ES2327063T3 - Determinacion de srl-alcohol deshidrogenasa de cadena corta (dhrs4) como biomarcador para inflamaciones e infecciones. - Google Patents
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Abstract
Uso de SRL-alcohol deshidrogenasa de cadena corta (DHRS4) con la secuencia de aminoácidos según la ID SEC Nº:1 como biomarcador humoral para la detección diagnóstica y para la prognosis evolutiva así como para el control evolutivo y terapéutico de inflamaciones e infecciones.
Description
Determinación de SRL-alcohol
deshidrogenasa de cadena corta (DHRS4) como biomarcador para
inflamaciones e infecciones.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la detección diagnóstica y para la prognosis
evolutiva así como para el control evolutivo y terapéutico de
inflamaciones e infecciones en los cuales se determina un
biomarcador de nuevo tipo para las indicaciones indicadas. La
invención se refiere en particular a procedimientos de la clase
mencionada en los cuales las inflamaciones e infecciones
diagnosticadas son parte de la compleja evolución de una morbilidad
séptica (inflamaciones sistémicas de etiología infecciosa;
sepsis).
En la siguiente descripción, conceptos tales
como "diagnosis" o "diagnóstico(a)" se usan
fundamentalmente como conceptos generales simplificativos que,
cuando no se desprenda otra cosa del contexto, se entenderá que
incluyen también la diagnosis diferencial más especializada y las
aplicaciones para la prognosis/prognosis anticipada y el control
evolutivo y terapéutico de las afecciones sobre las que se
trate.
La presente invención tiene su punto de partida
en los intensivos trabajos de investigación de la solicitante en
relación con adicionales perfeccionamientos de la diagnosis y la
terapia de la sepsis.
Entre la sepsis y las inflamaciones existe en el
plano científico una relación objetiva y definitoria. Se designan
como inflamaciones (reacciones inflamatorias) por completo en
general determinadas reacciones fisiológicas de protección de un
organismo a ataques externos de distintas clases, como p. ej.
lesiones, quemaduras, alergenos, infecciones por microorganismos
tales como bacterias y hongos y virus, a tejidos foráneos que
provocan reacciones de rechazo, o a determinados estados
inflamatorios endógenos del cuerpo, p. ej. en el caso de las
afecciones autoinmunes y del
cáncer.
cáncer.
Cuando las inflamaciones son parte de una
reacción mal encaminada del cuerpo a determinados procesos
endógenos, tal como p. ej. sucede en el caso de las afecciones
autoinmunes, y/o son de naturaleza crónica, o cuando las mismas
alcanzan proporciones sistémicas, como sucede en el caso del
síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (Systemic Inflammatory
Response Syndrome, SIRS) o como sucede en el caso de una sepsis
severa debida a causas infecciosas, las inflamaciones pueden
devenir auténticas morbilidades que cuando los procesos fisiológicos
típicos de las reacciones inflamatorias quedan fuera de control,
como sucede en el caso del SIRS y de la sepsis, pueden incluso
llegar a constituir una aguda amenaza para la vida.
En las inflamaciones sistémicas como las que se
dan en el caso de una sepsis o del shock séptico, las cascadas de
reacciones inflamatorio-específicas se propagan de
manera incontrolada a todo el cuerpo y llegan además a constituir
una amenaza para la vida, en el sentido de una excesiva respuesta
inmune. Con respecto a los conocimientos actuales acerca de la
aparición de distintos grupos de sustancias endógenas
inflamatorio-específicas y del posible papel
desempeñado por las mismas se hace por ejemplo referencia a A.
Beishuizen et al., "Endogenous Mediators in Sepsis and
Septic Shock", Advances in Clinical Chemistry, Vol. 33, 1999,
55-131, y a C. Gabay et al., "Acute Phase
Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation", The New
England Journal of Medicine, Vol. 340, Nº 6, 1999,
448-454. Puesto que la comprensión de la sepsis, y
con la misma también las definiciones reconocidas, han ido
cambiando y afinándose en los últimos años, se hace además
referencia a K. Reinhart et al., "Sepsis und septischer
Schock", en: Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. New
York, 2001, 756-760, donde se da una definición
moderna del concepto de la sepsis, así como en particular también a
Mitchell M. Levy et al., "2001 SCCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS
International Sepsis Definition Conference", en: Crit Care Med
2003, Vol. 31, Nº 4, 1250-1256. Con respecto al
significado del cuadro morboso de la "sepsis severa" se hace
además referencia a Niels C. Riedemann et al., The enigma of
sepsis, J. Clin. Invest. 112:460-467 (2003). Se
encuentra también en
http://www.talessin.de/scripte/medizin/sepsis1.html. un resumen más
reciente de los criterios y definiciones para una sepsis y los
cuadros morbosos estrechamente emparentados con la misma. Dentro
del marco de la presente solicitud, el concepto de la "sepsis"
se usa en un sentido amplio que engloba en particular a la sepsis,
a la sepsis severa y al shock séptico, de acuerdo con las
definiciones que pueden sacarse de las publicaciones mencionadas,
para cuadros morbosos sépticos de pacientes gravemente enfermos en
estaciones de cuidados intensivos.
Mientras que al menos en el ámbito europeo la
infección bacteriana sistémica detectable mediante un hemocultivo
positivo acuñó durante mucho tiempo el concepto de la sepsis, hoy en
día la sepsis se entiende en primera línea como inflamación
sistémica que tiene causas infecciosas, pero que como morbilidad
presenta grandes similitudes con inflamaciones sistémicas que son
provocadas por otras causas.
Con la mencionada transformación de la
comprensión de la sepsis están en correspondencia modificaciones de
los planteamientos diagnósticos. Así, la determinación directa de
agentes causales bacterianos fue sustituida o complementada por
complejas supervisiones de parámetros de laboratorio y parámetros
hemodinámicos usando los llamados sistemas Score asistidos por
ordenador (como p. ej. el APACHE II SCORE; significando APACHE
"Acute Physiology and Chronic Health Evaluation"; véase G.
Pilz et al., Krankenpflege-Journal 29 (1991),
pp. 483-492 o la introducción de la patente DE 42
27 454 C1), así como más recientemente en particular también por la
detección de determinadas sustancias endógenas que participan en la
aparición de sepsis o en la aparición de inflamación, es decir, de
"biomarcadores" específicos.
