CN114660289A

CN114660289A - 肝癌标志物及其应用

Info

Publication number: CN114660289A
Application number: CN202210213918.9A
Authority: CN
Inventors: 石国军; 潘序雅; 王何婷; 陈燕铭; 陈健宁; 温诗怡; 王瑨; 李婷; 艾鹤英; 何学敏; 朱延华
Original assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明涉及癌症领域，尤其是提供了一种有利于肝癌诊断和预后的生物标志物，其中受试者样本中生物标志物(转录激活因子4)的变化水平有助于受试者的肝癌诊断或肝癌受试者的预后。相比传统生物标志物，ATF4蛋白更为全面的标记肝癌细胞，在肝癌癌灶中存在明显的表达差异，可通过检测确证癌灶范围，更利于判定肿瘤侵袭范围；传统肿瘤生物标志物Ki67仅标记增殖活跃的肝癌细胞，而ATF4蛋白不仅可标记Ki67阳性细胞，同时，相较于癌旁组织，其在整个肝脏肿瘤组织中都呈现高表达。并且，ATF4蛋白和其他肝癌生物标志物联用可以更加精确且全面地定位癌灶。

Description

肝癌标志物及其应用

技术领域

本发明涉及癌症领域，尤其是提供了一种有利于肝癌诊断和预后的生物标志物，其中受试者样本中生物标志物的变化水平有助于受试者的肝癌诊断或肝癌受试者的预后。

背景技术

癌症的早期筛查、精确诊断分型对癌症患者治疗及预后评估至关重要。目前，基于特殊生物标志物的组织病理学证据是绝大多数癌症的诊断“金标准”。通过对患者疑似癌灶、淋巴结、癌旁组织、血液或分泌物等进行取材，测定生物学标志物表达量及分布，可判定癌灶范围及来源、癌细胞分化程度、侵袭范围等，对患者诊疗方案制定及生存预后评估具有决定性作用。除了应用于明确诊断，生物标志物对癌症与影像学证据结合，对包括肝癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌等多种癌症的早诊筛查、监测治疗敏感性也有较大帮助。

近几十年来，由于生物技术的不断发展，涌现出大量用于诊断的生物标志物，其可为大分子蛋白、核苷酸(如microRNA或non-coding RNA、突变基因)、抗体、多肽等。

近年来，有研究公开可以通过ki67、CK7、CK19、Arginase-1、CD34、AFP等生物标志物诊断肝癌。其中CD34作为内皮细胞标志物可于新生血管及毛细血管化肝窦中呈强阳性；细胞角蛋白CK7、CK19染色可示胆管反应，染色阳性为肺恶性肝细胞癌特征，反之示高分化恶性肝细胞癌浸润汇管区；Glypican-3、HSP70、GS在肝癌早期即于癌细胞中呈特异性高表达，因此当其中任意两种呈阳性时并结合临床可诊断早期肝癌；此外，Hep Par1、pCEA、CD10、CKs 7、8/18、19、20等可有助于鉴别原发性肝癌或转移性癌灶。AFP是目前被认为肝癌早诊筛查的最佳指标，对于具有肝癌高风险人群而言，建议规律进行AFP、AFP-L3及DCP监测。

虽然肝癌的病理分子诊断的发展已较为成熟，但目前临床应用的原位生物标志物仍具有一定局限性。例如Ki67作为细胞增殖标记物，仅标记增生活跃的肝癌细胞，对于准确判定癌灶范围具有一定局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种有利于肝癌诊断和预后的生物标志物转录激活因子4(ATF4蛋白)。ATF4蛋白在肝癌癌灶中存在明显的表达差异，可通过检测确证癌灶范围，为肝癌诊断或/和预后提供新更可靠的参考。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了转录激活因子4在制备用于诊断或/和预后受试者肝癌的试剂盒中的应用。

ATF4蛋白作为转录活化因子参与细胞应激状态下对稳态的维持调控，是未折叠蛋白反应(UPR,Unfolded Protein Response)中重要一环。UPR由PERK、IRE1α、ATF6作为压力感受器，可由多种细胞应激状态激活，例如错误折叠蛋白累积、钙离子稳态失调、氧化还原失衡、蛋白质糖基化异常或蛋白质折叠机制受损等；激活的UPR可降低细胞整体蛋白合成水平，同时通过增强特定内质网功能蛋白合成以增加内质网对蛋白的容纳及折叠能力；当应激超过细胞承载能力时，其可激活细胞凋亡以维持机体整体稳态。协同作用的UPR通路决定细胞在应激状态下最终重塑稳态抑或走向细胞死亡。ATF4蛋白是PERK下游的主要蛋白，激活的ATF4蛋白进入细胞核，特异性启动包括CHOP、GADD34及ATF3等基因的转录，最终导致细胞凋亡、细胞周期停滞。

