NO341484B1

NO341484B1 - Forbedrede immunoassay metoder

Info

Publication number: NO341484B1
Application number: NO20161584A
Authority: NO
Inventors: John Forsyth Russell Robertson; Tony Barnes; Andrea Murray; Caroline Chapman
Original assignee: Oncimmune Ltd
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2016-10-03
Publication date: 2017-11-27
Also published as: BRPI0610267A2; BRPI0610267B8; IL187481A; PT1889059E; RU2010149266A; RU2636532C2; US9719984B2; US20140221245A1; BRPI0610267B1; CY1113013T1; NO20161584A1; US9714938B2; IL215528A; IL215527A; RU2010149267A; CY1109461T1; IL187481A0; NO342101B1; IL215527A0; NZ563466A

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen angår generelt diagnostiske og prognostiske prøver og angår spesielt optimalisering av prøver for å påvise antistoffer i en prøve som omfatter kroppsvæsker fra en pasient hvor slike antistoffer brukes som biologiske markører på en sykdomstilstand eller er assosiert med mottakelig eller risiko for sykdom.

Det har i de senere år blitt klart at antistoffer, og da spesielt autoantistoffer, også kan tjene som biologiske markører på sykdom eller sykdomsmottakelighet.

Autoantistoffer er naturlig forekommende antistoffer rettet inn mot et antigen som et individs immunsystem gjenkjenner som fremmed selv om antigenet i virkeligheten har oppstått i individet. De kan være tilstede i kretsløpet som sirkulerende frie antistoffer eller i form av sirkulerende immunkomplekser som består av autoantistoffer bundet til sitt målmarkørprotein. Forskjellen mellom et villtypeprotein som er uttrykt av "normale" celler og en endret form av proteinet fremstilt av en slik celle eller under en sykdomsprosess, kan i enkelte tilfeller føre til at det endrede proteinet blir gjenkjent av et individs immunsystem som "ikkeselv" og derved utløse en immunrespons i individet. Dette kan være en humoral (det vil si en B-cellestyrt) immunrespons som fører til produksjon av autoantistoffer som er immunologisk spesifikke for det endrede proteinet.

WO 99/58978 beskriver fremgangsmåter som kan brukes ved påvisning/diagnose på kreft som er basert på å bedømme et individs immunrespons i forhold til to eller flere distinkte tumormarkører. Disse fremgangsmåtene innbefatter generelt å kontakt en prøve av en kroppsvæske tatt fra individet med et utvalg av to eller flere distinkte tumormarkørantigener som hver er avledet fra et separat tumormarkørprotein og så påvise dannelsen av komplekser av tumormarkørantigenet bundet til sirkulerende autoantistoffer som er immunlogisk spesifikke for tumormarkørproteinene. Nærværet av slike sirkulerende antistoffer blir så brukt som en indikasjon på nærvær av kreft.

Rasmussen et al., (Journal of Immunological methods, 1990, vol. 127, no.1, side 139-145) beskriver ELISA som er rettet mot en enkelt konsentrasjon av et autolog antigen. Nærmere bestemt beskrives ELISA som er rettet mot påvisning av antinøytrofilocyt cytoplasma antistoffer (ANCA).

Prøver som måler individets immunrespons i forhold til nærværet av tumormarkørprotein i forhold til autoantistoffproduksjon, er et alternativ til den direkte måling eller påvisning av tumormarkørprotein i kroppsvæskene. Slike prøver består i alt vesentlig av en indirekte påvisning av nærværet av tumormarkørproteiner. På grunn av immunresponsens natur, er det sannsynlig at autoantistoffer kan bli utløst av en meget liten mengde av sirkulerende tumormarkørprotein og indirekte fremgangsmåter som er basert på å påvise immunresponsen i forhold til tumormarkører vil følgelig være mer følsomme enn fremgangsmåter som anvender direkte måling av tumormarkører i kroppsvæsker. Prøvemetoder som er basert på påvisningen av autoantistoffer kan derfor være spesielt verdifulle i det tidlige stadium av sykdomsprosessen og eventuelt også i forhold til å screene asymptomatiske pasienter, for eksempel ved screening for å identifisere individer som "har risiko" for å utvikle sykdom blant en gruppe av asymptomatiske individer for å identifisere individer som har utviklet en sykdom, blant en gruppe av asymptomatiske individer. Videre kan fremgangsmåten basert på påvisning av autoantistoffer være spesielt verdifull tidlig i sykdomsutviklingen og vil eventuelt også kunne brukes for å identifisere individer som har utviklet en sykdom blant en gruppe av symptomatiske individer. Videre kan de være brukbare for tidlig å påvise tilbakevendende sykdomsutbrudd. Prøvemetodene vil også være verdifulle ved å velge ut og kontrollere terapier for en sykdom.

Antistoffer og autoantistoffer kan også tjene som biologiske markører på andre sykdomstilstander eller sykdomsmottakeligheter og som eksempler kan nevnes revmatisk artritt, systemisk lupus erytematose (SLE), primær gallecirrhose (PBS), autoimmun tyroiditt (for eksempel Hashimotos tyroiditt), autoimmun gastritt (for eksempel pernikøs anemi), autoimmun adrenalitt (for eksempel Addisons sykdom), autoimmun hypoparatyroidisme, autoimmun diabetes (for eksempel type 1 diabetes) og myastenia gravis.

De foreliggende søkere innser at når prøver basert på påvisning av antistoffer brukes diagnostisk eller prognostisk for å bedømme sykdomstilstanden, sykdomsutviklingen eller sykdomsmottakelighet for et individ i en populasjon eller gruppe, så kan det oppstå vanskeligheter med å utforme en standardprøvemetodologi som er passende for hele gruppen av personer eller pasienter som skal screenes, ettersom de absolutte mengder av tilstedeværende antistoff varierer dramatisk fra ett individ til et annet. Dette kan gi en høy forekomst av falske negative resultater, for eksempel blant individer som har en lav antistoffmengde. På lignende måte er det en vanskelighet med å score virkelig positive resultater ettersom variasjonen i de absolutte mengder av antistoff fra individ til individ betyr at det er vanskelig å sette en terskelverdi for et positivt prøveresultat som måtte passe for alle individer innenfor den undersøkte gruppen.

De foreliggende søkere har nå funnet ut at gjennomføring og mer spesifikt den kliniske anvendbarheten og påliteligheten til prøvene basert på påvisning av antistoffer, da spesielt autoantistoffer, som biologiske markører på sykdom kan bedres dramatisk ved å inkludere et antigentitreringstrinn. Ved å teste prøven som er bestemt for å inneholde antistoffer mot en serie av forskjellige mengder av antigen og deretter konstruere en titreringskurve, er det mulig å pålitelig og identifisere virkelig positive screeningsresultater uavhengig av den absolutte mengden av antistoff som er tilstede i prøven. En slik fremgangsmåte står i motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter som titrerer antigen utelukkende for å konstruere en kalibreringskurve som gjør det mulig å identifisere den mest passende antigenkonsentrasjonen som skal brukes for å påvise antistoffer i de virkelige pasientprøvene. I disse fremgangsmåtene blir bare enkeltpunktsmålinger foreslått for virkelig diagnose. Fremgangsmåtene vil således ikke kunne fange opp variasjon i mengdene av det antistoff som skal påvises fra ett individ til et annet individ, noe som vil resultere i en forekomst av falske positive eller falske negative resultater som beskrevet ovenfor. Den foreliggende oppfinnelsen har funnet at antigentitreringsmetoden ifølge oppfinnelsen som beskrevet her har større spesifitet og følsomhet enn å måle autoantistoffreaktivitet i forhold til en enkelt antigenkonsentrasjon eller fremgangsmåter hvor serumprøven blir titrert snarere enn antigenet.

Sammendrag av oppfinnelsen

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for å påvise et antistoff i en testprøve som omfatter en kroppsvæske fra et pattedyr eller en person hvor nevnte antistoff er rettet inn mot et fremmed stoff som innføres i nevnte person eller pattedyr og hvor fremgangsmåten omfatter:

(a) kontakte testprøven med en rekke forskjellige mengder av et antigen som er spesifikt for nevnte antistoff,

(b) påvise mengden av spesifikk binding mellom nevnte antistoff og nevnte antigen ved hver ulik antigenkonsentrasjon som benyttes; og

(c) avsette eller beregne en kurve for mengden av nevnte spesifikke binding i forhold til mengden av antigen for hver mengde av antigen som ble brukt i trinn (a) der tilstedeværelsen i testprøven av antistoff som er reaktivt mot antigenet som benyttes i analysen blir indikert ved en generelt S-formet eller sigmoid kurve.

I alle aspekter av oppfinnelsen er pattedyret eller personen fortrinnsvis et menneske.

I alle aspekter av oppfinnelsen blir fremgangsmåten fortrinnsvis utført in vitro på en testprøve som omfatter en kroppsvæske oppnådd fra eller fremstilt fra et pattedyr eller en person.

Et spesielt trekk ved den foreliggende oppfinnelsen i alle dens aspekter er at bedømmelsen av hvorvidt det relevante antistoffet er tilstede eller fraværende i testprøven, er basert på mengden av den spesifikke bindingen som observeres for hver forskjellige antigenkonsentrasjon som testes, med andre ord, det er de samlede verdiene snarere enn en avlesning av en enkelt konsentrasjon. Bestemmelsen av nærværet eller fraværet av sykdomstilstanden eller sykdomsmottakeligheten eller antistoffene til et fremmed stoff i en pasientprøve kan således følges, basert direkte på disse samlede verdiene. Bedømmelsen blir fortrinnsvis utført på basis av at det fremtrer et generelt S-formet eller sigmodial kurve når mengden av spesifikk binding blir avsatt i forhold til mengden av antigen. Det vil fremgå av de etterfølgende eksemplene at de foreliggende søkere har observert at antigentitreringsmetodene ifølge den foreliggende oppfinnelsen har høyere spesifitet og følsomhet enn fremgangsmåter for diagnose eller påvisning som er basert på en enkeltavlesning og vil redusere forekomsten av falske positive og falske negative bestemmelser.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1: Måling av autoantistoffer i serum ved å br4uke en antigentitreringskurve. Kreftpasientserum 17766 (C) binder seg sterkt til testantigenet med en karakteristisk sigmoidal kurve ( ), men binder seg ikke til den negative kontrollen, VOL ( ). Som sammenligning er det vist at serum fra et normalt individ, 18052 (N) ikke binder seg til testantigenet ( ) eller til den negative kontrollen ( ).

Figur 2: Sammenligning av p53-autoantistoffnivåene i normale individer og hos pasienter med primær brystkreft (PBC) som målt ved å bruke antigentitreringsprøven. Autoantistoffnivåene ble uttrykt som OD650-verdien, det vil si binding til testantigenet (p53) minus bindingen til den negative kontrollen.

Normalt avskjæringnivå (-----) ble beregnet som middelverdien pluss 2 standardavvik i forhold til den normale gruppen.

Figur 3 viser en sammenligning av p53 og NY-ESO-autoantistoffnivåer i normale individer og pasienter med lungekreft som målt ved å bruke antigentitreringsprøven. Autoantistoffnivåene er uttrykt som OD650-verdien, det vil si binding til testantigenet (p53 eller NY-ESO) minus bindingen til den negative kontrollen.