De entre el gran número de mediadores y
proteínas de fase aguda son en particular adecuados con finalidades
diagnósticas aquéllos cuya aparición es muy específica de la sepsis
o de determinadas fases de una sepsis, cuyas concentraciones varían
drástica y significativamente desde el punto de vista diagnóstico, y
que además presentan, en particular también ex vivo, las
estabilidades necesarias para las determinaciones rutinarias y
alcanzan altos valores de concentración. A efectos diagnósticos está
en primer plano la fiable correlación de la morbilidad (sepsis) con
el respectivo biomarcador, sin que tenga siempre que ser conocido en
detalle el papel desempeñado por el mismo en la compleja cascada de
las sustancias endógenas que participan en la aparición de la
sepsis. Hay sin embargo un creciente interés en determinar nuevos
biomarcadores particulares que en el sentido de una
"estratificación" permitan (también) efectuar una asignación de
los pacientes de sepsis a grupos con causas de enfermedad
emparentadas o a una similar y previsible evolución de la
enfermedad, para que de entre las del espectro de las posibles
medidas terapéuticas puedan aplicarse las más adecuadas. Puede
hacerse complementariamente a este respecto referencia a John C.
Marshall et al., Crit Care Med 2003, Vol 31, Nº 5,
1560-1567.
Una sustancia endógena establecida y
particularmente adecuada como biomarcador de la sepsis es la
procalcitonina (PCT). La procalcitonina es un prohormona cuyas
concentraciones en suero bajo las condiciones de una inflamación
sistémica de etiología infecciosa (sepsis) alcanzan valores muy
altos, mientras que prácticamente no es detectable en los sujetos
sanos. Además, en un estadio relativamente temprano de una sepsis se
alcanzan altos valores de procalcitonina, con lo cual la
determinación de procalcitonina es también adecuada para la
detección temprana de una sepsis y para establecer una temprana
distinción entre una sepsis de etiología infecciosa e inflamaciones
severas debidas a otras causas. La determinación de procalcitonina
como marcador de sepsis es objeto de la publicación de M. Assicot
et al., "High serum procalcitonin concentrations in
patients with sepsis and infection", The Lancet, vol. 341, Nº
8844, 1993, 515-518, y de las patentes DE 42 27 454
C2 y EP 0 656 121 B1 y US 5.639.617. Como complemento de la
presente descripción se hace explícitamente referencia a las
patentes mencionadas y a las anteriores referencias de la
literatura que se enumeran en la publicación mencionada.
Una discusión actual del uso de biomarcadores,
incluyendo el uso del biomarcador PTC, dentro del marco de la
diagnosis de la sepsis se encuentra también en el estudio de Shawn
D. Carrigan et al., "Toward Resolving the Challenges of
Sepsis Diagnosis" en: Clinical Chemistry 50:8, agosto 2004,
1301-14.
La disponibilidad del marcador de sepsis
procalcitonina ha dado fuertes impulsos a la investigación de la
sepsis, y en la actualidad se hacen intensivos esfuerzos para
encontrar adicionales biomarcadores que puedan complementar la
determinación de procalcitonina y/o puedan proporcionar adicionales
informaciones a efectos de diagnosis fina o de diagnosis
diferencial o de estratificación.
La búsqueda de potenciales nuevos biomarcadores
de sepsis se ve ciertamente dificultada por el hecho de que a
menudo se sabe aún muy poco o nada sobre la función exacta o sobre
los motivos exactos para la aparición de determinadas sustancias
endógenas que participan en la aparición de sepsis.
Primeros resultados de la verificación
experimental de un fructífero planteamiento puramente hipotético
para la determinación de adicionales potenciales marcadores de
sepsis se encuentran en los documentos DE 198 47 690 A1 y WO
00/22439 de la solicitante. Ahí se demuestra que en la sepsis no tan
sólo está incrementada la concentración de prohormona
procalcitonina, sino que pueden observarse concentraciones
significativamente incrementadas también para otras sustancias que
pueden contarse entre las prohormonas peptídicas o representan
fragmentos de tales prohormonas y presentan una inmunorreactividad
típica de tales prohormonas.
La presente solicitud es el resultado de otro
fructífero planteamiento puramente experimental para la búsqueda de
adicionales biomoléculas específicas de la sepsis. Este
planteamiento se basa en que mediante la administración de una
endotoxina o bien mediante infección con bacterias se provoca en
primates (babuinos) un estado morboso que puede ser designado como
sepsis artificial, y luego y mediante la comparación de los
patrones de manchas de proteína de electroforesis en gel de babuinos
tratados con endotoxina y no tratados se determinan sustancias
endógenas de naturaleza peptídica o proteínica que se encuentran
solamente en los babuinos "sépticos" y que por consiguiente
representan potenciales biomarcadores específicos de sepsis. El
modelo de primates fue elegido debido a la gran similitud de la
fisiología de los primates y los humanos y a la alta reactividad
cruzada con muchos reactivos terapéuticos y diagnósticos
humanos.
Como se expone más exactamente en la parte
experimental de anteriores solicitudes de patente de la
solicitante, tras haber provocado experimentalmente una sepsis
artificial en babuinos mediante administración de endotoxina (LPS
de Salmonella Typhimurium) y reacondicionamiento
electroforético en gel bidimensional de tejidos de los animales
tratados se encuentra una cantidad de manchas de proteína
identificables tan sólo en los animales tratados. Los productos
proteínicos correspondientes a las manchas se aíslan del gel de
electroforesis y se analizan por espectrometría de masas (ante todo
mediante espectrometría de masas en tándem).
Según el procedimiento mencionado y como se
describió por primera vez en anteriores solicitudes de patente
alemana y europea de la solicitante, además de marcadores de sepsis
sobre los que ya se ha tratado en la literatura se identificaron
como marcadores de sepsis de nuevos tipos entre otros las proteínas
"inflamina" (WO 02/085937), CHP (WO 03/005035), fragmentos de
citoqueratina-1 solubles (sCY1F; WO 03/002600) y la
proteína LASP-1 (WO 03/089934), así como en enzimas
tales como aldosa-1-epimerasa
(mutarotasa; WO 03/048780),
glicina-N-aciltransferasa (GNAT; WO
03/048781) y carbamoilfosfato sintetasa 1 soluble (CPS 1; WO
03/089933). Está publicada en J. Struck et al.,
Immuno-analyse & biologie spécialisée 19 (2004)
131-137 una discusión del procedimiento de análisis
proteómico empleado y de los resultados que se obtuvieron para un
marcador de sepsis establecido recurriendo al procedimiento, que
está en forma de un fragmento de la región central del precursor de
la hormona ANP (péptido atrial natriurético).
