JP2003083970A

JP2003083970A - 試験片を用いた被検物質の測定方法及び装置

Info

Publication number: JP2003083970A
Application number: JP2002194444A
Authority: JP
Inventors: Satoru Isomura; 哲磯村; Takaaki Munebayashi; 孝明宗林
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2003-03-19

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】試験片を用いて、液体中の被検物質を、定量
性及び再現性よく測定する方法及び装置を提供する。【解決手段】以下の各過程で液体試料中の被検物質の
濃度を測定する。（Ａ）毛管現象で液体試料を展開する
領域を有し、第１、第２及び第３の領域がこの順序に設
定された担体と、第１の領域に展開可能に担持し、標識
した被検物質に特異的に結合する第１の物質と、第２の
領域に固定した、被検物質に特異的に結合する第２の物
質とを有する試験片に、液体試料を展開し、（Ｂ）第１
の領域で被検物質と第１の物質とを結合させ、第２の領
域で被検物質と第２の物質を結合させて捕獲し、第３の
領域に、捕獲されなかった被検物質及び第１の物質を保
留させ、（Ｃ）第２の領域、及び第２の領域以外の領域
において、標識を検出し、（Ｄ）第２の領域の標識検出
結果を、第２の領域以外の領域の標識検出結果を用いて
補正して、被検物質の濃度を算出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試験片を用いた被
検物質の測定方法及び装置に関する。詳しくは、液体試
料中の被検物質の濃度を測定する方法及び装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より、簡易な定性免疫分析法とし
て、イムノクロマトグラフィーが知られている。この方
法は、被検物質に特異的に結合する標識化された第１の
抗体又は抗原を、液体とともに展開可能に保持するリリ
ース部位と、被検物質に特異的に結合する第２の抗体又
は抗原が固定化された捕捉部位とを有する試験片を用
い、被検物質を含む液体試料をリリース部位に接触させ
て、第１の抗体又は抗原と被検物質を結合させるととも
に、液体を試験片の担体上に展開させ、第１の抗体又は
抗原と被検物質が結合した複合体を、固定化された第２
の抗体又は抗原に結合させることにより試験片上の捕捉
部位に捕捉し、捕捉部位における標識を検出することに
よって、被検物質の存在や量を測定する方法である。

【０００３】また、イムノクロマトグラフィーを用いた
定量分析法として、ソマーら（特開平8-240591号公報）
は、抗体を結合した金ゾルの反射率を捕捉部位の位置で
読み取る方法を開示している。さらに、本川ら（特開平
8-334511号公報）は、イムノクロマトグラフィーを用い
た定量分析法として、捕捉部位における免疫分析のラベ
ル剤の量を細かい階調で読み取ることにより、定量精度
を向上させる方法を開示している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、一般的なイム
ノクロマトグラフィーでは、目視による陽性／陰性の判
定を前提としており、またそれ以上の精度を有するもの
ではない。また、第１の抗体又は抗原に結合しなかった
未反応の被検物質も捕捉部位で捕捉される結果、被検物
質と第１の抗体又は抗原が結合した複合体が捕捉部位で
十分に捕捉されないことがある。さらに、第１の抗体又
は抗原が捕捉部位以外の担体上に非特異的に結合するこ
とがある。したがって、捕捉部位上で検出される標識
は、試料中の被検物質の濃度を反映せず、試験片間にお
ける測定誤差を補正する手段が存在しない。前記のソマ
ーらの方法、及び本川らの方法においても、同様の問題
がある。

【０００５】上記のように、従来のイムノクロマトグラ
フィーは、定量性、再現性に問題がないとはいえない。
本発明は、上記観点からなされたものであり、試験片を
用いて、液体中の被検物質を、定量性及び再現性よく測
定する方法及び装置を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、標識の検出を
捕捉部位におけるのと同様に、捕捉部位以外の部位にお
いても行い、その結果を用いて捕捉部位における検出結
果を補正することによって、イムノクロマトグラフィー
における定量性及び再現性を向上できることを見出し、
本発明を完成するに至った。すなわち本発明の要旨は以
下のとおりである。