Normalt avskjæringsnivå (-----) ble beregnet som middelverdien pluss 2 standardavvik i forhold til normalgruppen.

Figur 4 viser en titreringskurve for påvisning av autoantistoffer mot p53 og NY-ESO i en prøve av ascitesvæske tatt fra en pasient med brystkreft. Denne pasienten ble testet, men produserte ikke autoantistoffer mot c-myc.

Figur 5 viser en titreringskurve for påvisning av autoantistoffer mot BRCA1, BRCA2 og HER2 i en prøve av serum fra en pasient med brystkreft (duktalt carcinom in situ).

Figur 6 viser en titreringskurve for påvisning av autoantistoffer mot NY-ESO i en prøve av serum fra en pasient med lungekreft. Denne pasienten ble testet, men produserte ikke autoantistoffer mot p53 eller c-myc.

Figur 7 viser en titreringskurve for påvisning av autoantistoffer mot NY-ESO og p53 i en prøve av serum fra en pasient med lungekreft. Denne pasienten ble testet, men produserte ikke autoantistoffer mot c-myc.

Figurene 8(a) og 8(b) viser resultatene av to uavhengige titreringsprøver for autoantistoffer mot p53, c-myc og NY-ESO-1 i prøver av serum fra en "normal" person (det vil si et individ hvor det ikke var tegn til kreft).

Figurene 9(a) og 9(b) viser resultatene av to uavhengige titreringsprøver som ble utført på prøver av serum fra en enkelt pasient med invaderende brystkreft ved å bruke en rekke forskjellige antigener.

Figurene 10(a) og 10(b) viser resultatene av titreringsprøver hvor prøvene av serum fra en klinisk normal person ble testet for nærvær av autoantistoffer ved å bruke biotinylerte antigener BRCA2, HER2, c-myc og NY-ESO-1, ikke-biotinylert BRCA1 og kontrollekspresjonsprodukter av den "tomme" vektoren VOL som koder biotintaggen, men ikke noe ytterligere antigen.

Figur 11 illustrerer resultatene av en autoantistoffanalyse fra en pasient med primær brystkreft ved å bruke antigentitreringsprøven ifølge oppfinnelsen med hensyn til antigenene p53, c-myc og NY-ESO-1 og kontrollekspresjonsproduktene fra den "tomme" vektoren VOL.

Figur 12 illustrerer resultatene av er en repetisjon av den prøven som er vist på figur 11, men med serum fra et normalt individ.

Figur 13 illustrerer videre de resultatene som ble oppnådd ved å bruke antigentitreringsprøven ifølge den foreliggende oppfinnelsen på en pasient med primær brystkreft, men som også hadde en antistoffrespons til biotin.

Figur 14 illustrerer resultatene av en eksperimentell sammenligning av normale prøver mellom en autoantistoffpåvisningsprøve når antigenet blir titrert i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen og en autoantistoffpåvisningsprøve hvor antigenmengden forblir konstant, men hvor serumet blir titrert.

Figur 15 illustrerer resultatene av en eksperimentell sammenligning på en prøve fra en pasient med primær brystkreft mellom en autoantistoffpåvisningsprøve når antigenet blir titrert i overensstemmelse med oppfinnelsen og en autoantistoffpåvisningsprøve når antigenmengden forblir konstant, men hvor serumet blir titrert.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer generelt en immunprøvemetode for påvisning av et antistoff som tjener som en biologisk markør for en sykdomstilstand eller sykdomsmottakelighet, karakterisert ved at en prøve som skal testes for nærvær av antistoffet testes for spesifikk binding mot forskjellige mengde av antigen som er spesifikt for antistoffet og hvor det produseres en titreringskurve for antistoff/antigenbinding versus den mengden av antigen som testes.

De generelle egenskapene ved immunprøver så som for eksempel ELISA, radioimmunprøver og lignende, er velkjente for personer med faglig innsikt (se Immunoassay, E. Diamandis og T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Immunprøver for påvisning av antistoffer med en spesiell immunologisk spesifitet krever vanligvis bruken av en reagens (antigen) som oppviser eller har spesifikk immunologisk aktivitet med det antistoffet som testes. Avhengig av prøvens format, vil dette antigenet kunne immobileres på et fast underlag. En prøve som skal testes for nærværet av antistoffet bringes i kontakt med antigenet og hvis antistoffene med den nødvendige immunologiske spesifiteten er tilstede i prøven, så vil de immunlogisk reagere med antigenet og danne antistoff-antigenkomplekser som så kan påvises eller måles kvantitativt.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er karakterisert ved at en standardisert prøve som skal testes for nærvær av antistoffet testes mot en rekke forskjellige mengder av antigen (her også betegnet som en titreringsserie). Prøven blir testet mot minst to, og fortrinnsvis minst tre, fire, fem, seks eller endog syv forskjellige mengder av antigenet. Typiske prøver vil også inkludere en negativ kontroll som ikke inneholder noe antigen.

I denne sammenhengen refererer begrepet "antigen" seg til et stoff som omfatter minst én antigenisk determinant eller epitop som er i stand til å interagere spesifikt med målantistoff som det er ønskelig å påvise eller ethvert annet eventuelt innfangingsmiddel ved at det interagerer spesifikt med et variabelt område eller de komplementært bestemmende områder av nevnte antistoff. Antigenet vil typisk være et naturlig forekommende eller syntetisk biologisk makromolekyl så som for eksempel et protein eller peptid, et polysakkarid eller en nukleinsyre og kan inkludere antistoffer eller fragmenter av disse så som antiidiotype antistoffer.

Det tør være underforstått for personer med faglig innsikt at i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen så er mengden av antigene determinanter eller epitoper som er tilgjengelige for binding til målantistoffet viktige for å etablere en titreringsserie. I mange prøveformater vil mengden av antigene determinanter eller epitoper som er tilgjengelige for binding være direkte korrelert med mengden av de tilstedeværende antigenmolekyler. I andre utførelser så som for eksempel i visse fastfaseprøvesystemer, så er imidlertid mengden av eksponerte antigene determinanter eller epitoper ikke nødvendigvis direkte korrelert med mengden av antigen, men vil kunne være avhengig av andre faktorer så som tilfestingen til den faste overflaten. I disse utførelsene så betyr referanser til "forskjellig mengder av antigen" i en titreringsserie, bety forskjellige mengder av den antigene determinanten eller epitopen.

De relative eller absolutte mengder av spesifikk binding mellom antistoff og antigen bestemmes for hver forskjellige mengde av antigen (antigen determinant eller epitop) som blir brukt og blir så avsatt for å beregne en kurve for den (relative eller absolutte) mengden av spesifikk binding versus mengden av antigen for hver mengde av det antigen som er testet. Typiske resultater er for eksempel illustrert på de vedlagte tegningene for påvisning av en rekke forskjellige antistoffer. Nærværet i testprøven av antistoffet i forhold til det antigenet som brukes i prøven, bestemmes på basis av mengden av spesifikk binding som observeres for hver antigenmengde og blir generelt angitt ved en generelt S-formet eller sigmoidal kurve. De absolutte mengder av spesifikk binding mellom antistoff og antigen er generelt ikke absolutt, bortsett fra de tilfeller hvor det er ønskelig å oppnå en kvantitativ måling. For en enkelt ja/nei-bestemmelse for nærværet eller fraværet av antistoffer, er det tilstrekkelig bare at det er utviklet en kurve med den riktige formen. Hvis det ikke er noen variasjon i påvisbar binding over forskjellige mengder av antigen som er testet, så kan dette scores som et fravær av en påvisbar mengde av antistoffet. I foretrukne utførelser av oppfinnelsen er fremgangsmåten ikke-kvantitativ. Man kan således oppnå en ja/nei-bestemmelse av en nærvær eller fravær av antistoff ved å bruke et dimensjonsløst proporsjonalt forhold som er uavhengig av signalstyrken.

Et mål på mengden av antistoff som er tilstede i en spesiell prøve kan, hvis det er ønskelig, avledes fra resultatene fra antigentitreringsprøvene.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan med fordel brukes ved kliniske diagnostiske, prognostiske, prediktive og/eller kontrollerende prøver hvor de absolutte mengder det tilstedeværende antistoffet kan variere i meget høy grad fra pasient til pasient. De foreliggende søkere har observert at hvis slike prøver er basert på påvisning av antistoffbinding ved å bruke en enkelt mengde/konsentrasjon av testantigen, så kan pasientprøver som inneholder en mengde av antistoff som enten er meget lav eller er meget høy i forhold til det normale fysiologiske variasjonsområdet for mengden av antistoff over en befolkningsgruppe gå tapt på grunn av begrensninger i prøvemetodene; idet prøver med lav mengde av antistoff kan scores som et falskt negativt resultat mens de med meget høye nivåer av antistoffet kan være utenfor skalaen for nøyaktig bestemmelse innenfor de valgte prøvemetodene.

Titreringsprøvemetoden ifølge oppfinnelsen er også spesielt egnet for påvisning av antistoffer/autoantistoffer som biologiske markører på sykdomstilstander eller mottakelighet hvor det er en betydelig pasient-til-pasientvariasjon med hensyn til spesifiteten og affiniteten for antistoffene/autoantistoffene til målantigenet.

Autoantistoffresponser kan på grunn av sin natur og reaksjonsevne variere signifikant fra pasient til pasient, hvor variasjon opptrer både med hensyn til de absolutte mengder av tilstedeværende antistoff og autoantistoffene spesifitet/affinitet. Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen tar hensyn til denne pasient-til-pasientvariasjonen og gjør det mulig å således å utvikle et standardprøveformat for ethvert gitt antistoff/autoantistoff.

Interaksjoner mellom autoantistoffer og deres målantigener er generelt av lav affinitet, men styrken på bindingen kan variere fra pasient til pasient slik det er beskrevet ovenfor. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt godt egnet for påvisning av lavaffinitetsbinding ettersom et positivt resultat kan utledes fra formen på titreringskurven.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen virker også som en beskyttelse mot dag-tildagvariasjon med hensyn til gjennomføringen av de immunprøver som anvendes for påvisning av autoantistoffer/antistoffer for diagnostiske, prognostiske og/eller kontrollerende (sykdomstilstand eller terapi) formål. Det er ofte observert at det kan være betydelig dag-til-dagvariasjon med hensyn til signalstyrken når det utføres immunprøver for påvisning av antistoffer i prøver som omfatter pasientkroppsvæsker. En slik variasjon kan for eksempel oppstå på grunn av forskjeller på den måten ved hvilken prøvene blir oppnådd og lagret før testing. Slike faktorer gjør det vanskelig å score resultatene av kliniske prøver med sikkerhet, for eksempel på basis av en enkel terskelverdi for antistoff/antigenbinding. Den foreliggende oppfinnelsen minimaliserer effektene av en slik dag-til-dagvariasjon ettersom et positivt resultat for nærværet av antistoff fremgår klart fra formen på titreringskurven, uavhengig av signalstyrken.