Al haberse hecho explícitamente referencia a
estas solicitudes y publicaciones, debe considerarse que queda
incorporado a la exposición de la presente solicitud el contenido de
las anteriores solicitudes mencionadas de la solicitante y de las
correspondientes publicaciones mencionadas.
La presente invención se basa en que en una
investigación de la clase anteriormente descrita usando extractos
hepáticos de babuinos fue aislada una sustancia que se presenta
solamente en los extractos de los babuinos tratados con LPS pero
está ausente en el caso de los babuinos sanos, habiendo podido ser
dicha sustancia identificada como SRL-alcohol
deshidrogenasa (SCAD-SRL o DHRS4), como se aclara
más detalladamente en la parte experimental.
Según ello, la presente invención se refiere
según la reivindicación 1 en el sentido más amplio al uso de
SRL-alcohol deshidrogenasa de cadena corta (DHRS4)
como biomarcador humoral para la detección diagnóstica y para la
prognosis evolutiva así como para el control evolutivo y terapéutico
de inflamaciones e infecciones, y en particular de aquéllas que son
parte de la compleja evolución de una morbilidad séptica.
Está descrito en la reivindicación 2 el uso
diagnóstico preferido para la diagnosis de la sepsis ex
vivo.
Las reivindicaciones 3 a 10 se refieren a
procedimientos preferidos para la diagnosis de la sepsis y a sus
configuraciones preferidas.
Como se describe más detalladamente en la parte
experimental, en las investigaciones de la solicitante fue
identificada una sustancia peptídica que pudo ser identificada como
SRL-alcohol deshidrogenasa de cadena corta
(DHRS4).
La DHRS4 ("miembro 4 (de la familia SDR) de
las deshidrogenasas/reductasas", sinónimos:
SCAD-SRL ("alcohol deshidrogenasa de cadena corta
con la secuencia SRL C-terminal"), alcohol
deshidrogenasa peroxisomal de cadena corta, entre otras) pertenece a
una gran familia de oxidorreductasas NAD- o
NADP-dependientes (familia de
deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR)) (1)
(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/getacc?PF00106).
Estas enzimas comprenden aproximadamente de 250 a 300 aminoácidos y
están en la mayoría de los casos en forma de homodi- o -tetrámeros.
Las SDRs típicamente contienen dos dominios: uno que fija la
coenzima (NAD- o NADP), y otro que fija el sustrato, determina la
especificidad de sustrato e interviene en la catálisis. No está
documentada experimentalmente la especificidad de sustrato de la
DHRS4 que aquí interesa. Debido a la similitud secuencial se presume
sin embargo que la DHRS4 reduce el
todo-trans-retinal y el
9-cis-retinal. Podrían ser otros
sustratos alquilfenilcetona y compuestos
alfa-dicarbonílicos con anillos aromáticos (tales
como pirimidin-4-aldehído,
3-benzoilpiridina,
4-benzoilpiridina, menadiona y
4-hexanoilpiridina)
(http://us-expasy.org/,cgibin/niceprot.pl?q9nv08).
La DHRS4 es codificada por un gen en el
cromosoma 14
(http://genecards.bcgsc.bc.ca/cgi-bin/carddisp?
DHRS4&search=dhrs4&suff=txt). La secuencia de aminoácidos de la DHRS4 se ha sacado de la correspondiente secuencia de cDNA. En la literatura hay distintas interpretaciones con respecto a la zona N-terminal de la proteína. Así indican por ejemplo Clark et al. la secuencia que comprende 278 aminoácidos según la ID SEC Nº:1 (2). Otros autores ven el comienzo de la proteína a partir de la metionina en la posición 18 de la secuencia según la ID SEC Nº:1 (3).
DHRS4&search=dhrs4&suff=txt). La secuencia de aminoácidos de la DHRS4 se ha sacado de la correspondiente secuencia de cDNA. En la literatura hay distintas interpretaciones con respecto a la zona N-terminal de la proteína. Así indican por ejemplo Clark et al. la secuencia que comprende 278 aminoácidos según la ID SEC Nº:1 (2). Otros autores ven el comienzo de la proteína a partir de la metionina en la posición 18 de la secuencia según la ID SEC Nº:1 (3).
Si se parte de la base de la variante más larga,
en el extremo N-terminal puede identificarse una
secuencia señal que podría señalizar la secreción de la proteína
(2). Los resultados de Fransen et al. más bien sugieren una
localización peroxisomal que es señalizada por el tripéptido SRL
C-terminal. Una estructura
C-terminal de este tipo es conocida como PTS
(secuencia de direccionamiento peroxisomal) (4).
La DHRS4 es evidentemente expresada en distintos
tejidos/órganos
(http://genecards.bcgsc.bc.ca/cgi-bin/carddisp?
DHRS4&search=dhrs4&suff=txt).
DHRS4&search=dhrs4&suff=txt).
Han sido además descritas distintas variantes
alternativas de empalme para el gen de DHRS4: El NBCI (NCBI =
(banco de datos del) Centro Nacional de Información Biotecnológica)
prevé actualmente 30 distintos transcritos empalmados y
correspondientemente 30 distintos productos de traducción
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/
Acembly/av.cgi?db=human&c=locusid&1=10901). En el banco de datos SWISSPROT están ciertamente descritas tan sólo dos variantes adicionales.
Acembly/av.cgi?db=human&c=locusid&1=10901). En el banco de datos SWISSPROT están ciertamente descritas tan sólo dos variantes adicionales.
En la WO 0153486 se prevén en la DHRS4 posibles
sitios de glicosilación y miristoilización que por cierto no están
documentados experimentalmente.
En la presente solicitud se entiende que la
designación DHRS4 comprende además de proteínas mono- o multímeras
según la ID SEC Nº:1 también variantes de corte y empalme, así como
fragmentos y variantes modificadas postraslacionalmente de otro
modo, y en particular aquéllas que en los análisis que se describen
a continuación presentan una inmunorreactividad correspondiente a
la DHRS4.
En contextos patofisiológicos se expone en la WO
0153486 que entre otras la DHRS4 es sobreexpresada en determinadas
células cancerosas y por consiguiente podría servir de punto de
apoyo para la terapia del cáncer y la diagnosis a partir de
muestras de tejido. No se establece sin embargo una relación con
infecciones y morbilidades sépticas.
Esto sucede por vez primera en la presente
solicitud, que se refiere en particular a la utilización de los
nuevos conocimientos para la diagnosis in vitro (ex
vivo).