通过分析发现，非肝癌组织样本中未检测出ATF4蛋白，但在肝癌患者中组织样本中观察到ATF4蛋白，因此，确认组织样本中的ATF4蛋白的表达水平可以用于肝癌的检测、诊断和预后中。

作为本发明所述应用的优选实施方式，转录激活因子4用于确证肝癌癌灶范围。

作为本发明所述应用的优选实施方式，转录激活因子4和其他肝癌生物标志物联用用于诊断或/和预后受试者肝癌，所述其他肝癌生物标志物包括ki67、CK7、CK19、Arginase-1、CD34、AFP、AFP-L3、DCP、Glypican-3、HSP70、GS、Hep Par1、pCEA、CD10中的至少一种，其中ki67、Glypican-3更为优选。

转录激活因子4和其他肝癌生物标志物联用，可以更加精确且全面地定位癌灶，有利于肝癌诊断和治疗。

本发明还提供了一种用于诊断或预后肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)用于测定受试者样本中转录激活因子4水平的工具，其中，所述样本为生物体液样本，以及

2)将1)中获得的水平与参考值进行比较的工具，其中：

如与参考值相比，受试者样本中转录激活因子4水平升高，则受试者被诊断患有肝癌；

如与参考值相比，受试者样本中转录激活因子4水平降低，则受试者被诊断不患有肝癌；其中，测定的转录激活因子4水平为转录激活因子4蛋白水平。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述参考值通过测定健康受试者样本或测定未被诊断为患有肝癌的受试者样本所得。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，转录激活因子4水平通过免疫组织化学、ELISA或Western印迹方法测定。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述受试者是人。

此外，本发明还提供了鉴定转录激活因子4的试剂在制备用于诊断或/和预后受试者肝癌的试剂盒中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

本发明利用ATF4蛋白在肝癌组织中高表达的特点，后续根据ATF4蛋白具体表达水平，可探究ATF4蛋白与患者肝癌分期、预后生存之间的关系，通过结合具体临床资料、随访、建立数学模型等方法，构建基于ATF4的肝癌预后模型，为肝癌患者治疗、预后评估提供新的方向。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种肝癌标志物(ATF4蛋白)，相比传统生物标志物，ATF4蛋白更为全面的标记肝癌细胞，更利于判定肿瘤侵袭范围；传统肿瘤生物标志物Ki67仅标记增殖活跃的肝癌细胞，而ATF4蛋白不仅可标记Ki67阳性细胞，同时，相较于癌旁组织，其在整个肝脏肿瘤组织中都呈现高表达。并且，ATF4蛋白和其他肝癌生物标志物联用可以更加精确且全面地定位癌灶。

附图说明

图1为利用ATF4蛋白表达鉴定人肝细胞癌染色图；

图2为实施例2中ATF4蛋白表达水平的结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所使用的术语“诊断”涉及了一种尝试确定和/或确认受试者可能疾病的过程，即诊断规程和根据该过程所形成的意见，即“诊断意见”。因此，诊断可以认为是一种对受试者疾病进行尝试分类，分为一系列单独且有区别的类别，从而作出治疗决定和制定预后。特别是，术语“肝癌诊断”指的是对受试者肝癌的存在性进行确认或检测的能力。这种检测过程由于是本领域技术人员所能理解的，不会要求其针对所有分析样本的结果都是正确的。然而，这一过程要求所分析样本中被正确分类的量应当具有统计学显著性。本领域技术人员可以使用不同的统计工具来建立所述统计学显著的量；所述统计工具中演示性、非局限的例子包括确定置信区间、确定P值、学生t检验和Fisher判别函数等。(详见，例如DowdyandWearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York1983)置信区间优选至少90％、至少95％、至少97％、至少98％至少99％。p值优选小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.0001。本发明的教导优选允许对所测定组或分析人群中的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的受试者做出正确诊断。

这里所使用的术语“表达水平”指的是受试者样本中基因所产生的可测量的基因产物的量，其中所述基因产物可以是转录产物或转译产物。根据本领域技术人员的理解，基因表达水平可以通过测定所述基因的信使RNA水平或所述基因的蛋白水平表示。在本发明的条件下，编码ATF4蛋白的基因表达水平可以通过测量该基因编码的mRNA水平或测量该基因编码的蛋白水平，即ATF4蛋白或其变体的水平。ATF4蛋白变体包括该蛋白所有生理学上相关的转译后化学修饰形式，例如糖基化、磷酸化、乙酰化等，但要具有该蛋白的功能。所述术语包括任何哺乳生物的ATF4蛋白，包括但不限于家养或农场动物(牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物)、灵长类动物和人类。