Andre ytterligere fordeler ved fremgangsmåten er at den muliggjør en fortynning av pasientprøven, men som ikke desto mindre vil gi konsistente resultater og som dessuten generelt vil gi det samme kvalitative screeningsresultatet (positivt/negativt) når det anvendes kroppsvæsker av forskjellig oppfinnelse fra et enkelt individ (for eksempel blod eller serum versus ascitesvæske eller lungevæske), selv når den absolutte konsentrasjonen av antistoffer kan være forskjellig i de forskjellige væskene.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan utføres i ethvert egnet format som muliggjør kontakt mellom en prøve hvor det er mistanke om eller som inneholder antistoffet og forskjellige mengder av et antigen. Hensiktsmessig kan kontakten mellom prøven og de forskjellige mengder av antigenet finne sted i separate, men parallelle, reaksjonskamre så vel som brønner på en mikrotitreringsplate. Varierende mengder av antigenet kan pålegges brønnene på mikrotitreringsplaten ved å fremstille seriefortynninger fra et lager av antigenet plassert i forskjellige brønner på mikrotitreringsplaten. Lageret av antigen kan være av kjent eller ukjent konsentrasjon. Porsjoner av testprøven kan så tilsettes brønnene på platen hvor volumet og fortynningen av testprøven holdes konstant i hver brønn. De absolutte mengder av antigen som tilsettes brønnene på mikrotitreringsplaten vil kunne variere, avhengig av slike faktorer som type av målantistoff, type av den prøve som er under testing, fortynning av testprøven, osv., noe som tør være innlysende for personer med faglig innsikt. Generelt vil mengdene av antigen og fortynningen av testprøven velges slik at man får tilveiebrakt en serie signalstyrker som faller innenfor det akseptable påvisningsområdet når det gjelder avlesningsområdet for påvisning av antistoff/antigenbindingen i fremgangsmåten. Typiske mengder og fortynninger for testing av humane serumprøver hvor det er mistanke om eller som inneholder antitumormarkørautoantistoffer, er gitt i de etterfølgende eksemplene. Hensiktsmessig kan testmengdene av antigen variere i området fra omtrent 0,01 µg/ml til 20 μg/ml.

Som nevnt ovenfor, er det også mulig å konstruere en titreringskurve som starter med en enkel lagerløsning av antigen, selv når den absolutte konsentrasjonen av antigenet i lagerløsningen er ukjent. Forutsatt at den samme enkeltlagerløsningen brukes og seriefortynnes på den samme måten, er det mulig å sammenligne resultatene fra separate titreringsprøver for dette antigenet utført på forskjellige starttestprøver.

I en ytterligere utførelse kan forskjellige mengder av antigenet (antigene determinanter eller epitoper) immobiliseres på diskrete punkter eller reaksjonssteder på et fast underlag. Hele underlaget kan så bringes i kontakt med testprøven, hvoretter binding av antistoff til antigen påvises eller måles separat på hvert enkelt diskret punkt eller reaksjonssted. Egnede faste underlag inkluderer mikromatriser, for eksempel matriser hvor diskrete seter eller punkter på matrisen omfatter eller inneholder forskjellige mengder av antigenet. Mikromatriser kan også fremstilles ved å immobilisere forskjellige mengder av et spesielt antigen på diskrete, oppløsbare reaksjonssteder på matrisen. I andre utførelser kan den virkelige mengden av de immobiliserte antigenmolekylene holdes i alt vesentlig konstant, men størrelsen på stedene eller punktene på matrisen varieres for å endre mengden av tilgjengelig bindende epitop, noe som vil kunne gi en titreringsserie av steder eller punkter med forskjellige mengder av tilgjengelig bindende epitop. I slike utførelser vil den todimensjonale overflatekonsentrasjonen av det eller de bindende epitopene på antigenet være viktig ved fremstillingen av titreringsseriene, snarere enn den absolutte mengden av antigen. Teknikker for fremstilling og tolkning av protein/peptidmikromatriser er generelt kjent innenfor bioteknologien.

Det er underforstått fra det som er beskrevet ovenfor at i alle utførelser av oppfinnelsen så vil en variasjon med hensyn til mengden av antigen kunne oppnås ved å forandre antigen- eller epitoptettheten i forhold til den prøven som testes eller ved å opprettholde antigen- eller epitoptettheten, men øke overflatearealet som antigenet immobiliseres på, eller begge deler.

Mikromatriser kan brukes for å gjennomføre multiple prøver for antistoffer med forskjellig spesifitet i en enkelt prøve i parallell. Dette kan gjøres ved å bruke matriser som omfatter multiple sett av forskjellige antigener og hvor hvert sett omfatter et spesielt antigen av flere forskjellige mengder eller konsentrasjoner. Begrepet "forskjellige antigener" omfatter antigener som er avledet fra forskjellige proteiner eller polypeptider (så som antigener avledet fra u beslektede proteiner som kodes av forskjellige gener), foruten antigener som er avledet fra forskjellige peptidepitoper av et enkelt protein eller polypeptid. En gitt mikromatrise kan inkludere eksklusive sett av forskjellige antigener avledet fra forskjellige proteiner eller polypeptider eller eksklusive sett av forskjellige antigener avledet fra forskjellige peptidepitoper fra et enkelt protein eller polypeptid, eller en blanding av de to i ethvert forhold. Det skal bemerkes at hvert individuelt antigensett av forskjellige mengder eller konsentrasjoner i enhver utførelse av oppfinnelsen vil generelt omfatte akkurat ett antigen og ikke blandinger av slike.

Med begrepet "kroppsvæske" slik det brukes her, forstås det materiale som skal testes for nærvær av antistoffer ved å bruke den foreliggende oppfinnelsen og som blant annet omfatter plasma, serum, helt blod, urin, svette, lymfe, avføring, ryggmargsvæske, ascites, lungeutsondringer, seminal væske, spytt, oppsugningsvæske fra brystvorter, postoperativt seroma eller sårvæske. Som nevnt tidligere blir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis utført in vitro på en testprøve som omfatter kroppsvæske som er fjernet fra testpersonen eller dyret. Den type kroppsvæske som brukes vil kunne variere avhengig av identiteten til det antistoffet som skal testes og den kliniske situasjonen i hvilken prøven brukes. Generelt er det foretrukket å utføre prøvene på prøver av serum eller plasma.

Testprøvene kan inkludere ytterligere komponenter i tillegg til kroppsvæske, for eksempel fortynningsmidler, konserveringsmidler, stabiliserende midler, buffere, osv.

Begrepet "antigen" slik det brukes her i vid forstand, refererer seg til ethvert stoff som oppviser spesifikk immunologisk reaktivitet i forhold til et målantistoff som skal påvises. Egnede antigener inkluderer, men er ikke begrenset til, naturlig forekommende proteiner, rekombinante eller syntetiske proteiner eller polypeptider, syntetiske peptider, peptidmimetika, osv., foruten polysakkarider og nukleinsyrer. Når begrepet "antigen" brukes her, så er det spesifikt tenkt å omfatte ethvert innfangingsmiddel, enten dette er av human opprinnelse, pattedyropprinnelse eller av annen type, som er i stand til en spesifikk immunologisk interaksjon med de variable eller komplementære bestemmende områder av det antistoffet som skal påvises. For eksempel kan antiidiotypiske antistoffer anses som et antigen for dette formålet og det samme gjelder antigener som er utviklet ved såkalt fagdisplay.

Visse antigener kan omfatte eller kan være avledet fra proteiner eller polypeptider som er isolert fra naturlige kilder og disse inkluderer, men er ikke begrenset til, proteiner eller polypeptider som er isolert fra pasientvev eller kroppsvæsker. I slike utførelser kan antigenet omfatte i alt vesentlig hele det naturlig forekommende proteinet, det vil si proteinet i alt vesentlig i den form i hvilken det er isolert fra den naturlige kilden eller kan omfatte et fragment av det naturlig forekommende proteinet. For å kunne være effektivt som et antigen i den foreliggende fremgangsmåten, så må et slikt "fragment" ha beholdt den immunologiske reaktiviteten i forhold til de antistoffene som det skal brukes sammen med i testen. Egnede fragmenter kan for eksempel fremstilles ved kjemisk eller enzymatisk spalting av det isolerte proteinet.

Avhengig av den presise type prøve som det skal brukes i, kan antigenet omfatte et naturlig forekommende protein eller et fragment av dette bundet til ett eller flere ytterligere molekyler som tilveiebringer noen ønskelige egenskaper som naturlig ikke er tilstede i proteinet. For eksempel kan proteinet eller fragmentet konjugeres til en avslørende markør så som en fluorescerende markør, en fargende markør, en luminescerende markør, en radiomarkør eller et tungmetall så som kolloidalt gull. I andre utførelser kan proteinet eller fragmentet være uttrykt som et fusjonsprotein. Som et eksempel kan fusjonsproteiner inkludere et tagpeptid ved N- eller C-terminus for å lette rensingen av det rekombinant uttrykte antigenet.

Avhengig av formatet på den prøven hvor antigenet skal brukes, kan det immobiliseres på et fast underlag, for eksempel brønnene på en mikrotitreringsplate, mikromatriseperler eller brikker eller magnetiske perler. Immobilisering kan utføres via en ikke-kovalent absorpsjon eller kovalent tilfesting.

Enhver egnet tilfestingsmåte kan brukes, forutsatt at denne ikke skadelig påvirker antigenets evne til immunologisk å reagere med målantistoffet i en vesentlig grad.

Oppfinnelsen er ikke begrenset til fastfaseprøver, men omfatter også prøver som helt eller delvis utføres i en væskefase, for eksempel løsningsfaseperleprøver.

I en utførelse kan antigenene merkes med en ligand som vil lette immobiliseringen så som biotin. Antigenet kan så fortynnes til et egnet titreringsområde og deretter reageres med autoantistoffer i pasientprøver i løsning. De resulterende immunkompleksene kan så immobiliseres på et fast underlag via en ligandreseptorinteraksjon (for eksempel biotin-streptavidin), hvoretter den gjenværende delen av prøven utføres som beskrevet i det etterfølgende.

For å lette produksjonen av biotinylerte antigener som skal brukes i prøvemetodene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, så kan cDNA-molekyler som koder et fullengdeantigen, en forkortet versjon av dette eller et antigent fragment av det, uttrykkes som et fusjonsprotein merket med en protein- eller polypeptidtag som biotinsamfaktoren kan tilknyttes via en enzymatisk reaksjon. Vektorer for produksjon av rekombinante biotinylerte antigener er kommersielt tilgjengelige fra en rekke forskjellige kilder.

Som illustrert i de etterfølgende eksemplene, så er en ytterligere fordel ved å bruke titreringskurvemetoden med biotinylerte antigener, at prøven gjør det mulig å skille mellom binding av biotinkomponenten til antibiotinantistoffer foruten den virkelige bindingen av antigenet til dets kognate antistoff. De foreliggende søkere har observert at et signifikant antall personer i en gitt befolkningsgruppe naturlig produserer antibiotinantistoffer som vil kunne føre til produksjon av falske positive resultater i prøver basert på bruken av biotinylert antigen.