En la WO 2004/003162 A2 se describe que en una
biblioteca de cDNA fue sobre la base de un RNA del intestino
delgado de una persona obesa de sexo femenino identificado un cDNA
que codifica para un péptido de 244 aminoácidos que pertenece a la
familia de las alcohol deshidrogenasas de cadena corta.
En la solicitud US 2002/0160392 A1 se menciona
la alcohol deshidrogenasa de cadena corta humana, sacada de un DNA
aislado e identificado de células de hepatoblastoma y designada como
PRO1800, en un contexto en el que se trata con preferencia de un
potencial desarrollo de fármacos.
La determinación de DHRS4 con fines de
diagnósticos en los fluidos biológicos se hace preferiblemente
ex vivo con ayuda de procedimientos de determinación
inmunodiagnóstica (ensayos de fijación de ligandos;
inmunoensayos).
Se entiende además que, presuponiendo la
necesaria especificidad y sensibilidad, pueden aplicarse
cualesquiera ensayos de fijación de ligandos/inmunoensayos que
operen según principios conocidos para la determinación
cuantitativa o semicuantitativa de DHRS4 en fluidos biológicos, y en
particular los de la circulación tales como el suero o el
plasma.
En una forma de realización preferida el
procedimiento se ejecuta como inmunoensayo heterogéneo en sándwich
en el cual un primer anticuerpo que fija DHRS4 está inmovilizado en
una fase fija cualquiera, como por ejemplo las paredes de tubitos
de ensayo recubiertos (p. ej. de poliestireno; "Coated Tubes";
CT) o en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestireno, o
en partículas, como por ejemplo partículas magnéticas, mientras que
otro anticuerpo específico para DHRS4 lleva un residuo que
representa una etiqueta directamente detectable o permite un enlace
selectivo con una etiqueta y sirve para la detección de las
estructuras en sándwich formadas. Es también posible una
inmovilización posterior o retardada en el tiempo usando adecuadas
fases fijas.
Fundamentalmente pueden usarse todas las
técnicas de marcación que son utilizables en los ensayos de la
clase que se ha descrito, a las cuales pertenecen marcaciones con
radioisótopos, enzimas y etiquetas de fluorescencia,
quimioluminiscencia o bioluminiscencia y marcaciones de color
directamente detectables por vía óptica, como por ejemplo átomos de
oro y partículas de colorante como las que se usan en particular
para los llamados ensayos rápidos o ensayos de
Point-of-Care (POC). Queda con ello
dentro del marco de la presente invención el configurar el
procedimiento según la invención también como ensayo rápido.
El procedimiento de determinación de DHRS4 puede
además ejecutarse por ejemplo también usando un homogéneo
procedimiento de detección en el que permanecen en suspensión en la
fase líquida complejos en sándwich formados a base de dos
anticuerpos y la DHRS4 a detectar. En un caso de este tipo se
prefiere marcar ambos anticuerpos con partes de un sistema de
detección que cuando ambos anticuerpos son integrados en un único
sándwich permite una generación o emisión de señales. Tales
técnicas son susceptibles de ser configuradas en particular como
procedimientos de detección por amplificación o extinción de
fluorescencia. Un procedimiento particularmente preferido de este
tipo se refiere al uso de reactivos de detección que se aplican por
parejas, como por ejemplo los que están descritos en los documentos
US-A-4 822 733,
EP-B1-180 492 o
EP-B1-539 477 y en el estado de la
técnica que ahí se cita. Los mismos permiten directamente en la
mezcla de reacción una medición que comprende selectivamente tan
sólo productos de reacción que contienen en un único inmunocomplejo
ambos componentes de marcación. Como ejemplo se hace referencia a
la tecnología que se oferta bajo las marcas TPACE® (Time Resolved
Amplified Cryptate Emission) o KRYPTOR®, la cual lleva a la práctica
las doctrinas de las solicitudes anteriormente mencionadas.
Pero también en el caso de los inmunoensayos
heterogéneos en sándwich dos anticuerpos específicos para DHRS4
pueden presentar partes de un sistema de detección de la clase que
acaba de ser descrita en relación con ensayos homogéneos.
Como se demuestra a continuación, la aparición -
en el sentido de una expresión detectable - de DHRS4 en extractos
hepáticos de babuinos está acoplada a una precedente estimulación
por endotoxinas provocadora de "sepsis" o a una infección
precedente. En consonancia con la literatura que se ha citado al
comienzo, en los controles no tratados no es posible una detección
de DHRS4. Con ello, la DHRS4 representa un potencial marcador de
sepsis.
A continuación se aclara más detalladamente la
invención haciendo referencia a siete figuras.
Las figuras muestran lo siguiente:
La Fig. 1: Partes ampliadas de geles
bidimensionales que permiten establecer una comparación de los
patrones de manchas de proteínas hepáticas solubles de un babuino
sano (A) y de las proteínas hepáticas de un babuino 5 h después de
una sepsis inducida mediante inyección de LPS (B). El círculo indica
la posición del producto DHRS4 específico de sepsis según la
invención.
La Fig. 2A: Resultados de una espectrometría de
masas en tándem ESI-MS/MS de un fragmento peptídico
seleccionado de la digestión con tripsina de la mancha de proteína
específica de sepsis. Espectro de masa en tándem del ion precursor
= 669,76. La interpretación del espectro redunda en la secuencia de
aminoácidos A(K/Q)DGAHVV.
La Fig. 2B: Resultados de una espectrometría de
masas en tándem ESI-MS/MS de un fragmento peptídico
seleccionado de la digestión con tripsina de la mancha de proteína
específica de sepsis. Espectro de masa en tándem del ion precursor
= 814,44. La interpretación del espectro redunda en la secuencia de
aminoácidos TASTDG(I/L)GS.
La Fig. 3: La secuencia de aminoácidos de DHRS4
(véase también la ID SEC Nº:1). Están destacados los elementos
estructurales de interés: Mediante comparación con las secuencias
que se indican en Kallberg Y et al., (2002) (15) y en
Jörnvall H et al., (1995) (1) fueron identificadas y están
enmarcadas probables estructuras en hoja plegada \beta y hélices
\alpha. Mediante la misma comparación fueron identificados
aminoácidos conservados a los que se ha puesto fondo sombreado.
Para otros miembros de la familia SDR se ha descrito que los puntos
de contacto para una multimerización son las zonas
\alpha4(E) y \alpha5(F); Jörnvall H et al.;
(1995) (1). El sitio de fijación para NAD/NADP es según comparación
secuencial con DHS2 (SWISSPROT inscripción Q13268) la zona de la
Pos. 36-59. Las zonas de secuencia que fueron usadas
como péptidos para la inmunización están indicadas con negrita y
cursiva (Pos. 19-30, 209-228,
230-247, 256-278).