【０００７】（１）以下の各ステップを含む、液体試料
中の被検物質の濃度を測定する方法；（Ａ）毛管現象により液体試料を展開することができる
領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び第３の領
域がこの順序に設定された担体と、担体上の第１の領域
に、液体とともに展開可能に担持され、検出可能な標識
を有する、被検物質に特異的に結合する第１の物質と、
担体上の第２の領域に固定された、被検物質に特異的に
結合する第２の物質とを有する試験片に、液体試料を展
開させ、（Ｂ）第１の領域で被検物質と第１の物質とを
結合させ、第２の領域で被検物質と第２の物質を結合さ
せて、被検物質を第２の領域にトラップし、第３の領域
に、第２の領域でトラップされなかった被検物質及び第
１の物質を保留させ、（Ｃ）第２の領域、及び担体の第
２の領域以外の領域の一部または全部において、標識を
検出し、（Ｄ）第２の領域における標識の検出結果を、
担体の第２の領域以外の領域の一部または全部における
標識の検出結果を用いて補正して、被検物質の濃度を算
出する。（２）ステップ（Ｃ）において、担体の第１の領域から
第３の領域までの標識を検出する、（１）の方法。（３）第１の領域から第３の領域までの標識を検出し、
第２の領域における検出値のピークの積分値を、第１の
領域から第３の領域における検出値の積分値で除した値
を用いて被検物質の濃度を測定する、（１）の方法。（４）前記被検物質に特異的に結合する第１の物質及び
第２の物質が、それぞれエピトープが異なる抗体であ
る、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。（５）以下の各ステップを含む、液体試料中の被検物質
の濃度を測定する方法；（ａ）毛管現象により液体試料を展開することができる
領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び第３の領
域がこの順序に設定された担体と、担体上の第１の領域
に、液体とともに展開可能に担持され、検出可能な標識
を有する第１の物質と、担体上の第２の領域に固定され
た、被検物質及び第１の物質の両方に特異的に結合する
第２の物質とを有する試験片に、液体試料を展開させ、
（ｂ）第２の領域で被検物質及び第１の物質と、第２の
物質を結合させて、被検物質及び第１の物質を第２の領
域にトラップし、第３の領域に、第２の領域でトラップ
されなかった被検物質及び第１の物質を保留させ、
（ｃ）第２の領域、及び担体の第２の領域以外の領域の
一部または全部において、標識を検出し、（ｄ）第２の
領域における標識の検出結果を、担体の第２の領域以外
の領域の一部または全部における標識の検出結果を用い
て補正して、被検物質の濃度を算出する。（６）ステップ（ｃ）において、担体の第１の領域から
第３の領域までの標識を検出する、(5)の方法。（７）第１の領域から第３の領域までの標識を検出し、
第２の領域における検出値のピークの積分値を、第１の
領域から第３の領域における検出値の積分値で除した値
を用いて被検物質の濃度を測定する、(5)の方法。（８）毛管現象により液体試料を展開することができる
領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び第３の領
域がこの順序に設定された担体と、担体上の第１の領域
に、液体とともに展開可能に担持され、検出可能な標識
を有する第１の物質と、担体上の第２の領域に固定され
た、被検物質に特異的に結合する第２の物質とを有し、
前記第１の物質は、被検物質に特異的に結合するか、又
は被検物質と競合して第２の物質に特異的に結合する試
験片を用いて、液体試料中の被検物質の濃度を測定する
ための装置であって、試験片の第１の領域から第３の領
域までの標識を光学的に検出する検出器と、第２の領域
において検出された標識の量を、担体の第２の領域以外
の領域の一部または全部において検出された標識の量に
基づいて補正する補正手段とを備えた装置。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、液体試料中の被検物質の濃度を試験
片、具体的にはイムノクロマトグラフィーを用いて測定
する方法を改良したものである。本発明を適用すること
ができる被検物質は、それに対して特異的に結合する物
質が２種類存在するものであれば、特に制限されない。
例えば、一般的なイムノクロマトグラフィー等の試験片
により測定可能な物質が挙げられ、より具体的には、例
えば、タンパク質、有機物質、脂質、糖、ペプチド、ホ
ルモン、核酸、ウィルス等が挙げられる。

【０００９】本発明の被検物質の測定法の第１の形態
は、サンドイッチ法によるものであり、前記（Ａ）〜
（Ｄ）の各ステップを含む。また、本発明の第２の形態
は、競合法をによるものであり、前記（ａ）〜（ｄ）の
各工程を含む。第１の形態におけるステップ（Ｃ）及び
（Ｄ）は、第２の形態におけるステップ（ｃ）及び
（ｄ）と共通する。以下に、本発明の各形態について説
明する。

【００１０】＜１＞ステップ（Ａ）及び（ａ）このステップでは、毛管現象により液体試料を展開する
ことができる領域を少なくとも一部に有し、第１、第２
及び第３の領域がこの順序に設定された担体と、担体上
の第１の領域に、液体とともに展開可能に担持され、検
出可能な標識を有する第１の物質と、担体上の第２の領
域に固定された、被検物質に特異的に結合する第２の物
質とを有する試験片を用いる。サンドイッチ法において
は、前記第１の物質としては、被検物質に特異的に結合
する物質が用いられる。また、競合法においては、被検
物質と競合して第２の物質に特異的に結合する物質が用
いられる。本明細書において、前記第１の領域及び第２
の領域は、それぞれリリース部位、及び捕捉部位ともい
う。

