DD271572A1

DD271572A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von pregnant mare's serum gonadotrophin (pmsg)

Info

Publication number: DD271572A1
Application number: DD31520088A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Jost Bergfeld; Ingrid Behn; Undine Hommel; Dieter Urbaneck
Original assignee: Dessau Tornau Impfstoffwerk
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1989-09-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Pregnant Mares Serum Gonadotrophin (PMSG) mittels eines Zweiseitenimmunassays (Sandwich-Prinzip) unter alleiniger Verwendung monoklonaler Antikoerper als immunologische Reagenzien. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass der monoklonale Antikoerper BL-PMSG/1 als Fangantikoerper und die enzymmarkierten monoklonalen Antikoerper BL-PMSG/2, BL-PMSG/3 oder BL-PH(a)24, einzeln oder in einer Kombination eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sind die veterinaermedizinische Diagnostik und die Produktionskontrolle.

Description

einem Enzym, ζ. B. Meerrettlch-Peroxldase (POD), über die bekannten Verfahren, ζ. B, via Glutaraldehyd, via perlodataktlvierter

POD und dgl. Die Reinigung des Antlkorper-EnzynvKonJugates kann mittel· üblicher Verfahren, ι. B. durch Qelchromatographle

oder rPLC, erfolgen.

Nach der Inkubation mit dem oder den enzymmarkierten Antlkörper(n) erfolgt eine erneute Waschung zur Entfernung der nicht

gebundenen Detektlonsantlkörper.

In einer anderen Ausführungsform werden der bzw. dio onzymmarklerton Antikörper sofort mit dem PMSG-Standard und den Testproben In die Reaktlonsgefäße plpettiert und gemeinsam Inkubiert. Danach erfolgt eine Entfernung der nicht gebundenen Komponenten durch Waschung. Die über den gebildetem Komplex an dio Festphase gebundene Enzymaktivität wird anschließend gomessen, wobei die für dao

gewählte Markierung^onzym gebräuchlichen Subetrat-Chromogen-Gemlsche eingesetzt werden. Gemäß dem Sandwich*

Prinzip wiro um so mehr Enzymaktivität en die Festphase gebundon, Je mehr PMSG In der Probe enthalten ist. Die Konzentrationsbestimmung in der Probe erfolgt durch vergleich mit Standards des PMSQ. Die verwendeten monoklonal^ Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 und BL-PH(a)24 sind im ZIM der AdW der DDR unter den Nummern

0272,0271,0270 und 0146 registriert. Die Hybridome sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Unlvereltat Leipzig In

Kultur bzw. liegen kryokonsei viert vor und sind zugänglich. Ausfuhrungsbeispiel Be&timmung der Konzentration von F.tiSG in Stutenserum

1. Mikrotiterplatten aus Polystyren werden mit dem monkionaen Antikörper BL-PMSG/1 beschichtet. Dazu worden die Kavitäten der Platte mit 0,25 ml einer Lösung des Antikörpers (50mg/l), In Karbonatpuffer (0,1 mg/l, pH 9.6) gelöst, gefüllt und für 2 h bei Raumtemperatur oder 16h bei +4'C inkubiert. Im Anschluß werden die Kavitäten abgesaugt und dreimal mit je 0,3ml PBS (Q, 15 mol/l NaCI, 0,01 mol/l Phosphat, pH 7,4) gewaschen.

2. Je 100μι PMSG'Standard (Verdünnungsreihe) bzw. Kontrollseren oder die Meßproben werden in die Kavitäten for beschichteten Platte gefüllt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend abgesaugt und dreimal mit je 0,3ml PBS/ 0,05%Tweon 80 gewaschon.

3. Zugabe von 100μΙ POD-markiertom monoklonalem Antikörper BL-PMSG/3, präpariert durch Kopplung periodataktivlerter Meerrettich — Peroxidase mit gereinigtem monoklonalem Antikörper BL-PMSG/3 (NAKANE, P. K. und J. AKAWAO: Histochem. Cytochom. 22 (19741,1084). Nach Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur werden die Kavitäten abgesaugt und, wie unter 2 angegeben, geweschen.

4. Inkubation mit 0.2ml Substrat-Chromogon-Gemisch, bestehend aus H₂Oj und o-Phenyldiamin, Abstoppen der Reaktion nach ausreichender Entwicklungszeit (15-45m!n) mit 100μΙ HjSO₄ (5mol/l) und Messung der Extinktion bei 492nm,

Claims

-1- 271672 Patentanspruch:

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Pregnan. Mare's Scum üonado'rophin mittels Zweiselten-Immunassay, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay unter alleiniger Verwendung \ monoklonaler Antikörper als immunologische Reagenzien ausgeführt wird, wobei der monoklonal Antikörper BL-PMSG/1 an eine feste Phase gebunden w" -d und als PanganlikÖrper dient, während die enzymmarkierten rnonoklonalen Antikörper BL-PMSü/2 und 3 sowie BL-PH(a)24, oirizeln oder in einer Kombination, als Detektionsantikörper eingesetzt werden.