La Fig. 4: Una típica curva estándar del
inmunoensayo en sándwich para DHRS4 utilizado en la presente
solicitud en el Capítulo 5.1 para determinaciones (ensayo de
quimioluminiscencia en el formato del tubo recubierto; anticuerpo
contra las zonas Pos. 209-228 (péptido PLE20; fase
fija) y 256-278 (péptido PSL23; indicador)).
Sirvieron de patrones diluciones de extracto de E. coli con
contenido de DHRS4 recombinante en suero de caballo normal a las
cuales les fueron atribuidas unidades arbitrarias. Está indicada la
sensibilidad funcional de ensayo de 2 U/l.
La Fig. 5: Inmunorreactividades de DHRS4 medidas
con un ensayo según la Fig. 4, medidas en cada caso en 50 muestras
de plasma de sujetos de ensayo sanos y de pacientes con sepsis. Está
indicada para 2 U/l la sensibilidad funcional de ensayo.
La Fig. 6: Una comparación metodológica de
distintos ensayos en sándwich para DHRS4: Fueron medidas muestras
de plasma en distintos ensayos. Están indicados en los ejes los
epítopes peptídicos de los anticuerpos usados en los ensayos. Los
coeficientes de correlación son los siguientes: r = 0,97 (A), r =
0,95 (B), r = 0,94 (C).
La Fig. 7A: Una comparación de secuencias de
DHRS4 (DHS4_HUMAN) con la secuencia DHS2_HUMAN (programa ClustalW).
Los aminoácidos idénticos están marcados con asteriscos, y los
aminoácidos estructuralmente emparentados están marcados con
puntos. Están marcadas aquellas zonas de secuencia de DHRS4 que
fueron sintetizadas como péptidos y usadas para la producción de
anticuerpos.
La fig. 7B: Una comparación de secuencias de
DHRS4 (DHS4_HUMAN) con dos variantes de corte y empalme
identificadas en el banco de datos SWISSPROT (programa ClustalW).
Los aminoácidos idénticos están identificados con asteriscos. Están
marcadas aquellas zonas de secuencia de DHRS4 que fueron
sintetizadas como péptidos y usadas para la producción de
anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a los ensayos efectuados con babuinos
para la estimulación de la secreción de procalcitonina mediante
inyecciones de endotoxina (5, 6) les fueron administrados por vía
intravenosa a babuinos macho (Papio ursinus) (de unos 2 años de edad
y de pesos de 27 a 29 kg) en cada caso 100 \mug de LPS
(lipopolisacárido de Salmonella typhimurium, fuente de
suministro: Sigma) por kg de peso corporal. Al haber transcurrido de
5 a 5,5 h después de la inyección, los animales fueron sacrificados
mediante administración intravenosa de 10 ml de Doletal.
Inmediatamente después de su exitus se procedió a preparar el hígado
y estabilizarlo mediante congelación en nitrógeno líquido.
En el posterior procesamiento se procedió a
mezclar muestras (de 1 g) de los hígados congelados bajo
enfriamiento con nitrógeno con 1,5 ml de tampón A (Tris 50 mM/HCl,
pH 7,1, KCl 100 mM, 20% de glicerol, Pefabloc 1 mM, cóctel
inhibidor de proteasa "Complete" (Roche): por cada 1,5 ml de
tampón A: 0,2 \mul de una solución de 1 tableta en 2 ml) y a
pulverizarlas en un mortero de porcelana hasta dejarlas en forma de
una harina (7). El homogeneizado fue tratado con ultrasonido en un
baño de agua por espacio de 6 x 10 seg. y fue centrifugado por
espacio de 40 min. a 100.000 g y a 4ºC, y se recuperó el
supernatante obtenido. El pellet de células que quedó fue
pulverizado bajo nitrógeno, tratado con ultrasonido y centrifugado
otra vez como se ha descrito anteriormente. El segundo supernatante
resultante de ello fue reunido con el primer supernatante y
almacenado a -80ºC hasta el posterior procesamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron para un análisis proteómico extractos
de proteínas hepáticas de por un lado babuinos sanos (control) y
por otro lado babuinos a los cuales les había sido inyectado LPS.
Para la electroforesis analítica en gel bidimensional extracto
hepático que contenía 150 \mug de proteína fue ajustado a urea 9M,
DTT 70 mM, 2% de anfolito pH 2-4, y fue luego
sometido a separación mediante electroforesis analítica en gel
bidimensional (8). La visualización de las proteínas en el gel de
electroforesis bidimensional se hizo mediante coloración con plata
(9).
Para la evaluación los patrones de manchas de
proteínas de las muestras de animales no tratados fueron comparados
con los patrones de manchas de proteínas que resultaron de las
muestras de tejido hepático de animales tratados. La Fig. 1 muestra
una comparación de los geles de electroforesis bidimensionales para
una muestra de control (A) y una muestra de un animal tratado con
LPS (B). La mancha de proteína adicional en (B) con un peso
molecular aparente de aproximadamente 29000 daltons y un punto
isoeléctrico aparente de aproximadamente 8,0 a 8,2 fue analizada
por espectrometría de masas, después de haber sido la proteína que
surge diferencialmente y es identificada en el patrón de manchas de
proteína de la electroforesis analítica en gel bidimensional
preparada adicionalmente a continuación mediante electroforesis
preparativa en gel bidimensional usando 350 \mug de proteína.
En la electroforesis preparativa en gel
bidimensional la coloración se hizo mediante Azul Brillante de
Coomassie G250 (10).
La mancha de proteína preseleccionada para el
ulterior análisis fue separada del gel por corte y fue digerida con
tripsina usando un método publicado (11), y los fragmentos de
tripsina generados fueron a continuación analizados mediante
espectrometría de masas por electronebulización
(ESI-MS) (12-14). Se usó un
espectrómetro de masas Q-TOF con una fuente de
iones de Z-spray de nanoflujo de la firma Micromass,
del R.U. Se trabajó según las instrucciones de trabajo del
fabricante del aparato.