【００１１】上記試験片は、通常イムノクロマトグラフ
ィーに用いられる試験片と同様にして製造することがで
きる。本発明に用いる試験片の一例を、図１に示す。こ
の試験片は、試料適用部位、リリースパッド（標識した
第１の物質を担持する部材）、クロマトグラフィー媒
体、及び吸収パッドを、各々一部が重なるように張り合
わせられて、担体を構成している。ポリビニルアルコー
ルコート・グラスファイバは、試料を適用する部位を構
成する。リリースパッドには、標識した第１の物質を担
持するリリース部位が設定されている。クロマトグラフ
ィー担体には、第２の物質を固定した捕捉部位が設定さ
れている。第２の領域と第３の領域は、図２に示すよう
に、同一のメンブレン上にあってもよい。

【００１２】試料適用部位は、その上に液体試料を滴下
するか、あるいは試料適用部位を液体試料に浸漬させる
等して、液体試料をリリース部位及びクロマトグラフィ
ー媒体まで展開させるためのものである。試料適用部位
には、ポリビニルアルコールコート・グラスファイバ、
セルロースメンブレン等を用いることができる。

【００１３】リリースパッドは、その一部又は全体に設
定されたリリース部位に、被検物質に特異的に結合する
第１の物質を、液体試料とともに展開可能に担持するこ
とができるものであればよく、グラスファイバ等が挙げ
られる。市販の素材（例えば、コンジュゲート・リリー
ス、F075-17, Whatman社）を用いてもよい。

【００１４】クロマトグラフィー媒体は、その上に設定
された捕捉部位に、被検物質に特異的に結合する第２の
物質を固定化することができ、さらに、第１の物質が保
持する標識の検出を妨げないものであって、毛管現象に
より液体試料を展開することができるものであれば、特
に制限されない。通常、溶媒に不溶性の多孔性物質が用
いられる。具体的には例えば、ガラスやシリカなどの無
機繊維からなる濾紙、又は、ニトロセルロース等の変性
セルロースからなる濾紙が挙げられる。単なるセルロー
スからなる濾紙も使用できるが、第１の物質を着色粒子
で標識する場合には、セルロース分子などに着色粒子が
捕捉されやすく、シグナルが不鮮明となる場合がある。

【００１５】吸収パッドは、液体試料を吸収することに
よって、クロマトグラフィー媒体中を液体試料が流通し
やすくし、また、未反応の物質とともに液体を吸収、保
留するためのものであり、セルロース等が挙げられる。
市販の素材（例えば、アブソーベント、17Chr, Whatman
社)を用いてもよい。

【００１６】担体のリリース部位には、検出可能な標識
を有する第１の物質を担持させておく。第１の物質は、
リリースパッドの表面に担持させても、リリースパッド
の内部に染み込ませてもよい。第１の物質は例えば、サ
ンドイッチ法においては、被検物質がタンパク質、ペプ
チド等の抗原の場合には、それに結合する抗体が挙げら
れ、被検物質が抗体である場合には、それに対する抗原
又は当該抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリンに
結合する抗体等が挙げられる。

【００１７】競合法においては、被検物質がタンパク
質、ペプチド等の抗原の場合には、それに結合する抗体
と競合的に結合する他の抗原が挙げられ、被検物質が抗
体である場合には、それに結合する抗原と競合的に結合
する他の抗体が挙げられる。どちらの方法においても、
抗体としては、イムノグロブリン分子であってもよく、
その派生物であるF(ab')₂、Fab'、Fab等の断片であって
もよい。その他、第１の物質としては、被検物質に結合
性を有する核酸、人工ポリマ、糖質、脂質、無機物質又
は有機配位子、ウィルス、各種薬物等が挙げられる。

【００１８】第１の物質は、検出可能な標識物質を用い
て標識される。標識物質としては、被検物質に結合した
まま担体上を展開することができ、被検物質が第２の物
質により捕捉部位に捕捉されたときに、被検物質ととも
に捕捉部位に留まるものであって、何らかの手段によっ
て検出可能なものである限り、特に制限されない。例え
ば、色素、発光物質、生物発光物質、蛍光物質、発色反
応を触媒する酵素等が挙げられる。