Som nevnt tidligere, så er den "immunprøven" som brukes for å påvise antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen basert på standardteknikker som er velkjente innenfor bioteknologien, med unntak av de multiple mengder av antigen som brukes for å utvikle en titreringskurve. I en mest foretrukket utførelse kan immunprøven være en ELISA. Slike prøver er generelt velkjente innenfor bioteknologien. I en typisk "indirekte" ELISA blir et antigen med spesifitet for de antistoffene som er under testing immobilisert på en fast overflate (for eksempel brønnene på en standard mikrotitreringsprøveplate eller på overflaten av en mikroperle eller en mikromatrise), hvoretter en prøve som omfatter den kroppsvæsken som skal testes for nærværet av antistoffer bringes i kontrakt med det immobiliserte antigenet. Eventuelle antistoffer med den forønskede spesifiteten som måtte være tilstede i prøven vil så binde seg til det immobiliserte antigenet. De bundne antistoff/antigenkompleksene kan så påvises ved å bruke enhver egnet fremgangsmåte. I en foretrukket utførelse blir et merket sekundært antihumant immunglobulinantistoff som spesifikt gjenkjenner en epitop som er felles for en eller flere klasser av humane immunglobuliner brukt for å påvise antistoff/antigenkompleksene. Typisk vil det sekundære antistoffet være anti-IgG eller anti-IgM. Det sekundære antistoffet blir vanligvis merket med en påvisbar markør, typisk en enzymmarkør så som for eksempel peroksidase eller alkalisk fosfatase, noe som muliggjør en kvantitativ påvisning ved å tilsette et substrat som enzymet reagerer med og utvikler et påvisbart produkt, for eksempel et farget, kjemiluminescerende eller fluorescerende produkt. Andre typer av påvisbare markører som er velkjente innenfor bioteknologien kan brukes med tilsvarende effekt.

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for å påvise antistoffer som er biologiske markører på en sykdomstilstand eller en sykdomsmottakelighet. Dette spesielle aspektet av oppfinnelsen utelukker fortrinnsvis prøver som er utformet for å teste antistoffer som er et resultat av en vaksinerespons eller en immuniseringsprotokoll, bortsett fra vaksinasjon med kreftmarkører. Prøver ifølge dette aspektet av oppfinnelsen inkluderer derfor fortrinnsvis ikke prøver som er utformet for å teste for nærværet av antivirale eller antibakterielle antistoffer som er et resultat av vaksinasjon/immunisering.

I visse utførelser av oppfinnelsen kan antistoffet være et autoantistoff. Som beskrevet ovenfor, så refererer begrepet "autoantistoff" seg til et naturlig forekommende antistoff som er rettet inn mot et antigen som individets eget immunsystem gjenkjenner som et fremmedelement selv om antigenet faktisk har sin opprinnelse i individet. Autoantistoffer inkluderer antistoffer som er rettet inn mot endrede former av naturlig forekommende proteiner som fremstilles av en syk celle eller under en sykdomsprosess. Den endrede formen av proteinet som oppstår i selve individet, men av immunsystemets system vil det bli oppfattet som "ikke-selv" og således utløse en immunsrespons i dette individet i form av autoantistoffer som immunologisk er spesifikke til det endrede proteinet. Slike endrede former av et protein kan for eksempel inkludere mutanter som har en endret aminosyresekvens, eventuelt fulgt av forandringer i en sekundær, tertiær eller kvarternær struktur, forkortede former, spleisevarianter, endre glykoformer, osv. I andre utførelser kan autoantistoffet være rettet inn mot et protein som blir overuttrykt i en sykdomstilstand, for eksempel som et resultat av genamplifisering eller unormal transkriberingsregulering. Overekspresjon av et protein som normalt ikke kommer i kontakt med cellene i immunsystemet i betydelige mengder, kan utløse en immunrespons som fører til autoantistoffproduksjon. I enda ytterligere utførelser kan autoantistoffet være rettet inn mot en fetal form av et protein som blir uttrykt under en sykdomstilstand. Hvis et fetalt protein som normalt bare blir uttrykt i de tidlige trinnene av utviklingen før immunsystemet er funksjonelt, blir uttrykt i en sykdomstilstand, så kan den fetale formen bli oppfattet av immunsystemet som "fremmed", noe som utløser en immunrespons som fører til en autoantistoffproduksjon.

I en utførelse kan antistoffet være et autoantistoff som er spesifikt for et tumormarkørprotein og mer spesielt et "kreftassosiert" antitumorautoantistoff.

Begrepet "kreftassosiert" antitumorantistoff refererer seg til et autoantistoff som er rettet inn mot en epitop som er tilstede på former av tumormarkørproteiner som fortrinnsvis blir uttrykt under kreftsykdomstilstanden. Nærværet av slike autoantistoffer er karakteristiske for kreftsykdomstilstanden eller for en predisponering for kreft hos asymptomatiske pasienter.

I foretrukne anvendelser vil fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen bli brukt for å påvise nærværet av kreftassosierte antitumorautoantistoffer hos mennesker eller pasienter og vil fortrinnsvis forekomme i form av en in vitro immunprøve utført på en testprøve som omfatter en prøve av en kroppsvæske tatt fra personen/pasienten. Prøven av kroppsvæsken kan fortynnes i en egnet buffer eller kan behandles for langtids lagring eller på annen møte før testen.

In vitro immunprøver er ikke-invaderende og kan gjentas så ofte det anses for nødvendig for å bygge opp en profil av autoantistoffproduksjonen i en pasient, enten før sykdommen utvikler seg eller under screening av "risikoutsatte" individer eller under hele sykdomsutviklingen (ytterligere beskrevet i det etterfølgende i forhold til foretrukne anvendelser av fremgangsmåten).

Ikke-begrensende utførelser av fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan spesielt omfatte immunprøver for å (samtidig) påvise to eller flere typer av autoantistoffer som hver har en spesifitet for forskjellige epitoper på de samme eller beslektede tumormarkørproteinene (for eksempel forskjellige isoformer eller varianter som kodes av et enkelt gen) eller for epitoper på forskjellige tumormarkørproteinet (dette betyr proteiner kodet av forskjellige gener). Disse fremgangsmåtene vil typisk innbefatte bruken av et utvalg av to eller flere sett av antigener hvor hvert sett av antigener vanligvis er avledet fra et forskjellig tumormarkørprotein (forskjellig i denne sammenhengen betyr proteiner som er produkter av forskjellige gener), skjønt som nevnt ovenfor, så kan et sett av antigener også involvere forskjellige epitoper på det samme tumormarkørproteinet. Et sett av antigener refererer seg til et enkelt antigen som skal testes i forskjellige mengder/konsentrasjoner i den foreliggende fremgangsmåten. Disse fremgangsmåtene som i det etterfølgende vil bli betegnet som "gruppeprøver" som bruker en gruppe eller et utvalg av to eller flere sett av antigener for å undersøke eller kontrollere den totale immunresponsen hos et individ i forhold til en tumor eller en annen carcinogen/neoplastisk forandring. Disse fremgangsmåtene vil således påvise en "profil" på immunresponsen i et gitt individ som indikerer hvilke tumormarkører som utløser en immunrespons som resulterer i en autoantistoffproduksjon. Bruken av et utvalg av to eller flere antigener for å kontrollere produksjonen av autoantistoffer mot to eller flere forskjellige tumormarkører er generelt mer følsom enn å påvise autoantistoffer for enkle markører og gir en langt lavere frekvens av falske negative resultater (se WO 00/58978 og WO 2004/044590 hvis innhold her i sin helhet er inkorporert som referanser).

I en ikke-begrensende utførelse av oppfinnelsen er det således tilveiebrakt en fremgangsmåte for å påvise to eller flere antistoffer i en testprøve som omfatter en kroppsvæske fra et pattedyr eller en person, hvor minst ett av de nevnte antistoffene er en biologisk markør på en sykdomstilstand eller sykdomsmottakelighet og hvor fremgangsmåten omfatter:

(a) kontakte testprøven med to eller flere sett av antigener hvor hvert av de nevnte settene av antigener er spesifikke for en av de nevnte antistoffer som skal påvises i testprøven og hvor hvert sett av antigener omfatter en rekke forskjellige mengder av nevnte antigen,

(b) påvise mengden av spesifikk binding av nevnte antistoffer og nevnte antigener, og

(c) avsette eller beregne en kurve på mengden av nevnte spesifikke binding versus mengden av antigen for hvert sett av antigener som er brukt i trinn (a).

I en utførelse så er hvert av de to eller flere antistoffene en biologisk markør på en sykdomstilstand eller sykdomsmottakelighet, men det ligger imidlertid innenfor oppfinnelsens omfang å kombinere en titreringsprøve for et sykdomsmarkørantigen med en titreringsprøve for enhver annen type av antistoff som kan være eller ikke være en sykdomsmarkør i den samme testprøven.

Uansett så vil bedømmelsen av hvorvidt de relevante antistoffer er tilstede eller fraværende i testprøven være basert på mengden av den spesifikke bindingen som observeres for hver av de forskjellige antigenkonsentrasjonene med hensyn til hvert enkelt forskjellige antigen i testen, det vil altså si de kollektive verdier for hvert enkelt antigen snarere enn en avlesning ved en enkel konsentrasjon for hvert antigen. Bestemmelse av nærvær eller fravær av en sykdomstilstand eller en sykdomsmottakelighet eller antistoffer for et fremmed stoff i en pasient eller prøve basert på nærvær av to eller flere typer antistoff, kan således være basert på disses samlede verdier for hvert antigen. Bedømmelsen blir fortrinnsvis utført på basis av utseendet av en generelt S-formet eller sigmoidal kurve med hensyn til enhver eller alle de antigener som er tilstede i testen.

For å unngå enhver tvil, så vil prøver basert på bruken av en enkelt type av antigen for å påvise antistoffer her bli betegnet som "enkeltmarkørprøver", mens prøver som er basert på bruken av en gruppe eller et utvalg av to eller flere antigener vil bli betegnet som "gruppeprøver".

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan tilpasses for å påvise autoantistoffer til i alt vesentlig ethvert tumormarkørprotein for hvilket det kan fremstilles et egnet antigen så som en enkeltmarkørprøve eller som en komponent i en gruppeprøve. Spesielt kan fremgangsmåten tilpasses for å påvise/måle autoantistoffer til det epidermale vekstfaktorreseptorproteinet EGFR (Downward et al (1984) Nature. 307: 521-527; Robertson et al. (2001 Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126; 177-81), glykoproteinet MUC1 (Batra, S.K. et al. (1992) Int. J. Pancreatology.

