas com tampão de ligação com gelatina de pele de porco (PSGBB, PBS + gelatina de pele de porco 0,1% + azida sódica 0,05%) a 200 μΐ/poço durante uma hora. As amostras de soro foram descongeladas, submetidas a vórtice e diluidas a 1/110 em PSGBB a 18-22°C. As placas foram aspiradas e batidas suavemente para secar. Cada amostra de soro diluida foi dispensada a 50 μΐ/poço em todos os poços da placa de microtitulação usando-se um instrumento automatizado de manipulação de liquidos. As placas foram cobertas e incubadas durante 1,5 horas à temperatura ambiente com agitação.

[0152] Etapa de lavagem: As placas foram lavadas três vezes em PBS + Tween 20 0, 1% usando-se uma lavadora automática de placas e, então, batidas suavemente para secar sobre papel absorvente.

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73/97 [0153] Imunoglobulina de coelho anti-humana conjugada com peroxidase de rábano (Dako, 1/5.000 em PSGBB) foi dispensada a 50 μΐ/poço em todos os poços das placas de microtitulação. As placas foram, então, incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora sob agitação. As placas foram lavadas como descrito acima.

[0154] O substrato TMB previamente preparado foi adicionado a cada placa a 50 μΐ/poço e incubado na bancada durante 15 minutos. As placas foram batidas suavemente para misturar. A densidade óptica de cada poço foi determinada a 650 nm usando-se um leitor espectrofotométrico padrão de placas.

Exemplo 2 - Detecção de autoanticorpos em carcinoma hepatocelular (HCC) por HTPA [0155] Os seguintes dados foram obtidos de um estudo piloto para avaliar a sensibilidade e especificidade de um painel de ensaios com autoanticorpos na detecção de HCC usando-se o formato HTPA. Os estados clinico e demográfico dos indivíduos incluídos no estudo são fornecidos nas Tabelas 1-4 .

Petição 870190066936, de 16/07/2019, pág. 78/108 [0156] Tabela 1 - Estado demográfico dos pacientes incluídos no estudo descrito no Exemplo 2

Fator demográfico	Pacientes com HCC	Pacientes com doença hepática benigna	Indivíduos sem evidência de malignidade
Número	99	99	99
Idade média	62,3	58,1	62,2
Intervalo de idade	30-91	30-89	30-87
% Masculino	69	69	69

[0157] Tabela 2 - Tamanho do tumor primário presente nos pacientes com HCC

	Número de pacientes disponíveis	média	Mín-Máx
Tamanho do tumor primário (cm)	88	5, 9	0,4-19

[0158] Tabela 3 - Estádio tumoral dos pacientes com

HCC usando-se estadiamento TNM

Estádio TNM	Número
1	35
2	21

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75/97

3	21
4	2
N/D	20

TNM = Classificação TNM do sistema de estadiamento de

Tumores Malignos; N/D = não disponível [0159] Tabela 4 - Doença hepática presente nos pacientes de doença hepática benigna

Origem benigna	Número
Infecção viral - Hepatite C	67
Infecção viral - Hepatite B	22
Doença Hepática Alcoólica	6
Hepatite Autoimune	2
Hemocromatose	1
Cirrose Biliar Primária	1
Total	99

[0160] O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo fornecido no Exemplo 1 usando-se os antígenos listados na Tabela 5. O limite (cut-off) do ensaio foi determinado selecionando-se o valor de corte (cut-off) que resultava no maior valor de Youden, enquanto se mantinha a especificidade do marcador individual maior que 90%. Os resultados são mostrados na Tabela 5 e fica evidente que alguns desses marcadores de autoanticorpos demonstram níveis

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76/97 mais altos de positividade em pacientes com HCC do que naqueles com doença hepática benigna ou nos controles saudáveis; sendo assim, eles podem ter a capacidade de distinguir pacientes com HCC de pacientes sem qualquer evidência de malignidade.

[0161] Além disso, fica evidente que a medição de um painel de AAbs aumenta a capacidade de se distinguirem os pacientes com HCC daqueles com doença hepática não cancerosa, em comparação com qualquer AAb sozinho. Os Painéis 1 e 2 (Tabelas 6 e 10) mostram como é possível combinar diferentes conjuntos de AAbs para se obterem desempenhos semelhantes, ao mesmo tempo que se otimizam certas características para se atender a necessidades clínicas variadas. O Painel 1 (Tabela 6) contém marcadores úteis para todos os pacientes. A otimização dos marcadores incluídos em painéis por gênero, como no Painel 2 (Tabela 10) aumenta a especificidade em comparação com o Painel 1, com uma pequena redução na sensibilidade. Isso demonstra a capacidade de se construírem painéis diferentes para se atender a necessidades clínicas variadas. As Tabelas 7 e 11 mostram que cada um dos painéis pode detectar pacientes com cânceres nos estádios 1 e 2, o que constitui um diagnóstico precoce crucial que leva ao tratamento efetivo de HCC.

