ES2244477T3 - Deteccion de la isoenzima de la piruvato cinasa en las heces. - Google Patents
Deteccion de la isoenzima de la piruvato cinasa en las heces.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección selectiva, cualitativa o/y cuantitativa de la isoenzima de la piruvato cinasa del tipo de tumor M2 (tumor M2-PK), que sirve como marcador de tumores, en las heces de seres humanos y animales para la detección de un suceso maligno en el tracto gastrointestinal, caracterizado porque se determina la tumor M2-PK en una muestra de heces, según el principio del inmunoensayo, con ayuda de por lo menos un receptor, que no reacciona de modo cruzado con ninguna otra isoenzima de la piruvato cinasa.
Description
Detección de la isoenzima de la piruvato cinasa
en las heces.
El presente invento se refiere a un procedimiento
para la detección selectiva, cualitativa o/y cuantitativa de la
isoenzima de la piruvato cinasa del tipo de tumor M2 (tumor
M2-PK), que sirve como marcador de tumores, en las
heces de seres humanos y animales para la detección de un suceso
maligno en el tracto gastrointestinal y en la cavidad abdominal (en
el esófago, el estómago, el intestino delgado, el páncreas y el
intestino grueso).
El documento de solicitud de patente
internacional WO 97/09600 describe un procedimiento para el
aislamiento de células a partir de las heces, y para el análisis de
las proteínas contenidas en las células. Con este procedimiento es
posible solamente la detección de células epiteliales
gastrointestinales exfoliadas. Los tumores, que no entregan células
de ningún tipo, por ejemplo tumores sólidos, no pueden ser
reconocidos con un procedimiento de este tipo.
Las isoenzimas específicas para un órgano, que
permanecen durante el proceso de metastatización dentro de un tumor,
son excelentes indicadores acerca de la malignidad (marcadores de
tumores). Las isoenzimas del metabolismo de hidratos de carbono, en
particular las isoenzimas de la piruvato cinasa y sobre todo la
piruvato cinasa del tipo de tumor M2-PK, parecen ser
tales indicadores.
Las isoenzimas de la piruvato cinasa (PK)
(E.C.2.7.1.40) existen en cuatro subespecies: L, R, M1 y M2. Unas
investigaciones han mostrado que ciertos tumores malignos de origen
humano o animal expresan una especie especial de la piruvato cinasa
del tipo M2, la denominada tumor M2-PK, y
ciertamente de manera independiente de su procedencia (véase la cita
de Eigenbrodt y colaboradores, Critical Reviews in Oncogenesis, 3
(1,2)(1992) 91-115).
Todos los tumores investigados hasta ahora
contenían esta isoenzima especial. Al contrario que otras piruvato
cinasas, que se presentan predominantemente en una forma
tetramérica, la tumor M2-PK se presenta en una forma
dimérica o monomérica, y es fosforilada en serina y tirosina por una
cinasa codificada por un oncogén (véanse las citas de Eigenbrodt y
colaboradores, (1997) Anticancer Research,
17:3.153-3.156, Eigenbrodt y
colaboradores(1998), Anticancer Research 18:
3.267-3.274, Steinberg y colaboradores, (1999)
virchows Arch 434: 213-220).
La transformación de la forma tetramérica de la
isoenzima en la forma monomérica y/o dimérica parece constituir una
etapa esencial en la génesis de tumores. Esta isoenzima tumor
M2-PK especial es puesta en libertad por las células
tumorales y es detectable cuantitativamente en líquidos corporales.
La concentración de la isoenzima tumor M2-PK se
correlaciona con la malignidad de los tumores. Por lo tanto, la
tumor M2-PK se ha de considerar por tanto como un
marcador de tumores.
Ya se desarrollaron anticuerpos, que son
específicos para la tumor M2-PK y que no reaccionan
de modo cruzado con otras isoenzimas de la piruvato cinasa del tipo
L, R, M1 o M2 (M2 normal). Con ayuda de estos anticuerpos se pudo
desarrollar un inmunoensayo sensible, con el que se podía detectar
la tumor M2-PK en sueros o plasmas de pacientes con
tumores (véase la cita de Scheefers-Borchel y
colaboradores, (1994), Research-trends, R. Klapdor
(coordinador de edición), editorial W. Zuckschwerdt GmbH,
Munich).