12: 271-283) og signaloverførings/cellesyklusreguleringsproteinene Myc (Blackwood, E.M. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell 5: 597-609), p53 (Matlashewski, G. et al. (1984) EMBO J.3: 3257-3262; Wolf, D. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1887-1893) og ras (eller Ras) (Capella, G. et al. (1991) Environ Health Perspectives. 93: 125-131) og også BRCA1 (Scully, R. et al. (1997) PNAS 94: 5605-10), BRCA2 (Sharan, S.K. et al. (1997) Nature. 386: 804-810), APC (Su, L. K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 2728-2731; Munemitsu, S. et al. (1995) PNAS 92: 3046-50), CA125 (Nouwen, E. J. et al. (1990) Differentiation. 45: 192-8), PSA (Rosenberg, R. S. et al. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248: 935-939), carcinoembryonisk antigen CEA (Duffy, M.J. (2001) Clin Chem, Apr 47(4): 624 30), CA19.9 (Haga, Y. et al (1989) Clin Biochem (1989) Oct 22(5): 363-8), NY-ESO-1 (kreft/testikkelantigen; Chen, Y.-T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 1914-1918, 1997), PSMA (prostataspesifikt membranantigen; Israeli, R. S. et al., Cancer Res. 53: 227-230, 1993), PSCA (prostatastamcelleantigen; Reiter, R. E. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998) og EpCam (epitelisk cellulært tilfestingsmolekyl; Szala, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 3542-3546, 1990), HER2 (også kjent som c-erbB2 Coussens, L. et al., Science 230: 1132-1139, 1985), CAGE (Jager D, et al., Cancer Res. 1999 Dec 15; 59(24): 6197-204; Mashino K, et al., Br J Cancer. 2001 Sep 1; 85(5): 713-20), cytokeratiner (Moll R, et al., Cell. 1982 Nov; 31(1): 11-24; Braun S, et al., N Engl J Med.2000; 342: 525-533), rekoverin (Maeda A, et al., Cancer Res. 2000 Apr 1; 60(7): 1914-20), kallikreiner (Kim H, et al., Br J Cancer 2001; 84: 643-650; Yousef GM, et al., Tumor Biol 2002;23:185-192); anneksiner (Hudelist G, et al., Breast Cancer Res Treat.2004 Aug; 86(3): 281-91), α-fetoprotein (Stiller D, et al., Acta Histochem Suppl. 1986; 33: 225-31), GRP78 (Block TM, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jan 18;

102(3): 779-84; Hsu WM, et al., Int J Cancer. 2005 Mar 1; 113(6): 920-7), CA125 (Norum LF, et al., Tumour Biol.2001 Jul-Aug; 22(4): 223-8; Perey L, et al., Br J Cancer. 1990 Oct; 62(4): 668-70; Devine PL, et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun; 12(3): 709-17); mammoglobin (Zehentner BK, et al., Clin Chem. 2004 Nov; 50(11): 2069-76; Zehentner BK, Carter D. Clin Biochem. 2004 Apr; 37(4): 249-57), raf (Callans LS. et al., Ann Surg Oncol. 1995 Jan; 2(1): 38-42; Pratt MA, et al., Mol Cell Biochem. 1998 Dec; 189(1-2):1 19-25), beta-human korionisk gonadotropin b-HCG (Ayala AR, et al., Am J Reprod Immunol. 1983 Apr-May; 3(3): 149-51;

Gregory JJ Jr, et al., Drugs. 1999 Apr; 57(4): 463-7) eller 4-5-antigen (Krause P, et al., J Immunol Methods. 2003 Dec; 283(1-2): 261-7). Det er imidlertid ikke slik at oppfinnelsen er tenkt begrenset til påvisning av autoantistoffer til disse spesielle tumormarkørene.

Prøvemetoder ifølge oppfinnelsen basert på påvisningen av antitumormarkørautoantistoffer (i en enkeltmarkør eller i en gruppeprøveform) kan anvendes i en rekke forskjellige kliniske situasjoner. Spesielt kan fremgangsmåten brukes for å påvise eller diagnostisere kreft ved bedømmelsen av prognosen for en pasient som er diagnostisert med kreft, til å predikere respons til terapi, ved overvåkning av utviklingen av kreft eller andre neoplastiske sykdommer i en pasient, ved å påvise tidlige neoplastiske eller tidlige carcinogene forandringer i en asymptomatisk person, ved screening av en gruppe av asymptomatiske personer for enten å identifisere de personene som har en forhøyet risiko for å utvikle kreft eller for å diagnostisere nærværet av kreft, ved predikering av responsen hos en kreftpasient til antikreftbehandling (for eksempel vaksinasjon, antivekstfaktor eller signaloverføringsterapi, radioterapi, endokrin terapi, human antistoffterapi, kjemoterapi), ved å overvåke eller kontrollere responsen hos en kreftpasient i forhold til antikreftbehandling (for eksempel vaksinasjon, antivekstfaktor eller signaloverføringsterapi, radioterapi, endokrin terapi, human antistoffterapi, kjemoterapi), ved påvisningen av en tilbakevendende sykdom hos en pasient som tidligere er diagnostisert med kreft og som har gått gjennom antikreftbehandling for å redusere mengden av tilstedeværende kreft eller ved valg av en antikreftterapi (for eksempel vaksinasjon, antivekstfaktor eller signaloverføringsterapi, radioterapi, endokrin terapi, human antistoffterapi, kjemoterapi) for bruk i en spesiell pasient.

De foreliggende søkere har generelt observert at nivåene av kreftassosierte autoantistoffer viser en positiv korrelering med sykdomstilstanden (se også WO 99/58979 hvis innhold her er inkorporert som en referanse). Når således fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukes for kliniske formål, så vil forhøyede nivåer av antitumormarkørautoantistoffer sammenlignet med egnede kontroller, generelt være en indikasjon på at det foreligger en kreftsykdomstilstand.

Når for eksempel immunprøvene brukes ved diagnose av kreft, så vil nærværet av et forhøyet nivå av autoantistoffer sammenlignet med "normale" kontrollindivider være en indikasjon på at individet har kreft. De "normale" kontrollindividene bør fortrinnsvis være innenfor samme aldersgruppe og ellers ikke ha noen diagnose på kreft basert på kliniske, billeddannende og/eller biokjemiske kriterier.

Når immunprøvene brukes for å predikere responsen til en kreftpasient på antikreftbehandling (for eksempel vaksinasjon, antivekstfaktor eller signaloverføringsterapi, radioterapi, endokrin terapi, human antistoffterapi, kjemoterapi), så vil nærværet av et forhøyet nivå av autoantistoffer sammenlignet med "normale" kontrollindivider kunne ses på som en indikasjon på hvorvidt eller ikke individet sannsynligvis vil respondere på antikreftbehandlingen. De "normale" kontrollindividene vil fortrinnsvis være innenfor samme aldersgruppe og ikke ha noen diagnose på kreft basert på kliniske, billeddannende og/eller biokjemiske kriterier. For hver av de behandlinger som er angitt ovenfor, så vil et forhold mellom nivået av autoantistoffer sammenlignet med kontrollene og sannsynligheten for en vellykket behandling bli etablert ved å observere resultatet av en slik behandling i pasienter hvis autoantistoffstatus blir overvåket under hele behandlingen. Tidligere etablerte forhold kan så brukes for å predikere sannsynligheten for et godt resultat i hver behandling i en gitt pasient, basert på bedømmelse av autoantistoffstatus.

Når immunprøvene brukes ved overvåking av utviklingen av kreft eller andre neoplastiske sykdommer i en pasient, så vil nærværet av et forhøyet nivå av autoantistoffer sammenlignet med en "normal kontroll" kunne tas som en indikasjon på nærværet av kreft i pasienten. Den "normale kontrollen" kan være nivåene av autoantistoffer som er tilstede i kontrollindivider, fortrinnsvis av samme aldersgruppe, og uten noen diagnose på kreft basert på kliniske, billeddannende og/eller biokjemiske kriterier. Alternativt kan den "normale kontrollen" være et "basislinje"-nivå etablert for den spesielle pasienten som er under testing.

"Basislinje"-nivået kan for eksempel være nivået av tilstedeværende autoantistoffer enten ved den første diagnosen på kreft eller en diagnose på tilbakevendende kreft. En økning over basislinjenivået vil kunne tas som en indikasjon på at mengden av kreft som er tilstede i pasienten har økt, mens en synkende verdi under basislinjen vil kunne tas som en indikasjon på at den tilstedeværende mengden av kreft i pasienten har avtatt. "Basislinje"-verdien kan for eksempel også være nivået før en ny behandling startes. En forandring i nivået av autoantistoffer vil kunne tas som en indikasjon på at terapien er effektiv. Retningen av "forandring" (det vil si en økning versus en senkning) som indikerer en positiv respons på behandling, vil være avhengig av behandlingens nøyaktige natur. For enhver gitt behandling vil retningen av "forandringen" i autoantistoffnivåene som indikerer et positivt resultat lett la seg bestemme, for eksempel ved å kontrollere eller overvåke autoantistoffnivåene sammenlignet med andre kliniske eller biokjemiske indikatorer på en respons på behandlingen.

Når immunprøvene brukes under screening av en gruppe av asymptomatiske personer, så kan dette være for å identifisere de personene hvor det foreligger en forhøyet risiko for å utvikle kreft for videre å identifisere individer med et forhøyet nivå av autoantistoffer sammenlignet med "normale" kontrollindivider, som ville kunne ha en "risiko" for å utvikle kreft. De "normale" kontrollindividene vil fortrinnsvis være innenfor samme aldersgruppe og er ikke blitt identifisert som å ha en predisponering for å utvikle kreft eller noen signifikant forhøyet risiko for å utvikle kreft. Et unntak til dette vil kunne være alder, som i seg selv er en vesentlig risikofaktor.

Når immunprøvene brukes ved screening av en gruppe av asymptomatiske personer, så kan dette være for å diagnostisere kreft i de personer som allerede har utviklet kreft, foruten å kartlegge individer som har et forhøyet nivå av autoantistoffer sammenlignet med "normale" kontrollindivider og som har kreft eller en annen form for neoplastisk forandring. De "normale" kontrollindividene vil fortrinnsvis være innenfor samme aldersgruppe og er ikke blitt identifisert til å ha noen som helst predisponering for å utvikle kreft eller noen som helst signifikant forhøyet risiko for å utvikle kreft. Et unntak til dette kan være alder, som i seg selv er en vesentlig risikofaktor. Alternativt kan den "normale kontrollen" være et "basislinje"-nivå etablert for den spesielle pasienten som er under testing. "Basislinje"-nivået kan for eksempel være nivået av autoantistoffer som er tilstede når pasienten første gang ble testet og ble påvist å ha nivåer som ikke var forhøyet ut over det som ble observert i en "normal kontroll" befolkningsgruppe. En økning deretter i forhold til basislinjemålingen vil kunne tas som en indikasjon på nærvær av kreft i det individet. Nevnte individ kan således ved en slik basislinjetest selv bli sin egen kontroll for fremtidig autoantistoffmåling.

Når immunprøvene brukes for å overvåke responsen til en kreftpasient på antikreftbehandling (for eksempel vaksinasjon, antivekstfaktor eller signaloverføringsterapi, radioterapi, endokrin terapi, human antistoffterapi, kjemoterapi), så vil nærværet av et endret nivå av autoantistoffer etter behandling kunne tas som en indikasjon på at pasienten har respondert positivt på behandlingen. En måling av basislinjenivået av autoantistoffer tatt før behandlingen er begynt, kan således brukes for sammenligningsformål for å bestemme hvorvidt behandlingen resulterer i en "økning eller en senkning" av autoantistoffnivåene. En forandring i nivået av autoantistoffer kan tas som en indikasjon på at terapien har vært effektiv. Retningen på "forandringen" (det vil si økning eller senkning) som indikerer en positiv respons på behandlingen, vil være avhengig av behandlingens presise natur. For enhver gitt behandling, så vil retningen på "forandringen" i autoantistoffnivåene som indikerer et positivt resultat, lett la seg bestemme, for eksempel ved å kontrollere autoantistoffnivåene sammenlignet med andre kliniske eller biokjemiske indikatorer på respons på behandlingen.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan brukes for å predikere og/eller kontrollere en respons hos et individ i forhold til i alt vesentlig alle kjente antikreftbehandlinger. Dette inkluderer for eksempel human antistoffterapi hvor monoklonale eller polyklonale antistoffer blir infusert i pasienten og et ikkebegrensende spesifikt eksempel er behandling med antivekstfaktorantistoffet Herceptin<TM>(Baselga, J., D. Tripathy et al., J Clin Oncol., 14(3), 737-744, 1996). Nærværet av en naturlig autoantistoffrespons kan bedre eller hemme effekten av behandlingen med kunstig infuserte terapeutiske antistoffer. Ved å bruke fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det mulig å korrelere responsen til enhver antikreftbehandling inklusive antistoffterapi, med naturlige nivåer av autoantistoffer før og i løpet av behandlingen i enhver pasient eller gruppe av pasienter. Denne kunnskapen kan så igjen brukes for å predikere hvordan andre pasienter (eller den samme pasienten i tilfellet av gjentatt behandling) vil respondere på den samme behandlingen.