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77/97 [0162] Tabela 5 - Positividade de marcadores AAb individuais em cada grupo

	HCC	Benigno	Normal
Positivos	%	Positivos	%	Positivos	%
AIF1	2	2,0	0	0	0	0
AKR1B10	1	1,0	0	0	0	0
ApoAl	1	1,0	0	0	0	0
BCL2	3	3, 0	1	1,0	1	1,0
CD44	1	1,0	0	0	0	0
CDKN1B	2	2,0	0	0	1	1,0
CK18	1	1,0	0	0	0	0
CPS1	2	2,0	1	1,0	0	0
DDX3X	3	3, 0	1	1,0	2	2,0
EpCAM	5	5, 1	1	1,0	6	6, 1
FUCA1	1	1,0	0	0	0	0
GLUL	1	1,0	0	0	0	0
HNRNP-A2	1	1,0	0	0	0	0
HNRNP-L	3	3, 0	2	2,0	0	0
HSPA2	1	1,0	0	0	0	0
HSPA4	5	5, 1	1	1,0	0	0
HSPD1	2	2,0	2	2,0	0	0
IL-8	5	5, 1	4	4,0	4	4,0
MDM2	2	2,0	1	1,0	0	0
MMP9	3	3, 0	1	1,0	1	1,0

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78/97

NPM1	2	2,0	1	1,0	0	0
NY-ESO-1	7	7, 1	0	0	1	1,0
PEBP1	1	1,0	0	0	0	0
Prolactina	2	2,0	1	1,0	1	1,0
RGN	1	1,0	0	0	0	0
SALL4	1	1,0	0	0	0	0
SPP1	1	1,0	1	1,0	0	0
SSX2	3	3, 0	1	1,0	1	1,0
TF	2	2,0	0	0	0	0
TGFB1	1	1,0	0	0	0	0
Vimentina	7	7, 1	3	3, 0	6	6, 1
YWHAZ	2	2,0	1	1,0	2	2,0

Painel 1 - Painel Geral [0163] O Painel 1 foi formado usando-se NRI (Net Reclassification Improvement, Melhora Liquida da Reclassificação) e contém os antigenos marcadores tumorais EpCAM, AIF1 e MMP9 juntamente com NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina, em que o resultado é positivo se qualquer um dos niveis de AAb dados estiverem acima de seu limite (cut-off) gerado como descrito no Exemplo 2. As Tabelas 6 e 7 mostram o desempenho do painel no conjunto de amostras descrito no Exemplo 2.

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79/97 [0164] Tabela 6 - Desempenho e composição do Painel

Painel 1	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normal (%)
NY-ESO-1, EpCAM, HSPA4, vimentina, HNRNP-L, transferrina, AIF1, MMP9	28,3	94	87, 9

[0165] Tabela 7 - Desempenho do Painel 1 por estádio

TNM

Estádio	Positivo	Negativo	Sensibilidade
1	8	27	23
2	4	17	19
3	8	13	38
4	0	2	0

Painel 2 - Painéis individuais para homens e mulheres [0166] O Painel 2 foi formado dividindo-se o conjunto de amostras descrito no Exemplo 2 em grupos separados por gênero e realizando-se uma NRI separada para cada grupo. O Painel 2 contém os antigenos marcadores

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80/97 tumorais EpCAM, AIF1 e MMP9 juntamente com HSPA4, CPS1, NYESO-1, vimentina, HSPA2 e HNRNP-L. O resultado é positivo se o paciente for do sexo feminino e qualquer um dentre HSPA4, AIF1, EpCAM ou CPS1 estiver acima do limite (cut-off) gerado como descrito no Exemplo 2, ou se o paciente for do sexo masculino e qualquer um dentre NY-ESO-1, vimentina, EpCAM, HSPA2, HSPA4 ou HNRNP-L estiver acima do limite (cutoff) gerado como descrito no Exemplo 2. As Tabelas 10 e 11 mostram o desempenho do Painel no conjunto de amostras descrito no Exemplo 2.

[0167] Tabela 8 - Desempenho e constituição do Painel 2a - Mulheres

Painel 2a	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normal (%)
HSPA4, AIF1 EpCAM, CPS1	22, 6	100	100

[0168] Tabela 9 - Desempenho e composição do Painel

2b - Homens

Painel 2b

Sensibilidade (%)

Especificidade benigno (%)

Especificidade normal (%)

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81/97

NY-ESO-1, vimentina, EpCAM, HSPA2, HSPA4, HNRNP-L

25

97, 1

92, 6

[0169] Tabela 10 - Desempenho e composição do Painel

- Combinados

Painel 2	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normal (%)
2a + 2b	24,2	98	94, 9

[0170] Tabela 11 - Desempenho do Painel 2 por estádio

TNM

Estádio	Positivo	Negativo	Sensibilidade (%)
1	6	29	17, 1
2	4	17	19
3	6	15	28, 6
4	0	2	0

Exemplo 3 - Medição adicional de AFP em combinação com autoanticorpos medidos por HTPA

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82/97 [0171] A alfafetoproteina (AFP) circulante foi medida nas amostras de soro para o conjunto de amostras descrito no Exemplo 2, usando-se um ELISA comercialmente disponível (Aviva Systems Biology). Um limite (cut-off) comumente usado de 200 ng/ml foi aplicado para se avaliar a positividade. A Tabela 12 mostra os resultados da adição de AFP aos Painéis 1 e 2 mostrados no Exemplo 2. Fica claro, a partir destes resultados, que o desempenho de AFP em combinação com os painéis AAb é maior do que o desempenho de AFP ou dos painéis AAb sozinhos.