Hasta ahora, esta detección cualitativa y
cuantitativa de la piruvato cinasa del tipo de tumor M2 (tumor
M2-PK) en un suero o plasma por medio de un ELISA,
tal como se describe, entre otros, en el documento de patente
europea EP-0.444.118.
Este ensayo manifiesta unas sensibilidades y
especificidades muy buenas en el caso de un gran número de
enfermedades tumorales (véanse las citas de Brinvk, U., Eigenbrodt,
E., Oehmke, M., Mazurek, S., Fischer, G. (1994) L- and
M2-pyruvate Kinase Expression in Renal Cell
Carcinomas and their Metastases ("Expresión de las piruvato
cinasas L y M2 en carcinomas de células renales y sus
metástasis", Virch Arch., 424: 177-185; Cerwenka,
H., Aigner, R., Bacher, H., Werkgartner, G.,
El-Shabrawi, A., Quehenberger, F. Mischinger, HJ.
(1999) TUM2-PK (Pyruvate Kinase Type Tumor M2),
CA19-9 and CEA in Patients with Benign, Malignant
and Metastasizing Pancreactic Lesions (TUM2-PK
(piruvato cinasa del tipo de tumor M2), CA19-9 y CEA
en pacientes con lesiones pancreáticas benignas, malignas y
metastatizantes), Anticancer Research 19: 858-852;
Eigenbrodt, E., Mazurek, S., Friis, R,R. (1988) Double role of
pyruvatkinase type M2 in the regulation of phosphometabolite pools
(El doble cometido de la piruvato cinasa del tipo M2 en la
regulación de agrupaciones de metabolitos de fósforo), Cell growth
and Oncogenesis [Crecimiento celular y oncogénesis] 15; Hugo, F.,
Fischer, G., Eigenbrodt, E. (1999) Quantitative Detection of Tumor
M2-PK in Serum and Plasma (Detección cuantitativa de
la tumor M2-PK en suero y plasma), Anticancer
Research (1999), 19: 2.753-2.758; Mazurek, S.,
Grimm, H., Wilker, S., Leib, S., Eigenbrodt, E. (1998) Metabolic
Characteristics of Different Malignant Cancer Cell Lines
(Características metabólicas de diferentes linajes de células de
cáncer maligno), Anticancer Research 18:
3.275-32.821; Oremek, G.M., Eigenbrodt, E., Rädle,
J., Zeuzem, St., Seiffert, U.B. (1997) Value of the Serum Levels of
the Tumor Marker TuM2-PK in Pancreatic Cancer (Valor
de los niveles en suero del marcador de tumores TuM2BPK en un cáncer
del páncreas), Anticancer Research, 17: 3.031-3.034;
Oremek, G.M., Teigelkamp, S., Kramer, W., Eigenbrodt, E., Usadel,
K.-H. (1999) The Pyruvate Kinase Isoenzyme Tumor M2 (tumor
M2-PK) as a Tumor Marker for Renal Carcinoma (La
isoenzima de la piruvato cinasa tumor M2 (tumor
M2-PK) como un marcador de tumores para carcinomas
renales), Anticancer Research (1999), 19:
2.599-2.602; Scheefers-Borchel, U.,
Scheefers, H., Michel, Will, A., Fischer, G., Basenau, D., Dahlmann,
N., Laumen, R., Mazurek, S., Eigenbrodt, E. (1994) Quantitative
determination (ELISA) of pyruvatkinase type tumor M2 (Detección
cuantitativa (por ELISA) de una piruvato cinasa del tipo de tumor
M2), en: Current Tumor Diagnosis, Applications, Clinical Relevance,
Research-trends, R. Klapdor (coordinador de
edición), editorial W. Zuckschwerdt GmbH, Munich; Wechsel, H.W.,
Petri, E., Feil, G., Bichler, K.-H. (1997) Tumor Specific Pyruvate
Kinase (tumor M2-PK): A potential marker for renal
cell carcinoma (RCC) 1 (Una piruvato cinasa específica para tumores
(tumor M2-PK): Un marcador potencial para el
carcinoma de células renales (RCC) 1), J Urology 157; 424; Wechsel,
H.W., Petri, E., Bichler, K.-H., Feil, G. (1999) Marker for Renal
Cell Carcinoma (RCC): The Dimeric Form of Pyruvate Kinase Type M2
(tumor M2-PK) (Marcadores para carcinomas de células
renales (RCC): La forma dimérica de la piruvato cinasa del tipo M2
(tumor M2-PK ), Anticancer Research (1999), 19:
2.583-2.590.