Når immunprøvene brukes for å påvise en tilbakevendende sykdom, så vil nærværet av et forhøyet nivå av autoantistoffer i pasienten sammenlignet med en "normal kontroll" bli tatt som en indikasjon på at sykdommen har vendt tilbake. Den "normale kontrollen" kan være nivåer av autoantistoffer som er tilstede i kontrollindivider, fortrinnsvis innenfor samme aldersgruppe og som ikke har noen diagnose på kreft basert på kliniske, billeddannende og/eller biokjemiske kriterier. Alternativt kan den "normale kontrollen" være et "basislinje"-nivå som er etablert for den spesielle pasienten som testes. "Basislinje"-nivået kan for eksempel være nivået av autoantistoffer som er tilstede under en remisjonsperiode fra sykdommen basert på kliniske, billeddannende og/eller biokjemiske kriterier.

Prøvemetoden ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å påvise mange forskjellige typer kreft og typiske eksempler er bryst-, blære-, kolorektal-, prostata-, lunge-, pankreas- og eggstokkreft. Prøvene vil eventuelt kunne komplementere eller utfylle fremgangsmåter som gjelder screening og overvåkning. I tilfelle av primær brystkreft, så kan for eksempel kreftimmunprøver for autoantistoffer brukes for å gjøre de behandlende legene innstilt på å foreta en biopsi av små sår som har vist seg i mammogrammer og som radiografisk ikke synes å være mistenkelige eller å utføre en billeddannelse av brystet, eller å gjenta en billeddannelse tidligere enn planlagt. I klinikken vil prøvemetoden ifølge den foreliggende oppfinnelsen forventes å være mer objektiv og reproduserbar sammenlignet med de for tiden anvendte billeddannelsesteknikkene (for eksempel mammografi eller ultralyd) hvor et heldig resultat kan være operatøravhengig.

"Gruppeprøver" kan tilpasses med hensyn til den spesielle kliniske anvendelsen. En gruppe antigener for påvisning av autoantistoffer til i det minste p53 og c-erbB2 er spesielt anvendbare for mange typer kreft og kan eventuelt suppleres med andre markører med kjent assosiering med den spesielle kreften eller det spesielle trinnet av en spesiell kreft som skal påvises. For brystkreft kan for eksempel gruppen eventuelt inkluderer MUC 1 og/eller c-myc og/eller BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller PSA, mens blærekreftgruppen kan eventuelt inkludere MUC 1 og/eller cmyc, for kolorektal kreft ras og/eller APC, for prostatakreft PSA og/eller BRCA1 og/eller BRCA2 eller for eggstokkreft BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller CA125. Det er andre foretrukne utførelser hvor p53 eller c-erbB2 ikke nødvendigvis er essensielle.

I tilfelle av brystkreft, så kan egnede grupper velges fra de følgende:

p53 og MUC 1 med eventuell c-erbB2 og/eller BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

p53 og c-myc med eventuell c-erbB2 og/eller MUC1 og/eller BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

p53 og BRCA1 med eventuell c-erB2 og/eller MUC 1 og/eller c-myc og/eller BRCA2 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

p53 og BRCA2 med eventuell c-erbB2 og/eller MUC 1 og/eller c-myc og/eller BRCA1 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

c-erbB2 og MUC 1 med eventuell p53 og/eller c-myc og/eller BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

c-erbB2 og c-myc med eventuell p53 og/eller MUC1 og/eller BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

c-erbB2 og BRCA1 med eventuell p53 og/eller MUC 1 og/eller c-myc og/eller BRCA2 og/eller PSA og/eller NY-ESO-1 og/eller BRC1;

c-erbB2 og BRCA2 med eventuell p53 og/eller MUC 1 og/eller c-myc og/eller BRCA1 og/eller PSA;

p53, c-myc, NY-ESO-1 og BRCA2.

I forbindelse med kolorektal kreft, så kan egnede grupper for eksempel velges fra de følgende:

p53 og ras med eventuell c-erbB2 og/eller APC;

p53 og APC med eventuell c-erbB2 og/eller Ras;

Ras og APC med eventuell p53 og/eller c-erbB2.

Slike grupper vil også kunne inkludere CEA eller CA19-9.

I forbindelse med prostatakreft, kan egnede grupper velges for eksempel fra de følgende:

p53 og PSA med eventuell BRCA1 og/eller BRCA2 og/eller c-erbB2;

c-erbB2 og PSA med eventuell p53 og/eller BRCA1 og/eller BRCA2;

PSMA, PSCA og kallikreiner.

I forbindelse med eggstokkreft, kan egnede grupper for eksempel velges fra de følgende:

p53 og CA125 med eventuell c-erbB2 og/eller BRCA1 og/eller BRCA2;

c-erbB2 og CA125 med eventuell p53 og/eller BRCA1 og/eller BRCA2;

HER2, anneksiner, CAGE og 4-5.

I forbindelse med lungekreft, kan for eksempel egnede grupper velges fra:

p53 og NY-ESO-1, eventuelt med ytterligere markører;

HER2, anneksiner, CAGE og 4-5.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir brukt for å gjennomføre en "gruppeprøve" basert på to eller flere tumormarkørantigener avledet fra forskjellige proteiner, så må minst ett av antigenene i gruppen være testet i en prøve ifølge den foreliggende oppfinnelsen basert på testing av multiple forskjellige mengder av antigenet for å kunne danne en titreringskurve. Fortrinnsvis bør hvert av de antigenene som utgjør gruppen være testet ved hjelp av oppfinnelsens prøve, hvoretter en titreringskurve blir avsatt/beregnet for hvert individuelle antigen i gruppen.

Oppfinnelsen omfatter også i tilfeller hvor en titreringskurve for påvisning av minst ett antitumormarkørantistoff kan brukes i kombinasjon med en prøve som er utformet for å påvise minst ett tumormarkørprotein (som kan være beslektet eller ubeslektet med det antigenet som brukes i titreringsprøven) i den samme pasientprøven. Prøvene for antitumormarkørautoantistoffene og prøvene på tumormarkørproteinene kan så utføres parallelt på en enkelt pasientprøve.

I en ytterligere utførelse så kan immunprøvemetoden ifølge oppfinnelsen brukes for å velge ut en antikreftvaksine som kan anvendes i forhold til en spesiell pasient. I denne utførelsen blir en prøve av kroppsvæske tatt fra pasienten og så testet ved å bruke en gruppe av to eller flere antigener som hver tilsvarer et forskjellig tumormarkørprotein, for derved å kunne bestemme den relative styrken på pasientens immunrespons i forhold til hvert av de forskjellige tumormarkørproteinene. "Styrken på immunresponsen" til et gitt tumormarkørprotein eller -proteiner er angitt ved nærværet og/eller mengden av kreftassosierte autoantistoffer som er spesifikke for det tumormarkørproteinet som skal påvises ved å bruke immunprøven; og i de tilfeller hvor autoantistoffene kvantifiseres, så vil det være slik at jo høyere nivået er av de kreftassosierte autoantistoffene, jo sterkere vil immunresponsen være. Det tumormarkørprotein eller -proteiner som er identifisert til å utløse den sterkeste immunresponsen eller de sterkeste responsene i pasienten (det vil si det høyeste nivået av autoantistoffer) kan så velges ut og danne basis for en antikreftvaksine som kan brukes i pasienten.

Anvendbarheten til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ikke begrenset til påvisning av antitumorautoantistoffer, skjønt prøven er spesielt brukbar for dette formålet. Kreft er bare ett eksempel på en sykdom hvor påvisning av autoantistoffer kan brukes som en biologisk markør for en sykdomstilstand eller sykdomsmottakelighet. De foreliggende søkerne har oppdaget at man vil oppnå vesentlige fordeler med å bruke en titreringsmetode for å påvise autoantistoffer i pasientprøver. Det er derfor sannsynlig å konkludere at lignende fordeler vil kunne oppnås ved å bruke titreringsmetoden for å påvise autoantistoffer som er biologiske markører for sykdommer som er forskjellige fra kreft. Fremgangsmåten lar seg derfor anvende for å påvise ethvert autoantistoff som tjener som en biologisk markør for en sykdomstilstand eller sykdomsmottakelighet og som i enhver sykdom er blitt vist (eller kan bli vist) å være assosiert med autoantistoffproduksjon.

Andre anvendelser av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, å påvise autoantistoffer som er biologiske markører på autoimmune sykdommer så som for eksempel revmatisk artritt, systemisk lupus erytematose (SLE), primær gallecirrhose (PBC), autoimmun tyroiditt (for eksempel Hashimotos tyroiditt), autoimmun gastritt (for eksempel pernikøs anemi), autoimmun adrenalitt (for eksempel Addisons sykdom), autoimmun hyperparatyroidisme, autoimmun diabetes (for eksempel type 1 diabetes) eller myastenia gravis og for å screene pasientprøver for påvisning av nyre- eller leversykdommer som kan føre til utilstrekkelighet eller svikt i et av disse organene eller for å screene pasientprøver etter transplantering for å påvise nærværet av antistoffer som er rettet enten mot det syke vevet (som er blitt igjen etter en in situ posttransplantering) eller mot det transplanterte vevet.

I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise et antistoff i en testprøve som omfatter en kroppsvæske fra et pattedyr eller en person hvor nevnte antistoff er rettet inn mot et fremmed stoff som innføres i nevnte pattedyr eller person og hvor fremgangsmåten omfatter:

(b) påvise mengden av spesifikk binding mellom nevnte antistoff og nevnte antigen, og

(c) avsette eller beregne en kurve for mengden av nevnte spesifikke binding versus mengden av antigen for hver mengde av det antigen som ble brukt i trinn (a).

I denne utførelsen av oppfinnelsen så inkluderer fremgangsmåten fortrinnsvis også et trinn (d) for å påvise nærvær av nevnte antistoff basert på mengden av spesifikk binding mellom nevnte antistoff og nevnte antigen ved hver anvendte forskjellige antigenkonsentrasjon, det vil med andre ord si de samlede verdier som er observert for et spesielt antigen. Fortrinnsvis blir nærværet i testprøven av antistoff som er reaktivt med antigenet som bruke si prøven angitt eller indikert ved en generelt S-formet eller sigmoidal kurve.

I dette aspektet av oppfinnelsen kan titreringsmetoden brukes for å bedømme immunresponsen til et pattedyr og fortrinnsvis et menneske, til ethvert fremmed stoff som innføres i nevnte pattedyr eller person.

I en utførelse kan det fremmede stoffet være et terapeutisk middel så som et medikament eller formedikament, human antistoffterapi eller vaksine.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan brukes for å bedømme hvorvidt administrering av et terapeutisk middel til en pasient utløser en immunrespons som fører til produksjon av antistoffer som er spesifikke for en epitop på det terapeutiske middelet eller en komponent i en leveringsvæske, eksipient, bærer, osv., som administreres med det terapeutiske middelet.