【００１９】また、標識物質は、単独で用いてもよい
し、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えば、目視
による定性的な検出が可能な標識物質で標識した第１の
物質と、光学系機器を用いて定量的な検出が可能な標識
物質で標識した第１の物質を混合して用いることができ
る。具体的には、色素と蛍光体を封入したラテックスの
ミクロカプセルを用いる方法や、金コロイドで標識した
第１の物質と蛍光物質で標識した第１の物質を混合して
用いる方法等が挙げられる。あるいは、フルオロセイン
のように、蛍光性を有する色素を用いると、目視による
検出と、蛍光による機器分析が可能となる。さらに、標
識物質として、ユーロピウム（Eu）錯体を封入したラテ
ックスと、カラーラテックスを用い、これらに第１の物
質を結合させたものを混合して用いると、目視及び蛍光
の測定が可能になる。すなわち、Eu錯体は白色であるた
め白い試験片上では見えないが、カラーラテックスと混
合することにより、目視による検出が可能となる。

【００２０】標識物質で第１の物質を標識する方法とし
ては、通常の免疫測定法における標識法を用いることが
できる。標識物質の検出については、後に詳述する。担
体の捕捉部位には、被検物質に特異的に結合する第２の
物質を固定しておく。第２の物質は、被検物質（サンド
イッチ法においては第１の物質が結合した被検物質）に
対して、特異的に結合することができ、試験片に固定さ
れ得るものであれば特に制限されない。尚、競合法にお
いては、第２の物質は、被検物質だけでなく、第１の物
質とも結合性を有する。

【００２１】第２の物質は、例えば、被検物質がタンパ
ク質、ペプチド等の抗原の場合には、それに結合する抗
体が、被検物質が抗体である場合には、それに対する抗
原又は当該抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリン
に結合する抗体等が挙げられる。抗体としては、イムノ
グロブリン分子であってもよく、その派生物であるF(a
b')₂、Fab'、Fab等の断片であってもよい。その他、第
２の物質としては、被検物質に結合性を有する核酸、人
工ポリマ、糖質、脂質、無機物質又は有機配位子、ウィ
ルス、各種薬物等が挙げられる。第２の物質は、被検物
質に第１の物質が結合する部位と異なる部位に結合する
ものであることが好ましい。例えば、被検物質がタンパ
ク質、ペプチド等である場合は、第１の物質及び第２の
物質は、それぞれエピトープが異なる抗体を用いる。ま
た、第１の物質をモノクローナル抗体とし、第２の物質
をポリクローナル抗体とすることもできる。

【００２２】通常、第２の物質は、試験片の長手方向に
対して直角となるように、帯状に固定される。クロマト
グラフィー媒体としてニトロセルロースを用いる場合
は、第２の物質がタンパク質又は核酸等であれば、その
溶液を捕捉領域に滴下することによって、固定すること
ができる。クロマトグラフィー担体の捕捉領域以外の領
域は、ウシ血清アルブミン（BSA）等を用いてブロッキ
ングし、第１の物質の非特異的吸着を防止することが好
ましい。

【００２３】捕捉部位は、単一の試験片上に、複数個所
設定されてもよい。複数の捕捉部位は、同一の分析対象
物の定量範囲の向上などに用いられてもよいし、又は、
複数の分析対象物を同時に測定するのに用いられてもよ
い。

【００２４】また、必要に応じて、テスト確認のための
テストラインを設けてもよい。テスト確認としては、例
えば、試験片上に第１の物質が流れたかどうかの確認
や、第１の物質が反応性を保持しているかの確認等が挙
げられる。

【００２５】ステップ（Ａ）では、上記のような試験片
の試料適用部位に液体試料を適用し、担体上で液体試料
を展開させる。

【００２６】＜２＞ステップ（Ｂ）及び（ｂ）ステップ（Ａ）で担体上を展開した液体試料がリリース
部位に達すると、サンドイッチ法では、液体試料中の被
検物質は、第１の物質と結合する。被検物質と第１の物
質が結合した複合体は、未反応の被検物質及び第１の物
質等とともにさらに展開し、捕捉部位に達すると、被検
物質は第２の物質に結合する。その際、被検物質に第１
の物質が結合していると、被検物質とともに第１の物質
がトラップされる。トラップされなかった被検物質及び
第１の物質は、第３の領域に保留される。

【００２７】一方、競合法では、担体上を展開した液体
試料がリリース部位に達すると、第１の物質は液体試料
中に溶解又は懸濁し、被検物質とともに展開する。液体
試料が捕捉部位に達すると、被検物質及び第１の物質
は、競合的に第２の物質に結合する。試料中の被検物質
の濃度が高い程、第１の物質と第２の物質の結合は少な
くなる。