La definición y la clasificación de marcadores de
tumores se llevan a cabo de la siguiente manera:
Los marcadores de tumores son macromoléculas o
antígenos que se presentan en sangre, suero u otros líquidos
corporales, cuyas modificaciones de la concentración se encuentran
en una cierta relación con la génesis y el crecimiento de tumores
malignos de un individuo.
El "marcador ideal de tumores" debería tener
las siguientes propiedades:
- -
- una alta especificidad, es decir no ser detectable en el caso de enfermedades benignas y de personas sanas;
- -
- una alta sensibilidad, es decir que él se puede detectar en un alto porcentaje de los pacientes con tumores;
- -
- especificidad para ciertos órganos;
- -
- buena correlación con los estadios tumorales o bien con la masa tumoral;
- -
- buen poder expresivo acerca de la malignidad
- -
- relación con el pronóstico;
- -
- valores fiables de predicción.
Los criterios de la especificidad al 100% y de la
sensibilidad al 100% no son cumplidos hasta ahora por ninguno de los
conocidos marcadores de tumores.
Puesto que, no obstante, la tumor
M2-PK se puede detectar en el caso de todas las
enfermedades tumorales en el suero o en el plasma sanguíneo de
pacientes, no es posible realizar afirmaciones acerca del tipo y de
la localización del órgano o tejido afectado en el cuerpo del
paciente. Por lo demás, sería deseable poder detectar lo más
tempranamente que sea posible un suceso tumoral en el tracto
gastrointestinal, en particular en una fase de crecimiento, en la
que el tumor todavía no ha entrado en ningún contacto con el sistema
vascular del cuerpo (en la secuencia de pólipo a cáncer (del inglés
"Polyp-cancer-sequence"),
cronológicamente antes de la infiltración en la submucosa).
En el caso de existir una sospecha en cuanto a un
suceso neoplásico en el tracto gastrointestinal, en particular en
atención a la denominada secuencia de adenoma a carcinoma en el caso
de pólipos (Polyposis coli), según el estado de la técnica se
intenta, mediante diversos métodos de determinación, detectar sangre
oculta en las heces. Con este fin se utilizan ensayos no
inmunológicos (p.ej. de la actividad de pseudoperoxidasas, de la
detección de porfirinas) y ensayos inmunológicos.
Ambos principios de ensayo no son, sin embargo,
muy específicos, puesto que pueden ser perturbados por un gran
número de magnitudes influyentes (falsamente positivas / falsamente
negativas, p.ej. por no respetarse las prescripciones dietéticas,
que son imperiosamente necesarias, por parte del paciente, y por una
serie de medicamentos, así como por una administración excesiva de
vitamina C (p.ej. en verduras, zumos de frutas, etc., véase la cita
de Thomas, L., "Labor und Diagnose" (Laboratorio y
diagnóstico), 5ª edición, 1998).
Un ensayo positivo en cuanto a sangre oculta en
las heces se tiene que clarificar durante tanto tiempo hasta que se
haya localizado la fuente de una hemorragia o bien la causa original
de la hemorragia. El hallazgo clínico justifica en cualquier caso un
diagnóstico más profundo que se ha de llevar a cabo rápidamente,
p.ej. por endoscopia, sonografía, rayos X. Sin embargo, la presencia
de sangre en las heces no siempre se puede atribuir a un suceso
tumoral y, a la inversa, la ausencia de sangre en las heces no
significa con seguridad que no esté presente ningún tumor en el
intestino.
El invento tiene como objetivo, por consiguiente,
el de satisfacer la necesidad que sigue existiendo de un
procedimiento específico, que se pueda llevar a cabo fácilmente, de
tal manera que se pueda detectar especialmente temprano y de una
manera indudable un suceso neoplásico, sobre todo en atención a la
problemática de la denominada secuencia de adenoma a carcinoma en el
caso de pólipos (Polyposis coli), en el tracto
gastrointestinal.