[0172] Tabela 12 - Desempenho de AFP sozinho e quando adicionado aos painéis descritos no Exemplo 2

Combinação de marcadores	Sensibilidade	Especificidade benigno	Especificidade normal
AFP	35,4	100	100
Painel 1 + AFP	52,5	93, 9	87, 9
Painel 2 (combinado) + AFP	49, 5	97, 9	94, 9

Exemplo 4 - Detecção de autoanticorpos em carcinoma hepatocelular (HCC) por ensaio de titulação

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83/97 [0173] Os seguintes dados foram obtidos de um estudo para avaliar a sensibilidade e especificidade de um painel de ensaios com autoanticorpos na detecção de HOC usando-se o formato de placa de titulação (Figura 2B) . Os estados clinico e demográfico dos indivíduos incluídos no estudo são fornecidos nas Tabelas 13-16.

[0174] Tabela 13 - Estado demográfico dos pacientes incluídos no estudo descrito no Exemplo 4

Fator demográfico	Pacientes com HCC	Pacientes com doença hepática benigna	Indivíduos sem evidência de malignidade
Número	98	99	95
Idade média	62, 6	50,7	62,7
Intervalo de idade	30-91	30-82	30-84
% Masculino	69	69	68

[0175] Tabela 14 - Tamanho do tumor primário presente nos pacientes com HCC

	Número de pacientes disponíveis	Média	Mín-Máx
Tamanho do tumor primário (cm)	86	6, 02	0,4-19

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84/97 [0176] Tabela 15 - Estádio tumoral dos pacientes com

HCC usando-se estadiamento TNM

Estádio TNM	Número
1	35
2	20
3	21
4	2
N/A	20

N/A = não aplicável [0177] Tabela 16 - Doença hepática presente nos pacientes de doença hepática benigna

Origem benigna	Número
Infecção viral - Hepatite C	58
Infecção viral - Hepatite B	31
Doença Hepática Alcoólica	6
Hepatite Autoimune	2
Hemocromatose	1
Cirrose Biliar Primária	1
Total	99

[0178] O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo fornecido no Exemplo 1 usando-se os antigenos listados na Tabela 17. O limite (cut-off) do ensaio foi determinado selecionando-se o valor de corte (cut-off) que

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85/97 resultava no maior valor de Youden, enquanto se mantinha a especificidade do marcador individual maior que 90%. Os resultados são mostrados na Tabela 17 e fica evidente que alguns destes marcadores de autoanticorpos demonstram niveis mais altos de positividade em pacientes com HOC do que naqueles com doença hepática benigna ou controles saudáveis, sendo assim, eles podem ter a capacidade de distinguir pacientes com HOC de pacientes sem qualquer evidência de malignidade. Verificou-se que os AAbs que demonstram diferenciação entre câncer/normal no estudo mostrado no Exemplo 2 continuam a mostrar uma capacidade de distinguir pacientes com HCC de pacientes com doença hepática não cancerosa (Benigna) e controles saudáveis (Normais). Além disso, fica evidente que a medição de um painel aumenta novamente a capacidade de se distinguirem pacientes com HCC em comparação com qualquer marcador isolado.

[0179] O painel 3 (Tabela 18) e o Painel 4 (Tabela 22) mostram como é possivel combinar diferentes conjuntos de marcadores para se obterem desempenhos semelhantes, ao mesmo tempo que se otimizam certas caracteristicas para se atender a necessidades clinicas variadas. O painel 3 contém marcadores que podem ser usados para todos os pacientes, enquanto o Painel 4 especifica marcadores diferentes por gênero, o que aumenta a especificidade, ao mesmo tempo que se mantém a sensibilidade (Tabelas 20 e 21). Isso demonstra

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86/97 a capacidade de se construírem painéis diferentes para se atender a necessidades clínicas variadas. Cada um dos exemplos de painéis pode detectar pacientes com cânceres nos estádios 1 e 2, o que é crucial para o diagnóstico precoce e, portanto, para o tratamento efetivo de HCC (Tabelas 19 e 23) .

[0180] Tabela 17 - Positividade de marcadores AAb individuais em cada grupo

	HCC	Benigno	Normal
Positivos	%	Positivos	%	Positivos	%
AIF1	1	1,0	0	0	0	0
CAGE	12	12,2	3	3, 0	9	9, 5
CDKN1B	14	14,3	13	13, 0	21	22, 1
DDX3X	5	5, 1	2	2,0	2	2,1
EpCAM	3	3, 1	0	0	3	3,2
HNRNP-A2	6	6, 1	4	4,0	6	6, 3
HSPA4	4	4,1	1	1,0	0	0
HSPD1	7	7,1	5	5, 0	3	3,2
MAGE A4	3	3, 1	0	0	0	0
MMP9	2	2,0	1	1,0	0	0
NY-ESO-1	8	8,2	0	0	4	4,2
p62	9	9, 2	5	5, 0	2	2,1
RalA	4	4,1	1	1,0	4	4,2
SALL4	6	6, 1	3	3, 0	1	1,1
SOX2	3	3, 1	0	0	1	1,1
Transferrins	7	7,1	5	5, 0	1	1,1

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87/97

YWHAZ

6

(6, 1)

4

(4, 0)

5

(5,3)

Painel 3 [0181] O Painel 3 foi formado usando-se NRI e contém os antigenos marcadores tumorais EpCAM, AIF1 e MMP9 juntamente com DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2, em que o resultado é positivo se qualquer um dos niveis de AAb dados estiver acima do seu limite (cut-off) gerado conforme descrito no Exemplo 4. As Tabelas 18 e 19 mostram o desempenho do painel no conjunto de amostras descrito no Exemplo 4.