\vskip1.000000\baselineskip
Del espectro matriz de la proteína digerida con
tripsina de la mancha seleccionada fueron respectivamente
identificados mediante ESI-MS/MS los distintos
péptidos individuales ("marcadores"). Los espectros de masas
obtenidos para estos fragmentos podían ser evaluados analíticamente
de manera en sí conocida. La búsqueda en banco de datos con los
marcadores de secuencia de ESI-MS/MS fue efectuada
con ayuda de MS-Edman
(http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/
ucsfhtml3.2/msedman.htm), que está localizado en el servidor Portein Prospector del Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad de San Francisco, California.
ucsfhtml3.2/msedman.htm), que está localizado en el servidor Portein Prospector del Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad de San Francisco, California.
La Fig. 2A muestra a título de ejemplo el
resultado de MS/MS para el péptido con la masa de 669,76 y la
secuencia A(K/Q)DGAHVV que se lee a partir del
espectro (K y Q no pueden ser diferenciados por espectrometría de
masas). La Fig. 2B muestra otro péptido con la masa de 814,44 y el
espectro que resulta del mismo y la secuencia de aminoácidos de
TASTDG(I/L)GS (I y L no pueden ser diferenciados
mediante espectrometría de masas).
Ambas secuencias de aminoácidos fueron
comparadas con todas las secuencias de las proteínas de mamífero
del banco de datos NCBI Nº 18.09.00 y NCBI Nº 6.17.2000. La mejor
coincidencia para ambos péptidos (A(K/Q)DGAHVV y
TASTDG(I/L)GS) fue hallada con partes de la proteína
humana DHRS4 (alcohol deshidrogenasa peroxisomal de cadena corta):
AQDGAHVV y TASTDGIGF. Esta identificación debe considerarse como
fuera de toda duda. Para la DHRS4 humana (ID SEC Nº:1) se calcula
un peso molecular de 29,5 kDa y un punto isoeléctrico de 8,8. Estos
valores son muy cercanos a los valores observados experimentalmente
(véase lo indicado anteriormente) y apoyan el resultado de la
identificación.
Sobre la base de la alta similitud de las
reacciones patofisiológicas de los babuinos y los humanos, que se
ha puesto repetidamente de manifiesto también precisamente en las
numerosas investigaciones de la solicitante sobre las que se ha
tratado anteriormente y que se basan en los resultados de una sepsis
inducida artificialmente en babuinos, puede partirse de la base de
que en pacientes humanos infectados o sépticos se dan en esencia
circunstancias idénticas a las que corresponden al modelo animal de
los babuinos que se ha descrito. Esta suposición básica se confirmó
mediante determinación inmunodiagnóstica de DHRS4 en plasmas humanos
de sujetos sanos y pacientes con sepsis.
Con esta finalidad fueron desarrollados
inmunoensayos en sándwich para DHRS4 y con ello se investigó la
aparición de DHRS4 en la circulación sanguínea de distintos grupos
de pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la producción de anticuerpos contra DHRS4
fueron sintetizados a partir de la secuencia de aminoácidos de
DHRS4 péptidos parciales con los cuales se inmunizaron ovejas (Fig.
3). Para la selección de los péptidos se tomaron en consideración
informaciones sobre la estructura secundaria, terciaria y
cuaternaria de la proteína, con el objetivo de producir anticuerpos
que sean adecuados para fijar DHRS4 nativa.
Sacadas de la secuencia de aminoácidos conocida
de DHRS4 fueron seleccionadas cuatro zonas (Pos.
19-30, 209-228,
230-247, 256-278). Las zonas fueron
(Pos. 19-30 y 230-247
respectivamente completadas con un residuo de cisteína
N-terminal) sintetizadas químicamente como péptidos
solubles según procedimientos estándar, purificadas, sometidas a
control de calidad mediante espectrometría de masas y HPLC de fase
inversa y liofilizadas en partes alícuotas (firma JERINI AG, de
Berlín, Alemania). Las secuencias de aminoácidos de los péptidos son
las siguientes:
- PML13
- CMASSGMTRRDPL (ID SEC Nº:2)
- PLE20
- CLAPGLIKTSFSRMLWMDKE (ID SEC Nº:3)
- PED19
- CEESMKETLRIRRLGEPED (ID SEC Nº:4)
- PSL23
- CSEDASYITGETVVVGGGTPSRL (ID SEC Nº:5)
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante MBS (éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)
los péptidos PML13, PLE20, PED19 y PSL23 fueron conjugados con la
proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin) (véanse las
instrucciones de trabajo
"NHS-Esters-Maleimide
Crosslinkers" de la firma PIERCE, de Rockford, IL, EE.UU.). Con
estos conjugados fueron inmunizadas ovejas según el esquema
siguiente: Cada oveja recibió inicialmente 100 \mug de conjugado
(estando el dato de masa referido a la parte peptídica del
conjugado) y a continuación cada 4 semanas respectivamente 50
\mug de conjugado (estando el dato de masa de referido a la parte
peptídica del conjugado). Empezando en el cuarto mes tras el
comienzo de la inmunización fueron extraídos cada 4 semanas por cada
oveja 700 ml de sangre, y mediante centrifugación se obtuvo
antisuero de los mismos. Las conjugaciones, las inmunizaciones y la
obtención de antisueros fueron realizadas por la firma MicroPharm,
de Carmarthenshire, R.U.
En un procedimiento de 1 paso se prepararon los
anticuerpos péptido-específicos a partir de los
antisueros que habían sido obtenidos comenzando con el cuarto mes
después de la inmunización.
Para ello, los péptidos PML13, PLE20, PED19 y
PSL23 fueron primeramente acoplados a gel SulfoLink (véanse las
instrucciones de trabajo "Sulfolink Kit" de la firma PIERCE, de
Rockford, IL, EE.UU.). Para el acoplamiento se aportaron
respectivamente 5 mg de péptido por cada 5 ml de gel.
La purificación por afinidad de anticuerpos
péptido-específicos de antisueros de oveja contra
los péptidos se hizo de la manera siguiente:
Las columnas de péptidos fueron en primer lugar
lavadas tres veces alternativamente con 10 ml de tampón de elución
(ácido cítrico 50 mM, pH 2,2) y tampón de fijación (fosfato sódico
100 mM, 0,1% de Tween, pH 6,8), respectivamente. 100 ml de los
antisueros fueron filtrados a través de un tamaño de poro de 0,2
\mum y mezclados con el material de columna existente. Para ello,
el gel fue barrido de la columna cuantitativamente con 10 ml de
tampón de fijación. La incubación se hizo durante la noche a
temperatura ambiente y bajo agitación. Las cargas se pasaron
cuantitativamente a columnas vacías (NAP 25, Pharmacia). Fueron
desechados los materiales que pasaron a través de las columnas. A
continuación se efectuó lavado con 250 ml de tampón de fijación
exento de proteína (contenido de proteína del eluido de lavado <
0,02 A 280 nm). Se aportó a las columnas lavadas tampón de elución,
y se reunieron fracciones a razón de 1 ml. De cada fracción se
determinó el contenido de proteína mediante el método BCA (véanse
las instrucciones de trabajo de la firma PIERCE, de Rockford, IL,
EE.UU.). Fueron combinadas las fracciones con concentraciones de
proteína > 0,8 mg/ml. Tras la determinación de proteínas del
combinado mediante el método BCA se obtuvieron unas producciones de
57 mg para el anticuerpo anti-PLE13, 56 mg para el
anticuerpo anti-PLE20, 12 mg para el anticuerpo
anti-PED19 y 99 mg para el anticuerpo
anti-PSL23.