El problema planteado por esta misión se resuelve
conforme al invento mediante un procedimiento para la detección
selectiva, cualitativa o/y cuantitativa de la isoenzima de la
piruvato cinasa del tipo de tumor M2 (tumor M2-PK),
que sirve como marcador de tumores, en las heces de seres humanos y
animales a fin de detectar un suceso maligno en el tracto
gastrointestinal, que está caracterizado porque se determina la
tumor M2-PK en una muestra de heces, de acuerdo con
el principio del inmunoensayo, con ayuda de por lo menos un
receptor, en particular de un anticuerpo, que fija específicamente a
la tumor M2-PK, y que no reacciona de modo cruzado
con ninguna otra isoenzima de la piruvato cinasa.
Se encontró, en efecto, que el contenido en
cuanto a la tumor M2-PK se puede detectar
directamente en las heces de pacientes con tumores, siendo el
contenido directamente proporcional al grado del suceso maligno en
el tracto gastrointestinal.
Esto resulta tanto más sorprendente, por cuanto
que extensas investigaciones en cuanto a otras proteínas específicas
en las heces no permitieron obtener indicaciones de ningún tipo
acerca de su utilización como marcadores de tumores.
Sorprendentemente, ni la estructura ni tampoco
las propiedades físico-químicas de la tumor
M2-PK son perjudicadas de una manera persistente por
la considerable actividad proteolítica y las extremas circunstancias
fisiológicas (p.ej. el valor del pH, ácido en el estómago, alcalino
en el intestino) del tracto gastrointestinal. Esto es válido también
para la detección de la tumor M2-PK por medio de
métodos inmunológicos.
Conforme al invento se puso de manifiesto, en
efecto, que a pesar de la desnaturalización y de la digestión de las
proteínas, que antes se describen, en el tracto gastrointestinal, se
puede llevar a cabo una detección específica de la tumor
M2-PK en las heces de pacientes con tumores. Hasta
ahora, la tumor M2-PK se determinaba
cuantitativamente de una manera exclusiva en muestras naturales, no
digeridas, de pacientes (líquidos corporales, sueros, plasmas
sanguíneos), y esta determinación se empleaba en el diagnóstico
clínico de tumores para un gran número de enfermedades
tumorales.
Sorprendentemente, se comprobó por fin, no
obstante, que la tumor M2-PK sigue siendo
detectable cuantitativamente también en el caso de muestras de heces
homogeneizadas intensamente, almacenadas durante un largo período de
tiempo (p.ej. en el caso de la expedición de muestras). También en
el caso de una fuerte dilución de las heces se obtiene una
manifiesta reacción.
Sorprendentemente, se comprobó, además, que la
detección se efectúa selectivamente en la muestra de heces también
sin una extracción previa. Preferiblemente, sin embargo, se ha de
utilizar un procedimiento de extracción mediando utilización
preferente de un detergente especial (CHAPS) (el procedimiento de
extracción se describe más detalladamente en el Ejemplo 2).
En una forma de realización preferida del
invento, se utiliza como anticuerpo un anticuerpo monoclonal, que es
obtenible a partir del linaje de células de hibridoma Klon 1
(depositado en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (Colección
Alemana de Microorganismos) bajo el número DSM ACC 2155), o sino un
anticuerpo, que tiene la misma especificidad y la misma
selectividad. Tales anticuerpos se pueden producir por ejemplo tal
como se ha descrito en el documento EP-0.444.118. No
obstante, la producción no es crítica, puesto que son bien conocidos
para un experto en la materia procedimientos para la producción de
anticuerpos monoclonales específicos. Para esto, se utiliza el
antígeno, en el presente caso, por lo tanto, la tumor
M2-PK en una forma purificada de una manera usual (o
fragmentos parciales de la misma) para la producción de anticuerpos.
En principio se puede aplicar para esto el procedimiento, que fue
descrito por primera vez por Köhler y Milstein, siendo conocidos
también para un experto en la materia modificaciones y desarrollos
ulteriores de estos procedimientos. La producción no es crítica,
siempre y cuando que se obtengan anticuerpos específicos, lo cual se
puede comprobar mediante selección. La selección se efectúa en
cuanto a anticuerpos, que fijan específicamente a la tumor
M2-PK, pero no a una de las otras isoenzimas de la
piruvato cinasa, ni tampoco a la forma no tumoral de
M2-PK.