【００２８】＜３＞ステップ（Ｃ）、（ｃ）及びステッ
プ（Ｄ）、（ｄ）液体試料を展開させた後に、捕捉部位、及び担体の捕捉
部位以外の領域において、標識を検出する。捕捉部位以
外の領域としては、捕捉部位を除く領域の全てであって
もよく、一部であってもよい。一部としては、試料適用
部位、リリース部位、捕捉部位以外のクロマトグラフィ
ー媒体、第３の領域が挙げられる。具体的には、リリー
ス部位から第３の領域までの標識を検出することが好ま
しい。

【００２９】そして、捕捉部位における標識の検出結果
を、捕捉部位以外の領域の一部または全部における標識
の検出結果を用いて補正して、被検物質の濃度を算出す
る。すなわち、従来のイムノクロマトグラフィーにおい
ては、標識の検出は捕捉部位のみで行っていたが、本発
明においては、他の領域でも標識を検出し、その値を用
いて捕捉部位における検出値を補正する。捕捉部位、及
び担体の捕捉部位以外の領域における標識の検出は、分
けて行う必然性はなく、全体をスキャンしながら検出を
行ってもよい。また、二次元又はそれ以上の検出器、例
えばCCDなどで各部位のデータを、例えば画像として同
時に取り込んでから、各部位の標識を検出してもよい。
尚、捕捉部位における検出値を補正するに際し、捕捉部
位以外の領域における標識の検出値を用いてもよいし、
捕捉部位を含む試験片全体又は一部における検出値を用
いてもよい。具体的には、リリース部位から第３の領域
における検出値を用いることが好ましい。本発明におい
て、リリース部位（すなわち第１の領域）から第３の領
域における検出値とは、各領域のみならず、各領域間の
間隙部分における検出値も含む。

【００３０】試験片上の標識の検出方法は、試験片上の
標識を位置特異的に測定できるものである限りその方法
を問わない。例えば、標識として蛍光物質を用いる場合
は、通常、試験片に励起光を照射し、試験片上で発せら
れた蛍光を、励起光をフィルタでカットしながら検出す
る。蛍光は、励起光を照射する面と反対の面から透過光
として検出してもよいし、励起光を照射した面から検出
してもよい。以下に、補正の方法を例示するが、本発明
はこれらに限られるものではなく、標識の種類、検出の
方法等によって、定量性、再現性のよい条件を、適宜設
定することができる。

【００３１】例えば、捕捉部位における検出ピークの積
分値（面積）を試験片全体における検出値の積分値で割
り、得られた値を用いて被検物質の濃度を算出する。別
の例では、捕捉部位における検出ピークの積分値を、試
験片のリリース部位域から第３の領域まで、又は、リリ
ース部位から捕捉部位まで、もしくは捕捉部位から第３
の領域における検出値の積分値で割り、得られた値を用
いて被検物質の濃度を算出する。さらに別の例では、捕
捉部位及びリリース部位における検出値の積分値を、試
験片のリリース部位から第３の領域における検出値の積
分値で割り、得られた値を用いて被検物質の濃度を算出
する。

【００３２】上記の各補正方法は、いずれの標識の検出
方法にも、適用可能である。尚、上記の各補正方法にお
いては、試験片の各領域の材質の相違等により生じる誤
差を補正するため、検出値に補正係数を掛けることが好
ましい。例えば、例えば、ニトロセルロースメンブレン
とグラスファイバのように材質が異なると、各々に同じ
量の標識が存在したとしても、測定される蛍光値が異な
る場合がある。したがって、図１又は２に示す試験片の
ように領域によって材質が異なる場合は、それぞれの領
域において測定された値を、他の領域において測定され
た値と比較するために、必要な係数を掛けることが好ま
しい。

【００３３】例として、図１の試験片の、リリースパッ
ド１２、クロマトグラフィー媒体１４、及び吸収パッド
１６が、各々異なる材質である場合の、補正係数の算出
方法を説明する。まず、試験片を構成する各部材（リリ
ースパッド、クロマトグラフィー媒体、及び吸収パッ
ド）に、標識体である蛍光物質を一定量滴下して、各部
材の蛍光強度を測定する。その測定結果をもとに、各部
材の材質に応じた補正係数を算出する。次いで、図１の
試験片を用いて試料を測定し、試験片上の蛍光を測定す
る。捕捉部位、リリース部位から第３の領域における蛍
光強度の検出値の積算値に、先に求めた材質ごとに算出
された補正係数を材質ごとに各々掛けて補正する。捕捉
部位の補正後の積算値を、リリース部位から第３の領域
における補正後の積算値で割り、得られた値を用いて被
検物質の濃度を算出する。