[0182] Tabela 18 - Desempenho e composição do Painel

	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normais (%)
DDX3X, SALL4, MAGE A4, MMP9,
AIF1, NY- ESO-1, CAGE, RalA, EpCAM, SOX2	36, 7	89, 9	84,2

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88/97 [0183] Tabela 19 - Desempenho do Painel 3 por estádio

TNM

Estádio	Positivo	Negativo	Sensibilidade (%)
1	10	25	28, 6
2	8	12	40
3	8	13	38
4	1	1	100

Painel 4 - Painéis individuais para homens e mulheres [0184] O Painel 4 foi formado dividindo-se o conjunto de amostras descrito no Exemplo 2 em grupos separados por gênero e realizando-se uma NRI separada para cada grupo. O painel 4 contém os antigenos marcadores tumorais EpCAM e AIF1 juntamente com CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1, HSPD1, SALL4, HSPA4 e transferrina. O resultado é positivo se o paciente for do sexo feminino e qualquer um dentre CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, AIF1, HSPA4 ou transferrina estiver acima do limite (cut-off) gerado conforme descrito no Exemplo 4, ou se o paciente for do sexo masculino e qualquer um dentre CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY-ESO-1 ou EpCAM estiver acima do limite (cut-off) gerado conforme descrito no Exemplo 4. As Tabelas 10 e 11 mostram o desempenho do Painel no conjunto de amostras descrito no Exemplo 4.

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89/97 [0185] Tabela 20 - Desempenho e composição do Painel

- Homens

	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normais (%)
CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X, NY- ESO-1, EpCAM	32,4	95, 6	86, 2

[0186] Tabela 21 - Desempenho e composição do Painel

- mulheres

	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normais (%)
CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, AIF1, HSPA4, transferrina	50	90,3	90

[0187] Tabela 22 - Desempenho e composição do Painel

- Combinados

Sensibilidade (%)

Especificidade benigno (%)

Especificidade normais (%)

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90/97

4a + 4b

37

93, 8

87,4

[0188] Tabela 23 - Desempenho do Painel 4 por estádio

TNM

Estádio	Positivo	Negativo	Sensibilidade (%)
1	12	23	34,3
2	7	13	35
3	7	14	30
4	1	1	50

Exemplo 5 - Medição adicional de AFP em combinação com autoanticorpos medidos por ensaio de titulação [0189] A alfafetoproteina (AFP) circulante foi medida nas amostras de soro para o conjunto de amostras descrito no Exemplo 4, usando-se um ELISA comercialmente disponível (Aviva Systems Biology). Um limite (cut-off) comumente usado de 200ng/ml foi aplicado para se avaliar a positividade. A Tabela 24 mostra os resultados da adição de AFP aos Painéis 3 e 4 mostrados no Exemplo 4. Fica claro, a partir destes resultados, que o desempenho de AFP em combinação com os painéis AAb é maior do que o desempenho quer de AFP quer dos painéis AAb sozinhos.

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91/97 [0190] Tabela 24 - Desempenho de AFP sozinho e quando adicionado aos painéis descritos no Exemplo 4

Combinação de marcadores	Sensibilidade (%)	Especificidade benigno (%)	Especificidade normal (%)
AFP	31, 6	100	100
Painel 3 + AFP	55, 1	89, 9	84,2
Painel 4 (combinado) + AFP	55, 1	93, 8	87,4

Exemplo 6 - Estudo de Treinamento para Projeto & Desenvolvimento do EarlyCDT-Liver LDT [0191] Os seguintes dados foram obtidos de um estudo para avaliar a sensibilidade e especificidade de um painel de ensaios com autoanticorpos na detecção de HCC usando-se o formato de placa de titulação (Figura 2B) . O estado demográfico dos indivíduos e o estado cirrótico da coorte benigna são dados nas Tabelas 25-26, uma coorte diferente das usadas nos exemplos anteriores.

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92/97 [0192] Tabela 25 - Estado demográfico da coorte de pacientes usada no Exemplo 6

Fator demográfico	Pacientes com HCC (HCC)	Pacientes com doença hepática benigna (Benigno)	Indivíduos sem evidência de malignidade (Normal)
Número	169	184	191
Idade média (intervalo de idade)	59, 8 (32-81)	54,7 (20-76)	59,9 (31-81)
% Masculino	85,2	70, 1	84,3

[0193] Tabela 26 - Estado cirrótico dos pacientes da coorte benigna

Estado Cirrótico	Número
Cirrótico	87
Doença hepática não- cirrótica	81
Desconhecido	16
Total	184

[0194] O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo fornecido no Exemplo 1 usando-se os antígenos listados na Tabela 27. Os limites (cut-offs) para cada

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93/97 marcador foram determinados aplicando-se um método de busca direta de Monte Cario que restringe a especificidade para> 85%. Os resultados são mostrados na Tabela 27 e fica evidente que alguns desses marcadores de autoanticorpos demonstram níveis mais altos de positividade em pacientes com HOC do que naqueles com doença hepática benigna ou nas coortes normais; sendo assim, eles podem ter a capacidade de distinguir pacientes com HCC de pacientes sem qualquer evidência de malignidade. Verificou-se que os AAbs que demonstram diferenciação entre câncer/normal no estudo mostrado no Exemplo 2 continuam a mostrar uma capacidade de distinguir pacientes com HCC de pacientes com doença hepática não cancerosa (Benigna) e controles saudáveis (Normais). Além disso, fica evidente que a medição de um painel aumenta novamente a capacidade de se distinguirem pacientes com HCC em comparação com qualquer marcador isolado. 0 painel pode detectar pacientes com cânceres nos estádios 1 e 2, com sensibilidades de 40-45%, o que é crucial para o diagnóstico precoce e, portanto, para o tratamento efetivo de HCC (Tabela 28) .