En el procedimiento conforme al invento se llevan
a cabo de manera preferida las siguientes etapas:
(a) se pone en contacto la muestra con por lo
menos dos receptores diferentes, de los cuales el primer receptor R1
se presenta en una fase sólida y es capaz de fijarse con la tumor
M2-PK, y el segundo receptor R2 se presenta en una
fase líquida, y es asimismo capaz de fijarse con la tumor
M2-PK, llevando el receptor R2 una marcación o
mediando en la fijación a una molécula detectable;
(b) se separa la fase sólida con respecto de la
fase líquida;
(c) se determina la marcación o la molécula
detectable en la fase sólida según métodos en sí conocidos, y se
cuantifica correspondientemente la cantidad de la tumor
M2-PK que está presente en la muestra, utilizándose
conforme al invento, como por lo menos uno de los receptores 1 ó 2,
un anticuerpo, que es capaz de fijarse específicamente con la tumor
M2-PK, y que la discrimina entre otras isoenzimas de
la piruvato cinasa, es decir que no fija a ninguna de las otras
isoenzimas y tampoco a la forma no tumoral de
M2-PK.
A pesar de que, evidentemente, también es posible
utilizar dos anticuerpos, ambos de los cuales son capaces de fijarse
específicamente con la tumor M2-PK de acuerdo con la
definición anterior, para el segundo de los receptores 1 ó 2 es
suficiente, por regla general, utilizar un anticuerpo que no sea tan
específico. En el caso, de que como receptor R1 ya se hubiera
utilizado un anticuerpo que sea capaz de fijarse específicamente
sólo con la tumor M2-PK, después de una separación
de la fase líquida, solamente la tumor M2-PK se
presenta fijada a este receptor. El receptor de detección R2, por lo
tanto, únicamente tiene que ser capaz de fijarse con la tumor
M2-PK, pero no tiene que permitir indispensablemente
una discriminación entre isoenzimas de la PK.
En el caso, en el que como receptor R1 se emplee
un anticuerpo menos específico, se utiliza un receptor R2, que es
capaz de fijarse específicamente sólo con la tumor
M2-PK, de tal manera que resulta una señal
detectable solamente en el caso de estar presente la tumor
M2-PK.
Tal como ya se ha citado más arriba, no obstante,
se pueden emplear también dos anticuerpos que sean capaces de
fijarse específicamente sólo con la tumor M2-PK,
para alcanzar si cabe una especificidad todavía más alta.
En una forma de realización preferida del
procedimiento conforme al invento, se utiliza como receptor R1 un
anticuerpo capaz de fijarse específicamente con la tumor
M2-PK y que la discrimina entre otras isoenzimas de
la piruvato cinasa.
En otra forma preferida de realización, se
utiliza como receptor R2 un anticuerpo, que por sí mismo lleva una
marcación. De esta manera es posible una detección directa todavía
con más rapidez que en el caso en el que una molécula detectable
está fijada al receptor R2. Otra forma preferida adicional de
realización del invento es un procedimiento, en el que como receptor
R2 se utiliza un anticuerpo fijado a una enzima, y el procedimiento
se lleva a cabo como un ensayo de inmuno sorbente fijado a una
enzima ((ELISA) del inglés "Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay").
Para la realización del procedimiento conforme al
invento, se adecua p.ej. un estuche de ensayo destinado al
diagnóstico de un suceso tumoral maligno en el tracto
gastrointestinal y en particular en los intestinos, que contiene por
lo menos un receptor para la tumor M2-PK, que no
reacciona de modo cruzado con ninguna otra isoenzima de la piruvato
cinasa, así como eventualmente otros reactivos que son necesarios
para la realización de un monoensayo.
El estuche de ensayo está equipado en particular
para la realización del procedimiento conforme al invento. Por lo
tanto, el estuche de ensayo contiene de manera preferida un segundo
receptor R2, que lleva una marcación o que media en la fijación a
una molécula detectable.
Preferiblemente, un anticuerpo que se fija
específicamente a la tumor M2-PK se inmoviliza por
medio de procedimientos conocidos junto a una fase sólida. Esta fase
sólida es, en una realización preferida del invento, asimismo un
componente del estuche de ensayo. La muestra que se ha de investigar
se pone luego en contacto con la proteína, que preferiblemente está
disuelta, y se fija a la fase sólida en un sistema tamponador
apropiado por medio del anticuerpo. Después de haber lavado el
complejo, inmovilizado así obtenido, de anticuerpo y tumor
M2-PK, se añade luego un segundo anticuerpo
adicional marcado, p.ej. provisto de biotina, que se fija a otro
epítopo de la tumor M2-PK. Luego se determina la
marcación, p.ej. con ayuda de estreptavidina - peroxidasa. La
cantidad de marcador fijado es directamente proporcional a la
cantidad de la tumor M2-PK en la muestra.