Die monokionalen Antikörper haben die Registriernummern 0272,0271,0270 und 014b Im ZIM der AdW der DDR.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des PMSQ mittels eines Zweloelten*lmmunassaye. Ein derartiges Verfahren gestattet die einfache und schnelle Jestlmmung des Hormons, während der Produktion des und In der veterlnärrm Ui>ir';chen Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur quantitativen Bestimmung des PMSG werden vorliegend Bioassays eingesetzt. Diese Bioassaye sind zeitaufwendig und KiU einer Rilhe von Mängeln behaftet. Die quantitative BeJtIm nunp dia PMSO mittels radio· oder enzymlmmunologlscher Methoden hat sich In der Praxis u.a. dadurch nicht bowän,., daß durch die bisher eingesetzten konventionellen Antiseren, die durch Immunisierung von Versuchstieren hergestellt wurden, nicht gewährleistet werden konnte, daß die gemessenen Werte mit den biologischen Aktivitäten korrelieren. Dies liegt offenbar in erster Linie an der Erfassung von PMSQ bzw. von Bestandteilen des Hormons die zwar noch antigen sind, aber keine biologische Wirkung aufweisen. Mittels konventioneller Antiseren gelingt die Unterscheidung von wirksamen und unwirksamen Komponenten des PMSQ nicht, so daß auf ihnen aufbauende Assays keine zuverlässige Werte liefern. Außerdem besitzen solche konventionellen Antiseren generell eine Reihe von Nachteilen, so sind Antiseren von differenten Tieren nicht Identisch, im Gegenteil, es können beträchtliche Unterschiede hinsichtlich des Gehaltes von Antikörpern, in quantitativer und qualitativer Hinsicht, bestehen. Diese Schwankungen und die Chargenabhängigkoit der Antiseren erlauben keine durchgehende Standardisierung der auf Ihnen aufbauenden Assays. Monoklonal Antikörper, die von permanent wachsenden und produzierenden Hybrldomen sezerniert werden, stehen in praktisch ausreichender Menge und über einen theoretisch unbegrenzten Zeitraum zur Vorfügung, so daß sich auf ihrer Grundlage reproduzierbare und standardisierbare Immunassays aufbauen lassen. Es ist bereits bekannt, wie monoklonal Antikörper hergestellt werden. Die Prinziplösung der Hybridomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 258, (1975], S.495) beschrieben.

E& sind aber bisher keine monokionalen Antikörper gegen PMSG hergestellt und in einem Zweiseiten-Immunassay eingesetzt worden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein zuverlässig reproduzierbare Werte lieferndes analytisches Verfahren zu entwickeln, das eine empfindliche, spezifische, zeitsparende und kostengünstige Bestimmung des PMSG gestattet.

Darlegung des Wesens der Fifindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein analytisches Verfahren nach dem Prinzip des Zweiseiten-Immunassays für die quantitative Bestimmung von PMSG unter alleiniger Verwendung von monokionalen Antikörpern als immunulogische Reagenzien zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der monoklonal*) Antikörper BL-PMSG/1 an eine feste Phase gebunden wird. Der monoklonal Antikörper wird dabei als gereinigte Immunglobulinfraktion aus Ascites oder Zellkulturüberstand zur Anwendung gebracht. Die Kopplung an die feste Phase erfolgt entweder durch Adsorption oder durch kovalente Ankopplung. Nach der Entfernung von überschüssigem Antikörper durch mehrere Waschschritte werden unspezifische Bindungsstellen der festen Phase durch Beladung mit einem inerten Protein blockiert.

Anschließend erfolgt die Inkubation mit einer Verdünnungsreihe eines PMSG-Standards sowie mit den Testproben und entsprechenden Kontrollen. Nach dieser Inkubation werden die Proben abgesaugt und die Gefäße mit dem fixierten Antikörper , erneut gewaschen.

Danach wird das an den monokionalen Antikörper gebundene PMSG durch enzymmarkierte monoklonale Antikörper, die mit einem anderen als dem durch BL-PMSG/1 erkannten A-Epitop des PMSG reagieren, quantifiziert. Als Dotektionsantikörper können die monokionalen Antikörper BL-PMSG/2, BL-PMSG/3 und BL-PH(a)24, einzeln oder in einer Kombination, eingesetzt werden. Die Darstelluna der enzymmarkinrten Antikörper erfolgt durch Kopplung des kompletten monoklonalen Antikörpers mit