[0195] Tabela 27 - Positividade de marcadores AAb individuais em cada grupo

Autoanticorpo	HCC	Benigno	Normal
Positivos	(%)	Positivos	(%)	Positivos	(%)
AIF1	2	1,2	0	0, 0	0	0, 0

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94/97

CAGE	33	19,5	7	3, 8	5	2,6
CYCLIN BI	8	4,7	8	4,3	2	1,0
DDX3X	3	1,8	0	0, 0	0	0, 0
EpCAM	5	3, 0	2	1, 1	1	0,5
HSPA4	12	7, 1	6	3,3	2	1,0
MAGE A4	14	8,3	6	3,3	3	1,6
MMP9	17	10, 1	5	2,7	6	3, 1
NY-ESO-1	21	12,4	11	6, 0	4	2,1
RalA	12	7, 1	7	3, 8	6	3, 1
SALL4	11	6, 5	7	3, 8	4	2,1
Transferrina	15	8, 9	5	2,7	10	5,2
Painel	78	46,2	24	87	26	86,4

[0196] Tabela 28 - Desempenho do painel de AAb por estádio para a coorte de HCC: número de pacientes (n) por estádio e sensibilidade resultante

Estádio	n	Positivo	Sensibilidade (%)
BCLC 0	1	0	0,0
BCLC A	30	12	40,0
BCLC B	71	32	45, 1
BCLC C	28	19	67, 9
BCLC D	8	5	62,5
Desconhecido	31	10	32,3

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BCLC = sistema de estadiamento do Câncer de Figado da Clínica de Barcelona (BCLC, do inglês Barcelona Clinic Liver Cancer) [0197] A alfafetoproteina (AFP) circulante foi medida nas amostras de soro para o conjunto de amostras descrito no Exemplo 6, usando-se um ELISA comercialmente disponível (Aviva Systems Biology). Um limite (cut-off) comumente usado de 200 ng/ml foi aplicado para se avaliar a positividade, a qual está discriminada por estádio na Tabela 29. A sensibilidade do antigeno AFP aumenta com o estádio para esta coorte, com sensibilidade para doença em estágio inicial muito menor do que para a doença em estágio avançado. Também é importante notar que a sensibilidade para a doença em estágio inicial é muito menor para o antigeno AFP em comparação com o painel AAb para este exemplo, ao passo que o desempenho em fase avançada é similar.

[0198] Tabela 29 - Desempenho do antigeno AFP por estádio para coorte de HCC: número de pacientes (n) por estádio e sensibilidade resultante

Estádio	n	Positivo	Sensibilidade (%)
BCLC 0	1	0	0,0
BCLC A	30	3	10,0
BCLC B	71	25	35,2

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96/97

BCLC C	28	16	57,1
BCLC D	8	5	62,5
Desconhecido	31	3	9, 7

[0199] A positividade e sensibilidade para a coorte de HCC no Exemplo 6 podem ser aumentadas combinando-se o antigeno AFP com os resultados do painel AAb (Tabela 30), melhorando-se a sensibilidade tanto para a doença em estágio inicial quanto avançado. Fica claro, a partir destes resultados, que o desempenho de AFP em combinação com o painel AAb é maior do que o desempenho do painel quer de AFP quer de AAb sozinhos (Tabela 31). Combinar o painel Aab com o AFP tem um efeito minimo sobre a especificidade.

[0200] Tabela 30 - Desempenho do painel AAb + antigeno AFP por estádio para a coorte de HCC: número de pacientes (n) por estádio e sensibilidade resultante

Estádio	n	Positivo	Sensibilidade (%)
BCLC 0	1	0	0,0
BCLC A	30	13	43, 0
BCLC B	71	42	59, 2
BCLC C	28	25	89, 3
BCLC D	8	6	75, 0
Desconhecido	31	11	35,5

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97/97 [0201] Tabela 31 - Desempenho de AFP sozinho e quando adicionado ao painel AAb descrito no Exemplo 6

Combinação de marcadores	Sensibilidade	Especificidade (Benigno)	Especificidade (Normal)
Painel AAb	46,2	87,0	86, 4
Antigeno AFP	30,8	99, 5	100,0
Painel AAb + antigeno AFP	57,4	86, 4	86, 4

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Claims (121)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para detectar câncer de fígado em um indivíduo mamífero caracterizado pelo fato de que compreende detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

   (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

   em que a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de fígado.
2. 2. Método para detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamífero, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

   (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um

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   2/30 antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que se suspeita que o indivíduo mamifero tenha câncer de figado.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os resultados de testes para o indivíduo mamifero foram positivos para alfafetoproteina (AFP), des-gama-carboxiprotrombina (DCP) ou alfafetoproteina reativa à lectina (AFP-L3).
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os resultados de testes para o indivíduo mamifero foram positivos para câncer de figado usando-se vigilância por ultrassom.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamifero tem cirrose, doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica, doença de Wilson, hemocromatose hereditária, hepatite autoimune, hepatite B, hepatite C, exposição documentada à aflatoxina, esquistossomose ou diabetes mellitus.
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das

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   3/30 reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que são detectados dois ou mais autoanticorpos e em que o método compreende a etapa de:

   (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais que compreendem um antígeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B e um ou mais antigenos marcadores tumorais adicionais, imunologicamente específicos para pelo menos um dos referidos autoanticorpos.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o painel compreende dois ou mais antigenos marcadores tumorais que são antigenos distintos.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o painel compreende duas ou mais variantes de antígeno de um ou mais dos antigenos distintos.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende um ou mais antigenos marcadores tumorais

    Petição 870190048605, de 24/05/2019, pág. 18/48

    4/30 selecionados do grupo que consiste em NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Cyclina Bl,

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    5/30

    EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 18 ou com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 21,

    Petição 870190048605, de 24/05/2019, pág. 20/48

    6/30 caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.
23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.
24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2.
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2.
26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.
27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.
28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.