Convenientemente, el estuche de ensayo contiene un material de
referencia con un contenido conocido de tumor M2-PK,
para la determinación cuantitativa.
Por supuesto que se pueden emplear conforme al
invento todos los otros tipos de procedimientos inmunológicos de
detección, que se llevan a cabo con ayuda de anticuerpos.
Precisamente también para la formulación real como estuche de
ensayo, un experto en la materia conoce muchas alternativas, que son
apropiadas, en principio, en su totalidad para la realización del
procedimiento conforme al invento. Así, por ejemplo, también se
puede concebir un sistema de ensayo en forma de una tira de ensayo,
sobre la que los anticuerpos requeridos están dispuestos en
diferentes zonas de la tira de ensayo, o bien en una forma disuelta
o bien fijados a una fase sólida. La muestra o bien la porción de
líquido de la muestra, o un extracto, pueden luego migrar a través
de la tira de ensayo y proporcionar una señal junto al sitio de
detección, cuando la tumor M2-PK está presente en la
muestra. La disposición exacta de los componentes individuales en la
tira de ensayo es dependiente del procedimiento inmunológico
aplicado y es fácilmente realizable por un experto en la
materia.
Dentro del marco del presente invento, la
expresión "receptor" o bien "anticuerpo" debe de abarcar
también las partes o los fragmentos de receptores o respectivamente
anticuerpos, que todavía median en la fijación necesaria a la tumor
M2-PK. En este caso, también es posible emplear, en
lugar de un anticuerpo individual, un conjugado de dos anticuerpos.
Por ejemplo, se puede concebir el hecho de utilizar como receptor R2
un anticuerpo capaz de fijarse con la tumor M2-PK y
llevar a cabo la detección a través de un anticuerpo marcado
adicional, que está dirigido contra la parte Fc del receptor 2 y que
lleva una marcación o que, por su parte, está acoplado con una
molécula detectable. Esta fijación de un conjugado de dos
anticuerpos se ha de abarcar conjuntamente en el marco del presente
invento, cuando R2 esté definido de tal manera que medie en la
fijación a una molécula detectable. Algo análogo es válido para la
fijación del receptor R1 a la fase sólida. También esta fijación se
puede efectuar a través de anticuerpos acoplados a través de fases
sólidas, a los que se fija la parte Fc del receptor 1.
Son concebibles muchas otras ejecuciones
adicionales del invento y pueden ser llevadas a cabo sin problemas
por un experto en la materia. Estas ejecuciones son, por lo tanto,
abarcadas conjuntamente en el marco del presente invento, siempre y
cuando que ellas hagan posible la detección de la tumor
M2-PK en una muestra de heces.
En formas de realización especialmente preferidas
del invento, el estuche de ensayo contiene, como uno de los
receptores, el anticuerpo monoclonal, que se puede obtener a partir
del linaje de células de hibridoma Klon 1 (DSM ACC 2155). En otra
forma preferida de realización, se utiliza un anticuerpo específico
para la tumor M2-PK, fijado a la fase sólida, que no
reacciona de modo cruzado con otras isoenzimas ni con la PK M2 no
tumoral.
De manera preferida, el receptor R2 soluble es un
anticuerpo marcado.