本发明中所使用的术语“参考值”指的是一种实验室数值，它作为参考用于通过实验室检查受试者或受试者来源的样本获得数值或数据。参考值或参考水平可以是绝对值、相对值、具有上限或下限的值，一个数值范围、算术平均值、中位值、平均值或与特定参照或基线值的一种比较值。参考值可以是基于单独样本得到的数值，例如，受试者从测试开始前的早期样本中所获得的数值。参考值可以是来源于大量样本的数值，例如来自实际年龄匹配组的受试者人群，或基于一系列包含或排除测试样本的样本组。

实施例1、一种受试者肝癌的诊断方法

本发明的发明人发现，通过免疫荧光染色，非肝癌组织样本中检测出ATF4蛋白水平较低(共12例样本)，但在肝癌患者中组织样本中观察到大量ATF4蛋白(共24例样本)，因此，确认组织样本中的ATF4蛋白的表达水平可以用于肝癌的检测、诊断和预后中。

本发明提供了一种受试者肝癌的诊断方法，包括：

1)测定受试者样本中转录激活因子4水平，其中，所述样本为生物体液样本，以及

2)将1)中获得的水平与参考值进行比较，其中：

如与参考值相比，受试者样本中转录激活因子4水平降低，则受试者被诊断不患有肝癌；其中，测定的转录激活因子4水平为转录激活因子4蛋白水平。所述参考值通过测定健康受试者样本或测定未被诊断为患有肝癌的受试者样本所得。

在本发明诊断方法的第一步中，应当对待确诊受试者的样本中转录激活因子4表达水平进行测定。所要测定转录激活因子4表达水平的样本可以为任何包含潜在肝癌细胞的样本。在一项具体实施例中，含有潜在肝癌细胞的样本是一种生物体液样本。在一项具体实施例中，含有潜在肝癌细胞的样本是潜在的肝癌组织或其部分。所述样本可以通过常规方法获得，例如通过本领域普通技术人员所熟知的方法进行的活体检查、外科切除或抽吸(穿刺)。通过活体检查获得样本的方法包括生物团总分配、或微切除或其他已知的细胞分离方法包括肝切除术。肝癌胞还可以通过细针穿刺(抽吸)细胞学方法额外获得。为了简化样本的保存和处理过程，这些样本可以使用福尔马林固定，然后使用石蜡包埋或快速冷冻并随后使用低温固化介质进行包埋，例如OCT-Compound，通过进入浸入超低温介质中，使样本快速冷冻。

选用合适方法进行蛋白水平上的基因表达水平测定，方法包括但不限于测定蛋白表达水平的常规测试，例如使用可以与由所述基因编码的蛋白质(或其含有抗原决定簇的片段)特异结合的抗体，随后对所得的抗体-抗原复合物进行定量。在一项具体实施例中，ATF4蛋白的蛋白水平定量可以使用确定蛋白表达水平的标准检测方法，例如Western印迹或Western转移，ELISA(酶联免疫吸附测定)，RIA(放射免疫测定)，竞争性EIA(竞争酶免疫测定)，DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)，免疫细胞化学和免疫组织化学技术，基于使用生物芯片或包括特异性抗体的蛋白质微阵列技术，或基于胶体沉淀的测定形式，例如试纸。

这些检测中所应用的抗体可以是，例如，多克隆血清、杂交瘤上清液或单克隆抗体、抗体片段、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2、ScFv、双抗体、三抗体、四体抗体和人源化抗体。同时，抗体可以被标记或不被标记。在只为演示目的所提供的非排他性的实施例中，可被使用的标志物包括放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、颗粒、着色剂等。本发明中可以使用大量众所周知的测定法，测定方法中使用了非标记抗体(一抗)和标记抗体(二抗)；这些技术包括Western印迹或Western转移、ELISA、RIA、竞争性EIA、DAS-ELISA、免疫细胞化学和免疫组织化学方法，基于使用生物芯片或包括特异性抗体的蛋白质微阵列技术，或基于胶体沉淀的测定形式，例如试纸。其它检测和定量目的蛋白水平的方法包括亲和色谱、结合-配体检测方法等。