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    7/30
29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transferrina.
30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transferrina.
31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2,

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    8/30

    CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2 , PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
35. 35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 34, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a etapa de:

    (c) detectar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

    em que a presença ou a ausência do autoanticorpo é baseada em uma comparação entre a quantidade de ligação especifica observada e um valor de corte pré-determinado.
36. 36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o antigeno marcador tumoral é fornecido em uma pluralidade de quantidades diferentes e em que o método compreende as etapas de:

    (a) colocar em contato a amostra de ensaio com uma

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    9/30 pluralidade de quantidades diferentes do antígeno marcador tumoral;

    (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antígeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

    (c) detectar a quantidade de ligações especificas entre o antígeno marcador tumoral e os autoanticorpos;

    (d) representar graficamente ou calcular uma curva da quantidade da ligação especifica versus a quantidade de antígeno marcador tumoral para cada quantidade de antígeno marcador tumoral usada na etapa (a); e (e) determinar a presença ou a ausência do autoanticorpo com base na quantidade de ligação especifica entre o antígeno marcador tumoral e o autoanticorpo em cada quantidade diferente de antígeno marcador tumoral usada.
37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a presença ou a ausência do autoanticorpo é determinada com base nos valores coletivos da quantidade de ligação especifica para todas as quantidades de antígeno marcador tumoral usadas.
38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a presença ou a ausência do autoanticorpo é determinada rastreando-se o gráfico da etapa (d) em busca da presença de uma curva dose-resposta.
39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 38,

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    10/30 caracterizado pelo fato de que a curva dose-resposta é, geralmente, uma curva em forma de S ou sigmoidal.
40. 40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 36 a 39, caracterizado pelo fato de que o método, adicionalmente, compreende as etapas de:

    (dl) calcular um parâmetro de curva secundária a partir da curva traçada ou calculada na etapa (c); e (e) determinar a presença ou a ausência do autoanticorpo com base em uma combinação de:

    (i) da quantidade de ligação especifica entre o autoanticorpo e o antigeno marcador tumoral determinada na etapa (b); e (ii) do parâmetro da curva secundária determinado na etapa (dl).
41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o parâmetro da curva secundária é selecionado do grupo que consiste em Inclinação, Intercepto, AUC, InclinaçãoMáx e constante de dissociação (Kd) .
42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o parâmetro da curva secundária é calculado a partir de uma curva de regressão que pode ser tanto linear como logaritmica.
43. 43. Método, de qualquer uma das reivindicações de 40 a 42, caracterizado pelo fato de que o parâmetro da curva

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    11/30 secundária é Assintota Máxima, Assintota Minima, Inclinação de Colina (ou Fator de Inclinação) ou Ponto de Inflexão de uma curva logística ajustada a cada curva traçada ou calculada na etapa (c).
44. 44. Método in vitro caracterizado pelo fato de que é para determinar um perfil de anticorpos de um individuo que sofre de câncer de figado em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do individuo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

    (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e

    b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio, em que se repete o método para se construir um perfil de produção de anticorpos.
45. 45. Método caracterizado pelo fato de que é para diagnosticar e tratar câncer de figado em um individuo mamifero detectando-se um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do individuo mamifero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente especifico para uma proteina marcadora

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    12/30 tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

    (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B;

    (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antígeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

    (c) diagnosticar câncer de fígado no indivíduo quando forem detectados complexos do antígeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e (d) administrar um tratamento para câncer de fígado ao indivíduo que recebeu o diagnóstico.
46. 46. Método para prever a resposta a um tratamento contra o câncer de fígado, o método caracterizado pelo fato de que compreende detectar um anticorpo em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um indivíduo mamífero, em que o anticorpo é um autoanticorpo imunologicamente específico para uma proteína marcadora tumoral selecionada do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B, método este que compreende as etapas de:

    (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antígeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B;

    (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do

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    13/30 antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

    (c) detectar a quantidade de ligação específica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos presentes na amostra de ensaio; e (d) comparar a quantidade de ligação específica entre o antigeno marcador tumoral e o autoanticorpo com uma relação previamente estabelecida entre a quantidade de ligação e o resultado provável do tratamento;

    em que uma mudança na quantidade de ligação específica, quando comparada aos controles, prediz se o paciente responderá ou não ao tratamento contra o câncer de fígado.
47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 45 ou com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o tratamento para câncer de fígado é selecionado do grupo que consiste em quimioterapia, ablação por radiofrequência, ressecção hepática, transplante hepático, vacinação, terapias com fator anticrescimento ou transdução de sinal, terapia endócrina, terapia com anticorpos humanos, quimioembolização arterial com transcateter, injeção percutânea de etanol, ablação por micro-ondas, administração de sorafenibe e radioembolização
48. 48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 44 a 47, caracterizado pelo fato de que são detectados dois ou mais autoanticorpos e em que o método