【００３４】尚、上記補正方法においては、各領域の検
出値の面積値を用いて被検物質の濃度を算出する方法を
例示しているが、必ずしも面積値を利用する必要はな
く、試験片上の各位置での検出強度を利用してもよい。
例えば、捕捉部位の最大蛍光強度から、捕捉部位とリリ
ース部位の中間位置のメンブレンの蛍光強度を引いて補
正する方法が考えられる。また、補正のための計算式の
導出には、統計的な手法を用いてもよい。多変量統計学
の手法として、例えば独立成分分析、好ましくは主成分
分析を行ってもよいし、あるいは高次統計学的な手法を
用いてもよい。

【００３５】本発明の方法によって被検物質の濃度を定
量する場合は、予め、既知量の被検物質を用いて標準曲
線を作成しておいてもよいし、測定の都度、標準曲線を
作成してもよい。

【００３６】本発明の装置は、上記した本発明の方法を
実施するための装置である（図３）。すなわち、本発明
の装置は、毛管現象により液体試料を展開することがで
きる領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び第３
の領域がこの順序に設定された担体と、担体上の第１の
領域に、液体とともに展開可能に担持され、検出可能な
標識を有する第１の物質と、担体上の第２の領域に固定
された、被検物質に特異的に結合する第２の物質とを有
し、前記第１の物質は、被検物質に特異的に結合する
か、又は被検物質と競合して第２の物質に特異的に結合
する試験片を用いて、液体試料中の被検物質の濃度を測
定するための装置であって、試験片の第１の領域から第
３の領域までの標識を光学的に検出する検出器と、第２
の領域において検出された標識の量を、担体の第２の領
域以外の領域の一部または全部において検出された標識
の量に基づいて補正する補正手段とを備える。

【００３７】標識を光学的に検出する検出器及び光学配
置は、試験片を位置特異的に測定できる限り、その種類
を問わない。例えば、標識が蛍光物質である場合は、反
射型の光学配置でも透過型の光学配置でも構わない。標
識が発光物質である場合は、光源は必要ない。

【００３８】また、スキャンニングは、試験片を載置す
るステージを可動式にしてもよく、光源及び検出部位を
可動式にしてもよい。さらに、スキャンニングを行わな
くても、二次元又はそれ以上の検出器、例えばCCDなど
で各部位のデータを同時に取り込み、取り込まれたデー
タに基づいて、必要な補正を行ってもよい。補正手段
は、上述した補正を行うための手段であり、コンピュー
タが使用される。各種補正を実施するプログラムによ
り、同手段はコンピュータの中央処理装置上に実現され
る。尚、補正手段は必ずしも検出器と同じ筺体に備えら
れる必要はなく、ネットワークや通信回線によって随時
接続されてもよい。

【００３９】本発明は、製造および分析条件に差が出や
すいイムノクロマトグラフィーにおいて、各分析間の再
現性・繰り返し性を向上させ、定量の際の信頼性を向上
させるるという長所を有する。また、簡易分析系におい
て、特に分析機器の小型化に際しては、光学系のキャリ
ブレーションを兼ねた方法としても用いることができる
ため、メンテナンスフリー化に有用であることも特徴で
ある。

【００４０】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【実施例１】粒径0.21μmのEu（ユーロピウム）錯体を
含むポリスチレン粒子（EuLTX、Ceradyne社製）を、0.0
5 M MES(pH 6.0)にて希釈し、１％懸濁液２mLを調製し
た。この懸濁液に、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（EDC）0.63mg
を加え、室温で１時間反応させた。その後、遠心分離に
より、未反応のEDCを除去し、粒子を洗浄した後、0.05
M MES(pH 7.0)でEuLTXを分散させた後、抗ヒトFSH（濾
胞刺激ホルモン）-αサブユニット抗体（Medix Biochem
ica Oy Ab社）0.8mgを加え、室温で１時間反応させた。
反応液を遠心し、未反応の抗体を除去し、BSA含有トリ
ス緩衝液（0.3% BSA, 0.1 M Tris, pH 8.0）を加え、Eu
LTXを安定化した。室温で30分攪拌した後、遠心し、精
製水でEuLTXを洗浄した。洗浄後、0.05%アジ化ナトリウ
ム液にEuLTXを分散させ、抗ヒトFSH-αサブユニット抗
体固定化EuLTX(Ab-EuLTX)を作製した。抗体固定化時の
未結合抗体濃度は0.15mg/mLであった。したがって、抗
体の固定化率は (0.40-0.15)/0.40×100%＝62.5% であ
った。尚、FSHのαサブユニットは、TSHのαサブユニッ
トと共通構造を有しており、抗FSH-αサブユニット抗体
は、TSHに結合することができるため、抗TSH抗体として
機能する。