Det terapeutiske middelets nøyaktige natur eller type er ikke begrensende for oppfinnelsen. I ikke-begrensende utførelser kan fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen brukes for å bedømme en immunrespons til syntetiske små molekyler, naturlig forekommende stoffer, naturlig forekommende eller syntetisk fremstilte biologiske midler eller enhver kombinasjon av to eller flere av de foran nevnte, eventuelt i kombinasjon med eksipienter, bærere eller leveringsvæsker.

En brukbar utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan brukes for å bedømme immunresponsen til en ikke-måldel av det terapeutiske middelet eller vaksinen. Med "ikke-mål"-delen forstås en komponentdel av det administrerte terapeutiske middelet eller vaksinen som i tilfelle av et terapeutisk middel, ikke direkte bidrar til den terapeutiske aktiviteten eller i tilfelle av en vaksine, ikke er tenkt å utløse produksjon av antistoffer i verten. En ikke-måldel kan for eksempel være tilstede for å lette rensingen av det terapeutiske middelet eller vaksinen eller kan være utformet for å assistere levering, opptak eller målsøking når det gjelder det terapeutiske middelet og/eller vaksinen. Eksempler på slike "ikke-mål"-deler inkluderer, men er ikke begrenset til, linkere eller andre grupper som vanligvis er tilknyttet rekombinant uttrykte polypeptider så som biotinmarkører, histidintagger, osv.

I en annen utførelse av dette aspektet ifølge oppfinnelsen, kan det fremmede stoffet være et infiserende middel så som en sopp, bakterie, virus eller parasitt.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere forstått ved henvisning til de følgende ikkebegrensende eksperimentelle eksemplene:

Eksempel 1 – Generell protokoll for titrering av antigen i en autoantistoffprøve

Prøver av (biotinylerte) tumørmarkørantigener kan fremstilles ved rekombinant ekspresjon ved å anvende analoge fremgangsmåter til de som er beskrevet i WO 99/58978.

Kort beskrevet ble cDNA-molekyler som koder markørantigenene av interesse klonet inn i pET21-vektoren (Invitrogen) som var blitt modifisert til å kode en biotintag og en 6 x histidintag for å lette rensingen av det uttrykte proteinet. De resulterende klonene ble så dyrket i en egnet bakterievertscelle (i inklusjonslegemer), hvoretter bakteriene ble oppløst og denaturert, hvoretter de uttrykte antigener ble innvunnet via nikkelgelataffinitetskolonner (Hi-trap, kommersielt tilgjengelig fra Amersham og ved å følge fabrikantens protokoll). De uttrykte antigenene ble renaturert ved dialyse i en passende buffer, hvoretter utbyttet av uttrykt protein bedømt ved SDS-PAGE, western blot og ELISA, kan kvantifiseres før lagring.

Den negative kontrollen VOL er en tom vektor (det vil si uten klonet cDNA), men som ikke desto mindre inkluderer His- og biotintagsekvensene.

GenBank-tilvekstnumrene for en rekke markør cDNA-molekyler er som følger:

P53: B003596

c-myc: V00568

ECD6 (HER2) ekstracellulært domene: M11730

NY-ESO: NM_001327

BRCA2: U43746

BRCA1 delta 9-10: NM_007302

1. Antigener og VOL (negativ kontroll) ble fortynnet til passende konsentrasjoner i 0,1 M karbonatbuffer og så seriefortynnet til å danne et semi-log titreringsområde (se tabell 1). Antigenfortynningene ble så plassert i en mengde på 50 μl/brønn i rekker på en Falcon mikrotitreringsplate etter en plateutforming ved å bruke en elektronisk multikanalpipette. Platene ble dekket og lagret ved 4�C i 48 timer.

2. Platene ble vasket en gang i PBS 0,1% tween 20 ved å bruke en automatisert platevasker og så tørket ved kontakt med silkepapir.

3. Platene ble blokkert med en høysaltinnkuberingsbuffer (HSB, PBS 0,5 M NaCl 0,1% kasein) i en mengde på 200 μl/brønn i en time eller inntil det var nødvendig for bruk (lagret ved 4�C).

4. Serumprøver ble opptint, virvlet og fortynnet 1/100 i HSB ved romtemperatur.

5. Platene ble tømt og tørket ved hjelp av silkepapir. Hver fortynnede serumprøve ble så i en mengde på 50 μl/brønn plassert i alle brønnene på mikrotitreringsplaten ved å bruke en elektronisk multikanalpipette.

Kontrollantistoffer ble fortynnet 1/1000 i HSB og plassert i passende brønner på platene. Platene ble dekket og innkubert i 1,5 timer ved romtemperatur med risting.

6. Vasketrinn: Platene ble vasket tre ganger i PBS 01,% tween 20 ved å bruke en automatisert platevasker og så tørket ved hjelp av silkepapir.

7. Pepperrotperoksidasekonjugert kanin antihumant Ig (Jackson, 1/10000 i HSB) ble tilsatt i en mengde på 50 μl/brønn i alle brønnene på mikrotitreringsplaten. HRP-konjugert kanin anti-mus Ig (1/1000 i HSB) ble plassert i kontrollbrønner som inneholdt antiantigenantistoffet. Platene ble så innkubert ved romtemperatur i 1 time med risting.

8. Platene ble så vasket som beskrevet i trinn 6.

9. På forhånd fremstilt TMB-substrat ble tilsatt i en mengde på 50 μl/brønn og platene ble innkubert på en benk i 10 minutter. Platene ble så forsiktig berørt for å få utført en blanding.

10. Optisk tetthet i brønnene ble bestemt ved 650 nm ved å bruke en standard plateleserprotokoll.

Tabell 1: Standard plateoppsetting

p53-plater

BRCA-plater

Eksempel 2 – Påvisning av autoantistoffer i primær brystkreft

De følgende data ble oppnådd fra en pilotundersøkelse for å bedømme følsomheten og reproduserbarheten til en gruppe av titreringsautoantistoffprøver i primær brystkreft (PBC). Undersøkelsen inkluderte serum fra 17 kvinner uten noen tegn til kreft og preoperative serumprøver fra 20 kvinner med primær brystkreft. Normale og kreftprøver var alderstilpassede. En normal og tre kreftprøver måtte fjernes fra undersøkelsen ettersom de viste tegn til antibiotinantistoffresponser og kunne derfor ikke bedømmes ved å bruke prøven i sitt nåværende format. Tilnærmet 10% av gruppen antas å utvikle en immunrespons mot biotin.

Prøven ble utført ved å anvende den protokollen som er beskrevet i eksempel 1 ved å bruke antigenene p53, c-myc, NY-ESO-1 og BRCA2.

Figur 1 gir eksempler på kurver oppnådd når antigentitreringsprøven ble brukt for å mål ep53-autoantistoffer i serum. Det fremgår at kreftpasientenes serum 17766(C) binder seg sterkt til testantigenet (p53) med en karakteristisk sigmoidal kurve, men binder seg ikke til den negative kontrollen, VOL. I sammenligning så gir serum fra et normalt individ, 18053(N) ikke en titreringskurve for binding til testantigenet eller den negative kontrollen.

Autoantistoffnivåene ble uttrykt som optisk tetthet (650 nm) som skyldes binding til testantigenet minus det som skyldes binding til den negative kontrollen (VOL). Den normale avskjæringsgrensen ble beregnet den som den 95. persentil (middelverdi 2 standardavvik) av den normale gruppen. Dette er vist som en stiplet linje på figur 2 hvor anti-p53-autoantistoffnivåene i normale individer er sammenlignet med kreftpasienter. Det fremgår at kreftgruppen har generelt høyere autoantistoffnivåer og har dessuten en større andel individer med nivåer over avskjæringsgrensen.

Gruppen besto av fire antigener; p53, c-myc, NY-ESO-1 og BRCA2. Følsomheten på de individuelle prøvene er gitt i tabell 2 sammen med den samlede følsomheten for gruppen av fire antigener ved påvisningen av primær brystkreft (63%).

Tabell 2: Følsomhet for antigentitreringsautoantistoffprøven. Autoantistoffer mot fire forskjellige antigener ble målt og den samlede følsomheten for gruppen ble beregnet. Avskjæringsnivåene ble beregnet som middelverdi 2 standardavvik av det normale prøvesettet. Individer med antibiotinantistoffresponser ble utelukket ettersom de ikke kunne bedømmes.

For å bedømme hvorvidt eller ikke de oppnådde målingene ved å bruke titreringsautoantistoffprøven var reproduserbare, ble det så utført prøver på tre separate dager og resultatene er vist i tabell 3. Prøven ble ansett å være reproduserbar hvis alle tre resultatene var i overensstemmelse med hverandre.

Reproduserbarheten for målingene utført på normalt serum var 94% (15/16) og 88% (14/16) i brystkreftprøvene.

Forsøk Forsøk

Normale PBC-individer A B C individer A B C

18017 - 17733 - -18018 - - - 17734 AB - -18019 - - - 17735 - - -18020 - - - 17742

18021 - - - 17743

18047 - - - 17744

18048 AB - 17755 - -18049 - - - 17756 - - -18050 ND - - 17757 - - -18051 - - - 17758 ND - -18052 - - - 17759

18053 - - - 17766

18054 - - - 17774 - - -18055 - - - 17775 AB -18056 - - - 17776 - - -18057 - - - 17777 - - ND

18058 - - - 17796 - - -17797 AB - -17832

17450 - - -

Tabell 3: Reproduserbarhet for antigentitreringsprøven for p53-autoantistoffer.

Prøver ble utført på tre separate dager (forsøk A, B og C) på serumprøver fra pasienter med primær brystkreft (PBC) eller normale kontrollindivider.

Avskjæringsnivåene ble beregnet på daglig basis som middelverdien 2 standardavvik av det normale prøvesettet. AB betegner individer som viste tegn til en antibiotinantistoffrespons og som ikke kan bedømmes ved det foreliggende prøveformatet. En prøve ble ansett å være reproduserbar hvis alle tre resultatene var i overensstemmelse med hverandre. Reproduserbarheten for normale individer var 94% (15/16) og for PBC-pasientene var den 88% (14/16).

Eksempel 3 – Påvisning av autoantistoffer i lungekreft

En analyse av autoantistoffresponsene mot 2 antigener (p53 og NY-ESO) i en pilot lungekreftundersøkelse (10 normale og 9 lungekreft plasmapasienter) viste et påvisningsforhold på 78% (figur 3).

Prøven ble utført ifølge den generelle protokollen som er beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at plasmaprøver ble brukt i stedet for serum.

Positive pasientprøver ga sigmoidale titreringskurver lik de som er vist på figur 1. Figur 3 viser en sammenligning mellom p53- og NY-ESO-autoantistoffnivåene i normale individer og i pasienter med lungekreft slik dette ble målt ved å bruke antigentitreringsprøven. Normale avskjæringsgrenser ble beregnet som middelverdien pluss 2 standardavvik for den normale gruppen.

Eksempel 4 – Ytterligere titreringskurver

De følgende ytterligere titreringskurvene ble alle utviklet i prøver basert på den generelle fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 1. Resultatene indikerer at titreringskurvemetoden kan anvendes for påvisning av en rekke forskjellige antigener, i forskjellige typer av kroppsvæsker og i forbindelse med forskjellige sykdommer (eksemplifisert ved forskjellige typer av kreft) og viser også fordelen ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen ved å kunne skille mellom "virkelige" og "falske" positive resultater.