Conforme al invento, también es posible
determinar la concentración de un analito por medio de biosensores,
tales como p.ej. sensores amperométricos, sensores potenciométricos,
potenciométricos selectivos para iones o fotométricos, o también los
que trabajan mediante electrodos semiconductores tales como
transistores de efecto de campo (FET), transistores de efecto de
campo quimiosensibles (CHEMFET), transistores de efecto de campo con
puerta suspendida (SGFET) o transistores de efecto de campo
sensibles para iones. Tales biosensores se se describen de una
manera compendiada en la obra de E.A.H. Hall y G. Hummel
"Biosensoren" (Biosensores), Editorial Springer Heidelberg,
Alemania, 1995. Otros desarrollos de transistores de efecto de campo
sensibles para iones (ISFET) o de detectores ópticos han sido
descritos, entre otros autores, por F. Aberl y H. Wolf en
"Aktuelle Trends in der Immunsensorik" (Tendencias actuales en
la ciencia inmunosensorial), Labor 2000, páginas
70-96 (1993). Asimismo, el procedimiento conforme al
invento es apropiado para la realización mediante cuarzos
vibratorios piezoeléctricos y elementos de ondas superficiales, que
se pueden utilizar como microbásculas. En este caso, el anticuerpo
primario (el denominado "catcher" (capturador)) se inmoviliza
sobre un substrato piezoeléctrico y, después de haberse fijado con
la tumor M2-PK que se ha de analizar, se mide una
modificación de la frecuencia de oscilación del cuarzo. Tales
sensores se describen, por ejemplo, por A. Leidl y colaboradores en
"Proceedings of the Second International Symposium on Miniaturized
Total Analyses Systems \muTAS" [Actas del Segundo Simposio
Internacional acerca de Sistemas de análisis totales miniaturizados
\muTAS], Basilea 1996. Las microbásculas de cristales de cuarzo,
tal como han sido descritas por C. Köslinger y colaboradores,
Fresenius J. Anal. Chem (1994), 349: 349-354, se han
acreditado como especialmente apropiadas.
Se pueden conseguir unos mejoramientos
significativos de los inmunoensayos en lo que se refiere a la
sensibilidad, la cinética de los ensayos y otros puntos, tales como
la flexibilidad de alcance dinámico y de formato (del inglés
"dynamic range and format flexibility"), mediante aplicación de
la electroquimioluminiscencia. La
electroquimio-luminiscencia es el proceso, mediante
el cual se genera luz cuando se aplica una pequeña tensión a un
electrodo, con lo que se desencadena una reacción redox cíclica en
un ion metálico de rutenio (véase la cita de Bruno, G. (1997),
Rec.Rp páginas 175-179; Williams R. (1996), Amer.
Biotech., página 26).
Los anticuerpos que se han de utilizar conforme
al invento, son obtenibles de una manera en sí conocida, tal como se
ha descrito antes. De manera preferida, se aísla primeramente la
tumor M2-PK, p.ej. desde tumores de intestino grueso
(por utilización de la cromatografía en presencia de DEAE Sephadex
A-50 y de la subsiguiente cromatografía de afinidad
en presencia de Sepharose CL 6B azul), tal como se ha descrito por
K. Scheiner-Bobis (tesis doctoral en la Universidad
de Justus Liebig en GieBen, presentada el 8 de noviembre de 1988).
Después de esto, un animal de experimentación se inmuniza con la
tumor M2-PK así obtenida, o con fragmentos de ésta,
que tienen el correspondiente epítopo, y se aíslan los anticuerpos
formados. Tales fragmentos, que se utilizan para la inmunización,
pueden proceder p.ej. de una digestión con proteasas de la tumor
M2-PK purificada, o pueden consistir en péptidos
parciales sintéticos de la misma. La preparación de tales péptidos
parciales es de por sí conocida para un experto en la materia. En
este caso, a partir de la secuencia, p.ej. con ayuda de programas de
ordenador, se escogen secuencias que pueden contener los epítopos
correspondientes.
Estas secuencias se ensayan luego en cuanto a su
aptitud de utilización para la producción de anticuerpos
específicos.
De manera preferida, se utilizan anticuerpos
monoclonales obtenibles según el método de Köhler, Milstein (Nature
256, 495-497 (1975)). En este caso por ejemplo
ratones BALB/C se inmunizan con una tumor M2-PK
aislada y las células esplénicas (de bazo) de estos animales se
fusionan con un linaje de células de mieloma, por ejemplo, el PA 1.
Los anticuerpos segregados en la ascitis se ensayan en cuanto a su
especificidad, por ejemplo en un ensayo ELISA o RIA, y se aíslan.
Usualmente, los anticuerpos obtenidos de esta manera pertenecen a la
clase de IgG1.
El invento es ilustrado adicionalmente mediante
los siguientes Ejemplos:
Un tubito no recuperable que contiene
aproximadamente 12 ml y un asa de inoculación microbiológica (p.ej.
de Sarstedt) se equilibran a 0 con una báscula de laboratorio
digital sensible. A continuación, se pesan las heces con el asa de
inoculación, pinchando con el asa en la muestra de heces, y la
cantidad de heces que queda en la punta (aproximadamente 100 mg) se
introduce en el tubito no recuperable. En lugar del asa de
inoculación se puede utilizar también un palillo mondadientes.