【００４１】孔径8μmのポリエステルサポート付きニト
ロセルロースメンブレン（Whatman社）を、4mm×20mmに
切断し、中央に1.1 mg/mLの抗TSH（甲状腺刺激ホルモ
ン）抗体（マウスIgG、Medix Biochemica Oy Ab社）を1
μL固定化し、10% BSA(Sigma社)でブロッキングした
後、メンブレンを洗浄し、乾燥させた。

【００４２】ラベル剤のリリース部位を設けるリリース
パッドには、コンジュゲート・リリース(F075-17, What
man社)を4mm×5mmに切断したものを用い、これに前記で
調製したAb-EuLTXを100倍に希釈した懸濁液を滴下し、
乾燥させた。

【００４３】試料を適用する部位には、ポリビニルアル
コールをコートしたグラスファイバ(GF/AVA, Whatman
社)を4 mm×20mmに切断したものを用いた。また余分な
水分やラベル剤を吸収する吸収パッドとしては、アブソ
ーベント(17Chr, Whatman社)を4mm×20mmに切断して用
いた。この４つのパーツを、図１のように重ね、裏側か
ら透明粘着テープで接合し、ストリップ状の試験片１を
作製した。11が試料適用部位、12がリリースパッド、13
がラベル剤のリリース部位、14がニトロセルロースメン
ブレン、15が捕捉部位、16が余分な水分やラベル剤を吸
収する吸収パッドであり、それぞれの重なりは２mmであ
る。

【００４４】6% BSAで希釈し、各種濃度に調整したTSH
標準品（Zymed社）150μLを、試料適用部位に滴下し、
１時間静置した。測定は、反射光学系測定装置で行っ
た。光源は60Wのキセノンフラッシュランプ（浜松ホト
ニクス社）を用い、同軸型光ファイバ（FU-35FA, キー
エンス社）を用いて励起光を測定部位に照射し、蛍光を
光電子倍増管（H4195-01, 浜松ホトニクス社）で増幅
し、ユニバーサルフォトンカウンティングシステム（C3
858,浜松ホトニクス社）で検出した。スキャンは、試験
片を自動XYステージ（L0243P, 駿河精機社）で移動する
ことにより行った。

【００４５】表１に、捕捉バンド部位にあたる検出ピー
クの積分値を、リリース部位から第３の領域における検
出値の積分値で割って補正した値を示す。全濃度域にわ
たりCVが減少しており、定量再現性の向上が確認され
た。

【００４６】

【表１】

【００４７】

【実施例２】実施例１と同様にして、TSH標準品（Zymed
社）150μLを試験片の試料適用部位に滴下し、１時間静
置した。また、蛍光の測定を、実施例１と同様にして行
った。表２に、捕捉バンド部位にあたる蛍光値の積分値
と、リリース部位に残留した蛍光値の積分値を足し合わ
せた値を、リリース部位から第３の領域における検出値
の積分値で割って補正した値を示す。全濃度域にわたり
CVが減少しており、定量再現性の向上が確認された。

【００４８】

【表２】

【００４９】

【実施例３】実施例１、２で使用したポリエステルサポ
ート付きニトロセルロースメンブレン（Whatman社）、
コンジュゲート・リリース(F075-17, Whatman社)、ポリ
ビニルアルコールをコートしたグラスファイバ(GF/AVA,
Whatman社)の各々に、実施例１でコンジュゲート・リ
リースに滴下したのと同濃度、同量の抗ヒトFSH-αサブ
ユニット抗体固定化EuLTX(Ab-EuLTX)懸濁液を滴下し、
実施例１と同様の方法で蛍光強度を測定し、測定値の逆
数を補正係数とした。表３に、各材質の蛍光値、補正係
数を、リリース・パッドを基準とした相対値で示す。

【００５０】

【表３】

【００５１】次いで、実施例１、２と同様にして、試験
片を作製し、TSH標準品（Zymed社）150μLを、サンプル
適用部位に滴下し、１時間静置し、蛍光の測定を行っ
た。表４に、捕捉バンド部位にあたる蛍光値の積分値
を、各材質ごとに補正係数を掛けて補正し算出したリリ
ース部位から第３の領域までの検出値の積分値で割って
補正した値を示す。また、対照として、捕捉バンド部位
にあたる蛍光値の積分値、および捕捉バンド部位にあた
る蛍光値の積分値を、リリース部位から第３の領域まで
の検出値の積分値で割って補正した値（材質による補正
をしない値）を示す。補正係数を使用した場合、全濃度
域にわたりCVが減少しており、定量再現性の向上が確認
された。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【発明の効果】本発明により、試験片を用いて、液体中
の被検物質を、定量性及び再現性よく測定することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の試験片の構造の一例を示す図。