Mediante columnas de filtración en gel
NAP-5 (Pharmacia) se cambiaron de tampón según las
instrucciones de trabajo respectivamente 500 \mul de los
anticuerpos anti-PLE20, anti-PED19 y
anti-PSL23 purificados (véase lo expuesto
anteriormente) en 1 ml de tampón de fosfato potásico 100 mM (pH
8,0), respectivamente. Las concentraciones de proteína de las
soluciones de anticuerpos fueron ajustadas a 1,5 mg/ml con tampón de
fosfato potásico 100 mM (pH 8,0).
Para la marcación por quimioluminiscencia todos
los anticuerpos fueron tratados adicionalmente de la manera
siguiente: 67 \mul de la solución de anticuerpos fueron mezclados
con 10 \mul de
MA70-acridinio-NHS-éster (1 mg/ml;
firma HOECHST Behring) y se tuvieron en incubación por espacio de 15
minutos a temperatura ambiente. Luego fueron añadidos 423 \mul de
glicina 1M y se efectuó incubación por espacio de otros 10 minutos.
A continuación, por medio de una columna de filtración en gel
NAP-5 (Pharmacia) se cambió de tampón según las
instrucciones de trabajo la preparación de marcación en 1 ml de
eluyente A (fosfato potásico 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) y se le
retiraron los componentes de bajo peso molecular. Para la separación
de los últimos residuos de etiquetas no fijadas a anticuerpos se
hizo una HPLC de filtración en gel (columna: Waters Protein Pak
SW300). La muestra fue cargada y cromatografiada con un caudal de 1
ml/min. con eluyente A. Con un fotómetro de flujo fueron medidas
las longitudes de onda de 280 nm y 368 nm. La relación de absorción
a 368 nm/280 nm como medida del grado de marcación del anticuerpo
fue en el pico de 0,10 +/- 0,01. Las fracciones con contenido de
anticuerpos monómeros (tiempo de retención 8-10
min.) fueron reunidas y puestas en 3 ml de fosfato sódico 100 mM,
NaCl 150 mM, 5% de albúmina sérica bovina, 0,1% de azida sódica, pH
7,4.
Tubitos de poliestireno de 5 ml irradiados
(firma Greiner) fueron recubiertos como se indica a continuación
con anticuerpos anti-PML13 y anticuerpos
anti-PLE20 purificados, respectivamente. El
anticuerpo fue diluido en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,8 hasta una
concentración de 6,6 \mug/ml. Se pipetaron al interior de cada
tubito 300 \mul de esta solución. Los tubitos fueron incubados por
espacio de 20 horas a 22ºC. Se aspiró la solución. Entonces se
llenó cada tubito con 4,2 ml de fosfato sódico 10 mM, 2% de Karion
FP, 0,3% de albúmina sérica bovina, pH 6,5. Tras haber transcurrido
20 horas fue aspirada la solución. Finalmente los tubitos fueron
secados en un secador al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Fue desarrollado un primeramente inmunoensayo en
sándwich para DHRS4 (anticuerpos contra las zonas Pos.
209-228 o el péptido PLE20 y 256-278
o el péptido PSL23) con una sensibilidad funcional de ensayo de
aproximadamente 2 U/l (típica curva estándar: véase la Fig. 4).
Con este ensayo fueron medidas muestras de
plasma de sujetos sanos y pacientes de sepsis (Fig. 5). Todas las
muestras de sujetos sanos arrojaron valores de medición inferiores a
la sensibilidad funcional de ensayo; y 38 de las 50 muestras de
pacientes de sepsis arrojaron valores de medición superiores a la
sensibilidad funcional de ensayo. Se da una sensibilidad
diagnóstica de un 76% para una especificidad del 100%.
En una comparación metodológica se demostró que
los ensayos en sándwich que usan anticuerpos contra otros epítopes
de la DHRS4 conducen a la obtención de resultados equiparables a los
del ensayo utilizado en 5.1 (Fig. 6).
Para ello se establecieron en total tres
inmunoensayos en sándwich para DHRS4 que trabajaban con los
anticuerpos siguientes:
a) Fase fija: anti-PLE20,
indicador: anti-PSL23 (véase 5.1.)
b) Fase fija: anti-PLE20,
indicador: anti-PED19
c) Fase fija: anti-PML13,
indicador: anti-PLE20
Sirvió en cada caso de material estándar DHRS4
humana recombinante en forma de un extracto de bacterias E.
coli transformadas (In Vivo GmbH, de Hennigsdorf,
Alemania). La clonación y expresión del gen de DHRS4 se efectuaron
según procedimientos biologicomoleculares estándar. El extracto fue
diluido serialmente en suero de caballo normal (firma SIGMA). A los
patrones así producidos les fueron atribuidas concentraciones en
unidades arbitrarias.
Las muestras de medición eran plasmas EDTA de
sujetos aparentemente sanos y de pacientes con sepsis.
Los tres inmunoensayos en sándwich fueron
preparados de la misma manera como se indica a continuación: Se
pipetaron al interior de los respectivos tubitos de ensayo
recubiertos con anticuerpos 100 \mul de patrones y de muestras
así como 100 \mul de tampón de ensayo (fosfato sódico 100 mM, NaCl
150 mM, 5% de albúmina sérica bovina, 0,1% de IgG inespecífica de
oveja, 0,1% de azida sódica, pH 7,4) que contenía 1 millón de RLU
(unidades relativas de luz) del respectivo anticuerpo marcado con
MA70. Se hizo incubación por espacio de 20 horas a 22ºC con
sacudimiento. Luego se hicieron 4 lavados con 1 ml de solución de
lavado (Tween 20 al 0,1%) por tubito cada vez, se dejó que se
escurriesen los tubitos y se midió la quimioluminiscencia fijada al
tubito en un luminómetro (firma BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos
BRAHMS AG).