Correspondientemente a la masa pesada de la
muestra de heces, se hacen variar los volúmenes del tampón de
extracción que se ha de añadir (p.ej. 100 mg de heces + 10 ml de
tampón o 75 mg de heces + 7,5 ml de tampón). Concentración final: 10
mg de heces / ml de tampón de extracción.
La suspensión de las muestras de heces se mezcla
enérgicamente a la temperatura ambiente varias veces con ayuda de un
aparato sacudidor de tubos de ensayo (p.ej. VORTEX). Las heces deben
de estar bien homogeneizadas. A fin de garantizar una extracción
total, es importante añadir al tampón de extracción tamponado con
fosfato el detergente CHAPS
(3-[(3-colamido-propil)dimetilamonio)-1-propano-sulfonato,
10 mM (de Sigma).
Una placa para ELISA se reviste con un anticuerpo
monoclonal, que reconoce solamente a la tumor M2-PK.
La tumor M2-PK procedente de muestras de EDTA -
plasma y de patrones se fija a estos anticuerpos, y de esta manera
es fijada a la placa. Un segundo anticuerpo monoclonal, que está
biotinilado, se fija en la siguiente etapa de incubación a la tumor
M2-PK. Seguidamente, un conjugado de POD
(peroxidasa) y estreptavidina se fija a la unidad de biotina del
anticuerpo. La peroxidasa oxida a la ABTS (sal de diamonio de ácido
2,2'-azino-bis-(4-etil-benzotiazolina-6-sulfónico))
mediando formación de un color verde oscuro. Finalmente, se
determina fotométricamente la concentración de ABTS oxidada.
Claims (7)
1. Procedimiento para la detección selectiva,
cualitativa o/y cuantitativa de la isoenzima de la piruvato cinasa
del tipo de tumor M2 (tumor M2-PK), que sirve como
marcador de tumores, en las heces de seres humanos y animales para
la detección de un suceso maligno en el tracto gastrointestinal,
caracterizado porque
se determina la tumor M2-PK en
una muestra de heces, según el principio del inmunoensayo, con ayuda
de por lo menos un receptor, que no reacciona de modo cruzado con
ninguna otra isoenzima de la piruvato cinasa.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, para la detección selectiva, cualitativa o/y cuantitativa de la
isoenzima de la piruvato cinasa del tipo de tumor M2 (tumor
M2-PK), que sirve como marcador de tumores, en las
heces de seres humanos y animales para la detección de un suceso
maligno en el tracto gastrointestinal,
caracterizado porque
se determina la tumor M2-PK en
una muestra de heces, según el principio del inmunoensayo, con ayuda
de por lo menos un anticuerpo, que fija específicamente a la tumor
M2-PK, y que no reacciona de modo cruzado con
ninguna otra isoenzima de la piruvato cinasa.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2,
caracterizado porque
como anticuerpo se utiliza un anticuerpo
monoclonal, que es obtenible a partir del linaje de células de
hibridoma Klon 1 (nº de DSM ACC 2155), o un anticuerpo con la misma
especificidad y la misma selectividad.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2 ó 3,
caracterizado porque
a) se pone en contacto la muestra con por lo
menos dos receptores diferentes, de los cuales el primer receptor R1
se presenta en una fase sólida y es capaz de fijarse con la tumor
M2-PK, y el segundo receptor R2 se presenta en una
fase líquida y asimismo es capaz de fijarse con la tumor
M2-PK, y llevando el receptor R2 una marcación o
mediando en la fijación a una molécula detectable,
b) se separa la fase sólida con respecto de la
fase líquida,
c) se determina la marcación o la molécula
detectable en la fase sólida y se cuantifica
correspondientemente a la cantidad de la tumor
M2-PK presente en la muestra, utilizándose como por
lo menos uno de los receptores 1 ó 2 un anticuerpo, que es capaz de
fijarse específicamente con la tumor M2-PK y que la
discrimina entre otras isoenzimas de la piruvato cinasa.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4,
caracterizado porque
como receptor 1 se emplea el anticuerpo que es
capaz de fijarse específicamente con la tumor M2-PK
y que la discrimina entre otras isoenzimas de la piruvato
cinasa.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
como receptor 2 se utiliza un anticuerpo que
lleva una marcación.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque
como receptor 2 se utiliza un anticuerpo fijado a
una enzima, y el procedimiento se lleva a cabo como un ELISA.
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