【図２】本発明の試験片の構造の他の例を示す図。

【図３】本発明の装置の一例を示す図。

【符号の説明】１．試験片 11．ポリビニルアルコールコート・グラスファイバ（試
料適用部位） 12．リリースパッド 13．第１の領域（リリース部位） 14．クロマトグラフィー媒体（ポリエステルサポート付
きニトロセルロース・メンブレン） 15．第２の領域（捕捉部位） 16．第３の領域（吸収パッド）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の各ステップを含む、液体試料中の
被検物質の濃度を測定する方法；（Ａ）毛管現象により液体試料を展開することができる
領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び第３の領
域がこの順序に設定された担体と、担体上の第１の領域に、液体とともに展開可能に担持さ
れ、検出可能な標識を有する、被検物質に特異的に結合
する第１の物質と、担体上の第２の領域に固定された、被検物質に特異的に
結合する第２の物質とを有する試験片に、液体試料を展
開させ、（Ｂ）第１の領域で被検物質と第１の物質とを結合さ
せ、第２の領域で被検物質と第２の物質を結合させて、被検
物質を第２の領域にトラップし、第３の領域に、第２の領域でトラップされなかった被検
物質及び第１の物質を保留させ、（Ｃ）第２の領域、及び担体の第２の領域以外の領域の
一部または全部において、標識を検出し、（Ｄ）第２の領域における標識の検出結果を、担体の第
２の領域以外の領域の一部または全部における標識の検
出結果を用いて補正して、被検物質の濃度を算出する。
【請求項２】ステップ（Ｃ）において、担体の第１の
領域から第３の領域までの標識を検出する、請求項１に
記載の方法。
【請求項３】第１の領域から第３の領域までの標識を
検出し、第２の領域における検出値のピークの積分値
を、第１の領域から第３の領域における検出値の積分値
で除した値を用いて被検物質の濃度を測定する、請求項
１に記載の方法。
【請求項４】前記被検物質に特異的に結合する第１の
物質及び第２の物質が、それぞれエピトープが異なる抗
体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】以下の各ステップを含む、液体試料中の
被検物質の濃度を測定する方法；（ａ）毛管現象により液体試料を展開することができる
領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び第３の領
域がこの順序に設定された担体と、担体上の第１の領域に、液体とともに展開可能に担持さ
れ、検出可能な標識を有する第１の物質と、担体上の第２の領域に固定された、被検物質及び第１の
物質の両方に特異的に結合する第２の物質とを有する試
験片に、液体試料を展開させ、（ｂ）第２の領域で被検物質及び第１の物質と、第２の
物質を結合させて、被検物質及び第１の物質を第２の領
域にトラップし、第３の領域に、第２の領域でトラップされなかった被検
物質及び第１の物質を保留させ、（ｃ）第２の領域、及び担体の第２の領域以外の領域の
一部または全部において、標識を検出し、（ｄ）第２の領域における標識の検出結果を、担体の第
２の領域以外の領域の一部または全部における標識の検
出結果を用いて補正して、被検物質の濃度を算出する。
【請求項６】ステップ（ｃ）において、担体の第１の
領域から第３の領域までの標識を検出する、請求項５に
記載の方法。
【請求項７】第１の領域から第３の領域までの標識を
検出し、第２の領域における検出値のピークの積分値
を、第１の領域から第３の領域における検出値の積分値
で除した値を用いて被検物質の濃度を測定する、請求項
５に記載の方法。
【請求項８】毛管現象により液体試料を展開すること
ができる領域を少なくとも一部に有し、第１、第２及び
第３の領域がこの順序に設定された担体と、担体上の第
１の領域に、液体とともに展開可能に担持され、検出可
能な標識を有する第１の物質と、担体上の第２の領域に
固定された、被検物質に特異的に結合する第２の物質と
を有し、前記第１の物質は、被検物質に特異的に結合す
るか、又は被検物質と競合して第２の物質に特異的に結
合する試験片を用いて、液体試料中の被検物質の濃度を
測定するための装置であって、試験片の第１の領域から第３の領域までの標識を光学的
に検出する検出器と、第２の領域において検出された標識の量を、担体の第２
の領域以外の領域の一部または全部において検出された
標識の量に基づいて補正する補正手段とを備えた装置。