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    14/30 compreende a etapa de:

    (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais que compreendem um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B e um ou mais antigenos marcadores tumorais adicionais, imunologicamente específicos para pelo menos um dos referidos autoanticorpos.
49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o painel compreende dois ou mais antigenos marcadores tumorais que são antigenos distintos.
50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o painel compreende duas ou mais variantes de antigeno de um ou mais dos antigenos distintos.
51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.
52. 52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 48 a 50, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende um ou mais antigenos marcadores tumorais selecionados do grupo que consiste em NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4,

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    15/30

    Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1.
54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1.
55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP.
56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP.
57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 52,

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    16/30 caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.
58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.
59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.
60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.
61. 61. Método, de acordo com a reivindicação 59 ou com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
62. 62. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.
63. 63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em EpCAM, NY-ESO-1,

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    17/30 vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.
64. 64. Método, de acordo com a reivindicação 62 ou com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.
65. 65. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2.
66. 66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2.
67. 67. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.
68. 68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.
69. 69. Método, de acordo com a reivindicação 67 ou com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.
70. 70. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais

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    18/30 antígenos marcadores tumorais compreende AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transferrina.
71. 71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transferrina.
72. 72. Método, de acordo com a reivindicação 70 ou com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
73. 73. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
74. 74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.

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    19/30
75. 75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
76. 76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 48 a 75, caracterizado pelo fato de que o antigeno marcador tumoral é fornecido em uma pluralidade de quantidades diferentes e em que o método compreende as etapas de:

    (a) colocar em contato a amostra de ensaio com uma pluralidade de quantidades diferentes do antigeno marcador tumoral;

    (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

    (c) detectar a quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e os autoanticorpos;

    (d) representar graficamente ou calcular uma curva da quantidade da ligação especifica versus a quantidade de antigeno marcador tumoral para cada quantidade de antigeno marcador tumoral usada na etapa (a);

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    20/30 (e) construir um perfil de produção de anticorpos ou diagnosticar câncer de figado no individuo com base na quantidade de ligação especifica entre o antigeno marcador tumoral e o autoanticorpo em cada quantidade diferente de antigeno marcador tumoral usado; e, opcionalmente, (f) administrar um tratamento para câncer de figado ao individuo que recebeu o diagnóstico.
77. 77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a presença ou a ausência de câncer de figado é determinada com base nos valores coletivos da quantidade de ligação especifica para todas as quantidades de antigeno marcador tumoral usadas.
78. 78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que se diagnostica câncer de figado no individuo rastreando-se o gráfico da etapa (d) em busca da presença de uma curva dose-resposta.
79. 79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a curva dose-resposta é, geralmente, uma curva em forma de S ou sigmoidal.
80. 80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 76 a 79, caracterizado pelo fato de que o método, adicionalmente, compreende:

    (dl) calcular um parâmetro de curva secundária a partir da curva traçada ou calculada na etapa (d); e (e) diagnosticar câncer de figado com base em uma

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    21/30 combinação de:

    (i) a quantidade de ligação especifica entre o autoanticorpo e o antigeno marcador tumoral determinada na etapa (c); e (ii) do parâmetro da curva secundária determinado na etapa (dl).
81. 81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o parâmetro da curva secundária é selecionado do grupo que consiste em Inclinação, Intercepto, AUC, InclinaçãoMáx e constante de dissociação (Kd) .
82. 82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o parâmetro da curva secundária é calculado a partir de uma curva de regressão que pode ser tanto linear como logaritmica.
83. 83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 80 a 82, caracterizado pelo fato de que o parâmetro da curva secundária é Assintota Máxima, Assintota Minima, Inclinação de Colina (ou Fator de Inclinação) ou Ponto de Inflexão de uma curva logística ajustada a cada curva traçada ou calculada na etapa (d).
84. 84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 83, caracterizado pelo fato de que o antigeno marcador tumoral é uma proteina ou um polipeptideo de ocorrência natural, uma proteina ou um polipeptideo

    Petição 870190048605, de 24/05/2019, pág. 36/48

    22/30 recombinantes, uma proteína ou um polipeptideo sintéticos, um peptídeo sintético, um peptídeo mimético, um polissacarídeo ou um ácido nucleico.
85. 85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e de 3 a 75, caracterizado pelo fato de que o câncer de fígado é carcinoma hepatocelular (CHC).
86. 86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 85, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é selecionado do grupo que consiste em plasma, soro, sangue total, urina, suor, linfa, fezes, líquido cerebrospinal, líquido ascítico, efusão pleural, líquido seminal, escarro, aspirado de mamilo, seroma pósoperatório, saliva, líquido amniótico, lágrimas e líquido de drenagem de feridas.
87. 87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o método compreende, adicionalmente, a detecção de alfafetoproteína (AFP), des-gama-carboxiprotrombina (DCP) ou alfafetoproteína reativa à lectina (AFP-L3) em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero.
88. 88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o método compreende a detecção de alfafetoproteína (AFP) em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo

    Petição 870190048605, de 24/05/2019, pág. 37/48

    23/30 mamífero .
89. 89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que autoanticorpos imunologicamente específicos para as proteínas marcadoras tumorais CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1 são detectadas em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero.
90. 90. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que autoanticorpos imunologicamente específicos para as proteínas marcadoras tumorais CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP são detectadas em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero.
91. 91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 87 a 90, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é sangue.
92. 92 . Uso de um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9 AIF1, EpCAM e CDKN1B em um método para detectar câncer de fígado em um indivíduo mamífero detectando-se um autoanticorpo imunologicamente específico para MMP9, AIF1, EpCAM ou CDKN1B em uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente do indivíduo mamífero, método este que compreende as etapas de:

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    24/30 (a) colocar em contato a amostra de ensaio com um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) determinar a presença ou a ausência de complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio;

    em que a presença dos referidos complexos é indicativa da presença de câncer de figado.
93. 93. Kit adequado para executar o método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 92, caracterizado pelo fato de que o kit compreende:

    (a) um ou mais antigenos marcadores tumorais; e (b) um reagente que tem a capacidade de detectar complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio.
94. 94. Um kit para a detecção de autoanticorpos em uma amostra de ensaio, caracterizado pelo fato de que compreende um fluido corporal proveniente de um mamifero que compreende:

    (a) um antigeno marcador tumoral selecionado do grupo que consiste em MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B; e (b) um reagente que tem a capacidade de detectar complexos do antigeno marcador tumoral ligados a autoanticorpos presentes na amostra de ensaio.
95. 95. Kit, de acordo com a reivindicação 93 ou com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que compreende,

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    25/30 adicionalmente :

    (c) meios para se colocar em contato o antigeno marcador tumoral com uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um individuo mamifero.
96. 96. Kit, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que os meios para se colocar em contato o antigeno marcador tumoral com uma amostra de ensaio que compreende um fluido corporal proveniente de um individuo mamifero compreende o antigeno marcador tumoral imobilizado sobre um chip, lâmina, placa, poços de uma placa de microtitulação, conta, membrana ou nanoparticula.
97. 97. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 93 a 96, caracterizado pelo fato de que o antigeno marcador tumoral está presente dentro de um painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais.
98. 98. Kit, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o painel compreende dois ou mais antigenos marcadores tumorais que são antigenos distintos.
99. 99. Kit, de acordo com a reivindicação 97 ou com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM e CDKN1B.
100. 100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 97 a 99, caracterizado pelo fato de que o

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     26/30 painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende um ou mais antigenos marcadores tumorais selecionados do grupo que consiste em NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4,

     RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1. 101. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais

     antigenos marcadores tumorais compreende CAGE, NY-ESO-1,

     MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1. 102. Kit, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais

     antigenos marcadores tumorais consiste em CAGE, NY-ESO-1,

     MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, e AIF1. 103. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais

     antigenos marcadores tumorais compreende CAGE, NY-ESO-1,

     MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, 104. Kit, de SOX2 e AFP. acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais

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     27/30 antígenos marcadores tumorais consiste em CAGE, NY-ESO-1, MMP9, transferrina, MAGE A4, RalA, HSPA4, SALL4, Ciclina Bl, EpCAM, DDX3X, AIF1, SOX2 e AFP.
101. 105. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.
102. 106. Kit, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, NY-ESO-1, HSPA4, vimentina, HNRNP-L e transferrina.
103. 107. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.
104. 108. Kit, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais consiste em AIF1, EpCAM, HSPA4 e CPS1.
105. 109. Kit, de acordo com a reivindicação 107 ou com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
106. 110. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antígenos marcadores tumorais compreende EpCAM, NY-ESO-1,

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     28/30 vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.
107. 111. Kit, de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em EpCAM, NY-ESO-1, vimentina, HSPA2, HSPA4 e HNRNP-L.
108. 112. Kit, de acordo com a reivindicação 110 ou com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que o individuo é do sexo masculino.
109. 113. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2.
110. 114. Kit, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, DDX3X, SALL4, MAGE A4, NY-ESO-1, CAGE, RalA e SOX2.
111. 115. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.
112. 116. Kit, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em EpCAM, CAGE, SOX2, RalA, MAGE A4, DDX3X e NY-ESO-1.
113. 117. Kit, de acordo com a reivindicação 115 ou com a

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     29/30 reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo masculino.
114. 118. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transferrina.
115. 119. Kit, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em AIF1, CAGE, HSPD1, SOX2, SALL4, HSPA4 e transferrina.
116. 120. Kit, de acordo com a reivindicação 118 ou com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é do sexo feminino.
117. 121. Kit, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
118. 122. Kit, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais compreende MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L,

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     30/30

     HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
119. 123. Kit, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o painel de dois ou mais antigenos marcadores tumorais consiste em MMP9, AIF1, EpCAM, CDKN1B, NY-ESO-1, vimentina, HSPA4, transferrina, HNRNP-L, HSPD1, HNRNP-A2, SALL4, Ciclina Bl, AFP, NPM1, YWHAZ, DDX3X, p62, CAGE, MAGE A4, RalA, GBU4-5, SOX2, AKR1B10, ApoAl, BCL2, CD44, CK18, CPS1, FUCA1, GLUL, HSPA2, IL-8, MDM2, PEBP1, prolactina, RGN, SPP1, SSX2 e TGFB1.
120. 124. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 93 a 123, caracterizado pelo fato de que é para a detecção de câncer de figado
121. 125. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 93 a 124, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é selecionado do grupo que consiste em plasma, soro, sangue total, urina, suor, linfa, fezes, liquido cerebrospinal, liquido ascitico, efusão pleural, liquido seminal, escarro, aspirado de mamilo, seroma pós-operatório, saliva, liquido amniótico, lágrimas e liquido de drenagem de feridas.