Figur 4 viser en titreringskurve for å påvise autoantistoffer mot p53 og NY-ESO i en prøve av ascitesvæske tatt fra en pasient med brystkreft. Denne pasienten ble testet, men viste seg ikke å produsere autoantistoffer mot c-myc.

Figur 6 viser en titreringskurve for påvisning av autoantistoffer mot NY-ESO i en prøve av serum fra en pasient med lungekreft. Denne pasienten ble testet, men viste seg ikke å produsere autoantistoffer mot p53 eller c-myc.

Figur 7 viser en titreringskurve for påvisning av autoantistoffer mot NY-ESO og p53 i en prøve av serum fra en pasient med lungekreft. Denne pasienten ble testet, men viste seg ikke å produsere autoantistoffer mot c-myc.

Figurene 8(a) og 8(b) illustrerer resultatene av to uavhengige titreringsprøver for autoantistoffer mot p53, c-myc og NY-ESO-1 i prøver av serum fra en "normal" pasient (det vil si et individ uten noen tegn til kreft). I den prøven som er vist på figur 8(a), ble det observert en flat linje med økende mengder av antigen, noe som indikerer at serumprøven ikke inneholder autoantistoffer til noen av de testede antigenene. Når en ny porsjon av det samme pasientserumet på nytt ble testet ved å bruke den samme prøvemetodikken, så resulterte prøven ikke i de unormale resultater som er vist i figur 8(b). Fravær av den karakteristiske titreringskurven med økende mengder av antigen indikerer at dette er et unormalt resultat snarere enn et virkelig positivt resultat. Hadde denne prøven blitt testet i en enkeltpunktsprøve ved å bruke en enkel fast mengde av antigen, så ville denne fremtre som et "falskt positivt" resultat. Disse resultatene illustrerer således fordelen ved å anvende titreringskurvemetoden for å skille mellom virkelige og falske positive resultater.

Figurene 9(a) og 9(b) viser resultatene av to uavhengige titreringsprøver utført på prøver av serum fra en enkelt pasient med invaderende brystkreft ved å bruke forskjellige antigener. Denne spesielle pasienten viste autoantistoffer til NY-ESO-1, HER2 og BRCA2. For hvert positive antigen er et positivt prøveresultat angitt ved økende signalstyrke med økende konsentrasjon av antigen, det vil si et titreringssignal.

Figurene 10(a) og 10(b) viser anvendbarheten av den foreliggende oppfinnelsen ved å kunne skille mellom antibiotinresponser og "virkelige" autoantistoffer til et spesifikt antigen (for eksempel en tumormarkør). I disse prøvene ble serumprøver fra klinisk normale personer testet for nærvær av autoantistoffer ved å bruke biotinylerte antigener BRCA2, HER2, c-myc og NY-ESO-1, ikke-biotinylert BRCA1 og kontrollekspresjonsprodukter av den "tomme" vektoren VOL, som koder biotintaggen, men ikke noe ytterligere antigen. Det testede individet oppviste en titreringsrespons til både biotinylerte antigener og til den tomme vektoren VOL som effektivt virker som biotin alene, men ingen respons til det ikke-biotinylerte antigenet BRCA1, noe som indikerer at de "positive" resultatene med de biotinylerte markørene i virkeligheten skyldes nærværet av antibiotinantistoffer i dette individet.

Eksempel 5 – Analyse av følsomheten og spesifiteten til antigentitreringsprøver sammenlignet med enkeltpunktsmåling

Autoantistoff (AAb) -målinger ble utført på 100 kvinner med primær brystkreft (PBC) og 80 kvinner uten noen tegn til ondartet sykdom ved å bruke både titreringsmetoden og ved å måle en enkeltkonsentrasjon av antigen (10 μg/ml). Tabeller som viser en direkte sammenligning mellom de to metodene er vist nedenfor:

Tabell 4. Sammenligning mellom følsomheten for titrerings AAb-prøven med en måling ved en enkelt antigenkonsentrasjon PBC.

Antigen Enkeltpunkt Titreringsprøve

p53 17,5% 18,9%

c-myc 6,2% 22,9%

NY-ESO-1 24,7% 25,0%

BRCA2 20,6% 31,3%

HER2 23,7% 25,0%

MUC1 18,5% 19,8%

Gruppe (av 6 Ags) 54,6% 62,2%

Tabell 5. Sammenligning mellom spesifiteten til titrerings AAb-prøven med en måling ved en enkelt antigenkonsentrasjon i normale kvinner.

Antigen Enkeltpunkt Titreringsprøve

p53 93,8% 97,3%

c-myc 93,8% 94,6%

NY-ESO-1 90,0% 93,3%

BRCA2 90,0% 94,6%

HER2 91,3% 95,9%

MUC1 92,5% 95,9%

Gruppe (av 6 Ags) 71,3% 78,4%

Det fremgår at ved å bruke flere punkter på antigentitreringskurven så ble det oppnådd både høyere følsomhet og spesifitet enn med en enkeltpunktsmåling.

Eksempel 6 – Mulige årsaker til den høyere følsomheten og spesifiteten med antigentitreringsprøven

Uten å være bundet spesifikt av en eller flere teorier, så anser den foreliggende søker at det er en rekke årsaker til den observerte høyere spesifiteten og følsomheten for en prøve hvor antigenet ble titrert.

(i) Figur 11 viser resultatene av en AAb-analyse av serum fra en pasient med primær brystkreft (PCB) ved å bruke antigenene p53, c-myc og NY-ESO-1 i varierende konsentrasjoner. Disse resultatene viser at i enkelte tilfeller så faller titreringskurven ved høye antigennivåer (NY-ESO-1-kurven). Dette er et vanlig observert fenomen i immunkjemiske undersøkelser. Hvis en enkeltpunktsmåling ved 10 μg/ml ble brukt, så ville denne pasienten ha blitt klassifisert som negativ med hensyn til NY-ESO-1-antistoffer, mens det i virkeligheten var en klar positiv respons.

(ii) Figur 12 viser analysen av serum fra et normalt individ ved også å bruke titrert antigen p53, c-myc og NY-ESO-1. Denne figuren viser en effekt som de foreliggende søkere har observert i tilnærmet 10% av prøvene hvor basislinjen for antigenmålingen (i dette tilfellet p53) forskyves til et nivå over det tilsvarende nivået for den negative kontrollen (VOL). Dette gir en falsk høy avlesning. Denne typen resultat lar seg lett identifisere ved titreringsprøven, men vil være usynlig i et sett av enkeltpunktsmålinger. Dette vil resultere i redusert spesifitet på grunn av disse falske positive verdiene (se tabell 5).

(iii) Som nevnt ovenfor i eksempel 4, så hadde de antigenene som ble brukt i titrerings AAb-prøven en biotintag som kan brukes ved rensing av proteinet. Det er imidlertid kjent at tilnærmet 10% fra en vilkårlig befolkningsgruppe har en antistoffrespons til biotin som er et vitamin. Figur 13 viser en antibiotinrespons hos en pasient med PBC. Denne responsen kan klart identifiseres ved å bruke titreringskurven som en sterk antistoffrespons mot den negative kontrollen, VOL (som også er biotinylert). Disse individene lar seg ikke måle ved hjelp av prøven i dette formatet. Hvis man imidlertid brukte en enkeltpunktsprøve, så vil antibiotinresponderende personer ikke la seg skille fra virkelige responderende individer.

Eksempel 7 – Påvisning av forhøyet følsomhet ved antigentitrering sammenlignet med serumtitrering

AAb-målinger ble utført på to måter i to ganske forskjellige eksperimenter. Det første anvendte standardformatet hvor platen ble belagt med antigen i en semi-log titrering fra 10 μg/ml ned til 0,01 μg/ml. Etter blokkering ble serum tilsatt i en fortynning 1 til 100. I det andre eksperimentet ble platene belagt med et antigen ved en konsentrasjon på 3 μg/ml og etter blokkering ble serum tilsatt i et semi-log titreringsområde fra en fortynning 1 i 10 ned til 1 i 10000. Metodene når det gjelder resten av prøvene var identiske. To samlinger av serum som var kjent for å være positive for p53 og c-myc ble undersøkt sammen med 8 sera fra kvinner med PBC og 10 sera fra normale individer. Resultatene er vist i den etterfølgende tabell 6.

Tabell 6. Følsomhet ved AAb-prøver som innbefatter titrering av antigen sammenlignet med de som omfatter titrering av serum.

Det fremgår at prøveformatet som innbefatter titrering av antigen er mer følsomt enn formatet som innbefatter titrering av serum. Prøver som var sterkt positive ble påvist i begge formater, mens svakt positive resultater i antigentitreringsprøven ble imidlertid generelt ikke påvist i serumtitreringsprøven.

Den lavere følsomheten som ble påvist i serumtitreringsformatet skyldes en iboende ikke-spesifikk binding av serum ved høye konsentrasjoner. Dette gir et bindingsnivå til proteinene selv i normale prøver (se figur 14), noe som forhøyer den normale avskjæringsverdien med en etterfølgende reduksjon av følsomheten. Spesifiteten ble også redusert i serumtitreringsformatet (BRCA2 = 90%) sammenlignet med antigentitreringsformatet (BRCA2 = 100%).

Figur 15 viser resultater av de eksperimenter som er vist i figur 4, men med serum fra en pasient med primær brystkreft. Det ble observert at pasienten var positiv for autoantistoffer mot p53 og c-myc, men negativ for autoantistoffer mot BRCA2 når man anvendte antigentitreringsmetoden ifølge oppfinnelsen. Når man imidlertid måte autoantistoffer innenfor et serumtitreringsområde, ble det ikke påvist noen autoantistoffer (se tabell 6). Dette skyldes den ikke-spesifikke bindingen som forekommer i serum ved høye konsentrasjoner (vist ved det høye bindingsnivået for det negative kontrollproteinet (VOL)) som maskerer de signalene som skyldes spesifikk autoantistoffbinding. Konsekvensen er at med serumfortynning vil denne prøven angi at en pasient med primær brystkreft var negativ. Ettersom følsomheten = virkelige positive verdier/virkelige positive verdier falske negative verdier, så har dette den effekten at det øker telleren og derfor nedsetter følsomheten.

Som en konklusjon, så har de foreliggende søkere vist at antigentitreringsautoantistoffprøver er mer følsomme og mer spesifikke enn å måle autoantistoffreaktivitet ved en enkelt antigenkonsentrasjon. Dette fordi antigentitreringen gir en mulighet for å påvise både lav forekomst, lavaffinitetsautoantistoffer ved høye antigenkonsentrasjoner så vel som høyforekommende autoantistoffer som ellers ville unngå observasjon ved høye antigenkonsentrasjoner, men som binder seg maksimalt videre nedover titreringskurven. Fremgangsmåten gjør det også mulig å diskriminere ikke anvendbare prøver fra virkelige resultater, noe som ikke er mulig med enkeltpunktsmåling. Det er antatt at antigentitrerings AAb-prøver er mer følsomme enn bare titrering av serum, ettersom det høye nivået av ikke-spesifikk binding som observeres med serum ved høye konsentrasjoner hever de normale avskjæringsnivåene og derved senker følsomheten.