Usando el software MultiCalc (Spline Fit) fueron
leídas las concentraciones de DHRS4 de las muestras en la curva
estándar.
Para evaluar si los anticuerpos que fueron
producidos contra los péptidos seleccionados podrían también
reaccionar en el marco de una reacción cruzada con otros
péptidos/proteínas humanos distintos de la DHRS4
(SCAD-SLR), se comparó la DHRS4 mediante
"Quickblast" con todas las secuencias humanas que están
contenidas en el banco de datos SWISSPROT. Fueron analizadas más
detalladamente las secuencias halladas que presentaban similitud
con la DHRS4 y contenían zonas que correspondían a epítopes para
tales anticuerpos que se usaron en las tres variantes de ensayo en
sándwich realizadas. Se hallaron dos variantes de corte y empalme de
DHRS4, así como el producto del gen de DHRS2 (Fig. 7A, 7B). Sería
de esperar una reactividad cruzada con ambas variantes de corte y
empalme, en tanto que el anticuerpo anti-PLE20
reconociese también solamente la secuencia LWMDKE (lo cual no fue
investigado experimentalmente). Una reactividad cruzada con el
producto del gen de DHRS2 parece sin embargo más bien improbable
debido a la escasa homología secuencial, pero no puede ser excluida
por completo.
Puesto que no es sabido si y en qué
concentraciones la DHRS4 está también presente en las células
sanguíneas, pero esto es relevante para la toma de muestras
(hemólisis, separación incompleta de trombocitos), fue totalmente
hemolizada mediante ultrasonido y luego medida con respecto a la
DHRS4 sangre con EDTA de sujetos de ensayo normales. Fueron con
ello detectadas concentraciones de 1-3 U/l (datos no
indicados). Esto indica que la DHRS4 está presente en las células
sanguíneas, pero lo está en concentraciones tan pequeñas, que la
hemólisis parcial o la separación incompleta parcial de trombocitos
no ejercen influencia relevante alguna en los resultados de
medición.
Está por ver mediante qué mecanismo la DHRS4
pasa a la circulación de la sangre en la sepsis.
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<120> Determinación de
SRL-alcohol deshidrogenasa de cadena corta (DHRS4)
como biomarcador para inflamaciones e infecciones
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 278
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Sintética
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<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Sintética
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<400> 3
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Sintética
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<400> 4
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\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Sintética
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<400> 5
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Claims (10)
1. Uso de SRL-alcohol
deshidrogenasa de cadena corta (DHRS4) con la secuencia de
aminoácidos según la ID SEC Nº:1 como biomarcador humoral para la
detección diagnóstica y para la prognosis evolutiva así como para el
control evolutivo y terapéutico de inflamaciones e infecciones.
2. Uso según la reivindicación 1 dentro del
marco de la identificación anticipada y la identificación
diagnóstico-diferencial, para la determinación del
grado de gravedad y para el control evolutivo y terapéutico de
sepsis e infecciones graves mediante determinación ex vivo
de la aparición y/o de la cantidad de DHRS4 con la secuencia de
aminoácidos según la ID SEC Nº:1 y/o de fragmentos, variantes de
corte y empalme y formas postraslacionales modificadas de DHRS4 de
aparición patofisiológica con inmunorreactividad de DHRS4 en un
fluido biológico, y en particular en el suero o el plasma de un
paciente.
3. Procedimiento ex vivo para la
identificación anticipada y la identificación
diagnóstico-diferencial, para la prognosis
evolutiva y para el enjuiciamiento del grado de gravedad y para el
control evolutivo y terapéutico de sepsis e infecciones graves, y
en particular de infecciones sistémicas similares a la sepsis,
caracterizado por el hecho de que en un fluido biológico de
un paciente y con ayuda de un ensayo de fijación de ligandos se
determina la presencia y/o la cantidad de
SRL-alcohol deshidrogenasa de cadena corta (DHRS4)
con la secuencia de aminoácidos la ID SEC Nº:1 y/o de fragmentos,
variantes de corte y empalme y formas postraslacionales modificadas
de DHRS4 de aparición patofisiológica con inmunorreactividad de
DHRS4, y de la determinación y/o de la cantidad de
inmunorreactividad de DHRS4 se sacan conclusiones con respecto a la
presencia, a la evolución previsible, al grado de gravedad o al
éxito de una terapia de una sepsis o infección.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado por el hecho de que el ensayo de fijación de
ligandos es un inmunoensayo heterogéneo u homogéneo en forma de un
ensayo en sándwich.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 3 o 4, caracterizado por el hecho de que es
ejecutado dentro del marco de una determinación multiparamétrica en
la que al mismo tiempo se determina al menos un adicional parámetro
de sepsis y se obtiene un resultado de medición en forma de un
conjunto de al menos dos magnitudes de medición que es valorado
para la diagnosis fina de la sepsis y para la estratificación de
pacientes.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado por el hecho de que dentro del marco de la
determinación multiparamétrica además de la inmunorreactividad de
DHRS4 se determina al menos un parámetro adicional que es
seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de
procalcitonina, CA 19-9, CA 125, S100B, proteínas
S100A, fragmentos de citoqueratinas solubles, y en particular CYFRA
21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles
(sCY1F), las enzimas
aldosa-1-epimerasa,
glicina-N-aciltransferasa (GNAT),
Cu/Zn-SOD, carbamoilfosfato sintetasa (CPS) y
fragmentos de las enzimas mencionadas, los péptidos inflamina, CHP,
LASP-1, gastroquina 1 así como inmunorreactividad
derivada, precursores de péptidos vasoactivos, y en particular de
pro-ANP, pro-endotelina,
pro-vasopresina y pro-adrenomedulina
así como citoquinas, interleuquinas, TNF y la proteína
C-reactiva (CRP).
7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6,
caracterizado por el hecho de que la determinación
multiparamétrica se efectúa como determinación simultánea mediante
un dispositivo de medición de la tecnología de chips o un
dispositivo de medición inmunocromatográfica.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado por el hecho de que la valoración del complejo
resultado de medición obtenido con el dispositivo de medición se
efectúa con ayuda de un programa de ordenador.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 3 a 4, caracterizado por el hecho de que
está configurado como ensayo rápido o ensayo de POC
(Point-of-Care).
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado por el hecho de que es un procedimiento
inmunocromatográfico con una marcación directa detectable
visualmente.
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