在本发明诊断方法的第二步骤中，将要进行诊断的受试者样本的ATF4蛋白表达水平与参考值进行对比。在使用本发明方法诊断受试者的癌症时，参考值是一名健康受试者的一个样本中测定的ATF4蛋白表达水平，即未被诊断为患有肝癌的受试者，或者是确诊患有肝癌受试者的非爱干组织样本，优选参考值来自一名健康受试者或未被诊断患有肝癌的受试者样本中测定的ATF4蛋白表达水平。

一旦参考值确定后，可以将样本中ATF4蛋白表达水平与所述参考值进行比较，从而确认这是一种“增长”或“降低”的表达水平。例如，当与参考值比较时，发现表达水平的上升程度高于参考值至少1.1倍、1.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多的情况下，则被认为是“增长”的表达水平。另一方面，当与参考值比较时，发现表达水平的下降到参考值的至少0.9倍、0.75倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、0.025倍、0.02倍、0.01倍、0.005倍或更少的情况下，则被认为是“降低”的表达水平。

因此，如果发现待确定诊断的受试者，其样本ATF4蛋白表达水平与参考值比较，表达水平上升，则该受试者被诊断为患有肝癌。可选择地，如果发现待确定诊断的受试者，其样本ATF4蛋白表达水平与参考值比较，表达水平降低，则该受试者不能诊断为患有肝癌。

实施例2、利用ATF4蛋白表达鉴定人肝细胞癌

1)患者肝脏肿瘤及癌旁组织取样：术中取患者肝脏同时包含肿瘤及癌旁的样本，进行快速冰冻或浸于4％PFA中保存。

2)取样标本固定、制片：对于快速冰冻样本，可置于OCT中，-80℃保存；对于浸于4％PFA的样本，可石蜡包埋保存。利用冰冻切片机或石蜡切片机进行切片，切片厚度为5μm。

3)样本染色处理：

对于冰冻切片：通过磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三遍后，利用含0.5％Triton-X100及3％驴血清的PBS封闭液进行封闭处理30分钟；利用含ATF4抗体的封闭液进行过夜孵育。

对于石蜡切片：按照二甲苯、无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、75乙醇顺序进行脱蜡水化；将切片浸于Tris-EDTA抗原复性液(Tris1.4g,EDTA0.37g,0.05％Tween20溶于1000ml ddH₂O)中，煮沸30分钟；待抗原复性液及切片自然冷却；磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，每次10分钟；利用含0.5％Triton-X100及3％驴血清的PBS封闭液进行封闭处理30分钟；利用含ATF4抗体的封闭液进行过夜孵育。

第二日进行二抗孵育：弃去一抗，用含有0.2％Tween20的PBS清洗3遍，每次10分钟；利用封闭液配制荧光二抗，避光孵育2小时；弃去二抗，用含有0.2％Tween20的PBS清洗3遍，每次10分钟；进行DAPI染色；封片。

4)镜检：在激光共聚焦显微镜或荧光显微镜或荧光病理扫描仪下，根据二抗荧光属性，选择适合的激发光进行检测，寻找ATF4表达水平高d的区域，即可定位为癌灶，及其范围。

利用ATF4蛋白对肝癌患者肝脏肿瘤及癌旁组织如上部分所述方法进行染色，并同时利用Ki67作为已知癌细胞定位标志进行对比，结果如下图1-图2所示。

可见：(1)Ki67阳性细胞内ATF4蛋白表达显著升高；(2)Ki67阳性区域内ATF4蛋白表达水平升高；(3)Ki67阴性区域ATF4蛋白表达水平较低。由此可见ATF4蛋白可作为可靠的标记肝癌组织范围的生物标志物。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.转录激活因子4在制备用于诊断或/和预后受试者肝癌的试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，转录激活因子4用于确证肝癌癌灶范围。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，转录激活因子4和其他肝癌生物标志物联用用于诊断或/和预后受试者肝癌，所述其他肝癌生物标志物包括ki67、CK7、CK19、Arginase-1、CD34、AFP、AFP-L3、DCP、Glypican-3、HSP70、GS、Hep Par1、pCEA、CD10中的至少一种。

4.一种用于诊断或预后肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

2)将1)中获得的水平与参考值进行比较的工具，其中：

如与参考值相比，受试者样本中转录激活因子4水平降低，则受试者被诊断不患有肝癌。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述参考值通过测定健康受试者样本或测定未被诊断为患有肝癌的受试者样本所得。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，转录激活因子4水平通过免疫组织化学、ELISA或Western印迹方法检测。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述受试者是人。

8.鉴定转录激活因子4的试剂在制备用于诊断或/和预后受试者肝癌的试剂盒中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂包括质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。